JP4430869B2 - 宿主細胞の分離した生産及び異化経路 - Google Patents
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Description
本発明はアメリカ合衆国商務省によって授与された授与番号70NANB5H1138に基づいてアメリカ合衆国政府の支援の下でなされたものである。合衆国政府は本発明において権利の一部を有する。
本発明は宿主細胞の代謝経路の工学技術に関し、宿主細胞における生成物の生成に関する方法及びシステムを提供するものである。特に、本発明は分離した生産及び異化経路を有するように遺伝子組換えされた宿主細胞における生成物を生成する方法を提供する。
宿主炭水化物代謝、すなわち解糖の初期段階において、各グルコース分子が細胞質ゾル中2つのピルビン酸化合物分子に変換される。グルコースをピルビン酸化合物に変換する化学反応はエムデン・マイエルホーフ経路と呼ばれる。初期炭水化物と最終生成物であるピルビン酸化合物の間における代謝中間物の全てはリン酸化合物である。また、炭水化物酸化の最終段階であるクエン酸回路は細胞質ゾル中に起こる一連の複雑な反応である。エムデン・マイエルホーフ経路及びクエン酸回路における反応は、NAD+のNADH分子への還元及びATPの生成と同時に、結果として炭水化物分子をCO2分子に変換する。
(1)有機代謝生成物の直接還元による醗酵経路において。
(2)呼吸鎖から最終電子受容体への電子伝達による呼吸器官工程において。この受容体は通常O2であるが、硝酸塩や硫酸塩などの生産性イオンの場合もある。全ての呼吸器官工程でATPが発生する。いくつかの細菌は細胞外で基質を酸化する能力を有し、L−ソルボース、D−グルコン酸塩、ケト−グルコン酸塩等のような有用な酸化生成物を生成する。このような酸化反応は、不完全な基質酸化に関与して成長培地中に大量のそれによる酸化生成物の蓄積を伴うので、生産醗酵という。酸化反応は微生物の呼吸鎖に結合する(Bacterial Metabolism 第2版(1985)Springer−Verlag、ニューヨーク)。
生成の全過程またはその一部において生産及び異化経路が分離したものとなるように遺伝子的に改変された組換え宿主細胞において生成物を生成するための方法を提供する。本発明はまた、生成の間分離され、または調節できる、生産経路及び/または異化経路を含むように遺伝子的に改変された組換え宿主細胞及びそれらの調整方法も提供する。
本発明は生産経路及び異化経路を含む組換え宿主細胞を含有する生成物を生成する方法を提供するものであり、該経路は該方法の全過程または一部の間宿主細胞中で分離されており、すなわち、該経路はD−グルコースまたはD−グルコン酸のような初期炭素源の獲得のために争わず、または例えば共同因子及びATPのような細胞構成要素を該方法の全または一部過程の間で獲得のために争わない。本発明は、生産及び/または異化経路に存在する酵素活性の変異及び/または調節によって生産及び異化経路が分離されている方法を包含する。
本発明の実践手段は、特に示さない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学及び生化学の当業界の範囲である従来技術を用いる。このような技術は文献において十分に説明されており、例えば、分子クローニング(Molecular Cloing):A Laboratory Manual、第2版(Sambrook et al.、1989);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.編、1987及び年間最新版);オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait、編、1984);及びPCR;ポリメラーゼ鎖反応、(Mullis et al.、1994)である。Mannual of Industrial Microbiology and Biotechnology、第2版(A.L.Demain et al.編、1999)。
ここで用いられる“分離(uncoupled)”の語は、宿主細胞の生産経路及び異化経路について言及する場合、基質及び生成された生成物を含む宿主細胞の生産経路において基質が宿主細胞の異化経路へ転用されることが低減されていることを意味する。転用の低減により、野生型の産出量が変異宿主細胞の産出量よりも少ないことを意味する。
図2及び図3はいくつかの代謝経路から得られる代謝産物のいくつかを記載したものである。図3の左側の生成物の大部分(グルコース−6−リン酸、グルコース−1−リン酸;フルクトース−6−リン酸、マンノース−6−リン酸、ジヒドロアセトン−リン酸;ジヒドロアセトン;グリセロール;1,2−プロパンジオール;1,3−プロパンジオール;乳酸;琥珀酸;シュウ酸;クエン酸;フマル酸;リンゴ酸;アミノ酸;グリコーゲン;トレハロース;及びUDP−グルコース)は異化またはTCA回路から得られる。これに対して、右側の化合物は、本発明の目的において望ましい最終産物であって(グルコン酸、2−ケト−D−グルコン酸、2,5−ジ−ケト−グルコン酸;エリソルビン酸;5−ケト−D−グルコン酸;酒石酸;D−リボース;リボフラビン;デオキシリボヌクレオチド;芳香族アミノ酸;芳香族化合物;[例えば、P−ヒドロキシ安息香酸;キノン;カテコール;インドール;インディゴ;没食子酸;ピロガロール;メラニン、アジピン酸、p−アミノ安息香酸];ピリドキシン及びアスパルテーム)、そのほとんどの炭素がペントース経路及び/またはグルコースからケト酸への酸化により生じる。多くの場合において、これらの生成物は特定の細胞の天然代謝産物ではないが、特定の酵素機能を付加または取り除くことによって生成できる。
Tm=81.5+16.6log[X+]+0.41(%G/C)−0.61(%F)−600/L
ここで[X+]はmol/Lで表されるカチオン濃度である(通常はナトリウムイオン、Na+);(%G/C)は二本鎖における総残基の比率としてのG及びC残基の数である;(%F)は溶液中のホルムアミド比率である(wt/vol);及びLは二本鎖の各鎖におけるヌクレオチド数である。
また、本発明は宿主細胞におけるアスコルビン酸中間体の生成方法を提供するものである。本発明は、例えば6位置炭素でD−グルコースをリン酸化し、及び/または6炭素位置でリン酸化D−グルコン酸をリン酸化する生産経路と異化経路を結合させる酵素活性のレベルを培養の全過程または一部の過程において減少させる方法を包含する。本発明は、酵素活性レベルがD−グルコースをその6炭素位置でリン酸化する、及び/または酵素活性レベルが6炭素位置におけるリン酸化D−グルコン酸を培養の全過程または一部の過程において増加させる方法を包含する。また、本発明は、酵素活性レベルがD−グルコースをその6炭素位置でリン酸化する、及び/または酵素活性レベルが培養の初期において、成長を促進するために6炭素位置におけるリン酸化D−グルコン酸を変性しないで、または増加して、細胞バイオマスを生成し、培養の後半は望ましい生成物の蓄積を促進するために該リン酸化D−グルコン酸が減少する、方法を包含するものである。
本発明は、6炭素位置でD−グルコースをリン酸化する内生酵素活性をエンコードするポリヌクレオチドにおける変異、及び/またはASA中間体のin vivo生成中に6炭素位置においてD−グルコン酸をリン酸化する酵素活性をエンコードするポリヌクレオチドにおける変異を含む宿主細胞の使用を包含するものである。生体触媒は、例えばグルコースのような六炭糖または六炭糖酸または六炭糖及び/または六炭糖の組合わせのような酸腸内細菌株によって通常使用される適当な炭素源を含む環境において宿主細胞の培養を開始する。その他の炭素源としては、限定されないが、ガラクトース、ラクトース(乳糖)、フルクトース(果糖)またはこれらの酵素誘導体が挙げられる。適当な炭素源に加えて、醗酵媒体は、望ましい最終生成物の生成のために必要である培地の成長及び酵素経路の促進に関する当業者に公知の適当な鉱物、塩、共同因子、バッファー(緩衝物)、及びその他の成分を含まなければならない。
本発明はin vitroまたはバイオリアクターのような非醗酵性環境において、炭素源からKDG、DKG及びKLGのようなASA中間体を生成する生体触媒生成を提供する。細胞を成長のため最初に培養し、そして非醗酵性プロセスにおいて成長に利用される炭素源は除去し、pHは約4〜約9に維持し、酸素を存在させる。
例えばKDG、DKGまたはKLGのようなASA中間体へ宿主細胞炭化水素経路を導くために必要な生産または還元酵素は、もしこれらの酵素が宿主細胞に天然に生じるものでなければ、当業界に公知の組換えDNA技術によって取り込むことができる。もしくは、望ましい経路を阻害する酵素は組換えDNA方法によって不活性化できる。本発明はいかなる酵素または所望経路を達成するために必要な中間体の組換導入または不活性化をも包含するものである。
一旦生成すると、ASA中間体を再生させることができ、及び/または凍結乾燥、結晶化、噴霧乾燥及び電気透析等の当業界に公知の任意の手段によって精製することができる。ASA及びKLGのようなASA中間体を精製するための電気透析法は、例えば1998年5月5日に発行された米国特許第5747306号及び1998年8月30日に発行された米国特許第4767870号に記載されている。あるいは、中間体は醗酵培養液またはバイオリアクターから直接構築でき、粉状にするか液剤中に入れることができる。
ASA中間体、ASA及びASA立体異性体の検出方法としては2,6ジクロロインドフェノール(Burton et al.、1979、J.Assoc.Pub.Analysis 17:105)またはその他の適当な試薬を用いる酸化還元滴定;陰イオン交換を用いる高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)(J.Chrom.1980、196:163);及び電気的な酸化還元手順(Pachia、1976、Anal.Chem.48:364)の利用が挙げられる。当業者はこれらの検出方法を利用する際の適用の制御について十分に認識しているであろう。
前培養(precultures):
通常、細胞培養は適当な媒体中25〜32℃で成長させ、好ましくは約28または29℃である。実施例は使用した成長媒体について記載するが、本発明に有用なその他の典型的な成長媒体はルリア栄養培地(Luria Bertani(LB) broth)、サブローデキストロース培地(SD)またはYM(Yeast medium)培地のような一般的な市販媒体である。その他の規定のまたは合成成長媒体も使用でき、特定の微生物の成長に適当な媒体は微生物学または醗酵科学の分野の当業者に公知であろう。
本発明の方法は培養系としてフェッドバッチ醗酵法を用いる。伝統的なバッチ醗酵は媒体の組成物が醗酵の開始時にセットされ、醗酵の間は人工的な改変を行わない閉鎖系である。従って、醗酵の開始時に、媒体に所望の生物を接種し、系へ何も加えることなく醗酵を起こすことが可能である。一般に、しかしながら、“バッチ”醗酵は炭素源添加に関するバッチであり、pHや酸素濃度のような因子を制御しながら行われる。バッチ系において、該系の代謝産物及びバイオマス組成物は醗酵が止まる時まで絶えず変化している。バッチ培養地内において、細胞は静電誘導相から高成長ログ相(log phase)、そして最終的には成長速度が減少または停止した固定相へ抑制される。もし放置した場合、固定相中の細胞は最終的には死滅する。ログ相中の細胞は一般的に最終生成物または中間体のバルク生成を引き起こす。
醗酵媒体からの望ましいアスコルビン酸中間体の精製方法は公知である。
一般的方法
細菌培地の維持及び成長に適した物質及び方法はManual of Methods for General Bacteriology(Phillip Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,EugeneW.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Kreig andG.Briggs Phillip編集)、210〜213頁、米国微生物学会(ワシントンDC)またはThomas D.Brock 生命工学:工業微生物学テキスト(Textbook of Industrial Microbiology)、第2版(1989)(Sinauer Associates,Inc.、Sunderland、Mass)に記載されている。成長のために使用される試薬及び物質及び細菌細胞試薬及び物質は、特に示さない限りディフコ研究所(Diffco)(デトロイト、ミシガン州)、Aldrich Chemicals(ミルウォーキー、ウィスコンシン州)またはシグマ・ケミカル社(セントルイス、ミズーリ州)から得た。
2つの基本的な醗酵媒体を以下の実施例で使用するために調製し、シードフラスコ媒体及び醗酵媒体として同定した。これらの基本的な媒体は炭素源を変換することにより、または亜硫酸塩剤のようなその他の試薬を添加することにより変性した。それぞれの媒体に有用な試薬はKH2PO4、K2HPO4、MgSO4・7H2O、ディフコ社製ソイトーン(Difco Soytone)、クエン酸ナトリウム、フルクトース、(NH4)2SO4;ニコチン酸、FeCl3・6H2O及び微量の塩であって、限定されないがZnSO4・7H2O、MnSO4・H2O及びNa2MoO4・2H2O;KH2PO4、MgSO4・7H2O、(NH4)2SO4、グルタミン酸一ナトリウム、ZnSO4・7H2O、MnSO4・H2O、Na2MoO4・2H2O、FeCl3・6H2O、塩化コリン、Mazu DF−204(消泡剤)、ニコチン酸、パントテン酸カルシウム及びHFCS(42DE)を含むものが挙げられる。HFCSはグルコースとフルクトースの所望の比に従って生成することができる。例えば、フルクトース/グルコース溶液は27.3g/L粉末フルクトース、25.0g/L粉末グルコースから作られる。
以下の実施例において使用される全ての市販の細胞はATCCから得たものであり、本文中ATCC番号によって特定される。組換えパンテア属(P.citrea)細胞(ATCC39140)をアスコルビン酸中間体生産者として用い、実施例4及び5に記載されるように構築した。酵素分析及びゲノム分析によってMDP41及びDD6株がグルコキナーゼ、グルコノキナーゼ及び両酵素をエンコードする遺伝子を持たないことが明らかになり、それに対して、野生型株はグルコキナーゼ及び/またはグルコのキナーゼ酵素をエンコードする遺伝子を含むということが示された。
アスコルビン酸中間体、例えば2−KLGの存在はHPLC分析を行うことにより実証した。醗酵反応容器サンプルを貯蔵槽から流出させ、ウォーターズ2690分離モジュール及び/またはウォーターズ410示差屈折率検出器(ミルフォード、マサチューセッツ州)に接続したDionex社(サニーベール、カリフォルニア州、製造番号043118番)Ion Pac AS 10カラム(4mm times 250mm)に充填した。
収量、OUR及びCERの測定方法は定義の段落において既に記載した。
組換え方法
ベクター配列
本発明の方法で使用される発現ベクターは酵素に関連する少なくとも1のプロモーターを含み、該プロモーターは宿主細胞中で働く。本発明の1の実施形態において、プロモーターは選択酵素の野生型プロモーターであり、他の実施形態において、プロモーターは酵素に対して非相同性であるが、宿主細胞中で働くことができるのものである。本発明の1の実施形態において、酵素をエンコードする核酸は微生物ゲノム中に安定して組み込まれる。
一般的な変換手順はCurrent Protocols In Molecular Biology(vol.1、Ausubel et al.編集、John Wiley&Sons,Inc.1987、第9章)に教示されており、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストランを用いる変換及びエレクトロポレーションが挙げられる。所定の宿主細胞において所望のタンパク質をエンコードする核酸を導入するための様々な変換手順が当業界に公知である。様々な宿主細胞は酵素が外因的に加えられる経路を組換えによって生成するために使用でき、細菌、菌類、哺乳類、昆虫及び植物細胞が挙げられる。
宿主細胞が変換されたかどうかは、目的の核酸が存在するかどうかを提示できるマーカー遺伝子発現の存在/不存在により検出できる。しかしながら、その発現は追認すべきものである。例えば、経路の酵素をエンコードする核酸をマーカー遺伝子配列内に挿入した場合、該挿入を含む組換え体細胞はマーカー遺伝子機能の不存在により同定できる。もしくは、マーカー遺伝子は単一プロモーターの制御下において、経路の酵素をエンコードする核酸と並行して位置することができる。導入または選択に対して反応したマーカー遺伝子の発現は通常同様に酵素の発現も示す。
実施例1
P.citrea 139−2a由来のゲノムライブラリーの構築
P.citreaゲノムDNAをDNA−Pure TMゲノムDNA単離キット(CPG、リンカーン、ニュージャージー州)を用いて調製した。50μgの該DNAをメーカーの説明に従って(ロシュ(Roche Molecular Biochemicals)、インディアナポリス、インディアナ州)制限酵素Sau3Aを用いて部分的に消化した。消化生成物を1%アガロースゲル上に分離し、3−5キロベースのDNA断片をQiaquick Gel extraction kit(キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州)を用いてゲルから精製した。最終DNAをBamH1−線形プラスミド pBK−CMV(Stratagene、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)と連結させた。10××異なるプラスミド周囲のライブラリーを該方法において得た。
グルコキナーゼ酵素の構造遺伝子の単離
P.citrea由来のグルコキナーゼ遺伝子を運ぶプラスミドを選択するために、ゲノムライブラリー(上述を参照)をグルコキナーゼ遺伝子(glkA)及びPTS輸送系、NF9株、glk−(Flores et al.、Nat.Biotech.14、620−623)を欠いている大腸菌株に変換する。変換後、該細胞をM9媒体上に成長させるために唯一の炭素源としてグルコースと一緒に選出した。この方法を用いて、glk−またはpts−変異体に相補的となることができるプラスミドを選出した。
自殺ベクターを用いて相同組換えにより遺伝子を不活性化する一般的な方法は、以前に説明されている(Miller and Mekalaons.、J.Bacteriol.170(1988)2575−2583)。この方法によりP.citrea由来のglk遺伝子を不活性化するために、2つのプラスミドを構築した:pMD5及びpMD6。
MDP4におけるクロラムフェニコール耐性マーカーの除去
30℃におけるYENB媒体上における一晩の成長後(0.75%酵母抽出物、0.8%栄養ブイヨン)、水懸濁液中のP.citreaMDP4をプラスミドpJW168を用いて電気形質転換を行った(Palmeros et al.、Gene(2000)247、255−264)。該プラスミドは、バクテリオファージP1 Creリコンビナーゼ遺伝子(IPTG−誘導性)、温度感受性pSC101レプリコン及びアンピシリン耐性遺伝子を含む。30℃でSOC媒体における結果物において、形質転換体を30℃(pJW168複製の許容温度)のカルベニシリン(200μg/ml)及びIPTG(1mM)で補ったLB寒天培地上で回収した。回収したコロニーを、Creリコンビナーゼにより仲介されたloxP部位において組換えによりクロラムフェニコール耐性遺伝子の切除をできるようにするためにカルベニシリン及びIPTGで補った新しいLB寒天培地上で2晩連続35℃で形質転換を行った(Hoess and Abremski,J.Mol.Biol.、181:351−362)。結果として生じたコロニーをカルベニシリン及びIPTGで補ったLB寒天培地及びクロラムフェニコール(12.5μg/ml)で補ったLB寒天上へレプリカ培養し、カルベニシリン耐性を有し及びクロラムフェニコール感受性を有する30℃でコロニーを同定し、マーカー遺伝子の除去を示した。このようなコロニーの1つを30℃で一晩中培養させたものを10mlのLB媒体に接種させるために用いた。0.6のOD(600nm)で30℃での成長において、培地を35℃で一晩中培養した。いくつかの希釈物を前もって温めておいたLB寒天培地上にプレートし、そのプレートを35℃で一晩中培養した(pJW168複製の非許容温度)。結果として生じたコロニーをLB寒天培地及びカルベニシリン(200μg/ml)で補ったLB寒天培地上へレプリカ培養し、カルベニシリン感受性を有する30℃でコロニーを同定し、プラスミドpJW168の損失を示した。このような1つのglk変異体である、MDP41を、配列番号5及び配列番号6のプライマーを用いてゲノムPCRによってさらに分析し、予想通りのPCR生成物を生じた(データは示していない)。
相同組換えによるグルコン酸キナーゼ遺伝子の不活性化
図9に表した、P.citreaのグルコン酸キナーゼ遺伝子を不活性化させるために利用される一般的な方法は、グルコキナーゼ遺伝子を不活性化させるために実施例3に記載したものと実質的には使用するものは同じである。簡潔に言えば、唯一の炭素源としてグルコン酸を用いて(データには示していない)大腸菌株gntKまたはidnKの成長を可能にするプラスミドを単離及びシーケンシングした後;グルコン酸キナーゼ遺伝子の構造遺伝子を含むDNA断片を配列番号10及び配列番号11のプライマーを用いてPCRによって生成させた。この約3kbPCR生成物をR6K複製起源を含む多コピー型プラスミド中にクローニングした。配列番号2に示すようにグルコン酸キナーゼ構造遺伝子中にある固有PstI制限部位はloxP−Cat−loxPカセットを挿入するために利用した。この構造を相同組換えによりP.citrea株MDP41の染色体に移した。loxP−Cat−loxPカセットを含むグルコン酸キナーゼの正確な阻害を配列番号11及び配列番号12のプライマーを用いてPCRによって確認した。
以下はO2需要に関して2つの欠失(グルコキナーゼ及びグルコノキナーゼが欠失したパンテア宿主細胞)を有する宿主細胞の利点を説明する。
液体窒素中に保管された培養ビンを空気中で解凍し、0.75mLを500mLの種媒体を含んだ殺菌2−Lのエレンマイヤーフラスコへ加えた。フラスコを29℃、250rpmで12時間培養した。移動基準は.5より大きいOD550である。
種フラスコ媒体
媒体組成物は以下に従って生成した:
成分 量
KH2PO4 12.0g/L
K2HPO4 4.0g/L
MgSO4・7H2O 2.0g/L
ディフコ・ソイトーン 2.0g/L
クエン酸ナトリウム 0.1g/L
フルクトース 5.0g/L
(NH4)2SO4 1.0g/L
ニコチン酸 0.02g/L
FeCl3・6H2O (0.4g/L原液の)5mL/L
微量の塩 5mL/L(の以下の溶液:0.58g/L ZnSO4・7H2O、0.34g/L MnSO4・H2O、0.48g/L Na2MoO4・2H2O)
媒体溶液のpHを20%NaOHを含む7.0±0.1単位に調節した。テトラサイクリンHClを20mg/L(10g/L原液の2mL/L)の最終濃度に加えた。最終的な媒体溶液をそれから0.2ろ過単位でフィルター消毒した。媒体をそれからオートクレーブで処理し、500mLの前もってオートクレーブ処理した媒体を2−Lのエレンマイヤーフラスコに加えた。
殺菌消毒の前に反応容器に加えるもの
成分 量
KH2PO4 3.5g/L
MgSO4・7H2O 1.0g/L
(NH4)2SO4 0.92g/L
グルタミン酸一ナトリウム 15.0g/L
ZnSO4・7H2O 5.79mg/L
MnSO4・H2O 3.44mg/L
Na2MoO4・2H2O 4.70mg/L
FeCl3・6H2O 2.20mg/L
塩化コリン 0.112g/L
Mazu DF−204 0.167g/L
上記構成成分からなる媒体を121℃で45分間殺菌消毒した。
成分 量
ニコチン酸 16.8mg/L
パントテン酸カルシウム 3.36mg/L
HFCS(42DE) 95.5g/L(特定の出発基質として所望によりグルコン酸またはグルコース)
成長条件は29℃及びpH6.0である。攪拌速度、逆圧及び気流は溶解酸素を0以上に維持するため必要に応じて調節する。
アスコルビン酸中間体の酸化経路を図10に表す。二酸化炭素生成量(CER)を測定することにより、異化経路に利用される炭素量が計算でき、従って唯一の源であるCO2の炭素は炭素基質から得られ、反応容器中にそれ以上の追加のCO2は供給されないので、異化経路と生産(酸化)経路の分離を測定できる。野生型生物を醗酵プロセス中利用する場合、異化生成物に対してCERで測定して63%のグルコースがアスコルビン酸中間体に変換され、37%が変換されなかった(図12)。研究の第2段階において、グルコキナーゼ発現をエンコードする核酸を野生型の条件下で実験を行った。図13に示すように、CO2発生量はCERで測定して約18%に減少した。従って、グルコース異化は減少した。しかし、完全に分離しているわけではない。供給源、すなわち炭素基質が異化経路に流用される経路の確認を試みると、グルコン酸が唯一の炭素源として与えられていた。図13Bに示すように図13Aと比較すると、グルコン酸はグルコースが炭素基質となったかのように、大体同じ量で異化されている。(83%のグルコン酸塩がアスコルビン酸中間体へ変換された。17%のグルコン酸が異化経路へ変換した(CERで測定して)。)表2も参照されたい。
グルコキナーゼ及びグルコノキナーゼの二重変異はほとんど全ての(約98%)グルコースから2,5−DKG経路をそれるようである。
フルクトースからグリセロールの生成
P.citreaがフルクトース由来の化学化合物を生成するために使用できることを説明するために、グリセロールをEmpatageらによって記載された手段を用いて生成した[Empatage,M.、Haynie,S.、Laffend,L.、Pucci,J.及びWhited,G.Process for the biological production of 1,3−propanediol with high titer.(高滴定量の1,3−プロパンジオールの生物学的生成のためのプロセス)、特許:国際公開番号WO0112833−A 41 2001年2月22日;E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY;ジェネンコア・インターナショナル社。]。簡潔に言うと、この方法は酵母由来の2つの酵素を用い、以下の反応に示すようにジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)をグリセロールに変換する。
Claims (5)
- 変異されたパンテアシトレア(Pantoea citrea)宿主細胞においてグルコースから2,5−ジケト−D−グルコン酸を生産する方法であって、
a)i)相同組換えにより内性グルコキナーゼ酵素をコードする酵素失活させる工程と、
ii)相同組換えにより内性グルコノキナーゼ酵素をコードする酵素を失活させる工程とを含む、パンテアシトレア宿主細胞を変異させる工程、
b)前記変異パンテアシトレア宿主細胞を、DKGの生産に好適な条件下で培養する工程、
c)前記変異パンテアシトレア宿主細胞の存在下でグルコースからDKGを生産させる工程を含み、
前記変異パンテアシトレア宿主細胞におけるDKGの生産が、同じ培養環境で育成した場合、対応する変異されていないパンテアシトレア宿主細胞と比較して高められていることを特徴とする方法。 - DKGを回収する工程を更に含む請求項1の方法。
- 前記宿主細胞を用いて内部酵素転換により、DKGから2−ケトLグルコン酸に転換する工程を更に含む請求項1又は2に記載の方法。
- 前記内性グルコキナーゼ酵素が配列番号2番で定義されるアミノ酸配列を含み、前記内性グルコノキナーゼ酵素が配列番号4で定義されるアミノ酸配列を更に含むことを特徴とする、請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。
- 前記内性グルコキナーゼ酵素が配列番号1番で定義される核酸配列を有し、前記内性グルコノキナーゼ酵素が配列番号3で定義される核酸配列を有することを特徴とする、請求項1乃至4のいずれかに記載の方法。
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