CN112154206A

CN112154206A - 丝状真菌中2-酮基-3-脱氧-d-葡萄糖酸的产生

Info

Publication number: CN112154206A
Application number: CN201980032798.9A
Authority: CN
Inventors: 莫莉·克雷布斯; 克里斯·菲利普斯; 费尔南多·瓦勒
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: BP Corp North America Inc
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2020-12-29
Also published as: US11708571B2; WO2019222226A3; BR112020023407A2; EP3794116A2; WO2019222226A8; WO2019222226A2; US20210214706A1

Abstract

提供了一种重组丝状真菌，其与未转化为具有降低的2‑酮基‑3‑脱氧‑葡萄糖酸(KDG)醛缩酶活性的丝状真菌相比，包括降低的KDG醛缩酶活性。还提供了一种产生KDG的方法。

Description

丝状真菌中2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸的产生

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2018年5月17日提交的美国专利申请序号62/672,719的优先权，所述美国专利申请的全部内容通过引用整体并入本文中。

序列表的并入

所附序列表中的材料特此通过引用并入本申请中。所附序列表文本文件名为BP17000_1WO_Sequence_Listing，创建于2019年5月14日并且为18kb。所述文件可以在使用Windows OS的计算机上使用Microsoft Word访问。

技术领域

本发明大体上涉及转化的丝状真菌，更具体地说，涉及产生2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)的方法。

背景技术

使用酮糖中间体产生呋喃衍生物例如呋喃二羧酸(FDCA)提供了使用从果糖中获得的5-羟甲基糠醛(HMF)的重要替代方案。某些糖酮中间体的优点之一在于，它们与果糖相比具有更高的获得呋喃糖构象的倾向，这对于产生FDCA或其他呋喃衍生物的进一步催化步骤而言是有利的。先前已经描述了几种酮糖衍生物在溶液中具有的呋喃糖构象的百分比(WO 2016/141148)。其中，2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸(KDG)是一种有趣的中间体，因为它比果糖更有效地形成呋喃糖环；并且因为它可以使用葡萄糖酸脱水酶通过单个酶促步骤从葡萄糖酸产生(Matsubara等,(2014))。此外，如图1和图2所示，KDG是在使用非磷酸化Entner-Doudoroff途径的微生物中葡萄糖酸分解代谢期间的正常中间体(Conway,T.(1992))；来自己糖醛酸分解代谢(Suvorova等(2011))；或来自果胶和藻酸盐的降解(HobbsJK.(2016))。

发明内容

本发明是基于以下发现：丝状真菌可用于经由发酵过程产生2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸(KDG)和其他糖酸衍生物。

因此，本公开提供了一种遗传修饰的丝状真菌，其与野生型丝状真菌相比包括降低的2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶活性。

在一个实施方案中，丝状真菌是曲霉属(Aspergillus)菌株。

在另一个实施方案中，丝状真菌是黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。

在另一个实施方案中，黑曲霉菌株是NRRL 322、NRRL 328、NRRL 566、NRRL 599或NRRL 2270。

在一个实施方案中，遗传修饰导致内源性KDG醛缩酶活性降低。

在另一个实施方案中，遗传修饰是突变。

在某些实施方案中，突变是移码突变、取代突变、插入突变、功能丧失突变、功能获得突变、失活突变、易位突变和/或缺失突变。

在另一个实施方案中，突变是在2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶基因的启动子区域、3'非翻译区、5'非翻译区和/或调节序列中。

在一个实施方案中，突变是在编码与SEQ ID NO:1具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性的多肽的核酸序列中。

在另一个实施方案中，突变是具有SEQ ID NO:2的核酸序列的基因的缺失。

在另一个实施方案中，突变是在编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的KDG醛缩酶的核酸序列中。

在另一个实施方案中，突变抑制包含SEQ ID NO:1的多肽的表达。

在另一个实施方案中，具有降低的2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶活性的酶具有EC4.1.2.51的分类。

本公开还提供了产生2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)的方法。所述方法包括用核酸序列转化丝状真菌；以及在培养基中培养转化的丝状真菌，其中在所述转化的丝状真菌中产生的KDG水平高于在未用核酸序列转化的丝状真菌中积累的KDG水平，从而产生KDG。

在一个实施方案中，核酸序列使编码KDG醛缩酶的基因失活，降低编码KDG醛缩酶的基因的表达或抑制编码KDG醛缩酶的基因的表达。在一个实施方案中，核酸序列整合到丝状真菌基因组中，和/或核酸序列引入移码突变、取代突变、插入突变、功能丧失突变、功能获得突变、失活突变、易位突变和缺失突变。

在另一个实施方案中，丝状真菌是曲霉属菌株。

在另一个实施方案中，丝状真菌是黑曲霉菌株。在另一个实施方案中，编码KDG醛缩酶的基因的核酸序列包含与SEQ ID NO:2的至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性。

在另一个实施方案中，KDG醛缩酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性。在另一个实施方案中，核酸序列包含SEQ ID NO:8。

在另一个实施方案中，KDG被转化为5-羟甲基呋喃甲酸(HMFA)和/或二羧酸(FDCA)。

本公开另外提供了包含SEQ ID NO:8的DNA构建体。

在一个实施方案中，DNA构建体包含异源核酸序列。

本公开还提供了用于表达2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶的表达载体，其中所述表达载体包括编码具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的DNA序列。

在一个实施方案中，表达载体表达包含SEQ ID NO:1的多肽。

本公开还提供了用于表达2-酮基-3-脱氧葡萄糖酸(KDG)醛缩酶的表达载体，其中所述表达载体包括与SEQ ID NO:2基本上相似的DNA序列。

本公开另外提供了减少丝状真菌中由2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸产生D-甘油醛的方法。所述方法包括用核酸序列转化丝状真菌；以及在培养基中培养转化的丝状真菌，其中所述转化的丝状真菌中由2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸产生的D-甘油醛水平与未用核酸序列转化的丝状真菌中由2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸产生的甘油醛水平相比降低，从而减少来自2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸的D-甘油醛。

在另一个实施方案中，丝状真菌是曲霉属菌株。

在另一个实施方案中，丝状真菌是黑曲霉菌株。

在某些实施方案中，编码KDG醛缩酶的基因的核酸序列包含SEQ ID NO:2。

在另一个实施方案中，KDG醛缩酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性。

根据以下描述和所附权利要求，本发明的其他方面和优点将变得显而易见。

附图说明

图1示出了一些微生物用于代谢不同糖类并使用KDG作为中间体的代谢途径的概要。

图2示出了一些微生物用于代谢葡萄糖和葡萄糖酸并使用KDG作为中间体的代谢途径和酶的概要。

图3示出了黑曲霉中的葡萄糖和葡萄糖酸同化作用，其基于基因组分析(Flipphi等,2009)和由Elzainy等,1973提出的KDG途径。如对于其他微生物所报道的(van Dijken等,2002)，虚线箭头指示了另一种可能的途径，其中γ-葡萄糖酸内酯首先被转运到细胞中，然后转化为葡萄糖酸。

图4 A-B示出了(A)所提出的在丝状真菌中的D-半乳糖醛酸降解途径(Martens-Uzunova,E.和Shcaap,PJ.2008)，和(B)2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸与2-酮基-3-脱氧-L-半乳糖酸之间的差异。两种分子上不同的羟基位置用虚线框指出。

具体实施方式

本发明是基于以下开创性的发现：丝状真菌可用于经由发酵过程产生2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸(KDG)和其他糖酸衍生物。

在描述本发明的方法和组合物之前，应理解，本发明不限于所描述的特定方法、组合物和实验条件，因为这些方法、组合物和条件可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于具限制性，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限制。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。以下阐述的定义是用于理解本公开，但是绝不应被认为取代对本领域普通技术人员所持有的对术语的理解。

除非上下文另外明确指出，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，不带具体数量的指称物包括复数个指称物。因此，例如，对“方法”的提及包括本文描述的类型的一个或多个程序/方法和/或步骤，这对于本领域技术人员在阅读本公开内容等之后将变得显而易见。

为了经由发酵过程产生KDG和其他糖酸衍生物的目的，丝状真菌如曲霉属和木霉属(Trichoderma)菌株是有吸引力的生产宿主，因为它们在商业水平上广泛用于产生酶和化合物如葡萄糖酸、柠檬酸和衣康酸。在这个意义上，来自黑曲霉的葡萄糖酸过度产生菌株被设想为开发KDG和KDG衍生物商业过程的良好起点，因为事实是葡萄糖酸可以经由葡萄糖酸脱水酶容易地转化为KDG。此外，在葡萄糖酸代谢期间，黑曲霉可能已经能够产生KDG作为正常中间体。然而，关于黑曲霉如何代谢葡萄糖酸的报道存在矛盾：Müller,HM.(1984和1985)报道了某些黑曲霉菌株通过首先将葡萄糖酸磷酸化以形成葡萄糖酸-6-磷酸而利用传统的戊糖途径。相反，Elzainy等(1973)和Allam等(1975)已表明，黑曲霉的其他菌株对D-葡萄糖酸的分解代谢是通过首先使D-葡萄糖酸脱水以形成KDG，其随后被KDG-醛缩酶切割，产生D-甘油醛和丙酮酸。这两种产物经由糖酵解途径进一步代谢。最近，黑曲霉和其他曲霉属物种的基因组分析没有揭示任何存在KDG形成途径的证据(Pel等,2007；Flipphi等,2009)。此外，这些作者提出了几种假定的葡萄糖激酶，其可负责经由正常的戊糖途径将葡萄糖酸转化为葡萄糖酸-6-磷酸。

因此，本公开提供了与野生型丝状真菌相比包括降低的2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶活性的遗传修饰的丝状真菌。

丝状真菌是真核生物体，包括曲霉属，特别是黑曲霉。黑曲霉菌株的具体实例包括NRRL 322、NRRL 328、NRRL 566、NRRL 599或NRRL 2270。

对本发明的丝状真菌进行遗传修饰以降低KDG-醛缩酶活性。对真菌进行遗传修饰的一种方法是通过突变，其中改变生物体基因组，从而降低KDG-醛缩酶活性。突变包括移码突变、取代突变、插入突变、功能丧失突变、功能获得突变、失活突变、易位突变和/或缺失突变。

突变发生在基因组的任何地方。具体而言，突变可以在基因的启动子区域、3'非翻译区、5'非翻译区和/或调节序列中。调节序列是核酸分子的区段，其能够增加或减少生物体内特定基因的表达。

在本发明中，突变可以在编码与SEQ ID NO:1具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性的多肽的核酸序列中。

另外，突变可以是具有SEQ ID NO:2的核酸序列的基因的缺失。突变也可以在编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的KDG醛缩酶的核酸序列中。另外，突变可以减少或抑制包含SEQ ID NO:1的多肽的表达。

此外，在本发明中，具有降低的2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶活性的酶具有EC4.1.2.51的分类。

在一个实施方案中，将核酸插入并整合到丝状真菌基因组中可以使编码KDG醛缩酶的基因失活或者减少或抑制编码KDG醛缩酶的基因的表达。

丝状真菌可以是曲霉属菌株，特别是黑曲霉菌株。另外，黑曲霉菌株可以是NRRL322、NRRL 328、NRRL 566、NRRL 599或NRRL 2270。

在本发明中，编码KDG醛缩酶的基因的核酸序列包含与SEQ ID NO:2的至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性。

另外，KDG醛缩酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性。

在本发明中，整合到丝状真菌基因组中的核酸序列包含SEQ ID NO:8。

所产生的KDG可以进一步修饰并转化为其他呋喃衍生物。可以通过本领域已知的化学方法将KDG转化为5-羟甲基呋喃甲酸(HMFA)和/或二羧酸(FDCA)。

本公开另外提供了包含SEQ ID NO:8的DNA构建体。在一个实施方案中，DNA构建体包含异源核酸序列。异源核酸序列是来源于另一生物体或细胞类型的核酸序列。

本公开提供了用于表达2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶的表达载体，其中所述表达载体包括编码具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的DNA序列。所述表达载体可以表达包含SEQ ID NO:1的多肽。本公开还提供了用于表达2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶的表达载体，其中所述表达载体包括与SEQ ID NO:2基本上相似的DNA序列。

本发明提供了扩增编码多肽的核酸的方法，所述方法包括使用能够扩增本发明的核酸序列或其片段或子序列的扩增引物序列对，对模板核酸进行扩增。

本发明提供了表达盒，其包含本发明的核酸或其子序列。在一个方面，表达盒可以包含可操作地连接至启动子的核酸。任选地，启动子可以是真菌、酵母、病毒、细菌、哺乳动物、植物、合成或杂合启动子。启动子可以是组成型启动子。在另一方面，启动子可以是诱导型启动子。在一个方面，启动子可以是组织特异性启动子或环境调节或发育调节的启动子。在一个方面，表达盒还可包含植物或植物病毒表达载体。

本发明提供了克隆运载体，其包含本发明的表达盒(例如载体)或本发明的核酸。克隆运载体可以是病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、细菌噬菌体或人工染色体。病毒载体可以包含腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体。克隆运载体可以包含细菌人工染色体(BAC)、质粒、细菌噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。

本发明提供了包含本发明的核酸或本发明的表达盒(例如载体)或本发明的克隆运载体的转化细胞。在一个方面，转化的细胞可以是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。

本发明提供了产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供与启动子可操作地连接的本发明的核酸；以及(b)在允许多肽表达的条件下表达步骤(a)的核酸，从而产生重组多肽。在一个方面，所述方法还可以包括用步骤(a)的核酸转化宿主细胞，然后表达步骤(a)的核酸，从而在转化的细胞中产生重组多肽。

本发明提供了编辑生物体基因组的方法。一种这样的方法是使用CRISPR。CRISPR-Cas9是一项独特的技术，其可通过去除、添加或改变DNA序列的部分来实现基因组部分的编辑。具体而言，将与合成的指导RNA(gRNA)复合的Cas9核酸酶递送到细胞中，使得可以在所需位置处切割细胞的基因组，从而去除现有的基因和/或添加新的基因。

本发明提供了对编码多肽的核酸中的密码子进行修饰的方法；所述方法包括以下步骤：(a)提供本发明的核酸；以及(b)鉴定步骤(a)的核酸中的密码子并将其用不同密码子代替，所述不同密码子与所代替的密码子编码相同的氨基酸，从而修饰核酸中的密码子。

本发明提供了产生本发明的核酸变体的方法。这些方法可以重复或以各种组合使用，以产生由模板或野生型核酸编码的具有改变的或不同的活性的多肽。这些方法也可以重复或以各种组合使用，例如以产生基因/信息表达、信息翻译或信息稳定性的变化。在另一个方面，通过例如离体修饰同源基因，然后将其重新插入细胞中来改变细胞的遗传组成。

在一个方面，术语“变体”是指在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基处(分别)修饰的本发明的多核苷酸或多肽，但仍保留本发明KDG的生物学活性。变体可以通过多种方式产生，包括例如以下方法：易错PCR，改组，寡核苷酸定向诱变，组装PCR，有性PCR诱变，体内诱变，盒式诱变，递归整体诱变，指数整体诱变，位点特异性诱变，基因重新组装，基因位点饱和诱变(GSSM)，合成连接重新组装(SLR)及其任何组合。

本发明的核酸可以通过任何方式改变。例如，随机或偶然方法，或非偶然或“定向进化”方法，参见例如美国专利第6,361,974号。用于基因随机突变的方法是本领域众所周知的，参见例如美国专利第5,830,696号。例如，诱变剂可用于随机突变基因。诱变剂包括例如紫外线或γ射线照射，或化学诱变剂，例如丝裂霉素、亚硝酸、光活化的补骨脂素，它们单独或组合使用，以诱导适于通过重组修复的DNA断裂。其他化学诱变剂包括例如亚硫酸氢钠、亚硝酸、羟胺、肼或甲酸。其他诱变剂是核苷酸前体的类似物，例如亚硝基胍、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤或吖啶。这些试剂可以代替核苷酸前体添加到PCR反应中，从而使序列突变。也可以使用插入剂，例如原黄素、吖啶黄、奎纳克林(quinacrine)等。

可以使用分子生物学中的任何技术，例如，随机PCR诱变，参见例如Rice(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5467-5471；或组合多盒式诱变，参见例如Crameri(1995)Biotechniques 18:194-196。或者，可以在随机或“偶然”片段化后重新组装核酸例如基因，参见例如美国专利号6,291,242；6,287,862；6,287,861；5,955,358；5,830,721；5,824,514；5,811,238；5,605,793。在替代方面，通过以下引入修饰、添加或缺失：易错PCR，改组，寡核苷酸定向诱变，组装PCR，有性PCR诱变，体内诱变，盒式诱变，递归整体诱变，指数整体诱变，位点特异性诱变，基因重新组装，基因位点饱和诱变(GSSM)，合成连接重新组装(SLR)，重组，递归序列重组，硫代磷酸酯修饰的DNA诱变，含尿嘧啶的模板诱变，缺口双链体诱变，点错配修复诱变，修复缺陷型宿主菌株诱变，化学诱变，放射诱变，缺失诱变，限制性选择诱变，限制性纯化诱变，人工基因合成，整体诱变，嵌合核酸多聚体产生和/或这些和其他方法的组合。

本发明还提供了通过天然过程如翻译后加工(例如磷酸化、酰化等)或通过化学修饰技术来修饰本发明的多肽的方法，以及所得的修饰多肽。修饰可以发生在多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定多肽的若干位点处。给定的多肽也可以具有许多类型的修饰。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价连接，血红素部分的共价连接，核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接，脂质或脂质衍生物的共价连接，磷脂酰肌醇的共价连接，交联环化，二硫键形成，去甲基化，共价交联形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟基化，碘化，甲基化，肉豆蔻酰化，氧化，聚乙二醇化，蛋白水解加工，磷酸化，异戊烯化，外消旋化，亚硒化，硫酸化和转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加如精氨酰化。参见例如Creighton,T.E.,《蛋白质—结构和分子特性(Proteins—Structureand Molecular Properties)》第2版,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；《蛋白质的翻译后共价修饰(Posttranslational Covalent Modification of Proteins)》,B.C.Johnson编,Academic Press,New York,第1-12页(1983)。如本文所用，“片段”是天然存在的蛋白质的一部分，其可以至少两种不同的构象存在。片段可以具有与天然存在的蛋白质相同或基本上相同的氨基酸序列。“基本上相同”是指氨基酸序列在很大程度上但不完全相同，但是保留了与其相关的序列的至少一种功能活性，例如仅具有保守的氨基酸取代。还包括具有与天然存在的蛋白质不同的三维结构的片段。这样的一个实例是“原形式”分子，例如低活性原蛋白，其可以通过切割来修饰以产生具有显著更高活性的成熟酶。

如本文所用，“片段”是天然存在的蛋白质的一部分，其可以至少两种不同的构象存在。片段可以具有与天然存在的蛋白质相同或基本上相同的氨基酸序列。“基本上相同”是指氨基酸序列在很大程度上但不完全相同，但是保留了与其相关的序列的至少一种功能活性，例如仅具有保守的氨基酸取代。还包括具有与天然存在的蛋白质不同的三维结构的片段。这样的一个实例是“原形式”分子，例如低活性原蛋白，其可以通过切割来修饰以产生具有显著更高活性的成熟酶。

术语“基本上相似”是指具有不会实质性影响核酸或氨基酸序列的序列变异的核酸或氨基酸序列。特定关于核酸序列，术语“基本上相似”意在是指编码区和控制表达的保守序列，并且主要是指编码相同氨基酸的简并密码子，或编码多肽中编码保守取代氨基酸的替代密码子。关于氨基酸序列，术语“基本上相似”通常是指不涉及结构或功能确定的多肽区域中的保守取代和/或变异。

术语“密码子优化的”是指已通过用一种或多种在宿主基因中更频繁使用的密码子代替至少一种或多于一种或大量的密码子而适合于在给定宿主的细胞中表达的核酸编码区。

本公开另外提供了降低丝状真菌中由2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸产生D-甘油醛的方法。所述方法包括用核酸序列转化丝状真菌；以及在培养基中培养转化的丝状真菌，其中所述转化的丝状真菌中由2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸产生的D-甘油醛水平与未用核酸序列转化的丝状真菌中由2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸产生的甘油醛水平相比降低，从而减少来自2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸的D-甘油醛。

将核酸插入并整合到丝状真菌基因组中可以使编码KDG醛缩酶的基因失活或者减少或抑制编码KDG醛缩酶的基因的表达。

本发明提供，编码KDG醛缩酶的基因的核酸序列包含SEQ ID NO:2。

本发明提供了分离的、合成的或重组的核酸，其包含与本发明序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性的核酸序列。例如，这样的序列包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8。本发明还包括前述序列的变体/修饰。

本发明中公开的方法和/或本领域普通技术人员已知的方法可用于分离核酸，所述核酸具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8所示的核酸序列具有至少99％、至少98％、至少97％、至少95％、至少90％、至少80％或至少70％同源性的序列，与其基本上相同的序列，或其包含至少10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900以上的连续碱基的片段，以及与任何前述序列互补的序列。同源性可使用比对算法来测量。例如，同源多核苷酸可具有编码序列，该编码序列是本文所述编码序列之一的天然存在的等位基因变体。当与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8所示的核酸序列或其互补序列相比时，此类等位基因变体可以具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加。

本发明的另一方面包括具有与本发明序列例如SEQ ID NO:1具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性的多肽。本发明还包括下面讨论的前述序列的变体/修饰。

另外，本发明中公开的方法可用于分离核酸，所述核酸编码与具有以SEQ ID NO:1所示的序列的多肽具有至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％或至少70％同源性的多肽，与其基本上相同的序列，或其包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250、300以上的连续氨基酸的片段，如使用序列比对算法(例如，具有默认参数的FASTA版本3.0t78算法)所确定的。

本发明的另一方面是分离的或纯化的多肽，其包含以SEQ ID NO:1所示的序列，与其基本上相同的序列，或其包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250、300以上的连续氨基酸的片段。如本发明中所公开的和/或本领域普通技术人员已知的，可以通过将编码多肽的核酸插入载体中，使得编码序列与能够驱动所编码的多肽在合适的宿主细胞中表达的序列可操作地连接，来获得这样的多肽。例如，表达载体可以包含启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的适当序列。

如下文所讨论，在来自5种不同黑曲霉菌株的细胞提取物中测量了显著的KDG醛缩酶酶活性。此外，在纯化该假定的KDG-醛缩酶之后，鉴定了这种酶的结构基因并使其失活，并且证实携带该KDG-醛缩酶缺失的黑曲霉菌株能够积聚KDG。这表明消除或减弱KDG-醛缩酶活性对于KDG过量产生的重要性。

总之，在5种不同的黑曲霉菌株中测量了KDG醛缩酶活性。

从一种菌株中纯化了具有KDG醛缩酶活性的酶；并且根据基于LC-MS/MS的蛋白质组学，鉴定了来自黑曲霉ATCC 1015的蛋白质G3Y6P2(SEQ ID NO:1)。该蛋白质序列在GenBank中注释为EHA21505，并由ASPNIDRAFT_214527(或Aspni5_214527)编码。所述蛋白质序列显示它是一种以前未知的酶，功能未知，在GenBank中注释为假设蛋白或二氢二吡啶甲酸合酶家族蛋白。与来自黑曲霉的2-酮基-3-脱氧-L-半乳糖酸醛缩酶相比，EHA21505具有43％同一性。如表5上所示，Blast搜索表明该酶在其他黑曲霉近亲中是充分保守的。

基于基因EHA21505 DNA序列(SEQ ID:2)，构建缺失盒，其中用潮霉素B抗生素抗性标记(SEQ ID:8)代替EHA21505编码序列。该盒用于缺失下述实验室菌株中的基因。

与野生型菌株相比，含有EHA21505缺失的黑曲霉菌株显示小7倍的KDG-醛缩酶活性。

在含有葡萄糖酸作为唯一碳源的固体培养基上，KDG-醛缩酶缺失菌株显示出生长受损。

在具有葡萄糖酸作为唯一碳源的液体培养物中，缺失的菌株积累了大量的KDG，而野生型菌株在相同条件下则没有积累任何KDG。

合成了大肠杆菌密码子优化的基因，并将其克隆到表达载体中。来自携带该质粒的大肠杆菌菌株的细胞提取物显示出KDG-醛缩酶活性。

除了可能使用KDG来产生FDCA和其他呋喃衍生物外，KDG还可以用于葡萄糖酸和其他糖酸的类似用途，例如：(1)作为洗涤剂和饮料的螯合剂；(2)用于防垢应用；(3)作为除冰剂；(4)作为腐蚀抑制剂；(5)作为在精炼厂脱盐工艺中增强金属和胺去除的添加剂，等等。此外，由于KDG及其脱水衍生物具有至少2个羰基，因此对于当前和将来应用来说，其性能可能优于葡萄糖酸和其他糖酸。

提供以下实施例以进一步说明本发明的优点和特征，但无意限制本发明的范围。尽管它们是可能使用的典型实施例，但也可以替代地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。

实施例

实施例1

黑曲霉菌株的生长和细胞提取物的制备

将黑曲霉菌株NRRL 322、NRRL 328、NRRL 566、NRRL 599和NRRL 2270(NRRLCulture Collection)在马铃薯右旋糖琼脂糖板上形成孢子，然后将来自每个菌株的孢子接种到250mL烧瓶中的50mL马铃薯右旋糖肉汤中。将烧瓶在摇床培养箱中在30℃下在150rpm下温育并生长长达72小时。通过离心收集菌丝体，然后重悬于～40mL的Czapek Dox肉汤中，其中不包括蔗糖并且以5％葡萄糖酸钠作为唯一的碳源。使烧瓶返回30℃和150rpm的摇床培养箱中并温育长达48小时。然后经由超声处理来裂解细胞以产生细胞裂解物。使用PD-10柱上的凝胶过滤将裂解物缓冲液交换到200mM磷酸钠缓冲液pH 8.0中，以减少背景吸光度。

实施例2

黑曲霉裂解物的KDG醛缩酶测定

然后使用乳酸脱氢酶偶联反应测试裂解物，以分光光度法在340nm处监测NADH损失。用0.2mM NADH、4U/mL乳酸脱氢酶、10mM磷酸钠pH 7.0和适当体积的裂解物制备测定混合物。将所述混合物温热至30℃，并通过添加10mM的KDG-Li盐(Sigma p/n 12271)来引发反应。在比色杯中监测反应，并且每30秒读取读数，持续2分钟。菌株NRRL 328具有最高的KDG醛缩酶活性(参见表1)，并被选择用于进一步的生长和纯化。

表1.黑曲霉裂解物的KDG醛缩酶活性

	每分钟A340nm的降低
		无KDG	0.00562
无NADH	0.00058
		无酶	0.00088
菌株NRRL 322	0.01634
		菌株NRRL 328	0.02392
菌株NRRL 566	0.01086
		菌株NRRL 599	0.00696
菌株NRRL 2270	0.0197

实施例3

黑曲霉KDG醛缩酶的纯化

将黑曲霉菌株328接种到4×1L烧瓶中的200mL PD肉汤中，并在30℃和240rpm下生长46小时。通过离心收集菌丝体，然后将其重悬于200mL Czapek Dox肉汤中，其中以5％葡萄糖酸钠作为唯一的碳源，并返回到培养箱，持续44小时。收获菌丝体并超声处理以制备裂解物。将样品在60℃热处理15分钟并且通过在4℃下以10,000g离心15分钟来去除沉淀的蛋白质。将200mL体积的上清液与等体积的冷丙酮(-15℃)混合，并在4℃下轻轻混合10分钟。经由离心去除沉淀物并弃去，并且再加入200mL冷丙酮以形成第二沉淀物。

将该第二沉淀物干燥，然后重悬于缓冲液中，并装载在串联设置的两个5mL DEAE快速流动柱上。流动相是10mM磷酸钾pH 7.7，并且在40倍柱体积上以0至0.5M NaCl的梯度洗脱蛋白质。如前所述，在280nm处监测OD，并且收集级分并测定KDG脱水酶活性。然后将活性最高的级分合并以用于蛋白质组学分析。

实施例4

经由LC-MS/MS蛋白质组学鉴定KDG醛缩酶

经由胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析来自原始裂解物、第二丙酮沉淀物和DEAE柱中活性最高的级分的样品的蛋白质含量。含有活性最高的级分的样品含有富集丰度的肽，蛋白质在黑曲霉基因组数据库中注释为未表征蛋白质，登录号为G3Y6P2(SEQ ID NO:1)。在进一步研究后，相同序列的另一个注释是PFAM中的二氢吡啶甲酸合酶，PFAM是一类催化L-天冬氨酸4-半醛和丙酮酸缩合为4-羟基-四氢吡啶甲酸的酶。注意到该反应的逆向非常类似于已经观察到的活性，其中KDG的切割导致丙酮酸的产生。在进一步研究后，蛋白质G3Y6P2与来自乌达加瓦曲霉(Aspergillus udagawae)的假定的4-羟基-2-氧代戊二酸醛缩酶具有～76％序列同一性。为了进一步验证这是与KDG醛缩酶活性相关的蛋白质序列，使用相似的方案对蛋白质进行重新纯化，其中排除了丙酮沉淀以提高纯化产率，并使用更高分离度的MonoQ柱代替DEAE柱。在SDS-PAGE凝胶上分析活性最高的级分，并切除活性级分中的显著条带。胰蛋白酶消化物和LC-MS/MS证实最主要的条带实际上是G3Y6P2。

SEQ ID NO:1

>tr|G3Y6P2|G3Y6P2_ASPNA未表征蛋白质OS＝黑曲霉(菌株ATCC 1015/CBS113.46/FGSC A1144/LSHB Ac4/NCTC 3858a/NRRL 328/USDA 3528.7)GN＝ASPNIDRAFT_214527PE＝3SV＝1

MAITPRPLKPGIYVPTVAFFTSPNEDLDLSTTALHATYLAQAGVTGLVVQGSNGEAVHLSREERNLITSTTRRALDSHAPSAPLIVGCGAASTRETIQLCQDAAASGGDYTLILPPSYYKSLLSPKDLLDHFRLVASASPIPILVYNFPGASSGLDLSSDDILALAEHPNIVGVKLTCGNTGKLARIAAAAEPGFMTFGGSADFTLQTLVAGGHGVIGGVANLIPRLSVRVMELYQAGQVEEAQRLQAIVARADWQAIKGGFVAVKSALQTYRGYGALPRRPCVVPSEAQATAWKDSFAEAMELERQLEKQA

SEQ ID NO:2

ATGGCCATTACACCCCGCCCCCTCAAACCCGGCATCTACGTCCCAACCGTCGCCTTCTTCACCTCTCCCAACGAAGACCTCGACCTCTCCACCACCGCCCTCCACGCCACCTACCTCGCTCAAGCCGGCGTCACCGGTCTAGTCGTGCAAGGCAGCAACGGTGAAGCCGTCCACCTCAGCCGCGAAGAGCGCAACCTCATCACTTCCACCACCCGTCGCGCTCTCGACTCTCACGCCCCCTCCGCCCCGCTCATCGTCGGCTGCGGCGCCGCCTCCACCCGCGAGACCATCCAGCTGTGCCAAGACGCCGCCGCCTCCGGAGGCGACTATACCCTGATCCTCCCTCCCTCCTACTACAAATCCCTCCTCTCTCCCAAGGACCTTCTTGATCACTTCCGCCTCGTCGCCTCCGCCTCCCCCATCCCCATCCTGGTGTACAACTTCCCCGGCGCCTCTTCGGGCCTGGACCTCTCCTCCGACGACATCCTCGCCTTGGCGGAGCACCCCAACATCGTCGGCGTGAAGCTGACCTGTGGAAACACGGGTAAACTGGCGCGCATTGCCGCCGCCGCCGAACCCGGTTTCATGACCTTTGGTGGTTCCGCTGATTTCACTCTCCAGACGCTGGTGGCAGGCGGTCATGGAGTGATTGGCGGCGTGGCGAACCTGATCCCTCGTTTGAGTGTGCGCGTGATGGAGCTGTATCAGGCGGGACAGGTCGAAGAGGCCCAGCGGTTGCAGGCCATTGTAGCGCGTGCGGACTGGCAGGCTATCAAGGGTGGTTTTGTAGCGGTGAAGAGTGCGTTGCAGACGTACCGCGGATACGGAGCATTGCCGAGACGGCCGTGTGTGGTGCCGTCAGAGGCGCAGGCGACGGCGTGGAAGGATTCTTTTGCGGAGGCTATGGAGCTGGAGAGACAGTTAGAGAAGCAGGCCTAG

实施例5

假定的KDG醛缩酶EHA21505在大肠杆菌中的表达

为了确保黑曲霉KDG醛缩酶在大肠杆菌中的适当表达，获得了编码蛋白质G3YP2的大肠杆菌密码子优化基因，在此称为EHA21505或21505(SEQ ID NO:3)(Genewiz,SouthPlainfield,NJ)。

SEQ ID NO:3

ATGGCAATTACCCCTCGCCCGCTGAAGCCGGGCATTTACGTGCCGACCGTTGCCTTTTTCACCAGCCCGAATGAGGACCTGGACCTGAGCACCACCGCACTGCATGCAACCTATCTGGCACAGGCAGGTGTGACCGGCCTGGTTGTGCAGGGTAGCAATGGTGAAGCCGTGCATCTGAGCCGTGAGGAGCGTAACCTGATTACAAGCACCACCCGCCGTGCACTGGATAGCCATGCCCCGAGTGCCCCGCTGATCGTTGGTTGCGGTGCAGCAAGCACCCGCGAAACCATTCAGCTGTGTCAAGATGCAGCCGCCAGTGGCGGCGACTATACTCTGATCCTGCCGCCGAGCTACTACAAAAGCCTGCTGAGTCCGAAGGATCTGCTGGACCATTTTCGCCTGGTTGCCAGCGCAAGCCCGATTCCGATTCTGGTGTATAACTTTCCGGGCGCCAGTAGCGGTCTGGACCTGAGTAGCGATGATATTCTGGCACTGGCAGAGCATCCGAACATTGTGGGCGTGAAACTGACCTGCGGTAACACAGGCAAACTGGCACGTATCGCAGCCGCAGCAGAACCGGGTTTTATGACCTTTGGCGGTAGTGCCGACTTTACCTTACAGACCCTGGTTGCCGGTGGTCATGGTGTGATTGGCGGCGTGGCAAATCTGATTCCGCGCCTGAGCGTTCGTGTTATGGAGCTGTACCAGGCAGGTCAGGTGGAAGAAGCCCAGCGTCTGCAGGCCATTGTGGCACGTGCCGACTGGCAGGCCATTAAAGGCGGTTTTGTGGCCGTGAAAAGCGCCCTGCAGACCTACCGCGGTTATGGTGCACTGCCGCGTCGTCCGTGTGTGGTGCCTAGCGAAGCACAGGCCACCGCATGGAAAGATAGCTTTGCCGAGGCTATGGAACTGGAACGCCAGCTGGAAAAACAAGCCTAA

该基因被克隆到表达载体pTrcHis2B(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)的NcoI-HindIII位点中。该质粒命名为pTrc-An21505。

根据供应商提供的方案，将质粒pTrc-An21505转化到BL21大肠杆菌感受态细胞(EMD Millipore；Billerica,MA)中。含有质粒的BL21菌株被命名为大肠杆菌21505。载体pTrcHis2也被转化到BL21中作为对照。为了评估大肠杆菌中的KDG醛缩酶活性，将上述2个菌株接种到含有自动诱导液体培养基Studier ZYM-5052(Teknova；Hollister,CA)的摇瓶中。将烧瓶在摇动培养箱中于30℃和110rpm下温育24小时。培养后，将培养物在12500g下离心20分钟，并将团块在-80℃下储存过夜。为了制备细胞提取物，将团块解冻并在以下溶液中裂解：每克7ml的10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.3，与每毫升缓冲液7.5kU rLysozyme、每毫升缓冲液1ul苯甲酸酶核酸酶(EMD Millipore，P/N 70746)混合。将混合物在水浴中于60℃温育10分钟，然后以10000g离心20分钟。使用针对基于板的测定法进行修改的前述方法对裂解物的KDG醛缩酶活性进行测试。使用PD-10柱在10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.7)中将裂解物进行缓冲液交换。在96孔Costar板中监测测定反应，并每30秒读取读数，持续20分钟。测定中包括来自黑曲霉菌株NRRL 566的裂解物作为阳性KDG醛缩酶活性对照。如表2所示，表达21505基因的大肠杆菌菌株(BL21+pTrc-An21505裂解物)与大肠杆菌空载体菌株(BL21+pTrcHis2b)和背景对照相比具有更高的活性。大肠杆菌空载体菌株(BL21+pTrcHis2b)的活性最低，仅略高于“无KDF”背景对照。黑曲霉NRRL 566阳性对照的KDG醛缩酶活性最高。

表2.带有和不带有21505基因的黑曲霉和大肠杆菌裂解物中的KDG醛缩酶活性

描述	每分钟340nm下吸光度的降低
		未添加KDG	0.00296
未添加NADH	0.00071
		未添加细胞裂解物	0.00198
黑曲霉NRRL 566裂解物	0.01440
		BL21+pTrc-An21505裂解物	0.00851
BL21+pTrcHis2b裂解物	0.00323

实施例6

黑曲霉中EHA21505基因的失活

缺失盒的制备

构建缺失盒，使得DNA可以整合到基因组中的21505基因座处，从而用潮霉素B抗性基因取代21505基因。将21505上游和下游大约1000bp的区域克隆并连接到pBluescriptSK+质粒(Agilent；Santa Clara,CA)。使用以下引物克隆基因21505上游的区域：

SEQ ID NO:4

5'-CTTGATATCGAATTCGACGAGGTGGGATTATTGCTG-3'，和

SEQ ID NO:5

5'-CATCGTTTGCATCATCAGGGGATGGG-GAGAATGCG-3'，其被设计成引入EcoRI限制性位点。使用以下引物克隆21505的下游区域：

SEQ ID NO:6

5'-CACGGCTCAGACTCTCCCACATCTTCTACATACCCATC-3'，和

SEQ ID NO:7

5'-CTAGTGGATCCCCCGGGCGC-CTCATATTCCTCGATGC-3'。该引物还引入了XmaI限制性位点。使用黑曲霉泛素启动子和泛素终止子将潮霉素B抗性基因置于上游和下游片段之间(Punt等,1987)。使用In-Fusion HD Cloning Plus试剂盒(Clontech；Mountain View,CA)经由重叠PCR来组装由两个DNA片段和潮霉素B抗性基因构成的缺失盒。

完整缺失盒的DNA序列如下所示：

SEQ ID NO:8

CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCGACGAGGTGGGATTATTGCTGGCCAGCGGGCGGCGCGTCGAGGTCCGCCGGCGCAGGGGATGATGAGACGAGAGTTTGTAGGGCGTGGCAGCTGAGGAGGACGAGTTCTCCGTCGTGGTGGTGTCCAGCAGATCGGGGGAGCTTTTGCGACGGCGCGATGACGAGTGAGTCTGGAGACGAGCTCGCTTTGCAGGAGGCTCGGAGTCCGGCTGGTCGGGGGAATGGCCGTGATGAGGATCTCGTCGCAGGGAGACACGGACAGGCATCAGGGTGGTGGAGGTCATTCGGGAGGATCGAGGAGGGGAGAGGAATTGAGACGTGGGGGGAAAGAAAGGTCAGGAGGGATGCGTGCACGGCATGTCAGGGCCAGTCGGGGGCAATTCGGAGGATTGAAGTTGGCAGGAGGTTTTTTGGGCGAAGCTGAAGCACTCGAGAATCGCAGCTGCAGGTCTGGATGTGTTCCGGATTGGGAGGAGTTGAAAGTTGTATCTTTACGGATACCGCAGCAGGTATGTCTCAGTACCTGACAGGACAGGTGTTACCGCCAGGATGTATGATACCTGTCACAACGATACCTCACTGGACTAGCTTAACATACATACATACATCATACATCTTCACATCTTCACTCTTCTTCTACTGCATCAACTTCTGCGTGAAGCACTTCTAATTCATCCACCCCATTCACTCCTTTTCCGGCTCACCTCATTTCTCCGAGGAACCAATTCTCCGACGACTACCCCATTCCTCTACCATAATGCTTCCCAGCACGACGTGGGGGTGGGAGCTCCCCTGACTTGCCATAGGAGGGGATCTGCTGGAGAGAGTGTGGGGTGCGTGGGGGTTTGGCTGGATTGTTTTCTGCTCGACGCTGTCTGGATGGAGTCAACCGGCTCAATGTCCGACTCTCTCCCAACTTAACTGGAACTGTTTCCCCTCTTAGCCACCCACTGGCTTGCTTTCTTATATATCATGGCAACGACTTCCTCGTTGCTTTCCATCTGTCCTCCTCTTCTTCCTCCTCCTCCTTCCTCTTCCCCCGCATTCTCCCCATCCCCTGATGATGCAAACGATGAGCTGGTATATGACACTGGAATGCATGCAGTCATGGATACGATTCAGTGGGTGCCGGGCCAAAAGCGGGGCATTCCGGATGCGACGATCACCTGACCCATCTCCAGCCGCTAGCGATGGCCTAAGGCCACTTCCCGAGGCCGCGCCGTCGAGATAACAGCTGGAGAGGATCCCCTTCCCCCATCCTCCATCCTCCGATAAGGAATGCCCCCAACTCACACGTCATCGCCGTTGCTGCCGCCGCAAGGCCAGTTGTCGCATTCCCTCTCTGATCATCACCCCCCAGTTTACCTGGTGAGATGATACGAATTATCAATGAGAAGGCAAACAATATATAGACAGCAGAAACTCCGAGTTTCAACGGGTTCTATTTCAGGAACACGGCTGCGGTCTGGATTGGGTCGGGCTGAGATACCGACTGGTGGCGTCAGTGGCGGGTACGGACGGAGTCGTCCTGTCCGCTCGTAGACGCTTCCCCCGGACTGATATCAGGCCCCGGCAACCAACTGGCTTCGATTCCCCTCCCATGGCAGCAGCAGTGCCTACCACATGGGATCAGGCTTTTGCCTGTTGTTCTAAGTTTTGCAGACAGAATTTTCGTATGCGTTACCACTCTTTTTCTTTCAGCGACCATTCCCGTTGTAGTTGTAAACCCAATAATAGGTGGCTGCCGTGGGAGCCTGAGTCAACCCAACCAGAACCTTTCTAGTAGATTCTCCCTCCCAAGCGCTTCAGCAACGAAGCGTATTGGAGAACCAAATGACGCAGACCAGGCGGATTCCGGCGCAATAGCCGGATGGCAAGGGAATCCCCCAGGAGGTGCCAGAAGCGTCGCCCGAAAGGTACTTCGTCTGACAGGCTAACACCGCTCGGGCCAAGGTCCCTGCTGCTCTTTTCCCTTTATTGCGACTTGACCTCTAAGCCATTCCCTTGCATCACGTTATCTCACTGACCGATCCTCTGACTAAGGCGCTTCGCCTCCGCCTCCCCTCATTCACCTCCTCTCCTGACTACTTAAGCCTTCTCTTCCTTCCTTCCTCTACCAACCCTCCTTCATCCCTCATACCTCTCATCCTACCACTCACCTTCCGCGCATCGCCATCTGCGATTCTCTCCACAACAACTCCACCTAATCACATACACCATTAACTGCGCTTCTACAACATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAAAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCTTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTACATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGTGCCTTATTTTGATCTTTCTTCTTTAGCACGGCTCATCTACGGTTGAGTGGCCTGCATGGCGTTGGGACGGTTGTTTTATCGGTTTTATGACACGGATAAATTGGGCATACCTTAGGGTCACCATCTTCTATGGTGCCTTGCGACATTCTTTCACCTAGGAATCAATCCAATAATTATATTCCACCTGATATCTTGCTTGCACTGTTTCCTGTAGATTTAGTAGGACCGCCCGAAGTAGACCGCCACGCTAGCATAGACGTGGTCCACATGCAATTCAGGACGGCGTCCACCCCCTTACAGATCGTATGCGAAGAAATTAACTAGATAATAAAATGGCTTCATCTTCATCTTCATCTACCTATACAATCGCTAACAAGGAACTAATAGACATCGCAGGTGAGTCACCGTCTTCACCACCCGTATCTTAGCACGTGACTATACCGTCCCAAGGCGGCGTGGGACAGGAAAGTAGCTTCCATTCATGAACTCGACCTGAGAGAGCAGTTGCAGACGTGTAACACGCTGGAGATGTGAGCATCAGTCGTGATGCCCTCCTACTTCTACCACATTGCGATCGAATTATTTGCTCGCCCGCACTCTGACCTCCATGGCACCTACCCAGGCGTGGACAAGCACTCGACATCGCTATCCTTCGACTCCGCATGCGAAGCTCTACCCCCGTTCCAGAAGCGCCCCCGACACTCACCGTGGGCACATCGATCCTCTCGTCATCAAGCGCATGGGAAACACCCACGCCCCTCATCCAACACTTTCGCCGAAACCCACGGCTCAGACTCTCCCACATCTTCTACATACCCATCATCATCATCATCATCTATACAAACGGCAACACCAAATACGAATCAAACTCCACCCCACAATGAACCTCATGCACCTGCTCTTTCTCCCCCACATCCCCTCCCGATCCCTCCCCTTCCACCGGACCAAACTCCACCTCCGGATAACACAAATCACGCCCCGCCACCCTCAACATAATCCCCTCCCCAGCACCAAACACCATTCCCATCGGCCACAACGTAATATCAATCGGCACGATCTTTCCCGCCGGGATGCTCTCCGCCCGATCATGTCTATACACAATCTCATGCTCTGTCGAGAGCGTCTCGTCCCGTGTGACGGCGTGCGACGCACGCAGGAACCCCTGCGGTCCGAGCGTCTTGGCTGTGTTGACGTTGGGGACGGCGTCAACGGGCACGGGACACGGGTAGTTGAGGTGTTCGAGAAGCGTGCCGGTGGCGGAGATCTTGCGGATTTGCACGATGATGTCCATGTCTGTGTGGTGGGGGGTGGAGAGCCACAGATGTACGCGGGGGTACCCGGCTAACTGAGTGGGGGTGGGGAAGTGGAGGGTGAAGTCCTATTATTTGTTAGGAGATATTGAGAGAGAGGGTATGTTAAGGGGGAGACGTACGGAGGTGCCATGGAGGGCGGAATGGGTTGTTGAGGTGACTGTGCTTGGGAGAGAGGGTTGGAGGGTCTTGGTTGATGCGTTGAGGTAGAATTTCTTGAGCTCCTGCCGGGTTAATGGGTAGGTATGTTCGGGGCGTTCGAGGATGGTTGGCACAGAGCTGCCTTCGAATCCAAGGAGGGAGAGGCGCACCGGTGGTGTGCTTTCCCAGTCGTTGGGTGTGTTCTTAAGATAGCGGTCGAAGAAACGAGAGAGGTCGTCGACCATCTCGGGTCGGTATAGATCGTACCATTCTTGGTATGGGTGCACGCGGAGCCATTTTCGGGTGCTCTGGGCGGTGCGGAAGGTTTCGAAGGAGCCGCGCGTGTGCAGCATCGAGGAATATGAGGCGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC

在转化到黑曲霉中之前，用iProof聚合酶(Bio-Rad；Hercules,CA)通过PCR扩增所述缺失盒。

黑曲霉转化

根据Yelton等(1984)的方法并作出一些修改来进行转化。使用1×10⁶个NRRL 566孢子/mL接种曲霉完全培养基(ACMU2；1％酵母提取物、1％细菌蛋白胨、2.5％葡萄糖、11mMKH2PO4、7mM KCl，2mM MgSO4、5mM尿苷、5mM尿嘧啶、1×Hutner微量元素)并在摇动培养箱中在30℃和250rpm下生长17小时。经由miracloth过滤收集菌丝体，用渗透培养基(OM；1.2MMgSO4，10mM磷酸钠，pH 5.8)洗涤，并转移至1L烧瓶中，以与de Bekker等(2010)描述的酶混合液的变体组合。所述混合液由来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的0.15U/mL几丁质酶(Sigma，P/N C6137)、来自哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的裂解酶(Sigma，P/NL1412)、来自玛瑙螺(Helix pomatia)的β-葡萄糖醛酸苷酶(Sigma P/N G1512)和8毫升/克生物质的OM构成。通过将培养物在30℃和100rpm的摇动培养箱中放置2.75小时来生成原生质体。然后将原生质体与等体积的ST缓冲液(0.6M山梨糖醇、100mM Tris-HCl pH7.5)组合。将混合物以4000g离心15分钟，然后将所得原生质体层转移至新瓶中。将团块悬浮在残留的缓冲液中，并重复该程序以收集任何残留的原生质体。然后用冷的STC缓冲液(1M山梨糖醇、10mM Tris-HCl pH 7.5、10mM CaCl₂)和4100g离心速度洗涤原生质体两次，持续15分钟。用10％总体积的PTC(60％PEG4000、50mM CaCl₂、10mM Tris-HCl pH 7.5)、10％总体积的200mM金三羧酸(Gielesen，B.2013)制成原生质体悬浮液，并且将80％总体积的原生质体悬浮液与STC混合以使最终浓度达到4×10⁷原生质体/mL。

在圆底管中将PCR扩增的敲除盒DNA与原生质体悬浮液混合，并在冰上温育20分钟。缓慢加入PTC(60％w/v PEG 4000；10mM Tris-HCl，pH 7.5；50mM CaCl₂)，并将所述管在室温下温育10分钟。然后加入冷的STC并混合，接着在4℃下以3220g离心10分钟。将团块悬浮在残留的上清液中，并铺在选择板(PDA、1.2M山梨糖醇、潮霉素500μg/ml、5mM尿苷、5mM尿嘧啶)上。在30℃下温育5天后，将潮霉素抗性转化体转移至次级选择板(PDA、潮霉素500μg/ml、5mM尿苷、5mM尿嘧啶)，并在30℃下温育4天。

使用Phire Plant Direct PCR Master混合物(ThermoFisher，Waltham,MA)，通过PCR分析来自次级选择板的34个真菌菌落的21505基因缺失。靶向21505基因上游和下游区域的引物分别为5'-TCGTTGCTTTCCATCTGTCC-3'(SEQ ID NO:9)和5'-GTGGGGTGGAGTTTGATTCG-3'(SEQ ID NO:10)，当存在敲除盒时产生3.1kb产物，并且当仍存在21505基因时产生1.2kb产物。进行第二次PCR以测试敲除盒的适当靶向整合位置。引物靶向潮霉素B抗性标记5'-CGATCAGAAACTTCTCGACAGAC-3'(SEQ ID NO:11)和21505侧翼区域的上游区域5'-GATGTGATAGTGGGGGTGGAATC-3'(SEQ ID NO:12)，产生2.3kb产物。四个菌落显示出敲除盒在靶向位置的插入，以确认21505基因的缺失，并选择了三个分离株以用于进一步分析。

实施例7

黑曲霉敲除菌株中KDG-醛缩酶活性的测量

使用珠粒搅拌器和裂解缓冲液(Zymo Research，Irvine,CA，P/N D6001)制备了野生型黑曲霉菌株和三种敲除菌株分离株的细胞裂解物，并使用先前针对实施例5中所述的大肠杆菌21505活性测定所述的方法测试了KDG醛缩酶活性。如表3所示，野生型黑曲霉菌株NRRL 566具有可见的KDG醛缩酶活性(参见表3)，而敲除菌株仅显示出与“无KDG”背景吸光度类似的吸光度值。

表3.黑曲霉亲本和敲除菌株的KDG醛缩酶活性

	每分钟340nm下吸光度的降低
		无KDG	0.00116
无NADH	0.00008
		无酶	0.00091
野生型亲本菌株	0.01716
		敲除菌株分离株A	0.00179
敲除菌株分离株B	0.00151
		敲除菌株分离株C	0.00140

实施例8

KDG的定量

使用Dionex ICS-5000离子色谱系统分析培养上清液样品中的葡萄糖酸和KDG含量。所述仪器配备有Dionex IonPac AS11-HC柱和AG11保护柱。洗脱液发生器以2mL/min产生的以下氢氧化钾梯度用于从葡萄糖酸中分离KDG进行定量：2分钟内5mM至20mM，1分钟内20mM至50mM，50mM持续2分钟。将所述柱重新平衡至5mM持续3分钟。利用Dionex ASRS-Ultra4mm自动抑制器在248mA下在循环模式中将抑制电导率用于葡萄糖酸和KDG检测。电导池设置为35℃，检测器室设置为15℃并且柱室设置为30℃。将葡萄糖酸和KDG的固体标准物溶解在水中至20mM，并合并至储备浓度各为10mM。将标准储备溶液用水进一步稀释以产生以下浓度：5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156和0.078mM。所有样品和标准物的进样量均为10μL。注射前，将所有发酵样品在水中按1:50稀释。基线将分别在2.28分钟和2.52分钟时从柱上洗脱出的葡萄糖酸和KDG的峰分离。峰积分是通过应用软件特定算法实现的。根据标准曲线拟合来确定样品浓度。

实施例9

黑曲霉菌株的KDG产生

使三个含有21505敲除的分离株在基于葡萄糖酸的培养基中生长，并与亲本菌株一起评估以确定KDG是否积累。为此目的，将来自黑曲霉亲本菌株NRRL 566和21505敲除菌株的三个不同分离株的孢子用于在摇瓶中接种马铃薯右旋糖肉汤、5mM尿苷和5mM尿嘧啶的起始培养物。将烧瓶在摇动培养箱中在30℃和220rpm下生长48小时。然后将生物质生长转移至摇瓶中含3％葡萄糖酸钠作为唯一碳源的Czapek Dox肉汤中。使培养物在摇动培养箱中在30℃和220rpm下生长4天。然后收集培养肉汤，并以7500g离心20分钟以除去任何残留的生物质。如实施例8所述测定上清液中葡萄糖酸和KDG的浓度。如下表4所示，仅3个敲除菌株积累大量KDG，表明基因EHA21505参与黑曲霉中的KDG代谢。

表4.黑曲霉菌株培养物中的KDG积累

样品	KDG(mM)
		生长培养基	0
来自敲除分离株A的裂解物	11.4
		来自敲除分离株B的裂解物	10.2
来自敲除分离株C的裂解物	10.8
		来自黑曲霉NRRL 566野生型的裂解物	0

表5使用序列EHA21505的所得07-19-2017的BLAST结果

实施例10

为了改善黑曲霉中的KDG形成，可能需要增强葡萄糖酸脱水酶的活性。这可以通过在黑曲霉中表达异源葡萄糖酸脱水酶来实现，或者通过增强曲霉属菌株中已经存在的内源性(原生)葡萄糖酸脱水酶的表达来实现。但是，丝状真菌中的内源性葡萄糖酸脱水酶尚未被鉴定。然而，这种酶活性的存在对于黑曲霉和许多其他微生物中存在的非磷酸化葡萄糖酸降解途径是必不可少的。到目前为止，在细菌和古细菌中只有少数葡萄糖酸脱水酶已得到表征；并且已发现它们属于ILVD/EDD蛋白质家族(COG0129)。该家族包括参与短链氨基酸生物合成的二羟基酸脱水酶(DHAD)，并催化2,3-二羟基-3-甲基丁酸的脱水。DHAD在细菌中通常称为IlvD，或在真菌中通常称为ILV-3。COG0129还包含糖酸脱水酶，其参与己糖和戊糖的代谢，并包括D-木糖酸脱水酶、L-阿拉伯糖酸脱水酶、D-葡萄糖酸脱水酶和6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(EDD)。

预测特定基因组中基因功能的一种方法是寻找近亲中已表明活性的基因的同源物。例如，为了预测曲霉属中的基因功能，通常将来自酵母菌(Saccharomyces)、链孢霉(Neurospora)或青霉属(Penicillium)的已知基因用于此目的。在这个意义上，Oliver等(2012)对来自烟曲霉的DHAD进行了表征，并且发现该真菌具有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ILV-3的4个同源物(AfIlv3A、AfIlv3B、AfIlv3C和AfIlv3D)，ILV-3作为DHAD的功能已得到明确证实。使用基因缺失，Oliver等发现，AfIlv3A是烟曲霉中真正的DHAD。Oliver等未预测到AfIlv3B、AfIlv3C和AfIlv3D的功能。重要的是，该出版物还显示构巢曲霉也具有四个ILV-3同源物，而黑曲霉则具有七个同源物(Anig1-7)。基于该报道和其他报道，提议黑曲霉Anig5(XP_001397198)、Anig6(XP_001392062)和Anig7(XP_001394885)是糖酸脱水酶的良好候选物。特别地，与木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)D-葡萄糖酸脱水酶gnaD具有60％同一性、74％相似性的Anig5(Kim和Lee.2008)。由于GenBank中基因的重新注释和重命名，下表给出了Anig5、Anig6和Anig7的其他注释/名称。本领域技术人员可以确定用于注释黑曲霉菌株CBS 513.88的基因组的名称在其他黑曲霉菌株中可能不同。

表6黑曲霉中的注释

尽管已经根据特定的示例性实施方案和实施例描述了本发明，但是应当理解，本文公开的实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术人员可以在不脱离如所附权利要求书所示的本发明的精神和范围的情况下进行各种修改和变更。

参考文献

本文引用的所有参考文献，包括以下参考文献并且包括但不限于以下或本说明书其他部分提及的所有专利、专利申请和非专利文献，均通过引用整体并入本文中。

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US 7,125,704.

US 7,510,861.

US 8,383,375.

US 7,858,775.

序列表

<110> BP北美公司（BP CORPORATION NORTH AMERICA INC. ）

<120> 丝状真菌中2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸的产生

<130> BP1700-1WO

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 312

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 未表征蛋白质OS=黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 1

Met Ala Ile Thr Pro Arg Pro Leu Lys Pro Gly Ile Tyr Val Pro Thr

1 5 10 15

Val Ala Phe Phe Thr Ser Pro Asn Glu Asp Leu Asp Leu Ser Thr Thr

20 25 30

Ala Leu His Ala Thr Tyr Leu Ala Gln Ala Gly Val Thr Gly Leu Val

35 40 45

Val Gln Gly Ser Asn Gly Glu Ala Val His Leu Ser Arg Glu Glu Arg

50 55 60

Asn Leu Ile Thr Ser Thr Thr Arg Arg Ala Leu Asp Ser His Ala Pro

65 70 75 80

Ser Ala Pro Leu Ile Val Gly Cys Gly Ala Ala Ser Thr Arg Glu Thr

85 90 95

Ile Gln Leu Cys Gln Asp Ala Ala Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Leu

100 105 110

Ile Leu Pro Pro Ser Tyr Tyr Lys Ser Leu Leu Ser Pro Lys Asp Leu

115 120 125

Leu Asp His Phe Arg Leu Val Ala Ser Ala Ser Pro Ile Pro Ile Leu

130 135 140

Val Tyr Asn Phe Pro Gly Ala Ser Ser Gly Leu Asp Leu Ser Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ile Leu Ala Leu Ala Glu His Pro Asn Ile Val Gly Val Lys Leu

165 170 175

Thr Cys Gly Asn Thr Gly Lys Leu Ala Arg Ile Ala Ala Ala Ala Glu

180 185 190

Pro Gly Phe Met Thr Phe Gly Gly Ser Ala Asp Phe Thr Leu Gln Thr

195 200 205

Leu Val Ala Gly Gly His Gly Val Ile Gly Gly Val Ala Asn Leu Ile

210 215 220

Pro Arg Leu Ser Val Arg Val Met Glu Leu Tyr Gln Ala Gly Gln Val

225 230 235 240

Glu Glu Ala Gln Arg Leu Gln Ala Ile Val Ala Arg Ala Asp Trp Gln

245 250 255

Ala Ile Lys Gly Gly Phe Val Ala Val Lys Ser Ala Leu Gln Thr Tyr

260 265 270

Arg Gly Tyr Gly Ala Leu Pro Arg Arg Pro Cys Val Val Pro Ser Glu

275 280 285

Ala Gln Ala Thr Ala Trp Lys Asp Ser Phe Ala Glu Ala Met Glu Leu

290 295 300

Glu Arg Gln Leu Glu Lys Gln Ala

305 310

<210> 2

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

atggccatta caccccgccc cctcaaaccc ggcatctacg tcccaaccgt cgccttcttc 60

acctctccca acgaagacct cgacctctcc accaccgccc tccacgccac ctacctcgct 120

caagccggcg tcaccggtct agtcgtgcaa ggcagcaacg gtgaagccgt ccacctcagc 180

cgcgaagagc gcaacctcat cacttccacc acccgtcgcg ctctcgactc tcacgccccc 240

tccgccccgc tcatcgtcgg ctgcggcgcc gcctccaccc gcgagaccat ccagctgtgc 300

caagacgccg ccgcctccgg aggcgactat accctgatcc tccctccctc ctactacaaa 360

tccctcctct ctcccaagga ccttcttgat cacttccgcc tcgtcgcctc cgcctccccc 420

atccccatcc tggtgtacaa cttccccggc gcctcttcgg gcctggacct ctcctccgac 480

gacatcctcg ccttggcgga gcaccccaac atcgtcggcg tgaagctgac ctgtggaaac 540

acgggtaaac tggcgcgcat tgccgccgcc gccgaacccg gtttcatgac ctttggtggt 600

tccgctgatt tcactctcca gacgctggtg gcaggcggtc atggagtgat tggcggcgtg 660

gcgaacctga tccctcgttt gagtgtgcgc gtgatggagc tgtatcaggc gggacaggtc 720

gaagaggccc agcggttgca ggccattgta gcgcgtgcgg actggcaggc tatcaagggt 780

ggttttgtag cggtgaagag tgcgttgcag acgtaccgcg gatacggagc attgccgaga 840

cggccgtgtg tggtgccgtc agaggcgcag gcgacggcgt ggaaggattc ttttgcggag 900

gctatggagc tggagagaca gttagagaag caggcctag 939

<210> 3

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

atggcaatta cccctcgccc gctgaagccg ggcatttacg tgccgaccgt tgcctttttc 60

accagcccga atgaggacct ggacctgagc accaccgcac tgcatgcaac ctatctggca 120

caggcaggtg tgaccggcct ggttgtgcag ggtagcaatg gtgaagccgt gcatctgagc 180

cgtgaggagc gtaacctgat tacaagcacc acccgccgtg cactggatag ccatgccccg 240

agtgccccgc tgatcgttgg ttgcggtgca gcaagcaccc gcgaaaccat tcagctgtgt 300

caagatgcag ccgccagtgg cggcgactat actctgatcc tgccgccgag ctactacaaa 360

agcctgctga gtccgaagga tctgctggac cattttcgcc tggttgccag cgcaagcccg 420

attccgattc tggtgtataa ctttccgggc gccagtagcg gtctggacct gagtagcgat 480

gatattctgg cactggcaga gcatccgaac attgtgggcg tgaaactgac ctgcggtaac 540

acaggcaaac tggcacgtat cgcagccgca gcagaaccgg gttttatgac ctttggcggt 600

agtgccgact ttaccttaca gaccctggtt gccggtggtc atggtgtgat tggcggcgtg 660

gcaaatctga ttccgcgcct gagcgttcgt gttatggagc tgtaccaggc aggtcaggtg 720

gaagaagccc agcgtctgca ggccattgtg gcacgtgccg actggcaggc cattaaaggc 780

ggttttgtgg ccgtgaaaag cgccctgcag acctaccgcg gttatggtgc actgccgcgt 840

cgtccgtgtg tggtgcctag cgaagcacag gccaccgcat ggaaagatag ctttgccgag 900

gctatggaac tggaacgcca gctggaaaaa caagcctaa 939

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

cttgatatcg aattcgacga ggtgggatta ttgctg 36

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

catcgtttgc atcatcaggg gatggggaga atgcg 35

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

cacggctcag actctcccac atcttctaca tacccatc 38

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

ctagtggatc ccccgggcgc ctcatattcc tcgatgc 37

<210> 8

<211> 8040

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660

gccccccctc gaggtcgacg gtatcgataa gcttgatatc gaattcgacg aggtgggatt 720

attgctggcc agcgggcggc gcgtcgaggt ccgccggcgc aggggatgat gagacgagag 780

tttgtagggc gtggcagctg aggaggacga gttctccgtc gtggtggtgt ccagcagatc 840

gggggagctt ttgcgacggc gcgatgacga gtgagtctgg agacgagctc gctttgcagg 900

aggctcggag tccggctggt cgggggaatg gccgtgatga ggatctcgtc gcagggagac 960

acggacaggc atcagggtgg tggaggtcat tcgggaggat cgaggagggg agaggaattg 1020

agacgtgggg ggaaagaaag gtcaggaggg atgcgtgcac ggcatgtcag ggccagtcgg 1080

gggcaattcg gaggattgaa gttggcagga ggttttttgg gcgaagctga agcactcgag 1140

aatcgcagct gcaggtctgg atgtgttccg gattgggagg agttgaaagt tgtatcttta 1200

cggataccgc agcaggtatg tctcagtacc tgacaggaca ggtgttaccg ccaggatgta 1260

tgatacctgt cacaacgata cctcactgga ctagcttaac atacatacat acatcataca 1320

tcttcacatc ttcactcttc ttctactgca tcaacttctg cgtgaagcac ttctaattca 1380

tccaccccat tcactccttt tccggctcac ctcatttctc cgaggaacca attctccgac 1440

gactacccca ttcctctacc ataatgcttc ccagcacgac gtgggggtgg gagctcccct 1500

gacttgccat aggaggggat ctgctggaga gagtgtgggg tgcgtggggg tttggctgga 1560

ttgttttctg ctcgacgctg tctggatgga gtcaaccggc tcaatgtccg actctctccc 1620

aacttaactg gaactgtttc ccctcttagc cacccactgg cttgctttct tatatatcat 1680

ggcaacgact tcctcgttgc tttccatctg tcctcctctt cttcctcctc ctccttcctc 1740

ttcccccgca ttctccccat cccctgatga tgcaaacgat gagctggtat atgacactgg 1800

aatgcatgca gtcatggata cgattcagtg ggtgccgggc caaaagcggg gcattccgga 1860

tgcgacgatc acctgaccca tctccagccg ctagcgatgg cctaaggcca cttcccgagg 1920

ccgcgccgtc gagataacag ctggagagga tccccttccc ccatcctcca tcctccgata 1980

aggaatgccc ccaactcaca cgtcatcgcc gttgctgccg ccgcaaggcc agttgtcgca 2040

ttccctctct gatcatcacc ccccagttta cctggtgaga tgatacgaat tatcaatgag 2100

aaggcaaaca atatatagac agcagaaact ccgagtttca acgggttcta tttcaggaac 2160

acggctgcgg tctggattgg gtcgggctga gataccgact ggtggcgtca gtggcgggta 2220

cggacggagt cgtcctgtcc gctcgtagac gcttcccccg gactgatatc aggccccggc 2280

aaccaactgg cttcgattcc cctcccatgg cagcagcagt gcctaccaca tgggatcagg 2340

cttttgcctg ttgttctaag ttttgcagac agaattttcg tatgcgttac cactcttttt 2400

ctttcagcga ccattcccgt tgtagttgta aacccaataa taggtggctg ccgtgggagc 2460

ctgagtcaac ccaaccagaa cctttctagt agattctccc tcccaagcgc ttcagcaacg 2520

aagcgtattg gagaaccaaa tgacgcagac caggcggatt ccggcgcaat agccggatgg 2580

caagggaatc ccccaggagg tgccagaagc gtcgcccgaa aggtacttcg tctgacaggc 2640

taacaccgct cgggccaagg tccctgctgc tcttttccct ttattgcgac ttgacctcta 2700

agccattccc ttgcatcacg ttatctcact gaccgatcct ctgactaagg cgcttcgcct 2760

ccgcctcccc tcattcacct cctctcctga ctacttaagc cttctcttcc ttccttcctc 2820

taccaaccct ccttcatccc tcatacctct catcctacca ctcaccttcc gcgcatcgcc 2880

atctgcgatt ctctccacaa caactccacc taatcacata caccattaac tgcgcttcta 2940

caacatgaaa aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt 3000

cgacagcgtc tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt 3060

cgatgtagga gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa 3120

agatcgttat gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga 3180

cattggggaa ttcagcgaaa gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac 3240

gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat 3300

ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca 3360

aggaatcggt caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt 3420

gtatcactgg caaactgtga tggacgacac cgtcagtgct tccgtcgcgc aggctctcga 3480

tgagctgatg ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt 3540

cggctccaac aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga 3600

ggcgatgttc ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt 3660

ggcttgtatg gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc 3720

gccgcggctc cgggcgtaca tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt 3780

tgacggcaat ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc 3840

cggagccggg actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga 3900

tggctgtgta gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc 3960

aaaggaatag tgccttattt tgatctttct tctttagcac ggctcatcta cggttgagtg 4020

gcctgcatgg cgttgggacg gttgttttat cggttttatg acacggataa attgggcata 4080

ccttagggtc accatcttct atggtgcctt gcgacattct ttcacctagg aatcaatcca 4140

ataattatat tccacctgat atcttgcttg cactgtttcc tgtagattta gtaggaccgc 4200

ccgaagtaga ccgccacgct agcatagacg tggtccacat gcaattcagg acggcgtcca 4260

cccccttaca gatcgtatgc gaagaaatta actagataat aaaatggctt catcttcatc 4320

ttcatctacc tatacaatcg ctaacaagga actaatagac atcgcaggtg agtcaccgtc 4380

ttcaccaccc gtatcttagc acgtgactat accgtcccaa ggcggcgtgg gacaggaaag 4440

tagcttccat tcatgaactc gacctgagag agcagttgca gacgtgtaac acgctggaga 4500

tgtgagcatc agtcgtgatg ccctcctact tctaccacat tgcgatcgaa ttatttgctc 4560

gcccgcactc tgacctccat ggcacctacc caggcgtgga caagcactcg acatcgctat 4620

ccttcgactc cgcatgcgaa gctctacccc cgttccagaa gcgcccccga cactcaccgt 4680

gggcacatcg atcctctcgt catcaagcgc atgggaaaca cccacgcccc tcatccaaca 4740

ctttcgccga aacccacggc tcagactctc ccacatcttc tacataccca tcatcatcat 4800

catcatctat acaaacggca acaccaaata cgaatcaaac tccaccccac aatgaacctc 4860

atgcacctgc tctttctccc ccacatcccc tcccgatccc tccccttcca ccggaccaaa 4920

ctccacctcc ggataacaca aatcacgccc cgccaccctc aacataatcc cctccccagc 4980

accaaacacc attcccatcg gccacaacgt aatatcaatc ggcacgatct ttcccgccgg 5040

gatgctctcc gcccgatcat gtctatacac aatctcatgc tctgtcgaga gcgtctcgtc 5100

ccgtgtgacg gcgtgcgacg cacgcaggaa cccctgcggt ccgagcgtct tggctgtgtt 5160

gacgttgggg acggcgtcaa cgggcacggg acacgggtag ttgaggtgtt cgagaagcgt 5220

gccggtggcg gagatcttgc ggatttgcac gatgatgtcc atgtctgtgt ggtggggggt 5280

ggagagccac agatgtacgc gggggtaccc ggctaactga gtgggggtgg ggaagtggag 5340

ggtgaagtcc tattatttgt taggagatat tgagagagag ggtatgttaa gggggagacg 5400

tacggaggtg ccatggaggg cggaatgggt tgttgaggtg actgtgcttg ggagagaggg 5460

ttggagggtc ttggttgatg cgttgaggta gaatttcttg agctcctgcc gggttaatgg 5520

gtaggtatgt tcggggcgtt cgaggatggt tggcacagag ctgccttcga atccaaggag 5580

ggagaggcgc accggtggtg tgctttccca gtcgttgggt gtgttcttaa gatagcggtc 5640

gaagaaacga gagaggtcgt cgaccatctc gggtcggtat agatcgtacc attcttggta 5700

tgggtgcacg cggagccatt ttcgggtgct ctgggcggtg cggaaggttt cgaaggagcc 5760

gcgcgtgtgc agcatcgagg aatatgaggc gcccggggga tccactagtt ctagagcggc 5820

cgccaccgcg gtggagctcc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt gcgcgcttgg 5880

cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 5940

acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 6000

cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 6060

attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 6120

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 6180

caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 6240

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 6300

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 6360

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 6420

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 6480

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 6540

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 6600

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 6660

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 6720

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 6780

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 6840

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 6900

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 6960

tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 7020

aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 7080

tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 7140

ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 7200

gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 7260

gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 7320

taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 7380

tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 7440

ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 7500

tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 7560

ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 7620

tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 7680

ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 7740

aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 7800

actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 7860

aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 7920

tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 7980

aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 8040

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

tcgttgcttt ccatctgtcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

gtggggtgga gtttgattcg 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

cgatcagaaa cttctcgaca gac 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

gatgtgatag tgggggtgga atc 23

Claims

1.一种遗传修饰的丝状真菌，所述遗传修饰的丝状真菌与野生型丝状真菌相比具有降低的2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶活性。

2.如权利要求1所述的丝状真菌，其中所述丝状真菌是曲霉属(Aspergillus)菌株。

3.如权利要求2所述的丝状真菌，其中所述丝状真菌是黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。

4.如权利要求3所述的丝状真菌，其中所述黑曲霉菌株选自NRRL 322、NRRL 328、NRRL566、NRRL 599和NRRL 2270。

5.如权利要求1所述的丝状真菌，其中所述遗传修饰导致内源性KDG醛缩酶活性降低。

6.如权利要求1所述的丝状真菌，其中所述遗传修饰是突变。

7.如权利要求6所述的丝状真菌，其中所述突变选自移码突变、取代突变、插入突变、功能丧失突变、功能获得突变、失活突变、易位突变和缺失突变。

8.如权利要求6所述的丝状真菌，其中所述突变是在2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶基因的启动子区域、3'非翻译区、5'非翻译区和/或调节序列中。

9.如权利要求6所述的丝状真菌，其中所述突变是在编码与SEQ ID NO:1具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性的多肽的核酸序列中。

10.如权利要求6所述的丝状真菌，其中所述突变是具有SEQ ID NO:2的核酸序列的基因的缺失。

11.如权利要求6所述的丝状真菌，其中所述突变是在编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的KDG醛缩酶的核酸序列中。

12.如权利要求6所述的丝状真菌，其中所述突变抑制包含SEQ ID NO:1的多肽的表达。

13.如权利要求1所述的丝状真菌，其中具有降低的2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)醛缩酶活性的酶具有EC4.1.2.51的分类。

14.一种产生2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸(KDG)或呋喃衍生物的方法，所述方法包括：

用核酸序列转化丝状真菌；以及

在培养基中培养转化的丝状真菌，其中在所述转化的丝状真菌中积累的KDG或呋喃衍生物的水平高于未用所述核酸序列转化的丝状真菌中积累的KDG或呋喃衍生物的水平，从而产生KDG或呋喃衍生物。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述核酸序列使编码KDG醛缩酶的基因失活，减少编码KDG醛缩酶的基因的表达或抑制编码KDG醛缩酶的基因的表达。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述丝状真菌是曲霉属菌株。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述丝状真菌是黑曲霉菌株。

18.如权利要求14所述的方法，其中编码所述KDG醛缩酶的基因的核酸序列包含与SEQID NO:2的至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性。

19.如权利要求14所述的方法，其中所述KDG醛缩酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性。

20.如权利要求14所述的方法，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:8。

21.如权利要求17所述的方法，其中所述黑曲霉菌株选自NRRL322、NRRL 328、NRRL566、NRRL 599和NRRL 2270。

22.如权利要求14所述的方法，所述方法还提供了将KDG转化为5-羟甲基呋喃甲酸(HMFA)和/或二羧酸(FDCA)。

23.一种减少丝状真菌中由2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸产生D-甘油醛的方法，所述方法包括：

用核酸序列转化丝状真菌；以及

在培养基中培养转化的丝状真菌，其中所述转化的丝状真菌中由2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸产生的D-甘油醛的水平与未用所述核酸序列转化的丝状真菌中由2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸产生的甘油醛的水平相比降低，从而减少来自2-酮基-3-脱氧-葡萄糖酸的D-甘油醛。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述核酸序列使编码KDG醛缩酶的基因失活，减少编码KDG醛缩酶的基因的表达或抑制编码KDG醛缩酶的基因的表达。

25.如权利要求23所述的方法，其中所述丝状真菌是曲霉属菌株。

26.如权利要求23所述的方法，其中所述丝状真菌是黑曲霉菌株。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述黑曲霉菌株选自NRRL 322、NRRL 328、NRRL566、NRRL 599和NRRL 2270。

28.如权利要求23所述的方法，其中编码所述KDG醛缩酶的基因的核酸序列包含SEQ IDNO:2。

29.如权利要求23所述的方法，其中所述KDG醛缩酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或完全序列同一性。