CN102099466A - 在丝状真菌细胞中增加天冬氨酸蛋白酶的产生 - Google Patents

Abstract

描述了涉及丝状真菌细胞的组合物和方法，所述丝状真菌细胞经遗传改造以提供增加产生天冬氨酸蛋白酶，如PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd。还描述了用于制备改造的丝状真菌细胞的核酸和方法。

Description

在丝状真菌细胞中增加天冬氨酸蛋白酶的产生

优先权

本申请要求2008年7月29日提交的美国临时专利申请系列号61/084,491的优先权，此处以其整体引入作为参考。

技术领域

本发明组合物和方法涉及经过遗传改造的丝状真菌细胞，以提供增加产生天冬氨酸蛋白酶，包括PEPA同源物：PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd。

发明背景

遗传改造已经允许在用作工业生物反应器、细胞工厂和食品发酵的微生物中进行改良。改造的微生物产生的重要酶和蛋白质包括葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、纤维素酶、中性蛋白酶和碱性(或丝氨酸)蛋白酶、激素和抗体。

例如，具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶，如葡糖淀粉酶是用于生产化合物的重要工业酶，所述化合物如有机酸(例如，乳酸)、氨基酸(例如，谷氨酸)、蔗糖增甜剂产品(例如，葡萄糖和高果糖玉米糖浆)、醇(例如，乙醇)以及来自谷粒和谷物的淀粉底物的其它化合物。此外，在微生物发酵过程中，尤其是在同时糖化和发酵(SSF)过程中，当颗粒淀粉底物用作碳供给时需要酶来减少发酵中残留淀粉的量。

已经改造了丝状真菌(例如曲霉(Aspergillus)和木霉(Trichoderma)种)和某些细菌(例如芽孢杆菌(Bacillus)种)，以产生并分泌大量有用的蛋白质和代谢产物(参阅，例如Bio/Technol.5：369-76，713-19，和1301-04(1987)和Zukowski，“Production of commercially valuable products，”Doi和McGlouglin(编辑)Biology of Bacilli：Applications to Industry，Butterworth-Heinemann，Stoneham.Mass，第311-37页(1992))。

此处引入作为参考的美国专利号7,332,319涉及改造的丝状真菌宿主细胞，其包含编码具有GSH活性的酸稳定α淀粉酶(asAA)的异源多核苷酸。该宿主细胞系统可与葡糖淀粉酶组合使用，以提高淀粉水解和醇的产生。

然而，蛋白质降解的发生可以干扰异源蛋白质在遗传改造的细胞中的有效产生。因此，已经改造了丝状真菌，使某些蛋白酶的产生降低或失活。

此处引入作为参考的WO 97/22705涉及真菌，其不产生某些蛋白酶，并可用作产生易于被通常产生的蛋白酶水解降解的蛋白质的宿主。

此处引入作为参考的美国专利号5,840,570和6,509,171涉及突变体丝状真菌，其在天冬氨酸蛋白酶的基因中有缺陷，并且是用于产生异源多肽如凝乳酶的有用宿主。

此处引入作为参考的美国专利公开号2006/0246545涉及重组丝状真菌细胞，通过失活包括天冬氨酸蛋白酶基因pepAa、pepAb、pepAc和pepAd的染色体基因改造所述丝状真菌细胞用于产生异源蛋白质(例如，漆酶)。

天冬氨酸蛋白酶是胃蛋白酶样酶，其为肽酶A1家族的成员(参阅，例如Rawlings等，“MEROPS：the peptidase database，”Nucleic Acids Res.32：160-164(2004))。一般地，该酶家族包含三维结构与胃蛋白酶相近的蛋白质。所述三维结构具有氨基酸序列不同但折叠基本相似的两个结构域。催化位点在两个结构域的连接处形成，并含有两个天冬氨酸残基Asp32和Asp215(基于人的胃蛋白酶编号)，每个结构域中具有一个天冬氨酸残基(参阅，例如Blundell等，“The aspartic proteinases：an historicaloverview，”Adv.Exp.Med.Biol.436：1-13(1998))。根据胃蛋白酶样酶功能的公认机制(参阅，例如James，“Catalytic pathway of aspartic peptidases，”Handbook of Proteolytic Enzymes，Barrett，A.J.，Rawlings，N.D.，Woessner，J.F.(编辑)，Elsevier，London，第12-19页(2004))，Asp215带电荷，并且Asp32必须质子化用于催化。催化中心在酸性pH范围内显示活性。已经从灰葡萄孢菌(Botrystis cinerea)(参阅，例如ten Have等，“An asparticproteinase gene family in the filamentous fungus Botrytis cinerea containsmembers with novel features，”Microbiology 150，2475-89(2004))以及米曲霉(A.oryzae)(参阅，例如Machida等，“Genome sequencing and analysisof Aspergillus oryzae，”Nature 438：1157-61(2005))中鉴定了天冬氨酸蛋白酶。

已经在黑曲霉(A.niger)的NRRL3、ATCC 1015和CBS 513.88菌株的基因组序列中鉴定了天冬氨酸蛋白酶(即，肽酶A1家族的成员)的至少8个预测ORF(参阅，例如Wang等，“Isolation of four pepsin-likeprotease genes from Aspergillus niger and analysis of the effect ofdisruptions on heterologous laccase expression，”Fungal Genetics andBiology 45：17-27(2008)；Pel等，“Genome sequencing and analysis of theversatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88，”Nat.Biotechnol.25：221-31(2007))。已知这8个ORF中的一个，PEPA显著促进了黑曲霉中的酸性蛋白水解。已经发现缺失pepA基因将异源牛凝乳酶原的产量提高了高于66％(参阅，例如Berka等，“Molecular cloning and deletion ofthe gene encoding aspergillopepsin A from A.awamori，”Gene 86：153-62(1990))。已经显示黑曲霉中pepA编码的PEPA天冬氨酸蛋白酶(也称为“曲霉胃蛋白酶A”(aspergillopepsin A))构成了约80％的细胞外酸性蛋白水解活性(使用BSA作为宽底物测定蛋白水解活性)(参阅，例如van denHombergh et al.，“Disruption of three acid proteases in Aspergillusniger-effects on protease spectrum，intracellular proteolysis，anddegradation of target proteins，”Eur.J.Biochem.247：605-13(1997))。已经表明pepA基因中的缺陷减少了黑曲霉中过表达的奇甜蛋白的降解参阅，例如Moralejo等，“Overexpression and lack of degradation of thaumatin inan aspergillopepsin A-defective mutant of Aspergillus awamori containingan insertion in the pepA gene，”Appl.Microbiol.Biotechnol.54：772-77(2000))。

在多种曲霉基因组中鉴定的其它7个天冬氨酸蛋白酶ORF是pepA基因的同源物。这些pepA同源物基因中的4个是pepAa、pepAb、pepAc和pepAd，并报道了它们可分别编码424、426、453和480个氨基酸的蛋白质(参阅，例如Wang等，Fungal Genetics and Biology 45：17-27(2008))。发现pepA失活的黑曲霉菌株中pepAa、pepAb或pepAd的失活将异源漆酶的菌株分泌水平分别提高了约18.7％、37.0％和5.20％(参阅，例如Wang等，Fungal Genetics and Biology 45：17-27(2008))。

尽管已经显示它们的失活提高了异源蛋白质的产生，天冬氨酸蛋白酶是酸性蛋白酶，其为如乙醇生产和用于动物饲料生产的玉米浸渍应用中的有用工业酶。在丝状真菌细胞系统中产生大量单独的天冬氨酸蛋白酶，如PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd的能力提供可以给这些工业应用。

发明概述

在一些实施方案中，提供了丝状真菌细胞，其包含失活的pepA基因和重组基因，所述重组基因包含选自pepAa、pepAb、pepAc和pepAd的PEPA同源物。在一些实施方案中，所述重组基因包含选自SEQ ID NOs：7(pepAa扩增子)、9(pepAa^＊扩增子)、12(pepAb扩增子)、17(pepAc扩增子)、25(pepAd扩增子)、20(pepAd^＊扩增子)和27(pepAd^＊＊扩增子)的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组基因包含启动子序列和终止子序列。在一些实施方案中，所述重组基因包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepA同源物序列和塔宾曲霉(A.tubingensis)葡糖淀粉酶终止子序列。在一些实施方案中，所述重组基因被异源整合到细胞的染色体DNA中。

在丝状真菌细胞的一些实施方案中，pepA同源物编码细胞分泌的多肽。在一些实施方案中，pepA同源物编码与选自SEQ ID NOs：1(PEPAa)、2(PEPAb)、3(PEPAc)、4(PEPAd)、21(PEPAd^＊)、23(PEPAa^＊)和28(PEPAd^＊＊)的序列具有至少85％同一性的多肽。

在一些实施方案中，丝状真菌细胞以比相应的亲本菌株高至少约10％到约1000％的量分泌pepA同源物编码的多肽。在一些实施方案中，所述pepA同源物编码的多肽是丝状真菌细胞分泌的总蛋白质的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％，或甚至更高。

在丝状真菌细胞的一些实施方案中，细胞培养物上清液的蛋白酶活性比相应亲本菌株培养物上清液的蛋白酶活性高至少约0.5倍到约100倍。在一些实施方案中，在约pH 2.0时PEPA同源物的蛋白酶活性比在约pH3.0时高。

在一些实施方案中，所述丝状真菌细胞选自曲霉(Aspergillus spp.)、根霉(Rhizopus spp.)、木霉(Trichoderma spp.)和毛霉(Mucor spp)。在一些实施方案中，所述丝状真菌是选自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)、构巢曲霉(A.nidulans)、酱油曲霉(A.sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、A.kawachi和棘孢曲霉(A.aculeatus)的曲霉种(Aspergillus sp.)。

在一些实施方案中，提供用于产生酸性蛋白酶的方法，其包括：(a)提供包含失活pepA基因的丝状真菌细胞；(b)用包含选自pepAa、pepAb、pepAc和截短的pepAd的pepA同源物的重组基因转化所述细胞；和(c)在适合于表达所述重组基因的条件下培养所述细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括回收所述酸性蛋白酶。在所述方法的一些实施方案中，重组基因包含选自SEQ ID NO：7、9、12、17、20、25和27的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组基因包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepA同源物序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。

在一些实施方案中，提供分离的核酸，其包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepA同源物序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列，其中所述pepA同源物序列编码与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28的氨基酸序列具有至少85％同一性的多肽。在所述分离核酸的一些实施方案中，pepA同源物包含选自SEQ ID NO：7、12、17和20的核苷酸序列。

在一些实施方案中，提供用于产生酸性蛋白酶的方法，其包括：a)向丝状真菌细胞中引入核酸，其中所述细胞包含失活的pepA基因，并且其中所述核酸包含启动子序列、pepA同源物序列和终止子序列；和b)在适合于产生酸性蛋白酶的条件下培养所述细胞。在一些实施方案中，进行所述方法，其中向丝状真菌细胞中引入核酸包括用载体转化细胞，并且在一些实施方案中，其中所述载体是质粒。在一些实施方案中，所引入的质粒选自pGAMD-pepAa、pGAMD-pepAb、pGAMD-pepAc、pGAMD-pepAd、pGAMD-pepAd^＊、pGAMD-pepAa^＊和pGAMD-pepAd^＊＊。

在一些实施方案中，提供包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepA同源物序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列的载体，其中所述pepA同源物序列编码与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28的序列具有至少85％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述载体包含选自SEQ ID NO：7、9、12、17、20、25和27的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述载体是质粒，并且在一些实施方案中，所述质粒包含具有pepA同源物序列插入片段的pGAMD质粒。在一些实施方案中，所述质粒选自pGAMD-pepAa、pGAMD-pepAb、pGAMD-pepAc、pGAMD-pepAd、pGAMD-pepAd^＊、pGAMD-pepAa^＊和pGAMD-pepAd^＊＊。

在一些实施方案中，提供用于产生酸性蛋白酶的方法，其包括：(a)用质粒转化丝状真菌细胞，其中所述细胞包含失活的天然pepA基因，并且其中所述质粒包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepA同源物序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列；和(b)在适合于产生pepA同源物序列编码的蛋白质的条件下培养所述细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括回收酸性蛋白酶。在所述方法的一些实施方案中，pepA同源物序列编码与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28的序列具有至少85％同一性的多肽。在一个实施方案中，所述质粒包含选自SEQ ID NO：7、9、12、17、20、25和27的核苷酸序列。

在一些实施方案中，提供分离的核酸，所述核酸编码与SEQ ID NO：21具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或甚至更高同一性的多肽。

在一些实施方案中，提供与SEQ ID NO：21具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或甚至更高同一性的分离的多肽。

在一些实施方案中，提供酶组合物，所述酶组合物包含与SEQ ID NO：21具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或甚至更高同一性的多肽。

附图简述

图1描述了PEPAa氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2描述了PEPAb氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3描述了PEPAc氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。

图4描述了PEPAd氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图5描述了pepAa扩增子的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)，其包含编码PEPAa(SEQ ID NO：1)的pepAa基因核苷酸序列。

图6描述了pGAMD载体，其包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。

图7描述了10.4kb pGAMD-pepAa载体，其包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepAa序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。

图8描述了来自pGAMD-pepAa转化的黑曲霉GAP3菌株和非转化GAP3亲本菌株的上清液的SDS-PAGE凝胶图像(最右边泳道)。在GAP3对照泳道中未出现的圈起来的约55kD的宽条带归因于细胞分泌到上清液中的重组产生的PEPAa酶。认为重组PEPAa条带的宽度/异质性是蛋白质糖基化的原因。

图9描述了pepAa^＊(“截短的pepAa”)扩增子的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)，其包含pepAa^＊核苷酸序列。

图10描述了pepAb扩增子的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)，其包含编码PEPAb(SEQ ID NO：2)的pepAb基因核苷酸序列。

图11描述了10.3kb pGAMD-pepAb载体，其包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepAb序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。

图12描述了来自pGAMD-pepAb转化的黑曲霉GAP3菌株和非转化GAP3亲本菌株的孢子纯化菌株#1-3的上清液的SDS-PAGE凝胶图像(最右边泳道)。在GAP3对照泳道中未出现的圈起来的约47kD的条带归因于分泌到上清液中的重组产生的PEPAb酶。

图13描述了pepAc扩增子的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)，其包含编码PEPAc(SEQ ID NO：3)的pepAc基因核苷酸序列。

图14描述了10.4kb pGAMD-pepAc载体，其包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepAc序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。

图15描述了来自pGAMD-pepAc转化的黑曲霉GAP3菌株和非转化GAP3亲本菌株的孢子纯化菌株#12-2的上清液的SDS-PAGE凝胶图像(最右边泳道)。在GAP3对照泳道中未出现的圈起来的约60kD的宽条带归因于分泌到上清液中的重组产生的PEPAc酶。

图16描述了pepAd^＊(即，“截短的pepAd”)扩增子的核苷酸序列(SEQID NO：20)，其包含编码PEPAd^＊(SEQ ID NO：21)的pepAd^＊基因核苷酸序列。

图17描述了PEPAd^＊(即，“截短的pepAd”)蛋白质的氨基酸序列(SEQID NO：21)和缺失以形成PEPAd^＊的PEPAd的C末端GPI锚定序列(SEQID NO：22)。

图18描述了10.2kb pGAMD-pepAd^＊载体，其包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepAd^＊序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。

图19描述了SDS-PAGE凝胶图像，其泳道包括改造以过量产生重组PEPAd^＊蛋白质的四株不同孢子纯化黑曲霉菌株，以及GAP3对照和野生型黑曲霉13528菌株(CGMCC No.AS3.10145)的上清液。标记为Ad#9-2的泳道是pGAMD-pepAd^＊转化黑曲霉GAP3菌株的孢子纯化菌株。在GAP3对照泳道中未出现的圈起来的约60kD的宽条带归因于分泌到上清液中的重组产生的PEPAd^＊酶。

图20描述了pepAd扩增子的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)，其包含编码PEPAd(SEQ ID NO：4)的全长pepAd基因核苷酸序列。

图21描述了野生型13528菌株(CGMCC No.AS3.10145)、GAP3菌株和含有重组基因pepAa、pepAb、pepAc和pepAd^＊的孢子纯化黑曲霉菌株的蛋白酶活性(使用实施例7中描述的酪蛋白水解测定法测定)曲线。

图22描述了(A)野生型13528菌株；(B)GAP3菌株；(C)菌株PepAa#2-9；(D)菌株PepAb#1-3；(E)菌株PepAc#12-2和(F)菌株PepAd^＊#9-2的蛋白酶活性(使用实施例7中描述的酪蛋白水解测定法测定)相对于pH的曲线。

图23描述了(A)野生型13528菌株；(B)GAP3菌株；(C)菌株PepAa#2-9；(D)菌株PepAb#1-3；(E)菌株PepAc#12-2和(F)菌株PepAd^＊#9-2的蛋白酶活性(使用实施例7中描述的酪蛋白水解测定法测定)相对于温度的曲线。

图24描述了PEPAa^＊氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。

图25描述了pepAd^＊＊扩增子的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)，其包含编码突变体PEPAd^＊＊蛋白质(SEQ ID NO：28)的pepAd^＊＊核苷酸序列。

图26描述了PEPAd^＊＊氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。

图27描述了SDS-PAGE凝胶图像，其泳道包括来自改造以过量产生重组PEPAd^＊(泳道1)、PEPAd(泳道2)和PEPAd^＊＊蛋白质(泳道3)的三株不同孢子纯化的黑曲霉菌株的上清夜。用箭表示相应的蛋白质条带。

图28描述了野生型GAP3菌株、产生重组PEPAd^＊(3#和9#)、PEPAd(5#和8#)和PEPAd^＊＊(3#和7#)的孢子纯化的黑曲霉菌株的蛋白酶活性(使用实施例7中描述的酪蛋白水解测定法测定)的曲线。

发明详述

I.综述

本发明组合物和方法涉及丝状真菌细胞，如曲霉种的细胞，其具有失活的pepA天冬氨酸蛋白酶基因和整合的重组基因，所述重组基因是选自pepAa、pepAb、pepAc和pepAd的pepA的同源物，其中所述细胞产生由重组pepA同源物编码的天冬氨酸蛋白酶。该丝状真菌细胞以显著高于相应亲本细胞/菌株产生的天冬氨酸蛋白酶的量分泌重组编码的PEPA同源物酶。在一些实施方案中，测定为细胞培养物上清液的酪蛋白水解活性的PEPA同源物酶的产量比相应的亲本细胞/菌株高至少约0.5倍到约100倍。

在一些实施方案中，编码PEPA同源物酶的整合重组基因包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepA同源物序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。在一些实施方案中，所述整合重组基因包含选自SEQ ID NO：7、9、12、17、20、25和27的核苷酸序列。

本发明组合物和方法提供包含编码PEPA同源物酶的重组基因的质粒载体，所述重组基因包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepA同源物序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。在一些实施方案中，所述质粒载体中包含的重组基因包含选自SEQ ID NO：7、9、12、17、20、25和27的核苷酸序列。所述质粒载体可用于转化丝状真菌细胞(例如曲霉种)，产生具有包含pepA同源物序列的整合重组基因的细胞，所述细胞能够比相应的亲本菌株产生量多得多的PEPA同源物酶。

本发明组合物和方法还提供截短形式的PEPA同源基因pepAd。该截短的pepAd基因(即，“pepAd^＊”)已经缺失了其3′序列的部分，该部分编码C末端GPI锚定序列(SEQ ID NO：22)。与全长蛋白质PEPAd(SEQ IDNO：4)不同，截短的PEPAd^＊酶(SEQ ID NO：21)由转化的丝状真菌细胞分泌。

II.定义

此处参考的所有专利和出版物包括在这些专利和出版物中公开的所有序列明确引入作为参考。除非另有说明，此处所用的所有技术和科技术语具有本发明组合物和方法隶属领域的技术人员一般理解的相同意思(参阅，例如Singleton等，D_{ICTIONARY OF} M_{ICROBIOLOGY AND} M_OLECULARB_IOLOGY，第二版，John Wiley and Sons，New York(1994)；及Hale和Marham，T_HE H_ARPER C_OLLINS D_{ICTIONARY OF} B_IOLOGY，HarperPerennial，NY(1991)，两份参考文献为技术人员提供了此处所用许多术语的常用字典)。与此处描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于实践或测试本发明的组合物和方法。

期望每一公开的最大(或最小)数值界限包括每一更低(或更高)的数值界限，就如同明确描述了这种更低(或更高)的数值界限一样。此外，每一公开的数值范围旨在包括处于更宽数值范围内的每一更窄的数值范围，就如同明确描述了这种更窄数值范围一样。

在一些方面，本发明组合物和方法依赖于在遗传改造和分子生物学领域中使用的常规技术和方法。以下资源包括根据本发明说明书有用的重要通用方法的描述：Sambrook等，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL(第2版，1989)；Kreigler，GENE TRANSFERAND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)和Ausubel等，(编辑)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。这些通用参考文献为本领域技术人员提供了定义和方法。然而，并不旨在限制本发明的组合物和方法为所描述的任何特定方法、方案和试剂，因为这些都是可以变化的。

如此处所用，单数包括复数形式，除非上下文中另行明确指出。因此，例如，“一个宿主细胞”包括大量此类宿主细胞。

如此处所用，短语“至少”与一列数值或术语组合使用时表示应用到该列中的每一数值或术语。例如，短语“至少85％、90％、95％和99％的序列同一性”用于表示至少85％、至少90％、至少95％和/或至少99％的序列同一性。

如此处所用，术语“包含”与其同义词以其包含意义使用；即，等同于术语“包括”及其相应的同义词。

除非另有指出，分别以5′到3′方向从左到右书写核酸；以氨基到羧基方向从左到右书写氨基酸序列。

标题不旨在限制，一个标题下描述的多个方面或实施方案可以作为一个整体应用到说明书中。

如此处所用，当描述蛋白质和编码它们的基因时，用于基因的术语一般用斜体字书写，(例如，编码黑曲霉PEPA天冬氨酸蛋白酶的基因可表示为“pepA”)。用于蛋白质的术语一般不用斜体字书写，并且所有字母一般均大写，(例如，pepA基因编码的蛋白质可表示为“PEPA”)。

为了清晰性，定义了以下术语：

如此处所用，术语“来自”包括术语“起源于”、“获得自”、“从中获得”和“分离自”，并表示从天然存在核苷酸序列的或已经插入该核苷酸序列的细胞中产生由该核苷酸序列编码的多肽。

如此处所用，术语“天冬氨酸蛋白酶”或“天冬氨酸蛋白酶”指胃蛋白酶样蛋白酶，其为肽酶A1家族的成员(参阅，例如Rawlings等，“MEROPS：the peptidase database，”Nucleic Acids Res.32：160-64(2004))。术语“天冬氨酸蛋白酶”包括但不限于由黑曲霉基因：pepA、pepAa、pepAb、pepAc和pepAd编码的酶。

如此处所用，术语“PEPAx”指由pepA基因的同源物编码的蛋白质，所述pepA基因的同源物包括但不限于黑曲霉同源物：pepAa、截短的pepAa(pepAa^＊)、pepAb、pepAc、pepAd和截短的pepAd(pepAd^＊和pepAd^＊＊)。

如此处所用，术语“截短的”，如“截短的PepAx”指这样的酶，其中已经去除了至少一部分氨基酸序列，但剩余部分保留至少一些催化功能。

如此处所用，术语“天然的”或“内源的”对多核苷酸或蛋白质而言指在主题宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。

如此处所用，对细胞、核酸或蛋白质使用的术语“重组”表示已经通过使用载体引入天然的或异源的核酸或蛋白质进行修饰了的细胞、核酸或蛋白质，或来自如此修饰的细胞的细胞、核酸或蛋白质。因此，术语“重组PEPAx”、“重组表达的PEPAx”和“重组产生的PEPAx”指在表达引入细胞的pepAx基因的宿主细胞中产生的成熟PEPAx蛋白质序列。

如此处所用，术语“载体”指任何核酸分子，可以向该核酸分子中插入另外的核酸分子(例如，基因)并且可以将其引入细胞并在细胞中进行复制。因此，该术语指能够用于在不同宿主细胞之间转移遗传物质的任何核酸构建体(和，如果需要任何相关的递送系统)。许多原核和真核载体可以通过商业途径获得。选择适当的载体为本领域技术人员所知。

如此处所用，术语“质粒”指可用作载体向细胞中引入DNA的环形双链DNA构建体。质粒在许多细菌和一些真核生物中作为染色体外自主复制的遗传元件起作用。在一些实施方案中，可将一个或更多质粒整合到其中引入所述质粒的宿主细胞的基因组中。

如此处所用，术语“宿主”、“宿主细胞”或“宿主菌株”指可表达引入细胞中的DNA序列的细胞。示例性宿主细胞是曲霉种的那些细胞。

如此处所用，术语“丝状真菌细胞”指微小丝状真菌任何种的细胞，其可生长为多细胞丝状丝条，包括但不限于：曲霉(例如，米曲霉、黑曲霉、A.kawachi和泡盛曲霉)、木霉(Trichoderma spp.)(例如，里氏木霉(Trichoderma reesei)(之前划分为T.longibrachiatum，目前也称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum))；青霉(Penicillium spp.)、腐质霉(Humicola spp.)(例如特异腐质霉(Humicolainsolens)和灰色腐质霉(Humicola grisea))；金孢子菌(Chrysosporiumspp.)(例如，C.lucknowense)、胶霉(Gliocladium spp.)、镰孢菌(Fusariumspp.)、链孢霉(Neurospora spp.)、肉座菌(Hypocrea spp.)、根霉(Rhizopusspp.)、毛霉(Mucor spp.)和裸孢壳(Emericella spp.)(也参阅，Innis等，(1985)Science 228：21-26)。

如此处所用，术语“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状形式(参阅，Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY，Wiley，N.Y.和AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE FUNGI，第9版(2001)Kirk等，编辑，CAB International University Press，CambridgeUK)。这些真菌的特征在于具有壳多糖、纤维素和其它复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。所述丝状真菌在形态、生理和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长，并且碳代谢是专性需氧的。

如此处所用，“曲霉”或“曲霉属”包括“曲霉”属内所有的种，如本领域技术人员所知，包括但不限于黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、A.kawachi和构巢曲霉。

如此处所用，术语“木霉”或“木霉属”指先前或目前划分为木霉属的任何真菌属。

如此处所用，术语“失活的”在细胞的上下文中指具有一个或更多失活基因的宿主生物(例如黑曲霉细胞)。该术语旨在包括失活突变体或失活菌株的后代，并不限于细胞经受最初的失活手段(例如，最初转染的细胞)。

如此处所用，术语“失活”指基本防止一个或更多基因、其片段或同源物进行功能表达的任何方法，其中所述基因或基因产物不能发挥其已知功能。期望包括基因失活的任何手段，包括缺失、蛋白质编码序列的破坏、插入、添加、突变、基因沉默(例如RNAi基因、反义核酸等)等。因此，术语“失活的”如上所述指“失活”的结果。在一些实施方案中，“失活”导致细胞检测不到对应于失活基因的基因或基因产物的活性。在一些实施方案中，“失活”导致基因很少量或不进行功能表达，但仍然进行基因同源物的功能表达。因此，“失活的菌株”因同源基因可能显示部分有活性的表型。

如此处所用，术语“相应的亲本菌株”指失活的突变体来源的宿主菌株(例如原始和/或野生型菌株)。相应的亲本菌株可包括已经经过改造包括失活基因的菌株，例如具有失活pepA基因的黑曲霉的GAP3菌株。

如此处所用，术语“基因”表示参与产生多肽的DNA区段，并可包括编码区前面和后面的区域(例如，启动子、终止子、5′非翻译(5′UTR)或前导序列和3′非翻译(3′UTR)或尾随序列，以及各编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子))。

如此处所用，术语“同源物”、“基因同源物”或“同源基因”指具有同源序列并导致具有相同或相似功能的蛋白质的基因。所述术语包括通过物种形成(即，新物种发生)分离的基因(例如，直向同源物或直向同源基因)，以及已经通过遗传复制分离的基因(例如，旁系同源物或旁系同源基因)。

如此处所用，术语“同源基因”指当进行最佳比对用于比较时，与目标核苷酸或氨基酸序列具有至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或甚至更高序列同一性的核苷酸或多肽序列。在一些实施方案中，同源序列具有约80％到100％的序列同一性，在一些实施方案中，具有约90％到100％的序列同一性，并且在一些实施方案中，具有约95％到100％的序列同一性。

可使用本领域已知的标准技术测定序列同源性(参阅，例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482(1981)；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443(1970)；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)；Wisconsin Genetics Software Package中的程序如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Genetics Computer Group，Madison，WI)；和Devereux等，Nucleic Acid Res.12：387-395(1984))。

用于测定序列同源性的重要算法包括：PILEUP和BLAST(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-10，(1990)；和Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-87(1993))。PILEUP使用了Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化版本(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351-60(1987))。所述方法与Higgins和Sharp描述的方法类似(Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-53(1989))。有用的PILEUP参数包括默认空位权重3.00，默认空位长度权重0.10，和加权的终点空位。

特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参阅，Altschul等，Meth.Enzymol.266：460-80(1996))。WU-BLAST-2使用几个搜索参数，其中大多数设定为默认值。根据以下值设定可调参数：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且可根据特定序列的组成和针对其进行目的序列搜索的特定数据库的组成由程序本身建立。然而，可调整数值来提高灵敏度。通过将匹配的相同残基数除以比对区中“更长”序列的残基总数来确定氨基酸序列的百分之同一性。所述更长序列是在比对区中具有最多实际残基的序列(忽略为了使比对值最大而通过WU-Blast-2引入的空位)。

如此处所用，术语“整合”用于基因时表示掺合到宿主细胞的染色体DNA中。基因可进行异源或同源整合。例如，将对宿主细胞天然的重组形式的pepA同源基因插入到质粒中，用于转化细胞，并异源整合到宿主细胞的染色体DNA中。多个拷贝的质粒与丝状真菌细胞的染色体DNA异源重组，并能够表达，导致分泌的蛋白质在宿主细胞培养物上清液中产量增加。基因也可通过“同源重组”的过程进行整合，其中引入的(转化)DNA的同源区与宿主染色体的同源区排列在一起。随后，引入的序列在双交换中替换同源区之间的序列。

如此处所用，术语“启动子”指作用于指导下游基因转录的核酸序列。在一些实施方案中，启动子适合于表达想要基因的宿主细胞。“诱导型启动子”是在环境或发育调节下有活性的启动子。

此处所用，术语“终止子”指恰好位于基因编码区段下游以终止基因转录的核酸序列。

此处所用，当一条核酸序列与另外的核酸序列处于功能关系中时，核酸序列是“有效连接的”。例如，如果所得多肽表达为前蛋白，其中前导肽参与多肽的分泌，那么编码分泌前导肽(即，信号肽)的DNA有效连接编码多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么该启动子或增强子有效连接该编码序列；或者如果核糖体结合位点定位利于翻译，那么该核糖体结合位点有效连接编码序列。一般地，“有效连接”表示相连的DNA序列是邻接的，并且在分泌前导肽的情况下，所述连接的DNA序列邻接并处于可读相内。然而，增强子不必是邻接的。通过连接在便利的限制性酶切位点完成连接。如果这种位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头或连接体。

如此处所用，术语“核酸”指核苷酸或多核苷酸序列，及其片段或部分，以及双链或单链(无论代表的是有义链还是反义链)的基因组或合成来源的DNA、cDNA和RNA。应理解因为遗传密码的简并性，多个核苷酸序列可编码一个给定的蛋白质。

如此处所用，术语“DNA构建体”、“核酸构建体”、“表达盒”和“表达载体”指通过重组或合成手段产生的核酸分子，其可引入到宿主细胞或生物中(即“转化到宿主细胞中”)并转录。例如，DNA构建体可掺入到质粒中用于转化宿主细胞或生物。可使用PCR或任何其它合适技术在体外产生DNA构建体。转化DNA可包括待整合到宿主基因组中的基因，和/或可包括侧翼序列，如启动子、终止子、或同源盒。转化DNA构建体可包含添加到末端的其它非同源序列(例如，填充序列或侧翼序列)。可闭合末端，以便转化DNA构建体形成闭合环(即，质粒)。

如此处所用，“氨基酸序列”指肽或蛋白质，或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，用于指通过肽键连接的氨基酸残基的邻接链。

如此处所用，术语“表达”指在细胞或在体外反应中产生多肽的过程。所述过程包括基因的转录和翻译。所述过程也可包括所得多肽的分泌。

如此处所用，术语“过量产生”和“过量产生”对重组细胞而言指以分泌蛋白质总量至少约5％的量产生并分泌重组蛋白质的细胞。

如此处所用，术语“插入”和“添加”在氨基酸或核苷酸序列的上下文中指核酸或氨基酸序列的改变，其中与内源蛋白质产物或mRNA/染色体序列相比添加了一个或更多氨基酸残基。

如此处所用，在“向细胞中引入核酸序列”的上下文中，术语“引入”(过去式“引入的”)指适合于将核酸序列转移到细胞中的任何方法，包括但不限于转化、电穿孔、核显微注射、转导、转染(例如，脂质体介导的和DEAE-葡聚糖介导的转染)、与磷酸钙DNA沉淀物的温育、利用DNA包被的微粒进行的高速轰击、农杆菌介导的转化和原生质体融合。

如此处所用，“引入序列”指被引入宿主细胞中的DNA序列。所述引入序列可以是DNA构建体，可以编码一个或更多目的蛋白质(例如，天然蛋白质的重组形式)，可包括侧翼序列，如目的蛋白质附近的启动子和终止子，可以是功能或非功能基因和/或突变或修饰基因，和/或可以是选择标记基因。例如，所述引入序列可包括截短形式的pepAd基因。

如此处所用，“侧翼序列”或“侧翼区”指所讨论的序列上游或下游的任何序列(例如，对于基因A-B-C，基因B侧翼为A和C基因序列)。引入序列可以是编码蛋白质的序列，并且侧翼序列是启动子和终止子序列。所述引入序列每一侧可以是同源盒。所述引入序列和所述同源盒可包含每一侧为填充序列的单元。侧翼序列可存在于被侧翼序列的仅一侧(例如，5′或3′)或存在于每一侧。每一同源盒的序列优选对曲霉染色体的序列同源。这些序列指导新构建体整合到曲霉染色体的什么位置以及引入序列替换曲霉染色体的哪一部分。这些序列可指导新构建体整合到曲霉染色体的什么位置，而引入序列不替换染色体的任何部分。选择标记的5′和3′末端的侧翼可以是包含失活染色体区段部分的多核苷酸序列。侧翼序列可存在于被侧翼序列的仅一侧(例如5′或3′)，或存在于每一侧。

如此处所用，术语“选择标记”和“可选标记”指能够在宿主细胞中表达的核酸，其考虑到便于选择含有所述标记的那些宿主。因此，术语“选择标记”指提供指示宿主细胞已经吸收(例如已经成功转化有)目的引入核酸(例如失活基因)或已经发生其它反应的基因。通常，选择标记是赋予宿主细胞抗微生物抗性或代谢优势以允许含有外源DNA的细胞区别于在转化过程中未接受任何外源序列的细胞的基因。对本发明组合物和方法有用的选择标记包括，但不限于抗微生物抗性标记(例如，ampR、phleoR、specR、kanR、eryR、tetR、cmpR、hygroR和neoR；参阅例如Guerot-Fleury，Gene，167：335-37(1995)；Palmeros等，Gene 247：255-64(2000)；和Trieu-Cuot等，Gene，23：331-41(1983))、营养缺陷标记，如色氨酸、pyrG和amdS，和检测标记，如β-半乳糖苷酶。

如此处所用，术语“杂交”指如本领域所知，核酸的一条链通过碱基配对与互补链连接的过程。

如果两条序列在中等到高度严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，那么认为核酸序列与参考核酸/核苷酸序列“选择性杂交”。杂交条件基于核酸结合复合体或探针的解链温度(Tm)。例如，“最高严格性”一般出现在约Tm-5℃(在探针的Tm以下5°)；“高度严格性”在Tm以下约5-10℃；“中等严格性”在探针的Tm以下约10-20℃；“低严格性”在Tm以下约20-25℃。在功能上，最高严格条件可用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近似严格同一性的序列；而中等或低严格杂交可用于鉴定或检测多核苷酸序列同源物。

中等和高等严格杂交条件为本领域所熟知。高等严格条件的实例包括在约42℃下50％甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt’s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，随后在室温下2X SSC和0.5％SDS中洗涤两次，并在42℃下0.1X SSC和0.5％SDS中额外洗涤两次。中等严格条件的实例包括在37℃下包含20％甲酰胺、5X SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5X Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑精DNA的溶液中过夜温育，随后在约37-50℃下1X SSC中洗涤滤膜。本领域技术人员知道怎样调整温度、离子强度等，必要时调整如探针长度等因素。

如此处所用，术语“引物”指以纯化的限制性酶切消化物天然产生的或合成产生的寡核苷酸，当其置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(即，存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶，并在合适温度和pH下)能够作为合成起始点起作用。一般地，使引物单链化，以在扩增中实现最高效率。更经常的是，所述引物是寡聚脱氧核糖核苷酸。

如此处所用，术语“聚合酶链式反应(PCR)”指使用一对引物、DNA聚合酶和DNA聚合、解链和退火重复循环来扩增DNA链的方法(参阅，例如美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188，此处引入作为参考)。

如此处所用，术语“限制酶”指细菌酶，其在特定核苷酸序列上或特定核苷酸序列附近切割双链DNA。

如此处所用，“限制性位点”指给定限制性内切核酸酶识别并切割的核苷酸序列，并且经常是插入DNA片段的位点。在本发明组合物和方法的某些实施方案中，将限制性位点工程化到选择标记和DNA构建体的5′和3′末端中。

如此处所用，术语“分离的”和“纯化的”用于指从其天然结合的至少一种其它组分中取出的分子(例如，核酸或多肽)或其它组分。

如此处所用，术语“培养”指在液体或固体培养基中合适条件下培养微生物细胞的群体。在一个实施方案中，培养指淀粉底物，如包含颗粒淀粉的底物经发酵生物转化成终产物(通常在容器或反应器中)。发酵是通过微生物酶促并厌氧分解有机物以产生更简单的有机化合物。尽管发酵在厌氧条件下发生，但并不旨在将所述术语仅限制在严格的厌氧条件，因为发酵也在存在氧气下发生。

如此处所用，术语“接触”指将各种酶置于与各种底物足够接近的距离，以使酶能够将底物转化成终产物。本领域技术人员将认识到酶与各底物的混合溶液可实现接触。

如此处所用，术语“比活性”表示酶单位，定义为在特定条件下每单位时间内通过酶组合物转化成产物的底物摩尔数。比活性表述为单位(U)/mg蛋白质。

如此处所用，术语“酶单位”指在试验条件下每给定时间量内产生给定量产物的酶的量。在一些实施方案中，酶单位指在特定试验条件下每分钟产生1微摩尔产物的酶的量。

如此处所用，术语“产量”指使用所述组合物和方法产生的终产物或想要的终产物的量。在一些实施方案中，所述产量比使用本领域已知方法产生的产量高。在一些实施方案中，该术语指终产物的体积。在一些实施方案中，该术语指终产物的浓度。

III.用于在丝状真菌细胞中增加天冬氨酸蛋白酶产量的组合物和方法

描述了组合物和方法，其涉及经过遗传改造的丝状真菌细胞，以提供天冬氨酸蛋白酶，包括但不限于PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd的提高产量。这些组合物和方法的多个方面和实施方案有待描述。

用于产生PEPAx酶的重组丝状真菌细胞

在本发明组合物和方法的一些实施方案中涉及包含失活的天然pepA基因和整合的重组基因的丝状真菌细胞，所述整合的重组基因包含选自pepAa、pepAb、pepAc和pepAd的pepA同源物。

在一些实施方案中，整合的重组基因包含有效连接基因的启动子和/或终止子序列。在一些实施方案中，所述有效连接的启动子是黑曲霉葡糖淀粉酶启动子。在一些实施方案中，所述有效连接的终止子是塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子。

在一些实施方案中，整合的重组基因包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽与选自PEPAa(SEQ ID NO：1)、PEPAb(SEQ ID NO：2)、PEPAc(SEQ ID NO：3)、PEPAd(SEQ ID NO：4)、截短的PEPAd^＊(SEQ ID NO：21)、截短的PEPAa^＊(SEQ ID NO：23)和截短的PEPAd^＊＊(SEQ ID NO：28)的序列具有至少85％的同一性。

在本发明组合物和方法的一些实施方案中，整合的重组基因包含与选自SEQ ID NO：7、9、12、17、20、25和27的序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核苷酸序列。

在一个实施方案中，丝状真菌选自曲霉、根霉、木霉和毛霉。在一个实施方案中，丝状真菌是选自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、构巢曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、A.kawachi和棘孢曲霉的曲霉。

在一些实施方案中，整合的重组基因是pepA的同源物。本发明组合物和方法使用的基因同源物与pepA具有相同或相似的功能(即编码具有相同或相似功能的多肽)并具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高的序列同一性。

在一些实施方案中，除了重组pepA同源基因整合到丝状真菌细胞中外，所述细胞还包括pepA同源基因的天然发生(即，野生型的)形式。例如，pepAa、pepAb、pepAc和pepAd均在黑曲霉基因组中发现了。然而一般情况下，细胞仅以非常少的量(例如，细胞分泌总蛋白质的＜1％)产生并分泌天然发生pepA同源基因编码的蛋白质。

在一些实施方案中，重组形式的pepA同源基因整合到具有失活pepA的丝状真菌细胞中，导致细胞过量产生分泌的蛋白质(例如，细胞分泌总蛋白质的＞5％)。在一些实施方案中，重组细胞以这样的量产生pepA同源蛋白质(即，PepAx)：其构成了细胞分泌总蛋白质的至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约12％、至少约15％、至少约20％或甚至更高。

本发明组合物和方法包括其中改造有额外失活基因的丝状真菌细胞，所述额外失活基因可额外提高细胞分泌的重组pepA同源蛋白质的量。在一些实施方案中，丝状真菌细胞可包括一个或更多额外的失活基因。所述额外的失活基因可包括但不局限于参与蛋白质降解或蛋白质修饰的那些，如ER降解途径中的蛋白质，蛋白酶基因，如分泌的丝氨酸和天冬氨酸蛋白酶基因、糖基化基因和糖蛋白降解基因。在一些实施方案中，所述额外的失活基因可选自以下的一个或更多个：derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepF、pepAa、pepAb、pepAc和pepAd。在美国专利公开号2006/0246545中描述了多个编码序列和这些基因的功能，以及制备和使用具有一个和更多失活基因的丝状真菌细胞的方法，所述专利出版物此处引入作为参考(参阅例如，Wang等，“Isolation of four pepsin-likeprotease genes from Aspergillus niger and analysis of the effect ofdisruptions on heterologous laccase expression，”Fungal Genet.Biol.45：17-27(2008)，其引入作为参考)。

pepAx同源基因

黑曲霉基因组的pepA同源基因pepAa、pepAb、pepAc和pepAd分别编码424(SEQ ID NO：1)、426(SEQ ID NO：2)、453(SEQ ID NO：3)和480(SEQ ID NO：4)个氨基酸的蛋白质。pepAx基因编码的四种氨基酸序列(即PEPAx蛋白质)与PEPA的比对显示这些蛋白质的功能区高度保守，例如，“Asp101-Thr102-Gly103”(使用PEPA编号)的活性位点基序。PEPA中的Asp156在PEPAc中不保守，如在一些其它天冬氨酸蛋白酶中所见，所述PEPAc在该位置上具有Glu残基(参阅例如，Capasso等，“Molecularcloning and sequence determination of a novel aspartic proteinase fromAntarctic fish，”Biochim.Biophys.Acta 1387：457-61(1998))。

这四种天冬氨酸蛋白酶“pepAx”基因在曲霉属中高度保守。已经在构巢曲霉、米曲霉和烟曲霉(A.fumigatus)中鉴定了pepAa、pepAb、pepAc和pepAd的推测的直向同源物。

使用ClustalW(参阅例如Thompson等，“CLUSTALW：improving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice，”Nucleic Acids Res.11：4673-80(1994))比较四条pepAx基因序列(pepAa、pepAb、pepAc和pepAd)与肽酶数据库(MEROPS)中列出的预测的天冬氨酸蛋白酶序列显示在丝状真菌的其它种中存在其它直向同源物。PEPAa蛋白酶看起来是先前从埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)(AF439995，未发表)和Scleotinia sclerotiorum(参阅例如Poussereau等，“aspS encodingan unusual aspartyl protease from Sclerotinia sclerotiorum is expressedduring phytopathogenesis，”FEMS Microbiol.Lett.194：27-32(2001))中鉴定的胃蛋白酶类型的天冬氨酸蛋白酶的直向同源物。PEPAb和PEPAc蛋白酶看起来是先前从富氏葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)(参阅例如，ten Have等，“An aspartic proteinase gene family in the filamentous fungusBotrytis cinerea contains members with novel features，”Microbiology150：2475-89(2004))中鉴定的天冬氨酸蛋白酶(BcAP1和BcAP5)的直向同源物。PEPAd的最近的直向同源物是来自Coccidioides posadasii(ABA54909，未发表)的天冬氨酰蛋白酶4。

在一些实施方案中，丝状真菌细胞包含整合的pepA同源基因，其中所述同源基因是来自丝状真菌细胞另一物种的直向同源基因。例如，本发明组合物和方法可提供构巢曲霉细胞，其中所述整合的重组pepA同源基因是来自黑曲霉的pepAa基因。

在一些实施方案中，本发明组合物和方法使用的pepAa基因同源物是丝状真菌细胞中的天然基因，其中所述基因编码与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28的序列具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至更高百分比氨基酸序列同一性的多肽。

在一些实施方案中，同源核苷酸序列可见于相关丝状真菌种中(例如黑曲霉和米曲霉(Aspergillus oryzae))并与选自SEQ ID NO：7、9、12、17、20、25和27的核苷酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至更高的百分比氨基酸序列同一性。

用于测定来自宿主细胞的同源序列的方法为本领域所知，并包括使用此处公开的核酸序列来构建寡核苷酸探针，所述探针对应于编码蛋白质的约6到20个氨基酸。所述探针然后可用于克隆所述同源基因。分离丝状真菌宿主基因组DNA并用适当的限制性内切酶进行消化。通过标准方法分离片段并用从蛋白质降解序列制备的寡核苷酸探针进行探测。分离通过与寡核苷酸探针杂交鉴定的对应于DNA区段的片段，并连接到适当载体上，然后转化到宿主中产生DNA克隆。

在一些实施方案中，本发明组合物和方法使用的基因同源物可具有编码通过一个或更多保守氨基酸替换不同于PEPA的氨基酸序列的核苷酸序列。在此类实施方案中，所述保守氨基酸替换包括但不限于甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；以及赖氨酸和精氨酸。

PEPAd GPI锚定序列的截短

曲霉PEPAd序列具有由约70个残基组成的保守C末端修饰。该延伸含有亲水的主要是丝氨酸残基的长的一段序列，以约20个疏水残基结束，其有利于胞外附着。用于鉴定真菌糖基磷脂酰肌醇(GPI)修饰基序的算法(参阅例如，Eisenhaber等，“A sensitive predictor for potential GPI lipidmodification sites in fungal protein sequences and its application togenome-wide studies for Aspergillus nidulans，Candida albicans，Neurospora crassa，Saccharomyces cerevisiae，and Schizosaccharomycespombe，”J.Mol.Biol.337，243-53(2004))预测PEPAd中的GPI修饰发生在具有S＞15高概率得分的Gly456处。此外，PEPAd在GPI修饰位点恰好上游处含有富含丝氨酸的一段序列。这些序列可能是O糖基化的靶标，其利于附着到黑曲霉的胞外葡聚糖基质上。

如截短和非截短形式PEPAd的构建和表达所示(参阅实施例5和6，如下描述)，去除62个氨基酸的C末端GPI锚定序列(SEQ ID NO：22)导致截短的PEPAd(SEQ ID NO：21)分泌到细胞上清液中。因此，该C末端序列可能提供了与膜的糖基磷脂酰肌醇连接，称为“GPI锚定”(参阅例如，Hamada等，“Screening for glycosylphosphatidylinositol(GPI)-dependent cell wall proteins in Saccharomyces cerevisiae，”Mol.Gen.Genet.258：53-59(1998))。

通过GPI锚定附着到细胞膜上的或包埋在菌丝基质中的PEPAd天冬氨酸蛋白酶可能提供了多种功能，如其它真菌水解酶的成熟、菌丝尖端附近宿主细胞壁蛋白质的蛋白水解。

本发明组合物和方法提供具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的截短的PEPAd(“PepAd^＊”)酶，其可通过宿主细胞大量分泌、纯化和分离。可考虑在pepAd截短的C末端序列中产生一系列突变，其可提供具有天冬氨酸蛋白酶活性的多种截短的PEPAd蛋白质。

本发明组合物和方法提供具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的突变体PEPAd(“PEPAd^＊＊”)酶，其可通过宿主细胞大量分泌、纯化和分离。突变包含PEPAd^＊＊，包含位于GPI锚定序列上的单个氨基酸Gly456的缺失。可考虑Gly456的缺失可破坏酶通过糖基磷脂酰肌醇连接细胞膜进行的附着。突变体因此可提供具有天冬氨酸蛋白酶活性的另一分泌的PEPAd蛋白质。

宿主丝状真菌细胞

在本发明组合物和方法中，宿主细胞是丝状真菌细胞(参阅例如，Alexopoulos，C.J.(1962)，I_NTRODUCTORY M_YCOLOGY，Wiley，New York)。本发明组合物和方法使用的丝状真菌细胞包括，但不限于：曲霉(例如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、构巢曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、A.kawachi和棘孢曲霉)；根霉、木霉(例如里氏木霉(先前划分为T.longibrachiatum，目前也称为红褐肉座菌)、绿色木霉、康宁木霉和哈茨木霉)；和毛霉(例如米黑毛霉(M.mieh ei)和微小毛霉(M.pusillus)))。在一些实施方案中，宿主细胞是黑曲霉细胞。

在一些实施方案中，丝状真菌宿主选自曲霉、木霉、镰孢菌(Fusariumspp.)和青霉(Penicillium spp.)。本发明组合物和方法使用的丝状真菌宿主细胞包括但不限于构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖镰孢和腐镰孢(F.solani)。

在一些实施方案中，宿主是木霉菌株，尤其是里氏木霉的菌株。里氏木霉的菌株是已知的，并且非限制性实例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767和NRRL15709。在一些实施方案中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37描述于Sheir-Neiss等(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53中。

在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是曲霉的菌株。本发明组合物和方法使用的特定曲霉菌株也公开于例如Ward等(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-43和Goedegebuur等(2002)Curr Gene 41：89-98中。其它重要的曲霉宿主菌株包括但不限于：构巢曲霉(Yelton等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-74；Mullaney等(1985)Mol.Gen.Genet.199：37-45；和Johnston等(1985)EMBO J.4：1307-11)；黑曲霉(Kelly等(1985)EMBO J.4：475-79)、泡盛曲霉(NRRL 3112，UVK143f；参阅例如美国专利号5,364,770，其引入作为参考)、ATCC No.22342、ATCC No.44733、ATCC No.14331和ATCC No.11490)和米曲霉(ATCC No.11490)及其衍生菌株。在一些实施方案中，曲霉菌株是pyrG突变体菌株，并因此需要尿苷用于生长。在一些实施方案中，曲霉宿主菌株表达并产生内源天冬氨酸蛋白酶。

在一些实施方案中，本发明组合物和方法可与黑曲霉的特定菌株一起使用，其包括ATCC 22342(NRRL 3112)、ATCC 44733、ATCC 14331及其衍生菌株。在一些实施方案中，宿主细胞能够表达异源基因。例如，宿主细胞可以是重组细胞，其产生异源蛋白质。在其它实施方案中，宿主是过量表达已经引入细胞中的蛋白质的宿主。

在一些实施方案中，宿主菌株是在除了pepA之外一个或更多蛋白酶基因中缺陷的突变体菌株。因此，本发明组合物和方法提供过量产生重组PEPAx酶的丝状真菌细胞的突变体菌株，其中相应的亲本菌株已经包括了失活pepA基因，和其它失活蛋白酶基因。

在一些实施方案中，先前已经通过遗传改造操作了宿主丝状真菌菌株。在一些实施方案中，所述遗传改造的宿主细胞或菌株可以是蛋白酶缺陷菌株。在其它实施方案中，已经降低或失活了丝状真菌宿主细胞多个天然基因的表达。这些基因包括例如编码蛋白酶和纤维素分解酶，如内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)的基因(例如，derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepF、pepAa、pepAb、pepAc、pepAd、cbh1、cbh2、egl1、egl2和egl3)。美国专利号5,650,322(其引入作为参考)公开了在cbh1基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37的衍生菌株。也参考美国专利号5,472,864和PCT公开WO05/001036，将每一文件引入作为参考。

具有失活pepA的丝状真菌宿主细胞

在一些实施方案中，本发明组合物和方法提供具有失活pepA基因的丝状真菌细胞菌株，其中整合了包含pepA同源基因的重组基因。在一个实施方案中，所述丝状真菌细胞来自具有失活pepA基因的黑曲霉的GAP3菌株(参阅例如Ward等Appl.Microbiol.Biotechnol，39：738-43(1993))。

亲本细胞中pepA基因的失活可通过任何合适的手段，包括在核酸基因序列中缺失、替换(例如突变)、破坏、插入，和/或基因沉默机制，如RNA干扰(RNAi)发生。在一个实施方案中，失活基因的表达产物是截短的蛋白质，所述蛋白质的生物学活性发生相应的改变。在一些实施方案中，所述失活导致基因的生物学活性丧失。在一些实施方案中，重组真菌细胞中失活基因的生物学活性实际上为零(即不能检测到)。在一些实施方案中，将保留一些剩余活性，但与相应亲本菌株中相同或同源基因的生物学活性相比经常低于约25％、20％、15％、10％、5％、2％或甚至更低。

在一些实施方案中，通过缺失完成失活，在其它实施方案中，通过破坏基因的蛋白质编码区完成失活。在一些实施方案中，通过同源重组失活所述基因。

在一些实施方案中，缺失可以是部分缺失，只要染色体中留下的序列使基因发生功能失活。在一些实施方案中，缺失突变体包含一个或更多基因缺失，其导致稳定且不可逆转的缺失。编码序列的侧翼区在5′和3′末端包括约1bp到约500bp。在一些实施方案中，所述侧翼区甚至长于500bp。最终结果是缺失的基因实际上没有功能。尽管在一些实施方案中不限制用于失活的方法，但通过缺失失活pepA基因。

在一些实施方案中，破坏序列包含向蛋白质编码区插入选择标记基因。通常，在体外将基因序列反向插入通过切割失活的基因的编码区序列，然后在限制性酶切位点处连接进行该插入。编码序列的侧翼区可以在5′和3′末端包括约1bp到约500bp。所述侧翼区甚至长于500bp。DNA构建体与宿主染色体的同源序列进行排列，并且在双交换事件中基因的翻译或转录被破坏。例如，apsB染色体基因与包含基因或部分基因编码序列和选择标记的质粒排列。在一些实施方案中，所述选择标记基因定位在基因编码序列内或在与基因分开的部分质粒上。载体进行染色体整合到宿主中，并且宿主的基因然后因存在插入编码序列中的标记而失活。

在一些实施方案中，以质粒作为载体以单交换事件插入失活基因。例如，载体整合到宿主细胞的染色体中，并通过在基因的蛋白质编码序列或基因的调节区插入载体来失活所述基因。

在备选实施方案中，失活归因于基因的突变。突变基因的方法为本领域所熟知，并包括但不限于定点突变、产生随机突变和缺口双链体方法(参阅例如，Moring等Biotech.2：646(1984)；Kramer等Nucleic Acids Res.12：9441(1984)；和美国专利号4,760,025，其引入作为参考)。

重组DNA构建体

在一些实施方案中，本发明组合物和方法包括DNA构建体，其包含引入序列，所述引入序列是pepA同源序列。在体外装配DNA构建体，随后将所述构建体直接克隆到感受态宿主(例如曲霉宿主)中，使得所述DNA构建体整合到宿主染色体中。例如，可使用PCR融合和/或连接在体外装配DNA构建体。

在一些实施方案中，所述DNA构建体掺入到载体中，所述载体是质粒。在一些实施方案中，使用环形质粒。在一些实施方案中，环形质粒被设计成在接触适当限制性内切酶时被线性化。

在一些实施方案中，引入序列包含pepA同源基因序列。同源序列是核酸序列，其编码与PEPA具有相似或相同功能并且与pepA同源基因具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或甚至更高核苷酸序列同一性的蛋白质。

在一些实施方案中，所述DNA构建体包含pepA同源物，并且侧翼序列包括约1bp到2500bp、约1bp到1500bp、约1bp到1000bp、约1bp到500bp、1bp到250bp的范围。

在一些实施方案中，所述DNA构建体包含pepA同源物和选择标记。在一个实施方案中，构巢曲霉amdS基因提供用于转化丝状真菌的选择标记系统。所述amdS基因编码在曲霉菌株中缺陷的乙酰胺酶，并为在乙酰胺培养基上生长的转化体提供阳性选择压力。所述amdS基因甚至可在已知含有内源amdS基因或同源物的真菌中用作选择标记，例如在构巢曲霉(Tilburn等1983，Gene 26：205-221)和米曲霉(Gomi等1991，Gene 108：91-98)中。通过在选择培养基中包括CsCl来抑制非转化体的背景amdS活性。

本领域中确定了用于在工业上重要的丝状真菌转化中使用amdS标记系统的方法(例如黑曲霉(参阅例如，Kelly和Hynes(1985)EMBO J.4：475-79；Wang等(2008)Fungal Genet.Biol.45：17-27)；产黄青霉(Penicillium chrysogenum)(参阅例如Beri和Turner(1987)Curr.Genet.11：639-41)；里氏木霉(参阅例如，Pentilla等(1987)Gene 61：155-64)；米曲霉(参阅例如，Christensen等(1988)Bio/technology 6：1419-22)；哈茨木霉(参阅例如，Pe′er等(1991)Soil Biol.Biochem.23：1043-46)；和美国专利号6,548,285，每一文件引入作为参考)。

在一个实施方案中，包含pepA同源序列的DNA构建体掺入到用于转化丝状真菌细胞的载体中(例如质粒)。通常，所述DNA构建体进行稳定转化，导致pepA同源基因非逆转的染色体整合。

用于DNA构建体体外构建并插入到合适载体中用于引入宿主细胞的方法为本领域所熟知。一般通过在便利的限制性酶切位点上进行连接完成序列的插入。如果不存在此类位点，可制备合成的寡核苷酸接头，并根据常规实践使用。(参阅例如，Sambrook(1989)上文，以及Bennett和Lasure，M_ORE GENE M_{ANIPULATIONS IN} F_UNGI，Academic Press，San Diego(1991)第70-76页)。此外，可使用已知的重组技术构建载体(例如，InvitrogenLife Technologies，Gateway Technology)。

在Sambrook等(1989)上文、Ausubel(1987)上文、van den Hondel等(1991)、Bennett和Lasure(编辑)M_ORE GENE M_{ANIPULATIONS IN} F_UNGI，Academic Press第396-428页和美国专利号5,874,276中提供了可用于实践组合物和方法的合适的表达和/或整合载体的实例。本发明组合物和方法使用的示例性载体包括pBS-T、pFB6、pBR322、pUC18、pUC100和pENTR/D。

在一些实施方案中，至少一个拷贝的DNA构建体整合到宿主染色体中。在一些实施方案中，多个拷贝的包含pepA同源物的DNA构建体整合到宿主染色体中。

载体

可构建本发明组合物和方法包含的DNA构建体(其包含编码pepA同源基因的核酸)以将pepA同源物转移到宿主细胞中。在一个实施方案中，使用载体将所述DNA构建体转移到宿主丝状真菌细胞中，所述载体包含有效连接编码PEPAx天冬氨酸蛋白酶的序列的调节序列。

载体可以是任何载体，当其引入真菌宿主细胞中时整合到宿主细胞基因组内并进行复制。合适的载体可见于美国专利号7,332,319，其引入作为参考。在一个实施方案中，用于将pepAx同源物构建体引入宿主细胞的载体是pGAMD载体，其包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、多克隆位点和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子，如美国专利号7,332,319中所公开(参阅图5A中的pSL898_MunI载体)。在下文实施例部分中描述了具有pepA同源基因序列的pGAMD载体的特定实施方案，包括pGAMD-pepAa、pGAMD-pepAa^＊、pGAMD-pepAb、pGAMD-pepAc、pGAMD-pepAd、pGAMD-pepAd^＊和pGAMD-pepAd^＊＊。

在本领域中可获得其它合适的载体，例如the Fungal Genetics StockCenter Catalogue of Strains中所述。在Sambrook等(1989)上文、Ausubel(1987)上文、van den Hondel等(1991)、Bennett和Lasure(编辑)MOREGENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press第396-428页和美国专利号5,874,276中提供了合适表达和/或整合载体的额外实例。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。

在一些实施方案中，编码PEPAx的核酸有效连接合适的启动子，其在丝状真菌宿主细胞中显示转录活性。所述启动子可来自编码对宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。在一些实施方案中，所述启动子可用于木霉宿主或曲霉宿主中。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、hfb1、hfb2、xyn1、spt1、pepA、glaA和amyA。

在一些实施方案中，所述启动子是对宿主细胞天然的启动子。例如，当里氏木霉是宿主时，所述启动子是天然的里氏木霉启动子。在优选的实施方案中，所述启动子是里氏木霉cbh1，其为诱导型启动子并已经保存于GenBank中检索号D86235下。在另一实施方案中，所述启动子是对真菌宿主细胞异源的启动子。

本发明组合物和方法使用的其它启动子包括，但不限于，以下基因的启动子：泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)(参阅例如，Nunberg等Mol.CellBiol.4：2306-15(1984)；美国专利号5,364,770和6,590,078(参阅例如，实施例3)，此处引入作为参考；Gwynne D.等BioTechnol.5：713-10(1987)；和Boel等EMBO J.3：1581-85(1984))；黑曲霉α淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1、里氏木霉纤维二糖水解酶1(参阅例如EP 0137280A1，其引入作为参考)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶和黑曲霉中性α淀粉酶。

在一些实施方案中，pepA同源基因编码序列有效连接信号序列。编码信号序列的DNA优选是与待表达的特定pepA同源基因天然结合的DNA。

在一些实施方案中，表达载体还包括终止序列(即，终止子)。所述终止子对宿主细胞可以是天然的或来自不同来源。在一个实施方案中，所述载体包含来自不同来源的终止子和启动子。在另一实施方案中，所述终止子对宿主细胞是同源的。本发明使用的丝状真菌细胞终止子包括来自黑曲霉、塔宾曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶基因的那些终止子(参阅例如Nunberg等Mol.Cell Biol.4：2306-15(1984)和Boel等EMBO J.3：1581-85(1984))。

在一些实施方案中，所述载体可包括选择标记。选择标记的实例包括但不限于赋予抗微生物抗性的选择标记(参阅例如潮霉素、博来霉素、氯霉素和腐草霉素)。赋予代谢优势，如营养选择标记的基因也可用于本发明的组合物和方法中，包括本领域中已知的那些标记，如amdS、argB和pyr4。可用于转化木霉和曲霉的载体系统中有用的标记为本领域所知(参阅例如，Finkelstein等BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI中第6章，编辑.Butterworth-Heinemann，Boston，Mass.(1992)；和Kinghorn等(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OFFILAMENTOUS FUNGI，Blackie Academic and Professional，Chapmanand Hall，London)。

在一些实施方案中，所述选择标记是amdS基因，其编码乙酰胺酶，允许转化细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。构巢曲霉amdS基因作为选择标记的用途(参阅例如，Kelley等EMBO J.4：475-79(1985)；和Penttila等Gene 61：155-64(1987))。在一些实施方案中，所述载体将包括黑曲霉pyrG基因作为选择标记，并且使用pyrG标记转化的曲霉菌株将为pyrG突变体菌株。

包含具有编码天冬氨酸蛋白酶的多核苷酸的DNA构建体的表达载体可以是能够在给定真菌宿主生物中自主复制或整合到宿主的DNA中的任何载体。在一些实施方案中，所述表达载体是质粒。在优选的实施方案中，涵盖了用于获得基因表达的两种类型的表达载体。第一个表达载体包含DNA序列，其中启动子、pepA同源物编码区和终止子均来源于待表达的基因。在一些实施方案中，通过缺失不想要的DNA序列(例如，编码不想要的结构域的DNA)以将待表达的结构域处于其自身转录和翻译调节序列的控制之下来获得基因截短。第二种类型的表达载体是预先装配好的，并含有高水平转录所需的序列和选择标记。

在一些实施方案中，将pepA同源基因的编码区或其部分插入到该通用表达载体中，使得其处于表达构建体启动子和终止子序列的转录控制之下。

用于连接DNA构建体并将它们插入合适载体中的方法为本领域所熟知，所述DNA构建体包含编码pepA同源物的多核苷酸、启动子、终止子和其它序列。一般通过在便利的限制性位点处进行连接完成连接。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头(参阅例如Sambrook(1989)上文，以及Bennett和Lasure，MORE GENEMANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press，San Diego(1991)第70-76页)。此外，可使用已知的重组技术构建载体(例如，Invitrogen LifeTechnologies，Gateway Technology)。

用于重组pepA同源物表达的启动子和终止子

在一个实施方案中，编码pepA同源物的核酸将有效连接合适的启动子，其在真菌宿主细胞中显示转录活性。所述启动子可来自编码对宿主细胞内源或异源的蛋白质的基因。所述启动子可以是截短的或杂合启动子。此外，所述启动子可以是诱导型启动子。通常，所述启动子可用于木霉宿主中。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、stp1和xyn1(参阅例如，EP 0 137 280 A1，其引入作为参考)。

在一个实施方案中，所述启动子是对宿主细胞天然的启动子。有用的启动子的其它实例包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因(glaA)(Nunberg等(1984)Mol.Cell Biol.4：2306-15和Boel等(1984)EMBO J.3：1581-85)；米曲霉TAKA淀粉酶；黑曲霉中性α淀粉酶；黑曲霉酸稳定α淀粉酶和突变体的基因的启动子、其截短的和杂合的启动子。

在一些实施方案中，多肽编码序列有效连接信号序列，该信号序列指导所编码的多肽进入细胞分泌途径。编码序列的5′末端可天然地含有在翻译可读框内天然连接编码所分泌多肽的编码区区段的信号序列。编码所述信号序列的DNA通常是与待表达的多肽天然结合的序列。通常，所述信号序列由黑曲霉α淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶编码。在一些实施方案中，所述信号序列是木霉cdh1信号序列，其有效连接cdh1启动子。

转化丝状真菌细胞

向宿主细胞中引入DNA构建体或载体包括多种技术，如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如脂转染介导的和DEAE-糊精介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀物温育；用DNA包被的微粒高速轰击；农杆菌介导的转化和原生质体融合。一般的转化技术为本领域所知(参阅例如，Ausubel等(1987)，上文，第9章；和Sambrook(1989)上文，Campbell等(1989)Curr.Genet.16：53-56和T_HE B_{IOTECHNOLOGY OF} F_ILAMENTOUSF_UNGI，第6章.编辑.Finkelstein和Ball(1992)Butterworth和Heinenmann，每一文件引入作为参考)。

在丝状真菌细胞表达系统中产生异源蛋白质也为本领域所知。例如，在Harkki等(1991)Enzyme Microb.Technol.13：227-33；Harkki等(1989)Bio Technol.7：596-603；EP 244,234；EP 215,594；和Nevalainen等″TheMolecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression ofBoth Homologous and Heterologous Genes″，M_OLECULAR I_NDUSTRIALM_YCOLOGY，(编辑)Leong和Berka，Ma rcel Dekker Inc.，NY(1992)第129-48页；和美国专利号6,022,725和6,268,328中描述了异源蛋白质在木霉中的表达，所述每一文件引入作为参考。

在Cao等(2000)Science 9：991-1001；和美国专利号6,509,171中描述了异源蛋白质在曲霉中的表达，将所述每一文件引入作为参考。

在一些实施方案中，用载体系统构建遗传上稳定的转化体，其中编码天冬氨酸蛋白酶(例如与选自SEQ ID NOs：1-4和21的序列具有至少90％同一性的PEPA同源物)的核酸整合到宿主菌株染色体中。然后通过已知技术纯化转化体。

在一个非限制性实例中，包括amdS标记的稳定转化体通过其更快的生长速率以及在含有乙酰胺的固体培养基上形成具有平滑而非粗糙轮廓的环形菌落而区分于非稳定转化体。此外，在一些情况下，可通过在固体非选择培养基(即，缺少乙酰胺的培养基)上培养所述转化体，从该培养基中回收孢子并测定随后在含有乙酰胺的选择培养基上萌发和生长的这些孢子的百分比进行进一步的稳定性测试。或者，本领域已知的其它方法可用于选择转化体。

在一个实施方案中，制备用于转化的木霉或曲霉涉及从真菌菌丝体制备原生质体(参阅例如，Campbell等(1989)Curr.Genet.16：53-56)。在一些实施方案中，从萌发的营养孢子中获得所述菌丝体。用消化细胞壁的酶处理菌丝体，产生原生质体。然后通过悬浮培养基中渗透稳定剂的存在保护所述原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。一般地，这些稳定剂的浓度在约0.8M到约1.2M之间变化。在一些实施方案中，优选使用山梨醇，并且在其它实施方案中，优选使用硫酸镁(例如在悬浮培养基中约1.2M山梨醇溶液或在悬浮培养基中约0.8M的硫酸镁溶液)。

DNA向宿主菌株中的吸收可能取决于钙离子浓度。一般地，约10mMCaCl₂到50mM CaCl₂可用于吸收溶液。除了吸收溶液中钙离子的需要，一般包括的其它化合物是缓冲系统，如TE缓冲液(10mM Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS，pH 6.0缓冲液(吗啉丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。

一般地，在转化中使用含有宿主细胞或原生质体，如木霉或曲霉原生质体或细胞的悬浮液，其已经以每ml约10⁵到10⁷，优选每ml约2x10⁶，还以约1x10⁷的密度进行了渗透处理。在一些实施方案中，在适当溶液(例如，1.2M山梨醇；50mM CaCl₂)中约100μL体积的这些原生质体或细胞与想要的DNA混合。在一些实施方案中，向吸收溶液中添加高浓度的PEG。可向原生质体悬浮液中添加0.1到1体积的25％PEG 4000。然而，优选向原生质体悬浮液中添加约0.25体积。也可向所述吸收溶液中添加添加剂，如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等并帮助转化。也可获得类似的方法用于其它真菌宿主细胞(参阅例如，美国专利号6,022,725和6,268,328，两者均引入作为参考)。

一般地，然后在大约0℃温育混合物10到30分钟的时间。可向混合物中添加额外的PEG，以进一步提高想要的基因或DNA序列的吸收。在一些实施方案中，以5到15倍转化混合物体积的体积添加25％PEG 4000；然而，更多和更少的体积都是合适的。所述25％PEG 4000优选是转化混合物体积的约10倍。加入PEG后，在添加山梨醇或CaCl₂溶液之前于室温或冰上温育所述转化混合物。然后向熔化的生长培养基的等分试样中进一步添加原生质体悬浮液。当所述生长培养基包括生长选择(例如，乙酰胺或抗生素)时，其仅允许转化体的生长。

细胞培养

丝状真菌细胞可以在常规培养基中生长。适当时可改良用于转化细胞的培养基，用于激活启动子并选择转化体。特定培养条件，如温度、pH等对本领域技术人员而言是显而易见的。

一般地，可在含有生理盐和营养物的标准培养基中培育细胞(参阅例如，Pourquie，J.等BIOCHEMISTRY AND GENETICS OFCELLULOSE DEGRADATION，编辑Aubert，J.P.等，Academic Press，第71-86页，1988和Ilmen，M.等(1997)Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306)。常见的商业上制备的培养基(例如Yeast Malt Extract(YM)培养液、Luria Bertani(LB)培养液和Sabouraud Dextrose(SD)培养液)也可用于本发明的组合物和方法。

培养条件也是标准的(例如，在摇动培养或发酵罐的适当培养基中大概28℃下培养培养物，直至达到想要水平的PEPA同源物表达)。给定丝状真菌的培养条件为本领域所知，并可见于科学文献和/或来自真菌来源，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)和真菌品种中心(Fungal Genetics Stock Center)。

建立真菌生长后，细胞暴露在足以引起或允许此处定义的PEPA同源物表达和分泌的条件下。在pepA同源物序列处于诱导型启动子控制之下的情况中，以足以诱导PEPA同源物表达的浓度向培养基中添加诱导剂。

本发明组合物和方法使用的丝状真菌的典型培养条件为本领域所知，并可见于科学文献，如Sambrook(1982)上文，并来自美国典型培养物保藏中心。此外，用于产生异源蛋白质的发酵方法本身为本领域所知。例如，可通过固体或液面下培养，包括分批、补料分批和恒流方法产生蛋白质。发酵温度可多少有些变化，但对于丝状真菌如黑曲霉，根据所选微生物的菌株，温度一般在约20℃到40℃的范围内，通常在约28℃到37℃的范围内。水溶性微生物发酵物(发酵混合物)中pH范围应该在约2.0到8.0的示例性范围内。对于丝状真菌，pH正常在约2.5到8.0的范围内；对于黑曲霉，所述pH正常在约4.0到6.0的范围内，并通常在约4.5到5.5的范围内。尽管发酵罐中发酵混合物的平均滞留时间可大幅度变化，但部分取决于发酵温度和所用的培养液，其一般地在约24到500小时，通常约24到400小时的范围内。在本发明组合物和方法中可使用用于培养丝状真菌的任何类型的发酵罐。本发明组合物和方法的一个有用的实施方案是在15L Biolafitte(Saint-Germain-en-Laye，France)中操作。

发酵

在本发明组合物和方法的一些实施方案中，在分批或连续发酵条件下培养表达重组天冬氨酸蛋白酶的丝状真菌细胞。典型的分批发酵是闭合系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并在发酵过程中不进行人为改变。因此，在发酵开始时用想要的生物接种所述培养基。在该方法中，允许发酵在不向系统添加任何组分的情况下进行。通常，分批发酵在添加碳源方面有资格成为“分批”，并经常在控制如pH和氧气浓度等因素方面进行尝试。分批系统的代谢物和生物量组成不断改变，直至发酵停止。在分批培养中，细胞通过静止停滞期到达高速生长对数期，最后到达稳定期，其中生长速率减缓或停止。如果不加处理，稳定期中的细胞最终死亡。一般地，对数期中的细胞负责大量产生终产物。

标准分批系统的变型是“补料分批发酵”系统，其也可用于本发明的组合物和方法中。在典型分批系统的这种变型中，随着发酵的进行以增量添加底物。当分解代谢物抑制倾向于抑制细胞代谢，并且其中想要在培养基中含有有限量的底物时，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中测定实际底物浓度是困难的，并因此在可测定因素如pH、溶解的氧气和废气如CO₂的分压的改变基础上进行评定。分批发酵和补料分批发酵是常见的并为本领域所熟知。

连续发酵是开放系统，其中向生物反应器中连续添加确定的发酵培养基，并同时取出等量的条件培养基进行处理。连续发酵一般以恒定高密度维持培养物，其中细胞主要处于对数生长期。

连续发酵允许调整影响细胞生长和/或终产物浓度的一个因素或任何数量的因素。例如，在一个实施方案中，以固定速率维持限制性营养物(如碳源或氮源)，允许所有其它参数改变。在其它系统中，可连续改变影响生长的许多因素，而通过培养基浑浊度测定的细胞浓度保持恒定。连续系统争取维持稳定状态的生长条件。因此，发酵中因培养基去除而丢失的细胞必须针对细胞生长速率进行平衡。调节营养物和生长因子用于连续发酵过程的方法，以及用于将产物形成的速率最大化的技术为工业微生物学领域所熟知。

信号肽和PEPAx蛋白质的分泌

本发明组合物和方法提供丝状真菌细胞，其以比相应亲本菌株分泌的量高至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约100％、至少约250％、至少约500％、至少约1000％或甚至更高的量分泌pepA同源物编码的重组多肽。在一些实施方案中，可通过比较从宿主细胞和相应亲本菌株细胞中获得的培养上清液的SDS-PAGE凝胶图像来测定所分泌多肽的量。

丝状真菌细胞的多肽分泌通常与所述多肽N末端信号肽的存在相关。PEPA同源物蛋白质PEPAa(SEQ ID NO：1)、PEPAc(SEQ ID NO：3)和PEPAd(SEQ ID NO：4)看起来含有信号肽，其分别包含N末端氨基酸1-19、1-20和1-19。在PEPAa、PEPAc和PEPAd中检测了可能的KexB切割位点(精氨酸和赖氨酸)。为PEPAb不能鉴定信号肽序列。然而在分泌的蛋白质中缺少“典型的”信号肽序列是无前例的。例如，灰葡萄孢(B.cinerea)中超氧化物歧化酶BcSOD1也缺少信号肽序列，但明确阐明其为分泌性蛋白质(Rolke等，“Functional analysis of H₂O₂-generating systemsin Botrytis cinerea：the major Cu-Zn-superoxide dismutase(BcSOD1)contributes to virulence on French bean，whereas a glucose oxidase(BcGOD1)is dispensable，”Mol.Plant Pathol.5，17-28(2004))。

重组酶回收

一旦宿主丝状真菌表达并分泌了想要的重组PEPAx酶，则可以将其回收并进一步纯化。可通过本领域已知的方法完成目的蛋白质从发酵液中的回收和纯化。所述发酵液一般含有细胞碎片，包括细胞、多种悬浮固体，和其它生物量污染物，以及想要的蛋白质产物。

用于该去除的合适方法包括常规的固-液分离技术，例如离心、过滤、透析、微量过滤、旋转真空过滤，或其它已知方法来产生无细胞滤液。经常地，在结晶之前使用如超滤、蒸发或沉淀技术进一步浓缩发酵液或无细胞滤液是有用的。

可通过盐，然后通过多种层析方法，例如离子交换层析、亲和层析或领域公认的类似方法完成上清液或滤液中蛋白质组分的沉淀。当分泌所表达的期望多肽时，可从生长培养基中纯化所述多肽。通常，在纯化多肽(例如通过离心)之前从培养基中去除表达宿主细胞。

当宿主细胞不分泌表达的重组期望多肽时，所述细胞一般被破裂并且所述多肽被释放到水性“提取物”中，其为纯化的第一阶段。通常，在细胞破裂前从培养基中收集(例如通过离心)表达宿主细胞。

宿主细胞重组表达酶

在本发明组合物和方法的一些实施方案中，对丝状真菌细胞进行遗传改造，以表达与SEQ ID NO：1-4和21任何一项具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性的重组天冬氨酸蛋白酶。

在黑曲霉的许多菌株中高水平表达编码PepA天冬氨酸蛋白酶的基因。在一些实施方案中，曲霉宿主菌株包括失活的pepA天冬氨酸蛋白酶基因。可改造许多曲霉菌株，使pepA或其它蛋白酶基因失活。

在其它实施方案中，本发明组合物和方法包含核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：1-4的氨基酸序列的多肽，或具有天冬氨酸蛋白酶活性的这些多肽任何一个的截短形式。在一个实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的截短的酶。

在一些实施方案中，包含失活的pepA基因和重组基因(包含pepA同源物)的丝状真菌细胞相比于不包括失活的pepA基因和/或重组pepA同源基因的相应亲本菌株具有改良的性质。这些改良的性质包括例如，提高的分泌性天冬氨酸蛋白酶活性、在较低的pH水平下提高的天冬氨酸蛋白酶稳定性或提高的比活性。

在一些实施方案中，在较低的pH下，从丝状真菌细胞产生的重组PEPAx天冬氨酸蛋白酶(例如PEPAa、PEPAa^＊、PEPAb、PEPAc、PEPAd、PEPAd^＊、PEPAd^＊＊)比在基本相同的条件下天然宿主内源产生的相应PEPAx显示更高的活性。因此，在一些实施方案中，在特定pH水平下，酶活性和/或酶稳定性的水平比在相同pH下内源表达的PEPAx高至少0.5、1.0、2.0或2.5倍。

在一些实施方案中，在较高温度下，丝状真菌细胞产生的重组PEPAx天冬氨酸蛋白酶(例如PEPAa、PEPAa^＊、PEPAb、PEPAc、PEPAd、PEPAd^＊、PEPAd^＊＊)比在基本相同的条件下从天然宿主内源产生的相应PEPAx显示更高的活性。因此，在一些实施方案中，在特定温度下酶活性和/或酶稳定性的水平比在相同温度下内源表达的PEPAx高至少0.5、1.0、2.0或2.5倍。

酶活性的检测和测定

为了评估天冬氨酸蛋白酶(例如具有天冬氨酸蛋白酶活性的PEPA同源物)通过细胞系的表达，可在蛋白质水平、RNA水平上进行测定或使用对天冬氨酸蛋白酶活性和/或生产特异的功能生物学测定进行测定，所述细胞系已经转化有编码本发明组合物和方法所包括的天冬氨酸蛋白酶的异源多核苷酸。在所使用的一般测定中包括，Northern印迹、点印迹(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)，或使用适当标记探针(基于核酸编码序列)的原位杂交和常规的Southern印迹以及放射自显影法。

本领域普通技术人员已知多种测定用于检测和测定胞内和胞外表达的多肽的活性。用于测定宿主细胞中目的蛋白质分泌水平并检测表达的蛋白质的手段包括使用对蛋白质特异的多克隆或单克隆抗体的免疫测定法。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。然而，其它方法为本领域技术人员所知，并可用于评估目的蛋白质(参阅例如，Hampton等，“S_EROLOGICALM_ETHODS，A L_ABORATORY M_ANUAL，”APS Press，St.Paul，MN(1990)和Maddox等J.Exp.Med.158：1211(1983)，每一文件引入作为参考)。

此外，例如通过直接测定培养基中蛋白水解的测定法和用于测定低pH蛋白水解活性、表达和/或产生的测定法在样品中直接测定本发明组合物和方法包括的天冬氨酸蛋白酶的产生和/或表达。可用于测定天冬氨酸蛋白酶活性的底物包括酪蛋白。

此外，可通过免疫方法，如细胞、组织切片的免疫组织化学染色或通过Western印迹或ELISA进行的组织培养基免疫测定来评估基因表达。此类免疫测定可用于定性和定量评估PEPA同源物的表达。此类方法的细节为本领域技术人员所知，并且用于实施此类方法的许多试剂可通过商业途径获得。

在本发明组合物和方法的一些实施方案中，木霉或曲霉宿主产生的PEPA同源物将高于每升1克蛋白质(g/L)、高于2g/L、高于5g/L、高于10g/L、高于20g/L、高于25g/L、高于30g/L、高于50g/L，甚至高于100g/L培养基。

在一些实施方案中，分泌的PEPA同源物的量将是宿主菌株的总分泌蛋白质量的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、95％或甚至更高。在其它实施方案中，分泌性PEPA同源物的量将高于总分泌蛋白质的50％。在一些实施方案中，分泌性PEPA同源物的量将低于总分泌蛋白质的50％。在一些实施方案中，分泌性PEPA同源物的量将高于来自曲霉菌株的分泌性PEPA同源物的量。

酶的纯化

一般地，丝状真菌细胞培养物中产生的根据本发明组合物和方法的天冬氨酸蛋白酶(如PEPA同源物)分泌到培养基中，并例如通过从细胞培养基中去除不想要的组分进行分离或纯化。在一些情况下，以细胞形式产生酶，需要从细胞裂解物中进行回收。在这种情况下，使用本领域技术人员常规使用的技术从产生酶的细胞中纯化所述酶。实例包括，但不限于，亲和层析(参阅例如Tilbeurgh等(1984)FEBS Lett.16：215)；离子交换层析方法(参阅例如Goyal等(1991)Biores.Technol.36：37；Fliess等(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314；Bhikhabhai等(1984)J.Appl.Biochem.6：336；和Ellouz等(1987)Chromatography396：307)，包括使用具有高分辨能力的材料进行的离子交换(参阅例如Medve等(1998)J.Chromatography A 808：153)；疏水作用层析(参阅例如Tomaz和Queiroz，(1999)J.Chromatography A 865：123)；两相分配(参阅例如Brumbauer等(1999)Bioseparation 7：287)；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。

酶组合物

特别有用的酶组合物包括一种或更多蛋白酶和/或一种或更多淀粉水解酶。蛋白酶包括一种或更多天冬氨酸蛋白酶，其与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28，或其组合的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，从pepA同源基因的异源表达，如里氏木霉或黑曲霉宿主中Aspergilluskawachi酸稳定天冬氨酸蛋白酶的异源表达获得天冬氨酸蛋白酶(例如PEPA同源物)。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括发酵或培养基，其包含产自曲霉细胞培养物的具有酸稳定蛋白酶活性的PEPA同源物酶，所述曲霉细胞包含编码PEPA同源物的异源多核苷酸，所述PEPA同源物与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

在一些实施方案中，酶组合物在无细胞滤液，即与宿主细胞分离的培养基中包含PEPA同源物。在一些实施方案中，所述PEPA同源物与其它酶共表达到培养基中。在其它实施方案中，在含有表达并分泌天冬氨酸蛋白酶的真菌宿主细胞的培养基中可获得所述天冬氨酸蛋白酶。

在其它方面，本发明组合物和方法包括发酵或培养基，其包含产自木霉细胞培养物的PEPA同源物，所述木霉细胞包含编码PEPA同源物的异源多核苷酸，所述PEPA同源物与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

在另一实施方案中，本发明组合物和方法包括发酵或培养基，其包含酸稳定的天冬氨酸蛋白酶(例如PEPA同源物)和α淀粉酶，其中所述天冬氨酸蛋白酶和α淀粉酶从曲霉细胞中共表达，所述细胞包含编码天冬氨酸蛋白酶的异源多核苷酸和编码α淀粉酶的多核苷酸，所述天冬氨酸蛋白酶与选自SEQ ID NO：1、2、3、4和21的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

在一些实施方案中，进一步回收培养基中的天冬氨酸蛋白酶。可配制所述酶用于酶组合物中用于许多应用。这些应用和组合物中的一些包括但不限于例如淀粉蛋白水解和水解组合物、清洁和洗涤剂组合物(例如洗衣洗涤剂、洗盘洗涤剂和硬表面清洁组合物)、动物饲料组合物、烘焙应用，如面包和蛋糕生产、酿造应用、医疗保健应用、织物应用、环境废物转化加工、生物泵加工和生物量转化应用。

如本领域技术人员所理解，用于本发明组合物和方法中的天冬氨酸蛋白酶(例如PEPA同源物)的量取决于天冬氨酸蛋白酶的酶促活性。在一些实施方案中，酶组合物中包含的天冬氨酸蛋白酶的范围从每克ds 0.001到80SSU、0.001到60SSU、也可以从0.01到40SSU；也可以从0.01到30SSU；也可以从0.01到20SSU；也可以从0.01到15SSU；也可以从0.05到15SSU，也可以从0.01到10SSU。

有用的酶组合物是如上所述的酶组合物，其还包含第二种酸稳定的蛋白酶。第二种酸稳定的蛋白酶是从不同于曲霉宿主的来源中获得的蛋白酶，其包含编码PEPA同源物的异源多核苷酸，例如编码天冬氨酸蛋白酶的多核苷酸，所述天冬氨酸蛋白酶与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

从说明书中将显而易见的是本发明组合物和方法实施方案的这些方面和其它方面。通过参考以下实施例，本领域技术人员将更彻底理解实施本发明组合物和方法的方式和方法，所述实施例不旨在以任何方式限制本发明组合物或方法的范围，或涉及其的附带权利要求的范围。

实施例

提供以下实施例，以说明和进一步阐明本发明组合物和方法的特定实施方案和方面，并且不理解为限制其范围。

在以下实验公开内容中，应用以下缩写：℃(摄氏度)；H₂O(水)；dH₂O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；g(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μl(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；MW(分子量)；s(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；NaCl(氯化钠)；PBS(磷酸缓冲盐水[150mMNaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；PCR(聚合酶链式反应)；SDS(十二烷基硫酸钠)；w/v(重量比体积)；v/v(体积比体积)；ATCC(美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection，Rockville，MD)；BDBioSciences(以前的CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)；Invitrogen(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)；和Sigma(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO).

实施例1

构建重组pepAa基因并通过黑曲霉的转化的GAP3菌株产生PEPAa 蛋白质

pepAa基因编码424个氨基酸的PEPAa蛋白质(SEQ ID NO：1)，其具有19个氨基酸的信号序列。该实施例说明了：(1)构建质粒载体pGAMD-pepAa，其具有包含在黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子之间插入的pepAa的重组基因；(2)用该载体转化黑曲霉来获得整合的重组基因；(3)选择过量表达pepAa的黑曲霉菌株；和(4)测定过量表达菌株的PEPAa蛋白质产量。

为了构建黑曲霉pepAa基因的重组表达质粒，在含有从黑曲霉UVK143菌株获得的基因组DNA模板的Pfu PCR反应中使用两条引物CACTCGAGGCCACCATGCAGCTCCTCCAG(SEQ ID NO：5)和AGGAAACTAGTTCTTGGGAGAGGCAAC(SEQ ID NO：6)(Ward等.Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-43(1993))。所得的PCR扩增子的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)示于图5中。

用限制酶XhoI消化PCR扩增子(SEQ ID NO：7)并将其克隆至已用XhoI和SnaBI消化的pGAMD质粒载体中(参阅例如，美国专利号7,332,319，此处引入作为参考)。如图6中所示，pGAMD质粒载体在黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列的上游和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子的下游侧翼具有XhoI和SnaBI限制性位点。通过DNA测序验证所得质粒pGAMD-pepAa(示于图7中)具有重组基因，所述重组基因包含在黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子之间插入的pepAa。

使用PEG介导的原生质体融合转化方案用pGAMD-pepAa质粒载体转化黑曲霉的GAP3菌株(Ward等，Appl.Microbiol.Biotechnol，39：738-43，(1993))。GAP3菌株具有失活的pepA基因。

所用的转化方案为坎贝尔(Campbell)方法的改进(参阅Campbell等，Curr.Genet.16：53-56(1989)，此处引入作为参考)，其中使用β-D葡聚糖酶G(InterSpex Products，Inc.San Mateo，CA)来产生原生质体并调节pH值为5.5。

简述之，原生质体制备和黑曲霉转化如下进行：

(a)将从新鲜斜面培养中制备的1-2ml孢子悬浮液接种至摇瓶中的50ml液体培养基中(可溶性淀粉3％、酵母提取物2％、KH₂PO₄ 0.5％、玉米粉0.5％，中性pH)，并在旋转摇床上以200rpm，30℃培养13到14小时；

(b)将培养物经纱布过滤收集菌丝体并用水洗涤三次，用0.8MMgSO₄(pH 5.8)洗涤一次；

(c)将洗涤后的菌丝体置于100ml烧瓶中，在含150mg裂解酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和15mg纤维素酶R-10(YakultBiochemical Co.，Ltd.，Nishinomiya，Japan)的15ml 0.8M MgSO₄中悬浮；

(d)30℃下在以80rpm摇动的摇瓶中将菌丝体细胞壁消化1-2小时，并在显微镜下监测原生质体的形成；

(e)经两层200目尼龙膜过滤去除细胞碎片来从细胞裂解物收集原生质体；

(f)经700g离心6-8分钟收集原生质体并用山梨醇溶液(1.2M山梨醇、50mM CaCl₂、10mM Tris pH 7.4)洗涤两次；

(g)在200μl山梨醇溶液中重悬浮原生质体并用血球计数器计数来测定浓度；

(h)将10μg转化载体DNA(pGAMD-pepAa)与2-4x10⁷个原生质体混合；

(i)将50μl PEG6000(或PEG4000)溶液(PEG 50％、50mM CaCl₂、10mM Tris pH 7.4)加入到上述混合物中，并温和但彻底混匀，置于冰上30分钟；

(j)加入1ml PEG溶液，充分混合，并置于室温下20分钟；

(k)加入1ml山梨醇溶液并与56-58℃的熔化的软琼脂混合均匀，随后立即将所有混合物倒入转化培养基平板上；

(l)将平板在30℃下温育4-8天。

所有溶液和培养基经高压灭菌或经0.2微米滤膜过滤除菌。

选择了超过16个转化体并在28℃下30ml pH 6.2 Promosoy特殊培养液中培养6天。将培养液过滤并用SDS-PAGE分析来分析上清液蛋白质含量。产生最高量的PEPAa蛋白质的转化体测定为菌株#2。将该菌株进一步孢子纯化来产生菌株#2-9。在摇瓶中进行从菌株#2-9中产生PEPAa蛋白质。对#2-9的上清液进行SDS-PAGE分析并且如图8中凝胶图像显示的，在约55kD分子量处检测到PEPAa蛋白质。由于PEPAa蛋白质发生了糖基化，因此在SDS凝胶上PEPAa蛋白质的分子量(55kD)比预测的分子量(44.9kD)更高。根据凝胶图像，估计由菌株#2-9产生的PEPAa蛋白质的量为细胞分泌至上清液中的总蛋白质的至少约15％。相反，在相应的GAP3亲本菌株的上清液的凝胶图像中没有检测到PEPAa条带。

实施例2

构建重组截短的pepAa基因并转化到黑曲霉的GAP3菌株中

制备重组截短形式的pepAa基因(“pepAa^＊”)并转化到黑曲霉的GAP3菌株，以证明该序列对于全长野生型PEPAa蛋白质(SEQ ID NO：1)的分泌的重要性。全长pepAa基因具有编码在SEQ ID NO：1中382位处起始的以下C末端氨基酸的3’核苷酸序列：

LCFGGIQSNGNTSLQILGDIFLKAFFVVFDMRGPSLGVASPKN。

如图24所示，由pepAa^＊编码的PEPAa^＊蛋白质的截短形式的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)并不具有SEQ ID NO：1的C末端的43个氨基酸，却具有插入的不同的13个氨基酸。因此，PEPAa和PEPAa^＊上1-381位的氨基酸序列是相同的，但从382位开始，PEPAa^＊序列(SEQ ID NO：23)具有C末端氨基酸：CKLLPFFCMIEHD。

所用的制备方法除下文描述之外其余与实施例1中基本相同。

为了构建截短的黑曲霉pepAa基因(pepAa^＊)的重组表达质粒，在含有从黑曲霉UVK143菌株获得的基因组DNA模板的Pfu PCR反应中使用引物CACTCGAGGCCACCATGCAGCTCCTCCAG(SEQ ID NO：1)和引物ACTCTAGATCAATCATGTTCAATCATG(SEQ ID NO：8)。所得的PCR扩增子的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)显示于图9中。

用限制性内切酶XhoI消化PCR扩增子(SEQ ID NO：9)并将其克隆至之前用XhoI和SnaBI消化过的pGAMD载体中。通过DNA测序证实所得质粒pGAMD-pepAa^＊的保真度。

如实施例1中所述进行pGAMD-pepAa^＊质粒向黑曲霉GAP3菌株的转化。选择了8个转化体并如实施例1中所述培养了6天。如实施例1中所述进行过滤培养物上清液的SDS-PAGE分析以检测分泌的蛋白质。凝胶中未观察到PEPAa^＊，提示缺失的43个氨基酸序列在PEPAa的表达和/或分泌中起关键作用。

实施例3

构建重组pepAb基因并通过转化的黑曲霉GAP3菌株产生PEPAb蛋 白质

如实施例1中对pepAa基因所述来构建黑曲霉pepAb基因的重组表达质粒，只是在含有从UVK143菌株获得的基因组DNA模板的Pfu PCR反应中使用的两种引物为AACTCGAGTCCATCATGGCTACCAAAATC(SEQ ID NO：10)和CCTCTAGACTACTCCGACTTCAGGCTC(SEQ IDNO：11)。所得PCR扩增子(SEQ ID NO：12)的1418bp核苷酸序列显示在图10中。

将PCR扩增子(SEQ ID NO：12)克隆至pGAMD载体中(如实施例1中对pepAa扩增子所述)。经DNA测序验证所得质粒pGAMD-pepAb(示于图11中)含有重组基因，所述重组基因包含在黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子之间插入的pepAb。

如实施例1中，用pGAMD-pepAb质粒载体转化黑曲霉GAP3菌株(如实施例1中所述)，选择8个转化体并进行培养，将培养液上清液过滤并进行SDS-PAGE分析。

将产生最高量的重组pepAb蛋白质的转化体(菌株#1)进一步孢子纯化来产生菌株#1-3。进行GGAb#1-3上清液的SDS-PAGE分析并如图12中SDS凝胶图所示在约47kD分子量处检测到了PEPAb蛋白质。然而，GGAb#1-3上清液的质谱分析表明PEPAb蛋白质为38kD。还检测到了对应于PEPAb C末端部分的更小的32.7kD肽。基于凝胶图像，由#1-3产生的PEPAb蛋白质的量估计是细胞向上清液中分泌的总蛋白质的至少约10％。相反，在对应的GAP3亲本菌株的上清液的凝胶图像中没有检测到PEPAb条带。

实施例4

构建重组pepAc基因并通过转化的黑曲霉GAP3菌株产生PEPAc蛋 白质

除下文描述之外，如实施例1中对pepAa基因所述来构建黑曲霉pepAc基因的重组表达质粒。

在含有从UVK143菌株获得的基因组DNA模板的Pfu PCR反应中使用两对引物。使用CACTCGAGTGCCGCCATGTATATCCCCGTC(SEQID NO：13)和TTGCTCAGTTCGAGGTACTTGGAGGAG(SEQ ID NO：14)扩增编码蛋白质N末端的DNA片段。使用AGTACCTCGAACTGAGCAAGACCAAG(SEQ ID NO：15)和TCTAGTAGGTGTCGTTGGAGGTGTAG(SEQ ID NO：16)扩增编码蛋白质C末端的DNA片段。

使用引物CACTCGAGTGCCGCCATGTATATCCCCGTC(SEQ IDNO：13)和TCTAGTAGGTGTCGTTGGAGGTGTAG(SEQ ID NO：16)以及N末端和C末端PCR扩增子作为DNA模板通过融合PCR来扩增pepAc基因片段。在所述融合PCR扩增子中，pepAc基因的第61位密码子由GAG改变为GAC，其去除了内在的XhoI限制性酶切位点，而没有改变所编码的氨基酸序列。所得PCR扩增子的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)显示在图13中。

用限制性内切酶XhoI消化PCR扩增子(SEQ ID No.17)并将其克隆至XhoI和SnaBI消化的pGAMD载体中。经DNA测序验证所得质粒pGAMD-pepAc(示于图14中)含有重组基因，所述重组基因包含在黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子之间插入的pepAc。

用pGAMD-pepAc质粒载体转化黑曲霉GAP3菌株(如实施例1中所述)。选择了29个转化体并在28℃下30ml Promosoy特殊培养液(pH 6.2)中培养6天。将培养液过滤并使用SDS-PAGE来分析上清液的蛋白质含量。产生最高量的PEPAc蛋白质的转化体测定为菌株#12。将该菌株进一步孢子纯化来产生菌株#12-2。进行菌株#12-2上清液的SDS-PAGE分析并且如图15中所示在约60kD处检测PEPAc蛋白质。由于所述PEPAc蛋白质发生了糖基化，因此在SDS凝胶上PEPAc蛋白质的分子量(60kD)比预测的分子量(46.2kD)高。基于凝胶图像，估计由菌株#12-2产生的PEPAc蛋白质的量是细胞分泌至上清液中的总蛋白质的至少约10％。相反，在对应的GAP3亲本菌株的上清液的凝胶图像中没有检测到PEPAc条带。

实施例5

构建重组截短的pepAd基因(“pepAd ^＊ ”)并通过转化的黑曲霉GAP3菌 株产生截短的蛋白质“PepAd ^＊ ”

除了在含有从UVK143菌株获得的基因组DNA模板的Pfu PCR反应中使用的两种引物为TGACTCGAGCAAGTTATGCATCTCCCAC(SEQID NO：18)和TTCTAGAGCCAAAGCATGAAGGAAGCACGCTCTGCAAATCCGAC(SEQ ID NO：19)外，如实施例1中对pepAa基因所述来构建黑曲霉pepAd^＊基因截短形式的重组表达质粒。所得的PCR扩增子(SEQ ID NO：20)的核苷酸序列显示在图16中。

将编码截短形式的PEPAd蛋白质的PCR扩增子(SEQ ID NO：20)称为“PEPAd^＊”。在图17中显示的PEPAd^＊的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)不包括天然PEPAd序列(SEQ ID NO：4)C末端的富含丝氨酸区(SEQ ID NO：22)，预测该区域为GPI锚定序列。将PCR扩增子(SEQ ID NO：20)克隆至pGAMD载体中(如实施例1中对pepAa所述)。经DNA测序验证所得质粒载体pGAMD-pepAd^＊(显示于图18中)含有重组基因，所述重组基因包含在黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子之间插入的pepAd^＊。

如实施例1中，用pGAMD-pepAd^＊质粒载体转化黑曲霉GAP3菌株(如实施例中所述)，选择了9个转化体并进行培养，将培养液过滤并进行SDS-PAGE分析来测定产生最高量PEPAd^＊蛋白质的菌株。将产生最高量的重组PEPAd^＊蛋白质的转化体(菌株#9)进一步孢子纯化来产生菌株#9-2。对菌株#9-2上清液进行SDS-PAGE分析并在约60kD处检测到PEPAd^＊蛋白质。图19显示具有PEPAd^＊条带以及PEPAa、PEPAb和PEPAc的孢子纯化菌株的泳道的SDS-PAGE凝胶图像。由于PEPAd^＊蛋白质发生了糖基化，因此在SDS凝胶上PEPAd^＊蛋白质的分子量(60kD)比预测分子量(43kD)高。通过对菌株#9-2上清液中PEPAd^＊蛋白质过量产生的SDS-PAGE显色表明预测的GPI锚定序列的截短导致能够分泌到培养基中的蛋白质。基于凝胶图像，估计由菌株#9-2产生的PEPAd^＊蛋白质的量是细胞分泌至上清液中的总蛋白质的至少约10％。相反，在对应的GAP3亲本菌株的上清液的凝胶图像中没有检测到PEPAd条带。

实施例6

构建重组pepAd基因并通过转化的黑曲霉GAP3菌株产生PEPAd蛋 白质

除了在含有从UVK143菌株获得的基因组DNA模板的Pfu PCR反应中使用的两种引物为TGACTCGAGCAAGTTATGCATCTCCCAC(SEQID NO：18)和AACTAGAGC CAAAGCATGAAGGAAG(SE Q ID NO：24)外，如实施例1中对pepAa基因所述来构建全长黑曲霉pepAd基因的重组表达质粒。所得的PCR扩增子(SEQ ID NO：25)的核苷酸序列示于图20中，并且编码全长PEPAd蛋白质(SEQ ID NO：4)。

如实施例1，用限制性内切酶XhoI消化PCR扩增子并将其克隆至XhoI和SnaBI消化的pGAMD载体中。经DNA测序验证所得质粒载体pGAMD-pepAd中含有重组基因，所述重组基因包含在黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子之间插入的pepAd。

用pGAMD-pepAd质粒载体转化黑曲霉GAP3菌株(如实施例1中所述)。选择了6个转化体并在28℃下30ml Promosoy特殊培养液(pH 6.2)中培养6天。将培养液过滤并使用上清液的SDS-PAGE分析来检测PEPAd蛋白质的存在。

在凝胶中未观察到预期分子量大小的PEPAd蛋白质。该结果进一步证实了实施例5的结论，即截短的富含丝氨酸的C末端氨基酸序列(SEQ IDNO：22)为GPI锚定序列，其阻止全长PEPAd蛋白质(SEQ ID NO：4)分泌到培养基中。值得注意的是，在筛选了额外的转化体后，获得了以低水平分泌全长PEPAd的两个转化体(见图27中菌株#5的SDS凝胶分析中的2号泳道)。尽管存在GPI锚定序列，但该“分泌的”全长蛋白质可能来自PEPAd蛋白质的过量表达并随后经细胞壁泄漏出来。

实施例7

构建重组突变pepAd基因(pepAd ^＊＊ )并通过转化的黑曲霉GAP3菌株产 生PEPAd ^＊＊ 蛋白质

构建了黑曲霉pepAd基因(此处称为“pepAd^＊＊”)的突变体的重组表达质粒，其中缺失了GPI锚定区中的一个甘氨酸残基(G456)。该突变应排除了所表达的“PEPAd^＊＊”蛋白质向细胞壁的锚定并因此允许其进行分泌。

除了在含有从UVK143菌株获得的基因组DNA模板的Pfu PCR反应中使用四条引物外，如实施例1中对pepAa基因所述来构建突变体质粒。两条引物为：TGACTCGAGCAAGTTATGCATCTCCCAC(SEQ ID NO：18)和ATGCTACTTGATTCAGCATCAGATGAAC(SE Q ID NO：26)。这些用于扩增编码蛋白质N末端的DNA片段。其它两条引物为：TGCTGAATCAAGTAGCATGACCATTCC(SEQ ID NO：29)和TAACTAGAGCCAAAGCATGAAGGAA(SEQ ID NO：30)。这些用于扩增编码蛋白质C末端的DNA片段。

使用引物TGACTCGAGCAAGTTATGCATCTCCCAC(SEQ ID NO：18)和TAACTAGAGCCAAAGCATGAAGGAA(SEQ ID NO：30)以及N末端和C末端PCR扩增子作为DNA模板通过融合PCR来扩增pepAd^＊＊基因片段。所得PCR扩增子的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)显示在图25中并编码PEPAd^＊＊蛋白质(SEQ ID NO：28)。

如实施例1，用限制性内切酶XhoI消化PCR扩增子并将其克隆至XhoI和SnaBI消化的pGAMD载体中。经DNA测序验证所得质粒载体pGAMD-pepAd^＊＊含有重组基因，所述重组基因包含在黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子之间插入的pepAd^＊＊。

用pGAMD-pepAd^＊＊质粒载体转化黑曲霉GAP3菌株(如实施例1中所述)。选择了12个转化体并在28℃下30ml Promosoy特殊培养液(pH6.2)中培养6天。将培养液过滤并用上清液的SDS-PAGE分析来检测PEPAd^＊＊蛋白质的存在。获得的两个转化体以低水平产生PEPAd^＊＊(见图27中菌株#3-4的SDS凝胶分析中的3号泳道)。这些结果提示GPI锚定位点上一个氨基酸的缺失没有去除GPI锚的功能。然而，如前所述，PEPAd^＊＊蛋白质的过量表达可导致泄漏到细胞壁外，其导致了所观察到的低水平的“分泌”蛋白质。

相关实验中，GPI结合位点上两个相邻的氨基酸(S455和G456)缺失。同样，该缺失没有完全去除GPI锚的正常功能(未显示)。

实施例8

重组pepAa、pepAb、pepAc和截短的pepAd的酪蛋白蛋白水解活性测 定

选择产生最大量的各种蛋白质的四孢子纯化的菌株用于活性测定：菌株#2-9(PEPAa)、菌株#1-3(PEPAb)、菌株#12-2(PEPAc)和菌株#9-2(PEPAd^＊)(参阅实施例1、3、4和5)。还使用相应的亲本菌株(GAP3)和黑曲霉野生型菌株13528(CGMCC No.AS3.10145)作为对照进行活性测定。所有菌株在28℃下30ml Promosoy特殊培养液中培养6天并且所有烧瓶中的上清液用于蛋白酶活性测定。

如下进行酪蛋白活性测定：

在pH 3.0 Na₂HPO₄柠檬酸缓冲液(每20ml中4.11ml 0.2M Na₂HPO₄和15.89ml 0.1M柠檬酸)中制备酪蛋白底物溶液(0.5％w/v酪蛋白)。

37℃预温育10分钟后，向0.9ml H₂O和2ml酪蛋白溶液的混合物中加入0.1ml培养物滤液的PEPAx样品等分试样并在37℃温育20分钟。通过加入3ml 10％的TCA来淬灭酪蛋白蛋白水解反应。

还测定“空白”对照。在加入2ml酪蛋白溶液之前先向0.1ml培养物滤液样品和0.9ml H₂O的混合物中加入3ml 10％TCA来制备所述空白。

酪蛋白蛋白水解的TCA淬灭后，将样品和空白在37℃温育30分钟，随后在室温下12000rpm离心2分钟。

离心后，将0.5ml上清液与0.5ml H₂O混合，加入到5ml Folin酚试剂A中(4％Na₂CO₄∶0.2M NaOH∶1％ CuSO₄∶2％酒石酸钾钠，50∶50∶1∶1)并在室温下培养10分钟。加入0.5ml Folin酚试剂B(1N Folin酚)后，将上述溶液在室温下温育30分钟。

使用725C分光光度计测定folin酚处理后淬灭的样品和空白的OD₆₆₀。从样品的OD₆₆₀中减去空白的OD₆₆₀来测定OD₆₆₀增加的终值用于测定酪蛋白蛋白水解的量。

在图21中所示的表中描述了重组PEPAa、PEPAb、PEPAc和截短的PEPAd(PEPAd^＊)以及GAP3和13528对照的酪蛋白蛋白水解活性。

相对于GAP3上清液的测定活性(0.036)，重组产生PEPAa、PEPAb和PEPAc酶的菌株的上清液显示了分别提高4.8倍(0.173)、6.2倍(0.222)和5.6倍(0.202)的相对酪蛋白蛋白水解活性。

将重组PEPAd的酪蛋白蛋白水解活性与对照菌株产生的GAP3进行比较。如图28中所示的表中描述，重组产生全长PEPAd蛋白质的菌株#5和#8的上清液中的酪蛋白蛋白水解活性是GAP3上清液的酪蛋白蛋白水解活性的2.8至3.5倍。

尽管SDS-PAGE显示其过量产生PEPAd^＊酶，但来自重组产生PEPAd^＊的菌株#9-2的上清液的酪蛋白蛋白水解活性与GAP3上清液的基本相同。PEPAd^＊蛋白质相对低(或缺少)的活性可能是由于C末端GPI锚定序列的截短造成或者是未知蛋白酶进行蛋白水解降解的结果。PEPAd的C末端GPI锚定序列的其它突变可能会产生截短的PEPAd蛋白，其以可比较的量分泌但具有显著的酪蛋白蛋白水解活性。

如上所述，PEPAd^＊＊是PEPAd的突变体变体，其中在GPI锚定区中缺失了氨基酸甘氨酸。将重组PEPAd^＊＊的酪蛋白蛋白水解活性与PEPAd、PEPAd^＊和GAP3的酪蛋白蛋白水解活性进行比较。该结果描述于图28中所示的表中。重组产生PEPAd^＊＊蛋白质的菌株#3和#7的上清液的酪蛋白蛋白水解活性是GAP3上清液的酪蛋白蛋白水解活性的2.3倍至3倍。

实施例9

测定用于重组产生的蛋白质：PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd ^＊ 的最佳活性的pH值

如实施例8中测定四孢子纯化菌株的蛋白酶活性，只是在以下pH值中的一个pH值下对酪蛋白溶液进行缓冲：2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0。所用缓冲液如下：

pH2.0的缓冲液包含：每20ml中1.06ml的0.2M Na₂HPO₄和18.94ml的0.1M柠檬酸。

pH3.0的缓冲液包含：每20ml中4.11ml的0.2M Na₂HPO₄和15.89ml的0.1M柠檬酸。

pH4.0的缓冲液包含：每20ml中7.71ml的0.2M Na₂HPO₄和12.29ml的0.1M柠檬酸。

pH5.0的缓冲液包含：每20ml中10.3ml的0.2M Na₂HPO₄和9.7ml的0.1M柠檬酸。

pH6.0的缓冲液包含：每20ml中12.63ml的0.2M Na₂HPO₄和7.37ml的0.1M柠檬酸。

pH7.0的缓冲液包含：每20ml中16.47ml的0.2M Na₂HPO₄和3.53ml的0.1M柠檬酸。

在图22A-F中绘制四种重组产生的蛋白质上清液各自的所得蛋白酶活性相对于缓冲液pH值的图。四种重组过量产生的PEPAx蛋白质的pH图在～pH5和～pH3处显示活性峰(在PEPAa、Ab和Ac中以肩形出现)。这些pH图的相似性说明三种重组酶具有相同的活性和机制。

实施例10

测定重组蛋白质：pepAa、pepAb、pepAc和截短的pepAd ^＊ 的最适活性 的温度

如实施例7中测定四孢子纯化菌株的蛋白酶活性，只是PEPAx样品等分试样与酪蛋白底物溶液在以下每一温度下温育20分钟：28℃、37℃、50℃、60℃和70℃。

在图23A-F中绘制四种重组产生的蛋白质上清液各自的所得蛋白酶活性相对于温度的图。

PEPAa活性-温度图在约50℃处显示峰并且在更高温度时下降。PEPAb活性对在约37℃到约70℃之间的温度相对不敏感。PEPAc活性在约28℃到70℃之间持续增加约两倍。PEPAd^＊活性不具有任何高于背景的活性并且与GAP3菌株的活性非常相似。

本领域的技术人员易于理解本发明组合物和方法非常适合于实施目标并获得所提到的目标和优势、以及那些其中固有的内容。此处描述的组合物和方法是有代表性的示例性的实施方案，并且不旨在限制所述组合物和方法的范围。

尽管已说明并描述了本发明组合物和方法的特定实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是可进行多种其它改变和修饰，而不背离所述组合物和方法的精神和范围。因此旨在在所附权利要求书中覆盖本发明组合物和方法范围内的所有此类改变和修饰。

此处适当示例性描述的组合物和方法可以在不存在此处未特别公开的任何要素或限制的情况下实施。已使用的术语和表述用作描述而非限制，并且不旨在使用此类术语和表述来排除所示和描述的特征的任何等同物或其部分。

此处已广泛并且一般性描述了本发明组合物和方法。一般性公开内容范围内的各种更窄的种类或亚类也构成了本发明组合物和方法的一部分。这包括从所述类中去除任何主题的限制条件或否定限制的组合物和方法的一般性描述，无论在本文中是否特别引用了所述去除的材料。

此处所有专利和出版物以相同程度引入作为参考，就如同每一出版物被特别和单独引入作为参考一样。

Claims (34)

1.包含失活pepA基因和重组基因的丝状真菌细胞，所述重组基因包含选自pepAa、pepAb、pepAc和pepAd的pepA同源物。

2.权利要求1的丝状真菌细胞，其中所述重组基因包含启动子和终止子。

3.权利要求1的丝状真菌细胞，其中所述重组基因包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子。

4.权利要求1的丝状真菌细胞，其中所述重组基因包含选自SEQ IDNO：7、12、17和20的核苷酸序列。

5.权利要求1的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌选自曲霉、根霉、木霉和毛霉。

6.权利要求4的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌是选自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、构巢曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、A.kawachi和棘孢曲霉的曲霉。

7.权利要求5的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌是黑曲霉。

8.权利要求1的丝状真菌细胞，其中所述pepA同源物编码所述细胞分泌的多肽。

9.权利要求1的丝状真菌细胞，其中所述pepA同源物编码与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28的氨基酸序列具有至少85％同一性的多肽。

10.权利要求1的丝状真菌细胞，其中所述细胞以比相应亲本菌株高至少约10％到约1000％的量分泌pepA同源物编码的多肽。

11.权利要求1的丝状真菌细胞，其中所述pepA同源物编码的多肽是所述细胞产生的总蛋白质的至少约10％。

12.权利要求1的丝状真菌细胞，其中所述细胞分泌的蛋白酶活性比相应亲本菌株分泌的蛋白酶活性高至少约0.5倍到约100倍。

13.分离的核酸，其包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepA同源物序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列，其中所述pepA同源物序列编码与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28的氨基酸序列具有至少85％同一性的多肽。

14.权利要求13的分离的核酸，其中所述pepA同源物包含选自SEQID NO：7、9、12、17、20、25和27的核苷酸序列。

15.载体，其包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列、pepA同源物序列和塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列，其中所述pepA同源物序列编码与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、21、23和28的氨基酸序列具有至少85％同一性的多肽。

16.权利要求15的载体，其中所述pepA同源物序列包含选自SEQ IDNO：7、9、12、17、20、25和27的核苷酸序列。

17.权利要求15的载体，其中所述载体是质粒。

18.权利要求15的载体，其中所述质粒包含具有pepA同源物序列插入片段的pGAMD。

19.权利要求15的载体，其中所述质粒选自pGAMD-pepAa、pGAMD-pepAb、pGAMD-pepAc、pGAMD-pepAd、pGAMD-pepAd^＊、pGAMD-pepAa^＊和pGAMD-pepAd^＊＊。

20.用于产生酸性蛋白酶的方法，其包括：

a)向丝状真菌细胞中引入核酸，其中所述细胞包含失活的pepA基因，并且其中所述核酸包含启动子序列、pepA同源物序列和终止子序列；和

b)在适合于产生所述酸性蛋白酶的条件下培养所述细胞。

21.权利要求20的方法，其中所述启动子包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子序列并且所述终止子包含塔宾曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。

22.权利要求20的方法，其中所述pepA同源物序列编码与选自SEQID NO：1、2、3、4、21、23和28的氨基酸序列具有至少85％同一性的多肽。

23.权利要求20的方法，其中所述pepA同源物序列包含选自SEQ IDNO：7、9、12、17、20、25和27的核苷酸序列。

24.权利要求20的方法，其中向丝状真菌细胞中引入所述核酸包括用载体转化所述细胞。

25.权利要求20的方法，其中所述载体是质粒。

26.权利要求20的方法，其中所述质粒包含具有pepA同源物序列插入片段的pGAMD。

27.权利要求20的方法，其中所述质粒选自pGAMD-pepAa、pGAMD-pepAb、pGAMD-pepAc、pGAMD-pepAd、pGAMD-pepAd^＊、pGAMD-pepAa^＊和pGAMD-pepAd^＊＊。

28.权利要求20的方法，其中所述方法还包括回收所述蛋白质。

29.包含SEQ ID NO：20的序列的分离的核酸。

30.分离的核酸，其包含编码与SEQ ID NO：21具有至少85％氨基酸序列同一性的多肽的序列。

31.分离的多肽，其与SEQ ID NO：21具有至少85％氨基酸序列同一性。

32.酶组合物，其包含与SEQ ID NO：21具有至少85％氨基酸序列同一性的多肽。

33.载体，其包含SEQ ID NO：20的核苷酸序列。

34.载体，其包含编码与SEQ ID NO：21具有至少85％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。

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