CN103374571B

CN103374571B - 一种丝状真菌启动子及其应用

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Publication number: CN103374571B
Application number: CN201210116460.1A
Authority: CN
Inventors: 李建军; 黄雪年; 谭俊; 吕雪峰
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2012-04-19
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2032-04-19
Also published as: CN103374571A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体的说是一种丝状真菌启动子及其应用。丝状真菌启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。本发明实获得的不同长度的具有启动子活性的核苷酸序列，其能够在丝状真菌中无需诱导即可启动同、异源基因的表达。

Description

一种丝状真菌启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说是一种丝状真菌启动子及其应用。

背景技术

丝状真菌因其分泌能力好、生产能力强、营养要求低且能产生种类繁多的代谢产物而受到广泛关注。丝状真菌在生物技术领域作为细胞工厂广泛应用于各种产品的生产，从简单的有机酸到复杂的次级代谢产物，从来源于丝状真菌自身到异源的各种蛋白质等。通过代谢工程对生产菌株进行改造，提高目标产物的生产水平，具有非常重要的意义。改造的前提是丝状真菌中导入的外源基因能够在启动子的调控下实现高效表达，研究比较多的丝状真菌启动子主要包括来自米曲霉的α-淀粉酶启动子PamyL(Christensen，T.，Woeldike，H.，Boel，E.，Mortensen，S.B.，Hjortshoej，K.，Thim，L.and Hansen，M.T.，High Level Expression ofRecombinant Genes in Aspergillus Oryzae，Nat.Biotechnol.，1988，6，1419-1422)、黑曲霉的葡萄糖淀粉酶启动子PglaA(Gwynne，D.I.，Buxton，F.P.，Williams，S.A.，Garven，S.& Davies，R.W.，GeneticallyEngineered Secretion of Active Human Interferon and a BacterialEndoglucanase from Aspergillus Nidulans，Nat. Biotechnol.，1987，5，713-719)、构巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdA(van Gorcom，R.F.，Punt，P.J.，Pouwels，P.H.，van den Hondel，C.A.，A system forthe analysis of expression signals in Aspergillus，Gene，1986，48，211-217.)。可供选择的丝状真菌强启动子并不多，当需要在真菌宿主中同时过量表达多种不同的基因时，知道多种功能性启动子是有益的，为防止压制特定转录因子的滴定(titration)，优选使用多种不同的启动子，对每种待表达基因使用一种特定的启动子。

柠檬酸合成酶作为三羧酸循环中的一个关键酶，其转录水平显而易见，因此柠檬酸合成酶启动子是一个强的组成型启动子。Ruijter等人发现在柠檬酸生产过程中柠檬酸合成酶不是限速瓶颈，这说明柠檬酸合成酶在高产柠檬酸的黑曲霉菌株中高水平表达(Ruijter，G.J.G.，Panneman，H.，Xu，D.and Visser，J.，Properties of Aspergillusniger citrate synthaseand effect of citA overexpression on citric acid production，FEMSMicrobio l.Lett.，2000，184，35-40)。Dave等人最近研究了来自黑曲霉的柠檬酸合成酶启动子PcitA(Dave，K.and Punekar，N.S.，Utility ofAspergillus niger citrate synthase promoter for heterologousexpre s s ion，J.Biotechnol.，2011，155，173-177)，该启动子能有效驱动绿色荧光蛋白的表达。关于土曲霉(Aspergillus terreus)柠檬酸合成酶启动子的研究至今未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种丝状真菌启动子及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种丝状真菌启动子，丝状真菌启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

所述丝状真菌启动子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的互补序列。

所述丝状真菌启动子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示具有60％或60％以上的同一性或具有相同功能的核苷酸序列；或

所述丝状真菌启动子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示具有60％或60％以上的同一性或具有相同功能的核苷酸序列的互补序列。

所述丝状真菌启动子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示具有90％或90％以上的同一性或具有相同功能的核苷酸序列；或

所述丝状真菌启动子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示具有90％或90％以上的同一性或具有相同功能的核苷酸序列的互补序列。

本领域普通技术人员均知晓不同启动子之间核苷酸相似性非常低，通常只是其中的一些顺式作用元件具有保守性，改变启动子中某些非重要核苷酸并不会影响启动子的活性，但改变一些核苷酸或增减一些序列会导致同一性低于100％、大于60％，因此与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列或其互补序列具有60％或60％以上同一性，具有相同功能的DNA序列也属于本发明的保护范围。

丝状真菌柠檬酸合成酶基因启动子(PcsX)的应用，所述丝状真菌启动子在调控丝状真菌基因表达中的应用。

所述丝状真菌启动子调控外源目的基因进行转录、表达。所述外源目的基因为编码绿色荧光蛋白基因sgfp。

利用所述丝状真菌启动子提供丝状真菌表达盒，其由启动子、目的基因和终止子组成，外源目的基因在启动子的调控下进行转录、表达，其中启动子为上述的核苷酸序列。所述外源目的基因为编码绿色荧光蛋白基因sgfp。

利用所述丝状真菌启动子提供表达载体，其表达载体包含上述的丝状真菌表达盒。所述表达载体为pJL-6、pJL-7、pJL-8、pJL-9。

利用所述丝状真菌启动子提供重组菌株：

1)将目的基因与上述具有启动子可操作地连接，构建其在丝状真菌中的表达载体。所述外源目的基因为sgfp，表达载体为pJL-6、pJL-7、pJL-8、pJL-9；

2)将上述表达载体转化丝状真菌，得到基因工程菌株。

其重组菌株包含上述的丝状真菌表达载体和合适的丝状真菌宿主菌。所述宿主菌株为土曲霉、黑曲霉、红曲霉、里氏木霉等丝状真菌，优选宿主菌株为土曲霉。

本发明所具有的优点：

本发明实获得的不同长度的具有启动子活性的核苷酸序列，其能够在丝状真菌中无需诱导即可启动同、异源基因的表达。

本发明的通过克隆不同长度的柠檬酸合成酶基因5’-端核苷酸序列，柠檬酸合成酶是三羧酸循环的一个关键酶，在生物体中高水平的组成型表达，使其驱动sgfp基因在土曲霉中进行表达，通过检测荧光判断sgfp的表达情况，确定该长度的柠檬酸合成酶基因的5’-端核苷酸序列是否具有启动子活性。

所述柠檬酸作为土曲霉生物合成途径中的一个关键中间产物，对柠檬合成酶的活性要求高，因此土曲霉柠檬酸合成酶的启动子效率提高。

附图说明

图1为本发明实施例提供的载体pSGF957质粒图谱。其中hph-ca sette为潮霉素抗性元件；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；Pmgpd为红曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子；GFP-F、TrpC-R1为一对引物。

图2为本发明实施例提供的pJL-6载体图谱。其中Pcs1是长度为1881bp的土曲霉柠檬酸合成酶启动子，hph-ca sette为潮霉素抗性元件；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；M13-47、GFP-s eqR为PCR验证转化子时的一对引物。

图3为本发明实施例提供的pJL-7载体图谱。其中Pcs2是长度为1124bp的土曲霉柠檬酸合成酶启动子，hph-ca sette为潮霉素抗性元件；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；M13-47、GFP-s eqR为PCR验证转化子时的一对引物。

图4本发明实施例提供的pJL-8载体图谱。其中Pcs3是长度为613bp的土曲霉柠檬酸合成酶启动子，hph-casette为潮霉素抗性元件；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；M13-47、GFP-s eqR为PCR验证转化子时的一对引物。

图5为本发明实施例提供的pJL-9载体图谱。其中Pcs4是长度为265bp的土曲霉柠檬酸合成酶启动子，hph-casette为潮霉素抗性元件；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；M13-47、GFP-seqR为PCR验证转化子时的一对引物。

图6为本发明实施例提供的PCR验证转化子的琼脂糖凝胶电泳图。分别以各转化子和土曲霉NRRL1960的基因组分别为模板，以M13-47(5’-CGCCGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和GFP-seqR (5’-CTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTG-3’)为引物对进行PCR，扩增转化载体中的PcsX元件，验证转化子。M1：1 kb DNA ladder；M2：DL2000 DNA ladder；1：pJL-6的土曲霉转化子；2：pJL-7的土曲霉转化子；3：pJL-8的土曲霉转化子；4：pJL-9的土曲霉转化子；5：阴性对照(土曲霉NRRL1960)。

图7为本发明实施例提供的出发菌株土曲霉NRRL1960在不同生长阶段的荧光检测。左列为孢子时期，中列为幼嫩菌丝时期，右列为成熟菌丝时期。

图8为本发明实施例提供的载体pJL-6的土曲霉转化子在不同生长阶段的荧光检测。左列为孢子时期，中列为幼嫩菌丝时期，右列为成熟菌丝时期。

图9为本发明实施例提供的载体pJL-7的土曲霉转化子在不同生长阶段的荧光检测。左列为孢子时期，中列为幼嫩菌丝时期，右列为成熟菌丝时期。

图10为本发明实施例提供的载体pJL-8的土曲霉转化子在不同生长阶段的荧光检测。左列为孢子时期，中列为幼嫩菌丝时期，右列为成熟菌丝时期。

图11为本发明实施例提供的载体pJL-9的土曲霉转化子在不同生长阶段的荧光检测。左列为孢子时期，中列为幼嫩菌丝时期，右列为成熟菌丝时期。

具体实施方式

所述丝状真菌(filamentous fungi)即霉菌，是一类菌丝体发达而又不产生大型子实体的真菌的统称。

柠檬酸合成酶(citrate synthase)又称柠檬酸缩合酶，在三酸酸循环第一步反应中，催化乙酰辅酶A的乙基与草酰乙酸的酮基结合生成柠檬酰辅酶A，以便后续高能硫酯键水解，释放出辅酶A，得到柠檬酸。

在本发明的实施方案中，启动子(promoter)定义为一种结合RNA聚合酶并指导聚合酶到达编码生物物质的核酸序列的正确的下游转录起始位点从而开始转录的DNA序列。RNA聚合酶能有效的催化与编码区适当DNA链互补的信息RNA的装配。启动子还可以理解为包括用于转录mRNA后用于翻译5’非编码区(介于启动子和转录起始位点之间)，cis-作用转录调控元件，如增强子和能与转录因子相互作用的其他核酸序列。

在本发明的实施方案中，载体(vector)是指能够将DNA片段(目的基因)转移到受体细胞中并能自我复制的DNA分子。

“同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分数＝相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)×100)。例如，“同一性百分比”通过下列方式来计算：在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即，窗的大小)，并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行：例如，Smith和Waterman(Smith，T.F.andWaterman，M.S.，Comparison of biosequences.Adv.Appl.Math.1981，2：482-489)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(Needleman S.B.andWunsch C.D.，A general method applicable to the search forsimilarities in the amino acid sequence of two proteins.J.Mol.Biol.，1970，48：443-453.)的同源性比对算法；Pearson和Lipman(PearsonW.R.，Lipman D.J.，Improved tools for biological sequencecomparison，Proc.Natl.Acad.Sci.，1988，85(8)：2444-2452.)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(例如，Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)；或手工比对和目测检查(参见，例如Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology(1995增刊)。

本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942-01)，DNA片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-01)，凝胶回收是采用OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01)。

实施例1

获得土曲霉柠檬酸合成酶(CS)启动子序列

根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Pcs-F1(5’-CAAGCTCGAGTGGTTGGTAGTGTGGATTATG-3’)和Pcs-R(5’-CACGCCATGGTTCGAATCCAACAAGAGTC-3’)，以土曲霉菌株NRRL 1960(ATCC 10020，CICC40205，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的基因组为模板，采用pfu DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0501)进行PCR，扩增Pcs1，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测长度约为1895 bp的条带为目的产物，产物TA克隆至pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D101A)中，测序后得到质粒pJL-1。测序证实土曲霉柠檬酸合成酶的启动子Pcs1的DNA序列为SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

tggttggtagtgtggattatgggaataagcagtgaaaaatcttcttttggtctttgcgacgccagtacagggaca

ctcggtcgagaggtcccagagtgcttgcagtggacgatgactatcggtttcaggtagaaaagaaaggatacccaa

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ctctggcgaccaggggctctcccgcctacagctggaacacagccaagcgatcgtgtccagggcctttgcgactcc

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tcaaaaatcgtatcagatgtatcacatgtgtatcggatatgggtatttttgattcaaattagcaaacacaatctt

cctcaactgttgagatgtccctccaaggcggtgacgactggcgattgcagtgagacaatcccttttggtcttagg

gcgacatgaatcagtcggaggtccaaattcggaccggagtaactacgtaggcagtttgcatgctttgagtactga

gctttgtactatttatctttatttccggagaatgtcggccaccgtgccatctctctgtacaaatttggtataggt

atatggataacatcctaaatgaggtcatatcttttgtacctaggtattcgggtggcgggccaaaggacgggagaa

agagaacgacttgccgacgtcactagccatgctctccgtttacggacggcacgggcgccgagatcgtcaaccaag

gaccgcgatgaccgcattctgaatgcgggatatggaagagggagggatcaattcaattccaatatataacatagg

tataatagatagggctgaattataagatagaatatcataaagaaaagaaaagaaaaaaaggaaaaagaaaaacct

ttcacaggattgaaaaccctggataaattgcaaaaaaaaataaaaaaataaaaaggtaggacaaattaattactt

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tgttataccctcctctcctctcttccatccttcccttcaaacagtctatcttttttagactcttgttggattcga

accatg

(a)序列特征：

●长度：1881 bp

●类型：碱基序列

●链型：双链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：土曲霉(Aspergillus terreus)

(f)特异性名称：misc-feature

实施例2

构建启动子活性分析载体

以PgpdAT-F1(5’-GACCTCGAGATATGGCCTACGAACGAATTGC-3’)和PgpdAT-R2(5’-CCCGGGTCTAGATGTGATGATTGATGAGTTGTTGG-3’)为引物对，以土曲霉NRRL1960的基因组为模板在进行PCR，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测大小约为2000bp的条带为目的片段，将目的片段经割胶回收后TA克隆至pMD18-T-simple载体(Takara，Catalog No.：D103A)，得到质粒pJL-2。

以mtpMD18-F(5’-GGATAACGCAGGAAAGAAGATGTGAGCAAAAGGC CAG-3’)和mtpMD18-R(5’-CTGGCCTTTTGCTCACATCTTCTTTCCTGCGTTAT CC-3’)为引物、pJL-2为模板，对pJL-2进行定点突变，除去pMD18-T-simple上的PciI酶切位点，得到质粒pJL-3。具体过程如下：在pfu DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增(94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸6min，16个循环；72℃延伸10min)，PCR产物经Dpn I(NEB，CatalogNo.：R0176V)消化模板质粒pJL-2，取2μL产物转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行测序验证。

以PciI(Fermentas，Catalog No.：ER1871)和Xba I(Fermentas，CatalogNo.：ER0681)酶切质粒pJL-3，回收大小约为4.8kb的片段。以GFP-F(5’-AGCCACATGTTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’)和TrpC-R1(5’-GTCGTGCCAGTCGACTCTAGA-3’)为引物，pSGF957(参见Jeong-Gu Kim，Yang Do Choi，Yung-Jin Chang，Soo-Un Kim，Genetict ransformation of Monascuspurpureus DSM1379，Biotechno logy Letters，2003，25：1509-1514的构建)为模板进行PCR，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测大小约为1.5kb的条带为目的片段，目的产物经Pci I和Xba I酶切，回收大小约为1.5kb的目的片段。将4.8kb和1.5kb两片段连接得到质粒pJL-4。

用Xba I酶切质粒pSGF957，回收大小约为3.2kb的带有潮霉素抗性筛选标签的条带。将质粒pJL-4经XbaI酶切，经碱性磷酸酶(Takara，CatalogNo.：D2250)去磷酸化后回收大小约为6.3kb条带。将3.2kb和6.3kb两片段经T4连接酶(Ferment a s，Ca t a l og No.：EL0011)连接得到质粒pJL-5。

实施例3

构建土曲霉柠檬酸合成酶启动子活性分析载体

用XhoI(Fermentas，Catalog No.：ER0691)和PciI对质粒pJL-5进行酶切，回收大小为7.4kb的gth片段。

以Pcs-F1(5’-CAAGCTCGAGTGGTTGGTAGTGTGGATTATG-3’)和Pc s-R(5’-CACGCCATGGTTCGAATCCAACAAGAGTC-3’)为引物、质粒pJL-1为模板进行PCR，扩增Pcs1，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测大小约为1.9kb，PCR产物经XhoI(Fermentas，Catalog No.：FD0694)和NcoI(Fermentas，CatalogNo.：FD0573)双酶切后，回收大小约为1.9kb的条带，即SEQ ID NO.1，与上述回收的gth片段进行连接，转化后挑取阳性克隆子进行验证，测序验证正确后获得质粒pJL-6(参见图2)。

以Pcs-F2(5’-CAAGCTCGAGCGAATCTGGCAACGTCCTCCG-3’)和Pc s-R(5’-CACGCCATGGTTCGAATCCAACAAGAGTC-3’)为引物对、质粒pJL-1为模板进行PCR，扩增Pcs2，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测大小约为1.1kb，PCR产物经XhoI和NcoI双酶切后，回收大小约为1.1kb的条带，即SEQ IDNO.2，与上述回收的gth片段进行连接，转化后挑取阳性克隆子进行验证，经测序验证正确后获得质粒pJL-7(参见图3)。

SEQ ID NO.2：

cgaatctggcaacgttctccgtgtgcattactccaagggtagaatcggtagaagtctccttaaggtaatcaaaaa

tcgtatcagatgtatcacatgtgtatcggatatgggtatttttgattcaaattagcaaacacaatcttcctcaac

tgttgagatgtccctccaaggcggtgacgactggcgattgcagtgagacaatcccttttggtcttagggcgacat

gaatcagtcggaggtccaaattcggaccggagtaactacgtaggcagtttgcatgctttgagtactgagctttgt

actatttatctttatttccggagaatgtcggccaccgtgccatctctctgtacaaatttggtataggtatatgga

taacatcctaaatgaggtcatatcttttgtacctaggtattcgggtggcgggccaaaggacgggagaaagagaac

gacttgccgacgtcactagccatgctctccgtttacggacggcacgggcgccgagatcgtcaaccaaggaccgcg

atgaccgcattctgaatgcgggatatggaagagggagggatcaattcaattccaatatataacataggtataata

gatagggctgaattataagatagaatatcataaagaaaagaaaagaaaaaaaggaaaaagaaaaacctttcacag

gattgaaaaccctggataaattgcaaaaaaaaataaaaaaataaaaaggtaggacaaattaattacttgttccgc

gaaacggaatttggcgggtacggggacaaacacaacccaaaacatgtccaagctgccgattttctctcggtagcc

cggacagcccgggggccacgggcctgccgttaccatactgtaccgatttccgccattgccagcccgccttgccga

tcgttaccgtacagtccgcgtaccggctgtatggtgacggtcagatggagaaaaaaaaaagaaaaaaagcgaccg

caaaagagcttctcccgcgatttgatccttcctctcttctct tccctttcccccctttgttgtgtccttgttata

ccctcctctcctctcttccatccttcccttcaaacagtctatcttttttagactcttgttggattcgaaccatg

(a)序列特征：

●长度：1124 bp

●类型：碱基序列

●链型：双链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：土曲霉(A spergi l l us terreus)

(f)特异性名称：misc-feature

以Pc s-F 3(5’-GATCGTCGACGGTACC AACCAAGGACCGCGATGACC-3’)和Pc s-R(5’-CACGCCATGGTTCGAATCCAACAAGAGTC-3’)为引物、质粒pJL-1为模板进行PCR，扩增Pcs3，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测大小约为600bp，PCR产物经XhoI和Nco I双酶切后，回收大小约为600bp的条带，即SEQ IDNO.3，与上述回收的gth片段进行连接，转化后挑取阳性克隆子进行验证，测序正确后获得质粒pJL-8(参见图4)。

SEQ ID NO.3：

aaccaaggaccgcgatgaccgcattctgaatgcgggatatggaagagggagggatcaattcaattccaatatata

acataggtataatagatagggctgaattataagatagaatatcataaagaaaagaaaagaaaaaaaggaaaaaga

aaaacctttcacaggattgaaaaccctggataaattgcaaaaaaaaataaaaaaataaaaaggtaggacaaatta

attacttgttccgcgaaacggaatttggcgggtacggggacaaacacaacccaaaacatgtccaagctgccgatt

ttctctcggtagcccggacagcccgggggccacgggcctgccgttaccatactgtaccgatttccgccattgcca

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aaaaaaagcgaccgcaaaagagcttctcccgcgatttgatccttcctctcttctcttccctttcccccctttgtt

gtgtccttgttataccctcctctcctctcttccatccttcccttcaaacagtctatcttttttagactcttgttg

gattcgaaccatg

(a)序列特征：

●长度：613 bp

●类型：碱基序列

●链型：双链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：土曲霉(A spergi l l us terreus)

(f)特异性名称：misc-feature

以Pc s-F4(5’-CATGGTCGACGGTACCATACTGTACCGATTTCCGCC-3’)和Pc s-R(5’-CACGCCATGGTTCGAATCCAACAAGAGTC-3’)为引物，质粒pJL-1为模板进行PCR，扩增Pcs4，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测大小约为260bp，PCR产物经XhoI和Nco I双酶切后，回收大小约为260bp的条带，即SEQ IDNO.4，与上述回收的gth片段进行连接，经测序正确后获得质粒pJL-9(参见图5)。

将pJL-6、pJL-7、pJL-8、pJL-9用DraI(Fermentas，CatalogNo.：FD0224)进行线性化，割胶回收目的片段。

SEQ ID NO.4：

atactgtaccgatttccgccattgccagcccgccttgccgatcgttaccgtacagtccgcgtac

cggctgtatggtgacggtcagatggagaaaaaaaaaagaaaaaaagcgaccgcaaaagagcttc

tcccgcgatttgatccttcctctcttctcttccctttcccccctttgttgtgtccttgttatac

cctcctctcctctcttccatccttcccttcaaacagtctatcttttttagactcttgttggatt

cgaaccatg

(a)序列特征：

●长度：265 bp

●类型：碱基序列

●链型：双链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：土曲霉(Aspergillus terreus)

(f)特异性名称：misc-feature

实施例4土曲霉的转化及筛选

1)将土曲霉NRRL1960的孢子悬液接种至50mL液体培养基ME中(20gL^-1葡萄糖，2g L^-1 NH₄NO₃，20mg L^-1 NH₄HPO₄，20mg L^-1 FeSO₄，0.4g L^-1 MgSO₄，4.4mg L^-1 ZnSO4)，浓硫酸调节pH至3.5，使孢子浓度约为10⁷个/mL，在200rmp、32℃培养12-18h。

2)用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6MMgSO₄溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中；按称取1g菌丝，加入10ml酶解液，在30℃、60 rpm处理1-3h。酶解液成分为：0.8％纤维素酶(Sigma，Catalog No.：C1184)、0.8％裂解酶(Sigma，Catalog NO.：L1412)、0.4％蜗牛酶(上海生工，Catalog No.：SB0870)、0.6M MgSO₄，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌.

3)将上述酶解后的混合液先用2层无菌的擦镜纸过滤，再用5层擦镜纸过滤，收集滤液。4℃离心收集原生质体，用预冷1.0M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(STC为1.0M山梨醇，50mM Tris·HCl-pH 8.0，50mM CaCl₂)洗涤一次，最后把原生质体重悬于150μl预冷的STC，并用STC将原生质体浓度调整为5×10⁷个/mL，得到原生质体悬液。

4)在上述原生质体悬液中分别加入10μl(约5μg)已线性化的质粒(pJL-6、pJL-7、pJL-8、pJL-9中的一种)和50μl PTC(PTC为40％PEG4000，50mM Tris-HCl-pH8.0，50mM CaCl₂)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PTC，混匀后室温放置20min；然后与上层琼脂混合后倾注于再生筛选培养基平板PDA-SH上(称取4g Difco^TMPotato DextroseAgar(BD，LOT：1165825)和22g Sorbitol(Sigma，LOT：071M00271V)，用蒸馏水溶解至100ml中，灭菌，冷却至约55℃时加入潮霉素(Solarbio，CatalogNo.：M419099)至终浓度为100μg/mL，制备平板)，在30℃、黑暗条件下培养3-4天。

5)从平板上将转化子转接至筛选平板PDA-H上(称取4g Difco^TMPotatoDextrose Agar(BD，LOT：1165825)溶解于100ml蒸馏水中，灭菌，冷却至约55℃时加入潮霉素至终浓度为100μg/mL，制备平板)，在30℃培养3-5天，挑取转化子在PDA-H筛选平板上传6代。

6)挑取筛选平板上的转化子于ME液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组，以M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和GFP-seqR(5’-CTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTG-3’)为引物对进行PCR，扩增转化载体中的PcsX元件，用1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，验证转化子。M13-47引物位于PcsX元件上游约90bp处，GFP-seqR引物设计在sgfp基因上，位于PcsX元件下游约330bp处，因此PCR扩增产物比相应的PcsX元件约大420bp(参见图6)。1％的琼脂糖凝胶电泳显示，pJL-6、pJL-7、pJL-8、pJL-9的转化子中都分别能扩增到相应大小的的PcsX元件，大小分别约为2.3kb、1.55kb、1.05kb、0.7kb，这说明pJL-6、pJL-7、pJL-8、pJL-9都分别成功整合至土曲霉NRRL1960的基因组中。以野生型土曲霉NRRL1960菌株基因组DNA模板作为阴性对照，没有扩增到DNA片段。

实施例5土曲霉转化子的荧光分析

用荧光显微镜(O lympus)分别观察经PCR验证为阳性的pJL-6、pJL-7、pJL-8、pJL-9的土曲霉转化子的荧光情况，分别取了孢子、幼嫩菌丝、成熟菌丝三种不同生长时期的材料。

孢子分别取自各土曲霉转化子的产孢平板上；幼嫩菌丝为孢子接种于ME液体培养基中，在32℃培养12h；成熟菌丝为孢子接种于ME液体培养基中，在32℃培养60h。荧光分析结果显示pJL-6的土曲霉转化子的孢子、幼嫩菌丝、成熟菌丝均有荧光，如图8；荧光分析结果显示pJL-7的土曲霉转化子的孢子、幼嫩菌丝、成熟菌丝均有荧光，如图9；荧光分析结果显示pJL-8的土曲霉转化子的孢子、幼嫩菌丝、成熟菌丝均有荧光，如图10；荧光分析结果显示pJL-9的土曲霉转化子的孢子、幼嫩菌丝、成熟菌丝均有荧光，如图11；而出发菌株NRRL1960的孢子和菌丝均无荧光，如图7。这表明在土曲霉转化子中，四种不同长度的柠檬酸合成酶启动子PcsX在孢子、幼嫩菌丝、成熟菌丝三个不同的生长时期均能有效驱动sgfp的表达，4个不同长度的启动子均有启动子活性。

Claims

1.一种丝状真菌启动子，其特征在于：丝状真菌启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

2.一种权利要求1所述的丝状真菌启动子的应用，其特征在于：所述丝状真菌启动子在调控土曲霉基因表达中的应用。

3.权利要求2所述的丝状真菌启动子的应用，其特征在于：所述丝状真菌启动子调控外源目的基因进行转录、表达。

4.权利要求3所述的丝状真菌启动子的应用，其特征在于：所述外源目的基因为编码绿色荧光蛋白基因sgfp。