CN110093277A

CN110093277A - 弓形虫腺苷酸琥珀酸裂解酶基因敲除虫株的构建方法及用途

Info

Publication number: CN110093277A
Application number: CN201910230540.1A
Authority: CN
Inventors: 方瑞; 王璐瑶; 唐定; 杨静; 李森阳; 杨承杭; 赵俊龙; 申邦; 周艳琴
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Zhijiang Yihezhong Animal Husbandry Co ltd
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: CN110093277B

Abstract

本发明公开了一种弓形虫基因敲除虫株的构建方法，该方法敲除了弓形虫腺苷酸琥珀酸酶基因，所述腺苷酸琥珀酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述弓形虫基因敲除虫株在腺苷酸琥珀酸酶位点具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。该基因敲除虫株具有毒力小的优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

Description

弓形虫腺苷酸琥珀酸裂解酶基因敲除虫株的构建方法及用途

技术领域

本发明涉及一种弓形虫腺苷酸琥珀酸裂解酶(简称ADSL)基因敲除虫株的构建方法，以及使用该方法构建的腺苷酸琥珀酸裂解酶基因缺失虫株的用途，属于生物及基因工程领域。

背景技术

弓形虫是人兽共患的寄生原虫，世界上约1/3的人口可能感染弓形虫，因为感染后大多呈隐形感染状态。弓形虫可在温血动物所有有核细胞内寄生，其宿主极其广泛。在南美和欧洲一些地区，人群和动物的感染率高达80-90％；在中国，感染率一般在10％左右。弓形虫是一种重要的机会性致病原虫，免疫功能正常的感染者通常是无症状的，而免疫功能亢进的感染者可能患脑炎，免疫功能受损的感染者和经胎盘获得弓形虫的先天性弓形虫病患者可能会产生严重疾病，如果孕妇在怀孕期间感染，则会导致胎儿发育中的严重先天性疾病，造成早产甚至胎儿死亡。在畜牧生产上，弓形虫感染经济动物(如羊、猪等)容易引起动物流产、肉/奶产品质量下降而产生巨大的经济损失，同时能将感染经食物传给人类。近年来，随着有机农业的兴起，动物的弓形虫感染率有上升的趋势。

因此，预防弓形虫病对于人类健康和畜牧业的发展均具有重要意义。然而，到目前为止，弓形虫病的预防没有良好的疫苗，因而构建具有良好免疫原性和免疫保护力的弓形虫疫苗具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种弓形虫腺苷酸琥珀酸裂解酶基因敲除虫株的构建方法，该虫株由于敲除了腺苷酸琥珀酸裂解酶基因，具有毒力小的优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

(1)本发明所述弓形虫基因敲除虫株(简称△ADSL虫株)的构建：构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgADSL质粒、制备ADSL-5UTR::DHFR::ADSL-3UTR同源模板,共电转至出发虫株ME49，经1uM乙胺嘧啶筛选、PCR鉴定获得弓形虫基因敲除虫株△ADSL。

(2)进行了基因敲除虫株△ADSL毒力试验：以野生型虫株ME49为对照,腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，1×10²个速殖子/小鼠，每组接10只，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明感染△ADSL敲除株的小鼠30天内存活率80％。

(3)不同剂量的△ADSL虫株对小鼠的毒力试验：腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，1×10²，1×10³，和1×10⁴个敲除株虫子，每组接10只，对照组接1×10²个ME49速殖子/小鼠，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明接种1×10²敲除株实验组小鼠30天之内存活率50％，1×10³敲除株30天之内小鼠存活率为0，1×10⁴敲除株30天之内小鼠存活率为0，对照组小鼠存活率25％。说明弓形虫ADSL基因敲除之后对小鼠的毒力下降明显。

(4)△ADSL虫株对小鼠的免疫保护力：以1×10²个速殖子每只小鼠的感染量接种ICR小鼠，每组5只。在第30天和75天后对免疫过的小鼠及空白ICR小鼠(每组10只)接种1×10³个ME49野生型虫株，观察、记录小鼠死亡情况，统计小鼠30天内的死亡率。结果表明△ADSL虫株对小鼠抵抗野生型虫株感染具有良好的保护力，有成为基因工程疫苗的潜力。

附图说明

图1是△ADSL的单克隆虫株PCR鉴定结果。

图2是△ADSL虫株对小鼠的毒力试验结果。

图3是△ADSL虫株对小鼠的免疫保护力试验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：弓形虫△ADSL虫株的构建

(1)出发虫株ME49

ME49是具有腺苷酸琥珀酸裂解酶基因的球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，所述腺苷酸琥珀酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgADSL质粒的构建

①用gRNA在线设计网站(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)对目标基因打靶位点进行设计，根据所设计的靶点序列设计gRNA引物：

上游引物gRNA-ADSL-F:5’-GACACTGCTCAATTTCGTCGGTTTTAGAGCTAGAA ATAGC-3’(SEQ ID NO：3)

下游引物gRNA-R：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’(SEQ ID NO：4)

②在灭菌PCR管中配制如下反应体系，其中模板DNA：pSAG1-Cas9-TgU6-sgUPRT质粒(购自http://www.addgene.org)：

③PCR反应条件如下：

④PCR结束以后，在PCR反应体系里直接加1μl DpnI，PCR仪里37℃消化30min。

⑤取新的灭菌PCR管，配制如下反应体系：

在PCR仪中，25℃反应15min；

⑥取全部反应产物转化入DH5α(100μl)感受态细胞中，涂LB/Amp平板，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落置于5ml LB/Amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊；取500μl菌液进行测序分析，若测序结果显示靶点序列已完全被替换，即质粒构建成功，利用Omega公司的去内毒素质粒提取试剂盒(Endo-free Plasmid Mini Kit II)对pSAG1-Cas9-TgU6-sgADSL质粒进行提取，并测定浓度、备用。

(3)ADSL-5UTR::DHFR::ADSL-3UTR同源模板的制备

①根据拟敲除基因的Gene ID在ToxoDB上确定该基因所在的locus，通过其所在的基因组序列确定5’同源臂(ADSL-5UTR)和3’同源臂(ADSL-3UTR)；

②根据多片段无缝连接试剂盒说明书中所介绍的方法进行5’同源臂，3’同源臂，DHFR药物筛选标签，pUC19载体无缝连接扩增引物的设计；

③利用设计的引物(表1)用高保真酶(KD plus)分别从弓形虫ME49基因组DNA中扩增获得5’同源臂和3’同源臂片段，从带DHFR的质粒(购自http://www.addgene.org)中扩增获得DHFR片段，利用所设计的特异性引物线性化pUC19载体(购自http://www.addgene.org)，分别对上述目的片段进行回收，并利用NanoDrop2000测定回收产物浓度；

表1.构建adsl-5UTR::DHFR::adsl-3UTR质粒所使用的引物

④根据回收产物的浓度配制如下反应体系：

充分混匀后，37℃反应30min，冰上放置5min；

⑤将10μl连接产物全部转化入DH5α(100μl)感受态细胞中，涂LB/Amp平板，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落置于含5ml LB/Amp液体培养基的无菌PV玻璃瓶中，37℃/180rpm振荡培养10h至菌液浑浊；分别利用M13正向和反向引物进行测序分析，若测序结果正确即可认为pADSL-5UTR::DHFR::ADSL-3UTR质粒构建成功，遂将鉴定正确的菌液进行质粒提取，-20℃保存，该正确质粒含有SEQ ID NO：2所示序列。

⑥利用高保真酶对padsl-5UTR::DHFR::adsl-3UTR质粒进行PCR扩增，扩增引物为U5adsl-F上游引物和U3adsl-R下游引物，对具有SEQ ID NO：2所示序列的目的片段(adsl-5UTR::DHFR::adsl-3UTR)进行切胶回收并测定浓度、备用。

(4)弓形虫基因敲除虫株△ADSL的获得

①收取步骤(1)所述新鲜的弓形虫速殖子ME49，利用无菌的3μm孔径滤膜过滤除掉宿主细胞碎片，1500rpm离心10min；弃上清，用Cytomix(120mM KCl,0.15mM CaCl₂,10mMK₂HPO₄/KH₂PO₄,25mM HEPES,2mM EGTA,5mM MgCl₂,pH＝7.6)重悬虫体沉淀至虫体量为1×10⁷个速殖子/ml。

②取250-300μl左右的虫体悬液到电转杯中，加入步骤(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgADSL质粒和步骤(3)adsl-5UTR::DHFR::adsl-3UTR同源模板，其中质粒和同源模板DNA摩尔比＝5:1，转染DNA的总量为10μg，总体积350μl。

③用移液枪将DNA和ME49虫体混合均匀于4mm电转杯中，并去除气泡；将电转杯置于Bio-Rad电转仪内，设置1500V、25μF、50Ω、4mm电击一次后，再用1550V、25μF、50Ω、4mm连续电击两次。

④在电转杯中立即加入1ml虫体培养液(DMEM+2％FBS+双抗)轻轻冲洗，再将该液体转移至新鲜的宿主细胞上进行培养(T25)，同时设立无DNA的转染对照组，同时进行培养观察。

⑤在60-80％转染后的虫体逸出HFF宿主细胞后，将细胞裂解使虫体从宿主细胞中释放出来；取500-2000μl虫体悬液加入到新鲜的宿主细胞中(T25)，在该培养基中加入1uM乙胺嘧啶筛选；

⑥在乙胺嘧啶作用3天后，可见宿主细胞内出现虫体增殖现象，在50％虫体从宿主细胞内逸出时将细胞裂解使虫体释放，取500-1000μl虫体传到新鲜的宿主细胞中，再进行药物筛选；

⑦在经过三至五代药物筛选后，将虫体置于含有宿主细胞的96孔板中进行单克隆筛选(接4块96孔板)，每孔接种1-3个(计算量)速殖子；剩余虫子可进行基因组DNA的提取(基因组提取方法参照基因组DNA提取试剂盒操作说明进行)，并利用(表2)引物检测同源臂整合效率和基因敲除效率，PCR1有条带说明ADSL的5’同源臂整合入弓形虫基因组中，PCR2有条带说明ADSL的3’同源臂整合入弓形虫基因组中，PCR3条带检测敲除基因ADSL是否还在基因组中，若对照组ME49有PCR3条带，而转染实验组无PCR3条带，则说明ADSL被成功敲除。

表2.△ADSL的单克隆虫株PCR鉴定引物

⑧在96孔板中培养8-11天后观察是否存在单克隆，利用无菌枪头将含有单克隆的宿主细胞从孔内刮下，加入到含有宿主细胞的24孔板中，继续培养；当24孔板中有70％的宿主细胞被裂解时，即可将孔内的虫子150μl传到新的24孔板中培养，其余的用于DNA提取以鉴定克隆；

⑨利用PCR1，PCR2和PCR3对挑选的单克隆虫株进行检测，若PCR1和PCR2有特异性条带而PCR3无目的带说明该单克隆虫株为基因敲除虫株△ADSL；将确定为△ADSL的虫株继续扩大培养至T25培养瓶；对T25培养瓶中的基因敲除虫株再次进行PCR1，PCR2和PCR3检测，PCR反应体系如下，若仍为敲除表型即可在扩大后进行冻存。

在灭菌PCR管中配制如下反应体系：

PCR反应条件如下：

⑩PCR产物鉴定：扩增完成后，取PCR产物10μL，加2ul的6×核酸上样缓冲液混匀，点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，110-120V，电泳30分钟，凝胶成像系统观察，PCR鉴定结果如图1所示，表示△ADSL的单克隆虫株构建成功。

实施例2弓形虫△ADSL虫株的用途

2.1基因敲除虫株△ADSL稀释注射液

1)稀释注射液配方

2)稀释注射液制作方法

①磁力搅拌器混匀5min。

②0.22um滤器过滤除菌。

2.2△ADSL敲除株对小鼠毒力实验

1)使用HFF细胞体外培养弓形虫速殖子，待有30-50％虫体逸出细胞；弃掉原培养瓶中的培养基，用PBS洗去已逸出的虫体和残留的培养基，加入新鲜不含FBS的稀释液。

2)用一次性细胞刮将细胞刮下，5ml注射器反复吹打悬液8-10次，使纳虫泡破裂，虫体逸出，用无菌的3μm孔径滤膜过滤纯化虫体；用细胞计数板对虫体悬液进行计数、稀释。

3)按照100个虫体/小鼠，腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，每组接10只，每天记录小鼠的存活情况，30天后对结果进行统计，结果如图2。从实验结果可以看出，接种△ADSL敲除株的小鼠30天内仅有2只小鼠死亡，存活率为80％而接种ME49的小鼠30天内有80％死亡，存活率为20％，说明△ADSL敲除株的毒力远低于出发虫株。

2.3不同剂量△ADSL敲除株对小鼠的毒力

分别向不同组7周龄雌性ICR小鼠，按照每组每只接种1×10²，1×10³和1×10⁴个敲除株虫子进行腹腔接种，每组各接10只小鼠，对照组小鼠每只接种1×10²个野生型ME49，每天记录小鼠的死亡情况，30天之后统计小鼠死亡情况，结果如下表显示，接种野生型ME49的对照组小鼠30天死亡率达75％，接种1×10²敲除株实验组小鼠在30天内死亡50％，接种量越高死亡率越大，1×10²为安全接种量。

表3接种不同剂量△ADSL敲除株对小鼠存活率的影响

2.4△ADSL敲除株对小鼠保护力实验

以1×10²个速殖子每只小鼠的感染量接种ICR小鼠，每组5只。第75天后对免疫过的小鼠及未经免疫的对照ICR小鼠(每组10只)接种1×10³个ME49虫株。观察、记录小鼠死亡情况，30天后统计小鼠死亡率。免疫实验结果如图3，对照组小鼠感染ME49株在30天内全部死亡，经△ADSL免疫过的小鼠再次感染高剂量野生型虫株能100％存活，说明△ADSL虫株对小鼠抵抗野生株毒力具有良好的保护力，有成为基因工程活疫苗的潜力。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 弓形虫腺苷酸琥珀酸裂解酶基因敲除虫株的构建方法及用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6816

<212> DNA

<213> 弓形虫(Toxoplasma Gondii)

<400> 1

atggcactct acgagccgcc gggagacgag gacgggtgcc gcggcgcctc gtcccccgcc 60

tctgcgacca attccagttc tgaccatctt tcgcgtcttc tggaaggccc tctggaagcg 120

gctgaggcgg cggcagaggc tgctcggctg cgcccaacgg cggacagtga agaggacgag 180

gtttcaaacg acgctgcgcg ccgtcggttc cgcaatctct cagaggaaca cattgccatc 240

ttgagcagcc tcaatcagaa ccagctcctg aaaggtaggc tattttgacg gtacagcacc 300

gctccggcga acgcgagaca caagaatgct cagttccaag gcgacgcctt tcgagtgcaa 360

aaaagacctt cccgatgcgg ggcgttccgc cacgaccgtc tctgcctcga ttccgctccc 420

atctgctcag aattcacttg agcatttgcg tatgcttgtc gtaggctctg catttcttag 480

agcggccgtc gggaagaggg ctacatggtt agacaagtat ccggtggatt cgcacgtgca 540

cgctggagac gtcagatcct cgagtgtgta tttccttcac atgcgacgac gtatattcca 600

gtggtgtgtt tgtcgtctcc cgtctggact ttttgtctct cgcccttgcc tttggaggct 660

tccacagaag caacgcattc ctgcttcctg actctctcac cctcgacgag tcaaggtcct 720

tttttcctgc atcagtcgcg tctcttctca gctttgctcg agtcgagtct gtcttcccct 780

cgcttctcca cttccgtcgc ctctccgtgg cgtccgcgaa cgggcgttcg gtgtcttcat 840

ggatccttcg tctttctgag tccacctcga gcatattgcg agcgctgcgg ttcttgcaga 900

cttcgtgaca tgcttctcgg aggaaaggct tcaggggaaa ctgttgtttt gtcttttgca 960

gtggttgacc aaatctgtga acggcaacat cccctcgatg ccgtcctcga caacgtagcc 1020

gccgatgtgg ctgccactgt gcgcaaggta agttccccgt ccctctacgt ttctccagaa 1080

aatcaactca tgaacacaca cacatatata tatatataat atataatata aatccatgct 1140

tatacatata tgtatgtata tatatgtata tataagtagg tattcatgct tggttcacat 1200

cgttttgatg catgaagaaa caaacgtaca ctctgtatct ggacgtaccc cgcgcaagac 1260

ggtggggcgg aaaactcttt cagttgacgg gttgtttggc ttcgttcgac ggtgtgcagc 1320

ttcgtcattc accttttgtt tctatttgcg gctacgcgag tgtctctgtg agagtgtctg 1380

tttcttgttt caccaggtcg cagagcagca gcgccaagcc gacgcagact cctcgctgga 1440

cgcggaccaa gcgacggctg tcgctgcttc aaactccttg aataaaagca acgcagaccc 1500

gtcgtcatcg tcagactact tgcacgtcgc ccgattcgtt cctcttcgac tcaccttcga 1560

aggtgagttc gcagaacgca cccggtccgt gacccccgtt ccacgcaggg acctccccgc 1620

cacagacggc aaagctgtct gcatcgactg aacttgaaag cgcgccgtga cctgtctggc 1680

tcatactcaa gaacctcctc atcccgacgg tgtgcagccg gcgctcggcg atctcagaca 1740

cctctccatg cgtttcttgg ctttttttga ccgtacattt tgagtcgtcg tggaggactg 1800

agggacgctt cggaccccgg cgtgtacagc cgaagctcgt ttgtctcgct tctttgcctg 1860

tcttaactat atctcgtttg ttttggtttt ttgcctgtct taactatatc tcgtttgttt 1920

tggttctttg cctgtcttaa atatacctcg tttgttttgg ttctttgcct gtcttaaata 1980

tatctcgttt gttttggttc tttgcctgtc ttaaatatac ctcgtttgtt ttggtttttt 2040

gcctgtctta aatatatctc gtttgttttg gttctttgcc tgtcttaaat atatctcgtt 2100

tgtcttggtt ttttgcctgt cttaaatata tctcgtttgt cttggttttt tgcctgtctt 2160

aaatatatct cgtttgtctt ggttctttgc ctgtcttaaa tatatctcgt ttgttttggt 2220

tttttgcctg tcttaaatat atctcgtttg ttttggttct ttgcctgtct taaatatatc 2280

tcgtttgttt tggttttttg cctgtcttaa atatatctcg tttgttttgg ttttttgcct 2340

gtcttaaata tacctcgttt gtcttggttt tttgcctgcg cccagagcgc gtatttctgc 2400

gactcctgga gagcacgctg gaggtgtcgg agtacactga caaaatcgac attctctgtg 2460

gcggcagcaa ggcgcgacga atggcgagag aaattcgaca agtctgtgcc attctctccg 2520

gcctcgctct cgcgcacaac tacggtcagt tctgccgttt tcttccttct gcatgcaacc 2580

agacatgtcg ccgtctgcgc aggacctttt ccttgtcgac actctccacc acagagaacc 2640

ttcatctcag gaaagacaca ggcatggccc cctgagtttg ttctctgcgg gtttacgcgg 2700

tgctcgtctc tttttccatc tccagtgccc tgtgtcttca agctttgagc gctgtgcttt 2760

tcacagtgta gagaacgcaa tcaaggaccg cgcctgcatc gcctgcatcg cctgcatgca 2820

gcgtagcttc ctcatatgct gctggttcgc tttctttgcc tcggccgttt ttgcagaaga 2880

gggacagcgg ctcgttcggg accatgactt tgtgtcgaac agggcgttct ttcagacggt 2940

cttcgagatc gggcgtcgct acaaaattct gaatccggag cgaatgcgga gtgcgtatgg 3000

aaagctgatt tacctcctga tggatgccaa gaaacctgag gtgctgcagc tgctccagtt 3060

cgactgcgtc acccctggtg agagcctcga gaatgtcgct tcgacctgag caacctctca 3120

gtctccgcgg atctagccgt tttcactctc gacagatttg ttgtcgtttt tccgcgtatg 3180

tcagggtctg tgacacgcga tgcttcaagc ctttcttttc tttggacttc cttcagcatc 3240

tgttccttcg gctgtttcgc gcttcgtcga ttctctgttt cttcgcagtt ctttctacga 3300

aacgctgtgg aatgcgttcg tccattcacc tcagtctttg cgaatttgtt tcttcagtca 3360

acacggtcta ctccctgctc gcgggaaaga agaacggctt gcagcttctc aaggatcctc 3420

tcgttcgcgt cgccaccatg ggtacctctg aaaggagtgc cgtgtgtctc gctcttgctt 3480

tcgtcgctgt ctctttgttt cctcgacctc tcgtgtctcc ccgccttcct gtctcctctt 3540

ctgtctctgc tgggtttttt tgtttgtgtt ttgatggggg ggagcgccgt tttgcttgtg 3600

ctggtcctct ctgttacctc tcccgcgtgt gtctgggcaa cgcgttttcg cttggcgatc 3660

gtgagctgct tctggcgaag cggatcctaa agactcttca gcttctgtcg ttttctgtgt 3720

cgttatgctt ttgaacggcg cagaaatcat gccggaggga aagagtcgcg cccagattca 3780

gagagaaatc aaggagaagc agaacgcaat caagacgctg gcgagaaagt atgcgggacg 3840

agatgtcccc aagcactctc caggattctt tggactccgt gagtcttcca agatcccttt 3900

gcgtccatac gtttctttct ctctctttct ctccctctct tgctctctcc tccacctttc 3960

ctttctctcg ctctcgcccg tcgcctcctc tttctcccga gtcaacgcga gcagaagtct 4020

gcttgttggc tgtcgtcttt tcaggccttt ctttctttca gagatccgac agtggaggag 4080

acgaggggct tcgcgcagag acgggagacg agagaagcga ccttctgacc cccgacgaaa 4140

ttgagcagtg tctctactct ctcggggacc acaatacgta tctccgattc aacagggaac 4200

cttgcgaccg catgattggg taggcgtctg ttcggcaaga gtctcagtgg cttttgtttt 4260

ctgtcgtctc ctctctcggc attccttgtg gcggatgttg tcaaagtcga gaggcgcacc 4320

catgacccag cctctctgga gatccgcgcg catctgctcg ctggtacagt gacgcgctgc 4380

gaaccagaca tgcgaatgtg atactttgaa ggaaccgatg ctctcgtctc ctctctcggc 4440

gttccttgtg gcgtctgttt ctcctcgatc cacgcgtgct cttcctcgtt ctctccctgc 4500

ctcttcttct ttcgacacag tcctctcctg acttgcttct cgttctcctt gcgcagcttc 4560

cttcgacaat acttcgaccc ctcggagcct gaggaaggtt actcgcttgc catctcttcg 4620

gggactggcg gtgcccgttt gacgcattct cacaggtctg ggagctttcg aaacgacacc 4680

acacctgaga agctcgagtg ctttcataac tgtcttttct gacgtagcgc agtaaatcct 4740

caagaaatgg acatccccgg ttctgtgtct gtcgtatccc ttgcccggcg tctcgtttgc 4800

gctttttcgg ctcgtttttt ccagtctgtc tcacagccac acacctgctc ttgggtgaat 4860

cttcgcctgc gtcttgcaga tcacgtttcc aacttctgtc tgtctttttg tctccttttt 4920

tcttgcctcc ttgtgacccg ttcgttctcg ttgtcttctc catgaagccg tcgagggttc 4980

agtctcctcg gcatctctcc ctttcctcgg ggtccgtggt tcgcctcttc tctcgctgtc 5040

cagacgccgt tttctcgccg gtgggagaag tcgttctttc gtggacacaa cgtccctctc 5100

gttgcgtcgc ctctgttctg cgtttccgcc gcagtcgcca gttcgtctac gtccttcagt 5160

cgctaactct gtggcgcgag gtctgcagcg aaatgtttgt cctctggcaa atggcagaag 5220

cagacatgct ccacagtggc aactgctatc gcctcagaga caccggccag ggcctcaacc 5280

ggtaaacaca aaaacaaatg ccatttcgtc tgcaagaaaa caatgtgaac acccattcat 5340

acatctatac atctatatat ttatatatat atatatatgt atatatatgt atgtatatgt 5400

atgtatacgt agttgtctat atttttgtgt gtatgtatgt ggatgtgtat tttcagagtg 5460

caagattgcc cgcgcgtgag caacgcgatg tacgccattt tggagcgcgt ccagcgcctc 5520

accacatcct gggtgggctc tgcggtcgtt catttgggag atcacaatgt cccgaatgcg 5580

ctgatgttca tcgacaagta cactcaggta acaggctccg ttaaaaacaa gcttctctcg 5640

gctgcgcgtc cgtttttgcg acgaccatcc tctcagtggg aagccgcatc tcttcaaatg 5700

cagaagcgtt tctcctgagg ggtcccctgc gcccgtgttc aataggatgt tcacaggcgt 5760

tgtggctttt tggtccaccc gtcgccaggc gtcagctttt gtcgctgccc ttccttctcg 5820

ctcgcttctt ctctgttttc ctctctcttt ctgtctgttc ctcgctcgtc cacgcaccgt 5880

gcatgcgcgc ctgtgctgat gtccgtggat ccgttcgccg cgcttcgttt tcgcctttcc 5940

gagggccggg tgtcagttgg gaagagacgc gcggtgagat gcggcatgtg cgtctccagg 6000

ttcctcggat tctaggaccg ttggtgctct gcctggagaa gttgcccgaa gtgtacgagt 6060

cgaagcaagc gatgcggaac tactttgaca accaattcgg cggcctccac gccctgcggt 6120

gcgccagctt tccttgaagc agtgaatcga aggaaaggac actgagggag gggagaaacg 6180

gagagaacag cgcgaaaacc gaaaacaggg gcagacgaga aagaattaga cgggaagaac 6240

gacacaggaa aggcgaagcg cagcgaggag aacagaggca ggagcgaaca tggaaggcga 6300

aaaaaaaacg cgggagaaag gaaaacatgg aaggagagaa aagacgaaca gatctacgaa 6360

cgcacgagag caacgtcgag agagctgtgc aggggtacag tgtgtagctg ggcgtttctt 6420

cggctcttat gtgtgacttt ctctcctgtc tgttcgagaa gcaaaacaac ttgttctaac 6480

gtcgccgctt cgagcgtcaa cgccatttct tttgcccgtt gccgcctcgc gtgaagcgcc 6540

gtctttttta atgtttttca cctctcgcct gctctctctc tctctctgtg ctctgggtat 6600

gttccgcagg aagcagattc tgtgcgactt cttcaggcac gcgttcgacg gaagtggagg 6660

agacaatttc ttcgatgcag gcagctgtat agacggtcgg ttaacgtcgg cctggaactg 6720

gtgctcgacg atcgagaaga aacgtttctt tcctgctttc ttgctcacgg ggtttcaggg 6780

attcgatgga aaattctgat tgttttgtcg acaaaa 6816

<210> 2

<211> 8297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ctaatttttg ccgggtctgg gcccccaaaa tagctggatt catcatcgtg cgaacgaaaa 60

tgtgtctgag ggcagtggtg ttgcgaggca ccctcccgtg tgctgccacg tccaaccttt 120

ctctggaaga ggaacgcttg gggcttcttt gccggacaca catttttgct ccagctgtgg 180

cgttgttttt gtcatacatg tggaaagctg accctctgtt tctcgtcgtc gcgtacaatt 240

tcagctgaaa tcctcacttt gcgcatcttt cttttcggcg cttcttttct ccggcgagcg 300

tccacgggtc gtccgtcgct gccgctcact cttccctcct cacgtttccc tctttccgcg 360

cttcaccgca gcatgtagtg taagcgacaa gtgcacgatt ttcacggcct ttatcgggtc 420

accgttgcga tttcggccgt ttgtacaact cgccatccag tccggtagag ctcgattcgc 480

gtccctcggc ggttccgctc gcaggttttc catttctttt ggcttctccc gcgctttctc 540

atcgcttttc acttgacagc gcccgggccg accggctttc tagcgttcct gtccgttcca 600

tgtctctctc ccgcgctgtt tcgcgacttt tttgcttgta tccgcccact tcccgtgtgg 660

caggaagcct ccggatgtcc gccgctctcc acgtactttt ccccaagaca acgccgctct 720

tttagcgctc tccgtccccc cttacgtcgc cggtggtccc gcgaggcgta cgttcacgtt 780

tctgcctggc cgccgcacag attccgccga cccgttccac ccattctcat cgaacggggt 840

gcagttaaac taccgaccgc gtcttttctt caaggcagtt ccgctctctt cttcgtctcg 900

caacccgcgc agaagacatc caccaaacgg tgttacacaa tcaccttgtg tgaagttctt 960

gcggaaaact actcgttggc attttttcta taacttcgta tagcatacat tatacgaagt 1020

tatagaattc cgacaaaatg gaggtccata ctaaccaaga tccacttgac cctaggatga 1080

gaggatcggg atccatgggt tcagagggcc aggctgtaaa tcccgtgagt cgtcctcaca 1140

aatcatcaag caggtgtcct cagggagact gcctgactga gttatgctaa ttcctttcta 1200

ctttggcgtg gtcacggggg cgcgccggat ccttaattaa gtctagcatg tcattcgatt 1260

ttcacccccc gcgtagttcc tgtgtgtcat tcgttgtcga gacaactctg tcccgccccg 1320

gtgctgttcc atatgcgtga ctttcccgca attttttcag actttcagga aagacaggct 1380

ccggaacgat ctcgtccatg actggtaaat ccacgacacc gcaatggccc ccagcacctc 1440

tatctctcgt gccaggggac taacgttgta tgcgtctgcg tcttgtcttt ttgcattcgc 1500

tttccaaaaa agagagccat ccgttccccc gcacattcaa cgccgcgagt gcggtttttg 1560

tcttttttga gtggtaggac gcttttcatg cgcgaactac gtggacatta agttccattc 1620

tctttttcga cagcacgaaa ccttgcattc aaacccgccc gcggaagatc cgatcttgct 1680

gctgttcgca gtcccagtag cgtcctgtcg gccgcgccgt ctctgttggt gggcagccgc 1740

tacacctgtt atctgactgc cgtgcgcgaa aatgacgcca tttttgggaa aatcggggaa 1800

cttcattctt taaaagtatg cggaggtttc ctttttcttc tgttcgtttc tttttctcgg 1860

gtttgataac cgtgttcgat gtaagcactt tccgtctctc ctccgtgctt tgttcgacat 1920

cgagaccagg tgtgcagatc cttcgcttgt cgatccggag acgcgtgtct cgtagaacct 1980

tttcatttta ccacacggca gtgcggagca ctgctctgag tgcagcaggg acgggtgaag 2040

tttcgcttta gtagtgcgtt tctgctctac ggggcgttgt cgtgtctggg aagatgcaga 2100

aaccggtgtg tctggtcgtc gcgatgaccc ccaagagggg catcggcatc aacaacggcc 2160

tcccgtggcc ccacttgacc acagatttca aacactttcg tcgtgtgaca aaaacgacgc 2220

ccgaagaagc cagtcgcctg aacgggtggc ttcccaggaa atttgcaaag acgggcgact 2280

ctggacttcc ctctccatca gtcggcaaga gattcaacgc cgttgtcatg ggacggaaaa 2340

actgggaaag catgcctcga aagtttagac ccctcgtgga cagattgaac atcgtcgttt 2400

cctcttccct caaagaagaa gacattgcgg cggagaagcc tcaagctgaa ggccagcagc 2460

gcgtccgagt ctgtgcttca ctcccagcag ctctcagcct tctggaggaa gagtacaagg 2520

attctgtcga ccagattttt gtcgtgggag gagcgggact gtacgaggca gcgctgtctc 2580

tgggcgttgc ctctcacctg tacatcacgc gtgtagcccg cgagtttccg tgcgacgttt 2640

tcttccctgc gttccccgga gatgacattc tttcaaacaa atcaactgct gcgcaggctg 2700

cagctcctgc cgagtctgtg ttcgttccct tttgtccgga gctcggaaga gagaaggaca 2760

atgaagcgac gtatcgaccc atcttcattt ccaagacctt ctcagacaac ggggtaccct 2820

acgactccgt ggttctcgag aagagaagga agactgacga cgcagccact gcggaaccga 2880

gcaacgcaat gagctccttg acgtccacga gggagacaac tcccgtgcac gggttgcagg 2940

ctccttcttc ggccgcagcc attgccccgg tgttggcgtg gatggacgaa gaagaccgga 3000

aaaaacgcga gcaaaaggaa ctgattcggg ccgttccgca tgttcacttt agaggccatg 3060

aagaattcca gtaccttgat ctcattgccg acattattaa caatggaagg acaatggatg 3120

accgaacggg cgttggtgtc atctccaaat tcggctgcac tatgcgctac tcgctggatc 3180

aggcctttcc acttctcacc acaaagcgtg tgttctggaa aggggtcctc gaagagttgc 3240

tgtggttcat tcgcggcgac acgaacgcaa accatctttc tgagaagggc gtgaagatct 3300

gggacaagaa tgtgacacgc gagttcctcg attcgcgcaa tctcccccac cgagaggtcg 3360

gagacatcgg cccgggctac ggcttccagt ggagacactt cggcgcggca tacaaagaca 3420

tgcacacaga ctacacaggg cagggcgtcg accagctgaa gaatgtgatc cagatgctga 3480

gaacgaatcc aacagatcgt cgcatgctca tgactgcctg gaatcctgca gcgctggacg 3540

aaatggcgct gccgccttgt cacttgttgt gccagttcta cgtgaacgac cagaaggagc 3600

tgtcgtgcat catgtatcag cggtcgtgcg atgtcggcct cggcgtcccc ttcaacatcg 3660

cttcctattc gcttttgacg ctcatggttg cacacgtctg caacctaaaa cctaaggagt 3720

tcattcactt catggggaac acgcatgtct acacgaacca tgtcgaggct ttaaaagagc 3780

agctgcggag agaaccgaga ccgttcccca ttgtgaacat cctcaacaag gaacgcatca 3840

aggaaatcga cgatttcacc gccgaggatt ttgaggtcgt gggctacgtc ccgcacggac 3900

gaatccagat ggagatggct gtctagcgga aatacagaag ctgcccgtct ctcgttttcc 3960

tctcttttcg gagggatcag ggagagtgcc tcgggtcgga gagagctgac gagggggtgc 4020

cagagacccc tgtgtccttt atcgaagaaa agggatgact cttcatgtgg catttcacac 4080

agtctcacct cgccttgttt tctttttgtc aatcagaacg aaagcgagtt gcgggtgacg 4140

cagatgtgcg tgtatccact cgtgaatgcg ttatcgttct gtatgccgct agagtgctgg 4200

actgttgctg tctgcccacg acagcagaca actttccttc tatgcacttg caggatgaat 4260

tcctacccag ctttcttgta caaagtggtc gtctctagtt tttttgacag accgctgacg 4320

gaatcaggga caccagcgac aagcgcgacc acgtgtgcca gcgcgaggtg gcctacgccc 4380

acagcgtgcc ccgcatcacc agcgccatcg gtagcgacga ggatatgcat agatcttaat 4440

taataacttc gtatagcata cattatacga agttataaaa tggtgagcaa gggcgaggag 4500

ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 4560

ttcagcgtgt ccacctcagt tgtcggcacc gtccgcagtg cctgcaacct gcgcttaatg 4620

gcttttcgaa cgactcgaaa ctgtgtgctt cttcgattca aaggaacctt tgggggctct 4680

ccagggtcgc cgcagagctg gaaagaaatc gcgtgaaggt ctcggcttcc tcagtcctgg 4740

aaatattcac cggagtacca cacgcgatct ctcacccctc ctcccgcgtt taggttctgc 4800

cctgctcgtt tctgtcgaaa gtttttcctt ctccattagt ccttcctgac gagcgttttc 4860

ctttccactc gtttatgtcg atcgtcttct ttctggctcc tgtctgtgca gatgcttctt 4920

tgtctactct tgtcttcata gatgcgtctt tgtctcttct tccctgtcaa gcttcttcct 4980

tctctgttca ttaatgccga tactcttctt tctcgtccgg tgtctgtgga gacgcttctc 5040

gttctctctc tagtctttct gctgtcgagg ttcgcaccgt ctgtttctct gtgtagtgtg 5100

tttccgctac acatgacgcg cctttgtgcc tggaatctcc cgtctttctt cacatgtcct 5160

tcgtgctctc gacgcccgct tcttaggtct ttttcttctg gcggtccggt tatctcaccg 5220

aaacccacac aggtttgtgt tatgctcgct tctcgtggac tgcttctttc cggctttcgt 5280

tctcctcttt ctctcatttt cgtagcttct tgtgcacggc tgtctctgct tctgtcgtga 5340

gtctcctcgg gcatggaagg tctttccgcc gaccccccag gagacagcag agaggagaga 5400

gagcatggag gaagcagaga aaaaacgaag agccgagaga cgcgaaaggc aacgcgaagg 5460

caccagacac aatcgccaca cagaaccgca cagagcacac agcatctttg ctcgagtctc 5520

aaagaggaat cgtagatcaa taagacatgt ccgatagaat cgaagtccat tgtttctgcc 5580

ccccccacgg ttcccgcagc tccgcctgtg gagtcgcaca gaaccttcgc tacgtccttt 5640

cgctctcgag aatagatttg agtctgcggg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 5700

gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 5760

cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 5820

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 5880

gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 5940

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 6000

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 6060

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 6120

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 6180

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 6240

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 6300

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 6360

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 6420

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 6480

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 6540

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 6600

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 6660

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 6720

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 6780

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 6840

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 6900

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 6960

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 7020

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 7080

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 7140

acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 7200

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 7260

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 7320

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 7380

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 7440

gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 7500

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 7560

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 7620

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 7680

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 7740

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 7800

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 7860

cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg 7920

acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 7980

atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct 8040

ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa 8100

taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc 8160

gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag 8220

ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt 8280

gtaaaacgac ggccagt 8297

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gacactgctc aatttcgtcg gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

aacttgacat ccccatttac 20

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gttgtaaaac gacggccagt ctaatttttg ccgggtctgg 40

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gatgtcttct gcgcgggttg cgagacgaag aagagagc 38

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gccacaagtt cagcgtgtcc acctcagttg tcggcaccgt 40

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gctatgacca tgattacgcc cgcagactca aatctattc 39

Claims

1.一种弓形虫腺苷酸琥珀酸裂解酶基因敲除虫株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)出发虫株是具有腺苷酸琥珀酸裂解酶基因的弓形虫虫株，所述腺苷酸琥珀酸裂解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgADSL质粒的构建：利用软件设计弓形虫腺苷酸琥珀酸裂解酶基因的打靶位点，根据所设计的靶点序列设计gRNA上、下引物，然后以pSAG1-Cas9-TgU6-sgUPRT质粒为模板，利用所设计的引物及Q5点突变试剂盒进行PCR扩增，对扩增产物进行KLD酶连接并转化DH5α感受态细胞，经提取后得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgADSL质粒，其中，上、下游引物序列分别为：

gRNA-ADSL-F：5’-GACACTGCTCAATTTCGTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’

gRNA-R：5’-AACTTGACATCCCCATTTAC-3’；

(3)adsl-5UTR::DHFR::adsl-3UTR同源模板的制备：以出发虫株的基因组为模板，设计引物，分别扩增adsl-5UTR和adsl-3UTR同源臂，以pUC19质粒及含DHFR质粒为模板分别扩增pUC19载体、DHFR药物筛选标签，连接上述4个片段，构建重组质粒pUC19-adsl-5UTR::DHFR::adsl-3UTR，该质粒即腺苷酸琥珀酸酶基因的敲除质粒，利用U5adsl-F、U3adsl-R引物扩增上述基因敲除质粒即获得adsl-5UTR::DHFR::adsl-3UTR同源模板，其中，扩增adsl-5UTR和adsl-3UTR同源臂所用的上、下游引物序列分别为：

U5adsl-F：5’-GTTGTAAAACGACGGCCAGTCTAATTTTTGCCGGGTCTGG-3’

U5adsl-R：5’-GATGTCTTCTGCGCGGGTTG CGAGACGAAGAAGAGAGC-3’

U3adsl-F：5’-GCCACAAGTTCAGCGTGTCCACCTCAGTTGTCGGCACCGT-3’

U3adsl-R：5’-GCTATGACCATGATTACGCCCGCAGACTCAAATCTATTC-3’

(4)弓形虫基因敲除虫株的获得：将步骤(2)中的pSAG1-Cas9-TgU6-sg ADSL质粒和步骤(3)中的adsl-5UTR::DHFR::adsl-3UTR同源模板共电转至步骤(1)中所述出发虫株，通过1uM乙胺嘧啶筛选，PCR鉴定，获得腺苷酸琥珀酸酶基因敲除虫株，所述基因敲除虫株缺失SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

2.弓形虫腺苷酸琥珀酸裂解酶基因敲除虫株在制备抗弓形虫基因工程活疫苗中的用途，所述弓形虫腺苷酸琥珀酸裂解酶基因敲除虫株是按照权利要求1所述的方法构建。