CN108676848B - 用于检测融合基因的混合基因、标准质粒、试剂盒及其制备方法 - Google Patents
用于检测融合基因的混合基因、标准质粒、试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测融合基因的混合基因，其基因序列如SEQ ID NO:1所示，包括SEQ ID NO:2的BCR‑ABL融合基因、SEQ ID NO:3的AML‑ETO融合基因、SEQ ID NO:4的PML‑RARA融合基因和SEQ ID NO:5的ABL内参基因；还涉及含有混合基因的标准质粒，包括SEQ ID NO:6的PUC57质粒；还涉及一种含有标准质粒的试剂盒；还涉及一种标准质粒的制备方法。其优点在于，能够用于在定量检测人的骨髓或外周血标本中的白血病相关融合基因中BCR‑ABL、RUNX1‑RUNX1T1(AML‑ETO)和PML‑RARA融合基因双标准曲线建立；有效地提高了检测效率及精确度，降低人为操作失误，避免出现多质粒污染；标准质粒的最低检出拷贝数为1*100个/ml；操作简单，不易污染，检测范围大，能够有效降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于检测融合基因的混合基因、标准质粒、试剂盒及其制备方法。
背景技术
目前针对临床血液病融合基因定量检测，主要是以合成ABL内参基因作为单荧光标准曲线，进行相对定量；也有以分别合成ABL内参基因和目的基因序列做双荧光定量标准曲线，进行定量。
单荧光标准曲线，存在需要基因扩增效率达到100％的理想状态，在实际检测过程中难以达到，检测结果准确性和一致性难以保证。另外由于目前血液病融合基因定量项目较多，双标准曲线法，需要合成多个目的基因质粒，有操作复杂，易污染，检测范围小的缺点。
因此，亟需一种混合多基因序列的标准质粒，能够简化日常白血病融合基因荧光定量PCR法检测过程中的双标准曲线的制备。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测融合基因的混合基因、标准质粒及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一方面，本发明提供一种用于检测融合基因的混合基因，其基因序列如SEQ IDNO:1所示。
优选地，如SEQ ID NO:2所示的BCR-ABL融合基因、如SEQ ID NO:3所示的AML-ETO融合基因、如SEQ ID NO:4所示的PML-RARA融合基因和如SEQ ID NO:5所示的ABL内参基因。
另一方面，本发明提供一种包括上述混合基因的用于检测融合基因的标准质粒，其还包括具有如SEQ ID NO:6所示的PUC57质粒。
上述融合基因、内参基因和PUC57质粒的序列如下表所示：
表1基因序列表
本发明还提供一种含有标准质粒的试剂盒。
最后，本发明还提供一种用于检测融合基因的标准质粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、对需要进行荧光定量的融合基因和内参基因设计相对应的引物探针；
步骤S2、根据步骤S1的所述引物探针的位置截取所述引物探针对应的所述融合基因和所述内参基因的基因序列；
步骤S3、将步骤S2中截取的所述融合基因的基因序列和所述所述内参基因的基因序列进行基因合成，得到混合基因；
步骤S4、将步骤S3中的所述混合基因插入到PUC57质粒，得到标准质粒；
其中，在步骤S1中，所述融合基因包括如SEQ ID NO:2所示的BCR-ABL融合基因、如SEQ ID NO:3所示的AML-ETO融合基因、如SEQ ID NO:4所示的PML-RARA融合基因和如SEQID NO:5所示的ABL内参基因。
优选地，所述BCR-ABL融合基因的对应的引物探针包括如SEQ ID NO:7所示的BCR-ABL-F、如SEQ ID NO:8所示的BCR-ABL-R和如SEQ ID NO:9所示的BCR-ABL-Probe。
优选地，所述AML-ETO融合基因的对应的引物探针包括如SEQ ID NO:10所示的AML-ETO-F、如SEQ ID NO:11所示的AML-ETO-R和如SEQ ID NO:12所示的AML-ETO-Probe。
优选地，所述PML-RARA融合基因的对应的引物探针包括如SEQ ID NO:13所示的PML-RARA-F、如SEQ ID NO:14所示的PML-RARA-R和如SEQ ID NO:15所示的PML-RARA-Probe。
优选地，所述ABL内参基因的对应的引物探针包括如SEQ ID NO:16所示的ABL-F、如SEQ ID NO:17所示的ABL-R和如SEQ ID NO:18所示的ABL-Probe。
上述引物探针的基因序列如下表所示：
表2引物探针基因序列
优选地，还包括：
步骤S5、对步骤S4制备的所述标准质粒进行验证
步骤S51、测定所述标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数；
步骤S52、将所述标准质粒进行梯度稀释；
步骤S53、制备荧光定量PCR体系；
步骤S54、进行荧光扩增检测；
其中，在步骤S53中，所述荧光定量PCR体系包括12.5μl Realtime PCR masterMix、8.5μl ddH2O、0.8μl F、0.8μl R、0.4μl Probe、2μl梯度稀释后的所述标准质粒。
优选地，所述步骤S52中，梯度稀释后的所述标准质粒的拷贝数分别为1*100个/ml、1*101个/ml、1*102个/ml、1*103个/ml、1*104个/ml、1*105个/ml、1*106个/ml、1*107个/ml、1*108个/ml、1*109个/ml。
优选地，所述步骤S51中，利用nanodrop2000测定所述标准质粒的浓度及其A260吸光度。
优选地，所述步骤S51中，拷贝数的计算公式如下所示：
Copy number＝50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+混合基因序列长度)*660)。
优选地，对所述标准质粒进行ABL内参基因验证时，所述F为ABL-F，所述R为ABL-R。
优选地，对所述标准质粒进行BCR-ABL融合基因验证时，所述F为BCR-ABL-F，所述R为BCR-ABL-R。
优选地，对所述标准质粒进行PML-RARA融合基因验证时，所述F为PML-RARA-F，所述R为PML-RARA-R。
优选地，对所述标准质粒进行RUNX1-RUNX1T1(AML-ETO)融合基因验证时，所述F为AML-ETO-F，所述R为AML-ETO-R。
优选地，所述步骤S54中的荧光扩增检测的方法为：94℃5min；94℃15s，60℃40s，40个循环。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的一种用于检测融合基因的混合基因、标准质粒及其制备方法，能够用于在定量检测人的骨髓或外周血标本中的白血病相关融合基因中BCR-ABL、RUNX1-RUNX1T1(AML-ETO)和PML-RARA融合基因双标准曲线建立；有效地提高了检测效率及精确度，降低人为操作失误，避免出现多质粒污染；标准质粒的最低检出拷贝数为1*100个/ml；操作简单，不易污染，检测范围大，能够有效降低检测成本。
附图说明
图1是实施例2的ABL内参基因的验证示意图。
图2是实施例3的BCR-ABL融合基因的验证示意图。
图3是实施例4的AML-ETO融合基因的验证示意图。
图4是实施例5的PML-RARA融合基因的验证示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1
本实施例为本发明所采用的混合基因、标准质粒及其制备方法。
本发明的用于检测融合基因的混合基因，其基因序列如SEQ ID NO:1所示，其由BCR-ABL融合基因、AML-ETO融合基因、PML-RARA融合基因和ABL内参基因通过基因合成的方式得到。
其中，BCR-ABL融合基因如SEQ ID NO:2所示，AML-ETO融合基因如SEQ ID NO:3所示，PML-RARA融合基因如SEQ ID NO:4所示，ABL内参基因如SEQ ID NO:5所示。
将上述混合基因按一定要求插入到质粒载体中，得到标准质粒。
其中质粒载体为PCU57质粒，其基因序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明的用于检测融合基因的标准质粒的制备方法如下所述，包括：
步骤S1、对需要进行荧光定量的融合基因和内参基因设计相对应的引物探针。
分别对BCR-ABL融合基因、AML-ETO融合基因、PML-RARA融合基因和ABL内参基因设计其相对应的引物探针，每一个融合基因对应三个引物探针，分别为-F、-R和-Probe。
其中，BCR-ABL融合基因对应的引物探针分别为BCR-ABL-F、BCR-ABL-R和BCR-ABL-Probe，BCR-ABL-F的基因序列如SEQ ID NO:7所示，BCR-ABL-R的基因序列如SEQ ID NO:8，BCR-ABL-Probe的基因序列如SEQ ID NO:9所示。
其中，AML-ETO融合基因对应的引物探针分别为AML-ETO-F、AML-ETO-R和AML-ETO-Probe，AML-ETO-F的基因序列如SEQ ID NO:10所示，AML-ETO-R的基因序列如SEQ ID NO:11，AML-ETO-Probe的基因序列如SEQ ID NO:12所示。
其中，PML-RARA融合基因对应的引物探针分别为PML-RARA-F、PML-RARA-R和PML-RARA-Probe，PML-RARA-F的基因序列如SEQ ID NO:13所示，PML-RARA-R的基因序列如SEQID NO:14，PML-RARA-Probe的基因序列如SEQ ID NO:15所示。
其中，ABL内参基因对应的引物探针分别为ABL-F、ABL-R和ABL-Probe，ABL-F的基因序列如SEQ ID NO:16所示，ABL-R的基因序列如SEQ ID NO:17，ABL-Probe的基因序列如SEQ ID NO:18所示。
步骤S2、根据步骤S1的引物探针的位置截取所对应的融合基因和内参基因的基因序列。
步骤S3、将步骤S2中得到的多个片段基因序列进行基因合成，得到混合基因，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。
步骤S4、将步骤S3得到的混合基因插入至PUC57质粒载体中，得到标准质粒。
将上述制备得到的标准质粒加入到检测融合基因的试剂盒中，以便方便快捷的进行使用。
在试剂盒中，还包括相应的制备荧光定量PCR体系的的组分。
实施例2
本实施例为对实施例1制备得到的标准质粒进行ABL内参基因的线性验证和灵敏度验证。
验证的具体步骤如下：
步骤S51、对标准质粒进行测定，以得到标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数。
检测仪器为nanodrop2000，吸光度为A260吸光度，拷贝数的计算公式如式(1)所示。
Copy number＝50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+混合基因序列长度)*660)(1)
步骤S52、将标准质粒进行梯度稀释，以得到不同拷贝数的标准质粒。
其中，梯度稀释后的拷贝数分别为1*100个/ml、1*101个/ml、1*102个/ml、1*103个/ml、1*104个/ml、1*105个/ml、1*106个/ml、1*107个/ml、1*108个/ml、1*109个/ml。
步骤S53、制备荧光定量PCR体系。
荧光定量PCR体系包括12.5μl Realtime PCRmaster Mix、8.5μl ddH2O、0.8μlABL-F、0.8μl ABL-R、0.4μl ABL-Probe、2μl梯度稀释后的标准质粒。
在本实施例中，进行验证的标准质粒的拷贝数分别为1*100个/ml、1*101个/ml、1*102个/ml、1*103个/ml、1*104个/ml、1*105个/ml、1*106个/ml、1*107个/ml、1*108个/ml、1*109个/ml。
步骤S54、进行荧光扩增检测，最后得到验证结果。
荧光扩增检测的方法为94℃5min；94℃15s，60℃40s，40个循环。
验证结果如图1所示。ABL内参基因的标准曲线如图1所示，其标准曲线公式为Y＝-3.347*LOG(X)+41.83，其Eff＝99.0％，Rsq＝0.999。
实施例3
本实施例为对实施例1制备得到的标准质粒进行BCR-ABL融合基因的线性验证和灵敏度验证。
验证的具体步骤如下：
步骤S51、对标准质粒进行测定，以得到标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数。
检测仪器为nanodrop2000，吸光度为A260吸光度，拷贝数的计算公式如式(1)所示。
Copy number＝50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+混合基因序列长度)*660)(1)
步骤S52、将标准质粒进行梯度稀释，以得到不同拷贝数的标准质粒。
其中，梯度稀释后的拷贝数分别为1*100个/ml、1*101个/ml、1*102个/ml、1*103个/ml、1*104个/ml、1*105个/ml、1*106个/ml、1*107个/ml、1*108个/ml、1*109个/ml。
步骤S53、制备荧光定量PCR体系。
荧光定量PCR体系包括12.5μl Realtime PCRmaster Mix、8.5μl ddH2O、0.8μlBCR-ABL-F、0.8μl BCR-ABL-R、0.4μl BCR-ABL-Probe、2μl梯度稀释后的标准质粒。
在本实施例中，进行验证的标准质粒的拷贝数分别为1*100个/ml、1*101个/ml、1*102个/ml、1*103个/ml、1*104个/ml、1*105个/ml、1*106个/ml、1*107个/ml、1*108个/ml、1*109个/ml。
步骤S54、进行荧光扩增检测，最后得到验证结果。
荧光扩增检测的方法为94℃5min；94℃15s，60℃40s，40个循环。
验证结果如图1所示。BCR-ABL融合基因的标准曲线如图2所示，其标准曲线公式为Y＝-3.352*LOG(X)+41.73，其Eff＝98.8％，Rsq＝0.998。
实施例4
本实施例为对实施例1制备得到的标准质粒进行AML-ETO融合基因的线性验证和灵敏度验证。
验证的具体步骤如下：
步骤S51、对标准质粒进行测定，以得到标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数。
检测仪器为nanodrop2000，吸光度为A260吸光度，拷贝数的计算公式如式(1)所示。
Copy number＝50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+混合基因序列长度)*660)(1)
步骤S52、将标准质粒进行梯度稀释，以得到不同拷贝数的标准质粒。
其中，梯度稀释后的拷贝数分别为1*100个/ml、1*101个/ml、1*102个/ml、1*103个/ml、1*104个/ml、1*105个/ml、1*106个/ml、1*107个/ml、1*108个/ml、1*109个/ml。
步骤S53、制备荧光定量PCR体系。
荧光定量PCR体系包括12.5μl Realtime PCRmaster Mix、8.5μl ddH2O、0.8μlAML-ETO-F、0.8μl AML-ETO-R、0.4μl AML-ETO-Probe、2μl梯度稀释后的标准质粒。
在本实施例中，进行验证的标准质粒的拷贝数分别为1*100个/ml、1*101个/ml、1*102个/ml、1*103个/ml、1*104个/ml、1*105个/ml、1*106个/ml、1*107个/ml、1*108个/ml、1*109个/ml。
步骤S54、进行荧光扩增检测，最后得到验证结果。
荧光扩增检测的方法为94℃5min；94℃15s，60℃40s，40个循环。
验证结果如图1所示。AML-ETO融合基因的标准曲线如图3所示，其标准曲线公式为Y＝-3.323*LOG(X)+41.82，其Eff＝100.0％，Rsq＝0.999。
实施例5
本实施例为对实施例1制备得到的标准质粒进行PML-RARA融合基因的线性验证和灵敏度验证。
验证的具体步骤如下：
步骤S51、对标准质粒进行测定，以得到标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数。
检测仪器为nanodrop2000，吸光度为A260吸光度，拷贝数的计算公式如式(1)所示。
Copy number＝50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+混合基因序列长度)*660)(1)
步骤S52、将标准质粒进行梯度稀释，以得到不同拷贝数的标准质粒。
其中，梯度稀释后的拷贝数分别为1*100个/ml、1*101个/ml、1*102个/ml、1*103个/ml、1*104个/ml、1*105个/ml、1*106个/ml、1*107个/ml、1*108个/ml、1*109个/ml。
步骤S53、制备荧光定量PCR体系。
荧光定量PCR体系包括12.5μl Realtime PCRmaster Mix、8.5μl ddH2O、0.8μlPML-RARA-F、0.8μl PML-RARA-R、0.4μl PML-RARA-Probe、2μl梯度稀释后的标准质粒。
在本实施例中，进行验证的标准质粒的拷贝数分别为1*100个/ml、1*101个/ml、1*102个/ml、1*103个/ml、1*104个/ml、1*105个/ml、1*106个/ml、1*107个/ml、1*108个/ml、1*109个/ml。
步骤S54、进行荧光扩增检测，最后得到验证结果。
荧光扩增检测的方法为94℃5min；94℃15s，60℃40s，40个循环。
验证结果如图1所示。PML-RARA融合基因的标准曲线如图3所示，其标准曲线公式为Y＝-3.317*LOG(X)+42.13，其Eff＝104.6％，Rsq＝0.985。
由上述实施例2～5可知，本发明制备得到的标准质粒能够建立有效可靠的双标准曲线，且精确度高，灵敏度好。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海科医联创医学检验所有限公司
<120> 用于检测融合基因的混合基因、标准质粒、试剂盒及其制备方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 412
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 混合基因
<400> 1
cgtccactca gccactggat ttaagcagag ttcaaaagcc cttcagcggc cagtagcatc 60
tgactttgag cctcagggtc tgagtgaagc cgctcgttgg agatacgaag ggagggtgta 120
ccattacagg atcaacactg cttctgatgg caagctctac gtctcctccg agagccgctt 180
caacaccctg gccgagcacc taccacagag ccatcaaaat cacagtggat gggccccgag 240
aacctcgaaa tcgtactgag aagcactcca caatgccaga ctcacctgtg gatggagccc 300
cgtcatagga agtgaggtct tcctgcccaa cagcaaccac gtggccagtg gcgccgggga 360
ggcagccatt gagacccaga gcagcagttc tgaagagata gtgcccagcc ct 412
<210> 2
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCR-ABL融合基因
<400> 2
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<210> 3
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AML-ETO融合基因
<400> 3
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tgagaagcac tccacaatgc cagactcacc tgtggat 97
<210> 4
<211> 119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PML-RARA融合基因
<400> 4
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<210> 5
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ABL内参基因
<400> 5
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tctcctccga gagccgcttc aacaccctgg ccgag 95
<210> 6
<211> 3132
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PUC57质粒
<400> 6
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attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
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gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 1620
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 1680
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 1740
gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 1800
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 1860
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 1920
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 1980
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 2040
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 2100
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 2160
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 2220
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 2280
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 2340
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 2400
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 2460
ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 2520
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 2580
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 2640
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 2700
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 2760
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 2820
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 2880
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 2940
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 3000
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 3060
ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga 3120
ggccctttcg tc 3132
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> BCR-ABL-R
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<212> DNA
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<220>
<223> BCR-ABL-Probe
<400> 9
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<220>
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<220>
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atccacaggt gagtctggca tt 22
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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ccattgagac ccagagcagc agttc 25
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<213> Artificial Sequence
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<223> ABL-F
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gatacgaagg gagggtgtac ca 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ABL-Probe
<400> 18
tgcttctgat ggcaagctct acgtctcct 29
Claims (8)
1.一种用于检测融合基因的标准质粒，其包括一种混合基因的序列，其特征在于，所述混合基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述标准质粒的序列如SEQ ID NO:6所示。
2.一种用于检测融合基因的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的标准质粒。
3.一种如权利要求1所述的用于检测融合基因的标准质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、对需要进行荧光定量的融合基因和内参基因设计相对应的引物探针；
步骤S2、根据步骤S1所述的引物探针截取所述引物探针对应的融合基因和内参基因的基因序列；
步骤S3、将步骤S2中截取的所述融合基因的基因序列和所述内参基因的基因序列进行基因合成，得到序列如SEQ ID NO:1所示的混合基因；
步骤S4、将步骤S3中的所述混合基因插入到PUC57质粒，得到如SEQ ID NO:6所示的标准质粒；
其中，在步骤S3中，所述混合基因的序列由如SEQ ID NO:2所示的BCR-ABL融合基因序列、如SEQ ID NO:3所示的AML-ETO融合基因序列、如SEQ ID NO:4所示的PML-RARA融合基因序列和如SEQ ID NO:5所示的ABL内参基因序列组成。
4.如权利要求3所述的用于检测融合基因的标准质粒的制备方法，其特征在于，所述BCR-ABL融合基因的引物和探针分别为如SEQ ID NO:7所示的BCR-ABL-F、如SEQ ID NO:8所示的BCR-ABL-R和如SEQ ID NO:9所示的BCR-ABL-Probe。
5.如权利要求3所述的用于检测融合基因的标准质粒的制备方法，其特征在于，所述AML-ETO融合基因的引物和探针分别为如SEQ ID NO:10所示的AML-ETO-F、如SEQ ID NO:11所示的AML-ETO-R和如SEQ ID NO:12所示的AML-ETO-Probe。
6.如权利要求3所述的用于检测融合基因的标准质粒的制备方法，其特征在于，所述PML-RARA融合基因的引物和探针分别为如SEQ ID NO:13所示的PML-RARA-F、如SEQ ID NO:14所示的PML-RARA-R和如SEQ ID NO:15所示的PML-RARA-Probe。
7.如权利要求3所述的用于检测融合基因的标准质粒的制备方法，其特征在于，所述ABL内参基因的引物和探针分别为如SEQ ID NO:16所示的ABL-F、如SEQ ID NO:17所示的ABL-R和如SEQ ID NO:18所示的ABL-Probe。
8.如权利要求3所述的用于检测融合基因的标准质粒的制备方法，其特征在于，还包括：
步骤S5、对步骤S4制备的所述标准质粒进行验证；
步骤S51、测定所述标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数；
步骤S52、将所述标准质粒进行梯度稀释；
步骤S53、制备荧光定量PCR体系；
步骤S54、进行荧光扩增检测。
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Denomination of invention: Mixed genes, standard plasmids, test kits, and preparation methods for detecting fusion genes Effective date of registration: 20230920 Granted publication date: 20220422 Pledgee: Fengxian Branch of Shanghai Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: SHANGHAI BIOMED UNION MEDICAL LABORATORY CO.,LTD. Registration number: Y2023310000569 |