CN114015723B - 一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明中公开了一种质粒载体，所述质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种鸭坦布苏病毒弱毒株的制备方法，将上述质粒载体进行体外转录，然后将体外转录的RNA转染BHK‑21细胞，获得鸭坦布苏病毒弱毒株。本发明同时公开由上述制备方法获得的鸭坦布苏病毒弱毒株及该鸭坦布苏病毒弱毒株在鸭坦布苏减毒活疫苗制备中的应用。本发明制备的鸭坦布苏重组致弱病毒对鸭胚和雏鸭的毒力显著减弱，不引起任何临床症状，并且引入的突变设计都具有良好的遗传稳定性，10代以内未恢复到野生型基因组和毒力水平；同时单剂量的重组致弱病毒就能为雏鸭提供完全的攻毒保护，是制备鸭坦布苏减毒活疫苗的非常优秀的候选病毒株。

Description

一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用。
背景技术
鸭坦布苏病毒(DTMUV)是能引起蛋鸭产蛋下降综合征，甚至致死性脑炎的一种新型黄病毒。自2010年在中国东南沿海地区首次爆发以来，迅速扩散大到全国多个省市，给我国的养鸭产业造成了巨大的经济损失。经病原的分离与鉴定确定引起该病的病原为鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)。
当前对该病的防控措施主要还是通过疫苗免疫来进行，虽然已有商品化的减毒活疫苗和灭活疫苗，但已有的商品化灭活疫苗免疫效果不够理想，需要多次增强免疫，加大了鸭群的应激反应。而现有的减毒活疫苗都是通过传统连续传代方式获得，安全风险较高。所以，当前的DTMUV的疫苗仍有很大的提高空间，尤其尤其需要研制一种安全性高、免疫效果好的DTMUV减毒活疫苗。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的鸭坦布苏病毒减毒活疫苗安全性低、免疫效果差的问题，提供一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种质粒载体，所述质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述质粒载体命名为pACYC-CQW1-IRES-mC，所述质粒载体包含IRES元件，所述IRES元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
优选地，将质粒载体pACYC-CQW1-IRES-mC中的IRES元件的5’端序列进行截短，截短后的IRES元件命名为MINI-IRES元件，所述MINI IRES元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；获得的截短后的质粒载体命名为pACYC-CQW1-MINI-mC。
进一步优选，所述pACYC-CQW1-IRES-mC的制备方法包括以下步骤：
S1、以pACYC-FL-TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，PCR扩增得到片段P1A；以IRES-RLuc-pA质粒为模板，以序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，PCR扩增得到片段P1B，所述P1B为IRES元件；以pUC57-mC质粒为模板，以序列SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8为引物，PCR扩增得到片段P1C，mC基因进行了同义密码子突变，但不改变mC的氨基酸残基的序列,防止潜在的RNA重组的影响；以pACYC-FL-TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物，PCR扩增得到片段P1D；通过融合PCR将片段P1A、P1B、P1C和P1D依次进行融合，获得片段P1-IRES-mC；将片段P1-IRES-mC与线性化后的pACYC-CQW1-P2-6质粒进行连接，筛选获得pACYC-CQW1-P2-6-IRES-mC质粒；
S2、以pACYC-FL-TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12为引物，PCR扩增得到片段ΔC-A；再以序列SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14为引物，PCR扩增得到片段ΔC-B；通过融合PCR将片段ΔC-A和片段ΔC-B连接起来，获得ΔC片段；
S3、将ΔC片段与线性化后的pACYC-CQW1-P2-6-IRES-mC质粒进行连接，筛选获得质粒载体pACYC-CQW1-IRES-mC。
本发明提供上述质粒载体在黄病毒减毒活疫苗制备中的应用。
本发明还提供一种鸭坦布苏病毒弱毒株的制备方法，将上述质粒载体进行体外RNA转录，然后将体外转录的RNA转染BHK-21细胞，获得鸭坦布苏病毒弱毒株。
本发明同时提供由上述制备方法获得的鸭坦布苏病毒弱毒株及该鸭坦布苏病毒弱毒株在鸭坦布苏减毒活疫苗制备中的应用。
本发明所具有的有益效果：
一)本发明将鸭坦布苏CQW1株病毒的结构蛋白C(capsid)蛋白在病毒基因组内进行了异位表达，即把原本的C蛋白删除后，利用内部核糖体进入位点(IRES元件或MINI-IRES元件)在病毒的3’UTR区域表达同义密码子更换的C蛋白，由于独立于病毒多聚蛋白表达的C蛋白无法被NS2A有效募集到病毒的组装位点，导致其病毒粒子的组装过程受损，显著降低病毒组装/释放过程的效率，因此获得了两株重组致弱病毒(CQW1-IRES-mC病毒株和CQW1-MINI-mC病毒株)。
二)本发明制备的重组致弱病毒(CQW1-IRES-mC病毒株和CQW1-MINI-mC病毒株)在BHK-21细胞上的复制显著降低，对鸭胚和雏鸭的毒力显著减弱，不引起任何临床症状，并且引入的突变设计都具有良好的遗传稳定性，10代以内未恢复到野生型基因组和毒力水平。同时单剂量CQW1-IRES-mC病毒或CQW1-MINI-mC病毒就能为雏鸭提供完全的攻毒保护，是制备鸭坦布苏减毒活疫苗的非常优秀的候选病毒株。
附图说明
图1为实施例2中质粒载体pACYC-CQW1-IRES-mC和pACYC-CQW1-MINI-mC的构建示意图；
图2为实施例3中鸭坦布苏病毒弱毒株CQW1-IRES-mC、CQW1-MINI-mC转染BHK21细胞后F0代和F1代的荧光信号图；
图3为实施例4中鸭坦布苏病毒弱毒株CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC的传代稳定性验证结果图(3A为弱毒株在BHK21细胞上的生长曲线图；3B为弱毒株的F1代和F10代的噬斑试验结果图)；
图4为实施例5中鸭坦布苏病毒弱毒株CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC对鸭胚的毒力试验结果图；
图5为实施例6中鸭坦布苏病毒弱毒株CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC在25日龄雏鸭体内诱导的免疫反应结果图(5A为免疫后，脾组织的IFN-α，IFN-β，IL-1β和TNF-α的mRNA表达情况图；5B为鸭外周血的T淋巴细胞特异性增殖数据图；5C为鸭血清中的Th1型细胞因子IFNγ和Th2型细胞因子IL-4的表达水平数据图)；
图6为实施例7中鸭坦布苏病毒弱毒株CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC对5日龄SPF雏鸭的致病性及其免疫保护力试验结果图(6A为试验流程图；6B为雏鸭免疫后及免疫攻毒后的体重变化图；6C为雏鸭免疫后临床症状统计图；6D为雏鸭免疫后死亡统计图；6E为雏鸭免疫攻毒后病毒血症滴度统计图；6F为雏鸭免疫攻毒后临床症状统计图；6G为雏鸭免疫攻毒后死亡统计图)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
质粒、细胞及实验动物：pAYC-FL-TMUV，IRES-RLuc-pA质粒，pAYC-CQW1-P2-6质粒、BHK21细胞、野生型鸭坦布苏病毒株DTMUV-CQW1、anti-TMUV的多抗均由四川农业大学动物医学院禽病防治中心提供；SPF雏鸭和SPF鸭胚购自哈尔滨兽医研究所；鸭坦布苏病毒株DTMUV-CHN-YC由华中农业大学动物医学院赠与；pUC57-mC质粒由擎科生物进行全基因合成。
主要试剂盒：ClonExpress II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物；Phanta EVO HS Super-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物；转染试剂Lipofectamine MessengerMAX reagent购自Invitrogen。
实施例1
构建质粒载体pACYC-CQW1-IRES-mC
以pACYC-FL-TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，PCR扩增得到片段P1A；以IRES-RLuc-pA质粒为模板，以序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，PCR扩增得到片段P1B，所述P1B为IRES元件；以pUC57-mC质粒为模板，以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，PCR扩增得到片段P1C，pUC57-mC质粒为全基因合成，pUC57-mC质粒中对mC基因(表达鸭坦布苏病毒的结构蛋白C)进行了同义密码子突变，但不改变mC的氨基酸残基的序列,防止潜在的RNA重组的影响；以pACYC-FL-TMUV质粒为模板，以序列SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10为引物，PCR扩增得到片段P1D；通过融合PCR将片段P1A、P1B、P1C和P1D依次进行融合，获得片段P1-IRES-mC；将片段P1-IRES-mC与线性化后的pACYC-CQW1-P2-6质粒进行连接，筛选获得pACYC-CQW1-P2-6-IRES-mC质粒；
为了构建获得全长cDNA感染性克隆，以pACYC-FL-TMUV质粒为模板，以序列SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12为引物，PCR扩增得到片段ΔC-A；再以序列SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14为引物，PCR扩增得到片段ΔC-B；通过融合PCR将片段ΔC-A和片段ΔC-B连接起来，获得ΔC片段；
将ΔC片段与线性化后的pACYC-CQW1-P2-6-IRES-mC质粒进行连接，筛选获得质粒载体pACYC-CQW1-IRES-mC。质粒载体pACYC-CQW1-IRES-mC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
质粒载体pACYC-CQW1-IRES-mC的构建示意图详见图1，如图1所示，本实施例将鸭坦布苏病毒基因组中原本的C蛋白序列删除后，利用内部核糖体进入位点(IRES元件)在病毒的3’UTR区域表达同义密码子更换的C蛋白。
片段P1A、P1B(IRES)、P1C、P1D、ΔC-A、ΔC-B、质粒pUC57-mC的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.15-21所示。本实施例中PCR扩增所用引物详见表1：
表1 PCR扩增引物
Figure BDA0003341020950000041
实施例2
构建质粒载体pACYC-CQW1-MINI-mC
在实施例1的基础上，按照相同的方法进行PCR扩增得到片段P1A、P1C、P1D、ΔC-A、ΔC-B，以IRES-RLuc-pA质粒为模板，以序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6为引物，PCR扩增得到片段MINI-IRES，MINI-IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。按照实施例1中质粒载体的构建方法，通过融合PCR将片段P1A、MINI-IRES、P1C和P1D依次进行融合，获得片段P1-MINI-mC；将片段P1-MINI-mC与线性化后的pACYC-CQW1-P2-6质粒进行连接，筛选获得pACYC-CQW1-P2-6-MINI-mC质粒；通过融合PCR将片段ΔC-A和片段ΔC-B连接起来，获得ΔC片段；将ΔC片段与线性化后的pACYC-CQW1-P2-6-MINI-mC质粒进行连接，筛选获得质粒载体pACYC-CQW1-MINI-mC。如图1所示，重组质粒pACYC-CQW1-MINI-mC仅仅是将实施例1获得的重组质粒pACYC-CQW1-IRES-mC核苷酸序列中的IRES元件替换成了MINI-IRES元件，除此之外的其余核苷酸序列与pACYC-CQW1-IRES-mC的核苷酸序列完全一致。
质粒载体pACYC-CQW1-MINI-mC的构建示意图详见图1，如图1中所示，本实施例将鸭坦布苏病毒基因组中原本的C蛋白序列删除后，利用内部核糖体进入位点(MINI-IRES元件)在病毒的3’UTR区域表达同义密码子更换的C蛋白。本实施例将实施例1中的IRES元件的5’端序列进行截短，获得MINI-IRES元件。与IRES元件相比，MINI-IRES元件只保留了保证其起始翻译的基本序列，相比原本的IRES元件的序列更短，但是其起始翻译的效率更低。
本实施例中用于扩增MINI-IRES序列的引物详见表2。
表2用于扩增MINI-IRES序列的引物
Figure BDA0003341020950000051
实施例3
转染及拯救鸭坦布苏重组致弱病毒CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC
将质粒载体pACYC-CQW1-IRES-mC、pACYC-CQW1-MINI-mC分别进行体外RNA转录，然后将体外转录的RNA转染BHK-21细胞，分别记为IRES-mC组和MINI-mC组；同时转染WT组和ΔC-Replicon组，WT组为转染野生型鸭坦布苏病毒株DTMUV-CQW1的RNA、ΔC-Replicon为转染删除C蛋白的鸭坦布苏病毒突变株RNA(ΔC-Replicon突变株的构建详见图1中的CQW1-ΔC-Replicon)。在转染后的第3、5天分别收样进行间接免疫荧光，检测病毒蛋白的表达情况。在转染后第5天(F0代)，收获细胞上清，接种下一代，获得F1代病毒，连续培养直至观察到细胞病变。
如附图2所示，在F0代和F1代，相对于WT组，IRES-mC和MINI-mC组产生的荧光信号较弱；而在F1代感染后的第3天，WT组、IRES-mC和MINI-mC组仍然产生了明显的荧光信号，ΔC-Replicon组不产生任何信号。同时在F1代感染后的第10天之后，IRES-mC和MINI-mC组都产生了明显的细胞病变。这些数据初步表明，弱毒株CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC的RNA都产生了具有感染性的病毒粒子。将F1代细胞上清收获后进行了测序分析，进一步证明了这两株突变病毒被拯救成功，获得鸭坦布苏病毒弱毒株CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC。
实施例4
CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC突变体的传代稳定性验证
在实施例3的基础上，设置IRES组(IRES-mC-F1和IRES-mC-F10)、MINI组(MINI-mC-F1和MINI-mC-F10)和WT组，IRES组为实施例3中获得的CQW1-IRES-mC病毒株，MINI组为实施例3中获得的CQW1-MINI-mC病毒株，WT组为野生型鸭坦布苏病毒株DTMUV-CQW1。将IRES组、MINI组和WT组分别在BHK-21细胞上连续传代10次。如附图3A所示，IRES组和MINI组的噬斑明显小于WT组形成的。进一步测定各组生长曲线(图3B)发现，相比于各自的F1代病毒，IRES-mC-F10或MINI-mC-F10的增殖都显著增强，且达到的滴度的峰值都分别提高了约10倍或100倍，但它们都显著低于WT组。测序发现，在F10代病毒的CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC的基因组仅分别出现了5个和3个适应性突变，突变位点如表3所示。
表3 CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC基因组突变位点
Figure BDA0003341020950000061
实施例5
CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC突变株对鸭胚的毒力验证
在实施例4的基础上，设立IRES-mC-F1组、IRES-mC-F10组、MINI-mC-F1组、MINI-mC-F10组、Mock组和WT组。其中，IRES-mC-F1组为F1代的CQW1-IRES-mC病毒株；IRES-mC-F10组为F10代的CQW1-IRES-mC病毒株；MINI-mC-F1组为F1代的CQW1-MINI-mC病毒株；MINI-mC-F10组为F10代的CQW1-MINI-mC病毒株；Mock组为DMEM；WT组为野生型鸭坦布苏病毒株DTMUV-CQW1。将上述各组病毒分别通过尿囊腔接种9日龄的鸭胚，每组接种3000TCID50的病毒，然后连续观察7天，记录死亡情况。如图4所示，WT感染组的鸭胚在5天之内全部死亡，表明WT病毒对鸭胚的毒力很强。相比之下，不论是F1还是F10代的CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC都没有造成任何的死亡。说明CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC弱毒株的鸭胚毒力显著降低，且连续传代10代后，毒力水平也没有出现明显的恢复，达到了非常好的减毒效果。
实施例6
CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC突变株在25日龄雏鸭体内诱导的免疫反应
在实施例3的基础上，以25日龄雏鸭为模型，将25日龄雏鸭随机分为4组，包括WT组、IRES-mC组、MINI-mC组和mock组，每组11只。WT组通过肌肉注射200μL的WT病毒；IRES-mC组通过肌肉注射200μL的CQW1-IRES-mC病毒；MINI-mC组通过肌肉注射200μL的CQW1-MINI-mC病毒，mock组通过肌肉注射200μL的DMEM。在免疫后的第5天，采取组织样品，用用RT-qPCR检测感染后第5天，脾组织的IFN-α，IFN-β，IL-1β和TNF-α的mRNA表达情况。第14天，分离鸭外周血的T淋巴细胞进行T细胞特异性增殖实验，测定其细胞免疫情况；用ELISA测定鸭血清中的Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4的表达水平。
如附图5A所示，IRES-mC组和MINI-mC组都能明显激活IFN-α，IFN-β，IL-1β和TNF-α的上调，且MINI-mC组诱导的IFN-α，IFN-β和IL-1β水平甚至比WT组更高。
如附图5B所示，IRES-mC和MINI-mC组对T淋巴细胞的刺激系数分别约为5和2。如附图5C所示，相对DMEM组，IRES-mC和MINI-mC组中Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4的表达水平均显著的上调。以上数据表明CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC弱毒株的感染都能有效激活雏鸭的细胞免疫。
实施例7
CQW1-IRES-mC和CQW1-MINI-mC突变株对5日龄SPF雏鸭的致病性及其免疫保护力验证
在实施例3的基础上，以5日龄的SPF雏鸭为模型，随机分为4组，包括WT组、IRES-mC组、MINI-mC组和mock组。WT组通过肌肉注射200μL(105TCID50)的WT病毒；IRES-mC组通过肌肉注射200μL(105TCID50)的CQW1-IRES-mC病毒；MINI-mC组通过肌肉注射200μL(105TCID50)的CQW1-MINI-mC病毒，mock组通过肌肉注射200μL的DMEM。在免疫后第1-14天，监测雏鸭的体重变化，临床症状以及死亡情况；在免疫14天后，所有组存活的雏鸭通过肌肉接种200μL(2×106TCID50)的CHN-YC株DTMUV病毒，并在攻毒后14天内监测动物的体重变化、临床症状以及死亡情况。图6A为实验流程图。
如图6B所示，在免疫后第4天开始，WT组的体重增长水平明显低于mock组，而IRES-mC、MINI-mC与mock组相比没有明显的差异。如图6C所示，在免疫后第3天开始，WT组的雏鸭出现精神沉郁、行动迟缓、站立不稳甚至后肢瘫痪等临床症状；如图6D所示，WT组从第5天开始出现死亡，到第7天，有70％的雏鸭死亡。而IRES-mC、MINI-mC和mock组未出现任何明显临床症状和死亡情况(图6C,6D)。
如图6B所示，在攻毒后的第二天，mock组的体重显著低于IRES-mC和MINI-mC组，且开始出现出现精神沉郁、行动迟缓、站立不稳甚至后肢瘫痪等临床症状；而IRES-mC、MINI-mC组和WT组未出现任何临床症状(图6F)。检测攻毒后第3天的病毒血症情况发现，除了mock组产生了明显的病毒血症，IRES-mC、MINI-mC和WT组都未检测到任何临床症状(图6E)。在攻毒后的第6天，mock组的有2只雏鸭死亡。而IRES-mC、MINI-mC和WT组未出现任何死亡情况(图6G)。这些数据表明，单次免疫CQW1-IRES-mC或CQW1-MINI-mC突变病毒，即能为雏鸭提供非常显著的免疫保护效果。
综上所述，本发明制备的重组致弱病毒(CQW1-IRES-mC病毒株和CQW1-MINI-mC病毒株)在BHK-21细胞上的复制显著降低，对鸭胚的毒力显著减弱，不引起任何临床症状，并且引入的突变设计都具有良好的遗传稳定性，10代以内未恢复到野生型基因组和毒力水平。同时单剂量CQW1-IRES-mC病毒或CQW1-MINI-mC病毒就能为雏鸭提供完全的攻毒保护，是制备鸭坦布苏减毒活疫苗的非常优秀的候选病毒株。
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用
<141> 2021-11-05
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15278
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 60
gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 120
agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 180
ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 240
cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 300
gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 360
cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 420
gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 480
ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 540
acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 600
ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 660
aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 720
aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccttaat aagatgatct 780
tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa aaccgccttg 840
cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt tgaaccgagg taactggctt 900
ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc gcatgacttc 960
aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt ttgcatgtct 1020
ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg actgaacggg 1080
gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac ccggaactga gtgtcaggcg 1140
tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga aaggcaggaa 1200
caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1260
ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg gggcggagcc 1320
tatggaaaaa cggctttgcc gcggccctct cacttccctg ttaagtatct tcctggcatc 1380
ttccaggaaa tctccgcccc gttcgtaagc catttccgct cgccgcagtc gaacgaccga 1440
gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg tatcacatat tctgctgacg 1500
caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc ctcatcagtg 1560
ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcatactag ttaatacgac tcactataga 1620
gaagttcatc tgtgtgaact tattccaaac agttttttgg gatagtgcgt gtgaacgtaa 1680
acacagtttg aacgtttttt ggatagagac aactatgtct aacaaaaaac caggaagacc 1740
cggctcaggc cgggttgtca atatgctaaa gcgcggaacg tcccgcggaa atccgctagc 1800
gcggataaag aggacgattg atggggtcct gagacggaag gcgaaacgtc ggggggggag 1860
ttgctcttgg gtcatcatgt tactcccgat agttgctggg ctgaaacttg gaaattataa 1920
tggtagagtt ttggccactt taaacaagac tgatgtgtca gacttgctag tcattccaac 1980
aacggctggc agcaatggat gcgtcgtgcg agctctagat gtgggactga tgtgtcagga 2040
tgacataacg tacctgtgcc caaagttgga gtacggctat gaacctgaag acatagactg 2100
ctggtgcaat gagactgaga tatacattca ttatgggaga tgtacccctt cacggcatgg 2160
acggaggtct aggaggtcgg tgaacgtgca tcaccatgga gagagtctac ttgaggccaa 2220
gaacacgccg tggatggatt cgaccaaagc cactaaatat ctcacaaagg ttgagaactg 2280
ggcgttgaga aatcctgggt acgcccttgc tgccatcttc ataggctgga acttgggaac 2340
gacgagaagc cagaagataa ttttcacaat tatgttaatg ttaattgccc cagcgtacag 2400
cttcagctgt ctggggatgc agaaccgaga ctttgttgag ggagtgaatg gtgttgagtg 2460
gatcgatgtc gttctggaag gaggctcatg cgtaactatt acggcaaaag acaggccgac 2520
catagacgtc aagatgatga acatggaggc tacggaatta gcggttgtga gatcttactg 2580
ctatgagccg aaagtgtcgg acgtgacgac agaatccaga tgcccaacca tgggagaggc 2640
tcataatccc aaggcaactt atgctgaata catatgcaaa aaagattttg tggacagggg 2700
ttggggcaat ggctgtggct tgtttggaaa ggggagcatc cagacatgtg ccaagtttga 2760
ctgcacaaag aaagcagaag gcaggatcgt gcagaaggaa aacgtccagt ttgaagttgc 2820
agtttttata catggttcca cggaagcgag cacctaccac aattattcag cccagcagtc 2880
gctgaaacat gccgctagat tcgtgataac gcccaaaagt cccgtctaca ctgctgagat 2940
ggaggattat ggtaccgtca cactcgaatg cgaaccccga tctggggttg acatggggca 3000
attctacgtc ttcaccatga atacaaagag ctggcttgtt aacagagact ggtttcatga 3060
cctcaactta ccatggacag ggtcatcagc ggggacgtgg caaaacaaag agtcattgat 3120
agaatttgag gaggctcatg ccaccaaaca atcagtggtg gctttggcat cacaagaagg 3180
agccctccat gcagcattgg cgggagctat tccagtgaag tactctggaa acaaattgga 3240
aatgacctca ggtcatctta aatgcagggt caaaatgcag ggtttgaagc tgaaaggaat 3300
gacctacccg atgtgtagca atacattttc cctagtgaag aatcctaccg acactgggca 3360
tggcactgtc gtggtggaat tgtcttatgc aggtaccgat gggccctgta gagttcccat 3420
atccatgtcg gcagatttga atgacatgac accagttgga cgcttgataa cagtcaaccc 3480
atacgtgtcg acttcctcca cgggtgccaa gataatggtg gaagtggaac ctccattcgg 3540
ggattcattt attttagtag gaagtggaaa aggacagatt aggtaccagt ggcatagaag 3600
tgggagtaca attggaaaag ctttcacgtc aacactcaaa ggagcacaaa ggatggttgc 3660
tttgggtgac actgcatggg attttggttc agttgggggt gtactcactt ccattgggaa 3720
aggcattcat caagtcttcg gctcagcatt taaaagctta tttggaggaa tgtcatggat 3780
tactcaaggc atgttagggg cactgctatt gtggatgggc ctgaatgcaa gggacagatc 3840
catttctatg acctttctag tcgtaggagg aattttagtc ttcttggcag taaatgtcaa 3900
tgccgacacg gggtgctcaa tcgacttggc taggaaagaa ttaaaatgtg gacaaggcat 3960
gtttgtcttc aacgatgttg aggcctggaa ggataattac aagtactatc catccacacc 4020
aaggagactt gccaaagtcg tggcaaaagc tcatgaggct ggaatttgtg gcatacgatc 4080
agtcagcagg ctcgagcaca atatgtgggt aagcatcaaa catgagttga atgcgatctt 4140
ggaagacaat gccattgatt tgactgtggt ggttgaagaa aatcctggaa gatacaggaa 4200
aaccaatcag aggctgccga acgttgatgg agagctcacg tacggatgga agaaatgggg 4260
gaaaagtatt tttagcagcc cgaagatgtc aaataataca tttgtcattg atggaccaaa 4320
aactagagag tgcccagatg agagaagagc atggaatagc atgaaaattg aagactttgg 4380
gtttggagtg ttgtccacaa aggtatggat ggaaatgcga acagaaaata caactgattg 4440
tgacaccgca gtaatgggca cagcaattaa aggaaataga gctgtgcaca gtgacctgag 4500
ctattggata gagagcaaga ataatggaag ctggaaactg gagagggctg tgttgggcga 4560
ggtgaagtca tgcacatggc cagaaaccca caccctgtgg agtgacagcg ttgtggagag 4620
tgaactcatc atacctaaga cattgggagg accgaagagt catcacaaca cgaggacagg 4680
atacagggtt cagagttccg gaccgtggga tgagaaagag attgcaatag acttcgacta 4740
ctgtcctgga acaactgtca cagtaacgag ctcgtgccgc gacagagggc cttcagctag 4800
gacaacaaca gcgagtggga aattgataac agattggtgt tgtaggtctt gcaccatccc 4860
accactgaga tttgttacaa aaagtggatg ctggtatggg atggaaattc ggccaattgt 4920
tcacggagac gacatgttga tcaaatcaaa ggtcatggct tttcaagggg gtggcatgga 4980
acctatgcaa ttagggatgc tcgttatgat tgtagcagcc caggagattt tgagaaggcg 5040
catgacggct ccaattgctt ggtcagcgct gctgttgctg atggctttgg tcctgtttgg 5100
aggaatcacg tacagtgatc tggtcaagta cgtcatccta gtggcagctg catttgctga 5160
gagcaataca ggtggtgaca ttgtgcactt ggccatggtg gctgctttta acattcagcc 5220
aggtttactg attggatttt tactgaggag gaagtggagc aatcaggaaa gcagattgct 5280
tggcgttgcg ttagcactca taacagtggc gatgagagac ttgaacatga gtataccaac 5340
attactaaac tccggagcca tggcctggct cttgctgaga gccgtgtttg aagggacggt 5400
tagctccttt gccctgccgc ttgttagctt gctggctcca ggactcagaa tagtggggat 5460
agatgtggtg aggataggtg tgctaaccct ggggatcctc tcactattga aagagaggag 5520
caacgcaatg gcaaaaaaga agggaggcat gctcctggga gtggcatgcg ctaccgctgg 5580
aatcgctagc cctttggtgt ttgctggtct gcacatggtg ctgaagccag tgacacggag 5640
agggtggcca gtcagtgagg ctttgactgc tgtgggattg acattcgcgt tggcaggagg 5700
aatagcccag tttgatgaca gcagcatggc gattccatta gccgttggcg ggatcatgct 5760
ggtggtggca gtggtgacag gcttctctac agacttatgg ctagagaaag cgagcgacat 5820
ctcgtggagt gaggaggcga gggtgactgg agcatcacag agatttgatg tggaaattga 5880
tcaggacggc aatatgagat tgctgaacga tcctggtgtg tcgctcggcg tttgggcctt 5940
tcgaactggg cttattctgc tatcttcata caacccatat ttcctgccat tgactctggc 6000
aggttactgg atgacaacta aggcaaaaca acgaggagga gtcatctggg atgtgccagc 6060
tccaaaggaa aggaagagag ccgaagtagg caatggagtt ttccgaatta tggcaagagg 6120
actgttagga aaataccagg ctggggtggg agtcatgcat gagggagtgt ttcacaccat 6180
gtggcacgtg acgaacgggg ccgttatcca agcaggagaa ggaacactgg tcccatattg 6240
ggcgagtgta cgcaatgatc tgatttccta tggtggacca tggaaattgg ggaagcaatg 6300
gaatggtgta gatgaagtgc aagtcatcgt cgtgcaacca ggcaaagagg tcataaacgt 6360
gcagactcag ccaggaattt tcaagactca atatggtgaa gttggagctg tgtccctcga 6420
ttacccaacg ggaacctctg gatcacctat tattgacaag gaaggacagg tggttggcct 6480
ctatggtaat ggaattctgg tgggttcagg cgattttgtc agcatgatta ctcaagggga 6540
gaagaaggag gaagaagttc ctcaggtgtt tgacgaaaac atgctgcgga aaaggcaact 6600
gacagttctg gacctacatc caggttcagg aaagaccaga aaggtcctcc ccatgattct 6660
gaagagcgcc attgacaaac gattaagaac agctgtcttg gctccgacgc gggtggtggc 6720
cgctgaaata gcggaagcac tgaaaggact cccaatacgg tatctgactc cggcagtaaa 6780
gagggagcat actggaacag agataataga tgtgatgtgt cacgcgactt tgacagcgcg 6840
gctgctcaca cctcagcgag tgccgaatta caacctgttc attatggatg aggctcactt 6900
cacagaccct gccagcattg ctgccagagg atacatatca acaaaggtgg aactgggaga 6960
ggcagctgca atattcatga cagccacacc tccaggtaca actgaggcat ttccggactc 7020
caactcgcca ataacagaca ttgaagagca aatccctgac agagcttgga attctgggta 7080
tgagtggata acagactttc aaggaaagac tgtatggttt gtccccagcg tgaagtctgg 7140
taatgagatc gccgtgtgct tgacaaaggc cggtaagaag gtaattcagt taaataggaa 7200
gagttttgac tcagagtatc ctaagtgcaa gagtggagaa tgggatttcg tgataaccac 7260
tgacatctca gaaatgggag cgaactttgg agcgcaacgg gtcatagata gtcggaagtg 7320
cattaaacca gtgattattg aggatggaga aggaagtgtg caaatgaatg gaccagttcc 7380
aataacatca gccagtgcag cccagcgtcg tggacgggtt ggaagggatg tgacacaaat 7440
tggagatgag taccactact caggaccaac cagcgaggat gatcatgatt tcgctcattg 7500
gaaagaggcc aagatactgc tggacaacat taacatgcca gatgggctgg ttgcccagtt 7560
gtacggccca gagcgggaca aggttgacgc aattgatggg gaattcagac tgaggactga 7620
gcagaggaaa cactttgtgg agtatctgag gacaggagac ctccctgtct ggatatcgta 7680
caaggtcgct gaagctggga taagttacaa tgaccggcgg tggtgctttg atggaccctc 7740
atgcaatact gttctggagg acaataaccc agtggagtta tggacaaagt caggtgagaa 7800
gaaaatcttg aagccccggt ggagagatgg aagattgtgg gcagatcacc aggccttaaa 7860
agccttcaag gattttgcga gtggaaagag atcagcgata gggatccttg aggtcttcag 7920
gatgcttccc gatcacttcg ctcacagaat gacagaatcc atggacaaca tatacatgct 7980
gactacagct gagaaaggga gtagggccca cagagaagcc ctggaggaac tgcctgagac 8040
acttgaaaca tttttactgg tgttcatgat gacagtcgcc tctatggggg tgttcttgtt 8100
ctttgttcag aggagaggtt tagggaagac aggtcttgga gccatggtca tggccacagt 8160
cacggttttg ttatggatag cagaagtccc agcccagaag attgccggtg tgctcctagt 8220
ttctctattg ctgatgattg ttctgatccc agaaccagag agacagagat cacagacgga 8280
tagtcacttg gctgttttca tgattgttgt cttgttagtg gtgggtgctg tggcgtcaaa 8340
tgaaatgggt tggctagagc aaacaaagaa ggacttgtca gctctgtttg ggagaaaaag 8400
cgaaagccat caagaaacct ggagtatgcc ttggccggat ttgagaccag cgacggcatg 8460
ggcggcctac gcaggagcta caacatttct gactcccttg ctaaaacacc tcataataac 8520
agagtatgtg aatttttcac tcatggcaat gacggcgcag gctggagcac tatttggact 8580
agggaaaggc atgccttttg tcaaagcaga cttgtcagta cccctgctac tcttagggtg 8640
ttggggacag ttcacaatga caacaacggt ctcggcagtc atgatggtca tactgcatta 8700
tgcatttttg gtgccaggtt ggcaagcaga agccatgagg tcggcccaga ggagaactgc 8760
tgcaggtgtg atgaaaaatc ccgtggttga tggcatagtg gctacagatg ttccagacct 8820
tgaggccagc actcctatta cagaaaagaa attgggtcaa tgcgtgctag tgggaatagc 8880
cttggtggcg gtgtttctaa caccaaacac gctaactttg actgagtttg gaatgttgac 8940
ctctgccgct tcggtgacat taattgaggg agctgcaggt cgtatttgga acgcaaccac 9000
agccgttgct atgtgccatc tgttgaggaa aaactggttg gctggggcct ctctagcatg 9060
gactataact cggaatctcc aggcagggac cttgcgtcga ggaggaggaa ctggcagaac 9120
tttgggggaa gcatggaagg cccagcttaa ccaactgacc cggcaagagt ttatggaata 9180
ccggaaagac gggattattg aagtagatag agctgctgca aaaagagccc gccgtgaagg 9240
aaatgtgaca ggagggcacc cagtttcacg aggcacggca aagttgaggt ggctcgtgga 9300
gcgtgggttt ctcaaaccaa gaggcaaagt tgtggattta ggctgcggca gaggaggctg 9360
gagttactac tgtgctacat taaagcaggt tcaggaagtg agaggttaca caaaaggagg 9420
gccagggcat gaggaaccag tgatgaccca gagctatggc tggaacattg tgacgttaaa 9480
gagtggggtt aatgttcatt tcaagccgac tgaaccatct gacacactgc tatgtgacat 9540
aggtgaagct tcacccgtcc cagaaattga atctgccaga acaatcaggg tgctgcaaat 9600
ggccgaggaa tggttagcta ggggcgttga agagttctgc ataaaagtgc tttgtcccta 9660
catgccagcg gtcataaaag aactggaaag actgcagctg aaatggggag gtggtttggt 9720
cagagtgcca ctctcgcgta attcaacgca tgagatgtac tgggtgagcg gctcaagtgg 9780
gaatgtgaca aatagtatta atacagtgag ccaaatgctg atcaacagga tgcacaaaac 9840
caaccgtaat ggacccaggt atgaagaaga tgtggacttg ggttcaggga ccagagctgt 9900
gagctgcaca agacagagga ctgactgggg aatggtcgct gatagggtga agaatttggc 9960
cagagaatat gctccgtctt ggcattatga ccaagacaat ccttacaaga cttggaacta 10020
tcatggaagt tacgaagtga aagccacagg ctcagccagc tcaatggtta atggggtagt 10080
taggatactg tcaaaacctt gggacacctt gcaaaacgtg gtgaatatgg ccatgacgga 10140
cactactcct tttgggcaac agcgcgtatt taaagaaaag gttgatacca aagccccaga 10200
accacctgca ggaacagcta gggttatgaa catcgtggca agatggatgt ggaactttgt 10260
tggcaggaac aaacaaccaa ggatgtgcac aaaagaagag ttcatagaga aggtgaatag 10320
taacgcagcc ctgggggcca tgtttgagga gcaacacaaa tgggccagcg ccagggaagc 10380
ggttgaggat cctgaatttt ggagtcttgt tgacagagag agagaactgc acttgcaagg 10440
gaagtgcgag acctgcattt acaacatgat gggaaagcga gaaaagaaga tgggagagtt 10500
cgggaaagca aaaggtagca gagctatttg gtacatgtgg ctcggggcca gattcctaga 10560
gttcgaagcc ttgggcttct tgaacgagga tcactggatg agcagggaaa acactaaagg 10620
aggcgttgaa ggacttggac tccaaaagtt ggggtatgtg ctgcgtgaca tttcggccaa 10680
agaaggagga cttatgtacg cagacgacac ggccggatgg gacactagaa taaccaaggc 10740
tgatttggaa aacgaagcca tcatcttgga aaagatggaa ccaatgcaca gagctgttgc 10800
agaaccactc attaaatttg cctacatgaa taaggtggtg aaggtgatgc gaccgggacg 10860
tgatgggaag acagttatgg atgtcatctc gcgggaagac cagaggggaa gtggacaggt 10920
tgtgacctat gctctcaaca ctttcacgaa cctgtgtgtc cagctcatta gatgtatgga 10980
aggggaggag ctgctgctcc ccgaggaaac agagcgtcta aaaaaaggaa aggagaagcg 11040
catccaagaa tggctccaaa agaatggaga gaacaggttg tcagccatgg cagtcagtgg 11100
ggatgactgt gtggtgaaac cagcggatga cagattcgcc acagcactgc acttcctcaa 11160
tagtatgtct aaggtgagga aagatactca ggaatggaag ccctcaaccg gttggagaaa 11220
ctggcaagaa gtcccctttt gctcacacca tttccacgag ctgcaaatga aagatggcag 11280
aaagattgtg gttccatgtc gagaccagga tgagctaatt ggaagagcca ggctctctcc 11340
agggtctggc tggtcactaa cagaaacagc atgcctgagc aaagcatatg ctcagatgtg 11400
gttattgatg tacttccaca ggagggacct cagactaatg gcaaacgcca tctgctcatc 11460
tgtccctgtc tcatgggtcc ccacaggaag gacaacgtgg tcaatccatg gaaaaggcga 11520
gtggatgact tctgaagaca tgctggcagt gtggaacagg gtgtggattg aagaaaatga 11580
acacatggaa gacaaaaccc cagtgacttc atggaacgaa gtgccatacc ttggaaagag 11640
ggaagatggc tggtgtggta gtctgattgg acaccgagcc agatctacct gggccgagaa 11700
catatacact ccaattatgc agatcagagc tctcattggc cctgagcact atgtagatta 11760
tatgccaact ctaaataggt tcaaacccat tgaaagctgg agtgaaggtg ttttgtaaac 11820
gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc 11880
accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg 11940
agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg 12000
aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc 12060
aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa 12120
gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa 12180
agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta 12240
ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg tgtttagtcg 12300
aggttaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacac 12360
gatgataata tgagtaataa gaagcctgga aggccagggt caggacgggt cgtgaacatg 12420
ttgaagaggg gaacctcgcg cggaaaccct ctagccagaa ttaaacgaac catagacggt 12480
gtgctccgtg gtgctggtcc gattcgcttc gtcctcgcac ttctcacatt ttttaaattc 12540
actgcgctcc gtcctacgat aggtatgctc aaacgttgga aattagtagg tgtgaacgaa 12600
gccacgaagc acctcaagag ctttaaaaga gatataggtc aaatgcttga tggcttgaac 12660
aaaagaaaag ccaagaggag ataaatatat gaggtaggtg taaaaatgta tgtaaagtag 12720
tgttagtcta gagtagataa atatataaat tagcatttgt ttgaatagat aggaagagga 12780
agtcaggcca gggaatccct gccaccggat gttggatgac ggtgctgtct gcgttccaac 12840
cccaggagga ctgggttaac aaatctgggt gcatggagga gctaagcgtt caataccgcc 12900
tcggagaact ccctggctca cgaagtgccc tggaccagtg tcgggccaca ggttttgtgc 12960
cactagcgtg cagtgcagcc cggacaaaag acacgcccca ggaggactgg gaaaacaaag 13020
ccgaaatggc ccccacggcc tgaaatgatg gagctggtgt gaccatcatg gagggactag 13080
aggttagagg agaccccgtg gaaagaaagc aaggcccaac ctagagtcaa gctgtaactc 13140
taggggaagg actagaggtt agaggagacc ccttgcgagt gagcaccaca agaaacagca 13200
tattgacacc tgggatagac taggagaccc tctgtcctaa caacaccagc cacttggcac 13260
agatcgccga aagtgtggct ggtggtggta gaacacagga tctgggtcgg catggcatct 13320
ccacctcctc gcggtccgac ctgggctact tcggtaggct aagggagaag gcggccgccc 13380
atcgattgta tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg 13440
ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc 13500
ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga 13560
tccccgggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg 13620
ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt 13680
ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg 13740
ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag 13800
aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac 13860
ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg 13920
gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc 13980
cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat 14040
tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt tctaatcaga attggttaat tggttgtaac 14100
actggcagag cattacgctg acttgacggg acggcggctt tgttgaataa atcgaacttt 14160
tgctgagttg aaggatcaga tcacgcatct tcccgacaac gcagaccgtt ccgtggcaaa 14220
gcaaaagttc aaaatcacca actggtccac ctacaacaaa gctctcatca accgtggctc 14280
cctcactttc tggctggatg atggggcgat tcaggcctgg tatgagtcag caacaccttc 14340
ttcacgaggc agacctcagc gctcaaagat gcaggggtaa aagctaaccg catctttacc 14400
gacaaggcat ccggcagttc aacagatcgg gaagggctgg atttgctgag gatgaaggtg 14460
gaggaaggtg atgtcattct ggtgaagaag ctcgaccgtc ttggccgcga caccgccgac 14520
atgatccaac tgataaaaga gtttgatgct cagggtgtag cggttcggtt tattgacgac 14580
gggatcagta ccgacggtga tatggggcaa atggtggtca ccatcctgtc ggctgtggca 14640
caggctgaac gccggaggat cctagagcgc acgaatgagg gccgacagga agcaaagctg 14700
aaaggaatca aatttggccg caggcgtacc gtggacagga acgtcgtgct gacgcttcat 14760
cagaagggca ctggtgcaac ggaaattgct catcagctca gtattgcccg ctccacggtt 14820
tataaaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 14880
tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 14940
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 15000
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 15060
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 15120
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 15180
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 15240
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgt 15278
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctggagtg aaggtgtttt gtaattgacg agcattccta gggg 44
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaaggtgat gcgaccgg 18
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttacaaaaca ccttcactcc agct 24
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agctggagtg aaggtgtttt gtaaacgtta ctggccgaag cc 42
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccttccaggc ttcttattac tcatattatc atcgtgtttt tcaaaggaa 49
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgagtaata agaagcctgg aagg 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttatctcctc ttggcttttc ttttg 25
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caaaagaaaa gccaagagga gataaatata tgaggtaggt gtaaaaatgt atgtaaag 58
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccatacaatc gatgggcggc cgccttctcc ctta 34
<210> 11
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tacactccgc tagcatacta gttaatacga ctcactatag agaagttcat ctgtgtgaac 60
ttattcc 67
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgacgtttcg ccttccgtct caggacccca tcaatcg 37
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggaaggcga aacgtcg 17
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tacccacata ttgtgctcga gc 22
<210> 15
<211> 980
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgaaggtgat gcgaccggga cgtgatggga agacagttat ggatgtcatc tcgcgggaag 60
accagagggg aagtggacag gttgtgacct atgctctcaa cactttcacg aacctgtgtg 120
tccagctcat tagatgtatg gaaggggagg agctgctgct ccccgaggaa acagagcgtc 180
taaaaaaagg aaaggagaag cgcatccaag aatggctcca aaagaatgga gagaacaggt 240
tgtcagccat ggcagtcagt ggggatgact gtgtggtgaa accagcggat gacagattcg 300
ccacagcact gcacttcctc aatagtatgt ctaaggtgag gaaagatact caggaatgga 360
agccctcaac cggttggaga aactggcaag aagtcccctt ttgctcacac catttccacg 420
agctgcaaat gaaagatggc agaaagattg tggttccatg tcgagaccag gatgagctaa 480
ttggaagagc caggctctct ccagggtctg gctggtcact aacagaaaca gcatgcctga 540
gcaaagcata tgctcagatg tggttattga tgtacttcca caggagggac ctcagactaa 600
tggcaaacgc catctgctca tctgtccctg tctcatgggt ccccacagga aggacaacgt 660
ggtcaatcca tggaaaaggc gagtggatga cttctgaaga catgctggca gtgtggaaca 720
gggtgtggat tgaagaaaat gaacacatgg aagacaaaac cccagtgact tcatggaacg 780
aagtgccata ccttggaaag agggaagatg gctggtgtgg tagtctgatt ggacaccgag 840
ccagatctac ctgggccgag aacatataca ctccaattat gcagatcaga gctctcattg 900
gccctgagca ctatgtagat tatatgccaa ctctaaatag gttcaaaccc attgaaagct 960
ggagtgaagg tgttttgtaa 980
<210> 16
<211> 599
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agctggagtg aaggtgtttt gtaaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatgag taataagaag cctggaagg 599
<210> 17
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgagtaata agaagcctgg aaggccaggg tcaggacggg tcgtgaacat gttgaagagg 60
ggaacctcgc gcggaaaccc tctagccaga attaaacgaa ccatagacgg tgtgctccgt 120
ggtgctggtc cgattcgctt cgtcctcgca cttctcacat tttttaaatt cactgcgctc 180
cgtcctacga taggtatgct caaacgttgg aaattagtag gtgtgaacga agccacgaag 240
cacctcaaga gctttaaaag agatataggt caaatgcttg atggcttgaa caaaagaaaa 300
gccaagagga gataa 315
<210> 18
<211> 734
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caaaagaaaa gccaagagga gataaatata tgaggtaggt gtaaaaatgt atgtaaagta 60
gtgttagtct agagtagata aatatataaa ttagcatttg tttgaataga taggaagagg 120
aagtcaggcc agggaatccc tgccaccgga tgttggatga cggtgctgtc tgcgttccaa 180
ccccaggagg actgggttaa caaatctggg tgcatggagg agctaagcgt tcaataccgc 240
ctcggagaac tccctggctc acgaagtgcc ctggaccagt gtcgggccac aggttttgtg 300
ccactagcgt gcagtgcagc ccggacaaaa gacacgcccc aggaggactg ggaaaacaaa 360
gccgaaatgg cccccacggc ctgaaatgat ggagctggtg tgaccatcat ggagggacta 420
gaggttagag gagaccccgt ggaaagaaag caaggcccaa cctagagtca agctgtaact 480
ctaggggaag gactagaggt tagaggagac cccttgcgag tgagcaccac aagaaacagc 540
atattgacac ctgggataga ctaggagacc ctctgtccta acaacaccag ccacttggca 600
cagatcgccg aaagtgtggc tggtggtggt agaacacagg atctgggtcg gcatggcatc 660
tccacctcct cgcggtccga cctgggctac ttcggtaggc taagggagaa ggcggccgcc 720
catcgattgt atgg 734
<210> 19
<211> 272
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tacactccgc tagcatacta gttaatacga ctcactatag agaagttcat ctgtgtgaac 60
ttattccaaa cagttttttg ggatagtgcg tgtgaacgta aacacagttt gaacgttttt 120
tggatagaga caactatgtc taacaaaaaa ccaggaagac ccggctcagg ccgggttgtc 180
aatatgctaa agcgcggaac gtcccgcgga aatccgctag cgcggataaa gaggacgatt 240
gatggggtcc tgagacggaa ggcgaaacgt cg 272
<210> 20
<211> 2277
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cggaaggcga aacgtcgggg ggggagttgc tcttgggtca tcatgttact cccgatagtt 60
gctgggctga aacttggaaa ttataatggt agagttttgg ccactttaaa caagactgat 120
gtgtcagact tgctagtcat tccaacaacg gctggcagca atggatgcgt cgtgcgagct 180
ctagatgtgg gactgatgtg tcaggatgac ataacgtacc tgtgcccaaa gttggagtac 240
ggctatgaac ctgaagacat agactgctgg tgcaatgaga ctgagatata cattcattat 300
gggagatgta ccccttcacg gcatggacgg aggtctagga ggtcggtgaa cgtgcatcac 360
catggagaga gtctacttga ggccaagaac acgccgtgga tggattcgac caaagccact 420
aaatatctca caaaggttga gaactgggcg ttgagaaatc ctgggtacgc ccttgctgcc 480
atcttcatag gctggaactt gggaacgacg agaagccaga agataatttt cacaattatg 540
ttaatgttaa ttgccccagc gtacagcttc agctgtctgg ggatgcagaa ccgagacttt 600
gttgagggag tgaatggtgt tgagtggatc gatgtcgttc tggaaggagg ctcatgcgta 660
actattacgg caaaagacag gccgaccata gacgtcaaga tgatgaacat ggaggctacg 720
gaattagcgg ttgtgagatc ttactgctat gagccgaaag tgtcggacgt gacgacagaa 780
tccagatgcc caaccatggg agaggctcat aatcccaagg caacttatgc tgaatacata 840
tgcaaaaaag attttgtgga caggggttgg ggcaatggct gtggcttgtt tggaaagggg 900
agcatccaga catgtgccaa gtttgactgc acaaagaaag cagaaggcag gatcgtgcag 960
aaggaaaacg tccagtttga agttgcagtt tttatacatg gttccacgga agcgagcacc 1020
taccacaatt attcagccca gcagtcgctg aaacatgccg ctagattcgt gataacgccc 1080
aaaagtcccg tctacactgc tgagatggag gattatggta ccgtcacact cgaatgcgaa 1140
ccccgatctg gggttgacat ggggcaattc tacgtcttca ccatgaatac aaagagctgg 1200
cttgttaaca gagactggtt tcatgacctc aacttaccat ggacagggtc atcagcgggg 1260
acgtggcaaa acaaagagtc attgatagaa tttgaggagg ctcatgccac caaacaatca 1320
gtggtggctt tggcatcaca agaaggagcc ctccatgcag cattggcggg agctattcca 1380
gtgaagtact ctggaaacaa attggaaatg acctcaggtc atcttaaatg cagggtcaaa 1440
atgcagggtt tgaagctgaa aggaatgacc tacccgatgt gtagcaatac attttcccta 1500
gtgaagaatc ctaccgacac tgggcatggc actgtcgtgg tggaattgtc ttatgcaggt 1560
accgatgggc cctgtagagt tcccatatcc atgtcggcag atttgaatga catgacacca 1620
gttggacgct tgataacagt caacccatac gtgtcgactt cctccacggg tgccaagata 1680
atggtggaag tggaacctcc attcggggat tcatttattt tagtaggaag tggaaaagga 1740
cagattaggt accagtggca tagaagtggg agtacaattg gaaaagcttt cacgtcaaca 1800
ctcaaaggag cacaaaggat ggttgctttg ggtgacactg catgggattt tggttcagtt 1860
gggggtgtac tcacttccat tgggaaaggc attcatcaag tcttcggctc agcatttaaa 1920
agcttatttg gaggaatgtc atggattact caaggcatgt taggggcact gctattgtgg 1980
atgggcctga atgcaaggga cagatccatt tctatgacct ttctagtcgt aggaggaatt 2040
ttagtcttct tggcagtaaa tgtcaatgcc gacacggggt gctcaatcga cttggctagg 2100
aaagaattaa aatgtggaca aggcatgttt gtcttcaacg atgttgaggc ctggaaggat 2160
aattacaagt actatccatc cacaccaagg agacttgcca aagtcgtggc aaaagctcat 2220
gaggctggaa tttgtggcat acgatcagtc agcaggctcg agcacaatat gtgggta 2277
<210> 21
<211> 2992
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tatcggatcc atgagtaata agaagcctgg aaggccaggg tcaggacggg 480
tcgtgaacat gttgaagagg ggaacctcgc gcggaaaccc tctagccaga attaaacgaa 540
ccatagacgg tgtgctccgt ggtgctggtc cgattcgctt cgtcctcgca cttctcacat 600
tttttaaatt cactgcgctc cgtcctacga taggtatgct caaacgttgg aaattagtag 660
gtgtgaacga agccacgaag cacctcaaga gctttaaaag agatataggt caaatgcttg 720
atggcttgaa caaaagaaaa gccaagagga gaaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 780
tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 840
aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 900
ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 960
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 1020
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 1080
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 1140
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catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 1260
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ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 1380
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 1440
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 1500
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 1560
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 1620
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 1680
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cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 1800
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tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 1920
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 1980
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 2040
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 2100
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 2160
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 2220
agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 2280
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 2340
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 2400
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 2460
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 2520
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 2580
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 2640
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 2700
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 2760
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 2820
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 2880
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 2940
attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 2992
<210> 22
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agctggagtg aaggtgtttt gtaattgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc 60
aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga 120
agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg 180
tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag 240
tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc 300
aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta tgggatctga tctggggcct 360
cggtgcacat gctttacatg tgtttagtcg aggttaaaaa acgtctaggc cccccgaacc 420
acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacac gatgataata tgagtaataa gaagcctgga 480
agg 483

Claims (6)

1.一种质粒载体，其特征在于，所述质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种质粒载体，其特征在于，将权利要求1所述的质粒载体中的IRES元件的5’端序列进行截短，截短后的IRES元件命名为MINI-IRES元件，所述MINI IRES元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；获得的截短后的质粒载体命名为pACYC-CQW1-MINI-mC。
3.一种鸭坦布苏病毒弱毒株的制备方法，其特征在于，将权利要求1或2所述质粒载体进行体外转录，然后将体外转录的RNA转染BHK-21细胞，获得鸭坦布苏病毒弱毒株。
4.由权利要求3所述制备方法获得的鸭坦布苏病毒弱毒株。
5.权利要求4所述鸭坦布苏病毒弱毒株在鸭坦布苏病毒减毒活疫苗制备中的应用。
6.权利要求1或2所述质粒载体在鸭坦布苏病毒减毒活疫苗制备中的应用。
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