CN103224955A - 一种高效标记斑马鱼pgc的载体及转基因鱼的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效标记斑马鱼PGC的载体及转基因鱼的制备方法和用途。利用Gal4/UAS转录激活系统，以mRFP作为报告基因，实现斑马鱼原始生殖细胞中诱导基因表达调控技术。首先分别构建激活转基因品系Tg(kop:KalTA4)和效应转基因品系Tg(UAS:mRFP)。然后将Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交就能获得高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼。这种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼在鱼类生物工程具有广泛应用。

Description

一种高效标记斑马鱼PGC的载体及转基因鱼的制备方法和用途

技术领域

本发明属于鱼类生物工程技术领域，本发明涉及一种高效标记斑马鱼PGC的载体，还涉及一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法，还涉及该转基因斑马鱼在鱼类生物工程技术的用途。

背景技术

作为遗传物质的传递者，鱼类原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC）因其具有全能性已成为了鱼类生物工程技术的崭新的工具（Yoshizaki,G.,Takeuchi,Y.and Okutsu,T.(2007)."Germ cell in fish:basic biology and biotechnological applications."Tanpakushitsu Kakusan Koso52,2067-2072.）。然而，缺乏良好的标记系统仍然是原始生殖细胞操作的一大障碍。因此，有必要将目前的分子遗传学技术运用到原始生殖细胞中，以便更好的分析生殖细胞发育过程中的分子机制和对其进行遗传操作。

目前已经有一些研究报道建立了观察原始生殖细胞的方法，例如通过早期注射nos13’UTR调控荧光蛋白表达的mRNA可以快速简便地标记斑马鱼原始生殖细胞（Koprunner,M.,Thisse,C.,Thisse,B.and Raz,E.(2001)."A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells."Genes Dev15,2877-2885.），但是利用这种方法荧光蛋白在发育早期并没有非常特异地在原始生殖细胞中表达，而且也不适用于在发育晚期观察原始生殖细胞。同时，研究者们也利用原始生殖细胞的marker基因vasa的启动子和3’UTR驱使的GFP表达构建了转基因品系vas::EGFP("Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish."Mech Dev116,141-150;Fan,L.,Moon,J.,Wong,T.T.,Crodian,J.and Collodi,P.(2008)"Zebrafish primordial germ cell cultures derived from vasa::RFP transgenic embryos."Stem Cells Dev17,585-597.)。在vas::EGFP品系胚胎中，母源的vas::EGFP mRNA和VAS::EGFP蛋白在体节后主要在原始生殖细胞中聚集，且到受精后13天仍能能在原始生殖细胞中持续观察到GFP。利用该品系胚胎，Fan等(Fan,L.,Moon,J.,Wong,T.T.,Crodian,J.and Collodi,P.(2008)"Zebrafish primordial germcell cultures derived from vasa::RFP transgenic embryos."Stem Cells Dev17,585-597)用流式细胞仪分离出荧光标记的斑马鱼体节期原始生殖细胞进行了体外培养。然而，在体节以前，母源表达荧光蛋白VAS::EGFP蛋白分布于整个卵裂球，并不特异于原始生殖细胞中(Krovel,A.V.and Olsen,L.C.(2002)"Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish."Mech Dev116,141-150)。为了避免母源效应，vas::EGFP雄鱼与野生型雌鱼的杂交后代是从14-126天才开始表达EGFP，无法特异观察到早期原始生殖细胞(Wang,X.G.,Bartfai,R.,Sleptsova-Freidrich,I.and Orban,L.(2007)"The timing andextent of'juvenile ovary'phase are highly variable during zebrafish testis differentiation."Journal of Fish Biology70,33-44.)，所以利用vas::EGFP转基因品系并不利于胚胎发育早期操作原始生殖细胞。为了能在发育早期观察原始生殖细胞的迁移和分化，Blaser等人利用kop启动子和nos13’UTR构建了Tg(kop:EGFP)品系能够在发育早期特异地在原始生殖细胞中表达EGFP(Blaser,H.,Eisenbeiss,S.,Neumann,M.,Reichman-Fried,M.,Thisse,B.,Thisse,C.and Raz,E.(2005)"Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish."J Cell Sci118,4027-4038)。由于kop启动子的母源表达效应和nos13’UTR的定位作用，Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFP mRNA从受精卵开始就定位于生殖质和原始生殖细胞中，从而可以利用Tg(kop:EGFP)从发育早期追踪观察原始生殖细胞的迁移和分化过程。然而由于母源性启动子kop表达的EGFP-UTRnos1mRNA的含量不高，导致EGFP的荧光强度非常弱，对观察原始生殖细胞的发育带来不便。

Gal4/UAS系统在很多生物的特异组织中都具有转录放大作用(Halpern,M.E.,Rhee,J.,Goll,M.G.,Akitake,C.M.,Parsons,M.and Leach,S.D.(2008)"Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish."Zebrafish5,97-110.)。利用Gal4/UAS系统控制基因表达的策略是首先利用组织特异性的启动子或增强子，将Gal4基因与启动子或增强子相连接，建立Gal4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制Gal4的表达。同时建立Gal4识别序列UAS（Upstream Activation Sequence）与靶基因相融合的转基因系。UAS-靶基因系中靶基因处于转录沉默状态，只有将Gal4转基因系与UAS-靶基因系进行杂交，才可能产生在特异组织中表达靶基因的后代(Traven,A.,Jelicic,B.and Sopta,M.(2006)"Yeast Gal4:a transcriptional paradigm revisited."EMBO Rep7,496-499;Scheer,N.andCampos-Ortega,J.A.(1999)"Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish."Mech Dev80,153-158)。近期，研究者们利用Gal4/UAS系统用于斑马鱼的启动子捕获研究，建立了能一些在斑马鱼组织中特异诱导表达荧光蛋白的转基因品系(Davison,J.M.,Akitake,C.M.,Goll,M.G.,Rhee,J.M.,Gosse,N.,Baier,H.,Halpern,M.E.,Leach,S.D.and Parsons,M.J.(2007)"Transactivation from Gal4-VP16transgenic insertionsfor tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish."Dev Biol304,811-824;Asakawa,K.,Suster,M.L.,Mizusawa,K.,Nagayoshi,S.,Kotani,T.,Urasaki,A.,Kishimoto,Y.,Hibi,M.and Kawakami,K.(2008)"Genetic dissection of neural circuits by Tol2transposon-mediated Gal4gene and enhancer trapping in zebrafish."Proc Natl Acad Sci U S A105,1255-1260)。然而目前为止，仍没能构建出能在斑马鱼原始生殖细胞中特异表达Gal4的转基因品系。同时，考虑到该系统的激活效率和细胞毒性，Distel等人将Gal4蛋白的DNA结合域与优化的单纯疱疹病毒蛋白VP16转录激活域TA4相融，同时连接上kozak翻译增强序列改造成的KalTA4蛋白，与4xUAS搭配使用可以有效的减少Gal4/UAS系统的细胞毒性和提高诱导激活效率(Distel,M.,Wullimann,M.F.and Koster,R.W.(2009)"Optimized Gal4genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish."Proc Natl Acad Sci U S A.106,13365-13370)。因此，我们基于Gal4/UAS系统的转录放大作用，以mRFP作为报告基因，尝试在斑马鱼原始生殖细胞中特异高效诱导mRFP表达。首先，在斑马鱼中建立激活转基因品系Tg(kop:KalTA4)。在这个转基因品系中，KalTA4转录激活因子特异的在原始生殖细胞中表达；其次建立效应转基因品系Tg(UAS:mRFP)。在这个品系中，mRFP是沉默的。当将Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)的雄鱼杂交后，KalTA4转录激活因子就能在杂交胚胎原始生殖细胞中诱导表达mRFP，从而特异，高效标记原始生殖细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的载体：pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1,CMV:EGFP-SV40)，其序列为SEQ ID NO.1所示和pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1,CMV:EGFP-SV40)，其序列为SEQ ID NO.2所示。将这两个载体分别导入到斑马鱼中，Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)的雄鱼杂交后，KalTA4转录激活因子就能在杂交胚胎原始生殖细胞中诱导表达mRFP，从而特异、高效标记原始生殖细胞。

本发明还有一个目的在于提供一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法。该方法是基于诱导系统Gal4/UAS系统构建的，包含2套转基因品系：在原始生殖细胞中特异地表达KalTA4转录激活因子的激活转基因品系Tg(kop:KalTA4)；mRFP表达沉默的效应转基因品系Tg(UAS:mRFP)。将Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)的雄鱼杂交后，KalTA4转录激活因子就能在杂交胚胎原始生殖细胞中特异，高效表达mRFP以标记原始生殖细胞。

本发明的最后一个目的是在于提供了这种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的用途。首先，本发明利用Gal4/UAS转录激活系统，以mRFP作为报告基因，实现了在斑马鱼原始生殖细胞中特异高效诱导基因表达调控技术。其次，利用Tg(kop:KalTA4)品系的转录放大功能在原始生殖细胞中高表达荧光蛋白，从而为研究体内观察，追踪原始生殖细胞发育提供了一个有力的平台，更重要的是，可以通过特异高效表达荧光蛋白分离出更早期的原始生殖细胞进行遗传操作。最后，利用Tg(kop:KalTA4)品系，可以通过注射质粒的方法特异、高效、持续地标记原始生殖细胞。如果将包含表达框UAS:mRFP-UTRnos1的质粒作为构建转基因载体的基本骨架，并将转基因注射到Tg(kop:KalTA4)品系胚胎中，挑出能在原始生殖细胞中表达mRFP的胚胎培养，即在转基因鱼发育早期高效、快速筛选原始生殖细胞整合有外源基因的转基因胚胎。从而大大提高转植基因在转基因鱼中的生殖传递效率，减少转基因鱼的筛选工作量。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下技术措施：

本发明的思路是：激活转基因品系Tg(kop:KalTA4)的转基因载体有2个串联表达框：一个是由kop启动子(Blaser,H.,Eisenbeiss,S.,Neumann,M.,Reichman-Fried,M.,Thisse,B.,Thisse,C.and Raz,E.(2005)"Transition from non-motile behaviour to directed migrationduring early PGC development in zebrafish."J Cell Sci118,4027-4038)和nos13’UTR(Koprunner,M.,Thisse,C.,Thisse,B.and Raz,E.(2001)"A zebrafish nanos-related geneis essential for the development of primordial germ cells."Genes Dev.15,2877-2885.)调控的KalTA4表达框，它们能指导KalTA4在原始生殖细胞中的特异表达，使用的KalTA4蛋白是酵母Gal4蛋白的DNA结合域与优化的单纯疱疹病毒蛋白VP16转录激活域TA4相融合的编码蛋白，同时在KalTA4序列5’端添加的Kozak序列增加KalTA4蛋白的翻译效率，经优化后KalTA4蛋白的诱导水平高且细胞毒性小。另一个是CMV启动和SV40poly(A)调控的EGFP的报告基因表达框，便于构建转基因品系的筛选。效应转基因品系Tg(UAS:mRFP)的转基因载体也包含了2个串联表达框：一个是由UAS和nos13’UTR调控的mRFP表达框，另一个是CMV启动子和SV40poly(A)调控的EGFP的报告基因表达框，便于构建转基因品系的筛选。

一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法，其步骤是：

（1）设计基于Gal4/UAS系统利用mRFP标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因品系。策略图见图1所示：激活品系Tg(kop:KalTA4)可以在斑马鱼原始生殖细胞中特异表达KalTA4转录因子；效应品系Tg(UAS:mRFP)中mRFP因受UAS和nos13’UTR调控表达而处于沉默的状态。如果将Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)的雄鱼杂交，杂交胚胎原始生殖细胞中特异表达的KalTA4转录激活因子就能在原始生殖细胞中特异高效诱导表达mRFP。

（2）构建激活品系Tg(kop:KalTA4)的转基因载体pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)，其序列为SEQ ID NO.1所示。

（3）构建效应品系Tg(UAS:mRFP)的转基因载体pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)，其序列为SEQ ID NO.2所示。

（4）显微注射。

（5）Tg(kop:KalTA4)与Tg(UAS:mRFP)转基因品系的筛选。

（6）Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交获得特异、高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼Tg(kop:KalTA4,UAS:mRFP)。

一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的用途，其步骤是：

（1）激活品系Tg(kop:KalTA4)胚胎中KalTA4mRNA特异地在原始生殖细胞中表达。

1）.KalTA4探针制备。

A.模板的制备和纯化。

以质粒pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)为模板，Probe-KalTA4-F和T3-nos13‘UTR-R（带T3启动子序列）为引物，PCR扩增出模板DNA，参照Axygen公司的PCR clean up试剂盒回收PCR产物，以其作为合成探针的探针。

B.探针合成和回收。

参照Promega的T3RNA聚合酶说明书转录合成RNA探针，并参照sigma spin post-reaction chean-up columns说明书回收探针。

2）.原位杂交检测检测激活品系Tg(kop:KalTA4)胚胎中KalTA4mRNA的表达。

收集的4cell(a)，shield(b)，体节(c)及1day post-fertilization(dpf)(d)时期Tg(kop:KalTA4)品系早期胚胎，然后用KalTA4探针进行原位杂交检测（常规方法，Thisse,B.,Heyer,V.,Lux,A.,Alunni,V.,Degrave,A.,Seiliez,I.,Kirchner,J.,Parkhill,J.P.and Thisse,C.(2004)"Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening."Methods Cell Biol77,505-519.）。

原位杂交结果显示在胚胎早期发育KalTA4mRNA特异地在原始生殖细胞中表达：在二、四细胞期，母源性的KalTA4mRNA定位于分裂沟的边缘；在原肠过程中，KalTA4mRNA呈4簇在胚盘的边缘进行迁移。体节期，KalTA4mRNA聚集成2簇左右对称分布于3-5体节处。发育至1dpf时，KalTA4mRNA呈左右对称全部迁移至背部的肠系膜处。

（2）过表达外源质粒诱导mRFP在原始生殖细胞中表达。

在Tg(kop:KalTA4)品系胚胎1细胞期注射25ng/μl pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)质粒，观察胚胎中的荧光表达。结果显示在体节早期，可以在原始生殖细胞中观察到非常特异地高表达的mRFP。随着发育的进行，在1dpf到9dpf，部分胚胎原始生殖细胞中仍能持续特异地高表达mRFP。这些结果表明利用Gal4/UAS系统，通过注射质粒的方法特异、高效、持续地标记原始生殖细胞。

（3）mRFP mRNA在Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎的原始生殖细胞中特异表达。

分别收集4cell期，shield时期，体节早期和1dpf时期的Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼的杂交胚胎，用vasa和mRFP探针进行原位杂交。原位杂交的结果显示出Gal4/UAS系统胚胎中mRFP mRNA的表达模式与生殖细胞的标志基因vasa的表达模式相似。表明Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼的杂交胚胎中的mRFP都非常特异地表达于原始生殖细胞中。

（4）Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎的原始生殖细胞中增强表达mRFPmRNA。

参照Invitrogen公司的TRIzol试剂盒提取胚胎总RNA，然后参见Invitrogen的反转录酶Superscript II说明书用Oligo(dT)合成cDNA的合成。参照TOYOBO公司的SYBR GreenMix说明书在Applied Biosystems7900仪器上进行Real-Time PCR后。然后运用Appliedbiosystems的SDS2.4软件分析数据，以β-actin基因的表达做内参，用2－△△CT方法分析出EGFP和mRFP的相对表达量(常规方法，Livak,K.J.and Schmittgen,T.D.(2001)"Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the2(-DeltaDelta C(T))."Method.Methods25,402-408.)。

结果显示，Tg(kop:KalTA4,UAS:mRFP)中的mRFP mRNA的表达水平是Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFP mRNA表达水平的300倍(P<0.001)。表明Gal4／UAS系统不仅能特异地在原始生殖细胞中诱导激活目的基因表达，更能高效地增强目的基因在原始生殖细胞中表达。

（5）Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎的原始生殖细胞中特异高效表达mRFP。

之前，Blaser等人构建的Tg(kop:EGFP)品系在发育早期能够用EGFP可以特异地标记原始生殖细胞。他们在共聚焦显微镜下通过观察EGFP追踪原始生殖细胞，并描绘出发育早期原始生殖细胞迁移过程中的细胞形态特征和调控原始生殖细胞迁移的分子机制(Blaser etal.,2005)。首先，我们观察了表达载体kop:EGFP-UTRnos1构建的转基因品系Tg(kop:EGFP)胚胎中EGFP表达模式。在我们实验室的荧光显微镜下，这些品系胚胎能在体节早期观察到原始生殖细胞特异的EGFP，但是荧光只能持续3天。而且EGFP的荧光强度非常弱，对观察原始生殖细胞的发育带来不便。

然后，将Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)品系的雄鱼杂交，观察杂交胚胎Tg(kop:KalTA4,UAS:mRFP)中的mRFP的表达模式。

结果显示，在相同的显微镜下，Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)品系的雄鱼杂交胚胎原始生殖细胞中高表达mRFP：shield时期可以观察到有微弱的mRFP，随着外包的进行荧光强度逐渐增加；胚胎发育至1天时，可以在原始生殖细胞处观察非常强的mRFP，并且荧光持续在原始生殖细胞中高表达；随后，在18dpf时，我们观察mRFP的表达在不同的鱼苗中发生了变化。部分胚胎的整个性腺组织中几乎都能观察到明亮的荧光，而其余的胚胎的性腺中仅少量的荧光表达；在25dpf时，仍能在部分的鱼苗中检测到少量的mRFP；到了30dpf，几乎所有鱼苗都不能在性腺中观察到mRFP。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

（1）本发明所述方法，构建了转基因品系Tg(kop:KalTA4)和转基因品系Tg(UAS:mRFP)。当将Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)的雄鱼杂交后，KalTA4转录激活因子就能在杂交胚胎原始生殖细胞中诱导表达mRFP，从而特异、高效标记原始生殖细胞。

（2）本发明利用Gal4/UAS转录激活系统，以mRFP作为报告基因，实现斑马鱼原始生殖细胞中诱导基因表达调控技术。可以利用Tg(kop:KalTA4)品系的转录放大功能在原始生殖细胞中高表达荧光蛋白，从而为研究体内观察，追逐原始生殖细胞发育提供了一个有力的平台。更重要的是，可以通过特异高效表达的荧光蛋白分离出更早期的原始生殖细胞进行遗传操作和研究。

（3）利用Tg(kop:KalTA4)品系，可以通过注射质粒的方法特异、高效、持续地标记原始生殖细胞。如果将包含表达框UAS:mRFP-UTRnos1的质粒作为构建转基因载体的基本骨架，并将转基因注射到Tg(kop:KalTA4)品系胚胎中，挑出能在原始生殖细胞中表达mRFP的胚胎培养，即在转基因鱼发育早期高效、快速筛选原始生殖细胞整合有外源基因的转基因胚胎。从而大大提高转植基因在转基因鱼中的生殖传递效率，减少转基因鱼的筛选工作量。

附图说明

图1为一种基于Gal4/UAS系统标记斑马鱼原始生殖细胞的策略示意图。

a:Tg(kop:KalTA4)品系载体示意图；b:Tg(UAS:mRFP)品系载体示意图；c:Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交后，原始生殖细胞特异的转录因子KalTA4激活UAS表达mRFP。

图2为一种构建的Tg(kop:KalTA4)品系与Tg(UAS:mRFP)品系示意图。

a,b:构建的Tg(kop:KalTA4)品系与Tg(UAS:mRFP)品系泛表达EGFP的荧光图。

图3为一种Tg(kop:KalTA4)品系早期胚胎中的KalTA4mRNA表达模式示意图。

收集的4cell(a)，shield(b)，体节(c)及1dpf(d)时期Tg(kop:KalTA4)品系早期胚胎用KalTA4探针检测。

图4为在Tg(kop:KalTA4)胚胎中直接注射质粒pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)就可以特异，高效，持续的标记原始生殖细胞。

pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)质粒简写为UAS:mRFP-UTRnos1。从体节期(a)，1天(b)，3天(c)到9天(d)时mRFP都特异地在原始生殖细胞中高表达。

图5为一种原位杂交检测Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎中mRFP mRNA的时空表达模式示意图。

野生型斑马鱼胚胎中原始生殖细胞的特异marker基因vasa的表达模式(a-e)和Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎中mRFP mRNA的表达模式(f-j)。分别收集4细胞期时(a,f,k），sphere时期(b,g,l)，shield时期(c,h,m)，体节期(d,i,n)和1dpf(e,j,o)的胚胎分别用vasa和mRFP探针检测。

图6为Real-Time PCR检测Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼的杂交胚胎中mRFPmRNA表达水平相对于Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFP mRNA表达水平示意图。

图7为一种Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎中荧光表达示意图。

(a-d)Tg(kop:EGFP)品系胚胎中从体节早期(a)，1dpf(b)，3dpf(c)持续表达微弱的EGFP，但是在9dpf不能观察到EGFP(d)。(e-l)Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎中mRFP的表达。从shield时期能够观察到原始生殖细胞中特异表达mRFP(e,e’)。从1dpf(f,f’)，3dpf(g,g’)到9dpf(h,h’)，都能在原始生殖细胞中持续观察到明亮的mRFP。在18dpf时，mRFP的表达在不同的鱼苗中发生了变化。少数胚胎的整个性腺组织中几乎都能观察到明亮的荧光(i,i’)，大部分胚胎的性腺中仅少量的荧光表达(j,j’)；在25dpf时，仍能在部分的鱼苗中检测到少量的mRFP(k,k’)；到了30dpf，几乎所有鱼苗都不能在性腺中观察到mRFP(l,l’)。

具体实施方式

本发明实施例中的方法未经特别说明，均为本领域技术人员熟知的常规方法，具体可参考《分子克隆实验指南》（第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993）。本发明中所用的生物试剂如未经特别说明，均来源于Fermantas公司。

实施例1：一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法，其步骤是：

1.制备基于Gal4/UAS系统利用mRFP标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因品系，策略图见图1所示。然后设计扩增转基因载体中各个片段所需要的引物。引物序列如下表所示：

2.构建激活品系Tg(kop:KalTA4)的转基因载体pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)。

（1）构建载体pMD-18T-UTRnos1。

以质粒kop-new-F-EGFP-UTRnos1为模板(Blaser,H.,Eisenbeiss,S.,Neumann,M.,Reichman-Fried,M.,Thisse,B.,Thisse,C.and Raz,E.(2005)"Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish."J Cell Sci118,4027-4038)，nos13’UTR-F和nos13’UTR-R为引物，PCR扩增将nos13’UTRl连入pMD-18T载体中，获得载体pMD-18T-UTRnos1，同时在nos13’UTRl两端新加入了酶切位点BsiWI，MluI，BspEI和XhoI，ApaI，BglII（常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993）

（2）构建载体pMD-18T-UTRnos1-CMV：EGFP-SV40。

以质粒pCMVEGFP(Liu,W.Y.,Wang,Y.,Sun,Y.H.,Wang,Y.P.,Chen,S.P.and Zhu,Z.Y.(2005)Efficient RNA interference in zebrafish embryos using siRNA synthesized withSP6RNA polymerase.Dev Growth Differ.47,323-331)为模板，CES-F和CES-R为引物，PCR扩增出CMV：EGFP-SV40序列，再用XhoI和ApaI酶切连接的方法将CMV：EGFP-SV40连入载体pMD-18T-UTRnos1中，获得载体pMD-18T-UTRnos1-CMV：EGFP-SV40。

（3）构建载体pMD-18T-UTRnos1-CMV：EGFP-SV40-TR。

以质粒pDestTol2pA2(Urasaki,A.,Morvan,G.and Kawakami,K.(2006)Functional dissection of the Tol2transposable element identified the minimal cis-sequence and a highlyrepetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.Genetics.174,639-649)为模板，TR-F和TR-R为引物，PCR扩增出包含Tol2发挥转座作用的最小右臂的Tol2R序列，再用ApaI和BglII酶切连接的方法将Tol2R连入载体pMD-18T-UTRnos1-CMV：EGFP-SV40，获得pMD-18T-UTRnos1-CMV：EGFP-SV40-TR。

（4）构建载体pTol2(UTRnos1-CMV：EGFP-SV40)。

以质粒pDestTol2pA2(Urasaki,A.,Morvan,G.and Kawakami,K.(2006)Functional dissection of the Tol2transposable element identified the minimal cis-sequence and a highlyrepetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.Genetics.174,639-649)为模板，TL-F和TL-R为引物，PCR扩增出包含Tol2发挥转座作用的最小左臂的Tol2L序列，再用BsiWI和MluI酶切连接的方法将Tol2L连入载体pMD-18T-UTRnos1-CMV：EGFP-SV40-TR，获得载体pTol2(UTRnos1-CMV：EGFP-SV40)。

（5）构建载体pTol2(kop-UTRnos1-CMV：EGFP-SV40)。

以质粒kop-new-F-EGFP-UTRnos1为模板，kop-F和kop-R为引物，PCR扩增出kop启动子序列，再用MluI和BspEI酶切连接的方法将kop启动子连入载体pTol2(UTRnos1-CMV：EGFP-SV40)中，获得载体pTol2(kop-UTRnos1-CMV：EGFP-SV40)，同时在kop下游新加入了酶切位点AscI。

（6）构建载体pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)。

以质粒pBK-KalTA4(Distel,M.,Wullimann,M.F.and Koster,R.W.(2009)OptimizedGal4genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.Proc Natl Acad Sci U S A.106,13365-13370.)为模板，KalTA4-F和KalTA4-R为引物，PCR扩增出转录激活因子KalTA4的全长编码区序列，再用AscI和BspEI酶切连接的方法将KalTA4编码区序列连入载体pTol2(kop-UTRnos1-CMV：EGFP-SV40)中，获得载体pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)。

3.构建效应品系Tg(UAS:mRFP)的转基因载体pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)。

分别以质粒pBK-KalTA4(Distel,M.,Wullimann,M.F.and Koster,R.W.(2009)Optimized Gal4genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.Proc Natl Acad Sc i U S A.106,13365-13370.)和PCS2-mRFP(Addgene)为模板，UAS-mRFP-F和UAS-mRFP-m-R，UAS-mRFP-m-F和UAS-mRFP-R为引物，运用搭桥PCR(Horton,R.M.,H.D.Hunt,et al.(1989)."Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes:gene splicing by overlap extension."Gene77(1):61-68)将4xUAS和mRFP全长编码序列连接成一条DNA链4xUAS–mRFP。扩增条件为：95°C预变性4分钟；95°C变性30秒，65-60°C（每个循环降0.5°C）复性30秒，68°C延伸90秒，10个循环;95°C变性30秒，63°C复性30秒，68°C延伸90秒，10个循环；68°C延伸10分钟；4°C保存。再用MluI和BspEI酶切连接的方法连入载体pTol2(UTRnos1-CMV：EGFP-SV40)，获得载体pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)。

4.显微注射。

通过显微注射仪和显微注射法（Zhu Z,Li G,He L,et al.Novel gene transfer into the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L.1758).Z angew Ichthyol,1985,1:31-34）分别将含转基因载体pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)和pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)导入斑马鱼受精卵中。

5.Tg(kop:KalTA4)与Tg(UAS:mRFP)转基因品系的筛选。

转基因鱼性成熟后，与野生型的雌鱼杂交，将杂交胚胎培养于28°C培养24hr，在荧光解剖镜下挑选出能发出绿色荧光的胚胎继续培养，最后建立纯系Tg(kop:KalTA4)和Tg(UAS:mRFP)。

6.Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交。

将构建的纯合子Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交，就能获得特异高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼Tg(kop:KalTA4,UAS:mRFP)。

实施例2：一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼在鱼类生物工程中的应用，其过程是：

1.激活品系Tg(kop:KalTA4)胚胎中KalTA4mRNA特异地在原始生殖细胞中表达。

（1）KalTA4探针制备。

A.模板的制备和纯化。

以质粒pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)为模板，Probe-KalTA4-F和T3-nos13’UTR-R（带T3启动子序列）为引物，PCR扩增出模板DNA，参照Axygen公司的PCR clean up试剂盒回收PCR产物，以其作为合成探针的探针。

B.探针合成和回收。

参照Promega的T3RNA聚合酶说明书转录合成RNA探针，并参照sigma spin post-reaction chean-up columns说明书回收探针。

（2）原位杂交检测检测激活品系Tg(kop:KalTA4)胚胎中KalTA4mRNA的表达。

收集的4cell(a)，shield(b)，体节(c)及1dpf(d)时期Tg(kop:KalTA4)品系早期胚胎，然后用KalTA4探针进行原位杂交检测（常规方法，Thisse,B.,Heyer,V.,Lux,A.,Alunni,V.,Degrave,A.,Seiliez,I.,Kirchner,J.,Parkhill,J.P.and Thisse,C.(2004)"Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening."Metho ds Cell Biol77,505-519.）。

原位杂交结果显示在胚胎早期发育KalTA4mRNA特异地在原始生殖细胞中表达：在二、四细胞期，母源性的KalTA4mRNA定位于分裂沟的边缘；在原肠过程中，KalTA4mRNA呈4簇在胚盘的边缘进行迁移。体节期，KalTA4mRNA聚集成2簇左右对称分布于3-5体节处。发育至1dpf时，KalTA4mRNA呈左右对称全部迁移至背部的肠系膜处。见图3。

因此，本发明构建出能够在斑马鱼原始生殖细胞中特异表达转录激活因子KalTA4的转基因品系Tg(kop:KalTA4)，从而为基于Gal4/UAS系统诱导目的基因在原始生殖细胞中表达提供平台。

2.过表达外源质粒诱导mRFP在原始生殖细胞中表达。

在Tg(kop:KalTA4)品系胚胎1细胞期注射25ng/μl pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)质粒，观察胚胎中的荧光表达。结果显示在体节早期，可以在原始生殖细胞中观察到非常特异地高表达的mRFP。随着发育的进行，在1dpf到9dpf，部分胚胎原始生殖细胞中仍能持续特异地高表达mRFP。见图4。

因此，本发明利用Tg(kop:KalTA4)品系，通过注射质粒的方法特异、高效、持续地标记原始生殖细胞。如果将包含表达框UAS:mRFP-UTRnos1的质粒作为构建转基因载体的基本骨架，并将转基因注射到Tg(kop:KalTA4)品系胚胎中，挑出能在原始生殖细胞中表达mRFP的胚胎培养，即在转基因鱼发育早期高效、快速筛选原始生殖细胞整合有外源基因的转基因胚胎。从而大大提高转植基因在转基因鱼中的生殖传递效率，减少转基因鱼的筛选工作量。

3.Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎原始生殖细胞中特异表达mRFP mRNA。

分别收集4cell期，shield时期，体节早期和1dpf时期的Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼的杂交胚胎，用vasa和mRFP探针进行原位杂交（常规方法，Thisse,B.,Heyer,V.,Lux,A.,Alunni,V.,Degrave,A.,Seiliez,I.,Kirchner,J.,Parkhill,J.P.and Thisse,C.(2004)"Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening."Methods Cell Biol77,505-519.）。

以vasa基因作为内参标记生殖质和原始生殖细胞（图5，a-e），运用原位杂交技术检测出mRFP mRNA在Tg(kop:KalTA4)与Tg(UAS:mRFP)的杂交胚胎原始生殖细胞中特异表达：不能在4cell期观察到生殖质特异地mRFP mRNA的表达，并且最先只能在sphere时期观察到mRFP mRNA呈4簇分别于杂交胚胎中（图5，k，l）。发育至shield时期，所有检测的胚胎中的mRFP mRNA阳性细胞呈4簇分布于在胚盘的边缘，并且在体节期时聚集成2簇分别于脊索两侧（图5，i，n）。到发育第一天时，mRFP mRNA阳性细胞都位于卵黄球与卵黄管交接处的双侧（图5，j，o）。因此，原位杂交的结果显示出Gal4/UAS系统胚胎中mRFP mRNA的表达模式与生殖细胞的标志基因vasa的表达模式相似。这些结果表明Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼的杂交胚胎中的mRFP都非常特异地表达于原始生殖细胞中，见图5。

因此，本发明所使用的Gal4／UAS系统所诱导的mRFP非常特异地在原始生殖细胞中表达，从而可以用于调控目的基因在原始生殖细胞中特异表达。

4.Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎的原始生殖细胞中增强表达mRFP mRNA。

参照Invitrogen公司的TRIzol试剂盒提取胚胎总RNA，然后参见Invitrogen的反转录酶Superscript II用Oligo(dT)合成cDNA的合成。参照TOYOBO公司的SYBR Green Mix说明书在Applied Biosystems7900仪器上进行Real-Time PCR后。然后运用Applied biosystems的SDS2.4软件分析数据，以β-actin基因的表达做内参，用2－△△CT方法分析出EGFP和mRFP的相对表达量（常规方法，Livak,K.J.and Schmittgen,T.D.(2001)"Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the2(-Delta DeltaC(T))."Method.Methods25,402-408.）。定量PCR的引物序列如下：

以β-actin作为内参，经过Gal4／UAS系统的转录系统调控后，Tg(kop:KalTA4,UAS:mRFP)中的mRFP mRNA的表达水平是Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFP mRNA表达水平的300倍(P<0.001)，见图6。

因此，本发明所使用的Gal4／UAS系统不仅能特异地诱导激活目的基因表达，也能显著增强目的基因的表达，从而可以用于调控目的基因在原始生殖细胞中特异增强地表达。

5.Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎的原始生殖细胞中特异高效表达mRFP。

之前，Blaser等人构建的Tg(kop:EGFP)品系在发育早期能够用EGFP可以特异地标记原始生殖细胞。他们在共聚焦显微镜下通过观察EGFP追踪原始生殖细胞，并描绘出发育早期原始生殖细胞迁移过程中的细胞形态特征和调控原始生殖细胞迁移的分子机制(Blaser,H.,Eisenbeiss,S.,Neumann,M.,Reichman-Fried,M.,Thisse,B.,Thisse,C.and Raz,E.(2005)"Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish."J Cell Sci118,4027-4038)。首先，我们观察了表达载体kop:EGFP-UTRnos1构建的转基因品系Tg(kop:EGFP)胚胎中EGFP表达模式。在我们实验室的荧光显微镜下，这些品系胚胎能在体节早期观察到原始生殖细胞特异的EGFP，但是荧光只能持续3天。而且EGFP的荧光强度非常弱，对观察原始生殖细胞的发育带来不便，见图7。

然后，将Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)品系的雄鱼杂交，观察杂交胚胎Tg(kop:KalTA4,UAS:mRFP)中的mRFP的表达模式。

结果显示，在相同的显微镜下，Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)品系的雄鱼杂交胚胎原始生殖细胞中高表达mRFP：shield时期可以观察到有微弱的mRFP（图7，e,e’）随着外包的进行荧光强度逐渐增加（图7，f-h,f’-h'）；胚胎发育至1天时，可以在原始生殖细胞处观察非常强的mRFP(图7，f,f’)，并且荧光持续在原始生殖细胞中高表达；随后，在18dpf时，我们观察mRFP的表达在不同的鱼苗中发生了变化。部分胚胎的整个性腺组织中几乎都能观察到明亮的荧光(图7，i,i’)，而其余的胚胎的性腺中仅少量的荧光表达(图7，j,j’)；在25dpf时，仍能在部分的鱼苗中检测到少量的mRFP(图7，k,k’)；到了30dpf，几乎所有鱼苗都不能在性腺中观察到mRFP(图7，l,l’)。见图7。

因此，本发明可以利用Tg(kop:KalTA4)品系的转录放大功能在原始生殖细胞中高表达荧光蛋白，从而为研究体内观察，追逐原始生殖细胞发育提供了一个有力的平台。更重要的是，可以通过特异高效表达的荧光蛋白分离出更早期的原始生殖细胞进行遗传操作。

    SEQUENCE LISTING

<110>  中国科学院水生生物研究所

<120>  一种高效标记斑马鱼PGC的载体及转基因鱼的制备方法和用途

<130>  一种高效标记斑马鱼PGC的载体及转基因鱼的制备方法和用途

<160>  2    

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  11556

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca     60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc    180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc    240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat    300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt    360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttatcgta cgtttggtca    420

agaaccagag gtgtaaagta cttgagtaat tttacttgat tactgtactt aagtattatt    480

tttggggatt tttactttac ttgagtacaa ttaaaaatca atacttttac ttttacttaa    540

ttacattttt ttagaaaaaa aagtactttt tactccttac aattttattt acagtcaaaa    600

agtacttatt ttttggagat cacttcattc tattttccct acgcgttggt cctttggaag    660

tgacgtcatg tcacatctat taccacaatg cacagcacct tgacctggaa attagggaaa    720

ttataacagt caatcagtgg aagaaaatgg aggaagtatg tgattcatca gcagctgcga    780

gcagcacagt ccaaaatcag ccacaggatc aagagcaccc gtggccgtat cttcgcagat    840

ctgatctaga ggatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa    900

aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttctc    960

gccactgcat catccattct gtcactgata ccaggtacca ccttgctcag gatattgatc   1020

acaacactac gaacatcctc tcccggtttc tcttgtaccc cgtgtagttt cagtgtccac   1080

ctccaactgt accgtttgca cactcccact tcttctttta aagttgcgtt cacctgtttt   1140

agctcgagaa tctccgtgtt cacaacctga agggcttcct tgtgagtgga cacttcggct   1200

acaagctgat gcacggtcga ggacaagttt tcaatctgtt ttgcagtaac ggcagttgtt   1260

tggtcaattg acgcaatctt ttcgaacatc ttgtcatatt taccagcaag atcttgaatg   1320

gcggccaaaa ttgcagcgga tgtgttgtca ctatccatgc cttcacgttt tgactttttt   1380

gagctgggtt ttattggggt gtcgggcaac ggagttgcca ggacatcgct cattttgggc   1440

cgaacgttaa accattcgtt cgttgacttt tcccctgtcg ctaagtcttg ttcatcctcc   1500

gaaagtgcag gcttcagggt acattcactt tgatcaggat ccatccttga cttagatgac   1560

acgtgagtaa cttgtgcttg cttgtttttt cttctgccca taaactcaac tcgaagtaac   1620

gtcttaaata acagtcctaa atatatgttt atccataagt attaatttgt gcgttactgg   1680

ttgttttatg ctccaacctc aagttttcct gacgagactt cagcaacacc tcctatctct   1740

ccgccatctt ggccggcctt gagcggcagt tctgttggcg caaatgcctt gttgctgtca   1800

gaggagaatg gccagacagg ttccagctga tagaaaggca acagtaactc aaataaccac   1860

tcgttacaac caaggtctgc aaaagagcaa ctctgaacct gccaacacat tgaaccttga   1920

ggaagatgga ctacagcagc agacgaccag acggctactt ccagcaggat attgcaacat   1980

gtcataaagc gcgaatcatc tcagactggt ttcttaaaca tgacaatgag ttcagtgtac   2040

tcaaatggcc tccacagtct ccagatcctt atccaataga gcacctttgg gatttggtgg   2100

aacaggagaa tcacataatg aatgtgcagc cgacaaatct gcagcaactg cgtgatgcta   2160

tcatgtcaat atggagctaa atctcagagg aatatttcca gtaccttgtt gaatctatgt   2220

catgaagtat taaagcagtt ctgaaggcaa aagggggtcc aacctggtag tgggtaaggg   2280

tacctaataa agtggctggt gagtatgttg atttttgttt catttttcat tggatttcat   2340

tattttactt ttaataaagg gattggtgtt aaaataatgc tctttaagaa gcttacaatt   2400

atataatgat atagtttcta taaagcaaaa ctttaattat aaaattatta taattatagc   2460

attgcattac tatggatttc caaggtatgc tttataaaac acttattatt ttgcatttta   2520

catgcatttt tccagccaat aatataccag aagtcattta agacaggtac agtgtgaaat   2580

gcttgctcat gttgaaatat aataatcatt taaaagcagt gaactcatat ttatcgtcaa   2640

actgattaaa aatacaacac aagcagttag tttgtggttt acaaagggtt tatttcactt   2700

cataagggaa gttctaacac ccactgttag ttcctgtttg cattaatcgt ttcattttca   2760

tacattaaaa ctgtgaagtg atgtgtttta attgatgttt taatagcgcc atccagtggt   2820

aaaatgaagg cagtgctgtt acgagtgttt ggaatgtcaa tccacattgt tgtcatattt   2880

taatttcatt tctgtgtttt taattatcat tggctattta aagttgttat tatatcacaa   2940

agtgcatgat ggatatattt cacgcgatat gtattaatat tcataaaatc gccaggataa   3000

aaagagcaat acctactaat ataaactgta gtaatatctg catcttatta aacacattta   3060

aaccccaagc caacaaacca aatccacatt tattatttaa aatctgtctc tcagccaata   3120

aattataagt acagaccgac cgttgcattg tgtaattagt attcatgacg tcttcgtttt   3180

catcagcagg ctttataaac tcgaattaac cacacctatg tttttgaact tcaataataa   3240

tctaattaaa agttgataag gctattaaaa agggctattt aaagttgtta ttagctcaca   3300

gagtgcattg ttggatatat ttcatgcaat atttattaat attcataaaa tcagcaggct   3360

gttaagagca atacctactg atataaatca tagtaatctt cattgtaatc ctcaaacaaa   3420

caaactaaat tcaccttctt aattcaaact cggtctgtca gccaatcaat tgtaagtacg   3480

acctttgtat tgcgtaatta atattcatga agtccacgtt tttgtcagta gggtttttaa   3540

attttattaa ccacacatat atgttttttt atactttaat aattctattt aaaggtacta   3600

aggctttttt ttaaataagg ctatttaaaa gtttttttat tagccttatt aaacattcaa   3660

acttaaaaca aaccccactt cattcaaaat ctgtctgcca accaattgta agtacaggcc   3720

gaccgtctta ttgcctaatt aatattcatg aagtccacgt tttcatcagt aggatttata   3780

aattcgaatt taccacttct atgttttttt agactttaat aataattgta tttaacattc   3840

aactcggtat ttgactgatt ttgaatatca caaataccat ttaatttaat ttgattccaa   3900

aaaaataatc cacatgattt ccagccaatc agcagcctgg gtgtcagtga aacgttagtt   3960

ttgatatttg agtttgtcag tctgtttggg taataatttg cactttaaaa aaacgcgata   4020

tcgtactaca ggtaagtttt cagagtgtta attatctctc aatcgttcaa cctcatcaat   4080

ttagaacagt ttaaagttaa cgttatcaac aaactcataa catgcataac gttacaccac   4140

acgtttaact tgaacgatgt ttgtgtttag ctgtttgcaa gtcacccggt cgtgatatcg   4200

acacaatcct gtttcaatac cgttaattat catcatacat tctttgtttg cggagataat   4260

attagccctt gtgcacagtt caaattgacc acccgtttgt tatgttcctg gctgttttgt   4320

tctattgact tccatcgtaa ttaacttaaa aatttttatt gcaatgcctt gacactgtat   4380

aatccgtgcg ttcttgattg ttggtggttt tcgctgttga gaagaggtca aatctgtact   4440

gttgatcaga tcgtcaattg gtattaaccc tttagataga cctgtgcaaa aaataaataa   4500

aacgtttctg gcttttatat ggggttctat ggaggaaaac gggtaattat actgtgtgtg   4560

tatgtgtgtg cgcatgaatt tttgctatgt ttctaaaagc tgagtgaatc aagtgtgcaa   4620

tggtctctct caaatacact cacacttctc tctctctgac tcacaaacac aaaccagacc   4680

atgcccgcca gcctggtgaa aggggtggtt cttatttttc cagttattcg cctcattttt   4740

atttaattat gaggtttaga tgctgcattt tagtagcatt tcaagcacaa ttttttgctg   4800

gattagtttg tcggatggtc atcataatcc cattttttat gtgtcaaaaa catttctgaa   4860

atatttagaa taaagaaatg tgaatatgat acttattttt aaaatacaaa ttttctactt   4920

catatatcat tagaaaaata ggaatttgtt aatgttttaa ataaaaaaaa aaaaaactga   4980

gtattgattt cccagagatg ggttgcggct ggaaggacat ctgctccgta aaaatgtgct   5040

ggataaattg gcggctaatt ccgctgtggc ggcctcggat taataaaggg actaagccga   5100

caagaaaatg aatgaatgag aattaacatg actatttttt atacaaaaaa atactattgt   5160

catttattag gctaaataca aactggccag cacattcaac tttccttaat cagtatttgg   5220

gatgctgagt ttggtacggc atgacttcag tacaggaaca caggattctg cttggtctta   5280

aggccttttt taaagggttg ctttcacaat ttatgatggc atagcagtca aaataggaca   5340

aatgagtatg tattggacaa attatggact tttgtcagtg aggggtgggt ctttcaataa   5400

gacaccatat ccaaaatgca catcaaacta ggaaagaaac attgctgttg tactgcataa   5460

cagtggtttg ttttgtagac aattgaaaca aaatgttgct tatgggagct aatgctattg   5520

aagaaattgt gttttcaact gtataaacta ataatgaata gaatttatag aaaaggtact   5580

atactgggat atctttgtca gggtattatg agatggctta tatcataaga gtatttttgt   5640

catatccagt taatctactg ctgaaaataa cttttttttt tttcttcagg tttcaagagg   5700

tttcagaaga caagacgatt tatcttcctc tttcagtggt agttttttcc tacaaaaata   5760

tcattcggcg cgccgagaac cctggacctc aattcgccgc caccatgaaa ctgctctcat   5820

ccatcgagca agcctgcgac atttgtcggc ttaagaagct gaaatgctcc aaggaaaagc   5880

cgaaatgtgc caaatgcctg aagaacaatt gggaatgtcg ttactctccc aaaaccaagc   5940

gaagtccact cacaagggct catctgaccg aagtggagag caggctagag agactggaac   6000

aactcttttt gctcatcttc cctagagagg accttgacat gatcctcaag atggattctc   6060

tccaggatat taaagccctt ttgactggct tattcgtcca ggacaatgtg aacaaagacg   6120

ctgtgacaga ccgattggca agtgtcgaga ccgatatgcc tctgacactg agacagcaca   6180

gaatcagcgc tacttcctca agcgaagagt cttctaacaa gggacagaga cagctgactg   6240

tttcgagcag gtcgaccccg tccccggccg acgccctgga cgacggcgac ctggacatgc   6300

tgcctgctga tgctctcgat gatttcgatc tggatatgct cccggccgac gccctggacg   6360

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cattgatgct ccgggagatt tgaagaaaca ctttttaccg caggttttaa tgtttaagtt   6480

ttaactcttt aattgtttgt ttggttgata cgcggcggat tgcgagtttg catgcatgtg   6540

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tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat  11220

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gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga  11340

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gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg  11460

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<210>  2

<211>  6992

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  2

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Claims (4)

1.一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的载体，其特征在于，转基因载体pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1, CMV:EGFP-SV40)，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的载体，其特征在于：转基因载体pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1, CMV:EGFP-SV40)，其序列为SEQ ID NO.2所示。

3.一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法，其步骤是：

（1）Tg(kop:KalTA4)转基因品系的制备

通过显微注射仪和显微注射法将含转基因载体导入斑马鱼受精卵中，转基因鱼性成熟后，与野生型的雌鱼杂交，将杂交胚胎培养于28oC培养24hr，在荧光解剖镜下筛选出发出绿色荧光的胚胎继续培养，建立纯系Tg(kop:KalTA4)；

所述的转基因载体pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1, CMV：EGFP-SV40)其序列为SEQ ID NO.1所示；

（2）Tg(UAS:mRFP)转基因品系的制备

通过显微注射仪和显微注射法将转基因载体导入斑马鱼受精卵中，转基因鱼性成熟后，与野生型的雌鱼杂交，将杂交胚胎培养于28oC培养24hr，在荧光解剖镜下筛选出能发出绿色荧光的胚胎继续培养，建立纯系Tg(UAS:mRFP)；

所述的转基因载体pTol2(UAS:mRFP-UTRnos1, CMV：EGFP-SV40)其序列为SEQ ID NO.2所示；

（3）Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交

将构建的纯合子Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交，获得一种特异高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼Tg(kop:KalTA4, UAS:mRFP)。

4.一种权利要求3所述的高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法所制备的转基因鱼在鱼类生物工程中的应用。

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