KR20080113199A

KR20080113199A - 에탄올을 생산하는 시아노박테리아 조성물 및 에탄올의 생산 방법

Info

Publication number: KR20080113199A
Application number: KR1020087019503A
Authority: KR
Inventors: 펭정 패트릭 후; 제이슨 덱스터
Original assignee: 유니버시티 오브 하와이
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2007-01-16
Publication date: 2008-12-29
Also published as: ES2343776B1; JP5306823B2; CA2637031A1; US8372613B2; ES2343776A1; EP1979481A4; EP1979481A1; JP2009523424A; AU2007207635B2; CN101395273A; WO2007084477A1; CA2637031C; ATE500327T1; AU2007207635A1; US20090155871A1; MX2008008970A; DE602007012829D1; EP1979481B1

Abstract

본 발명은 시아노박테리아에 의한 에탄올 생산 방법 및 시스템에 관한 것이다. 더욱 상세히는, 본 방법은 유전자 조작된 광 반응성 시아노박테리아를 사용하여 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

시아노박테리아, 에탄올, 피루베이트 데카복실라제, 알코올 데하이드로게나제, 시네코시스티스

Description

에탄올을 생산하는 시아노박테리아 조성물 및 에탄올의 생산 방법{Methods and compositions for ethanol producing cyanobacteria}

관련 기술의 설명

재생 에너지의 개발은 에너지 성장 및 방출 축소 목표를 만족시키기 위해 사회 및 산업에 의해 신속히 각광받고 있다. 산업 혁명 이래로, 세계 경제는 에너지 원료로서 화석 연료에 지나치게 의존하여 왔다. 이러한 에너지 원료에 대한 의존성은 몇 가지 심각한 문제점, 예를 들어 화석 연료 자원의 공급 감소, 환경 오염 및 후속적인 지구 온난화 효과를 야기하였다. 화석 연료에 대체 에너지가 에탄올이다. 현재 세계 에탄올 생산량은 슈거 작물로부터 60%, 기타 작물로부터 33% 및 화학적 합성에 의한 7%로 이루어진다. 통상적인 바이오매스 에탄올 생산 공정은 공급 원료 생장을 위해 광대한 양의 경작할 수 있는 토지와 에너지 공급을 필요로 한다. 더욱이, 통상적인 발효 방법은 발효 공정의 부산물로서 상당한 양의 CO₂를 방출한다. 예를 들어, 40MMGY(연중 100만 갤런) 바이오매스 에탄올 플랜트는 연 중 121,000 톤의 CO₂를 자연 환경으로 배출할 수 있다(BBI, 2003). 이러한 온실 가스는 지구 온난화 효과를 더욱 악화시킬 것이다.

바이오에탄올은 최근에 재생 연료 기술의 선두 자리로 급부상하고 있다. 이는 석유계 연료의 실용적인 대체 에너지로 생산 및 소비 과정 모두의 조절을 제공한다. 더욱이, 생물학적 시스템으로부터 유도된 에탄올은 수많은 현존하는 인프라구조 내로 용이하게 통합될 수 있기 때문에 생산 및 연료 산업 모두를 고려시 특히 매력적이다. 살아있는 유기체에 의해 에탄올을 생산하는 다양한 방법이 연구되어 왔다. 미생물에 의한 에탄올의 생산은 대부분에 있어서 효모 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 절대적 에탄올생산성 박테리아인 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)를 사용하여 연구되어 왔다. 이들 미생물 모두는, 해당 과정의 생산물인 피루베이트로부터 에탄올을 생산하는 데 사용되는 효소 피루베이트 데카복실라제(pdc)와 알코올 데하이드로게나제(adh)를 생산하는 유전 정보를 함유한다. 문헌[참조: Woods et al. 미국특허 6,306,639 및 6,699,696; Deng 및 Coleman, "Ethanol Synthesis by Genetic Engineering in Cyanobacteria" Applied and Environmental Microbiology (1999) 65(2):523- 428]은 에탄올 생산에 유용한 유전자 변형된 시아노박테리움을 기술하고 있다. 우드 등[Woods et al.]은 배양 30일 후 5mM 에탄올 생산 수준을 보고한다.

따라서, 상당한 양의 에탄올을 생산하는 간단하고, 효율적인, 비용-효율이 높은 생물학적 시스템을 밝혀내는 것이 바람직하다.

발명의 요약

상기 언급한 기술은 다양한 결점으로 인해 한계를 갖는다. 예를 들어, 우드 등[Woods et al.]에 의해 기술된 시스템은 낮은 에탄올 생산 수준, 장기간의 발효 시간 및 불안정성의 한계를 갖는다.

특정 양태에서, 상당한 양의 에탄올을 생산하는 간단하고, 효율적이며, 비용-효율이 높은 시스템의 개발이 요구된다. 본 발명은 경제적으로 적절한 에탄올 농도로 에탄올을 생산하고 숙주 세포의 내성을 최적화하는, 방법, 조성물, 숙주 세포 및 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태에서 핵산 구조물(construct)이 기술된다. 핵산 서열은 광 반응성 프로모터, 피루베이트 데카복실라제(pdc) 효소를 코딩하는 서열 및 알코올 데하이드로게나제(adh) 효소를 코딩하는 서열을 포함한다.

본 발명의 특정 양태에서 발현 벡터가 기술된다. 발현 벡터는 광 반응성 프로모터, 피루베이트 데카복실라제(pdc) 효소를 코딩하는 서열 및 알코올 데하이드로게나제(adh) 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.

본 발명의 특정 양태에서 숙주 세포가 기술된다. 숙주 세포는 광 반응성 프로모터, 피루베이트 데카복실라제(pdc) 효소를 코딩하는 서열 및 알코올 데하이드로게나제(adh) 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.

본 발명의 특정 양태에서 유전자 조작된 시아노박테리움이 기술된다. 시아노박테리움은 피루베이트 데카복실라제(pdc) 및 알코올 데하이드로게나제(adh) 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 구조물을 포함하며, 당해 시아노박테리움은 5일 발효 후에 약 10mM 초과의 회수가능한 양의 에탄올을 생산할 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서 에탄올의 생산 방법이 기술된다. 이 방법은, 배양 배지 중에서, 자이모모나스 모빌리스 pL01295 플라스미드로부터 수득된 pdc 및 adh를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 구조물을 포함하는, 시아노박테리아를 배양시키는 단계 및 5일 발효 후 배양 배지 중 약 10mM 초과의 에탄올 양으로 에탄올을 축적시키는 단계를 포함한다.

도 1은 pMota를 생성시 사용된 플라스미드 구조물 (a) pPSBAIIKS 및 (b) pLOI295의 맵(map)을 보여준다.

도 2는 BIOFLO

반응기에서 시간에 따른 에탄올 농도를 보여준다. 에탄올 농도는 발효 5일 후에 13mM에 도달하였다. 대조군은 비-형질변환된(와일드-타입)의 시네코시스티스(Synechocystis)이다.

본원의 출원 내용을 위 도와 관련하여서 이하 상세히 기술할 것이지만, 이는 단지 예시적 양태와 관련하여 제공되는 것이다. 첨부된 청구항에 의해 부분적으로 정의된 바와 같은 본 발명의 진정한 범위와 취지를 벗어나지 않으면서 기술된 양태 를 변화 및 개질시키고자 한다.

바람직한 양태에 대한 상세한 설명

I. 도입

본 발명의 바람직한 양태에서 시아노박테리아에 의해 고 수준의 에탄올을 생산하기 위한, 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포 및 이의 생산 방법이 기술된다.

태양광, CO₂ 및 무기 영양분(가능하다면 폐수 스트림으로부터 전환된)을 사용한 시아노박테리아로부터 에탄올 생산은, 재생 연료를 수득하는 효과적인 경로이다. 탄소 고정과 에탄올 생산 경로를 단일 생물에 결합시킴으로써, 총 input 에너지는 감소하면서 총 에너지 수확량은 증가되어, 플랜트 성장/수확/공정과 관련된 비용 문제를 해결할 수 있다. 바이오매스 에탄올 생산 공정과는 대조적으로, 기술된 방법은 연료 생산을 위한 탄소 공급원으로서 다량의 CO₂를 직접적으로 활용하여, 결과로서 대기 중 CO₂ 온실 가스가 감소하는 것을 도울 수 있을 것이다.

광합성 미생물, 예를 들어 시네코시스티스를 사용하여 에탄올을 생산하는 방법에는 수많은 이점이 있으며, 당해 이점으로는 바이오연료 생산의 경제적 기회, 긍정적인 환경적 영향, 지구 온난화 감소, 및 개선된 연료 보장을 포함한다. 시아노박테리아를 사용하여 태양 에너지와 CO₂로부터 에탄올을 생산하는 본 발명에 따른 방법은, 바이오매스계 에탄올 생산 시설과 비교해 자본 및 운용 비용 모두에서 상 당한 비용 절감을 제공한다. 감소된 비용은 예를 들어 다음 인자, 간소화된 생산 공정, 농업 작물 및 잔류물의 부재, 처리되어야 할 고체 폐기물의 부재 및 효소 불필요 등에 의해 획득된다. 시아노박테리아 발효에는 처리 곤란한 어떠한 경질 세룰로스나 헤미세룰로오스도 관여하지 않는다. 그 결과로, 시아노박테리아 에탄올 생산 플랜트로부터 해로운 공기 오염 물질이나 휘발성 유기 화합물이 전혀 방출되지 않을 것이다.

바이오매스 에탄올 생산의 통상적인 방법과 비교시, 본원에 기술된 방법 및 시스템은 음식 생산을 위한 농경 부지 보존에 도움을 줄 것이다. 더욱이, 시아노박테리아 에탄올 생산 플랜트는 특정 위치로의 곡물 수송이나 원료 물질의 전처리를 필요로 하지 않기 때문에 지리적인 제한 없이 널리 분포될 수 있다. 본원에 기술된 시스템을 사용한 에탄올 생산에 필요한 인프라구조 및 장비는, 연료 수송 및 분포 플랫폼(platform)의 더 평탄한 통합을 허용함으로써, 현재의 효모 발효 기술에서 요구되는 것보다 상당히 적은 것으로 예상된다.

이산화탄소의 광합성 고정에 의해 초기 생산물은 3-포스포글리세레이트이다. 3-포스포글리세레이트는 캡빈 회로에서 이산화탄소의 수용기인 리불로스-1,5-바이포스페이트의 재생산에 이용된다. 캘빈 회로의 중간 생성물을 기타 대사 경로와 연결시켜 주는 2개의 주요 브랜칭(branching) 포인트가 있다. 한 포인트에서, 프럭토스-6-포스페이트가 글루코스-6-포스페이트 및 글루코스-포스페이트로 전환되고, 이들은 펜토스 포스페이트 경로, 세룰로스 합성(세포벽의 주요 성분) 및 글리코겐(탄수화물 저장의 주요 형태) 합성의 기질이다. 다른 브랜칭 포인트에서, 3- 포스포글리세레이트는, 포스포글리세레이트 뮤타제, 에놀라제 및 피루베이트 키나제에 의해 각각 촉매된 후속 반응에서 2-포스포글리세레이트, 포스포에놀피루베이트 및 피루베이트로 전환된다. 피루베이트는 호기성 조건에서 아미노산, 핵산 염기 등의 합성을 위한 TCA 회로에 부분적으로 관련된다. 피루베이트는 또한 에탄올 합성의 기질이다.

저장 탄수화물을 에탄올로 전환시키기 위해서, 저장 탄수화물은 해당 과정을 거쳐야만 한다. 시아노박테리아에서 저장 탄수화물 대사를 위한 예상 경로는 해당 과정 및 포스포글루코네이트 경로 모두를 통해서이다. 에탄올 형성을 위해서 해당 과정이 일차적으로 중요하다. 비록 시아노박테리아에 특징적인 아니지만, 글리코겐은 글리코겐 포스포릴라제 및 1,6-글리코시다제의 조합에 의해 글로코스 1-포스페이트로 대사되는 것으로 추측된다. 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소메라제 및 포스포프럭토키나제는 글루코스 1-포스페이트를 프럭토스 1,6-비스포스페이트 분자로 전환시킨다. 당해 화합물은 알돌라제와 트리오스 포스페이트 이소메라제의 작용에 의해 2개 분자의 글리세르알데하이드 3-포스페이트가 된다. 당해 화합물은 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제, 포스포글리세레이트 키나제, 포스포글리세레이트 뮤타제, 에놀라제 및 피루베이트 키나제로 각각 촉매되는 후속의 일련의 반응에 의해 피루베이트로 전환된다.

몇몇의 녹조 및 시아노박테리아 종에서, 소량의 에탄올이 암소 혐기성 조건 하에서 발효 산물로서 합성된다[참조 문헌: Van der Oost et al., "Nucleotide sequence of the gene proposed to encode the small subunit of the soluble hydrogenase of the thermophilic unicellular cyanobacterium Synechococcus PCC 6716." Nucleic Acids Res. 1989 Dec 1 1 ;17(23):10098, 당해 문헌은 참조에 의해 전체가 본원에 혼입된다]. 그러나, 암소-혐기 발효 공정은 일반적으로 그러한 스트레스 조건 하에서 미생물의 생존에만 충분할 정도의 매우 낮은 수준으로 작동한다. 암소 혐기성 조건 하에서의 에탄올 합성은 전술한 바와 같이 저장 글리코겐의 분해에 의존한다. 더욱이, 혐기성 조건 하에서 에탄올 합성은 광에 의해 완전히 억제되는 것이 밝혀졌다. 따라서, 광합성 미생물에서 에탄올 합성은 광합성과 결합되지 못하고 광합성에 의해 실제로 억제될 수 있다.

따라서, 시아노박테리아는 이산화탄소를 활용하여 에탄올을 생산하지 못하는 것으로 관찰되었다. 더욱이, 상당히 실질적인 양으로 에탄올을 생산하는, 유전자 조작된 광합성 미생물을 포함한 어떠한 광합성 미생물도 공지되어 있지 않다. 추가적 문제점은 특정 광합성 미생물이, 배양 배지 내 에탄올 첨가로 광합성 관련된 유전자 발현이 억제됨으로써, 에탄올에 의해 억제되는 것으로 보인다는 것이다.

본 발명에 이르러, 시아노박테리아를 성공적으로 유전자 조작하여, 혐기의 암소의 조건하에서 저장 글리코겐을 활용하여 얻어지는 것과는 상반되게, 상당한 양의 에탄올을 생산할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 2개의 전술한 효소 pdc와 adh로 이루어진 에탄올 생산 대사 경로의 삽입에 의해, 무기 탄소가 동화되어 세포 성장 및 에탄올 생산 모두에 사용된다.

II . 정의

다른 언급이 없다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에 사용된 다음 용어는 다른 특정 언급이 없다면 이들에 속하는 의미를 갖는다.

"피루베이트 데카복실라제" 및 "pdc"는 피루브산의 아세트알데하이드 및 이산화탄소로의 탈탄소화를 촉매하는 효소를 나타낸다. "pdc 유전자"는 피루브산의 아세트알데하이드 및 이산화탄소로의 탈탄소화를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다. "알코올 데하이드로게나제" 및 "adh"는 알코올과 알데하이드 또는 케톤 사이의 상호 전환을 촉진시키는 효소를 나타낸다. "adh 유전자"는 알코올과 알데하이드 또는 케톤 사이의 상호 전환을 촉진시키는 효소를 코딩하는 유전자를 나타낸다. "pdc/adh"는 pdc 및 adh 효소를 집합적으로 나타낸다. "pdc/adh 카셋트(cassette)"는 pdc 효소 및 adh 효소를 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.

"프로모터"는 관련된 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열의 배열로, 이는 외래 또는 천연 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프로모터는 폴리머라제 결합 부위와 같은 전사의 출발 부위 근처의 핵산 서열을 포함한다. 또한, 프로모터는 전사의 출발 부위로부터 수천 개의 염기 쌍만큼의 위치를 갖는, 말단 인핸서(enhancer) 또는 리프레서(repressor) 요소를 임의로 포함할 수 있다.

"광 반응성 프로모터"는 광에 반응성인 프로모터를 나타낸다.

"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은, 자연적으로 발생하는 구조의 변이체 및 합성적인 비-자연적으로 발생하는 이의 유사체 관련의, 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 뉴클레오티드 단위(리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 관련된 자연적으로 발생하는 구조적 변이체, 및 합성적인 비-자연적으로 발생하는 이의 유사체)로 이루어진 중합체를 나타낸다. 따라서, 당해 용어는 뉴클레오티드 중합체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 사이의 연결이 비-자연적으로 발생하는 합성 유사체를 포함한다. 내용에 따라 필요한 경우, 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열에 의해 표현될 때(즉, A, T, G, C), 이는 또한 T가 U로 대체된 RNA 서열(즉, A, U, G, C)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

"재조합"은 합성 폴리뉴클레오티드 또는 시험관 내에서(in vitro) 조작된 기타 폴리뉴클레오티드를 나타내며("재조합 폴리뉴클레오티드"), 세포나 기타 생물학적 시스템에서 당해 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 유전자 생성물을 제조하기 위해 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법을 나타낸다. 예를 들어, 클로닝된 폴리뉴클레오티드가 적합한 발현 벡터, 예를 들어 박테리아 플라스미드 내로 삽입되고, 당해 플라스미드는 적합한 숙주 세포를 형질 변환시키는 데 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 "재조합 숙주 세포" 또는 "재조합 박테리아"로 표현할 수 있다. 당해 유전자를 다음으로 재조합 숙주 세포에서 발현시켜 예를 들어 "재조합 단백질"을 생산시킨다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 또한 비-코딩되는 기능(예: 프로모터, 복제 원인, 리보솜-결합 부위 등)을 제공할 수 있다.

용어 "상동 재조합"은 핵산 서열 유사성에 근거한 2개의 핵산 분자 사이의 재조합 과정을 나타낸다. 당해 용어는 상호적 및 비상호적 재조합(또한 유전자 전환으로 표현되는) 모두를 포함한다. 추가로, 재조합은 동등하거나 비동등한 크로 스-오버(cross-over) 사건의 결과일 수 있다. 동등한 크로스오버는 2개의 동등한 서열 또는 염색체 부위 사이에서 발생하는 반면, 비동등한 크로스오버는 비동등한 서열 또는 염색체 부위의 동일한 또는 실질적으로 동일한 단편 사이에서 발생할 수 있다. 비동등한 크로스오버는 일반적으로 유전자 중복 및 삭제를 야기한다. 상동의 재조합에 관련된 효소 및 메카니즘에 대한 기술은 문헌[ Watson et al., Molecular Biology of the Gene pp 313-327, The Benjamin/Cummings Publishing Co. 4th ed. (1987)]을 참조한다.

용어 "비-상동의 또는 랜덤(random) 통합"은 DNA가 상동의 재조합이 관여하지 않는 게놈 내로 통합되는 임의의 공정을 나타낸다. 랜덤 과정은 혼입이 임의의 다수의 게놈 위치에서 발생할 수 있는 것으로 보인다.

"이종(heterologous)의 폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "이종의 핵산"은, 다른 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 프로모터 서열과 기능적으로 관련된 폴리뉴클레오티드를 나타내는 상대적인 용어로, 당해 2개의 폴리뉴클레오티드 서열은 자연적으로 서로 동일한 관계로 배열되지 않는다. 이종의 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 이종의 핵산과 작동적으로 연결된 프로모터, 및 재조합 숙주 세포로 형질전환되는 이종의 벡터 내로 삽입되는 이의 천연 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이종의 폴리뉴클레오티드 서열은 당해 서열이 형질 전환 기술을 통해 숙주 세포로 도입되기 때문에 "외인성"인 것으로 간주된다. 그러나, 이종의 폴리뉴클레오티드는 외래(foreign) 기원 또는 동종 기원일 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 예를 들어 폴리뉴클레오티드를 제한 효소로 처리함으로써 발생하며, 이로써 조절 요소에 작동적으로 연결될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수 있다. 변형은 또한 부위-지시된 변이생성과 같은 기술에 의해 발생할 수 있다.

용어 "내생적(endogenous)으로 발현된"은 숙주 세포에서 유래되고, 숙주 세포에서 자연적으로 발현되는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.

"발현 카세트" 또는 "구조물"은 숙주 세포에서 유전자 전사를 허용하는 일련의 폴리뉴클레오티드 요소를 나타낸다. 일반적으로, 발현 카세트는 포로모터와 전사되는 이종 또는 천연의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현 카세트 또는 구조물은 또한 예를 들어 전사 종결 시그날, 폴리아데닐화 시그날 및 인헨서 요소를 포함할 수 있다.

용어 "작동적으로 연결된"은 한 부분의 작용(예: 전사를 조절하는 능력)으로 인해 다른 부분에 있어서 작용(예: 서열의 전사)을 일으키는, 2개 부분 사이의 기능적 관계를 나타낸다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터 또는 기타 전사 조절 서열) 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열(예: 천연 또는 이종의 폴리뉴클레오티드) 사이의 기능적 연결이 존재하는 경우, 폴리뉴클레오티드는 "프로모터에 작동적으로 연결"되며, 여기서 발현 조절 서열은 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시한다.

"발현에 충분한"은 내생적 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드의 발현에 충분한 세포 환경을 제공하는 숙주 세포를 나타낸다.

본 발명의 명세서 및 청구항에 사용된 성분, 반응 조건 등의 양을 나타내는 모든 숫자는, 모든 예에서 용어 "약"에 의해 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상반된 언급이 없다면, 본 발명의 명세서 및 첨부된 청구항에 나타난 수적인 파라미터는 본 발명에 의해 수득하려고 하는 목적하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사값이다. 적어도, 균등론의 적용을 청구항의 범위로 제한하려는 시도가 아닌 경우, 각각의 수적인 파라미터는 유의한 아라비아숫자(digit) 및 통상적인 대략의(rounding) 접근 관점에서 해석되어야 한다.

III . 양태의 설명

본 발명의 특정 양태에 있어서, 에탄올 생산을 최적화하는 핵산 및 재조합 발현 벡터가 기술된다. 도 1은 시스템의 한 양태를 보여주며, 이는 다양한 방법이나 공정을 시행하는 데 사용될 수 있는 하기 실시예 1에서 더욱 상세히 기술된다. 에탄올 생산을 최적화하는 pMota 재조합 발현 벡터의 서열을 SEQ ID NO: 1로 나타낸다. pMota 벡터는, 500 염기 쌍 상동의 업스트림 부위 핵산 서열(SEQ ID NO: 2)에서 시네코시스티스(Synechocystis) psbAII 프로모터에 대한 서열, PLOI295로부터의 자이모모나스 모빌리스 pdc를 코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 3), 및 PLOI295로부터의 자이모모나스 모빌리스 adhII을 코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 4)를 함유한다. pMota 벡터는 PLOI295(도 1b)로부터의 pdc/adh 카세트를 pPSBAIIKS 플라스미드(도 1a) 내로 서브클로닝함으로써 제조되었다. pMota 벡터는 시아노박테리아 게놈에서 psbAII 광 반응성 프로모터의 조절 하에 당해 유전자들을 통합하는 게 사용되었다.

숙주 세포의 형질 전환용 재조합 발현 벡터 및 관심 유전자(들)의 후속의 통합은, 우선 본원에 기술된 바와 같이 구성 폴리뉴클레오티드 서열을 분리시킴으로써 제조된다. 특정 양태에서, 관심 유전자는 숙주 세포 게놈 내로 상동적으로 통합된다. 다른 양태에서, 유전자는 숙주 세포 게놈 내로 비-상동적으로 통합된다. 바람직하게 관심 유전자는 시네코시스티스 게놈 내로 상동적으로 통합된다. 특정 양태에서, pMota 벡터는 이중 상동 재조합을 통해 psbAII 유전자 좌(locus) 내에 통합된다. 다음으로, 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 프로모터에 의해 유도된 pdc/adh 효소를 코딩하는 서열이 연결되어, "pdc/adh 구조물"로 언급될 수 있는 재조합 발현 벡터를 생성하며, 당해 벡터는 숙주 세포의 형질 전환에 적합하다. 재조합 폴리뉴클레오티드를 분리하고 제조하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2d ed. 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995)]은 많은 클로닝 연습을 통해 당업자가 실행하기에 충분한 정보를 제공한다.

특정 폴리뉴클레오티드를 수득하는 바람직한 한 방법은 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 용도를, mRNA 또는 DNA 템플릿 상 폴리머라제 확장 또는 연결(ligation)과 조합시키는 것이다. 이러한 방법, 예를 들어 RT, PCR 또는 LCR은 목적하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시킨다[참조: 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호]. 제한 엔도뉴클레아제 부위는 프라이머에 혼입될 수 있다. 증폭된 폴리뉴클레오티드를 정제하고 연결하여 발현 카세트를 제조할 수 있다. 천연 유전자 서열에서의 변경이, 시험관 내 변이유발과 같은 기술에 의해 도입될 수 있으며, 프라이머를 사용한 PCR이 적합한 변이를 혼입시키도록 고안된다. 뉴클레오티드 서열을 분리시키는 다른 바람직한 방법은, 핵산 단편을 플라스미드로부터 분리시키는 공지된 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용한다. 관심 유전자는 또한 공지된 유전자 서열에 기초하여 프라이머를 사용하여 당업자에 의해 분리될 수 있다.

본 발명에 적합한 프로모터는 예를 들어 psbAII 프로모터 및 nirA 프로모터와 같은, 임의의 적합한 광-반응성 프로모터를 포함한다. 특정 양태에서, 프로모터는, 와일드 타입의 시네코시스티스 종(Synechocystis sp.) PCC 6803 세포에서, 광시스템 II의 D1 서브유닛(subunit)을 코딩하는 psbAII 유전자 전사를 매개하는, 동일반응계(in situ) 천연 psbAII 프로모터이다. psbAII 광 반응성 프로모터는 시네코시스티스 종 PCC 6803에서 내생성 psbAII 유전자 업스트림(upstream) 바로 근처에 위치한다. 특정 양태에서, 프로모터는 nirA 프로모터로, 이는 시네코시스티스 종 PCC 6803의 유도성 발현 벡터를 개발 중에 퀴 등[Qi et al.(2005)]에 의해 기술된, 166 염기 쌍 시네코코커스 종(Synechococcus sp .) PCC 7942 프로모터 서열이다.

특정 양태에서, 프로모터는, psbAII 프로모터를 함유하는 SEQ ID NO:2로 표현된 핵산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 프로모터는 SEQ ID NO:5로 표현된 핵산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 프로모터는, SEQ ID NO:6으로 표현된 시네코코커스 nirA 프로모터 서열을 포함한다. SEQ ID NO:6에서, 와일드 타입 nirA 프로모터의 3' 말단에서 TCC가 서열 CAT로 대체되어, 프로모터/ORF 구조의 공간적 통합은 유지하면서, 출발 코돈에서 NdeI 제한 부위를 생성시킨다. 이로써 관심 유전자 가 배양 배지에 질산염을 첨가시키는 유도를 통해 발현될 수 있는 시스템이 생성된다. 암모니아가 유도 전 성장을 위한 질소원으로 사용될 수 있다[참조: Qi et al., 2005]. 특정 양태에서, SEQ ID NO:2로 표현되는 서열을 갖는 psbAII 프로모터를 함유하는 500 염기 쌍 상동 업스트림 영역이 재조합 발현 벡터를 제조하는 데 사용된다. 500 염기 쌍 상동성은, 이중 상동 재조합을 통해 psbAII 유전자 좌내로 통합을 위한 벡터를 표적으로 한다.

발현될 수 있는 임의의 pdc 유전자가 본 발명에서 사용될 수 있다. 특정 양태에서, pdc 유전자는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) pdc 유전자이다. 특정 양태에서, pdc 유전자는 자이모모나스 모빌리스 플라스미드 pLOI295로부터 수득된다. 특정 양태에서, pdc 유전자는 SEQ ID NO:3으로 표현된 핵산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, pdc 유전자는 SEQ ID NO:7로 표현된 단백질을 코딩하는 핵산 서열이다. 다른 양태에서, pdc 유전자는 자이모박터 팔마에(Zymobacter palmae)에서 수득되는 pdc 효소를 코딩하는 핵산이다. 자이모박터 팔마에로부터 완전한 pdc 단백질 서열의 NCBI 접근 번호는, AF474145(SEQ ID NO:8)이다. 특정 양태에서, pdc 유전자는 SEQ ID NO:8로 표현된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이다. pdc 및 adh 효소의 기타 공급원, 예를 들어 사카로마이세스 세레비스시아(Saccharomyces cerevisciae)가 존재한다.

발현될 수 있는 임의의 adh 유전자가 본 발명에서 사용될 수 있다. 특정 양태에서, adh 유전자는 자이모모나스 모빌리스 adhII 유전자이다. 특정 양태에서, adh 유전자는 자이모모나스 모빌리스 플라스미드 pLOI295로부터 수득된다. 특정 양태에서, adh 유전자는 SEQ ID NO:4로 표현된 핵산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, pdc 유전자는 SEQ ID NO:9로 표현된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이다.

선택되어 분리된 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 전술한 프로모터 서열에 의해 유도된 pdc/adh 유전자는, "발현 벡터", "클로닝 벡터", 또는 "벡터" 내로 삽입되며, 당해 용어들은 일반적으로 플라스미드 또는 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있는 기타 핵산 분자를 나타낸다. 발현 벡터는 자동적으로 복제하거나 숙주 세포의 게놈 내로 삽입됨으로써 복제할 수 있다.

빈번하게, 벡터는, 예를 들어 클로닝 및 구조를 위해서는 E. coli 및 발현을 위해서는 시네코시스티스와 같이, 하나 이상의 숙주 세포에서 사용될 수 있는 것이 바람직하다. 벡터의 추가적 구성 요소로, 예를 들어 선택가능한 마커, 예를 들어 가나마이신 저항성 또는 암피실린 저항성을 포함할 수 있으며, 이로써 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 세포를 동정 및/또는 선택할 수 있다.

세포 내로의 유전자 정보를 전달하는 데 사용되는 특정 벡터가 특히 중요한 것은 아니다. 재조합 단백질의 발현에 사용되는 임의의 적합한 벡터가 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 숙주 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있는 벡터가 사용된다. 특정 양태에서, 벡터는 라가드 등[Lagarde et al.(2000)]에 의해 제조되고 기술된 pSBAIIKS이다. 발현 벡터는 일반적으로 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클로오티드의 발현에 필요한 모든 구성 요소를 함유하는 발현 카세트를 가진다. 전형적인 발현 카세트는 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되는 프로모터 를 함유한다. 전술한 바와 같이, pdc/adh의 발현을 지시하는 프로모터가 사용될 수 있으며, 당해 프로모터는 pdc/adh 단백질을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 프로모터는, 바람직하게 이의 자연 세팅에서 전사 시작 부위로부터의 위치와 마찬가지로, 이종의 전사 시작 부위로부터 거의 동일한 거리에 위치한다. 그러나, 당업자에 의해 공지된 바와 같이 이러한 거리의 특정의 변화가 프로모터 기능을 소실하지 않으면서 제공될 수 있다.

pdc/adh 유전자 외에, 에탄올 생산을 최적화하는 발현 벡터는, 경제적으로 적절한 에탄올 농도를 위해 숙주 세포의 내성 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, omrA, lmrA 및 lmrCD와 같은 유전자가 발현 벡터 내 포함될 수 있다. 와인 젖산 박테리아 오에노코코스 오에니(Oenococcus oeni)로부터의 OmrA 및 이의 유사체인 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis)로부터의 LmrA가, tolC(-) E. Coli의 상대적 저항성을 100 내지 10,000배 증가시키는 것으로 보고되었다[참조: Bourdineaud et al., 2004). 따라서, 숙주 세포의 에탄올 내성을 증가시키기 위해, omrA, lmrA 및 기타 유사체를 혼입시키는 것이 유리할 수 있다. 특정 양태에서, pdc/adh 유전자를 포함하는 발현 벡터는 omrA 유전자를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, pdc/adh 유전자를 포함하는 발현 벡터는 lmrA 유전자를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, pdc/adh 유전자를 포함하는 발현 벡터는 lmrCD 유전자를 추가로 포함한다. 표준 발현 카세트에 일반적으로 사용된 것을 포함하여, 숙주 세포 내 이종의 유전자 발현을 유도하기에 적합한 임의의 프로모터가, 숙주 세포의 내성유전자 유도를 위해 사용될 수 있다.

재조합 발현 벡터를 제조 및 분리한 후, 당해 벡터는 에탄올 생산을 위해 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용된다. 단백질 발현을 위해 유전자 물질을 숙주 세포 내로 도입시키는 데 사용되는 특정 공정은 특별히 중요한 것은 아니다. 외래의 폴리뉴클레오티드 서열을 숙주 세포 내 도입시키기 위한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 형질전환되어 윌리암(1988)에 의해 기술된 프로토콜을 통해 순차적으로 스크리닝될 수 있다. 당해 방법은 시네코시스티스 종 PCC 6803 시아노박테리아의 자연적 형질전환을 이용하며, 여기서 형질전환은 정제된 플라스미드 구조물을 기하급수적으로 성장하는 세포와 단순히 배양시킴으로써 가능하다.

전술한 재조합 발현 벡터로 형질전환되는 숙주 세포는 에탄올을 생산하기에 충분한 임의의 적합한 숙주 시아노박테리움을 포함하며, 특히 시네코시스티스 속의 구성 요소를 포함한다. 본 발명에 사용되기 적합한 숙주 세포는, 예를 들어 와일드 타입 시네코시스티스 종 PCC 6803, 및 호위트 등(Howitt et al.(1999))에 의해 제조된, 기능성 NDH 타입 2 데하이드로게나제 결여된(NDH-2(-)), 변이 시네코시스티스를 포함한다. 타입 2 데하이드로게나제는 NADH로부터 NAD+의 재생산에 특이적이다. 에탄올 경로를 통한 플럭스(flux)가 변이체에서 증가될 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 시네코시스티스이다. pdc/adh 구조물로 형질전환된 숙주 세포는 에탄올 생산에 유용한 재조합 시아노박테리아이다. 시네코시스티스의 바람직한 하위종은 예를 들어 시네코시스티스 PCC 6803을 포함한다. 바람직한 종은 시네코시스티스 종 PCC 6803 NDH-2(-) 변이체이다.

숙주 세포가 pdc/adh 구조물로 형질전환된 후에, 숙주 세포는 에탄올 생산에 적합한 조건 하에서 배양된다. 일반적으로, 숙주 세포는 BG-11 배지의 광독립영양성 액상 배지 중에서, 1L/분의 공기 살포율, 8.5의 pH 세트포인트(setpoint), CO₂로 살포를 통한 조절, 30℃의 온도 조건 하에서 배양된다. 시아노박테리아를 성장시키기 위한 다양한 배지가 당업자에게 공지되어 있다. 특정 양태에서, 시네코시스티스 종 PCC 6803은, (최종 농도) 5mM 글루코스, 5% 수크로스 및/또는 5 ㎍ml^-1, 25 ㎍ml^-1또는 50 ㎍ml^-1의 가나마이신 첨가 또는 비첨가된, 표준 BG-11 배지 플레이트에서 배양된다. 시네코시스티스 종 PCC 6803을 함유하는 플레이트를 30℃의 ~100 마이크로아인슈타인 m²s^-1에서 배양하였다. 모든 시네코시스티스 액상 배양액에 적당한 시기에 50 ㎍ ml^-1의 가나마이신을 첨가하여, 표준 BG-11에서 성장시켰다.

에탄올의 분비 개선이, 에탄올을 생산하기에 충분하도록 숙주 세포를 pdc/adh 구조물로 형질전환시키고, 세포를 전술한 바와 같은 적합한 조건 하에서 성장시킨 후에 관찰되었다. 에탄올의 분비 개선은, 당업자에게 공지된, 하기 실시예에서 더욱 상세히 기술될 표준 방법에 의해 관찰될 수 있다. 특정 양태에서, 숙주 세포를 뱃치 배양을 사용하여 성장시킨다. 특정 양태에서, 숙주 세포를 광바이오반응기(photobioreactor) 발효를 사용하여 성장시킨다. 특정 양태에서, 숙주 세포를 BIOFLO

반응기에서 성장시킨다. 특정 양태에서, 숙주 세포가 성장하는 성장 배지를 교환하여, 이로써 에탄올 생산 수준을 증가시킨다. 배지 교환 횟수는 달라질 수 있다. 에탄올 농도 수준은 발효 약 2 내지 약 5일 후에 약 5mM 내지 약 15mM에 도달할 수 있다. 배지가 교환되는 경우에, 에탄올 생산 수준은 발효 5일 후에 약 25 내지 약 100mM에 도달할 수 있다. 특정 양태에서, 에탄올 생산 수준은, 발효 약 5일 후에, 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11.0, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9, 12.0, 12.1, 12.2, 12.3, 12.4, 12.5, 12.6, 12.7, 12.8, 12.9, 13.0, 13.1, 13.2, 13.3, 13.4, 13.5, 13.6, 13.7, 13.8, 13.9, 14.0, 14.1, 14.2, 14.3, 14.4, 14.5, 14.6, 14.7, 14.8, 14.9 또는 15.0 mM이다. 배지가 교환되는 경우에, 특정 양태에서, 에탄올 생산 수준은 발효 약 5일 후에, 약 25.0, 25.1, 25.2, 25.3, 25.4, 25.5, 25.6, 25.7, 25.8, 25.9, 26.0, 26.1, 26.2, 26.3, 26.5, 26.6, 26.7, 26.8, 26.9, 27.0, 27.1, 27.2, 27.3, 27.5, 27.6, 27.7, 27.8, 27.9, 28.2, 28.3, 28.5, 28.6, 28.7, 28.8, 28.9, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 29.5, 29.6, 29.7, 29.8, 29.9, 30.0, 30.1, 30.2, 30.3, 30.4, 30.5, 30.6, 30.7, 30.8, 30.9, 31.0, 31.1, 31.2. 31.3, 31.4, 31.5, 31.6, 31.7, 31.8, 31.9, 32.0, 32.1, 32.2, 32.3, 32.4, 32.5, 32.6, 32.7, 32.8, 32.9, 33.0, 33.1, 33.2, 33.3, 33.4, 33.5, 33.6, 33.7, 33.8, 33.9, 34.0, 34.1, 34.2, 34.3, 34.4, 34.5, 34.6, 34.7, 34.8, 34.9, 35.0, 35.1, 35.2, 35.3, 35.4, 35.5, 35.6, 35.7, 35.8, 35.9, 36.0, 36.1, 36.2, 36.3, 36.5, 36.6, 36,7, 36.8, 36.9, 37.0, 37.1, 37.2, 37.3, 37.5, 37.6, 37.7, 37.8, 37.9, 38.2, 38.2, 38.3, 38.5, 38.6, 38.7, 38.8, 38.9, 39.0, 39.1, 39.2, 39.3, 39.5, 39.6, 39.7, 39.8, 39.9, 4O.0, 40.1, 40.2, 40.3, 40.4, 40.5, 40.6, 40.7, 40.8, 40.9, 41.0, 41.1, 41.2. 41.3, 41.4, 41.5, 41.6, 41.7, 41.8, 41.9, 42.0, 42.1, 42.2, 42.3, 42.4, 42.5, 42.6, 42.7, 42.8, 42.9, 43.0, 43.1, 43.2, 43.3, 43.4, 43.5, 43.6, 43.7, 43.8, 43.9, 44.0, 44.1, 44.2, 44.3, 44.4, 44.5, 44.6, 44.7, 44.8, 44.9, 45.0, 45.1, 45.2, 45.3, 45.4, 45.5, 45.6, 45.7, 45.8, 45.9, 46.0, 46.1, 46.2, 46.3, 46.5, 46.6, 46.7, 46.8, 46.9, 47.0, 47.1, 47.2, 47.3, 47.5, 47.6, 47.7, 47.8, 47.9, 48.2, 48.2, 48.3, 48.5, 48.6, 48.7, 48.8, 48.9, 49.0, 49.1, 49.2, 49.3, 49.5, 49.6, 49.7, 49.8, 49.9 또는 50.0 mM이다. 발효 시간은 약 2일 내지 약 30일 발효로 달라질 수 있다. 특정 양태에서, 발효 시간은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25일이다.

숙주 세포 성장 동안의 공기 살포율은 0.1L/분 내지 3.0L/분일 수 있다. 특정 양태에서, 숙주 세포 성장 동안의 공기 살포율은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3.0 L/분이다. 바람직하게, 공기 살포율은 1L/분이다. 숙주 세포 성장을 위한 pH 세트포인트는 7.0 내지 9.5일 수 있다. 특정 양태에서, pH 세트포인트는 약 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4 또는 9.5이다. 숙주 세포 성장 동안의 온도는 약 25℃ 내지 35℃일 수 있다. 특정 양태에서, 온도는 약 25.0, 25.1, 25.2, 25.3, 25.4, 25.5, 25.6, 25.7, 25.8, 25.9, 26.0, 26.1, 26.2, 26.3, 26.5, 26.6, 26.7, 26.8, 26.9, 27.0, 27.1, 27.2, 27.3, 27.5, 27.6, 27.7, 27.8, 27.9, 28.2, 28.2, 28.3, 28.5, 28.6, 28.7, 28.8, 28.9, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 29.5, 29.6, 29.7, 29.8, 29.9, 30.0, 30.1, 30.2, 30.3, 30.4, 30.5, 30.6, 30.7, 30.8, 30.9, 31.0, 31.1, 31.2. 31.3, 31.4, 31.5, 31.6, 31.7, 31.8, 31.9, 32.0, 32.1, 32.2, 32.3, 32.4, 32.5, 32.6, 32.7, 32.8,. 32.9, 33.0, 33.1, 33.2, 33.3, 33.4, 33.5, 33.6, 33.7, 33.8, 33.9, 34.0, 34.1, 34.2, 34.3, 34.4, 34.5, 34.6, 34.7, 34.8, 34.9 또는 35.0℃이다.

다음 실시예는 예시를 위한 것으로 발명의 범위를 이에 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1

형질전환 벡터, pMota 의 제조

본 실시예는 형질전환 벡터, pMota의 제조를 예시한다.

pLOI295로부터 pdc/adhII 카세트 증폭과 5' 및 3' 말단에 NdeI 및 BamHI 부위를 각각 동시에 도입시키기 위해, PCR이 사용되었다. 다음으로, 당해 부위에서 pdc/adhII를 pPSBAIIKS 플라스미드의 백본(backbone) 내로 서브클로닝(subcloning) 시키고, Ndel/BamHI 이중 소화를 통해 aphX/sacB 선택 카세트를 제거시켜 pMota를 수득하였다. 다음 프라이머를 상기 PCR 반응에 사용하였다(제한 부위는 밑줄 표시되어 있으며, 유도된 변이는 굵게 표시되어 있다): 업스트림: 5'-ggAgTAAgCATATgAgTTATACTg - 3'(SEQ ID NO: 10) 다운스트림: 5'- ggATCTCgACTCTAgAggATCC - 3' (SEQ ID NO: 11). PCR을 다음과 같이 시행하였다: 총 반응 용적 50㎕, 템플릿으로 0.36㎍의 pLOI295, 4 유닛의 0.36 Vent_R

폴리머라제, 최종 농도 0.5 μM의 각 프라이머, 300 μM의 각 dNTP. Eppendorf

Mastercycler

에서 반응을 다음 프로그램으로 진행시켰다: 2분 동안 94℃에서 초기 변성, 다음으로 94℃에서 10초 변성의 35주기, 47℃에서 1분 냉각, 및 68℃에서 3.7분 신장, 최종 4℃ 유지.

모든 플라스미드/PCR 클린업 키트 및 Taq DNA 폴리머라제는 퀴아젠(Qiagen

)으로부터 구입하였다. 모든 제한 효소, Vent_R

폴리머라제 및 T4 DNA 리가제는 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs

)으로부터 구입하였다. 플라스미드 PSBAIIKS를 아리조나 주 대학의 윔(Wim F. J. Vermaas)으로부터 구입하였다. Z. 모빌리스 pdc 및 adhII 유전자를 함유하는 플라스미드 LOI295를 플로리다 대학에서 로니(Lonnie O. Ingram)으로부터 수득하였다.

실시예 2

안정한 에탄올 생산을 위한 형질 전환 및 스크리닝

본 실시예는 에탄올 생산에 있어서 안정한 시아노박테리아 주(line) 제조를 예시한다.

pMota를 제조한 후(상기 실시예 1 참조), 시네코시스티스 종 PCC 6803의 와일드 타입과 NDH-2(-) 변이 종 모두를 형질전환시키고 윌리암(1988)에 의해 기술된 프로토콜에 의해 pPSBAIIKS 및 pMota로 순차적으로 스크리닝하였다. pPSBAIIKS로 형질전환시킨 후, PCR계 검사에 의해 확인되는 바와 같이, 증가하는 가나마이신 농도에 대한 순차적 리플릿팅(replating)으로, aphX / sacB 선택 카세트에 대하여 완전히 분리된, 종 WT_[r] 및 NDH-2(-)_[r]를 분리시켰다. 이를 차례로 액상 시드(seed) 배지에서 50 ㎍ ml^-1의 가나마이신의 존재하에 성장시키고, 후속적으로 pMota로 형질전환시켰다.

형질전환체를 5% 수크로스를 함유하는 BG-11 플레이트 상에서 스크리닝하였다. 스크리닝은, psbAII 유전자 좌를 프로빙(probing)하는 데 사용된 초기 PCR계 검사와, 선택적 압력의 부존재 하의 에탄올 생산 안정성을 측정하는 최종 시드(seed) 반응기계 검사 모두와 결합된, 단일 콜로니의 순차적 스트리킹(streaking)을 통해 수행하였다. PCR 검사는 (1) WT psbAII 유전자, (2) aphX/sacB 선택 카세트, 및 (3) pdc / adhII 에탄올 경로 카세트의 존재를 프로빙하는, 샘플 당 3개의 PCR 반응물로 구성된다. PCR 검사를 포함하는 3개의 반응물 각각은 psbAII 유전자 좌의 외측에 위치한 공통의 업스크림 프라이머를 공유하며, 각 반응물은 3개의 가능한 유전자 구조물의 각각에 특이적인 다운스트림 프라이머로 정의된다. 모든 3개 반응물에 사용된 업스트림 프라이머는, psbAII 시작 코돈의 앰플리콘 개시 48 bp 업스트림을 가진, 5'-gTCAgTTCCAATCTgAACATCGA -3' (SEQ ID NO: 12)이었다. WT psbAII 유전자를 프로빙하기 위한 다운스트림 프라이머는, 5'-AATTTgTAACCgTAgTTCTgggAT - 3' (SEQ ID NO: 13)이고 생성 앰플리콘은 749 bp이다. aphX / sacB 선택 카세트를 프로빙하기 위해, 다운스트림 프라이머 5' - TTggTgATTTTgAACTTTTgCTTgC - 3' (SEQ ID NO: 14)를 사용하여 3.1 kb 앰플리콘을 생성하였다. pdc / adhll 카세트를 프로빙하기 위한 다운스트림 프라이머는 5' - TTgCAAgCgATTTCgAgATAAA - 3' (SEQ ID NO: 15)로, 554 bp 앰플리콘이 제조되었다. 모든 PCR 반응은, 임의의 고충실(high fidelity) 폴리머라제를 배제시키는 것만을 변형시킨, 긴 PCR 생산물의 섹션에서 퀴아젠(Qiagen

) Taq 폴리머라제 핸드북에 기술된 바와 같이 구성되었다. PCR 검사는 다음 주기의 프로그램을 사용하였다: 3분 동안 94℃에서 초기 변성, 다음으로 94℃에서 10초 변성의 35회 주기, 48℃에서 1분 냉각, 및 68℃에서 3.5분 신장, 최종 68℃에서 3분 신장, 4℃ 유지.

주어진 시아노박테리아 샘플에 PCR 검사를 실시하기 위해, 왓트맨(Whatman

) 브랜드 FTA

카드를, 상기 PCR 반응에서 템플릿으로서 사용되기 위한 게놈 DNA의 신속한 제조를 위해 사용하였다. 액상 배양을 시험하기 위해, 5㎕를 FTA

카드에 점적하였다. 시험을 위해 배양물을 고체 배지에 스트리킹하고, 다수의 콜로리를 플레이트로부터 채집한 후, 1.5ml의 튜브 내부에 스트리킹한 후, 보텍싱(vortexing)을 통해 10㎕의 BG-11에 재현탁시키고, 다음으로 5㎕를 상기한 바와 같은 FTA

카드에 점적하였다. 박테리아 제공원으로부터 저장된 DNA 제조를 위한 FTA

프로토콜 후 PCR 검사의 템플릿을 제조하였다.

일차 시드 반응계 검사가, 안정한 에탄올 생산을 위해 에탄올 카세트로 완전히 분리되었음을 보여주는 콜로니를 스크리닝하는데 사용되었다. 시드 반응기를, 주어진 고립자(isolate)의 플레이트로부터의 다수의 콜로니와 접촉시켰다. 세포를 0.1 초과의 OD₇₃₀으로 성장시키고, 실온에서 6분 동안 3220×g에서 원심분리한 후, 초기 OD₇₃₀ = 0.025에서 신선한 시드 반응기 중 재현탁하였다. 이를 순차적인 5개의 런(run) 중 제1 시험반응기에 위치시켰다. 반응기를 5일 동안 운행시키고, 세포를 원심분리하여 재수집하고, 이를 제2 시험 반응기에 상기 OD₇₃₀=0.025에서 순차로 접종하였다. 물론, 총 세포 바이오매스 중 오직 서브셋(subset)만이 당해 순차적 접종에 사용된 반면, 나머지는 폐기되거나 글리세롤 저장되었다. 특정 런의 각 날자에 OD₇₃₀가 기록되고, 550 ㎕의 분취량을 에탄올 농도 검사를 위해 채집하였다("전" 분취량). 다음으로 세포를 원심분리(상기와 같은)를 통해 수집하여 세척하고 상청액을 버리고, 25ml의 신선한 BG-11 중 전체 펠릿을 보텍싱시켜 재현탁하고 시드 반응기로 복귀하였다. OD₇₃₀을 재기록하고, 다른 분취량을 에탄올 농도 검사("후" 분취량이라 칭함)를 위해 채집하였다. 안정한 에탄올을 생산하는 고립물을 분리시킨 후, 완벽한 동정을 위해 PCR계 검사를 최종 시간에 적용하였다.

와일드 타입(WT) 시네코시스티스 종 PCC 6803 및 기능적인 NADH-산화 타입 II 데하이드로게나제 결여, NDH-2(-) 변이체가 아리조나 주 대학의 윔(Wim F. J. Vermaas)로부터 수득되었다. C600 E. coli를 마노아에 있는 하와이 대학의 몬토 쿠마게(Monto Kumagai) 실험실로부터 수득하였다.

E. coli를 액상 및 고체 배지 모두의 표준 LB 제형에서 배양하였다. 암피실린과 가나마이신을 각각 농도 100 ㎍ml^-1 및 50 ㎍ml^-1로 LB 배지 플레이트에 보충하였다.

모든 시네코시스티스 종 PCC 6803을, (최종 농도) 5mM 글루코스, 5% 수크로스 및/또는 5㎍ ml^-1, 25 ㎍ ml^-1또는 50 ㎍ ml^-1의 가나마이신의 첨가 또는 비첨가된, 표준 BG-11 배지 플레이트 상에서 배양하였다. 시네코시스티스 종 PCC 6803을 함유하는 플레이트를 30℃의 ~100 마이크로아인슈타인 m²s^-1에서 접종하였다. 모든 시네코시스티스 액상 배양을 적당한 시기에 50 ㎍ ml^-1의 가나마이신을 첨가하여, 표준 BG-11에서 성장시켰다.

실시예 3

뱃치 성장 시험

본 실시예는 생산성과 안정성 연구를 위한 뱃치 성장 시험을 예시한다.

병렬 뱃치 배양 시스템(6개의 100mL 바이오반응기)을, 개발된 에탄올-생산 시네코시스티스 종을 성장시키기 위해 설치하였다. 표준 BG-11 액상 배지를 모든 실험에서 사용하였다. 400rpm에서 교반시켰다. 채광 강도는 바이오반응기의 가장 먼(formost) 표면에서 200 마이크로아인슈타인이었다. 압축된 공기를 산포하여 CO₂를 제공하고, 시네코시스티스에 의해 생산된 산소를 제거하였다. 세미 배치 작동 모드가 에탄올 생산을 시험하기 위해 사용되었다. 총 세포 성장 기간은 20일이었다. 시드 배양을 플레이트에서 개시하였다. 시드 배양에서 기하급수적으로 성장하는 세포를 OD₇₃₀=0.025에서 반응기 내로 접종시켰다. 뱃치 배양을 약 4일 동안 수행하고, 다음으로 종결시켰다. 세포를 원심분리시키고, 감소된 용적 내 재현탁하고, 분취량을 신선한 배지를 갖는 바이오반응기에 접종하는 데 사용하였다.

실시예 4

에탄올 농도 검사

본 실시예는 액상 배양 중 에탄올 농도의 측정을 예시한다.

액상 배양 중 에탄올 농도를 측정하기 위해, 배양액 중 550㎕의 분취량을 채집하여, 5분 동안 12,100×g에서 회전시키고, 500㎕(또는 기타 적합한 용적)의 상청액을 신선한 1.5ml 튜브에 위치시키고 검사를 시작할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 분광광도계의 선형 범위 및 에탄올 검사의 민감도를 제공하기 위해, 샘플의 희석액(20배 이하)이 가끔 필요하였다. 이러한 경우에, 적합한 용적의 BG-11을 일차로 신선한 1.5ml의 튜브에 첨가하고, 여기에 투명한 상청액의 필요 용적을 첨가하였다. 당해 용액을 에탄올 검사에 직접 사용하였다. -20℃로부터 제거시 및 검 사 시행 직전에, 샘플을 5분 동안 12,100 ×g에서 2회 회전시켜 샘플의 해동을 도왔다.

에탄올 농도 측정에, 베링거 만하임의 r-바이오팜

효소 에탄올 측정 키트가 사용되었다. 요약하면, 당해 검사는 NAD⁺ 코팩터(cofacter)의 인산염-완충된 용액 중 알코올 데하이드로게나제(ADH) 및 알데하이드 데하이드로게나제의 작용을 이용하며, 당해 작용은 에탄올 첨가시 NAD⁺를 NADH로 전환시키는 것이다. NADH의 농도를 340nm(A₃₄₀)에서 광 흡수를 측정하고, 다음으로 이를 에탄올 농도를 측정하는 데 사용한다. 검사는 다음 변형과 함께 설명서에 기재된 바와 같이 실시하였다. 설명서 항목 4 이하에 기술된 바와 같이, 최대 민감도를 위해 최대 샘플 용적(v= 0.5ml)을 검사에 사용하였다. 최종적으로 검사에서 모든 용적(상기 v= 0.5ml를 포함하여)을 4 등분하였다. 이로써 시약을 보존하고 반복이 필요한 경우 샘플의 분취량 용적 대부분을 보유할 수 있다. 따라서, 사용된 샘플 용적은 반응 혼합물 2의 0.75ml 중 v=0.125ml이었으며, 후에 (ADH) 현탁액 3의 12.5 ㎕을 첨가하였다. 당해 보존된 비율 용적 환원은 시행된 검사에서 어떤 영향을 미치지 못하는 것으로 측정되었다. BG-11을 블랭크(blank)로 사용하였다.

실시예 5

독립영양의 광바이오반응기 발효

본 실시예는 독립영양 광바이오반응기 발효을 이용한 에탄올 생산을 예시한 다.

액상 시드 배양액을, 시드 반응기 표면에서 ~200 마이크로아인슈타인 m^-2s^-1의 최대 표면 플럭스(flux)를 갖는 광으로, 배양 진탕기(Innova 4230 benchtop, New Brunswick) 중 24℃에서 성장시키고, 마그네틱 교반 바(bar)를 통해 교반시키고, 압축된 공기를 대략 0.5L/분의 속도로 살포하였다. 일차의 시드 배양액은 표준 100 ml 피렉스^TM 배지 바틀(bottle) 중 총 용적 25ml로 구성되었으며, 살포기 및 오프가스 튜브로서 제공되는 2개의 파스퇴르 피펫을 함유한다. 살포 튜브의 업스트림은 왓트맨

PFTE 0.1 ㎛ 필터이고, 오프가스 튜브는 알루미늄 호일로 느슨하게 닫혀져 있었다. 광바이오반응기 접종에 사용되는 제2 시드 배양액은, 배양 용적이 표준 1L 피렉스^TM 배지 바틀 중 300ml로 구성되고, 살포 피펫이 레벨 C 다공성 분포기(제조원: Ace Glass Inc., 포어 크기 25 내지 50㎛)로 대체된 것을 제외하고는, 제1 시드 배양액과 동일하였다. 사용된 광은 40W 쿨 화이트 형광 튜브이었다. 액상 배지 중 세포 성장은 ThermoSpectronic

Genesys

10-S 분광광도계를 사용하여 730 nm(OD₇₃₀)에서 광학 밀도를 측정함으로써 모니터링하였다. Plastibrand

UltraVette

1.5 ml 1회용 큐벳(cuvette)을 사용하였다.

제1 시드 반응기로부터 기하급수적으로 성장하는 시드 배양액을 제2 시드 반응기에 접종하는 데 사용하고, 다음으로 OD₇₃₀ >0.31로 성장시키고, 독립영양 광바이 오반응기의 접종에 즉시 사용하였다. 접종을 위해, OD₇₃₀으로 하고, 초기 반응기 OD₇₃₀=0.02(총 발효 용적은 3.1L이었다)가 요구되는 시드 배양 용적의 측정에 사용하였다. 당해 측정된 시드 배양 용적의 세포를 원심분리를 통해 채집하고 신선한 BG-11 50ml로 보텍싱하여 재현탁하였다. 당해 50ml 시드로 바이오반응기를 접종시킨 후, 추가의 50ml BG-11을 접종 튜브를 수세하는 데 사용하였다.

7.5 L의 BIOFLO

110 바이오반응기 시스템(제조원: New Brunswick Scientific, 에디슨, 뉴저지주)을 본 실험에서 사용하였다. 7.5 L의 BIOFLO

110 바이오반응기 시스템은 온도, pH 및 용해된 산소 농도(DO) 조정을 위한 조절기를 포함한다. 시네코시스티스 배양 과정을, 인터페이스 보드 PCI-MIO-16E-10 (제조원: National Instruments Corp., 오스틴, 텍사스주)를 구비한 펜티엄

II (233 MHz, 윈도우 98) 컴퓨터를 사용하여 모니터링하고 자동적으로 조절하였다. 데이타 인지 프로그램은 LabVIEW7.1 (제조원: National Instruments Corp., 오스틴, 텍사스주)에서 판독되었다. pH, 교반, 온도 및 DO를 포함하는, BIOFLO

110 바이오반응기 시스템으로부터의 데이타를 컴퓨터 인터페이스 보드를 통해 수득하였다. 6개의 General Electric

26W, F26DBX/SPX41/4P 벌브를 반응기 주위에 정렬시켜, 반응기 표면에 ~1000 마이크로아인슈타인 m^-2s^-1의 최대 표면 플럭스를 생성시켰다. 반응기 온도를 광 시스템 주위의 외부 팬 순환 공기를 통해 발효 중 27 내지 29℃로 유지시켰다. 반응기에 1L/분의 속도로 공기를 살포하고 pH를 8.5의 세트포인트 에서 CO₂ 주입을 통해 조절하고, 교반 회전을 300rpm에서 시행하였다. 오프가스 포트 상의 콘덴서를 열 순환하는 수조(제조원: ClO-K20, Haake, 베를린, 독일)를 통해 8℃로 냉각시켰다. 8시간 마다 샘플링하면서 8일 동안 발효시켰다. 샘플링을 위해, ~15ml를 샘플링 포트를 통해 반응기로부터 채집(채집하는 튜브를 세척하기 위해)하고 버린 후, 제2의 ~15ml 분취량 샘플을 채집하였다. 각 샘플로부터 OD₇₃₀를 기록하고 분취량을 에탄올 농도 검사를 위해 채집하였다. 에탄올 농도는 112 시간의 발효 후에 12mM이었다(도 2). 발효 5일 후에는 에탄올 농도가 13mM이었다(도 2).

본원에 기술된 방법, 공정 및 장치는 현재 바람직한 양태를 대표하는 것으로 예시이며, 본 발명의 범위를 이에 제한하려고 하는 것이 아니다. 당업자는 이에 변화 및 다른 사용을 적용할 수 있으나, 이는 본 발명의 취지 내에 포함되며 본 발명의 범위에 의해 한정된다. 본 발명의 명세서 및 청구항에 사용된 성분, 반응 조건 등의 양을 나타내는 모든 숫자는, 모든 예에서 용어 "약"에 의해 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상반된 언급이 없다면, 본 발명의 명세서 및 청구항에 나타난 수적인 파라미터는 본 발명에 의해 수득하려고 하는 목적하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사값이다. 적어도, 균등론의 적용을 청구항의 범위로 제한하려는 시도가 아닌 것으로, 각각의 수적인 파라미터는 유의한 아라비아숫자(digit) 및 통상적인 대략의 접근 관점에서 해석되어야 한다.

본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 발명에 대해 다 양한 치환이나 변경이 당업자에 의해 이루어질 수 있음이 자명할 것이다.

당업자는 본원에 기술된 본 발명의 양태가 서로 별개로 시행되거나 서로 조합되어 시행될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 각각의 양태의 조합이 본원에 기술된 본 발명의 범위 내에 속한다.

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각 개별 간행물이 참조에 의해 혼입되는 것으로 특별하고 개인적으로 표현된 것과 같이, 상기 모든 특허 및 간행물은 동일한 내용이 참조에 의해 전체가 본원에 혼입된다.

본원에 예시적으로 기술된 본 발명은 임의의 구성 요소의 부존재, 본원에 특별히 기술되지 않은 한정의 부존재 하에 적합하게 실시될 수 있다. 본원에 사용된 용어 및 표현은 발명을 설명하고자 사용된 것으로 제한하고자 사용된 것이 아니며, 당해 용어 및 표현의 사용이, 본원에 나타내고 기술된 특징들의 균등물 또는 이의 일부분을 배제시키려는 의도는 아니다. 다양한 변형이 본 발명의 범위 내에서 가능함이 인정된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 양태 및 선택적 특징에 대해 상세 히 기술하고 있지만, 본원에 기술된 개념의 변형 및 변이가 당업자에 의해 추구될 수 있으며, 당해 변형 및 변이는 본원에 기술된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 해당하는 것으로 인정된다.

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70 75 80 Leu Lys Ile Leu Lys Asp Asn Asn Ser Asp Phe Val Ile Ser Leu Gly 85 90 95 Gly Gly Ser Pro His Asp Cys Ala Lys Ala Ile Ala Leu Val Ala Thr 100 105 110 Asn Gly Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Gly Ile Asp Lys Ser Lys Lys 115 120 125 Pro Ala Leu Pro Leu Met Ser Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr Ala Ser 130 135 140 Glu Met Thr Arg Phe Cys Ile Ile Thr Asp Glu Val Arg His Val Lys 145 150 155 160 Met Ala Ile Val Asp Arg His Val Thr Pro Met Val Ser Val Asn Asp 165 170 175 Pro Leu Leu Met Val Gly Met Pro Lys Gly Leu Thr Ala Ala Thr Gly 180 185 190 Met Asp Ala Leu Thr His Ala Phe Glu Ala Tyr Ser Ser Thr Ala Ala 195 200 205 Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Leu Lys Ala Ala Ser Met Ile Ala 210 215 220 Lys Asn Leu Lys Thr Ala Cys Asp Asn Gly Lys Asp Met Pro Ala Arg 225 230 235 240 Glu Ala Met Ala Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe Asn Asn 245 250 255 Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Met Ala His Gln Leu Gly Gly Tyr 260 265 270 Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Val Leu Leu Pro His Val 275 280 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ggat 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 14 ttggtgattt tgaacttttg cttgc 25 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 15 ttgcaagcga tttcgagata aa 22

Claims

광 반응성 프로모터, 피루베이트 데카복실라제(pdc) 효소를 코딩하는 서열 및 알코올 데하이드로게나제(adh) 효소를 코딩하는 서열을 포함하는, 핵산 구조물(construct).
제1항에 있어서, 광 반응성 프로모터가 psbAII 프로모터인, 핵산 구조물.
제1항에 있어서, pdc 효소 및 adh 효소를 코딩하는 서열이, 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 플라스미드 pLOI295로부터 수득된, 핵산 구조물.
제1항에 있어서, pdc 효소를 코딩하는 서열이, 자이모박터 팔마에(Zymobacter palmae)로부터 수득된, 핵산 구조물.
제1항에 있어서, pdc 효소를 코딩하는 서열이, 자이모박터 팔마에로부터 수득되고, adh 효소를 코딩하는 서열이 자이모모나스 모빌리스로부터 수득되는, 핵산 구조물.
제1항에 있어서, adh 효소를 코딩하는 서열이, 자이모모나스 모빌리스 플라스미드 pLOI295로부터 수득된, 핵산 구조물.
제1항에 있어서, pdc 효소를 코딩하는 서열이, 서열목록 번호 3(SEQ. ID NO: 3)을 포함하거나, pdc를 코딩하며 시아노박테리아에서 발현될 수 있는 유전자 서열을 포함하는, 핵산 구조물.
제1항에 있어서, adh 효소를 코딩하는 서열이, 서열목록 번호 4(SEQ. ID NO: 4)를 포함하거나, adh를 코딩하며 시아노박테리아에서 발현될 수 있는 유전자 서열을 포함하는, 핵산 구조물.
제1항에 있어서, pdc 효소를 코딩하는 서열이, 서열목록 번호 8(SEQ. ID NO: 8)로 표시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 구조물.
제1항에 따른 핵산 구조물을 포함하는 발현 벡터.
제10항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제11항에 있어서, 발현 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 통합된, 숙주 세포.
제11항에 있어서, 발현 벡터가 pMota인, 숙주 세포.
제11항에 있어서, 세포가 시아노박테리움인, 숙주 세포.
제14항에 있어서, 시아노박테리움이 시네코시스티스(Synechocystis)인, 숙주 세포.
제15항에 있어서, 시아노박테리움이 시네코시스티스 종(Synechocystis sp .) PCC 6803이거나, 시네코시스티스의 기타 형질전환가능한 종인, 숙주 세포.
제16항에 있어서, 시아노박테리움이 시네코시스티스 종 PCC 6803의 와일드-타입(wild-type)이거나, NDH-2(-) 변이 종인, 숙주 세포.
제14항에 있어서, 시아노박테리움이 시네코코커스(Synechococcus) PCC 7942이거나, 시네코코커스의 기타 형질전환가능한 종인, 숙주 세포.
제14항에 있어서, 숙주 세포가, 광 노출의 기간 후에 상대적으로 정량할 수 있는 양의 에탄올을 생산할 수 있는, 숙주 세포.
제19항에 있어서, 숙주 세포가 5일 발효 후에 약 10 mM 초과 에탄올의 회수가능한 양으로 에탄올을 생산할 수 있는, 숙주 세포.
제19항에 있어서, 숙주 세포가 5일 발효 후에 약 13mM 에탄올의 회수가능한 양으로 에탄올을 생산할 수 있는, 숙주 세포.
시아노박테리움이, 피루베이트 데카복실라제(pdc) 및 알코올 데하이드로게나제(adh) 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 구조물을 포함하며, 5일 발효 후에 약 10mM 초과의 회수가능한 양의 에탄올을 생산할 수 있음을 특징으로 하는, 유전자 조작된 시아노박테리움.
제22항에 있어서, pdc 효소 및 adh 효소를 코딩하는 핵산 서열이, 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 플라스미드 pLOI295로부터 수득된, 시아노박테리움.
제22항에 있어서, pdc 효소를 코딩하는 핵산 서열이, 자이모박터 팔마에(Zymobacter palmae)로부터 수득된, 시아노박테리움.
제22항에 있어서, pdc 효소를 코딩하는 핵산 서열이, 자이모박터 팔마에로부터 수득되고, adh 효소를 코딩하는 핵산 서열이 자이모모나스 모빌리스로부터 수득되는, 시아노박테리움.
제25항에 있어서, adh 효소를 코딩하는 핵산 서열이, 자이모모나스 모빌리스 플라스미드 pLOI295로부터 수득된, 시아노박테리움.
제22항에 있어서, 시아노박테리움이 시네코시스티스인, 시아노박테리움.
제27항에 있어서, 시아노박테리움이 시네코시스티스 종(Synechocystis sp .) PCC 6803이거나, 시네코시스티스의 기타 형질전환가능한 종인, 시아노박테리움.
제28항에 있어서, 시네코시스티스 종 PCC 6803이 와일드-타입이거나, NDH-2(-) 변이 시네코시스티스 종 PCC 6803 종인, 시아노박테리움.
제22항에 있어서, pdc 효소를 코딩하는 핵산 서열이, 서열목록 번호 3(SEQ. ID NO: 3)을 포함하거나, pdc를 코딩하며 시아노박테리움에서 발현될 수 있는 유전자 서열을 포함하는, 시아노박테리움.
제22항에 있어서, 핵산 서열이, 서열목록 번호 8(SEQ. ID NO: 8)을 포함하는 pdc 효소를 코딩하는 서열인, 시아노박테리움.
제22항에 있어서, adh 효소를 코딩하는 핵산 서열이, 서열목록 번호 4(SEQ. ID NO: 4)를 포함하는, 시아노박테리움.
제22항에 있어서, 구조물이 광 유도성 유전자를 함유하는, 시아노박테리움.
제22항에 있어서, 구조물이 psbAII 프로모터를 함유하는, 시아노박테리움.
제22항에 있어서, 구조물이 pMota인, 시아노박테리움.
자이모모나스 모빌리스 pL0I295 플라스미드로부터 수득된 pdc 및 adh 효소를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 구조물을 함유하는 시아노박테리아를, 배양 배지 중에서 배양시키는 단계, 및 5일 발효 후 약 10mM 초과의 에탄올 양으로 배양 배지 중 에탄올을 축적시키는 단계를 포함하는, 에탄올 생산 방법.
제36항에 있어서, 시아노박테리아가, 5일 발효 후 약 13mM 에탄올의 회수가능한 양으로 에탄올을 생산할 수 있는, 방법.
제36항에 있어서, 배양 배지 중 에탄올 농도가, 배양 약 5일 후에 약 5mM 이상인 방법.
제36항에 있어서, 배양 배지 중 에탄올 농도가, 배양 약 5일 후에 약 13mM 이상인 방법.
제36항에 있어서, 시아노박테리아가 시네코시스티스이고, 구조물이 pMota인, 방법.
제36항에 있어서, 구조물이, 광 반응성 유전자를 포함하는 DNA 단편을 추가로 포함하는, 방법.
제36항에 있어서, 구조물이 시아노박테리아 염색체 내로 통합된, 방법.