ES2343776A1 - Procedimientos y composiciones para cianobacterias productoras de etanol. - Google Patents
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Abstract
Procedimientos y composiciones para cianobacterias productoras de etanol. La presente invención se refiere a procedimientos y sistemas para la producción de etanol mediante cianobacterias. Más específicamente, los procedimientos se pueden usar para producir etanol usando cianobacterias genéticamente modificadas que responden a la luz.
Description
Procedimientos y composiciones para
cianobacterias productoras de etanol.
Esta solicitud reivindica las ventajas de la
Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos con el Nº de
Serie 60/758.683, presentada el 13 de enero de 2006, cuya
descripción se incorpora como referencia en su totalidad.
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La sociedad y la industria aceptan rápidamente
el desarrollo de energías renovables para cumplir los objetivos de
aumento de energía y de reducción de emisiones. Desde la revolución
industrial, la economía mundial se ha basado en gran medida en
combustibles fósiles como fuentes de energía. La dependencia de
estas fuentes de energía ha creado varios problemas que suponen un
reto, tales como la reducción del suministro de recursos de
combustibles fósiles, la contaminación ambiental y el efecto de
calentamiento global consiguiente. Una alternativa a los
combustibles fósiles es el etanol. Actualmente, la producción
mundial de etanol a partir de cultivos de azúcar es del 60%, a
partir de otros cultivos es del 33% y a partir de síntesis química
es del 7%. Los procesos de producción de etanol a partir de biomasa
tradicionales requieren grandes cantidades de tierras arables y la
necesidad de aportar energía para el crecimiento de la materia
prima. Además, los procedimientos de fermentación tradicionales
liberan cantidades considerables de CO_{2} como subproducto del
proceso de fermentación. Por ejemplo, una planta de etanol de
biomasa de 40 MMGY (millones de galones por año) puede liberar
121.000 toneladas de CO_{2} cada año al medio ambiente (BBI,
2003). Este gas invernadero empeorará el efecto de calentamiento
global.
El bioetanol ha entrado recientemente en la
vanguardia de la tecnología de combustibles renovables. Proporciona
una alternativa viable a los combustibles basados en petróleo,
ofreciendo un control tanto sobre los procesos de producción como
sobre los procesos de consumo. Además, el etanol derivado de
sistemas biológicos es particularmente atractivo porque puede
integrarse fácilmente en numerosas infraestructuras existentes;
considerando tanto la industria de producción como la industria de
combustibles. Se han investigado diversos procedimientos para la
producción de etanol por organismos vivos. La producción de etanol
por microorganismos, en gran parte, se ha investigado usando la
levadura Saccharomices cerevisiae y la bacteria etanogénica
obligada Zymomonas mobilis. Estos dos microorganismos
contienen la información genética para producir las enzimas piruvato
descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh), que se usan
para producir etanol a partir de piruvato, un producto de la ruta
glicolítica. Woods y col. (Patentes de Estados Unidos Nº 6.306.639 y
6.699.696; véase también Deng y Coleman, "Ethanol Synthesis by
Genetic Engineering in Cyanobacteria" Applied and
Environmental Microbiology (1999) 65(2):
523-428) describen una bacteria modificada
genéticamente útil para la producción de etanol. Woods y col. hablan
de un nivel de producción de etanol de 5 mM después de 30 días de
cultivo.
Por lo tanto, es deseable encontrar un sistema
biológico sencillo, eficaz y barato para producir cantidades
sustanciales de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Las tecnologías mencionadas anteriormente tienen
varios defectos. Por ejemplo, los sistemas descritos por Woods y
col. tienen el inconveniente de bajos niveles de producción de
etanol, largos tiempos de fermentación e inestabilidad.
En algunas realizaciones, lo que se necesita es
un sistema sencillo, eficaz y barato para producir cantidades
sustanciales de etanol. La presente invención se refiere a
procedimientos, composiciones, células huésped y vectores para la
optimización de la producción de etanol y tolerancia de una célula
huésped a concentraciones de etanol económicamente relevantes.
De acuerdo con algunas realizaciones de la
presente invención, se describe una construcción de ácido nucleico.
La secuencia de ácido nucleico comprende: un promotor con respuesta
a la luz, una secuencia que codifica una enzima piruvato
descarboxilasa (pdc) y una secuencia que codifica una enzima alcohol
deshidrogenasa (adh).
De acuerdo con algunas realizaciones de la
presente invención se describe un vector de expresión. El vector de
expresión comprende un ácido nucleico que comprende un promotor con
respuesta a la luz, una secuencia que codifica una enzima piruvato
descarboxilasa (pdc) y una secuencia que codifica una enzima alcohol
deshidrogenasa (adh).
De acuerdo con algunas realizaciones de la
presente invención se describe una célula huésped. La célula huésped
comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que
comprende un promotor con respuesta a la luz, una secuencia que
codifica una enzima piruvato descarboxilasa (pdc) y una secuencia
que codifica una enzima alcohol deshidrogenasa (adh).
De acuerdo con algunas realizaciones de la
presente invención, se describe una cianobacteria obtenida por
ingeniería genética. La cianobacteria comprende una construcción que
comprende secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas
piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh), donde
la cianobacteria es capaz de producir etanol en cantidades
recuperables mayores de aproximadamente una concentración 10 mM de
etanol después de una fermentación de 5 días.
De acuerdo con algunas realizaciones de la
presente invención, se describe un procedimiento para producir
etanol. El procedimiento comprende: cultivar en un medio de cultivo
cianobacterias, conteniendo las cianobacterias una construcción que
comprende fragmentos de ADN que codifican enzimas pdc y adh
obtenidas a partir del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis;
y acumular etanol en el medio de cultivo en una cantidad mayor de
aproximadamente una concentración 10 mM de etanol después de una
fermentación de 5 días.
La Fig. 1 muestra el mapa de las construcciones
plasmídicas (a) pPSBAIIKS y (b) pLOI295 usadas para crear pMota.
La Fig. 2 muestra la concentración de etanol
frente al tiempo en el Reactor BIOFLO®. La concentración de etanol
llegó a un valor de 13 mM después de cinco días de fermentación. El
control es Synechocystis no transformado (de tipo
silvestre).
Aunque a continuación se describirá la materia
objeto de esta solicitud con detalle haciendo referencia a las
figuras, esto se hace en relación con las realizaciones
ilustrativas. Se entiende que pueden realizarse cambios y
modificaciones en las realizaciones descritas sin apartarse del
verdadero alcance y espíritu de la presente invención como se
define, en parte, por las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la
presente invención se describen secuencias de ácido nucleico,
vectores, células huésped y procedimientos para la producción de
altos niveles de etanol por cianobacterias.
La producción de etanol a partir de
cianobacterias usando luz solar, CO_{2} y nutrientes inorgánicos
(posiblemente obtenidos a partir de una corriente de agua residual)
es una forma atractiva para obtener un combustible renovable. Por
medio de la combinación de la ruta de fijación de carbono y de
generación de etanol en un solo organismo, se evitan los costes
asociados con el cultivo/recolección/procesamiento de las plantas,
se reduce el aporte de energía total y se incrementa el aumento neto
de energía. A diferencia de lo que ocurre con los procesos de
producción de etanol a partir de biomasa, los procedimientos
descritos utilizarán directamente grandes cantidades de CO_{2}
como fuente de carbono para la producción de combustible y de esta
manera ayudarán a reducir este gas invernadero de la atmósfera.
Hay numerosas ventajas en la producción de
etanol usando microorganismos fotosintéticos tales como
Synechocystis, incluyendo: oportunidades económicas para la
producción de biocombustible, impactos positivos para el medio
ambiente, reducción en el calentamiento global y mejora de la
seguridad alimentaria. Los presentes procedimientos para producir
etanol a partir de energía solar y CO_{2} usando cianobacterias
ofrecen ahorros significativos tanto en el coste de capital como en
el coste de operación, en comparación con las instalaciones de
producción de etanol basadas en biomasa. La reducción del gasto se
consigue por factores tales como: simplificación de los procesos de
producción, ausencia de cultivos agrícolas y residuos, ausencia de
residuos sólidos que necesitan tratarse, no se necesitan enzimas,
etc. La fermentación por cianobacterias no implica la hemicelulosa o
celulosa dura, que es difícil de tratar. Como resultado, no habrá
emisiones de contaminantes perjudiciales al aire y compuestos
orgánicos volátiles procedentes de las plantas de producción de
etanol por cianobacterias.
En comparación con los procedimientos
tradicionales para la producción de etanol a partir de biomasa, los
procedimientos y sistemas descritos ayudarán a conservar el espacio
agrícola para la producción de alimentos. Además, las plantas de
producción de etanol por cianobacterias pueden distribuirse
ampliamente sin límites geográficos porque no requieren el
transporte del grano a ciertas localizaciones ni el pretratamiento
del material de partida. Se prevé que la infraestructura y el equipo
necesarios para la producción de etanol usando los sistemas
descritos en el presente documento sean significativamente menores
que los necesarios para la tecnología actual de fermentación con
levaduras, permitiendo una integración sin problemas con las
plataformas de transporte y distribución de combustible.
El producto inicial de la fijación fotosintética
de dióxido de carbono es 3-fosfoglicerato. El
3-fosfoglicerato se usa en el Ciclo de Calvin para
regenerar ribulosa-1,5-bifosfato,
que es el aceptor de dióxido de carbono. Hay dos puntos de
ramificación principales en los que los intermedios del Ciclo de
Calvin están conectados a otras rutas metabólicas. En un punto, la
fructosa-6-fosfato se convierte en
glucosa-6-fosfato y
glucosa-fosfato, que son los sustratos de la ruta de
la pentosa fosfato, la síntesis de celulosa (un componente principal
de la pared celular) y la síntesis de glucógeno (la forma principal
de reserva de los carbohidratos). En el otro punto de ramificación,
el 3-fosfoglicerato se convierte en
2-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato y piruvato en
una secuencia de reacciones catalizadas por la fosfoglicerato
mutasa, la enolasa y la piruvato quinasa, respectivamente. El
piruvato se dirige al ciclo parcial TCA para la síntesis de
aminoácidos, nucleótidos, etc. en condiciones aerobias. El piruvato
también es el sustrato para la síntesis de etanol.
Para convertir las reservas de carbohidratos en
etanol, las reservas de carbohidratos pueden desviarse a la ruta
glicolítica. La supuesta ruta para el metabolismo de reservas de
carbohidratos en cianobacterias es a través de la ruta glicolítica y
la ruta de fosfogluconato. Para la formación de etanol, tiene mayor
importancia la ruta glicolítica. Aunque no está bien caracterizado
en cianobacterias, se supone que el glucógeno se metaboliza para dar
glucosa-1-fosfato por una
combinación de glucógeno fosforilasa y una
1,6-glicosidasa. La fosfoglucomutasa,
fosfoglucoisomerasa y fosfofructoquinasa convierten glucosa
1-fosfato en una molécula de fructosa
1,6-bisfosfato. Este compuesto se escinde por la
acción de la aldosa y triosa fosfato isomerasa en dos moléculas de
gliceraldehído 3-fosfato. Este compuesto se
convierte en piruvato por medio de una serie secuencial de
reacciones catalizadas por la gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa, fosfoglicerato quinasa,
fosfoglicerato mutasa, enolasa y piruvato quinasa,
respectivamente.
En algunas algas y cepas de cianobacterias, se
sintetiza una pequeña cantidad de etanol como producto de
fermentación en condiciones de oscuridad y anaerobias (Van der Oost
y col., "Nucleotide sequence of the gene proposed to encode the
small subunit of the soluble hydrogenase of the thermophilic
unicellular cyanobacterium Synechococcus PCC 6716".
Nucleic Acids Res. 11 de diciembre de 1989; 17 (23): 10098,
incorporado en el presente documento como referencia en su
totalidad). Sin embargo, el proceso de fermentación anaerobio en
condiciones de oscuridad generalmente se produce a un nivel muy
bajo, sólo suficiente para la supervivencia de los organismos en
estas condiciones de estrés. La síntesis de etanol en condiciones de
oscuridad y anaerobias depende de la degradación de las reservas de
glucógeno, como se ha descrito anteriormente. Además, se ha
descubierto que la síntesis de etanol en condiciones anaerobias se
inhibe totalmente por la luz. De esta manera, en microorganismos
fotosintéticos, la síntesis de etanol no está acoplada con la
fotosíntesis y realmente puede inhibirse por la fotosíntesis.
Por lo tanto, se ha observado que las
cianobacterias no utilizan dióxido de carbono para producir etanol.
Además, no hay microorganismos fotosintéticos conocidos, incluyendo
microorganismos fotosintéticos modificados por ingeniería genética,
que produzcan etanol en cantidades relativamente sustanciales. Otra
complicación es que se ha demostrado que algunos organismos
fotosintéticos se inhiben por etanol de tal forma que la adición de
etanol al medio de cultivo inhibe la expresión de genes implicados
en la fotosíntesis.
En la presente invención, se ha descubierto que
las cianobacterias pueden modificarse por ingeniería genética
satisfactoriamente para producir una cantidad cuantificable de
etanol en lugar de utilizar una reserva de glucógeno como se hace en
condiciones anaerobias y de oscuridad. El carbono inorgánico se
asimila y se usa tanto para el crecimiento celular como para la
producción de etanol por medio de la inserción de la ruta metabólica
de generación de etanol que consta de las dos enzimas mencionadas
anteriormente: pdc y adh.
A menos que se definan de otra manera, todos los
términos y expresiones técnicas y científicas usadas en el presente
documento tienen el significado entendido comúnmente por un
especialista en la técnica a la que pertenece esta invención. Como
se usa en el presente documento, los siguientes términos tienen los
significados que se les atribuyen, a menos que se especifique otra
cosa.
"Piruvato descarboxilasa" y "pdc" se
refieren a una enzima que cataliza la descarboxilación de ácido
pirúvico para dar acetaldehído y dióxido de carbono. Un "gen de
pdc" se refiere al gen que codifica una enzima que cataliza la
descarboxilación de ácido pirúvico para dar acetaldehído y dióxido
de carbono. "Alcohol deshidrogenasa" y "adh" se refieren a
una enzima que facilita la interconversión entre alcoholes y
aldehidos o cetonas. Un "gen de adh" se refiere al gen que
codifica una enzima que facilita la interconversión entre alcoholes
y aldehídos o cetonas. "pdc/adh" se refiere a las enzimas pdc y
adh colectivamente. Un "casete de pdc/adh" se refiere a una
secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima pdc y una enzima
adh.
Un "promotor" es una serie de secuencias de
control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un
polinucleótido asociado, que puede ser un polinucleótido heterólogo
o nativo. Un promotor incluye secuencias de ácido nucleico cerca del
sitio de inicio de la transcripción, tal como un sitio de unión a
polimerasa. El promotor también incluye opcionalmente elementos
potenciadores o represores distales que pueden localizarse a una
distancia de hasta varios miles de pares de bases del sitio de
inicio de la transcripción.
Un "promotor con respuesta a la luz" se
refiere a un promotor que responde a la luz.
"Polinucleótido" y "ácido nucleico" se
refieren a un polímero compuesto de unidades nucleotídicas
(ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, variantes estructurales
naturales relacionadas y análogos no naturales sintéticos de los
mismos) unidas a través de enlaces fosfodiéster, variantes
estructurales naturales relacionadas y análogos no naturales
sintéticos de los mismos. De esta manera, el término incluye
polímeros nucleotídicos en los que los nucleótidos y los enlaces
entre ellos incluyen análogos sintéticos no naturales. Se entenderá
que, cuando lo requiere el contexto, cuando una secuencia de
nucleótidos se representa por una secuencia de ADN (es decir, A, T,
G, C), esto también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G,
C), en la que "U" reemplaza a "T".
"Recombinante" se refiere a polinucleótidos
sintetizados o manipulados de otra manera in vitro
("polinucleótidos recombinantes") y a procedimientos de uso de
polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos
codificados por esos polinucleótidos en las células u otros sistemas
biológicos. Por ejemplo, un polinucleótido clonado puede insertarse
en un vector de expresión adecuado, tal como un plásmido bacteriano,
y el plásmido puede usarse para transformar una célula huésped
adecuada. Una célula huésped que comprende el polinucleótido
recombinante se conoce como "célula huésped recombinante" o
"bacteria recombinante". El gen después se expresa en la célula
huésped recombinante para producir, por ejemplo, una "proteína
recombinante". Un polinucleótido recombinante también puede tener
una función no codificante (por ejemplo, promotor, origen de
replicación, sitio de unión a ribosomas, etc.).
La expresión "recombinación homologa" se
refiere al proceso de recombinación entre dos moléculas de ácido
nucleico basado en la similitud de las secuencias de ácido nucleico.
La expresión incluye tanto recombinación recíproca como
recombinación no recíproca (también denominada conversión génica).
Además, la recombinación puede ser el resultado de sucesos cruzados
equivalentes o no equivalentes. Se produce un entrecruzamiento
equivalente entre dos secuencias o regiones cromosómicas
equivalentes, mientras que se produce un entrecruzamiento no
equivalente entre segmentos idénticos (o sustancialmente idénticos)
de secuencias o regiones cromosómicas no equivalentes. El
entrecruzamiento desigual típicamente produce duplicaciones génicas
y deleciones. Como descripción de las enzimas y mecanismos
implicados en la recombinación homologa véase Watson y col.,
Molecular Biology of the Gene páginas 313-327, The
Benjamin/Cummings Publishing Co. 4ª ed. (1987).
La expresión "integración no homologa o
aleatoria" se refiere a cualquier proceso por medio del cual el
ADN se integra en el genoma que no implica recombinación homologa.
Parece ser un proceso aleatorio en el que la incorporación puede
producirse en cualquiera de un gran número de localizaciones
genómicas.
Una "secuencia polinucleotídica heteróloga"
o un "ácido nucleico heterólogo" es una expresión relativa que
se refiere a un polinucleótido que está relacionado funcionalmente
con otro polinucleótido, tal como una secuencia promotora, de tal
manera que las dos secuencias polinucleotídicas no se dispongan en
la misma relación entre sí que en la naturaleza. Las secuencias
polinucleotídicas heterólogas incluyen, por ejemplo, un promotor
unido de manera funcional a un ácido nucleico heterólogo, y un
polinucleótido incluyendo su promotor nativo que está insertado en
un vector heterólogo para la transformación de una célula huésped
recombinante. Las secuencias polinucleotídicas heterólogas se
consideran "exógenas" porque se introducen en la célula huésped
por técnicas de transformación. Sin embargo, el polinucleótido
heterólogo puede proceder de una fuente extraña o de la misma
fuente. Puede producirse una modificación de la secuencia
polinucleotídica heteróloga, por ejemplo, por medio del tratamiento
del polinucleótido con una enzima de restricción para generar una
secuencia polinucleotídica que pueda unirse de forma funcional a un
elemento regulador. La modificación también puede realizarse por
técnicas tales como mutagénesis dirigida.
La expresión "expresado de forma endógena"
se refiere a polinucleótidos que son nativos para la célula huésped
y se expresan de manera natural en la célula huésped.
Un "casete de expresión" o
"construcción" se refiere a una serie de elementos
polinucleotídicos que permiten la transcripción de un gen en una
célula huésped. Típicamente, el casete de expresión incluye un
promotor y una secuencia polinucleotídica heteróloga o nativa que se
transcribe. Los casetes o construcciones de expresión también pueden
incluir, por ejemplo, señales de terminación de la transcripción,
señales de poliadenilación y elementos potenciadores.
La expresión "unido de manera funcional" se
refiere a una relación funcional entre dos partes donde la actividad
de una parte (por ejemplo, la capacidad de regular la transcripción)
tiene como resultado la acción sobre la otra parte (por ejemplo,
transcripción de la secuencia). De esta manera, un polinucleótido
está "unido de manera funcional a un promotor" cuando hay una
asociación funcional entre una secuencia de control de la expresión
del polinucleótido (tal como un promotor u otras secuencias de
regulación de la transcripción) y una segunda secuencia
polinucleotídica (por ejemplo, un polinucleótido nativo o
heterólogo), donde la secuencia de control de la expresión dirige la
transcripción del polinucleótido.
"Competente para expresar" se refiere a una
célula huésped que proporciona un entorno celular suficiente para la
expresión de polinucleótidos endógenos y/o exógenos.
Todos los números que expresan cantidades de
ingredientes, condiciones de reacción y similares usados en la
memoria descriptiva y en las reivindicaciones deben considerarse
modificados en todos los casos por el término
"aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo
contrario, los parámetros numéricos indicados en la memoria
descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones
que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se
pretenden obtener por la presente invención. Como mínimo, y sin
intención de limitar la aplicación de la doctrina de equivalentes al
alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe
considerarse teniendo en cuenta el número de dígitos significativos
y las aproximaciones de redondeo habituales.
De acuerdo con algunas realizaciones de la
presente invención se describen ácidos nucleicos y vectores de
expresión recombinantes para la optimización de la producción de
etanol. La Figura 1 muestra una realización de un sistema, descrito
con más detalle en el Ejemplo 1 presentado más adelante, que puede
usarse para realizar una diversidad de métodos o procedimientos. La
secuencia del vector de expresión recombinante pMota para la
optimización de la producción de etanol se muestra en la SEC ID Nº:
1. El vector pMota contiene las secuencias para el promotor psbAII
de Synechocystis en una secuencia de ácido nucleico de región
cadena arriba homóloga de 500 pares de bases (SEC ID Nº: 2), la
secuencia de ácido nucleico que codifica la pdc de Zymomonas
mobilis procedente de PLOI295 (SEC ID Nº: 3) y la secuencia de
ácido nucleico que codifica la adhII de Zymomonas mobilis
procedente de PLOI295 (SEC ID Nº: 4). El vector pMota se creó por
subclonación del casete de pdc/adh a partir de PLOI295 (Figura Ib)
en el plásmido pPSB AIIKS (Figura Ia). El vector pMota se usó para
integrar estos genes bajo el control del promotor con respuesta a la
luz psbAII en el genoma cianobacteriano.
Un vector de expresión recombinante para la
transformación de una célula huésped y la posterior integración del
gen o genes de interés se prepara aislando primero las secuencias
polinucleotídicas constituyentes, como se describe en el presente
documento. En algunas realizaciones, el gen o genes de interés se
integran de forma homologa en el genoma de la célula huésped. En
otras realizaciones, los genes se integran de forma no homologa en
el genoma de la célula huésped. Preferiblemente, el gen o genes de
interés se integran de forma homologa en el genoma de
Synechocystis. En algunas realizaciones, el vector pMota se
integra en el locus psbAII por medio de una recombinación homologa
doble. Después se ligan las secuencias polinucleotídicas, por
ejemplo, una secuencia que codifica las enzimas pdc/adh dirigida por
un promotor para crear un vector de expresión recombinante, también
denominado "construcción de pdc/adh", adecuado para la
transformación de una célula huésped. Los procedimientos para el
aislamiento y preparación de polinucleótidos recombinantes son bien
conocidos para los especialistas en la técnica. Sambrook y col.,
Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2ª ed. 1989); Ausubel y
col., Current Protocols in Molecular Biology (1995)) proporcionan
información suficiente para indicar a personas de experiencia como
realizar muchos ejercicios de clonación.
Un procedimiento preferido para obtener
polinucleótidos específicos combina el uso de cebadores
oligonucleotídicos sintéticos con extensión con polimerasa o
ligamiento en una plantilla de ARNm o ADN. Este procedimiento, por
ejemplo, RT, PCR o LCR, amplifica la secuencia de nucleótidos
deseada (véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195 y
4.683.202). En los cebadores pueden incorporarse sitios de
endonucleasas de restricción. Los polinucleótidos amplificados se
purifican y se ligan para formar un casete de expresión. Pueden
introducirse alteraciones en la secuencia del gen natural por
técnicas tales como mutagénesis in vitro y PCR usando
cebadores que se han diseñado para incorporar mutaciones apropiadas.
Otro procedimiento preferido para aislar secuencias
polinucleotídicas usa sitios de endonucleasas de restricción
conocidos para aislar fragmentos de ácido nucleico a partir de
plásmidos. Los genes de interés también pueden aislarse por un
especialista en la técnica usando cebadores basados en secuencias de
genes conocidas.
Los promotores adecuados para la presente
invención incluyen cualquier promotor con respuesta a la luz
adecuado tal como, por ejemplo, el promotor psbAII y el promotor
nirA. En algunas realizaciones, el promotor es el promotor psbAII
nativo in situ que, en células Synechocystis sp. PCC
6803 de tipo silvestre, media la transcripción del gen psbAII que
codifica la subunidad D1 del fotosistema II. El promotor con
respuesta a la luz psbAII se localiza inmediatamente cadena arriba
del gen psbAII endógeno en Synechocystis sp PCC 6803. En
algunas realizaciones, el promotor es el promotor nirA, que es una
secuencia de promotor de Synechococcus sp. cepa PCC7942 de
166 pares de bases descrito por Qi y col. (2005) en el desarrollo de
un vector de expresión inducible para Synechocystis sp. PCC
6803.
En algunas realizaciones, el promotor comprende
la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID Nº: 2, que
contiene el promotor psbAII. En algunas realizaciones, el promotor
comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID Nº:
5. En otras realizaciones, el promotor comprende la secuencia
promotora nirA de Synechococcus mostrada en la SEC ID Nº: 6.
En la SEC ID Nº: 6, el triplete TCC en el extremo 3' del promotor
nirA de tipo silvestre se reemplazó por la secuencia CAT para
generar un sitio de restricción NdeI en el codón de iniciación
mientras se mantenía la integridad espacial de la construcción
promotor/ORF. Esto permite la creación de un sistema en el que el
gen o genes de interés pueden expresarse por medio de la inducción
por adición de nitrato al medio de cultivo. Como fuente de nitrógeno
para el crecimiento antes de la inducción puede usarse amoniaco. (Qi
y col., 2005). En algunas realizaciones, se usa una región cadena
arriba homologa de 500 pares de bases que contiene el promotor
psbAII que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 2 para
construir el vector de expresión recombinante. La homología de 500
pares de bases dirige el vector para la integración en el locus
psbAII a través de una recombinación homologa doble.
En la presente invención puede usarse cualquier
gen de pdc capaz de expresarse. En algunas realizaciones, el gen de
pdc es el gen de pdc de Zymomonas mobilis. En algunas
realizaciones, el gen de pdc se obtiene a partir del plásmido
PLOI295 de Zymomonas mobilis. En algunas realizaciones, el
gen de pdc comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en la
SEC ID Nº: 3. En algunas realizaciones, el gen de pdc es una
secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína mostrada en la
SEC ID Nº: 7. En otras realizaciones, el gen de pdc es un ácido
nucleico que codifica la enzima pdc obtenida a partir de
Zymobacter palmae. El número de acceso NCBI para la secuencia
de la proteína pdc completa a partir de Zymobacter palmae es
AF474145 (SEC ID Nº: 8). En algunas realizaciones, el gen de pdc es
una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 8. Hay otras fuentes de
enzimas pdc y adh, incluyendo Saccharomyces cerevisiae.
En la presente invención puede usarse cualquier
gen de adh capaz de expresarse. En algunas realizaciones, el gen de
adh es el gen de adh de Zymomonas mobilis. En algunas
realizaciones, el gen de adh se obtiene a partir del plásmido
pLOI295 de Zymomonas mobilis. En algunas realizaciones, el
gen de adh comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en la
SEC ID Nº: 4. En algunas realizaciones, el gen de pdc es una
secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID Nº: 9.
La secuencia polinucleotídica aislada elegida,
por ejemplo, los genes de pdc/adh dirigidos por la secuencia
promotora descrita anteriormente, se inserta en un "vector de
expresión", "vector de clonación" o "vector",
expresiones que normalmente hacen referencia a plásmidos u otras
moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula
huésped elegida. Los vectores de expresión pueden replicarse de
forma autónoma o pueden replicarse insertándose en el genoma de la
célula huésped.
A menudo, es deseable que un vector se pueda
utilizar en más de una célula huésped, por ejemplo, en E.
coli para la clonación y construcción y, por ejemplo, en
Synechocystis para la expresión. Otros elementos del vector
pueden incluir, por ejemplo, marcadores de selección, por ejemplo,
resistencia a kanamicina o resistencia a amplicilina, que permiten
la detección y/o selección de las células transformadas con las
secuencias polinucleotídicas deseadas.
El vector particular usado para transportar la
información genética a la célula tampoco es particularmente crítico.
Puede usarse cualquier vector adecuado usado para la expresión de
proteínas recombinantes. En realizaciones preferidas, se usa un
vector que es capaz de insertarse en el genoma de la célula huésped.
En algunas realizaciones, el vectores pSBAIIKS, creado y descrito
por Lagarde y col. (2000). Los vectores de expresión típicamente
tienen un casete de expresión que contiene todos los elementos
necesarios para la expresión del polinucleótido elegido en una
célula huésped. Un casete de expresión típico contiene un promotor
unido de forma funcional a la secuencia polinucleotídica elegida. El
promotor usado para dirigir la expresión de pdc/adh es como se ha
descrito anteriormente, y está unido de forma funcional a una
secuencia que codifica las proteínas pdc/adh. El promotor se coloca
preferiblemente aproximadamente a la misma distancia del sitio de
inicio de la transcripción heterólogo que al sitio de inicio de la
transcripción en su situación natural. Sin embargo, como es conocido
en la técnica, pueden acomodarse algunas variaciones en esta
distancia sin pérdida de la función del promotor.
Además de los genes de pdc/adh, el vector de
expresión para la optimización de la producción de etanol puede
incluir genes para la tolerancia de una célula huésped a
concentraciones de etanol económicamente relevantes. Por ejemplo, en
el vector de expresión pueden incluirse genes tales como omrA, ImrA
y ImrCD. Se ha demostrado que omrA procedente de la bacteria de
ácido láctico del vino Oenococcus oeni y su homólogo LmrA
procedente de Lactococcus lactis aumentan la resistencia
relativa de E. Coli tolC(-) de 100 a 10.000 veces.
(Bourdineaud y col., 2004). Por lo tanto, puede ser beneficioso
incorporar ormA, ImrA y otros homólogos para aumentar la tolerancia
al etanol de una célula huésped. En algunas realizaciones, el vector
de expresión que comprende los genes de pdc/adh comprende además el
gen omrA. En otras realizaciones, el vector de expresión que
comprende los genes de pdc/adh comprende además el gen ImrA. En
otras realizaciones, el vector de expresión que comprende los genes
de pdc/adh comprende además el gen ImrCD. Para dirigir los genes
para la tolerancia de una célula huésped puede usarse cualquier
promotor adecuado para dirigir la expresión de un gen heterólogo en
una célula huésped, incluyendo los usados típicamente en los casetes
de expresión convencionales.
Después de la construcción y aislamiento del
vector de expresión recombinante, éste se usa para transformar una
célula huésped para la producción de etanol. El procedimiento
particular usado para introducir el material genético en la célula
huésped para la expresión de una proteína no es particularmente
crítico. Puede usarse cualquiera de los procedimientos bien
conocidos para introducir secuencias polinucleotídicas extrañas en
células huésped. En algunas realizaciones, las células huésped
pueden transformarse y seleccionarse secuencialmente por el
protocolo descrito por Williams (1988). Este procedimiento explota
la transformabilidad natural de las cianobacterias Synechocystis
sp. PCC 6803, en las que la transformación es posible por medio
de una simple incubación de la construcción plasmídica purificada
con células en crecimiento exponencial.
Las células huésped para la transformación con
el vector de expresión recombinante descrito anteriormente incluyen
cualquier cianobacteria huésped adecuada competente para producir
etanol, especialmente miembros del género Synechocystis. Las
células huésped adecuadas para uso en la presente invención
incluyen, por ejemplo, Synechocystis sp. PCC 6803 de tipo
silvestre y Synechocystis mutante creada por Howitt y col.
(1999) que carece de una NDH deshidrogenasa de tipo 2 funcional
(NDH-2(-)). La deshidrogenasa de tipo 2 es
específica para la regeneración de NAD^{+} a partir de NADH. En el
mutante puede aumentarse el flujo a través de la ruta de etanol. En
realizaciones particularmente preferidas, las células huésped son
Synechocystis. Las células huésped que se transforman con la
construcción pdc/adh son cianobacterias recombinantes útiles para la
producción de etanol. Las subespecies preferidas de
Synechocystis incluyen, por ejemplo, Synechocystis PCC
6803. Una cepa preferida es el mutante Synechocystis sp. PCC
6803 NDH-2(-).
Después de transformar la célula huésped con la
construcción pdc/adh, la célula huésped se incuba en condiciones
adecuadas para la producción de etanol. Típicamente, la célula
huésped crecerá en un cultivo líquido fotoautotrófico en medio
BG-11, con una velocidad de rociado de aire de 1
l/min y un punió de ajuste del pH de 8,5, controlado rociando con
CO_{2}, y la temperatura mantenida a 30ºC. En la técnica se
conocen diversos medios para cultivar cianobacterias. En algunas
realizaciones, se cultiva Synechocystis sp. PCC 6803 en
placas de medio BG-11 convencionales, con o sin la
adición (concentración final) de: glucosa 5 mM, sacarosa al 5% y/o 5
\mug ml^{-1}, 25 \mug ml^{-1} o 50 \mug ml^{-1} de
kanamicina. Las placas que contenían Synechocystis sp. PCC
6803 se incubaron a 30ºC bajo \sim100 microeinsteins m^{2}
s^{-1}. Todos los cultivos líquidos de Synechocystis se
cultivaron en BG-11 convencional, con la adición de
50 \mug ml^{-1} de kanamicina cuando fue apropiado.
Se observa un aumento de la secreción de etanol
después de que las células huésped competentes para producir etanol
se transformen con la construcción de pdc/adh y las células se
cultiven en las condiciones adecuadas descritas anteriormente. El
aumento de la secreción de etanol puede observarse por
procedimientos convencionales descritos con más detalle más adelante
en los ejemplos, conocidos por los especialistas en la técnica. En
algunas realizaciones, las células huésped se cultivan usando
cultivos discontinuos. En algunas realizaciones, las células huésped
se cultivan usando fermentación en fotobiorreactores. En algunas
realizaciones, las células huésped se cultivan en un reactor
BIOFLO®. En algunas realizaciones, se cambia el medio de crecimiento
en el que se cultivan las células huésped, permitiendo de esta
manera aumentar los niveles de producción de etanol. El número de
cambios de medio puede variar. Los niveles de concentración de
etanol pueden alcanzar de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15
mM después de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 días de
fermentación. En casos en los que se cambia el medio, los niveles de
concentración de etanol pueden alcanzar de aproximadamente 25 a
aproximadamente 100 mM después de 5 días de fermentación. En algunas
realizaciones, el nivel de producción de etanol es de
aproximadamente 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9,
6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2,
7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5,
8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4 , 9,5, 9,6, 9,7, 9,8,
9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9,
11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0,
12,1, 12.2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,1,
13,2, 13,3, 13,4, 13,5, 13,6, 13,7, 13,8, 13,9, 14,0, 14,1, 14,2,
14,3, 14,4, 14,5, 14,6, 14,7, 14,8, 14,9 ó 15,0 mM después de
aproximadamente 5 días de fermentación. En los casos en los que se
cambia el medio, en algunas realizaciones, el nivel de producción de
etanol es de aproximadamente 25,0, 25,1, 25,2, 25,3, 25,4, 25,5,
25,6, 25,7, 25.8, 25,9, 26,0, 26,1 , 26,2, 26,3, 26,5, 26,6, 26,7,
26,8, 26,9, 27,0, 27,1, 27,2, 27.3, 27,5, 27,6, 27,7, 27,8, 27,9,
28,2, 28,2, 28,3, 28,5, 28,6, 28,7, 28,8, 28,9, 29,0, 29,1, 29,2,
29,3, 29,5, 29,6, 29,7, 29,8, 29,9, 30,0, 30,1, 30,2, 30,3, 30,4,
30,5, 30,6, 30,7, 30,8, 30,9, 31,0, 31,1, 31,2, 31,3, 31,4, 31,5,
31,6, 31,7, 31,8, 31.9, 32,0, 32,1, 32,2, 32,3, 32,4, 32,5, 32,6,
32,7, 32,8, 32,9, 33,0, 33,1, 33,2, 33,3, 33,4, 33,5, 33,6, 33,7,
33,8, 33,9, 34,0, 34,1, 34,2, 34,3, 34,4, 34,5, 34,6, 34,7, 34,8,
34,9, 35,0, 35,1, 35,2, 35,3, 35,4, 35,5, 35,6, 35,7, 35,8, 35,9,
36,0, 36.1, 36,2, 36,3, 36,5, 36,6, 36,7, 36,8, 36,9, 37,0, 37,1,
37,2, 37,3, 37,5, 37,6, 37.7, 37,8, 37,9, 38,2, 38,2, 38,3, 38,5,
38,6, 38,7, 38,8, 38,9, 39,0, 39,1, 39,2, 39.3, 39,5, 39,6, 39,7,
39,8, 39,9, 40,0, 40,1, 40,2, 40,3, 40,4, 40,5, 40,6, 40,7, 40.8,
40,9, 41,0, 41,1, 41,2, 41,3, 41,4, 41,5, 41,6, 41,7, 41,8, 41,9,
42,0, 42,1, 42.2, 42,3, 42,4, 42,5, 42,6, 42,7, 42,8, 42,9, 43,0,
43,1, 43,2, 43,3, 43,4, 43,5, 43.6, 43,7, 43,8, 43,9, 44,0, 44,1,
44,2, 44,3, 44,4, 44,5, 44,6, 44,7, 44,8, 44,9, 45.0, 45,1, 45,2,
45,3, 45,4, 45,5, 45,6, 45,7, 45,8, 45,9, 46,0, 46,1, 46,2, 46,3,
46.5, 46,6, 46,7, 46,8, 46,9, 47,0, 47,1, 47,2, 47,3, 47,5, 47,6,
47,7, 47,8, 47,9, 48.2, 48,2, 48,3, 48,5, 48,6, 48,7, 48,8, 48,9,
49,0, 49,1, 49,2, 49,3, 49,5, 49,6, 49.7, 49,8, 49,9 ó 50,0 mM
después de aproximadamente 5 días de fermentación. Los tiempos de
fermentación pueden variar de aproximadamente 2 días a
aproximadamente 30 días de fermentación. En algunas realizaciones,
el tiempo de fermen-
tación es de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 días.
tación es de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 días.
La velocidad de rociado de aire durante el
cultivo de las células huésped puede ser de 0,1 l/min a 3,0 l/min.
En algunas realizaciones, la velocidad de rociado de aire durante el
cultivo de las células huésped es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3,
0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6,
1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 ó
3,0 l/min. Preferiblemente, la velocidad de rociado de aire es de 1
l/min. El punto de ajuste del pH para el cultivo de las células
huésped puede ser de 7,0 a 9,5. En algunas realizaciones, el punto
de ajuste del pH es de aproximadamente 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5,
7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8,
8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4 ó 9,5. La temperatura durante el
cultivo de las células huésped puede ser de aproximadamente 25ºG a
35ºC. En algunas realizaciones, la temperatura es de aproximadamente
25,0, 25,1, 25,2, 25,3, 25.4, 25,5, 25,6, 25,7, 25,8, 25,9, 26,0,
26,1 , 26,2, 26,3, 26,5, 26,6, 26,7, 26,8, 26.9, 27,0, 27,1, 27,2,
27,3, 27,5, 27,6, 27,7, 27,8, 27,9, 28,2, 28,2, 28,3, 28,5, 28.6,
28,7, 28,8, 28,9, 29,0, 29,1, 29,2, 29,3, 29,5, 29,6, 29,7, 29,8,
29,9, 30,0, 30.1, 30,2, 30,3, 30,4, 30,5, 30,6, 30,7, 30,8, 30,9,
31,0, 31,1, 31,2, 31,3, 31,4, 31.5, 31,6, 31,7, 31,8, 31,9, 32,0,
32,1, 32,2, 32,3, 32,4, 32,5, 32,6, 32,7, 32,8,, 32,9, 33,0, 33,1,
33,2, 33,3, 33,4, 33,5, 33,6, 33,7, 33,8, 33,9, 34,0, 34,1, 34,2,
34.3, 34,4, 34,5, 34,6, 34,7, 34,8, 34,9 ó 35,0ºC.
Los siguientes ejemplos se proporcionan como
ilustración y no de modo limitante.
Ejemplo
1
Este Ejemplo ilustra la preparación del vector
de transformación, pMota.
Se usó PCR para amplificación del casete
pdc/adhII de pLOI295 y para la introducción simultánea de
sitios Ndel y BamHI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Estos
sitios se dejaron después para subclonar pdc/adhII dentro de
la columna vertebral del plásmido pPSBAIIKS, que resulta de la
eliminación del casete de selección aphX/sacB por medio de
digestión dual con NdeI/BamHI, produciendo pMota. Los siguientes
cebadores se usaron para la reacción de PCR anterior (los sitios de
restricción están subrayados, las mutaciones inducidas están en
negrita: Anteriormente en la secuencia:
5' - ggAgTAAgCATATgAgTTATACTg - 3' (SEQ ID Nº: 10) Posteriormente en la secuencia: 5' - ggATCTCgACTC
TAgAggATCC - 3' (SEQ ID Nº: 11). La PCR se llevó a cabo como sigue: volumen de reacción total de 50 \mul, 0,36 \mug de pLOI295 como plantilla, 4 unidades de polimerasa Vent_{R}®, una concentración final de 0,5 \muM para cada cebador, 300 \muM de cada dNTP. La reacción se llevó a cabo en el siguiente programa en un Eppendorf® Mastercycler®: desnaturalización inicial a 94ºC durante 2 minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturalización de 10 s a 94ºC, fusión de 1 minuto a 47ºC, y extensión de 3,7 minutos a 68ºC; finalmente, mantener a 4ºC.
5' - ggAgTAAgCATATgAgTTATACTg - 3' (SEQ ID Nº: 10) Posteriormente en la secuencia: 5' - ggATCTCgACTC
TAgAggATCC - 3' (SEQ ID Nº: 11). La PCR se llevó a cabo como sigue: volumen de reacción total de 50 \mul, 0,36 \mug de pLOI295 como plantilla, 4 unidades de polimerasa Vent_{R}®, una concentración final de 0,5 \muM para cada cebador, 300 \muM de cada dNTP. La reacción se llevó a cabo en el siguiente programa en un Eppendorf® Mastercycler®: desnaturalización inicial a 94ºC durante 2 minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturalización de 10 s a 94ºC, fusión de 1 minuto a 47ºC, y extensión de 3,7 minutos a 68ºC; finalmente, mantener a 4ºC.
Todos los kits de limpieza del producto de
plásmido/PCR y la ADN polimerasa Taq se adquirieron de Qiagen®.
Todas las enzimas de restricción, polimerasa Vent_{R}® y ligasa de
ADN T4 se obtuvieron de New England Biolabs®. El plásmido PSBAIIKS
se obtuvo de Wim F. J. Vermaas en la Universidad Estatal de Arizona.
El plásmido LOI295, que contiene los genes de Z. mobilis pdc
y adhII, se obtuvo de Lonnie O. Ingram en la Universidad de
Florida.
Ejemplo
2
Este Ejemplo ilustra la construcción de una
línea cianobacteriana estable para producción de etanol.
Tras la creación de pMota (véase Ejemplo 1
anterior), tanto la cepa de tipo salvaje como la cepa mutante
NDH-2(-) de Synechocystis sp. PCC 6803 se
transformaron y rastrearon secuencialmente con pPSBAIIKS y pMota por
medio del protocolo descrito por Williams (1988). Después de
transformación con pPSBAIIKS, se permitió replaquear en serie en
concentraciones crecientes de kanamicina para el aislamiento de las
cepas WT_{[r]} y NDH-2(-)_{[r]}, completamente
segregadas con respecto al casete de selección aphX/sacB,
como se verifica mediante un ensayo basado en PCR. Éstas se
cultivaron a su vez en cultivo de siembra líquido, en la presencia
de kanamicina a 50 \mug ml^{-1}, y se transformaron
subsiguientemente con pMota.
Los transformantes se rastrearon en placas
BG-11 que contenían sacarosa al 5%. Se llevó a cabo
el rastreo por medio de disposición en línea en serie de colonias
individuales junto con tanto un ensayo basado en PCR inicial usado
para sondear los loci de psbAII como finalmente un ensayo
basado en reactor de siembra para determinación de estabilidad de
generación de etanol dada la ausencia de presión selectiva. El
ensayo de PCR consistió en tres reacciones de PCR por muestra,
sondeando la presencia de (1) el gen psbAII WT, (2) el casete
de selección aphX/sacB, y (3) el casete de la ruta de etanol
pdc/adhII. Cada una de las tres reacciones que comprenden el
ensayo de PCR compartió un cebador anterior en la secuencia común
que se encuentra fuera de los loci del gen psbAII, mientras
que cada reacción se define por el cebador posterior en la secuencia
que es específico para cada una de las tres construcciones genéticas
posibles. El cebador anterior en la secuencia usado en todas las
tres reacciones fue: 5' - gTCAgTTCCAATCTgAACATCGA - 3' (SEQ ID Nº.:
12), con el amplicón empezando 48 pares de bases anteriormente en la
secuencia del codón de partida psbAII. El cebador posterior
en la secuencia para sondear el gen psbAII WT: 5'
AATTTgTAACCgTAgTTCTgggAT - 3' (SEQ ID Nº.: 13), y el amplicón
resultante es de 749 pb. Para sondear el casete de selección
aphX/sacB, se usó: 5' - TTggTgATTTTgAACTTTTgCTTgC - 3' (SEQ
ID Nº: 14), dando como resultado un amplicón de 3,1 kb. El cebador
posterior en la secuencia sondeando el casete pdc/adhII: 5' -
TTgCAAgCgATTTCgAgATAAA - 3' (SEQ ID Nº.: 15), dando como resultado
un amplicón de 554 pb. Todas las reacciones de PCR se formularon
como se describe en el Qiagen® Taq Polymerase Handbook en la sección
para productos de PCR largos, modificadas sólo por la exclusión de
una polimerasa de alta fidelidad. El ensayo de PCR utilizó el
siguiente programa de ciclación: desnaturalización inicial a 94ºC
durante 3 minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturalización de 10
s a 94ºC, fusión de 1 minuto a 48ºC, y extensión de 3,5 minutos a
68ºC; una extensión final de 3 minutos a 68ºC, mantener a 4ºC.
Para llevar a cabo el ensayo de PCR en una
muestra cianobacteriana dada, se usaron tarjetas FTA® marca
Whatman® para preparación rápida de ADN genómico para usar como una plantilla en la reacción de PCR anterior. Para probar un cultivo líquido, se salpicaron 5 \mul sobre la tarjeta FTA® Para probar cultivos sembrados en línea en medios sólidos, se separaron múltiples colonias de la placa, se sembraron en línea en el interior de un tubo de 1,5 ml y se resuspendieron en 10 \mul de BG-11 por medio de agitación; se salpicaron después 5 \mul sobre la tarjeta FTA®, como anteriormente. El protocolo de FTA® para preparación del ADN archivado de una fuente bacteriana se siguió para preparación de la plantilla para el ensayo de PCR.
Whatman® para preparación rápida de ADN genómico para usar como una plantilla en la reacción de PCR anterior. Para probar un cultivo líquido, se salpicaron 5 \mul sobre la tarjeta FTA® Para probar cultivos sembrados en línea en medios sólidos, se separaron múltiples colonias de la placa, se sembraron en línea en el interior de un tubo de 1,5 ml y se resuspendieron en 10 \mul de BG-11 por medio de agitación; se salpicaron después 5 \mul sobre la tarjeta FTA®, como anteriormente. El protocolo de FTA® para preparación del ADN archivado de una fuente bacteriana se siguió para preparación de la plantilla para el ensayo de PCR.
El ensayo basado en reactor de siembra principal
se usó rastreando colonias que estaban mostrando estar completamente
segregadas del casete de etanol para producción de etanol estable.
Los reactores de siembra se inocularon con colonias múltiples de una
placa de un aislado dado. Las células se cultivaron a una
D.O._{730} mayor de 0,1, se centrifugaron a 3220 x g durante 6
minutos a temperatura ambiente, y se resuspendieron en un reactor de
siembra nuevo a una D.O._{730} = 0,025 inicial. Esto constituyó el
primer reactor experimental en una serie de cinco funcionamientos.
El reactor se hizo funcionar durante cinco días, punto en el que las
células se recogieron de nuevo mediante centrifugación y se usaron
inoculando el segundo reactor experimental en la serie a la
D.O._{730} = 0,025 anterior. Por supuesto, sólo se usó un subgrupo
de la biomasa celular total para esta inoculación en serie mientras
el resto se desechó o se almacenó en glicerol. Cada día de un
funcionamiento particular, se registró la D.O._{730}, y se tomó
una alícuota de 550 \mul para el ensayo de concentración de etanol
(la alícuota "anterior"). Las células se lavaron mediante
recogida por medio de centrifugación (como anteriormente), desechado
del sobrenadante, resuspensión mediante agitación del sedimento
entero en 25 ml de BG-11 recién preparado, y se
retornaron al reactor de siembra. La D.O._{730} se registró de
nuevo y se tomó otra alícuota para ensayo de concentración de etanol
(la así llamada alícuota "después"). Después de aislamiento de
un aislado que produce etanol estable, el ensayo basado en PCR se
aplicó a tiempo final para confirmación
completa.
completa.
La cepa PCC 6803 de tipo salvaje (WT) de
Synechocystis sp. y el mutante NDH-2(-), que
carece de cualquier deshidrogenasa de tipo II
NADH-oxidante funcional, se obtuvieron de Wim F. J.
Vermaas en la Universidad Estatal de Arizona. Se obtuvo E.
coli C600 del laboratorio de Monfo Kumagai, mientras en la
Universidad de Hawaii en Manoa.
Se cultivó E. coli en formulación de LB
estándar tanto en medios líquidos como en sólidos. Se suplementaron
ampicilina y kanamicina a las placas de medios LB a concentraciones
de 100 \mug ml^{-1} y 50 \mug ml^{-1}, respectivamente.
Se cultivó toda la Synechocystis sp. PCC
6803 en placas de medios BG-11 estándar, con o sin
la adición de (concentración final): glucosa 5 mM, sacarosa al 5%,
y/o kamamicina bien a 5 \mug ml^{-1}, bien a 25 \mug
ml^{-1}, o bien a 50 \mug ml^{-1}. Se incubaron placas que
contenían Synechocystis sp. PCC 6803 a 30ºC bajo \sim100
microeinsteins m^{-2} s^{-1}. Todos los cultivos líquidos de
Synechocystis se cultivaron en BG-11
estándar, con la adición de kanamicina a 50 \mug
ml-1 cuando fue apropiado.
Ejemplo
3
Este Ejemplo ilustra experimentos de crecimiento
por lotes para estudios de productividad y estabilidad.
Se estableció un sistema de cultivo por lotes en
paralelo (seis biorreactores de 100 ml) para cultivar las cepas de
Synechocystis que producen etanol. Se usó el medio líquido
BG-11 estándar para todos los experimentos. Se
estableció agitación a 400 r.p.m. La intensidad de resplandor fue de
200 microeinsteins en la cara delantera de los reactores. Se roció
aire comprimido proporcionando CO_{2} y se eliminó el oxígeno
producido por Synechocystis. El modo de operación de
semilotes se usó probando la producción de etanol. El periodo de
cultivo celular total fue de 20 días. Los cultivos de siembra se
empezaron a partir de una placa. Las células que crecen
exponencialmente a partir de un cultivo de siembra se inocularon
dentro de los reactores a D.O._{730} = 0,025. Los cultivos por
lotes se llevaron a cabo durante aproximadamente 4 días, y después
se terminaron. Las células se hicieron girar hacia abajo mediante
centrifugación, se resuspendieron en un volumen reducido, y se usó
una alícuota inoculando un biorreactor con medios recién
preparados.
Ejemplo
4
Este Ejemplo ilustra la determinación de la
concentración del etanol en un cultivo líquido.
Para determinación de concentración de etanol de
un cultivo líquido, se tomó una alícuota de 550 \mul del cultivo,
se hizo girar hacia abajo a 12.100 x g durante 5 minutos, y se
situaron 500 \mul (u otro volumen apropiado) del sobrenadante en
un tubo de 1,5 ml y se almacenaron a -20ºC hasta que se llevó a cabo
el ensayo. Dado el intervalo lineal del espectrofotómetro y la
sensibilidad del ensayo de etanol, se requirió ocasionalmente la
dilución de la muestra (hasta 20 veces). En este caso, se añadió
primero un volumen apropiado de BG-11 al tubo de 1,5
ml recién preparado, al que se añadió el volumen requerido de
sobrenadante aclarado. Esta solución se usó directamente en el
ensayo de etanol. Tras la extracción de -20ºC e inmediatamente antes
de llevar a cabo el ensayo, las muestras se hicieron girar hacia
abajo una segunda vez a 12.100 x g durante 5 minutos, ayudando
además en la descongelación de la muestra.
El kit de detección de etanol enzimático
Boehringer Mannheim/r-biopharm® se usó para
determinación de concentración de etanol. Brevemente, este ensayo
explota la acción de alcohol deshidrogenasa (ADH) y acetaldehído
deshidrogenasa en una solución tamponada con fosfato del cofactor de
NAD^{+}, que tras la adición de etanol causa una conversión de
NAD^{+} a NADH. La concentración de NADH se determinó mediante
absorbancia de luz a 340 nm (A_{340}) y se usó después
determinando concentración de etanol. El ensayo se llevó a cabo como
se da en las instrucciones, con las siguientes modificaciones. Como
se da bajo el punto 4 de la hoja de instrucciones, se usó para el
ensayo el volumen de muestra máximo (v = 0,5 ml), para sensibilidad
máxima. Finalmente, se dividieron en cuatro partes todos los
volúmenes en el ensayo (incluyendo el anterior v = 0,5 ml). Esto
permitió la concentración del reactivo, y la capacidad para retener
una mayoría del volumen de alícuota de la muestra, en caso de que se
requiera repetición. Así, el volumen de muestra usado fue realmente
v = 0,125 ml, en 0,75 ml de mezcla de reacción 2, y con la adición
posterior de 12,5 \mul de suspensión 3 (ADH). Esta reducción
volumétrica de proporción conservada se determinó que no tenía
ningún efecto en el ensayo según se llevó a cabo. Se usó
BG-11 como un blanco.
Ejemplo
5
Este Ejemplo ilustra producción de etanol usando
fermentación de fotobiorreactor autótrofo.
Los cultivos de siembra líquidos se cultivaron a
24ºC en un agitador de incubación (Innova 4230 benchtop, New
Brunswick) con una luz que posee un flujo de superficie máximo de
\sim200 microeinsteins m^{-2} s^{-1} en la cara del reactor de
siembra, agitado por medio de barra de agitación magnética y rociado
con aire comprimido a una velocidad de aproximadamente 0,5 l/min.
Los cultivos de siembra principales consistieron en un volumen total
de 25 ml en una botella de medios Pyrex™ de 100 ml, con dos pipetas
Pasteur que sirven como los tubos de rociada y de salida de gas.
Anteriormente en el proceso con respecto al tubo de rociada estaba
un filtro de 0,1 \mum de Whatman® PFTE y el tubo de salida de gas
estaba tapado sin mucho rigor con papel de aluminio. El cultivo de
siembra secundario usado para inoculación del fotobiorreactor fue
idéntico al cultivo de siembra primario, excepto en que el volumen
de cultivo fue de 300 ml cultivados en una botella de medios Pyrex™
de 1 l estándar, la pipeta rociadora se reemplazó con un difusor de
porosidad de nivel C, tamaño de poro 25-50 \mum,
de Ace Glass Inc. Las luces usadas fueron tubos fluorescentes
blancos fríos de 40 W. El crecimiento celular en cultivo líquido se
siguió mediante determinación de densidad óptica a 730 nm
(D.O._{730}) usando un espectrofotómetro ThermoSpectronic®
Genesys®. Se usaron cubetas desechables de 1,5 ml de Plastibrand®
Ultra Vette®.
El cultivo de siembra de crecimiento exponencial
de reactores de siembra principales se usó inoculando un segundo
reactor de cultivo, que se cultivó después a una D.O._{730} >
0,31 y se usó inmediatamente para inoculación del fotobiorreactor
autótrofo. Para inoculación, la D.O._{730} se tomó y usó para
determinación del volumen de cultivo de siembra requerido para
biorreactor inicial a D.O._{730} \sim0,02 (el volumen de
fermentación total fue 3,1 l). Las células de este volumen
determinado de cultivo de siembra se recogieron por medio de
centrifugación y se resuspendieron en 50 ml de BG-11
recién preparado mediante agitación. Después de inoculación del
biorreactor con esta siembra de 50 ml, se usaron 50 ml de
BG-11 adicionales para el drenaje mediante flujo del
tubo de inoculación.
Se usó un sistema biorreactor BIOFLO® 110 de 7,5
I (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) para los experimentos. El
sistema biorreactor BIOFLO® 110 de 7,5 I incluye controladores para
temperatura, pH y ajuste de concentración de oxígeno disuelto (OD).
El procedimiento de cultivo de Synechocystis se siguió y
controló automáticamente mediante un ordenador Pentium® II (233 MHz,
Windows 98) equipado con una tarjeta interfaz de red
PCI-MIO-16E-10
(National Instruments Corp., Austin, TX). El programa de adquisición
de datos se escribió en LabVIEW7.1 (National Instruments Corp.,
Austin, TX). Los datos del sistema biorreactor BIOFLO® 110, que
incluyen pH, agitación, temperatura y OD se adquirieron a través de
la tarjeta interfaz de red. Se dispusieron seis bombillas
F26DBX/SPX41/4P, de 26 W de General Electric® alrededor del reactor
dando flujo de superficie máximo de \sim1000 microeinsteins
m^{-2} s^{-1} en la superficie del reactor. El reactor se
mantuvo a 27-29ºC a lo largo de la fermentación por
medio de un aire circulante de ventilador externo alrededor del
sistema de iluminación. El reactor se roció con aire a una velocidad
de 1 l/minuto, el pH se controló mediante inyección de CO_{2} con
el punto de operación a 8,5, y la turbina de agitación se ajustó a
300 r.p.m. El condensador del puerto de salida de gas se enfrió a
8ºC por medio de un baño de agua termocirculante
(C10-K20, Haake, Berlín, Alemania). La fermentación
se mantuvo durante 8 días, con toma de muestras cada ocho horas.
Para la toma de muestras, se sacaron \sim15 ml del reactor por
medio del puerto de toma de muestras (pasando el tubo inferior de
recogida), se desecharon, y se sacó la muestra, una segunda alícuota
de \sim15 ml. Se registró la D.O._{730} de cada muestra y se
tomó una alícuota para el ensayo de concentración de etanol. La
concentración de etanol fue 12 mM después de 112 horas de
fermentación (Figura 2). Después de 5 días de fermentación, se
alcanzó una concentración de etanol de 13 mM (Figura 2).
Los métodos, procedimientos, y dispositivos
descritos en el presente documento son en este momento
representativos de realizaciones preferidas y son ejemplares y no se
desean como limitaciones en el alcance de la invención. Tendrán
lugar cambios en esto y otros usos para aquellos expertos en la
técnica que están comprendidos dentro del espíritu de la invención y
se definen mediante el alcance de la descripción. Todos los números
que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, y
así sucesivamente usados en la memoria descriptiva y las
reivindicaciones son para entenderse como que están modificados en
todos los casos mediante el término "aproximadamente". De
acuerdo con ello, a menos que se indique lo contrario, los
parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva y las
reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar
dependiendo de las propiedades deseadas buscadas para obtenerse
mediante la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de
limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance
de las reivindicaciones, cada parámetro numérico se interpretaría a
la luz del número de dígitos significativos y aproximaciones de
redondeo normales.
Será patente para cualquiera de habilidad en la
técnica que se pueden hacer sustituciones y modificación variantes a
la invención descrita en el presente documento sin apartarse del
alcance y espíritu de la invención.
Aquellos expertos en la técnica reconocerán que
los aspectos y realizaciones de la invención expuestas en el
presente documento pueden llevarse a la práctica por separado unas
de otras o en conjunción unas con otras. Por lo tanto, combinaciones
de realizaciones separadas están dentro del alcance de la invención
como se describe en el presente documento.
\vskip1.000000\baselineskip
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Todas las patentes y publicaciones se incorporan
en el presente documento mediante referencia en sus totalidades en
el mismo grado que si cada publicación individual se indicara
específicamente e individualmente para incorporarse mediante
referencia.
La invención descrita ilustrativamente en el
presente documento se puede llevar a la práctica adecuadamente en
ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o
limitaciones que no estén descritos específicamente en el presente
documento. Los términos y expresiones que se han empleado se usan
como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención
de que en el uso de tales términos y expresiones se indique la
exclusión de equivalentes de las características mostradas y
descritas o de partes de los mismos. Se reconoce que son posibles
diversas modificaciones dentro del alcance de la invención descrita.
Así, se entendería que aunque la presente invención se ha descrito
específicamente mediante realizaciones preferidas y características
opcionales, se puede recurrir a la modificación y variación de los
conceptos descritos en el presente documento por aquellos expertos
en la técnica, y que tales modificaciones y variaciones se considera
que están dentro del alcance de esta invención como se define
mediante la descripción.
<110> Pengcheng Patrick Fu
\hskip1cmJason Dexter
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA
CIANOBACTERIAS PRODUCTORAS DE ETANOL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> UOH.021NP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> DESCONOCIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2008-07-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/758,683
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2006-01-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US2007/001071
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2007-01-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7286
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de expresión recombinante
pMota
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 502
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechocystis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1707
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zymomonas mobilis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zymomonas mobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 606
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechococcus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechococcus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zymomonas mobilis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 556
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zymobacter palmae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zymomonas mobilis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
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sintético
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<400> 14
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<210> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
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<400> 15
Claims (42)
1. Una construcción de ácido nucleico que
comprende: un promotor de respuesta a luz, una secuencia que
codifica una enzima piruvato decarboxilasa (pdc), y una secuencia
que codifica una enzima alcohol deshidrogenasa (adh).
2. La construcción de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que el promotor de respuesta a luz es el
promotor psbAII.
3. La construcción de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que las secuencias que codifican una enzima
pcd y una enzima adh se obtienen del plásmido pLOI295 de
Zymomonas mobilis.
4. La construcción de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima pdc
se obtiene de Zymobacter palmae.
5. La construcción de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima pdc
se obtiene de Zymobacter palmae y la secuencia que codifica
una enzima adh se obtiene de Zymomonas mobilis.
6. La construcción de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima adh
se obtiene del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis.
7. La construcción de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima pdc
comprende SEQ. ID Nº.: 3 o una secuencia génica que codifica pdc y
que es capaz de expresión en cianobacterias.
8. La construcción de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima adh
comprende SEQ. ID Nº.: 4 o una secuencia génica que codifica adh y
que es capaz de expresión en cianobacterias.
9. La construcción de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima pdc
comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia
de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº.: 8.
10. Un vector de expresión que comprende una
construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1.
11. Una célula huésped que comprende el vector
de expresión de la reivindicación 10.
12. La célula huésped de la reivindicación 11,
en la que el vector de expresión está integrado dentro del cromosoma
de la célula huésped.
13. La célula huésped de la reivindicación 11,
en la que el vector de expresión es pMota.
14. La célula huésped de la reivindicación 11,
en la que la célula es una cianobacteria.
15. La célula huésped de la reivindicación 14,
en la que la cianobacteria es Synechocystis.
16. La célula huésped de la reivindicación 15,
en la que la cianobacteria es Synechocystis sp. PCC 6803, u
otra cepa transformable de Synechocystis.
17. La célula huésped de la reivindicación 16,
en la que la cianobacteria es una cepa de Synechocystis sp.
PCC 6803 de tipo salvaje o es una cepa mutante
NDH-2(-) de Synechocystis sp. PCC 6803.
18. La célula huésped de la reivindicación 14,
en la que la cianobacteria es Synechococcus PCC 7942, u otra
cepa transformable de Synechococcus.
19. La célula huésped de la reivindicación 14,
en la que la célula huésped es capaz de producir etanol se produce
en cantidades relativamente cuantificables después de un periodo de
exposición a la luz.
20. La célula huésped de la reivindicación 19,
en la que la célula huésped es capaz de producir etanol en
cantidades recuperables mayores de aproximadamente etanol 10 mM
después de una fermentación de 5 días.
21. La célula huésped de la reivindicación 19,
en la que la célula huésped es capaz de producir etanol en
cantidades recuperables de aproximadamente etanol 13 mM después de
una fermentación de 5 días.
22. Una cianobacteria modificada mediante
ingeniería genética que comprende una construcción que comprende
secuencias de ácidos nucleicos que codifican enzimas piruvato
decarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh), en la que la
cianobacteria es capaz de producir etanol en cantidades recuperables
mayores que aproximadamente etanol 10 mM después de una fermentación
de 5 días.
23. La cianobacteria de la reivindicación 22, en
la que las secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas pcd y
adh se obtienen a partir del plásmido pLOI295 de Zymomonas
mobilis.
24. La cianobacteria de la reivindicación 22, en
la que la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima pdc se
obtiene de Zymobacter palmae.
25. La cianobacteria de la reivindicación 22, en
la que la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima pdc se
obtiene de Zymobacter palmae y la secuencia de ácido nucleico
que codifica la enzima adh se obtiene de Zymomonas
mobilis.
26. La cianobacteria de la reivindicación 25, en
la que la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima adh se
obtiene del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis.
27. La cianobacteria de la reivindicación 22, en
la que la cianobacteria es Synechocystis.
28. La cianobacteria de la reivindicación 27, en
la que la cianobacteria es Synechocystis sp. PCC 6803, u
otras cepas transformables de Synechocystis.
29. La cianobacteria de 28, en la que la
Synechocystis sp. PCC 6803 es una cepa Synechocystis
sp. PCC 6803 de tipo salvaje o es una cepa mutante
NDH-2(-) de Synechocystis sp. PCC 6803.
30. La cianobacteria de la reivindicación 22, en
la que la secuencia del ácido nucleico que codifica la enzima pdc
comprende SEQ. ID Nº.: 3 o una secuencia génica que codifica pdc y
que es capaz de expresión en cianobacterias.
31. La cianobacteria de la reivindicación 22, en
la que la secuencia del ácido nucleico es una secuencia que codifica
la enzima pdc que comprende SEQ. ID Nº: 8.
32. La cianobacteria de la reivindicación 22, en
la que la secuencia del ácido nucleico que codifica la enzima adh
comprende SEQ. ID Nº: 4.
33. La cianobacteria de la reivindicación 22, en
la que la construcción contiene un gen inducible por la luz.
34. La cianobacteria de la reivindicación 22, en
la que la construcción contiene el promotor de psbAII.
35. La cianobacteria de la reivindicación 22, en
la que la construcción es pMota.
36. Un procedimiento de producir etanol, que
comprende: cultivar cianobacterias en un medio de cultivo,
conteniendo las cianobacterias una construcción que comprende
fragmentos de ADN que codifican enzimas pdc y adh obtenidos del
plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis; y acumular etanol en
el medio de cultivo en una cantidad mayor que aproximadamente etanol
10 mM después de fermentación de 5 días.
37. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que la cianobacteria es capaz de producir etanol en cantidades
recuperables de aproximadamente etanol 13 mM después de una
fermentación de 5 días.
38. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que la concentración de etanol del medio de cultivo es al menos
aproximadamente 5 mM después de aproximadamente cinco días de
cultivo.
39. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que la concentración de etanol del medio de cultivo es al menos
aproximadamente 13 mM después de aproximadamente cinco días de
cultivo.
40. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que las cianobacterias son Synechocystis y dicha
construcción es pMota.
41. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que la construcción comprende adicionalmente un fragmento de ADN
que comprende un gen que responde a la luz.
42. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que la construcción está integrada en el cromosoma de las
cianobacterias.
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