DE69924873T2

DE69924873T2 - Cytochrom p450 monooxygenase und nadph-cytochrom p450-oxidoreduktase gene und proteine mit bezug zum omega-hydroxylase-komplex in candida tropicalis und dazu gehörigen verfahren

Info

Publication number: DE69924873T2
Application number: DE69924873T
Authority: DE
Inventors: Ron C. Wilson; L. David CRAFT; Dudley L. Eirich; Mark Eshoo; Krishna M. Madduri; Cathy A. Cornett; A. Alfred BRENNER; Maria Tang; C. John LOPER; Martin Gleeson
Original assignee: Cognis Corp
Current assignee: Cognis Corp
Priority date: 1998-10-05
Filing date: 1999-09-10
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2019-09-11
Also published as: DE69924873D1; EP1148135A2; EP1162268A3; DE69941603D1; EP1148134A3; AU5917799A; EP1148132A3; EP1148131A2; EP1162268A2; EP1148133A2; EP1148138A2; EP1148130A2; CA2653985A1; WO2000020566A9; EP1148136A2; EP1148136A3; EP1148137A3; EP1148143A2; EP1148143A3; EP1148131A3

Description

Hintergrund
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Gene, die für Enzyme des ω-Hydroxylase-Komplexes in Stämmen der Hefe Candida tropicalis codieren. Insbesondere betrifft die Erfindung Gene, die für die Enzyme Cytochrom-P-450 und NADPH-Reduktase des ω-Hydroxylase-Komplexes in der Hefe Candida tropicalis codieren, sowie ein Verfahren zur Quantifizierung der Genexpression.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Aliphatische Disäuren sind vielseitige chemische Zwischenverbindungen, die sich als Rohmaterialien zur Herstellung von Parfümen, Polymeren, Klebstoffen und Makrolidantibiotika eignen. Obschon mehrere chemische Wege zur Synthese langkettiger Alpha-, ω-Dicarbonsäuren zur Verfügung stehen, ist die Synthese nicht einfach, und die meisten Verfahren führen zu Gemischen mit kürzeren Kettenlängen. Daher sind umfangreiche Reinigungsschritte erforderlich. Zwar ist bekannt, daß langkettige Disäuren auch durch mikrobielle Transformation von Alkanen, Fettsäuren oder Estern davon produziert werden können, doch ist die chemische Synthese immer noch der kommerziell günstigste Weg aufgrund der Einschränkungen bei den gegenwärtigen biologischen Ansätzen.
Es ist bekannt, daß mehrere Hefestämme als Nebenprodukt Alpha-, ω-Dicarbonsäuren ausscheiden, wenn sie auf Alkanen oder Fettsäuren als Kohlenstoffquelle kultiviert werden. Insbesondere sind zur Gattung Candida gehörende Hefen, wie z.B. C. albicans, C. cloacae, C. guillermondii, C. intermedia, C. lipolytica, C. maltosa, C. parapsilosis und C. zeylenoides, dafür bekannt, solche Dicarbonsäuren zu produzieren (Agr. Biol. Chem. 35: 2033–2042 (1971)). Ebenso ist bekannt, daß verschiedene Stämme von C. tropicalis Dicarbonsäuren mit Kettenlängen im Bereich von C₁₁ bis C₁₈ produzieren (Okino et al., BM Lawrence, BD Mookherjee and BJ Willis (Hrsg.), in Flavors and Fragrances: A World Perspective. Proceedings of the 10^th International Conference of Essential Oils, Flavors and Fragrances, Elsevier Science Publishers BV Amsterdam (1988)), wobei diese Stämme die Grundlage für mehrere Patente, wie sie von Bühler und Schindler, in Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnology, H. J. Rehm und G. Reed, (Hrsg.), Bd. 169, Verlag Chemie, Weinheim (1984) in Form einer Übersicht dargestellt sind, bilden.
Untersuchungen der biochemischen Prozesse, mit denen Hefen Alkane und Fettsäuren metabolisieren, ergaben drei Arten von Oxidationsreaktionen: α-Oxidation von Alkanen zu Alkoholen, ω-Oxidation von Fettsäuren zu Alpha-, ω-Dicarbonsäuren sowie die abbauende β-Oxidation von Fettsäuren zu CO₂ und Wasser. Die ersten beiden Oxidationsarten werden von mikrosomalen Enzymen katalysiert, während die letzte Art in den Peroxisomen stattfindet. In C. tropicalis wird der erste Schritt im ω-Oxidationsweg von einem membrangebundenen Enzymkomplex (ω-Hydroxylase-Komplex) unter Einschluß einer Cytochrom-P450-Monooxygenase und einer NADPH-Cytochromreduktase katalysiert. Dieser Hydroxylase-Komplex ist für die primäre Oxidation der terminalen Methylgruppe in Alkanen und Fettsäuren verantwortlich (Gilewicz et al., Can. J. Microbiol. 25: 201 (1979)). Die Gene, die für die Cytochrom-P450- und NADPH-Reduktase-Bestandteile des Komplexes codieren, wurden bereits als P450ALK bzw. P450RED identifiziert und auch kloniert und sequenziert (Sanglard et al., Gene 76: 121–136 (1989)). P450ALK ist auch mit P450ALK1 bezeichnet worden. Erst kürzlich wurden die ALK-Gene mit dem Symbol CYP und RED-Gene mit dem Symbol CPR bezeichnet. Siehe z.B. Nelson, Pharmacogenetics 6 (1): 1–42 (1996). Siehe ebenso Ohkuma et al., DNA and Cell Biology 14: 163–173 (1995), Seghezzi et al., DNA and Cell Biology, 11: 767–780 (1992) und Kargel et al., Yeast 12: 333–348 (1996). So wird beispielsweise gemäß der Nomenklatur nach Nelson, supra P450ALK auch mit CYP52 bezeichnet. Aus Alkanen werden schließlich nach zwei zusätzlichen Oxidationsschritten, die von Alkoholoxidase (Kemp et al., Appl. Microbiol. and Biotechnol. 28: 370–374 (1988)) und Aldehyddehydrogenase katalysiert werden, Fettsäuren gebildet. Die Fettsäuren lassen sich weiter über denselben oder einen ähnlichen Weg zu der entsprechenden Dicarbonsäure oxidieren. Die ω-Oxidation von Fettsäuren läuft über die ω-Hydroxyfettsäure und ihr Aldehydderivat zur entsprechenden Dicarbonsäure ab, ohne daß dabei eine CoA-Aktivierung benötigt wird. Jedoch können sowohl Fettsäuren als auch Dicarbonsäuren nach Aktivierung zum entsprechenden Acyl-CoA-ester über den β-Oxidationsweg in den Peroxisomen abbauen, was zu einer Kettenverkürzung führt. In Säugersystemen werden sowohl Fettsäure- als auch Dicarbonsäureprodukte der ω-Oxidation mit gleicher Geschwindigkeit zu ihren CoA-Estern aktiviert und stellen Substrate sowohl für die mitochondriale als auch die peroxisomale β-Oxidation dar (J. Biochem., 102: 225–234 (1987)). In der Hefe findet die β-Oxidation ausschließlich in den Peroxisomen statt (Agr. Biol. Chem. 49: 1821–1828 (1985)).
Aus der US-A-4,474,882 ist die Produktion von Dicarbonsäuren durch Fermentation ungesättigter C₁₄-C₁₆-Monocarbonsäuren unter Verwendung eines Stamms der Spezies C. tropicalis bekannt. Die ungesättigten Dicarbonsäuren entsprechen hinsichtlich der Anzahl und Stellung der Doppelbindungen den Ausgangsmaterialien. Ähnliche Verfahren, bei denen andere spezielle Mikroorganismen verwendet werden, sind in den Patenten US-A-3,975,234 und 4,339,536, in der Britischen Patentschrift GB-A-1,405,026 und in den Deutschen Patentveröffentlichungen DE-A-21 64 626, 28 53 847, 29 37 292, 29 51 177 und 21 40 133 beschrieben.
Bei den Cytochromen P450 (P450s) handelt es sich um terminale Monooxidasen eines wie oben beschriebenen, aus mehreren Bestandteilen bestehenden Enzymsystems. Sie umfassen eine Superfamilie von Proteinen, die in der Natur weitverbreitet sind und aus verschiedenen Organismen, wie z.B. in Nelson, supra, beschrieben, isoliert wurden. Zu diesen Organismen gehören verschiedene Säuger, Fische, Wirbellose, Pflanzen, Weichtiere, Schalentiere, niedere Eukaryonten sowie Bakterien (Nelson, supra). Zunächst in den Lebermikrosomen von Nagern als ein Kohlenmonoxid bindendes Pigment entdeckt, wie z.B. in Garfinkel, Arch. Biochem. Biophys. 77: 493–509 (1958) beschrieben, wurden P450s später aufgrund ihrer Absorption bei 450 nm in einem reduzierten-CO-gekoppelten Differenzspektrum, wie z.B. in Omura et al., J. Biol. Chem. 239: 2370–2378 (1964) beschrieben, benannt.
P450s katalysieren den Stoffwechsel verschiedener endogener und exogener Verbindungen (Nelson, supra). Zu den endogenen Verbindungen gehören Steroide, Prostanoide, Eicosanoide, fettlösliche Vitamine, Fettsäuren, Säugeralkaloide, Leukotrine, Biogeneamine und Phytolexine (Nelson, supra). Am P450-Stoffwechsel sind solche Reaktionen wie etwa Epoxidierung, Hydroxylierung, Dealkylierung, N-Hydroxylierung, Sulfoxidierung, Entschwefelung und reduktive Dehalogenierung beteiligt. Diese Reaktionen führen im allgemeinen zu einer wasserlöslicheren, was der Ausscheidung förderlich ist, und elektrophileren Verbindung. Diese elektrophilen Produkte können schädliche Auswirkungen haben, wenn sie mit DNA oder anderen Zellbestandteilen reagieren. Sie können jedoch durch Konjugation mit niedermolekularen hydrophilen Substanzen reagieren, wobei als Ergebnis eine Glucuronidierung, Sulfatierung, Acetylierung, Amminosäurekonjugation oder Glutathion konjugation erfolgt, was typischerweise zur Inaktivierung und Eliminierung, wie z.B. in Klaassen et al., Toxicology, 3. Aufl., Macmillan, New York, 1986 beschrieben, führt.
P450s sind Häm-Thiolatproteine, die aus einer an eine einzelne Polypeptidkette von 45.000 bis 55.000 Da gebundene Häm-Gruppierung bestehen. Das Eisen der prosthetischen Häm-Gruppe ist im Zentrum eines Protoporphyrinrings lokalisiert. Vier Liganden des Häm-Eisens lassen sich auf den Porphyrinring zurückführen. Der fünfte Ligand ist ein Thiolatanion von einem Cysteinylrest des Polypeptids. Bei dem sechsten Liganden handelt es sich wahrscheinlich um eine Hydroxylgruppe, von einem Aminosäurerest oder um eine Gruppierung mit einer ähnlichen Feldstärke, wie z.B. einem Wassermolekül, wie z.B. in Goeptar et al, Critical Reviews in Toxicology 25 (1): 25–65 (1995) beschrieben.
Von den Cytochromen P450 in einem eukaryontischen membrangebunden System katalysierte Monooxygenierungen erfordern die Übertragung von Elektronen von NADPH auf P450 über die NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase (CPR), wie z.B. in Taniguchi et al., Arch. Biochem. Biophys. 232 585 (1984) beschrieben. CPR ist ein Flavoprotein von ungefähr 78.000 Da, das 1 mol Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) und 1 mol Flavin-Mononukleotid (FMN) pro mol Enzym enthält, wie z.B. in Potter et al., J. Biol. Chem. 258: 6906 (1983), hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben. Bei der FAD-Gruppierung des CPR handelt es sich um die Stelle des Elektroneneintritts in das Enzym, wohingegen FMN die Stelle der Elektronenabgabe an P450 darstellt, wie z.B. in Vermilion et al., J. Biol. Chem. 253: 8812 (1978) beschrieben. Die Gesamtreaktion lautet wie folgt: H⁺ + RH + NADPH + O₂ – ROH + NADP⁺ + H₂O
Die Bindung eines Substrats an das katalytische Zentrum von P450 führt anscheinend zu einer Konformationsänderung, die die Elektronenübertragung von CPR an P450 einleitet. Der Übertragung des ersten Elektrons folgt die Bindung von O₂ an den Fe₂ ⁺-P450-Substratkomplex unter Bildung des Fe₃ ⁺-P450-Substratkomplexes. Dieser Komplex wird dann durch ein zweites Elektron von CPR oder, in einigen Fällen, NADH über Cytochrom-b5 und NADH-Cytochrom-b5-Reduktase reduziert, wie z.B. in Guengerich et al., Arch. Biochem. Biophys. 205: 365 (1980) beschrieben. Ein Atom dieses reaktiven Sauerstoffs wird in das Substrat eingeführt, während das andere Atom zu Wasser reduziert wird. Danach dissoziiert das oxygenierte Substrat, wodurch die oxydierte Form des Cytochrom P450 regeneriert wird, wie z.B. in Klassen, Amdur und Doull, Casarett and Doull's Toxicology, Macmillan, New York (1986) beschrieben.
Der P450-Reaktionszyklus läßt sich kurzschließen, so daß O₂ zu O₂ ^– und/oder H₂O₂ reduziert wird, anstatt zur Substratoxygenierung verwendet zu werden. Diese Nebenreaktion wird häufig als „entkoppeln" von Cytochrom P450 bezeichnet, wie z.B. in Kuthen et al., Eur. J. Biochem. 126: 583 (1982) and Poulos et al., FASEB J. 6: 674 (1992). Die Bildung dieser Sauerstoffreste kann zu einer oxidativen Zellschädigung führen, wie z.B. in Mukhopadhyay, J. Biol. Chem. 269 (18): 13390–13397 (1994) und Ross et al., Biochem. Pharm. 49 (7): 979–989 (1995) beschrieben. Es wurde vorgeschlagen, daß die Wirkung des Cytochrom b5 auf die Bindung von P450 an CPR zu einem stabileren Komplex führt, der nicht so leicht „entkoppelt" wird, wie z.B. in Yamazaki et al., Arch. Biochem. Biophys. 325 (2): 174–182 (1996) beschrieben.
P450-Familien werden aufgrund von Proteinsequenzvergleichen zugeordnet. Trotz einer gewissen Heterogenität läßt sich eine praktische Klassifizierung von P450s in Familien aufgrund der Ähnlichkeit der abgeleiteten Aminosäuresequenzen erreichen. Dabei werden P450s mit einer Aminosäuresequenzähnlichkeit zwischen etwa 40–80% als zur gleichen Familie gehörig betrachtet, wobei Sequenzen mit etwa > 55% zur gleichen Unterfamilie gehören. Solche mit einer Sequenzähnlichkeit von etwa < 40% werden im allgemeinen als Mitglieder unterschiedlicher P450-Genfamilien aufgeführt (Nelson, supra). Ein Wert von etwa > 97% wird genommen, um allelische Varianten desselben Gens zu bezeichnen, außer wenn sich dies aufgrund der katalytischen Aktivität, der Sequenzabweichung in nicht translatierten Bereichen der Gensequenz oder der chromosomalen Kartierung nicht bestätigt.
Der am stärksten konservierte Bereich ist der HR2-Konsensus-Bereich, der den unveränderlichen Cysteinrest in der Nähe des Carboxyterminus enthält, der für die Häm-Bindung benötigt wird, wie z.B. in Gotoh et al., J. Biochem. 93: 807–817 (1983) und Motohashi et al., J. Biochem. 101: 879–997 (1987) beschrieben. Zusätzliche Konsensus-Bereiche, einschließlich des zentralen Bereichs der Helix I und des Transmembranbereichs, wurden ebenso identifiziert, wie z.B. in Goeptar et al., supra und Kalb et al., PNAS. 85: 7221–7225 (1988) beschrieben, obwohl das HR2-Cystein die einzige unveränderliche Aminosäure unter den P450s ist.
Kurzkettige (≤ C12) aliphatische Dicarbonsäuren (Disäuren) sind wichtige großtechnische Zwischenververbindungen bei der Herstellung von Diestern und Polymeren und finden Anwendung als thermoplastische Kunststoffe, Weichmacher, Schmiermittel, Hydraulikflüssigkeiten, landwirtschaftliche Chemikalien, Pharmazeutika, Farbstoffe, Tenside und Klebstoffe. Der hohe Preis sowie die begrenzte Verfügbarkeit kurzkettiger Disäuren liegt an durch die existierende chemische Synthese auferlegten Beschränkungen.
Langkettige Disäuren (aliphatische α, ω-Dicarbonsäuren mit einer Kohlenstoffanzahl von 12 oder höher, nachfolgend auch mit Disäuren bezeichnet) (HOOC-(CH₂)_n-COOH) stellen eine vielseitige Familie von Chemikalien mit nachgewiesenem und potentiellem Nutzen in verschiedenen chemischen Produkten, einschließlich Kunststoffen, Klebstoffen und Geruchsstoffen, dar. Unglücklicherweise konnte das volle Marktpotential der Disäuren noch nicht realisiert werden, da durch chemische Verfahren nur eine begrenzte Bandbreite dieser Materialien zu einem relativ hohen Preis produziert wird. Darüber hinaus weisen chemische Verfahren zur Produktion von Disäuren eine Reihe von Beschränkungen und Nachteilen auf. Alle chemischen Verfahren sind auf die Produktion von Disäuren mit spezifischen Kohlenstoffkettenlängen begrenzt. So beginnt beispielsweise das Dodecandisäureverfahren mit Butadien. Die erhaltenen Produkt-Disäuren sind auf Längen von Vielfachen von vier Kohlenstoffatomen beschränkt, wobei in der Praxis lediglich Dodecandisäure hergestellt wird. Das Dodecandisäureverfahren beruht auf nicht erneuerbaren petrochemischen Ausgangsstoffen. Durch den aus mehreren Reaktionen bestehenden Umwandlungsprozeß werden unerwünschte Nebenprodukte produziert, die zu Ausbeuteeinbußen, Verschmutzung mit NO_x und Schwermetallabfällen führen.
Langkettige Disäuren bieten potentielle Vorteile gegenüber kürzerkettigen Disäuren, doch wird durch ihren hohen Verkaufspreis sowie die begrenzte kommerzielle Verfügbarkeit ein weitverbreitetes Wachstum bei vielen dieser Anwendungen verhindert. Die Biokatalyse bietet einen neuartigen Weg zur Überwindung dieser Beschränkungen an, und zwar mit einem Verfahren, mit dem eine große Bandbreite an Disäureprodukten aus erneuerbaren Ausgangsstoffen produziert wird. Es gibt jedoch keinen kommerziell realisierbaren Bioprozeß zur Produktion langkettiger Disäuren aus erneuerbaren Quellen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Es wird eine isolierte Nukleinsäure bereitgestellt, die für ein CPRA-Protein mit der in SEQ ID NO: 83 aufgeführten Aminosäuresequenz codiert. Ebenso wird eine isolierte Nukleinsäure bereitgestellt, die einen durch die Nukleotide 1006–3042, wie in SEQ ID NO: 81 aufgeführt, definierten codierenden Bereich enthält. Es wird ein isoliertes Protein bereitgestellt, das eine wie in SEQ ID NO: 83 aufgeführte Aminosäuresequenz enthält. Es wird ein Vektor bereitgestellt, der eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein CPRA-Protein, einschließlich einer wie in SEQ ID NO: 83 aufgeführten Aminosäuresequenz, codiert. Es wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit der Nukleinsäure, die für ein CPRA-Protein mit einer wie in SEQ ID NO: 83 aufgeführten Aminosäuresequenz codiert, transfiziert oder transformiert wird. Ebenso wird ein Verfahren zur Produktion eines CPRA-Proteins, einschließlich einer wie in SEQ ID NO: 83 aufgeführten Aminosäuresequenz, bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren a) eine geeignete Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 83 aufgeführt ist, codiert, transformiert; und b) die Zelle unter Bedingungen, die die Expression des Proteins begünstigen, kultiviert.
Es wird eine isolierte Nukleinsäure bereitgestellt, die für ein CPRB-Protein mit der in SEQ ID NO: 84 aufgeführten Aminosäuresequenz codiert. Ebenso wird eine isolierte Nukleinsäure bereitgestellt, die einen durch die Nukleotide 1033–3069, wie in SEQ ID NO: 82 aufgeführt, definierten codierenden Bereich enthält. Es wird ein isoliertes Protein bereitgestellt, das eine wie in SEQ ID NO: 84 aufgeführte Aminosäuresequenz enthält. Es wird ein Vektor bereitgestellt, der eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein CPRB-Protein, einschließlich einer wie in SEQ ID NO: 84 aufgeführten Aminosäuresequenz, codiert. Es wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit der Nukleinsäure, die für ein CPRB-Protein mit einer wie in SEQ ID NO: 84 aufgeführten Aminosäuresequenz codiert, transfiziert oder transformiert wird. Ebenso wird ein Verfahren zur Produktion eines CPRB-Proteins, einschließlich einer wie in SEQ ID NO: 84 aufgeführten Aminosäuresequenz, bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren a) eine geeignete Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 84 aufgeführt ist, codiert, transformiert; und b) die Zelle unter Bedingungen, die die Expression des Proteins begünstigen, kultiviert.
Es wird ein Verfahren zur Unterscheidung von Mitgliedern einer Genfamilie durch Quantifizierung der Menge von Ziel-mRNA in einer Probe bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren a) einen ein Zielgen enthaltenden Organismus bereitstellt; b) den Organismus mit einem organischen Substrat kultiviert, das zur Hochregulierung der Aktivität des Zielgens führt; c) eine Probe von Gesamt-RNA aus dem Organismus zu einem ersten Zeitpunkt gewinnt; d) wenigstens einen Teil der Probe der Gesamt-RNA mit einer bestimmten Menge an Konkurrenz-RNA unter Bildung eines RNA-Gemischs kombiniert, wobei die Konkurrenz-RNA eine weitgehende Ähnlichkeit mit der Ziel-mRNA aufweist, jedoch im Vergleich mit der Ziel-mRNA eine geringere Anzahl an Nukleotiden besitzt; e) das RNA-Gemisch mit reverser Transkriptase in einer Menge versetzt, die ausreicht, um die entsprechende Ziel-DNA und Konkurrenz-DNA zu bilden; f) eine Polymerasekettenreaktion in Gegenwart wenigstens eines für wenigstens einen weitgehend nicht homologen Bereich der Ziel-DNA innerhalb der Genfamilie spezifischen Primer durchführt, wobei der Primer auch für die Konkurrenz-DNA spezifisch ist; g) die Schritte (c–f) unter Verwendung steigender Mengen der Konkurrenz-RNA wiederholt, während eine weitgehend konstante Menge an Ziel-RNA beibehalten wird; h) den Punkt bestimmt, an dem die Menge der Ziel-DNA der Menge an Konkurrenz-DNA weitgehend gleicht; i) die Ergebnisse durch Vergleichen des Verhältnisses der Konzentration von unbekanntem Ziel zur bekannten Konzentration des Konkurrenzmoleküls quantifiziert; and j) eine Probe von Gesamt-RNA aus dem Organismus zu einem weiteren Zeitpunkt gewinnt und die Schritte (d–i) wiederholt.
Es wird ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion einer Dicarbonsäure bereitgestellt, bei dem man a) eine Wirtszelle mit einer natürlich vorkommenden Anzahl an CPRA-Genen bereitstellt; b) in der Wirtszelle die Anzahl an CPRA-Genen, die für ein CPRA-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 83 aufgeführt ist, codieren, erhöht; c) die Wirtszelle in ein organisches Substrat, das die Hochregulierung des CPRA-Gens bewirkt, enthaltenden Medien kultiviert, um so die Dicarbonsäureproduktion zu erhöhen.
Es wird ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion eines CPRA-Proteins mit einer wie in SEQ ID NO: 83 aufgeführten Aminosäuresequenz bereitgestellt, bei dem man a) eine natürlich vorkommende Menge an CPRA-Protein aufweisende Wirtszelle mit einer erhöhten Kopienzahl eines CPRA-Gens, das für das CPRA-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 83 aufgeführt ist, codiert, transformiert; und b) die Zelle kultiviert und dadurch die Expression des Proteins im Vergleich mit der einer Wirtszelle, die eine natürlich vorkommende Kopienzahl des CPRA-Gens enthält, erhöht.
Es wird ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion einer Dicarbonsäure bereitgestellt, bei dem man a) eine Wirtszelle mit einer natürlich vorkommenden Anzahl an CPRB-Genen bereitstellt; b) in der Wirtszelle die Anzahl an CPRB-Genen, die für ein CPRB-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 84 aufgeführt ist, codieren, erhöht; c) die Wirtszelle in ein organisches Substrat, das die Hochregulierung des CPRB-Gens bewirkt, enthaltenden Medien kultiviert, um so die Dicarbonsäureproduktion zu erhöhen.
Es wird ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion eines CPRB-Proteins mit einer wie in SEQ ID NO: 84 aufgeführten Aminosäuresequenz bereitgestellt, bei dem man a) eine natürlich vorkommende Menge an CPRB-Protein aufweisende Wirtszelle mit einer erhöhten Kopienzahl eines CPRB-Gens, das für das CPRB-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 84 aufgeführt ist, codiert, transformiert; und b) die Zelle kultiviert und dadurch die Expression des Proteins im Vergleich mit der einer Wirtszelle, die eine natürlich vorkommende Kopienzahl des CPRB-Gens enthält, erhöht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Bei 1 handelt es sich um eine schematische Darstellung des Klonierungsvektors pTriplEx von Clontech^TM Laboratories, Inc. Dabei sind ausgewählte Restriktionsstellen in der Mehrfachklonierungsstelle dargestellt.
Bei 2A handelt es sich um eine Karte des Vektors ZAP Express^TM.
Bei 2B handelt es sich um eine schematische Darstellung des Phagemid-Klonierungsvektors pBK-CMV.
Bei 3 handelt es sich um eine doppelsträngige DNA-Sequenz eines Teils des 5'-codierenden Bereichs des CYP52A5A-Gens (SEQ ID NO: 36).
Bei 4 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform von hochkonservierten Bereichen der Proteinsequenzen der CYP- und CPR-Gene. Helix I stellt die putative Substratbindungsstellung und HR2 den Häm-Bindungsbereich dar. Die FMN-, FAD- und NADPH-Bindungs bereiche sind unterhalb des CPR-Gens angedeutet.
Bei 5 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pHKM1, das das im pTriplEx-Vektor vorhandene verkürzte CPRA-Gen enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 6 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pHKM4, das das im pTriplEx-Vektor vorhandene verkürzte CPRA-Gen enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 7 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pHKM9, das das im pBK-CMV-Vektor vorhandene CPRB-Gen (SEQ ID NO: 82) enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 8 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pHKM11, das das im pBK-CMV-Vektor vorhandene CYP52A1A-Gen (SEQ ID NO: 85) enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 9 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pHKM12, das das im pBK-CMV-Vektor vorhandene CYP52A8A-Gen (SEQ ID NO: 92) enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 10 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pHKM13, das das im pBK-CMV-Vektor vorhandene CYP52D4A-Gen (SEQ ID NO: 94) enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 11 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pHKM14, das das im pBK-CMV-Vektor vorhandene CYP52A2B-Gen (SEQ ID NO: 87) enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 12 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pHKM15, das das im pBK-CMV-Vektor vorhandene CYP52A8B-Gen (SEQ ID NO: 93) enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Die 13A–13D zeigen die vollständigen DNA-Sequenzen, einschließlich der regulatorischen und codierenden Bereiche, für das CPRA-Gen (SEQ ID NO: 81) und das CPRB-Gen (SEQ ID NO: 82) aus C. tropicalis ATCC 20336. Die 13A–13D zeigen die vergleichende Gegenüberstellung der regulatorischen und codierenden Bereiche dieser Sequenzen. Die Sternchensymbole bezeichnen konservierte Nukleotide. Protein codierende Nukleotide sind durch Fettdruck angedeutet; die Start- und Stop-Codons sind unterstrichen.
In 14 ist die Aminosäuresequenz der Proteine CPRA (SEQ ID NO: 83) und CPRB (SEQ ID NO: 84) aus C. tropicalis ATCC 20336 sowie die vergleichende Gegenüberstellung dieser Aminosäuresequenzen gezeigt. Dabei sind Reste, die nicht konserviert sind, durch Sternchensymbole gekennzeichnet.
Die 15A–15M zeigen die vollständigen DNA-Sequenzen, einschließlich regulatorischer und codierender Bereiche, für die folgenden Gene aus C. tropicalis ATCC 20366: CYP52A1A (SEQ ID NO: 85), CYP52A2A (SEQ ID NO: 86), CYP52A2B (SEQ ID NO: 87), CYP52A3A (SEQ ID NO: 88), CYP52A3B (SEQ ID NO: 89), CYP52A5A (SEQ ID NO: 90), CYP52A5B (SEQ ID NO: 91), CYP52A8A (SEQ ID NO: 92), CYP52A8B (SEQ ID NO: 93) und CYP52D4A (SEQ ID NO: 94).
Die 15A–15M zeigen die vergleichende Gegenüberstellung der regulatorischen und codierenden Bereiche dieser Sequenzen. Die Sternchensymbole bezeichnen konservierte Nukleotide. Protein codierende Nukleotide sind durch Fettdruck angedeutet; die Start- und Stop-Codons sind unterstrichen.
Die 16A–16C zeigen die für die Proteine CYP52A1A (SEQ ID NO: 95), CYP52A2A (SEQ ID NO: 96), CYP52A2B (SEQ ID NO: 97), CYP52A3A (SEQ ID NO: 98), CYP52A3B (SEQ ID NO: 99), CYP52A5A (SEQ ID NO: 100), CYP52A5B (SEQ ID NO: 101), CYP52A8A (SEQ ID NO: 102), CYP52A8B (SEQ ID NO: 103) und CYP52D4A (SEQ ID NO: 104) aus C. tropicalis ATCC 20336 codierenden Aminosäuresequenzen. Identische Reste sind durch Sternchensymbole und konservierte Reste durch Pünktchen gekennzeichnet.
Bei 17 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des pTAg-PCR-Produkt-Klonierungsvektors (kommerziell erhältlich von R&D Systems, Minneapolis, MN).
Bei 18 handelt es sich um eine graphische Auftragung des Log-Verhältnisses (U/C) von unbekanntem Ziel-DNA-Produkt zu Konkurrenz-[= competitor]DNA-Produkt gegen die Konzentration von Konkurrenz-mRNA. Die graphische Auftragung wird zur Berechnung der Ziel-Messenger-RNA-Konzentration in einer quantitativen kompetitiven Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (QC-RT-PCR) verwendet.
Bei 19 handelt es sich um einen Graphen, in dem die relative Induktion von C. tropicalis ATCC 20962 aus CYP52A5A (SEQ ID NO: 90) durch Zugabe des Fettsäuresubstrats Emersol^® 267 zum Wachstumsmedium gezeigt ist.
Bei 20 handelt es sich um einen Graphen, in dem die Induktion der Gene CYP52 und CPR aus C. tropicalis ATCC 20962 durch Emersol^® 267 gezeigt ist. Die P450-Gene CYP52A3A (SEQ ID NO: 88), CYP52A3B (SEQ ID NO: 89) und CYP52D4A (SEQ ID NO: 94) werden auf Niveaus exprimiert, die unterhalb der Nachweisgrenze des QC-RT-PCR-Assay liegen.
Bei 21 handelt es sich um ein Schema zur Integration ausgewählter Gene in das Genom von Candida tropicalis-Stämmen und der Rückgewinnung des selektionierbaren Markers URA3A.
Bei 22 handelt es sich um eine schematische Darstellung der Transformation von C. tropicalis H5343 ura3 mit CYP- und/oder CPR-Genen. Dabei braucht nur ein URA3-Locus funktionsfähig zu sein. Es liegen insgesamt 6 mögliche ura3-Ziele vor (5ura3A Loci – 2 pox4-Unterbrechungen, 2 pox-5-Unterbrechungen, 1 ura3A-Locus; und 1 ura3B-Locus).
Bei 23 handelt es sich um die vollständige, URA3A aus C. tropicalis ATCC 20336 codierende DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 105) sowie die Aminosäuresequenz des codierten Proteins (SEQ ID NO: 106).
Bei 24 handelt es sich um eine schematische Darstellung des Plasmids pURAin, dem Basisvektor zur Integration ausgewählter Gene in das Genom von C. tropicalis. Die ausführliche Konstruktion von pURAin wird im Text beschrieben.
Bei 25 handelt es sich um eine schematische Darstellung des Plasmid-Klonierungsvektors pNEB193 (kommerziell erhältlich von New England Biolabs, Beverly, MA).
Bei 26 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pPA15, das das im pTriplEx-Vektor vorhandene verkürzte CYP52A2A-Gen enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 27 handelt es sich um eine schematische Darstellung von pURA2in, der Basenvektor wird in pNEB193 konstruiert, das die 8 Bp langen Erkennungssequenzen für AscI, PacI und PmeI enthält. URA3A (SEQ ID NO: 105) und CYP52A2a (SEQ ID NO: 86) enthalten diese 8 Bp langen Erkennungsstellen nicht. URA3A ist invertiert, so daß das transformierende Fragment vor der Integration versucht zu rezirkularisieren. Zur Transformation von H5343 ura wurde ein AscI/PmeI- Fragment verwendet.
In 28 ist ein Schema zum Nachweis der Integration des CYP52A2A-Gens (SEQ ID NO: 86) in das Genom von H5343 ura gezeigt. In allen Fällen ließ sich die Anzahl der Integrationen durch die Intensität der Hybridisierungsbande widerspiegeln.
Bei 29 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pPA57, das das im pTriplEx-Vektor vorhandene verkürzte CYP52A3A-Gen enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 30 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pPA62, das das im pTriplEx-Vektor vorhandene verkürzte CYP52A3B-Gen enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 31 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pPAL3, das das im pTriplEx-Vektor vorhandene verkürzte CYP52A5A-Gen enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 32 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pPA5, das das im pTriplEx-Vektor vorhandene verkürzte CYP52A5A-Gen enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 33 handelt es sich um eine Darstellung in Diagrammform des Plasmids pPA18, das das im pTriplEx-Vektor vorhandene verkürzte CYP52D4A-Gen enthält. Eine ausführliche Restriktionskarte lediglich des sequenzierten Bereichs ist oben gezeigt. Der Balken deutet das offene Leseraster an. Die Transkriptionsrichtung wird durch einen Pfeil unterhalb des offenen Leserasters angedeutet.
Bei 34 handelt es sich um einen Graphen, der die Expression der Gene CYP52A1 (SEQ ID NO: 85), CYP52A2 (SEQ ID NO: 86) und CYP52A5 (SEQ ID NOS: 90 und 91) aus C. tropicalis 20962 in einem Fermenterlauf nach Zugabe von Mengen des Substrats Ölsäure oder Tridecan in einem „Spiking"-Experiment zeigt.
In 35 ist ein für die Extraktion und Analyse von Disäuren und Monosäuren aus Fermentationsbrühen verwendetes Schema dargestellt.
Bei 36 handelt es sich um einen Graphen, der die Induktion der Expression von CYP52A1A, CYP52A2A und CYP52A5A in einem Fermenterlauf nach Zugabe des Substrats Octadecan zeigt. Unter diesen Bedingungen wurde keine Induktion von CYP52A3A oder CYP52A3B beobachtet.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Disäureproduktivität durch selektive Erhöhung von Enzymen, von denen bekannt ist, daß sie für die Oxidation organischer Substrate, wie z.B. Fettsäuren, aus denen sich das gewünschte Nährmittel zusammensetzt, wichtig sind, verbessert. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden zehn CYP-Gene und zwei CPR-Gene von C. tropicalis identifiziert und charakterisiert, die die Beteiligung an der Katalyse des ersten Schritts im ω-Oxidationsweg durch den ω-Hydroxylase-Komplex betreffen. Darüber hinaus wird ein neuartiger Assay mit einer quantitativen kompetitiven Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (QC-RT-PCR) verwendet, um die Genexpression im Fermenter unter Bedingungen der Induktion mit einem oder mehreren organischen Substraten mit der hier angegebenen Bedeutung zu messen. Auf der Grundlage der QC-RT-PCR-Ergebnisse wurden drei CYP-Gene, CYP52A1, CYP52A2 und CYP52A5, mit größerer Bedeutung für die ω-Oxidation langkettiger Fettsäuren identifiziert. Die Produktivität wird durch Amplifikation der Kopienzahl der CPR-Gene verbessert. Der QC-RT-PCR-Assay deutet an, daß sowohl die CYP- als auch die CPR-Gene unter strenger Regulationskontrolle zu stehen scheinen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Unterscheidung von Mitgliedern einer Genfamilie durch Quantifizierung der Menge an Ziel-mRNA in einer Probe bereitgestellt, bei dem man a) einen ein Zielgen enthaltenden Organismus bereitstellt; b) den Organismus mit einem organischen Substrat kultiviert, das zur Hochregulierung der Aktivität des Zielgens führt; c) eine Probe von Gesamt-RNA aus dem Organismus zu einem ersten Zeitpunkt gewinnt; d) wenigstens einen Teil der Probe der Gesamt-RNA mit einer bestimmten Menge an Konkurrenz-RNA unter Bildung eines RNA-Gemischs kombiniert, wobei die Konkurrenz-RNA eine weitgehende Ähnlichkeit mit der Ziel-mRNA aufweist, jedoch im Vergleich mit der Ziel-mRNA eine geringere Anzahl an Nukleotiden besitzt; e) das RNA-Gemisch mit reverser Transkriptase in einer Menge versetzt, die ausreicht, um die entsprechende Ziel-DNA und Konkurrenz-DNA zu bilden; f) eine Polymerasekettenreaktion in Gegenwart wenigstens eines für wenigstens einen weitgehend nicht homologen Bereich der Ziel-DNA innerhalb der Genfamilie spezifischen Primer durchführt, wobei der Primer auch für die Konkurrenz-DNA spezifisch ist; g) die Schritte (c–f) unter Verwendung steigender Mengen der Konkurrenz-RNA wiederholt, während eine weitgehend konstante Menge an Ziel-RNA beibehalten wird; h) den Punkt bestimmt, an dem die Menge der Ziel-DNR der Menge an Konkurrenz-DNA weitgehend gleicht; i) die Ergebnisse durch Vergleichen des Verhältnisses der Konzentration von unbekanntem Ziel zur bekannten Konzentration des Konkurrenzmoleküls quantifiziert; and j) eine Probe von Gesamt-RNA aus dem Organismus zu einem weiteren Zeitpunkt gewinnt und die Schritte (d–i) wiederholt.
Darüber hinaus wird durch die Modifizierung existierender Promotoren und/oder die Isolierung alternativer Promotoren für eine erhöhte Expression von CYP- und CPR-Genen gesorgt. Starke Promotoren werden aus wenigstens vier Quellen gewonnen: zufällige oder spezifische Modifikationen des CYP52A2-Promotors, CYP52A5-Promotors, CYP52A1-Promotors, die Auswahl eines starken Promotors aus verfügbaren Candida β-Oxidationsgenen, wie z.B. POX4 und POX5 oder Screening zur Selektion eines anderen geeigneten Candida-Promotors.
Die Promotorstärke läßt sich mittels QT-RT-PCR zur Messung der CYP- und CPR-Genexpression in aus Fermentern isolierten Candida-Zellen direkt messen. Zur Bestätigung, daß die erhöhte Promotorstärke sich in einer erhöhten Synthese der entsprechenden Enzyme widerspiegelt, werden enzymatische Assays sowie für CYP- und CPR-Proteine spezifische Antikörper verwendet. Sobald ein geeigneter Promotor identifiziert ist, wird dieser mit den ausgewählten CYP- und CPR-Genen fusioniert und zur Konstruktion eines neuen verbesserten Produktionsstamms in Candida eingeführt. Dabei wird in Betracht gezogen, daß sich der codierende Bereich der CYP- und CPR-Gene mit geeigneten Promotoren oder anderen Regulationssequenzen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, fusionieren läßt.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wurden durch Untersuchungen an C. tropicalis ATCC 20336 sechs einzigartige CYP-Gene sowie vier potentielle Allele identifiziert. QC-RT-PCR-Analysen von im Verlauf der Fermentationsbiokonversionen isolierten Zellen deuten an, daß wenigstens drei der CYP-Gene durch Fettsäuren und wenigstens zwei der CYP-Gene durch Alkane induziert werden. Siehe 34. Zwei CYP-Gene werden stark induziert, was eine Beteiligung am ω-Hydroxylase-Komplex, der den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der Oxidation von Fettsäuren zu den entsprechenden Disäuren katalysiert, andeutet.
Die biochemische Charakterisierung der P450-Enzyme wird jeweils dafür verwendet, den C. tropicalis-Wert an eine optimale Disäureproduktivität anzupassen und P450-Enzyme so auszuwählen, daß sie auf der Grundlage des Fettsäuregehalts des Zulaufs amplifiziert werden. Ein CYP-Gen bzw. CYP-Gene, das bzw. die für P450-Enzyme codieren, die eine niedrige spezifische Aktivität für das gewählte Fettsäure- oder Alkansubstrat aufweisen, codiert bzw. codieren, wird bzw. werden als Ziel für die Inaktivierung gewählt, wodurch die physiologische Belastung der Zelle reduziert wird.
Da gezeigt werden konnte, daß CPR in Hefesystemen einen begrenzenden Faktor darstellen kann, kann das Entfernen nichtessentieller P450s aus dem System von nichtessentiellen P450s verwendete Elektronen freisetzen und diese den für die Disäureproduktivität wichtigen P450s zur Verfügung stellen. Zudem können durch das Entfernen nichtessentieller P450s andere notwendige, jedoch potentiell begrenzende Bestandteile des P450-Systems verfügbar gemacht werden (d.h. verfügbarer Membranraum, Häm und/oder NADPH).
Die Disäureproduktivität wird somit durch selektive Integration, Amplifikation und Überexpression von CYP- und CPR-Genen im C. tropicalis-Produktionswirt verbessert.
Es versteht sich dabei, daß Wirtszellen, in die eine oder mehrere Kopien der gewünschten CYP- und/oder CPR-Gene eingeführt wurden, mit allen dem Fachmann bekannten Techniken dazu gebracht werden können, solche Gene zu enthalten. So gehören zu den geeigneten Wirtszellen beispielsweise Prokaryonten, wie z.B. Bacillus sp., Pseudomus sp., Actinomycetes sp., Eschericia sp., Mycobacterium sp., und Eukaryonten, wie z.B. Hefe, Algen, Insektenzellen, Pflanzenzellen und filamentöse Pilze. Bei den geeigneten Wirtszellen handelt es sich vorzugsweise um Hefezellen, wie z.B. Yarrowia, Bebaromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces und Pichia sowie besonders bevorzugt um diejenigen der Gattung Candida. Zu den bevorzugten Candida-Spezies gehören tropicalis, maltosa, apicola, paratropicalis, albicans, cloacae, guillermondii, intermedia, lipolytica, parapsilosis und zeylenoides. Bestimmte bevorzugte C. tropicalis-Stämme sind in der US-A-5,254,466 aufgeführt.
Zur Transformation oder Transfektion geeigneter Wirtszellen lassen sich Vektoren wie z.B. Plasmide, Phagemide, Phagen oder Cosmide, verwenden. Wirtszellen können auch durch Einführen eines linearen DNA-Vektors bzw. linearer DNA-Vektoren mit der gewünschten Gensequenz in eine Zelle transformiert werden. Eine solche lineare DNA kann vorteilhaft sein, wenn es wünschenswert ist, die Einführung nichtnativer (Fremd-)DNA in die Zelle zu vermeiden. So läßt sich beispielsweise eine aus einem gewünschten Zielgen bzw. gewünschten Zielgenen, das bzw. die von für die Zelle nativen DNA-Sequenzen flankiert wird bzw. werden, bestehende DNA in die Zelle mittels Elektroporation, Lithiumacetattransformation, Sphäroplastierung u.ä. einführen. Flankierende DNA-Sequenzen können selektionierbare Marker und/oder andere Werkzeuge der Gentechnik enthalten.
Ein geeignetes organisches Substrat kann hierbei eine beliebige organische Verbindung sein, die zu einer Mono- oder Polycarbonsäure biooxidierbar ist. Bei einer solchen Verbindung kann es sich um eine beliebige gesättigte oder ungesättigte aliphatische Verbindung oder eine beliebige carbocyclische oder heterocyclische aromatische Verbindung mit wenigstens einer endständigen Methylgruppe, einer endständigen Carboxylgruppe und/oder einer endständigen funktionellen Gruppe, die durch Biooxidation zu einer Carboxylgruppe oxidiert werden kann, handeln. Im Substratmolekül kann eine endständige funktionelle Gruppe, bei der es sich um ein Derivat einer Carboxylgruppe handelt, vorhanden sein und sich über eine Reaktion, die von der Biooxidation verschieden ist, in eine Carboxylgruppe umwandeln lassen. Falls es sich beispielsweise bei der endständigen Gruppe um einen Ester handelt, wobei weder das Wildtyp-C. tropicalis noch die hier beschriebenen genetischen Modifikationen eine Hydrolyse der Esterfunktionalität zu einer Carboxylgruppe gestatten, kann dann während des Fermentationsschritts eine Lipase zugegeben werden, um freie Fettsäuren freizusetzen. Zu geeigneten organischen Substraten gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, gesättigte Fettsäuren, ungesättigte Fettsäuren, Alkane, Alkene, Alkine und Kombinationen daraus.
Als eine Art von gesättigtem organischem Substrat sind hier Alkane geeignet. Dabei können die Alkane linear oder zyklisch, verzweigt- oder geradkettig, substituiert oder nichtsubstituiert sein. Besonders bevorzugt sind diejenigen Alkane, die etwa 4 bis etwa 25 Kohlenstoffatome aufweisen und zu denen beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Butan, Hexan, Octan, Nonan, Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Octadecan u.ä. zählen.
Zu den ungesättigten organischen Substraten, die sich hier verwenden lassen, gehören beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, innere Olefine, wie z.B. 2-Penten, 2-Hexen, 3-Hexen, 9-Octadecen u.ä.; ungesättigte Carbonsäuren, wie z.B. 2-Hexensäure und deren Ester, Ölsäure und deren Ester, einschließlich Triglycerylester mit einem relativ hohen Ölsäuregehalt, Erucasäure und deren Ester, einschließlich Triglycerylester mit einem relativ hohen Erucasäuregehalt, Ricinolsäure und deren Ester, einschließlich Triglycerylester mit einem relativ hohen Ricinolsäuregehalt, Linolsäure und deren Ester, einschließlich Triglycerylester mit einem relativ hohen Linolsäuregehalt; ungesättigte Alkohole, wie z.B. 3-Hexen-1-ol, 9-Octadecen-1-ol u.ä.; ungesättigte Aldehyde, wie z.B. 3-Hexen-1-al, 9-Octadecen-1-al u.ä. Zu den organischen Substraten, die sich hier verwenden lassen, gehören neben den obigen Verbindungen alicyclische Verbindungen mit wenigstens einer internen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung und wenigstens einer endständigen Methylgruppe, einer endständigen Carboxylgruppe und/oder einer endständigen funktionellen Gruppe, die durch Biooxidation zu einer Carboxylgruppe oxidiert werden kann. Zu solchen Verbindungen gehören beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, 3,6-Dimethyl, 1,4-Cyclohexadien; 3-Methylcyclohexen; 3-Methyl-1, 4-Cyclohexadien u.ä.
Zu den aromatischen Verbindungen, die sich hier verwenden lassen, gehören beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Arene, wie z.B. o-, m-, p-Xylen; o-, m-, p-Methylbenzoesäure, Dimethylpyridin u.ä. Das organische Substrat kann ebenso weitere funktionelle Gruppen, die sich zu Carboxylgruppen biooxidieren lassen, wie z.B. eine Aldehyd- oder Alkoholgruppe, enthalten. Das organische Substrat kann auch weitere funktionelle Gruppen enthalten, die nicht zu Carboxylgruppen biooxidierbar sind und die Biooxidation nicht stören, wie z.B. Halogene, Ether u.ä.
Zu den gesättigten Fettsäuren, die Zellen, die die vorliegenden CYP- und CPR-Gene tragen, appliziert werden können, gehören beispielsweise Capronsäure, Önanthsäure, Caprylsäure, Pelargonsäure, Caprinsäure, Undecylsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Pentadecansäure, Palmitinsäure, Margarinsäure, Stearinsäure, Arachinsäure, Beheninsäure sowie Kombinationen daraus. Zu den ungesättigten Fettsäuren, die Zellen, die die vorliegenden CYP- und CPR-Gene tragen, appliziert werden können, gehören beispielsweise Palmitoleinsäure, Ölsäure, Erucasäure, Linolsäure, Linolensäure sowie Kombinationen daraus. Alkane und Alkanfraktionen, zu denen Kettenverknüpfungen von C12 bis C24 in beliebiger Kombination gehören, können appliziert werden. Bevorzugte Fettsäuregemische sind beispielsweise Emersol^® 267 und Tallow, die beide kommerziell von Henkel Chemicals Group, Cincinnati, OH erhältlich sind. Die typische Fettsäurezusammensetzung von Emersol^® 267 und Tallow ist wie folgt:
Die folgenden Beispiele sollen der Veranschaulichung der Erfindung dienen, diese jedoch nicht einschränken. Alle relevanten mikrobiellen Stämme und Plasmide sind in Tabelle 1 bzw. 2 beschrieben.
Tabelle 1. Liste der Escherichia coli- und C. tropicalis-Stämme
Tabelle 2. Liste von aus genomischen Bibliotheken isolierten und zur Verwendung bei den Genintegrationen konstruierten Plasmiden.
Im folgenden handelt es sich bei denjenigen Beispielen, die nicht von den Ansprüchen umfaßt sind, um Referenzbeispiele.
BEISPIEL 1
Reinigung von genomischer DNA aus C. tropicalis ATCC 20336
A. Konstruktion genomischer Bibliotheken
50 ml YEPD-Bouillon (siehe Liste) wurden mit einer Einzelkolonie C. tropicalis 20336 von einer YEPD-Agarplatte angeimpft und über Nacht bei 30°C wachsen gelassen. 5 ml der Übernachtkultur wurden zum Animpfen in 100 ml frische YEPD-Bouillon eingetragen und 4 bis 5 Std. unter Schütteln bei 30°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und in 4 ml Sphäroplastierungspuffer (1 M Sorbit, 50 mM EDTA, 14 mM Mercaptoethanol) resuspendiert und unter leichtem Schütteln 30 min bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 0,5 ml Zymolyase (2 mg/ml; ICN Pharmaceuticals, Inc., Irvine, CA) wurde unter leichtem Schütteln 30 bis 60 min bei 37°C inkubiert. Die Sphäroplastenbildung wurde mittels SDS-Lyse überwacht. Die Sphäroblasten wurden durch kurze Zentrifugation (4.000 UpM, 3 min) geerntet und einmal mit dem Sphäroblastenpuffer ohne Mercaptoethanol gewaschen. Die geernteten Sphäroplasten wurden danach in 4 ml Lysepuffer (0,2 M Tris/pH 8,0, 50 mM EDTA, 1% SDS) der 100 μg/ml RNase (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) enthielt, suspendiert und 30 bis 60 min bei 37°C inkubiert.
Die Proteine wurden denaturiert und zweimal mit einem gleichen Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert, indem die beiden Phasen durch Umdrehen von Hand vorsichtig gemischt wurden. Die beiden Phasen wurden durch 10minütige Zentrifugation bei 10.000 UpM getrennt, und die wäßrige Phase, die hochmolekulare DNA enthielt, wurde gewonnen. Zu der wäßrigen Schicht wurde NaCl mit einer Endkonzentration von 0,2 M gegeben und die DNA durch Zugabe von 2 Vol. Ethanol gefällt. Die gefällte DNA wurde auf einen sauberen Glasstab aufgespult und in TE-Puffer (10 mM Tris/pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und zum Lösen über Nacht bei 4°C stehengelassen. Zu der gelösten DNA wurde von jeglicher DNase-Aktivität freie RNase (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml gegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde Protease (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) mit einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben und 30 min bei 55 bis 60°C inkubiert. Die Lösung wurde einmal mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit dem gleichen Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Zu der wäßrigen Phase wurden 0,1 Vol. 3 M Natriumacetat sowie 2 Volumen an eiskaltem Ethanol (200 Proof) gegeben, und die hochmolekulare DNA wurde auf einen Glasstab aufgespult und in 1 bis 2 ml TE-Puffer gelöst.
B. Genomische DNA-Präparation für die PCR-Amplifikation von CYP- und CPR-Genen
Fünf 5 ml YPD-Medium wurden mit einer Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 30°C wachsen gelassen. Die Kultur wurde 5 min bei 1.200 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet mit 0,5 ml einer Sorbitlösung (0,9 M Sorbit, 0,1 M Tris-Cl pH 8,0, 0,1 M EDTA) versetzt. Das Pellet wurde am Vortex-Schüttler resuspendiert, und das Gemisch wurde mit 1 μl 2-Mercaptoethanol und 50 μl einer Zymolyaselösung (10 μg/ml) versetzt. Das Röhrchen wurde 1 Std. auf einem Rundschüttler (200 UpM) bei 37°C inkubiert. Danach wurde das Röhrchen 5 min bei 1.200 × g zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Protoplastenpellet wurde in 0,5 ml 1 × TE (10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die Protoplasten wurden durch Zugabe von 50 μl 10% SDS und anschließende 20minütige Inkubation bei 65°C lysiert. Als nächstes wurden 200 μl 5 M Kaliumacetat zugegeben, danach wurde gemischt und das Röhrchen mindestens 30 min auf Eis inkubiert. Zelltrümmer wurden durch 5minütiges Zentrifugieren bei 13.000 × g entfernt. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und in neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die DNA wurde durch Zugabe von 1 ml 100% (200 Proof) Ethanol gefällt und anschließend 5 min bei 13.000 × g zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde mit 1 ml 70% Ethanol gewaschen und anschließend 5 min bei 13.000 × g zentrifugiert. Nach teilweisem Trocknen der DNA im Vakuum wurde diese in 200 μl 1 × TE resuspendiert. Die DNA-Konzentration wurde über das Verhältnis der Absorptionen bei 260 nm/280 nm A_260/280) bestimmt.
BEISPIEL 2
Konstruktion genomischer Bibliotheken von C. tropicalis 20336
Es wurden drei genomische Bibliotheken von C. tropicalis konstruiert, und zwar zwei bei Clontech Laboratories, Inc., (Palo Alto, CA) und eine bei Henkel Corporation (Cincinnati, OH).
A. Clontech-Bibliotheken
Die erste Clontech-Bibliothek wurde wie folgt hergestellt: genomische DNA wurde aus C. tropicalis 20336 wie oben beschrieben präpariert, teilweise mit EcoRI verdaut und mittels Gelelektrophorese größenfraktioniert, um Fragmente mit einer Größe von weniger als 0,6 kb auszuschließen. Nach der Größenfraktionierung wurden mehrere Ligationen der genomischen EcoRI-DNA-Fragmente und der Lambda-(λ)-TriplEX^TM-Vektorarme (1) mit klebrigen EcoRI-Enden unter Bedingungen, bei denen eine Million unabhängige Klone erhalten werden sollten, in λ-Phagenköpfe verpackt. Die zweite genomische Bibliothek wurde wie folgt konstruiert: genomische DNA wurde teilweise mit Sau3AI verdaut und mittels Gelelektrophorese größenfraktioniert. Die DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von Standardvorschriften, wie z.B. in Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Press, USA (1989), hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben, mit stumpfen Enden versehen. Die Strategie bestand darin, die überstehenden Sau3AI-Enden mit Klenow-Polymerase (Life Technologies, Grand Island, NY) aufzufüllen und danach eine Verdauung mit S1-Nuklease (Life Technologies, Grand Island, NY) durchzuführen. Nach der Verdauung mit S1-Nuklease wurden die Fragmentenden nochmals mit Klenow-Polymerase aufgefüllt, um die endgültigen stumpfendigen DNA-Fragmente zu erhalten. An diese stumpfendigen DNA-Fragmente wurden EcoRI-Linker ligiert, und danach wurde eine Ligation in den λTriplEX-Vektor durchgeführt. Die erhaltene Bibliothek enthielt ungefähr 2 × 10⁶ unabhängige Klone mit einer durchschnittlichen Insertionsgröße von 4,5 kb.
B. Henkel-Bibliothek
Die dritte genomische Bibliothek wurde bei Henkel Corporation unter Verwendung des Vektors λZAP Express^TM (Stratagene, La Jolla, CA) (2) konstruiert. Genomische DNA wurde mit Sau3AI teilweise verdaut, und Fragmente im Bereich von 6 bis 12 kb wurden aus einem Agarosegel nach Elektrophorese der verdauten DNA gereinigt. Diese DNA-Fragmente wurden dann mit BamHI verdauten λZAP Express^TM-Vektorarmen gemäß den Vorschriften des Herstellers ligiert. Drei Ligationen wurden angesetzt, um ungefähr 9,8 × 10⁵ unabhängige Klone zu erhalten. Alle drei Bibliotheken wurden vereinigt und gemäß den Angaben des Herstellers unter Erhalt von Stammlösungen mit hohem Titer (> 10⁹ plaque forming units/ml [= Plaque-bildende Einheiten]/ml) zur Langzeitlagerung amplifiziert. Der Titer der verpackten Phagenbibliothek wurde nach Infektion von E. coli XL1Blue-MRF'-Zellen bestimmt. E. Coli XL1Blue-MRF' wurden über Nacht entweder in LB-Medium oder NZCYM (Liste) mit 10 mM MgSO₄ und 0,2% Maltose bei 37°C bzw. 30°C unter Schütteln wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und 0,5 bis 1 Volumen 10 mM MgSO₄ resuspendiert. 200 μl dieser E. coli-Kultur wurden mit mehreren Verdünnungen der verpackten Phagenbibliothek gemischt und 15 min bei 37°C inkubiert. Dieses Gemisch wurde mit 2,5 ml LB-Top-Agarose oder NZCYM-Top-Agarose (auf 60°C temperiert) (siehe Liste) versetzt und auf in 82-mm-Petrischalen vorgelegtem LB-Agar oder NCZYM-Agar (siehe Liste) ausplattiert. Man ließ den Phagen zur Vermehrung bei 37°C über Nacht inkubieren, so daß diskrete Plaques erhalten wurden, und danach wurde der Phagentiter bestimmt.
BEISPIEL 3
Screening von genomischen Bibliotheken
Bei den beiden Vektoren λTriplEx^TM und λZAP Express^TM handelt es sich jeweils um Phagemidvektoren, die sich entweder als Phage oder als Plasmid-DNA (nach Konvertierung des Phagen zum Plasmid) vermehren lassen. Daher lassen sich die in diesen Vektoren konstruierten genomischen Bibliotheken entweder einem Screening durch Plaque-Hybridisierung (Screening der Lambda-Form der Bibliothek) oder durch Koloniehybridisierung (Screening der Plasmidform der Bibliothek nach Konvertierung des Phagen zum Plasmid) unterziehen. Beide Vektoren sind in der Lage, die klonierten Gene zu exprimieren, wobei der Hauptunterschied im Mechanismus des Ausschneidens des Plasmids aus der Phagen-DNA besteht. Die Klonierungsstelle in λTriplEx^TM ist innerhalb eines Plasmids lokalisiert, daß im Phagen vorhanden ist und von einer loxP-Stelle flankiert ist (1). Wird λTriplEx^TM in den E. coli-Stamm BM25.8 (bezogen von Clontech) eingeführt, so fördert die in BM25.8 vorhandene Cre-Rekombinase das Ausschneiden und die Zirkularisierung des Plasmids pTriplEx aus dem Phagen λTriplEx^TM an den loxP-Stellen. Der Mechanismus des Ausschneidens des Plasmids pBK-CMV aus dem Phagen λZAP Express^TM verläuft anders. Es benötigt die Unterstützung eines Helferphagen, wie z.B. ExAssist^TM (Stratagene) und eines E. coli-Stamms wie etwa XLOR (Stratagene). Sowohl pTriplEx als auch pBK-CMV können autonom in E. coli replizieren.
A. Screening von genomischen Bibliotheken (Plasmidform) 1) Kolonienabdrucke [Colony Lifts]
Eine Einzelkolonie von E. coli BM25.8 wurde zum Animpfen in 5 ml LB mit 50 μg/ml Kanamycin, 10 mM MgSO₄ und 0,1% Maltose eingetragen und über Nacht bei 31°C, 250 UpM wachsen gelassen. 200 μl dieser Übernachtkultur (~4 × 10⁸ Zellen) wurden mit 1 μl Phagenbibliothek (2–5 × 10⁶ plaque forming units) und 150 μl LB-Bouillon versetzt und 30 min bei 31°C inkubiert, wonach 400 μl LB-Bouillon zugegeben wurden und 1 h bei 31°C, 225 UpM inkubiert wurde. Diese Bakterienkultur wurde verdünnt und auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) und Kanamycin (Sigma Chemical Company) ausplattiert, so daß 500 bis 600 Kolonien/Platte erhalten wurden. Die Platten wurden 6 bis 7 Std. bei 37°C inkubiert, bis die Kolonien sichtbar wurden. Die Platten wurden danach 1,5 h bei 4°C gelagert, bevor ein „Colony/Plaque Screen^TM Hybridization Transfer Membrane"-Scheibchen (DuPont NEN Reasearch Products, Boston, MA) so auf die Platte aufgelegt wurde, daß sie mit den Bakterienkolonien in Kontakt trat. Man ließ den Transfer der Kolonien auf die Membran 3 bis 5 min von statten gehen. Danach wurde die Membran abgehoben und auf eine frische LB-Agarplatte (siehe Liste) mit 200 μg/ml Chloramphenicol aufgelegt, wobei die den Bakterienkolonien ausgesetzte Seite nach oben zeigte. Die Platten mit den Membranen wurden danach über Nacht bei 37°C inkubiert, um die vollständige Entwicklung der Bakterienkolonien zu gestatten. Die LB-Agarplatten, von denen die Kolonien ursprünglich abgehoben worden waren, wurden bei 37°C über Nacht inkubiert und zur weiteren Verwendung bei 4°C aufbewahrt. Am folgenden Morgen wurden die Membranen mit den Bakterienkolonien abgehoben und auf zwei Lagen Whatman 3M-Papier (Whatman, Hillsboro, OR), das mit 0,5 N NaOH gesättigt war, aufgelegt und 3 bis 6 min zur Lyse der Zellen bei Raumtemperatur (RT) stehengelassen. Die weitere Behandlung der Membranen erfolgte wie in der von NEN Research Products bereitgestellten Vorschrift beschrieben.
2) DNA Hybridisierungen
Über Nacht getrocknete Membranen wurden an Oligonukleotidsonden hybridisiert, die unter Verwendung eines nichtradioaktiven ECL^TM-3'-Oligomarkierungs- und -Nachweissystems von Amersham Life Sciences (Arlington Heights, IL) hergestellt wurden. Die Markierung der DNA, Vorhybridisierung und die Hybridisierungen erfolgten gemäß den Vorschriften des Herstellers. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen zweimal bei Raumtemperatur in 5 × SSC, 0,1% SDS (in einem 2 ml/cm² Membran entsprechenden Volumen) jeweils 5 min gewaschen, wonach zwei Waschschritte von jeweils 15 min bei 50°C in 1 × SSC, 0,1% SDS (in einem 2 ml/cm² Membran entsprechenden Volumen) erfolgten. Danach wurde das Hybridisierungssignal mit Hyperfilm ECL^TM (Amersham) gemäß den Vorschriften des Herstellers erzeugt und nachgewiesen. Die Membranen wurden auf Bakterienkolonien enthaltenden Platten, von denen Kolonieabdrücke gemacht worden waren, entsprechend ausgerichtet aufgelegt, wonach Kolonien, die positiven Signalen auf dem Röntgenfilm entsprachen, isoliert und in LB-Bouillon vermehrt wurden. Von diesen Kulturen wurden Plasmid-DNAs isoliert und durch Restriktionsenzymverdauungen und DNA-Sequenzierung analysiert.
B. Screening von genomischen Bibliotheken (Plaque-Form)
1) Ausplattieren der λ-Bibliothek
E. coli XL1Blue-MRF'-Zellen wurden über Nacht in LB-Medium (25 ml) mit 10 mM MgSO₄ und 0,2% Maltose bei 37°C, 250 UpM wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann zentrifugiert (10 min bei 2.200 × g) und in 0,5 Volumen 10 mM MgSO₄ resuspendiert. 500 μl dieser E. coli-Kultur wurden mit einer Phagensuspension, die 25.000 amplifizierte Lambda-Phagenpartikel enthielt, gemischt und 15 min bei 37°C inkubiert. Zu diesem Gemisch gab man 6,5 ml NZCYM-Top-Agarose (auf 60°C temperiert) (siehe Liste) und plattierte danach auf in einer 150-mm-Petrischale vorgelegte 80–100 ml NCZYM-Agar (siehe Liste) aus. Man ließ den Phagen zur Vermehrung über Nacht bei 37°C inkubieren, so daß diskrete Plaques erhalten wurden. Nach dem Wachstum über Nacht wurden die Platten in einem Kühlschrank 1–2 Std. gelagert, bevor die Plaque-Abdrucke durchgeführt wurden.
2) Plaque-Abdruck und DNA-Hybridisierungen
Magna Lift^TM-Nylonmembranen (Micron Separations, Inc., westborough, MA) wurden so auf die Agaroberfläche aufgelegt, daß sie mit λ-Plaques vollständig in Kontakt waren, wonach man den Transfer der Plaques auf die Nylonmembranen 5 min bei RT ablaufen ließ. Nach dem Plaque-Transfer wurde die Membran auf 2 Lagen Whatman 3M^TM-Filterpapier (Whatman, Hillsboro, OR), daß mit einer Lösung von 0,5 N NaOH, 1,0 M NaCl gesättigt war, aufgelegt und zur Denaturierung der DNA 10 min bei RT stehengelassen. Überschüssige Denaturierungslösung wurde durch kurzes Ablöschen auf trockenem Whatman 3M-Papier entfernt. Die Membranen wurden dann auf 2 Lagen Whatman 3M^TM-Papier, daß mit 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl gesättigt war, überführt und zur Neutralisierung 5 min stehengelassen. Die Membranen wurden danach kurz in 200–500 ml 2 × SSC gewaschen, an der Luft getrocknet und 30–40 min bei 80°C gebacken. Danach wurden die Membranen mit markierter DNA sondiert.
Die Membranen wurden mit 200–500 ml einer Lösung von 5 × SSC, 0,5% SDS, 1 mM EDTA (pH 8,0) 1–2 Std. bei 42°C unter Schütteln (60 UpM) vorgewaschen, um die Membranen von Bakterienresten zu befreien. Die Membranen wurden 1–2 Std. bei 42°C mit ECL Gold^TM-Puffer (Amersham)(in einem 0,125–0,25 ml/cm² Membran entsprechenden Volumen) mit 0,5 M NaCl und 5% Blockierungsreagenz vorhybridisiert. Als Sonden verwendete DNA-Fragmente wurden aus Agarosegel unter Verwendung eines QIAEX II^TM-Gelextraktionskits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) gemäß der Vorschrift des Herstellers gereinigt und mit einem direkten Amersham ECL^TM-Nukleinsäuremarkierungskit (Amersham) markiert. Die markierte DNA (5–10 ng/ml Hybridisierungslösung) wurde auf die vorhybridisierten Membranen gegeben, und man ließ die Hybridisierung über Nacht ablaufen. Am folgenden Tag wurden die Membranen unter Schütteln (60 UpM) zweimal für jeweils 20 min bei 42°C in einem Puffer (in einem 2 ml/cm² Membran entsprechenden Volumen), der entweder 0,1 (hohe Stringenz) oder 0,5 (niedrige Stringenz) × SSC, 0,4% SDS und 360 g/l Harnstoff enthielt, gewaschen. Danach erfolgten zwei 5minütige Waschschritte bei Raumtemperatur in 2 × SSC (in einem 2 ml/cm² Membran entsprechenden Volumen). Die Hybridisierungssignale wurden mit dem ECL^TM-Nukleinsäurenachweisreagenz erzeugt und mit Hyperfilm ECL^TM (Amersham) nachgewiesen.
Agarpfropfen, die Plaques enthielten, die positiven Signalen auf dem Röntgenfilm entsprachen, wurden den Ausgangsplatten unter Verwendung des breiten Endes einer Pasteur-Pipette entnommen. Die Plaques wurden ausgewählt, indem die Platten an dem Röntgenfilm ausgerichtet wurden. Bei diesem Schritt wurden im allgemeinen mehrere Plaques entnommen. Die Phagenpartikel wurden aus den Agarpfropfen durch Einweichen in 1 ml SM-Puffer (Sambrook et al., supra) über Nacht eluiert. Das Phageneluat wurde danach verdünnt und mit frisch gewachsenen E. coli XL1Blue-MRF-Zellen ausplattiert, so daß 100–500 Plaques pro 85-mm-NCZYM-Agarplatte erhalten wurden. Die Plaques wurden wie zuvor auf Magna Lift-Nylonmembranen überführt und wiederum unter Verwendung dergleichen Sonden sondiert. Einzelne gut isolierte Plaques, die Signalen auf dem Röntgenfilm entsprachen, wurden durch Entnehmen von Agarpfropfen und Elution des Phagen durch Einweichen über Nacht in 0,5 ml SM-Puffer gepickt.
C. Konvertierung von λ-Klonen zur Plasmidform
Die isolierten Lambda-Klone wurden zur weiteren Analyse zur Plasmidform konvertiert. Die Konvertierung von der Plaque- zur Plasmidform erfolgte durch Infizieren der Plaques in den E. coli-Stamm BM25.8. Der E. coli-Stamm wurde über Nacht bei 31°C, 250 UpM in LB-Bouillon mit 10 mM MgSO₄ und 0,2% Maltose wachsen gelassen, bis eine OD₆₀₀ von 1,1–1,4 erreicht wurde. Zehn Milliliter der Übernachtkultur wurden abgenommen und mit 100 μl 1 M MgCl₂ gemischt. Ein Volumen von 200 μl Zellen wurde abgenommen, mit 150 μl der eluierten Phagensuspension gemischt und 30 min bei 31°C inkubiert. Nach Zugabe von LB-Bouillon (400 μl) in das Röhrchen wurde die Inkubation 1 Std. unter Schütteln bei 250 UpM bei 31°C fortgesetzt. 1–10 μl der infizierten Zellsuspension wurde auf LB-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin (Sigma, St. Louis, MO) ausplattiert. Gutisolierte Kolonien wurden gepickt und in 5 ml LB-Bouillon mit 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C, 250 UpM über Nacht wachsen gelassen. Aus diesen Kulturen wurde Plasmid-DNA isoliert und analysiert. Zur Konvertierung des Vektors λZAP Express^TM zur Plasmidform wurden die E. coli-Stämme XL1Blue-MRF' und XLOR verwendet. Die Konvertierung erfolgte gemäß den Vorschriften des Herstellers (Stratagene) für das Ausschneiden von Einzelplaques.
BEISPIEL 4
Transformation von C. tropicalis H5343 ura^–
A. Transformation von C. tropicalis H5343 mit Elektroporation
5 ml YEPD wurden mit C. tropicalis H5343 ura^– aus einer gefrorenen Stammlösung angeimpft und über Nacht auf einem Schüttler (New Brunswick) bei 30°C und 170 UpM inkubiert. Am nächsten Tag wurden 10 μl der Übernachtkultur zum Animpfen in 100 ml YEPD eingetragen, und das Wachstum wurde bei 30°C, 170 UpM fortgesetzt. Am folgenden Tag wurden die Zellen bei einer OD₆₀₀ von 1,0 geerntet und das Zellpellet einmal mit sterilem eiskaltem Wasser gewaschen. Die Zellen wurden in eiskaltem sterilem 35% Polyethylenglycol (4.000 MW) auf eine Dichte von 5 × 10⁸ Zellen/ml resuspendiert. Für die Elektroporation wurde jeweils ein 0,1 ml großes Volumen von Zellen verwendet. Es wurde nach der folgenden Elektroporationsvorschrift vorgegangen: 1,0 μg transformierende DNA wurde zu 0,1 ml Zellen zusammen mit 5 μg denaturierter, gescherter Kalbsthymus-DNA gegeben, und man ließ das Gemisch zur Inkubation 15 min auf Eis stehen. Die Zellösung wurde danach in eine eiskalte 0,2-cm-Elektroporationsküvette überführt, die dann aufgeklopft wurde, um sicherzustellen, daß sich die Lösung am Boden der Küvette befand, und die Elektroporation durchgeführt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Elektroporationsgeräts von Invitrogen (Carlsbad, CA) bei 450 Volt, 200 Ohm und 250 μF elektroporiert. Nach der Elektroporation wurde 0,9 ml SOS-Medium (1 M Sorbit, 30% YEPD, 10 mM CaCl₂) zu der Suspension gegeben. Die erhaltene Kultur wurde 1 Std. bei 30°C, 170 UpM, wachsen gelassen. Nach der Inkubation wurden die Zellen durch 5minütige Zentrifugation bei 1.500 × g sedimentiert. Die elektroporierten Zellen wurden in 0,2 ml 1 M Sorbit resuspendiert und auf synthetischem Vollmedium minus Uracil (Sc-uracil)(Nelson, supra) ausplattiert. In einigen Fällen wurden die elektroporierten Zellen direkt auf SC-uracil ausplattiert. Das Wachstum der Transformanten wurde 5 Tage lang überwacht. Nach drei Tagen wurden mehrere Transformanten gepickt und zur Präparation von genomischer DNA und zum Screening auf SC-uracil-Platten überführt.
B. Transformation von C. tropicalis unter Verwendung von Lithiumacetat
Die folgende Vorschrift wurde zur Transformation von C. tropicalis gemäß den in Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 5, 13.7.1 (1989), hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschriebenen Vorgehensweisen verwendet.
5 ml YEPD wurden mit C. tropicalis H5343 ura- aus einer eingefrorenen Stammlösung angeimpft und über Nacht auf einem Schüttler (New Brunswick) bei 30°C und 170 UpM inkubiert. Am nächsten Tag wurden 50 ml YEPD mit 10 μl der Übernachtkultur angeimpft und das Wachstum wurde bei 30°C, 170 UpM fortgesetzt. Am folgenden Tag wurden die Zellen bei einer OD₆₀₀ von 1,0 geerntet. Die Kultur wurde in ein 50 ml Polypropylenröhrchen überführt und 10 min bei 1000 × g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml sterilem TE (10 mM Tris-Cl und 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert. Die Zellen wurden wiederum 10 min bei 1.000 × g zentrifugiert, und das Zellpellet wurde in 10 ml einer sterilen Lithiumacetatlösung [LiAc (0,1 M Lithiumacetat, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA)] resuspendiert. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 1.000 × g wurde das Pellet in 0,5 ml LiAc resuspendiert. Diese Lösung wurde 1 Stunde bei 30°C unter leichtem Schütteln bei 50 UpM inkubiert. Eine 0,1 ml große Portion dieser Suspension wurde mit 5 μg transformierender DNA bei 30°C ohne Schütteln 30 min inkubiert. Es wurde mit 0,7 ml PEG-Lösung (40% w/v) Polyethylenglycol 3340, 0,1 M Lithiumacetat, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) versetzt und 45 min bei 30°C inkubiert. Die Röhrchen wurden danach 5 min bei 42°C stehengelassen. Eine 0,2 ml große Portion wurde auf synthetischem Vollmedium minus Uracil (Sc-uracil)(Kaiser et al. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1994) ausplattiert. Das Wachstum der Transformanten wurde 5 Tage lang beobachtet. Nach 3 Tagen wurden mehrere Transformanten gepickt und zur Präparation und zum Screening von genomischer DNA auf SC-uracil-Platten übertragen.
BEISPIEL 5
Isolierung von Plasmid-DNA
Plasmid-DNA wurde aus E. coli-Kulturen unter Verwendung eines Plasmid-Isolationskits von Qiagen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert.
BEISPIEL 6
DNA-Sequenzierung und -Analyse
Die DNA-Sequenzierung wurde bei der Firma Sequetech Corporation (Mountain View, CA) unter Verwendung eines automatischen Sequenziergeräts von Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, CA) durchgeführt. Die DNA-Sequenzen wurden mit den Software-Paketen MacVector und GeneWorks (Oxford Molecular Group, Campbell, CA) analysiert.
BEISPIEL 7
PCR-Protokolle
Die PCR-Amplifikation wurde in einem Thermocycler-Gerät von Perkin Elmer unter Verwendung des Enzymkits AmpliTaqGold (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) gemäß den Vorgaben des Herstellers durchgeführt. In einigen Fällen wurden nach der erfolgreichen Amplifikation die Produkte mit den entsprechenden Enzymen verdaut und unter Verwendung von QiaexII (Qiagen, Chatsworth, CA) wie vom Hersteller angegeben über ein Gel gereinigt. In besonderen Fällen wurde die Ultma-Taq-Polymerase (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) oder die Expand Hi-Fi-Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers oder wie in Tabelle 3 angegeben verwendet.
Tabelle 3. Mit verschiedenen Primer-Kombinationen verwendete PCR-Amplifikationsbedingungen
Die nachfolgende Tabelle 4 enthält eine Liste von Primern (SEQ ID NOS: 1–35), die für die PCR-Amplifikation zur Konstruktion von Genintegrationsvektoren oder zur Erzeugung von Sonden für den Nachweis und die Isolierung von Genen verwendet wurden.
Tabelle 4. Primer-Tabelle für PCR-Amplifikation zur Konstruktion von Gen-Integrationsvektoren, zur Erzeugung von Sonden für die Isolierung und den Nachweis von Genen und zur Gewinnung der DNA-Sequenz von Konstrukten. (A-Desoxyadenosintriphosphat [dATP], G-Desoxyguanosintriphosphat [dGTP], C-Desoxycytidintriphosphat [cCTP], T-Desoxythymidintriphosphat [dTTP], Y-dCTP oder dTTP, R-dATP oder dGTP, W-dATP oder dTTP, M-dATP oder dCTP, N-dATP oder dCTP oder dGTP oder dTTP).
BEISPIEL 8
Hefekolonie-PCR-Verfahren zur Bestätigung der Genintegration in das Genom von C. tropicalis
Hefe-Einzelkolonien wurden von der Oberfläche der Transformationsplatten aufgenommen, in 50 μl Sphäroplastierungspuffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,0 mg/ml Zymolyase, 5% Glyzerin) suspendiert und 30 min bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Lösung zur Lyse der Zellen 10 min bei 95°C erhitzt. Fünf μl dieser Lösung wurden als Matrize in der PCR verwendet. Die Taq-Polymerase Expand Hi-Fi (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde gekoppelt mit einem genspezifischen Primer (zu integrierendes Gen) sowie einem URA3-Primer in der PCR verwendet. Falls eine Integration eintreten sollte, so würde die Amplifikation ein PCR-Produkt der vorhergesagten Größe ergeben, was das Vorhandensein eines integrierten Gens bestätigen würde.
BEISPIEL 9
Fermentationsverfahren für Geniaduktionsuntersuchungen
In einem Fermenter wurde ein halbsynthetisches Wachstumsmedium mit der Zusammensetzung 75 g/l Glucose (wasserfrei), 6,7 g/l Yeast Nitrogen Base (Difco Laboratories), 3 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Ammoniumsulfat, 2 g/l Monokaliumphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid vorgelegt. Die Komponenten wurden als konzentrierte Lösungen zum Autoklavieren hergestellt und danach nach Abkühlen in den Fermenter gegeben: endgültiger pH-Wert ungefähr 5,2. Diese vorgelegte Lösung wurde mit 5–10% einer Übernachtkultur von C. tropicalis ATCC 20962, hergestellt in YM-Medium (Difco Laboratories), wie in den Verfahren der Beispiele 17 und 20 des US-Patents 5,254,466, daß hiermit mit Bezugnahme aufgenommen ist, beschrieben, angeimpft. Bei C. tropicalis ATCC 20962 handelt es sich um C. tropicalis ATCC 20336 mit POX-4 und POX-5-Unterbrechung. Die Lösung wurde belüftet und bewegt, damit eine Sättigung mit gelöstem Sauerstoff von mehr als etwa 40% gegenüber Luft aufrechterhalten werden konnte. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 5N Natronlauge nach pH-Kontrolle bei etwa 5,0 bis 8,5 gehalten. Sowohl ein Zustrom von Fettsäure (in diesem Beispiel: kommerzielle Ölsäure), dessen typische Zusammensetzung wie folgt war: 2,4% C₁₄; 0,7% C_14:1; 4,6% C₁₆; 5,7% C_16:1; 5,7% C_17:1; 1,0% C₁₈; 69,9% C_18:1; 8,8% C_18:2; 0,30% C_18:3, 0,90% C_20:1 sowie eine Zufuhr von Glucose als Kosubstrat wurden mit Beginn in der Nähe des Endpunkts des exponentiellen Wachstums im Feedbatch-Modus hinzugefügt. Während der Biokonvertierung von Fettsäuren zu Disäuren wurde nach pH-Kontrolle Lauge zugegeben, um den pH-Wert im gewünschten Bereich zu halten. Typischerweise wurden die Proben für die Geninduktionsuntersuchungen unmittelbar vor dem Start der Fettsäurezufuhr und über die ersten 10 Stunden der Biokonvertierung gesammelt. Die Bestimmung des Fettsäure- und Disäuregehalts wurde nach einer Methylester-Standardvorschrift unter Verwendung der Gas-Flüssigkeitschromatographie (GLC) bestimmt. Die Geninduktion wurde unter Verwendung des in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen QC-RT-PCR-Protokolls gemessen.
BEISPIEL 10
RNA-Präparation
Der erste Schritt dieser Vorschrift beinhaltet die Isolierung von zellulärer Gesamt-RNA aus Kulturen von C. tropicalis. Die zelluläre RNA wurde unter Verwendung des Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) wie folgt isoliert: 2 ml große Proben von C. tropicalis-Kulturen wurden aus dem Fermenter zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach Zugabe des Fettsäure- oder Alkansubstrats in einem 2-ml-Standard-röhrchen im Eppendorf-Stil mit Schraubverschluß gesammelt. Die Zellproben wurden unmittelbar nach ihrer Ernte aus dem Fermenter in flüssigem Stickstoff oder einem Trockeneis/Alkohol-Bad eingefroren. Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Proben ließ man die Röhrchen auf Eis auftauen und sedimentierte die Zellen in einer Microzentrifuge durch 5minütige Zentrifugation bei 4°C, wobei der Überstand verworfen wurde, während das Pellet bei eiskalter Temperatur gehalten wurde. Die Mikrozentrifugenröhrchen wurden mit eiskalten Zirconia/Silica-Kügelchen (Durchmesser: 0,5 mm, Biospec Products, Bartelsville, OK) auf 203 und danach mit eiskaltem RLT*Lysepuffer bis zum Rand gefüllt (*: Puffer im Qiagen RNeasy Mini Kit enthalten). Der Zellaufschuß wurde erreicht, indem die Proben in ein Mini-„Beadbeater"-Gerät [Kugelmühle](Biospec Products, Bartelsville, OK) überführt und unmittelbar danach bei voller Geschwindigkeit 2,5 min homogenisiert wurden. Man ließ die Proben in einem Eiswasserbad 1 Minute lang abkühlen, wonach der Homogenisierungs-/Abkühlungsvorgang noch zweimal mit einer Gesamthomogenisierungszeit von 7,5 min im Beadbeater wiederholt wurde. Die homogenisierten Zellproben wurden bei voller Geschwindigkeit 10 min in einer Microzentrifuge zentrifugiert, wonach 700 μl des RNA-haltigen Überstands abgenommen und in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt wurden. Nach Zugabe von jeweils 700 μl 70% Ethanol zu den Proben wurde durch Umdrehen gemischt. Dieser Schritt sowie alle nachfolgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Von den mit Ethanol behandelten Proben wurden jeweils 700 Mikroliter auf eine Qiagen RNeasy „Spin Column" [unter Zentrifugalkraft betriebene Säule] überführt, wonach 15 s bei 8.000 × g zentrifugiert wurde. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule erneut mit der restlichen Probe (700 μl) geladen und nochmals 15 s bei 8.000 × g zentrifugiert. Die Säule wurde einmal mit 700 μl Puffer RW1* gewaschen und 15 s bei 8.000 × g zentrifugiert, wobei der Durchlauf verworfen wurde. Die Säule wurde in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen gegeben und mit 500 μl RPE*-Puffer gewaschen, wobei der Durchlauf verworfen wurde. Der RPE*-Waschschritt wurde mit einer Zentrifugation für 2 min bei 8.000 × g wiederholt und der Durchlauf verworfen. Die Spin Column wurde in ein neues 1,5-ml-Sammelröhrchen überführt und mit 100 μl RNase-freiem Wasser versetzt, wonach 15 s bei 8.000 × g zentrifugiert wurde. Nach Zugabe von weiteren 75 μl RNase-freiem Wasser in die Säule wurde 2 min bei 8.000 × g zentrifugiert. Die im Wasserdurchlauf eluierte RNA wurde zur weiteren Reinigung gesammelt.
Das RNA-Eluat wurde danach zur Abtrennung von verunreinigender DNA behandelt. Dazu wurde die RNA-Probe mit zwanzig Mikrolitern 10 × -DNase-I-Puffer (0,5 M Tris (pH 7,5), 50 mM CaCl₂, 100 mM MgCl₂, 10 μl RNase-freier DNase I (2 Einheiten/μl, Ambion Inc., Austin, Texas) und 40 Einheiten Rnasin (Promega Corporation, Madision, Wisconsin) versetzt. Danach wurde das Gemisch 15 bis 30 min bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden auf Eis gestellt und mit 250 μl Lysepuffer RLT* sowie 250 μl Ethanol (200 Proof) versetzt. Die Proben wurden danach durch Umdrehen gemischt. Nach Überführen der Proben auf Qiagen RNeasy Spin Columns wurde 15 s bei 8.000 × g zentrifugiert, wobei der Durchlauf verworfen wurde. Die Säulen wurden in neue 2-ml-Sammelröhrchen gegeben und zweimal mit 500 μl RPE*-Waschpuffer gewaschen, wobei der Durchlauf verworfen wurde. Die Säulen wurden in neue 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt, und die RNA wurde durch Zugabe von 100 μl DEPC-behandeltem Wasser eluiert, wonach 15 s bei 8.000 × g zentrifugiert wurde. Verbliebene RNA wurde durch Zugabe von weiteren 50 μl RNase-freiem Wasser zur Spin Column gesammelt, wonach 2 min bei voller Geschwindigkeit zentrifugiert wurde. 10 μl der RNA-Präparation wurden abgenommen und mit dem (A_206/280)-Verfahren quantifiziert. Die RNA wurde bei –70°C aufbewahrt. Es ergaben sich Ausbeuten von 30–100 μg Gesamt-RNA pro 2,0 ml Fermentationsbouillon.
BEISPIEL 11
Protokoll zur quantitativen kompetitiven Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (QC-RT-PCR)
Bei der QC-RT-PCR handelt es sich um eine Technik, die zur Quantifizierung der Menge einer spezifischen RNA in einer RNA-Probe verwendet wird. Bei dieser Technik erfolgt die Synthese eines spezifischen DNA-Moleküls, daß zu einem RNA-Molekül in der ursprünglichen Probe komplementär ist, mittels reverser Transkription sowie seine anschließende Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion. Durch Zugabe verschiedener Mengen eines Konkurrenz-RNA-Moleküls zur Probe läßt sich die Konzentration des interessierenden RNA-Moleküls (in diesem Fall der mRNA-Transkripte der CYP- und CPR-Gene) bestimmen. Die Niveaus spezifischer mRNA-Transkripte wurden als Antwort auf die Zugabe von Fettsäure- und/oder Alkansubstraten zum Wachstumsmedium von fermentationskultivierten C. tropicalis-Kulturen über einen Zeitraum in einem Assay zur Identifizierung und Charakterisierung der an der Oxidation dieser Substrate beteiligten Gene getestet. Dieser Ansatz läßt sich zur Identifizierung der an der Oxidation eines gegebenen Substrats beteiligten CYP- und CPR-Gene auf der Grundlage ihrer Transkriptionsregulation verwenden.
A. Primer-Konstruktion
Als erstes wird für die QC-RT-PCR die Konstruktion der bei der reversen Transkription sowie den nachfolgenden PCR-Reaktionen zu verwendenden Primer-Paare benötigt. Diese Primer müssen einzigartig und spezifisch für das interessierende Gen sein. Da in C. tropicalis 20336 eine Familie genetisch ähnlicher CYP-Gene vorhanden ist, mußte dafür gesorgt werden, Primer-Paare zu konstruieren, die diskriminieren und nur das interessierende Gen amplifizieren, in diesem Beispiel das Gen CYP52A5. Auf diese Weise werden einzigartige Primer, die auf im wesentlichen nichthomologe (d.h. variable) Bereiche innerhalb von Zielmitgliedern einer Genfamilie gerichtet sind, konstruiert. Dabei wird von Fall zu Fall festgelegt, wie die im wesentlichen nichthomologen Bereiche aufgebaut sein sollen. Solche einzigartigen Primer sollten spezifisch genug sein, um ein Annealing mit dem nichthomologen Bereich des Zielgens einzugehen, ohne dabei ein Annealing mit anderen, Nicht-Zielmitgliedern der Genfamilie durchzuführen. Durch Vergleichen der bekannten Sequenzen der Mitglieder einer Genfamilie werden nichthomologe Bereiche identifiziert und einzigartige Primer konstruiert, die ein Annealing mit solchen Bereichen eingehen. Dabei wird angenommen, das nichthomologe Bereiche typischerweise weniger als etwa 85% Homologie zeigen würden, doch kann deren Homologie je nach den konservierten Positionen sowie der Stringenz der Reaktion größer sein. Nach Ausführen der PCR kann es hilfreich sein, das Reaktionsprodukt zu überprüfen, um sicherzustellen, daß es sich dabei um das einzigartige Zielgenprodukt handelt. Falls dies nicht der Fall ist, können die Reaktionsbedingungen hinsichtlich der Stringenz abgeändert werden, um die Reaktion auf das gewünschte Ziel zu richten. Andererseits kann auch ein neuer Primer oder ein neuer nichthomologer Bereich gewählt werden. Aufgrund des hohen Homologieniveaus zwischen den Genen der CYP52A-Familie wurde der am stärksten variable 5'-Bereich der CYP52A5-Codierungssequenz als Ziel für die Konstruktion der Primer-Paare ausersehen. In 3 ist ein Teil des 5'-codierenden Bereichs für das Allel CYP52A5A (SEQ ID NO: 36) von C. tropicalis 20336 gezeigt. Bei den eingerahmten Sequenzen in 3 handelt es sich um die Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärts-Primer (SEQ ID NOS: 47 bzw. 48), die zur Quantifizierung der Expression beider Allele dieses Gens verwendet wurden. Der tatsächliche Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 48) enthält ein Adenin weniger als in 3 gezeigt. Primer, die zur Messung der Expression spezifischer C.-tropicalis-20336-Gene unter Verwendung des QC-RT-PCR-Protokolls verwendet wurden, sind in Tabelle 5 aufgeführt (SEQ ID NOS: 37–58).
Tabelle 5. Zur Messung der C. tropicalis-Genexpression in den QC-RT-PCR-Reaktionen verwendete Primer
B. Konstruktion und Synthese der Konkurrenz-DNA-Matrize
Die Konkurrenz-RNA wird in vitro von einer Konkurrenz-DNA-Matrize synthetisiert, die den T7-Polymerasepromotor aufweist und vorzugsweise eine kleine Deletion von beispielsweise etwa 10 bis 25 Nukleotiden im Vergleich mit der nativen Ziel-RNA-Sequenz trägt. Die DNA-Matrize für die in-vitro-Synthese der Konkurrenz-RNA wird mit PCR-Primern synthetisiert, die eine Länge zwischen 46 und 60 Nukleotiden aufweisen. In diesem Beispiel sind die Primer-Paare für die Synthese der CYP52A5-Konkurrenz-DNA in den Tabellen 6 und 7 gezeigt (SEQ ID NOS: 59 und 60).
Tabelle 6. Zur Synthese der Konkurrenz-RNA-Matrize zur QC-RT-PCR-Messung der CYP52A5A-Genexpression verwendete Vorwärts- und Rückwärts-Primer
Tabelle 7. Primer für die Synthese der QC-RT-PCR-Konkurrenz-RNA-Matrizen
Der Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 59) enthält die T7-Promotor-Konsensussequenz „GGATCCTAATACGA CTCACTATAGGGAGG", die mit der Sequenz des Primers 7581-97-F (SEQ ID NO: 47) fusioniert ist. Der Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 60) enthält die Sequenz des Primers 7581-97M (SEQ ID NO: 48), gefolgt von den 20 Basen der stromaufwärts liegenden Sequenz mit einer 18 Basenpaar großen Deletion zwischen den beiden Blöcken der CYP52A5-Sequenz. Der Vorwärts-Primer wurde mit dem entsprechenden Rückwärts-Primer zur Synthese der Konkurrenz-DNA-Matrize verwendet. Die Primerpaare wurden in einer PCR-Standardreaktion mit Taq Gold-Polymerase gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA) miteinander kombiniert. Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt eine Endkonzentration von jeweils 250 nM Primer und 10 ng chromosomale C. tropicalis-DNA für die Matrizen. Das Reaktionsgemisch wurde in ein Thermocycler-Gerät für 25 bis 35 Zyklen gegeben, wobei die höchstmögliche Annealing-Temperatur während der PCR-Reaktionen verwendet wurde, um ein homogenes PCR-Produkt zu gewährleisten (in diesem Fall 62°C). Die PCR-Produkte wurden entweder über ein Gel oder ein Filter gereinigt, um nicht eingebaute Nukleotide und Primer abzutrennen. Danach wurde die Konkurrenz-Matrizen-DNA mit dem (A_260/280)-Verfahren quantifiziert. Die für die Synthese verschiedener kompetitiver DNA-Matrizen in den QC-RT-PCR-Experimenten verwendeten Primer sind in Tabelle 7 aufgeführt (SEQ ID NOS: 61–80).
C. Synthese der Konkurrenz-RNA
Zur Herstellung der Konkurrenz-RNA wurde Konkurrenz-Matrizen-DNA unter Verwendung des Kits Megascript T7 von Ambion Biosciences (Ambion Inc., Austin, Texas) In-Vitro transkribiert. 250 Nanogramm (ng) Konkurrenz-DNA-Matrize sowie die in-vitro-Transkriptionsreagenzien werden gemäß den vom Hersteller gelieferten Anweisungen gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die erhaltenen RNA-Präparationen wurden danach mittels Gelelektrophorese auf die Bedingungen, die die höchsten Ausbeuten und die höchste Qualität der Konkurrenz-RNA ergeben, hin überprüft. Dies erforderte häufig die Optimierung gemäß den Vorgaben des Herstellers. Die DNA-Matrize wurde danach mit DNase I, wie im Ambion-Kit beschrieben, entfernt. Danach wurde die Konkurrenz-RNA mit dem (A_260/280)-Verfahren quantifiziert. Zur Verwendung in den QC-RT-PCR-Reaktionen wurden Reihenverdünnungen der RNA (1 ng/μl bis 1 Femtogramm (fg)/μl) hergestellt und die ursprünglichen Stammlösungen bei –70°C gelagert.
D. QC-RT-PCR-Reaktionen
Die QC-RT-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der rTth-Polymerase von Perkin-Elmer (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA) gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt. Die reverse Transkriptionsreaktion wurde in einem Volumen von 10 μl mit Endkonzentrationen von jeweils 200 μM dNTP, 1,25 Einheiten rTth-Polymerase, 1,0 mM MnCl₂, 1 × des mit dem Enzym vom Hersteller gelieferten 10 × -Puffers, 100 ng aus einer fermenterkultivierten C. tropicalis-Kultur isolierten Gesamt-RNA und 1,25 μM des entsprechenden Rückwärts-Primers durchgeführt. Zur Quantifizierung der CYP52A5-Expression in C. tropicalis eignete sich als Rückwärts-Primer 7581-97M (SEQ ID NO: 48). Für jede charakterisierte RNA-Probe wurden mehrere Reaktionsgemische hergestellt. Zur Quantifizierung der CYP52A5-Expression wurden eine Reihe von 8 bis 12 der zuvor beschriebenen QC-RT-PCR-Reaktionsgemische in Portionen auf verschiedene Reaktionsröhrchen verteilt. Zu jedem Röhrchen wurde 1 μl einer Reihenverdünnung mit 100 pg bis 100 fg CYP52A5-Konkurrenz-RNA pro μl gegeben, wodurch die endgültigen Reaktionsgemische ein endgültiges Volumen von 10 μl erreichten. Die QC-RT-PCR-Reaktionsgemische wurden gemischt und 15 min bei 70°C gemäß den vom Hersteller empfohlenen Zeiten bis zum Eintreten der reversen Transkription inkubiert. Nach Beendigung der 15minütigen Inkubation wurde die Probentemperatur auf 4°C herabgesetzt, um die Reaktion zu stoppen und danach wurden 40 μl des PCR-Reaktionsgemischs zu der Reaktion gegeben, so daß das Gesamtvolumen auf 50 μl anstieg. Das PCR-Reaktionsgemisch besteht aus einer wäßrigen Lösung mit 0,3125 μM des Vorwärts-Primers 7581-97F (SEQ ID NO: 47), 3,125 mM MgCl₂ und 1 × Chelatierungspuffer, geliefert zusammen mit dem Enzym von Perkin-Elmer. Die Reaktionsgemische wurden in ein Thermocycler-Gerät (Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA) gegeben, wonach der folgende PCR-Zyklus durchgeführt wurde: 1 min bei 94°C, gefolgt von 10 Sekunden bei 94°C, gefolgt von 40 Sekunden bei 58°C über 17 bis 22 Zyklen. Die PCR-Reaktion wurde mit einer letzten Inkubation bei 58°C über 2 min, gefolgt von 4°C, beendet. Bei einigen Reaktionen, in denen keine nachweisbaren PCR-Produkte produziert worden waren, wurden die Proben für zusätzliche Zyklen in das Thermocycler-Gerät zurückgeführt und dieser Vorgang wiederholt, bis genug PCR-Produkte zur Quantifizierung mit HPLC produziert worden waren. Die Anzahl der Zyklen, die zur Produktion von genügend PCR-Produkt benötigt wird, ist eine Funktion der Menge der Ziel-mRNA in den 100 ng zellulärer Gesamt-RNA. In Kulturen, in denen das CYP52A5-Gen hochexprimiert wird, ist genügend CYP52A5-mRNA-Message vorhanden, und es werden zur Produktion einer quantifizierbaren Menge an PCR-Produkt weniger PCR-Zyklen (≤ 17) benötigt. Je niedriger die Konzentrationen der vorhandenen Ziel-mRNA, desto mehr PCR-Zyklen werden zur Produktion einer nachweisbaren Menge an Produkt benötigt. Diese QC-RT-PCR-Verfahrensweisen wurden auf alle in Tabelle 5 aufgeführten Zielgene unter Verwendung der jeweiligen dort angegebenen Primer angewandt.
E. HPLC-Quantifizierung
Nach Beendigung der QC-RT-PCR-Reaktionen wurden die Proben mittels HPLC analysiert und quantifiziert. Fünf bis fünfzehn Mikroliter des QC-RT-PCR-Reaktionsgemischs wurden in ein Bio-Compatible 625 HPLC-Gerät von Waters mit einem damit verbundenen einstellbaren Detektor Waters 484 injiziert. Der Detektor wurde auf eine Messung bei einer Wellenlänge von 254 nm eingestellt. Das HPLC-Gerät enthielt eine DNASep^TM-Säule der Marke Sarasep (Sarasep, Inc, San Jose, CA), die in den Ofen gestellt wurde, wobei die Temperatur auf 52°C eingestellt wurde. Die Säule wurde gemäß der Empfehlung des Herstellers so eingerichtet, daß sie 30 cm eines zwischen dem Injektor und der Säule angeordneten erhitzten PEEK-Schlauchs aufwies. Das System wurde mit einer Guard-Säule der Marke Sarasep, die vor dem Injektor angebracht wurde, versehen. Darüber hinaus befand sich unmittelbar vor der Säule im Ofen ein 0,22-μm-Filterscheibchen. Zur Erzeugung eines Elutionsgradienten zur Auflösung und Quantifizierung der PCR-Produkte aus den QC-RT-PCR-Reaktionen wurden zwei Puffer verwendet. Puffer-A besteht aus 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA) und 5 Vol.-% Acetonitril. Puffer-B besteht aus 0,1 M TEAA und 25 Vol.-% Acetonitril. Die QC-RT-PCR-Proben wurden in das HPLC-Gerät injiziert, und der lineare Gradient von 75% Puffer-A/25% Puffer-B bis 45% Puffer-A/55% B über einen Zeitraum von 6 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,85 ml pro Minute gefahren. Das 18 Basenpaare kleinere QC-RT-PCR-Produkt der Konkurrenz-RNA wird von der HPLC-Säule vor dem QC-RT-PCR-Produkt von der CYP52A5-mRNA(U) eluiert. Die Menge der QC-RT-PCR-Produkte wird mit einem verbundenen Datenmodul 745 von Waters Corporation aufgetragen und quantifiziert. Die Log-Verhältnisse der Menge an CYP52A5-mRNA-QC-RT-PCR-Produkt(U) zum Konkurrenz-QC-RT-PCR-Produkt(C), wie sie über die Peak-Zonen gemessen wurden, wurden aufgetragen und die zum Ausgleichen der Menge an CYP52A5 mRNA- Produkt benötigte Menge an Konkurrenz-RNA bestimmt. Bei allen in Tabelle 5 aufgeführten Zielgenen enthielt die Konkurrenz-RNA jeweils weniger Basenpaare im Vergleich mit der nativen Ziel-mRNA und eluierte vor der nativen mRNA auf ähnliche Weise wie von CYP52A5 demonstriert. Die HPLC-Quantifizierung der Gene wurde wie oben durchgeführt.
BEISPIEL 12
Beurteilung neuer Stämme in Schüttelkolben
Die CYP- und CPR-amplifizierten Stämme, wie z.B. die Stämme HDC10, HDC15, HDC20 und HDC23 (Tabelle 1) und H5343 wurden hinsichtlich der Disäureproduktion in Schüttelkolben beurteilt. Jedem Stamm wurde jeweils eine Einzelkolonie von einer YPD-Agarplatte in 5 ml YPD-Bouillon überführt und über Nacht bei 30°C, 250 UpM wachsen gelassen. Danach wurde ein Inokulum in 50 ml DCA2-Medium (Liste) überführt und 24 h bei 30°C, 300 UpM wachsen gelassen. Die Zellen wurden 5 min bei 5.000 UpM zentrifugiert und in 50 ml DCA3-Medium (Liste) resuspendiert und 24 h bei 30°C, 300 UpM wachsen gelassen. Nach 24 h Wachstum in DCA3-Medium wurde 3% Ölsäure (w/v) zugesetzt, und man ließ die Kulturen zur Biokonvertierung von Ölsäure 48 h stehen. Proben wurden geerntet und die Disäure- und Monosäurekonzentrationen gemäß dem in 35 angegebenen Schema analysiert. Jeder Stamm wurde in Doppelbestimmung getestet, wobei die in Tabelle 8 gezeigten Ergebnisse den Durchschnittswert aus zwei Kolben repräsentieren.
Tabelle 8. Biokonvertierung von Ölsäure mit unterschiedlichen rekombinanten Stämmen von C. tropicalis
BEISPIEL 13
Klonierung und Charakterisierung von Genen für Cytochrom-P450-Monooxygenase (CYP) und Cytochrom-P450-NADPH-Oxidoreductase (CPR) aus C. tropicalis 20336
Zur Klonierung der CYP- und CPR-Gene wurden mehrere unterschiedliche Strategien eingesetzt. Verfügbare CYP-Aminosäuresequenzen wurden vergleichend gegenübergestellt und Bereiche mit Ähnlichkeiten bestimmt (4). Diese Bereiche entsprachen in anderen Cytochrom-P450-Familien beobachteten und beschriebenen konservierten Bereichen (Goeptar et al., supra und Kalb et al., supra). Proteine aus acht eukaryontischen Cytochrom-P450-Familien weisen einen gemeinsamen segmentierten Bereich mit Sequenzähnlichkeit auf. Ein Bereich entsprach der HR2-Domäne mit dem für die Häm-Bindung benötigten unveränderlichen Cysteinrest in der Nähe des Carboxyterminus, während der andere Bereich dem zentralen Bereich der I Helix entsprach, von dem man annimmt, daß er an der Substraterkennung beteiligt ist (4). Degenerierte Oligonukleotidprimer, die diesen hochkonservierten Bereichen der in Candida maltosa und Candida tropicalis ATCC 750 vorhandenen CYP52-Genfamilie entsprachen, wurden konstruiert und zur Amplifikation von DNA-Fragmenten von CYP-Genen aus genomischer DNA von C. tropicalis 20336 verwendet. Diese eigenständigen PCR-Fragmente wurden dann als Sonden zur Isolierung von Vollängen-CYP-Genen aus den genomischen Bibliotheken von C. tropicalis 20336 verwendet. In einigen Fällen wurden hochkonservierten Bereichen entsprechende Oligonukleotidprimer direkt als Sonden zur Isolierung von Vollängen-CYP-Genen aus genomischen Bibliotheken verwendet. Für CPR wurde zur Isolierung des CPR-Gens von C. tropicalis 20336 eine auf der bekannten DNA-Sequenz für das CPR-Gen von C. tropicalis 750 beruhende heterologe Sonde verwendet.
A. Klonierung des CPR-Gens aus C. tropicalis 20336
1) Klonierung des CPRA-Allels
Ungefähr 25.000 Phagenpartikel aus der ersten genomischen Bibliothek von C. tropicalis 20336 wurden einem Screening mit einem 1,9 kb großen BamHI-NdeI-Fragment aus dem Plasmid pCU3RED (siehe Picattagio et al., Bio/Technology 10: 894–898 (1992), hiermit durch Bezugnahme aufgenommen), das den Großteil des CPR-Gens von C. tropicalis 750 enthält, unterzogen. Fünf mit der Sonde hybridisierende Klone wurden isoliert, und die Plasmid-DNA wurde aus diesen Lamba-Klonen isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse charakterisiert. Die Restriktionsenzymanalyse ließ vermuten, daß alle fünf Klone identisch waren, doch war nicht klar, ob ein vollständiges CPR-Gen vorhanden war.
Um zu bestimmen, ob ein vollständiges CPR-Gen in einem der fünf Klone vorhanden war, wurde die PCR-Analyse verwendet. Degenerierte Primer wurden für hochkonservierte Bereiche bekannter CPR-Gene hergestellt (siehe Sutter et al., J. Biol. Chem. 265: 16428–16436 (1990)(4). Zwei Primer wurden für den FMN-Bindungsbereich synthetisiert (FMN1, SEQ ID NO: 16 und FMN2, SEQ ID NO: 17). Ein Primer wurde für den FAD-Bindungsbereich synthetisiert (FAD, SEQ ID NO: 18) und ein Primer für den NADPH-Bindungsbereich (NADPH, SEQ ID NO: 19)(Tabelle 4). Diese vier Primer wurden in PCR-Amplifikationsexperimenten eingesetzt, wobei als Matrize aus vier der fünf oben beschriebenen Klone isolierte Plasmid-DNA verwendet wurde. Die FMN- (SEQ ID NOS: 16 und 17) und FAD-Primer (SEQ ID NO: 18) dienten als Vorwärts-Primer und der NADPH-Primer (SEQ ID NO: 19) als Rückwärts-Primer in den PCR-Reaktionen. Wurden andere Kombinationen aus Vorwärts- und Rückwärts-Primern verwendet, so wurden von keinem der Plasmide PCR-Produkte erhalten. Mit allen Primerkombinationen wurden jedoch Produkte der erwarteten Größe mit einem Plasmid, das das CPR-Gen von C. tropicalis 750 enthielt (Positivkontrolle), amplifiziert. Der Grund dafür, daß die Primerpaare kein Produkt amplifizierten, liegt höchstwahrscheinlich darin, daß alle vier Klone ein verkürztes CPR-Gen enthielten. Einer dieser vier Klone (pHKM1) wurde unter Verwendung der Triplex-5'- (SEQ ID NO: 30) und Triplex-3'-Primer (SEQ ID NO: 31)(Tabelle 4), die die Insertion sowie die Mehrfachklonierungsstelle auf dem Klonierungsvektor flankieren, sowie mit dem auf der oben beschriebenen NADPH-Bindungsstelle beruhenden degenerierten Primer sequenziert. Mit dem NADPH-Primer (SEQ ID NO: 19) wurden keinerlei Sequenzdaten erhalten, was mit der PCR-Analyse übereinstimmt. Mit Triplex-Primern erhaltene Sequenzen wurden unter Verwendung des Programms MacVector^TM (Oxford Molecular Group, Campbell, CA) mit der CPR-Sequenz von C. tropicalis 750 verglichen. Mit dem Triplex-3'-Primer (SEQ ID NO: 31) erhaltene Sequenz zeigte Ähnlichkeiten mit einer internen Sequenz des CPR-Gens von C. tropicalis 750, wodurch bestätigt wurde, daß pHKM1 eine verkürzte Version eines 20336-CPR-Gens enthielt. pHKM1 wies eine 3,8 kb große Insertion auf, die einen 1,2 kb großen codierenden Bereich des CPR-Gens enthielt, der von 2,5 kb stromaufwärtsliegender DNA begleitet wurde (5). Diesem Klon fehlen ungefähr 0,85 kb des den C-terminalen Anteil des CPR-Proteins codierenden 20336-CPR-Gens.
Da die erste Clontech-Bibliothek lediglich ein verkürztes CPR-Gen lieferte, wurde die zweite von Clontech hergestellte Bibliothek einem Screening zur Isolierung eines Vollängen-CPR-Gens unterzogen. Dabei wurden drei putative CPR-Klone erhalten. Die drei Klone mit Insertionen im Bereich von 5–7 kb wurden mit pHKM2, pHKM3 und pHKM4 bezeichnet. Alle drei wurden durch PCR unter Verwendung der oben beschriebenen degenerierten Primer charakterisiert. Sowohl pHKM2 als auch pHKM4 ergaben PCR-Produkte mit zwei Sätzen interner Primer. pHKM3 ergab lediglich mit den FAD- (SEQ ID NO: 18) und NADPH-Primern (SEQ ID NO: 19) ein PCR-Produkt, was darauf schließen läßt, daß dieser Klon wahrscheinlich ein verkürztes CPR-Gen enthält. Alle drei Plasmide wurden unter Verwendung der beiden Triplex-Primer und eines dritten Primers, dessen Sequenz aus der DNA-Sequenz in der Nähe des verkürzten Endes des in pHKM1 vorhandenen CPR-Gens ausgewählt wurde, teilweise sequenziert. Diese Analyse bestätigte, daß sowohl pHKM2 als auch pHKM4 Sequenzen aufweisen, die mit pHKM1 überlappen, und daß beide Plasmide den 3'-Bereich des CPR-Gens enthielten, der pHKM1 fehlt. Teile der Insertionen von pHKM1 und pHKM4 wurden sequenziert, wobei ein Vollängen-CPR-Gen identifiziert wurde. Aufgrund der DNA-Sequenz und PCR-Analyse wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß pHKM1 den putativen Promotorbereich sowie 1,2 kb der einen Teil (5'-Ende) eines CPR-Gens codierenden Sequenz enthielt. pHKM4 wies 1,1 kb DNA auf, die mit pHKM1 überlappte und den Rest (3'-Ende) eines CPR-Gens zusammen mit einem stromabwärts liegenden nichttranslantierten Bereich enthielt (6). Zusammen enthielten diese beiden Plasmide ein vollständiges CPRA-Gen mit einem stromaufwärts befindlichen Promotorbereich. CPRA weist eine Länge von 4206 Nukleotiden (SEQ ID NO: 81) auf und enthält einen Regulationsbereich sowie einen Protein codierenden Bereich (definiert durch die Nukleotide 1006–3042), der eine Länge von 2037 Basenpaaren aufweist und für ein putatives Protein von 679 Aminosäuren (SEQ ID NO: 83) (13 und 14) codiert. In 13 werden durch die Sternchen konservierte Nukleotide zwischen CPRA und CPRB angedeutet, wobei Protein codierende Nukleotide in Fettdruck dargestellt und die Start- und Stop-Codons unterstrichen sind. Eine Analyse des CPRA-Proteins mit dem Protein-Alignment-Programm des Sofwarepaketes GeneWorks^TM (Oxford Molecular Group, Campbell, CA) zeigte eine ausgeprägte Homologie zu CPR-Proteinen aus C. tropicalis 750 und C. maltosa.
2) Klonierung des CPRB-Allels
Zur Klonierung des zweiten CPRB-Allels wurde die von Henkel hergestellte dritte genomische Bibliothek einem Screening mit DNA-Fragmenten aus pHKM1 und pHKM4 als Sonden unterzogen. Dabei wurden fünf Klone erhalten, und diese wurden mit den drei zur Sequenzierung von CPRA verwendeten internen Primern sequenziert. Diese Primer wurden mit PRK1.F3 (SEQ ID NO: 20), PRK1.F5 (SEQ ID NO: 21) und PRK4.R20 (SEQ ID NO: 22) bezeichnet (Tabelle 4) und die beiden außenliegenden Primer (M13–20 und T3 [Stratagene]) für den im pBK-CMV-Klonierungsvektor vorhandenen Polylinkerbereich. Die Sequenzanalyse läßt darauf schließen, daß vier dieser Klone, mit pHKM5 bis 8 bezeichnet, Insertionen enthielten, die mit dem zuvor isolierten CPRA-Allel identisch waren. Alle vier schienen ein Vollängen-CPR-Gen zu enthalten. Der fünfte Klon besaß sehr große Ähnlichkeit mit dem CPRA-Allel, vor allem im Bereich des offenen Leserasters, wo die Identität sehr hoch war. Es bestanden jedoch signifikante Unterschiede in den 5'- und 3'-nichttranslatierten Bereichen. Dies ließ vermuten, daß es sich bei dem fünften Klon um das Allel zu CPRA handelte. Das Plasmid wurde mit pHKM9 (7) bezeichnet und ein 4,14 kb großer Bereich dieses Plasmids wurde sequenziert, wobei die Analyse dieser Sequenz das Vorhandensein des CPRB-Allels bestätigte (SEQ ID NO: 82), das einen Regulationsbereich sowie einen Protein codierenden Bereich (definiert durch die Nukleotide 1033–3069) enthält (13). Die Aminosäuresequenz des CPRB-Proteins ist in SEQ ID NO: 84 angegeben (14).
B. Klonierung von Genen aus C. tropicalis 20336 (CYP)
1) Klonierung von CYP52A2A, CYP52A3A & 3B und CYP52A5A & 5B
Klone, die die Gene CYP52A2A, A3A, A3B, A5A und A5B trugen, wurden aus den ersten und zweiten genomischen Clontech-Bibliotheken unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde (HemeB1, SEQ ID NO: 27), deren Sequenz auf der Aminosäuresequenz für den in der gesamten CYP52-Familie vorhandenen hochkonservierten Häm-Bindungsbereich beruhte, isoliert. Die erste und zweite Bibliothek wurden zur Plasmidform konvertiert und einem Screening mittels Koloniehybridisierungen unter Verwendung der HemeB1-Sonde (SEQ ID NO: 27)(Tabelle 4) unterzogen. Dabei wurden mehrere potentielle Klone isoliert, wobei die Plasmid-DNA aus diesen Klonen isoliert und unter Verwendung des HemeB1-Oligonukleotids (SEQ ID NO: 27) als Primer sequenziert wurde. Mit diesem Ansatz wurden fünf CYP52-Gene erfolgreich identifiziert. Drei der CYP-Gene schienen einzigartig zu sein, während die übrigen zwei als Allele klassifiziert wurden. Aufgrund einer willkürlichen Wahl von Homologie zu CYP52-Genen aus Candida maltosa wurden diese fünf Gene und entsprechenden Plasmide mit CYP52A2A (pPA15 [26]), CYP52A3A (pPA57 [29]), CYP52A3B (pPA62 [30]), CYP52A5A (pPAL3 [31]) und CYP52A5B (pPA5 [32]) bezeichnet. Die vollständige DNA-Sequenz, einschließlich der regulatorischen und Protein codierenden Bereiche, dieser fünf Gene wurde erhalten und bestätigte, daß alle fünf CYP52-Gene waren (15). In 15 werden durch die Sternchen konservierte Nukleotide unter den CYP-Genen angedeutet. Die Protein codierenden Nukleotide der CYP-Gene sind in Fettdruck dargestellt und die Start- und Stop-Codons sind unterstrichen. Das CYP52A2A-Gen, wie es durch SEQ ID NO: 86 dargestellt ist, weist einen durch die Nukleotide 1199–2767 definierten Protein codierenden Bereich auf, wobei das codierte Protein eine wie in SEQ ID NO: 96 angegebene Aminosäuresequenz aufweist. Das CYP52A3A-Gen, wie es durch SEQ ID NO: 88 dargestellt ist, weist einen durch die Nukleotide 1126–2748 definierten Protein codierenden Bereich auf, wobei das codierte Protein eine wie in SEQ ID NO: 98 angegebene Aminosäuresequenz aufweist. Das CYP52A3B-Gen, wie es durch SEQ ID NO: 89 dargestellt ist, weist einen durch die Nukleotide 913–2535 definierten codierenden Bereich auf, wobei das codierte Protein eine wie in SEQ ID NO: 99 angegebene Aminosäuresequenz aufweist. Das CYP52A5A-Gen, wie es durch SEQ ID NO: 90 dargestellt ist, weist einen durch die Nukleotide 1103–2656 definierten Protein codierenden Bereich auf, wobei das codierte Protein eine wie in SEQ ID NO: 100 angegebene Aminosäuresequenz aufweist. Das CYP52A5B-Gen, wie es durch SEQ ID NO: 91 dargestellt ist, weist einen durch die Nukleotide 1142–2695 definierten Protein codierenden Bereich auf, wobei das codierte Protein eine wie in SEQ ID NO: 101 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.
2) Klonierung von CYP52A1A und CYP52A8A
CYP52A1A- und CYP52A8A-Gene wurden aus der dritten genomischen Bibliothek mit PCR-Fragmenten als Sonden isoliert. Die PCR-Fragmentsonde für CYP52A1 wurde nach PCR-Amplifikation genomischer 20336-DNA mit Oligonukleotidprimern, die zur Amplifikation eines Bereichs vom Helix-I-Bereich bis zum HR2-Bereich, wobei alle verfügbaren CYP52-Gene vom National Center for Biotechnology Information verwendet wurden, konstruiert wurden, erzeugt. Degenerierte Vorwärts-Primer UCup1 (SEQ ID NO: 23) und UCup2 (SEQ ID NO: 24) wurden auf der Grundlage einer Aminosäuresequenz (-RDTTAG-) aus dem Helix-I-Bereich konstruiert (Tabelle 4). Degenerierte Primer UCdown1 (SEQ ID NO: 25) und UCdown2 (SEQ ID NO: 26) wurden auf der Grundlage einer Aminosäuresequenz (-GQQFAL-) aus dem HR2-Bereich konstruiert (Tabelle 4). Bei den reversen Primern stellt die DNA-Sequenz das reverse Kompliment der entsprechenden Aminosäuresequenz dar. Diese Primer wurden in paarweisen Kombinationen in einer PCR-Reaktion mit Stoffel Taq-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweise verwendet. Dabei wurde ein PCR-Produkt von ungefähr 450 Bp erhalten. Dieses Produkt wurde aus Agarosegel mit Gene-clean^TM (Bio 101, LaJolla, CA) gereinigt und mit dem Vektor pTAG^TM (17)(R&D systems, Minneapolis, MN) gemäß den Empfehlungen des Herstellers ligiert. Zur Klonierung in pTAG war keine Behandlung notwendig, da dabei die TA-Klonierungstechnik eingesetzt wird. Plasmide aus mehreren Transformanten wurden isoliert und ihre Insertionen charakterisiert. Ein Plasmid enthielt den PCR-Klon in intakter Form. Die DNA-Sequenz des PCR-Fragments (mit 44CYP3 bezeichnet, SEQ ID NO: 107) wies Homologie mit den DNA-Sequenzen für das CYP52A1-Gen aus C. maltosa und das CYP52A3-Gen aus C. tropicalis 750 auf. Dieses Fragment wurde als Sonde bei der Isolierung des CYP52A1-Homologs aus C. tropicalis 20336 verwendet. Die dritte genomische Bibliothek wurde unter Verwendung der PCR-Sonde 44CYP3 (SEQ ID NO: 107) einem Screening unterzogen, wobei ein Klon (pHKM11) erhalten wurde, der ein Vollängen-CYP52-Gen enthielt (8). Der Klon enthielt ein Gen mit regulatorischen und Protein codierenden Bereichen. Ein offenes Leseraster aus 1572 Nukleotiden codierte für ein CYP52-Protein mit 523 Aminosäuren (15 und 16). Dieses CYP52-Gen wurde mit CYP52A1A (SEQ ID NO: 85) bezeichnet, da seine putative Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 95) die größte Ähnlichkeit mit dem CYP52A1-Protein aus C. maltosa aufwies. Der Protein codierende Bereich des CYP52A1A-Gens ist durch die Nukleotide 1177–2748 der SEQ ID NO: 85 definiert.
Für die Klonierung von CYP52A8A wurde ein ähnlicher Ansatz unternommen. Eine PCR-Fragmentsonde für CYP52A8 wurde unter Verwendung der Primer für hochkonservierte Sequenzen der Gene CYP52A3, CYP52A2 und CYP52A5 aus C. tropicalis 750 erzeugt. Der Rückwärts-Primer (Primer 2, 3, 5, M)(SEQ ID NO: 29) wurde auf der Grundlage des hochkonservierten Häm-Bindungsbereichs konstruiert (Tabelle 4). Die Konstruktion des Vorwärts-Primers (Primer 2, 3, 5, P)(SEQ ID NO: 28) beruhte auf einer in der Nähe des N-Terminus konservierten Sequenz der Gene CYP52A3, CYP52A2 und CYP52A5 aus C. tropicalis 750 (Tabelle 4). Die Amplifikation von genomischer 20336-DNA mit diesen beiden Primern ergab ein gemischtes PCR-Produkt. Ein amplifiziertes PCR-Fragment war 1006 Bp lang (mit DCA1002 bezeichnet). Die DNA-Sequenz für dieses Fragment wurde bestimmt, wobei festgestellt wurde, daß sie 85% Identität mit der DNA-Sequenz für das CYP52D4-Gen aus C. tropicalis 750 aufwies. Bei Verwendung dieses PCR-Produkts zum Screening der dritten genomischen Bibliothek wurde ein Klon (pHKM12) identifiziert, der ein Vollängen-CYP52-Gen zusammen mit 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen enthielt (9). Das CYP52-Gen enthielt regulatorische und Protein codierende Bereiche mit einem offenen Leseraster mit einer Länge von 1539 Nukleotiden, der für das putative CYP52-Protein mit 512 Aminosäuren codierte (15 und 16). Dieses Gen wurde mit CYP52A8A (SEQ ID NO: 92) bezeichnet, da seine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 102) die größte Ähnlichkeit mit dem CYP52A8-Protein aus C. maltosa aufwies. Der Protein codierende Bereich des CYP52A8A-Gens ist durch die Nukleotide 464–2002 der SEQ ID NO: 92 definiert. Die Aminosäuresequenz des CYP52A8A- Proteins ist in SEQ ID NO: 102 angegeben.
3) Klonierung von CYP52D4A
Das Screening der zweiten genomischen Bibliothek mit dem Primer HemeB1 (SEQ ID NO: 27) (Tabelle 4) ergab einen Klon, der ein Plasmid (pPA18) trug, welches ein verkürztes Gen mit Homologie zum CYP52D4-Gen aus C. maltosa enthielt (33). Ein 1,3 bis 1,5 kb großes EcoRI-SstI-Fragment aus pPA18, das einen Teil des verkürzten CYP-Gens enthielt, wurde isoliert und als Sonde zum Screening der dritten genomischen Bibliothek auf ein Vollängen-CYP52-Gen verwendet. Dabei wurde ein Klon (pHKM13) isoliert, bei dem sich herausstellte, daß er ein Vollängen-CYP-Gen mit ausgedehnten 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen enthielt (10). Dieses Gen wurde mit CYP52D4A (SEQ ID NO: 94) bezeichnet, und die vollständige DNA, einschließlich regulatorischen und Protein codierenden Bereichen (codierender Bereich durch Nukleotide 767–2266 definiert), sowie die putative Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 104) dieses Gens sind in den 15 bzw. 16 gezeigt. CYP52D4A (SEQ ID NO: 94) weist die größte gemeinsame Homologie mit dem CYP52D4-Gen aus C. maltosa auf.
4) Klonierung von CYP52A2B und CYP52A8B
Eine gemischte Sonde mit den Genen CYP52A1A, A2A, A3A, D4A, A5A und A8A wurde zum Screening der dritten genomischen Bibliothek verwendet, wobei mehrere putative positive Klone identifiziert wurden. Davon wurden sieben sequenziert, und zwar mit den in Tabelle 4 gezeigten degenerierten Primern Cyp52a (SEQ ID NO: 32), Cyp52b (SEQ ID NO: 33), Cyp52c (SEQ ID NO: 34) und Cyp52d (SEQ ID NO: 35). Diese Primer wurden von hochkonservierten Bereichen der vier CYP52-Unterfamilien, nämlich CYP52A, B, C & D, konstruiert. Die Sequenzen von zwei Klonen, pHKM14 und pHKM15 (11 bzw. 12), teilten eine beträchtliche Homologie mit der DNA-Sequenz der Gene CYP52A2 bzw. CYP52A8 aus C. tropicalis 20336. Die vollständige DNA (SEQ ID NO: 87), einschließlich regulatorischen und Protein codierenden Bereichen (codierender Bereich durch Nukleotide 1072–2640 definiert), sowie die putative Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 97) des in pHKM14 vorhandenen CYP52-Gens ließen vermuten, daß es sich dabei um CYP52A2B handelte (15 bzw. 16). Die vollständige DNA (SEQ ID NO: 93), einschließlich regulatorischen und Protein codierenden Bereichen (codierender Bereich durch Nukleotide 1017–2555 definiert), sowie die putative Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 103) des in pHKM15 vorhandenen CYP52-Gens ließen vermuten, daß es sich dabei um CYP52A8B handelte (15 bzw. 16).
BEISPIEL 14
Identifizierung von durch ausgewählte Fettsäure- und Alkansubstrate induzierten CYP- und CPR-Genen
Gene, deren Transkription durch das Vorhandensein ausgewählter Fettsäure- oder Alkansubstrate angeschaltet wird, wurden mit dem QC-RT-PCR-Assay identifiziert. Dieser Assay wurde zur Messung der (CYP)- und (CPR)-Genexpression in Fermenter kultivierten Kulturen von C. tropicalis ATCC 20962 verwendet. Dieses Verfahren beinhaltet die Isolierung zellulärer Gesamt-RNA aus Kulturen von C. tropicalis sowie die Quantifizierung einer spezifischen mRNA innerhalb der Probe mittels der Konstruktion und Verwendung sequenzspezifischer QC-RT-PCR-Primer sowie einer Konkurrenz-RNA. Die Quantifizierung wird über die Verwendung bekannter Konzentrationen hochhomologer Konkurrenz-RNA in den QC-RT-PCR-Reaktionen erzielt. Die erhaltenen QC-RT-PCR-amplifizierten cDNAs werden getrennt und durch Verwendung von Ionenpaar-reverse-Phase HPLC quantifiziert. Dieser Assay wurde zur Charakterisierung der Expression von CYP52-Genen von C. tropicalis ATCC 20962 als Antwort auf verschiedene Fettsäure- und Alkansubstrate verwendet. Induzierte Gene wurden durch Berechnung ihrer mRNA-Konzentration zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Induktion identifiziert. In 18 ist ein Beispiel dafür angegeben, wie sich die Konzentration vom mRNA für CYP52A5 mit dem QC-RT-PCR-Test berechnen läßt. Das Log-Verhältnis von unbekanntem (U) zu Konkurrenz-Produkt (C) wird gegen die Konzentration der in den QC-RT-PCR-Reaktionen vorhandenen Konkurrenz-RNA aufgetragen. Die Konzentration des Konkurrenzmoleküls, die zu einem U/C-Log-Verhältnis von Null führt, stellt den Punkt dar, an dem die unbekannte Messenger-RNA-Konzentration gleich der Konzentration des Konkurrenzmoleküls ist. In 18 ist die Berechnung der Menge an CYP52A5-Message, die in 100 ng aus 0, 1 und 2 Stunden nach Zugabe von Emersol^® 267 in einem Fermenterlauf entnommenen Zellproben isolierter Gesamt-RNA vorhanden ist, berücksichtigt. Von dieser Analyse aus ist es möglich, die Konzentration der in 100 ng zellulärer Gesamt-RNA vorhandenen CYP52A5-mRNA zu bestimmen. Bei der in 18 enthaltenen graphischen Auftragung werden 0,46 pg Konkurrenzmolekül benötigt, um der Anzahl von mRNAs von CYP52A5 in 100 ng aus Zellen unmittelbar vor (Zeitpunkt 0) der Zugabe des Substrats Emersol^® 267 isolierter RNA gleichzukommen. Bei Zellproben, die eine und zwei Stunden nach Zugabe von Emersol^® 267 entnommen wurden, werden 5,5 bzw. 8,5 pg Konkurrenz-RNA benötigt. Dieses Ergebnis demonstriert, daß CYP52A5 (SEQ ID NOS: 90 und 91) innerhalb von zwei Stunden nach Zugabe von Emersol^® 267 mehr als 18fach induziert wird. Diese Art von Analyse wurde verwendet, um zu demonstrieren, daß CYP52A5 (SEQ ID NOS: 90 und 91) durch Emersol^® 267 induziert wird. In 19 sind die relativen Mengen der Expression von CYP52A5 (SEQ ID NOS: 90 und 91) in Fermenterläufen mit und ohne Emersol^® 267 als Substrat gezeigt. Die Unterschiede in den Expressionsmustern von CYP52A5 (SEQ ID NOS: 90 und 91) sind auf die Zugabe von Emersol^® 267 zum Fermentationsmedium zurückzuführen.
Durch diese Analyse wird deutlich demonstriert, daß durch die Zugabe von Emersol^® 267 zum Wachstumsmedium die Expression von CYP52A5 (SEQ ID NOS: 90 und 91) in C. tropicalis 20962 induzierbar ist. Diese Analyse wurde zur Charakterisierung der Expression von CYP52A2A (SEQ ID NO: 86), CYP52A3AB (SEQ ID NOS: 88 und 89), CYP52A8A (SEQ ID NO: 92), CYP52A1A (SEQ ID NO: 85), CYP52D4A (SEQ ID NO: 94) und CPRB (SEQ ID NO: 82) als Antwort auf die Gegenwart von Emersol^® 267 im Fermentationsmedium durchgeführt (20). Die Ergebnisse dieser Analysen deuten darauf hin, daß das CYP52A2A-Gen (SEQ ID NO: 86) wie das CYP52A5-Gen (SEQ ID NOS: 90 und 91) von C. tropicalis 20962 durch Emersol^® 267 induzierbar ist. Eine geringe Induktion wird bei CYP52A1A (SEQ ID NO: 85) und CYP52A8A (SEQ ID NO: 92) beobachtet. Im Gegensatz dazu liegt bei CYP52D4A (SEQ ID NO: 94), CYP52A3A (SEQ ID NO: 88), CYP52A3B (SEQ ID NO: 89) eine eventuelle Induktion unterhalb der Nachweisgrenze des Assays. CPRB (SEQ ID NO: 82) wird durch Emersol^® 267 mäßig, d.h. vier- bis fünffach, induziert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 20 zusammengefaßt. In 34 wird ein Beispiel für die selektive Induktion von CYP52A-Genen gegeben. Wurden reine Fettsäure oder Alkane einem Fermenter mit C. tropicalis 20962 oder einem Derivat davon zugesetzt, so wurde die Transkriptionsaktivierung von CYP52A-Genen unter Verwendung des QC-RT-PCR-Assays nachgewiesen. 34 zeigt, daß reine Ölsäure (C18:1) CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) während der Induktion von CYP52A5 (SEQ ID NOS: 90 und 91) stark induziert. Bei der gleichen Zugabe von reinem Alkan (Tridecan) zum Fermenter zeigt sich eine starke Induktion sowohl von CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) als auch CYP52A1A (SEQ ID NO: 85). CYP52A5 (SEQ ID NOS: 90 und 91) wurde jedoch nicht von Tridecan induziert. In einer separaten Fermentation mit ATCC 20962, wobei als Substrat reines Octadecan enthalten war, wird eine Induktion von CYP52A2A, CYP52A5A und CYP52A1A nachgewiesen (siehe 36). Das vorstehend Gesagte demonstriert eine selektive Induktion bestimmter CYP-Gene durch spezifische Substrate, womit Techniken zur selektiven metabolischen Manipulation von Zellstämmen bereitgestellt werden. So sind, falls beispielsweise eine Tridecanmodifikation gewünscht ist, für hohe Aktivitätsniveaus von CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) und CYP52A1A (SEQ ID NO: 85) manipulierte Organismen angezeigt. Falls eine Ölsäuremodifikation gewünscht ist, so sind für hohe Aktivitätsniveaus von CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) manipulierte Organismen angezeigt.
BEISPIEL 15
Integration ausgewählter CYP- und CPR-Gene in das Genom von Candida tropicalis
Um ausgewählte Gene in das Chromosom von C. tropicalis 20336 oder dessen Abkömmlinge zu integrieren, muß eine Ziel-DNA-Sequenz, bei der es sich gegebenenfalls um ein intaktes Gen handeln kann, vorliegen, in die die Gene inseriert werden können. Ebenso muß ein Verfahren zur Selektion auf das Integrationsereignis vorhanden sein. In einigen Fällen sind die Ziel-DNA-Sequenz und der selektionierbare Marker identisch, wobei, falls dies der Fall ist, auch ein Verfahren vorhanden sein muß, um das Zielgen als selektionierbaren Marker nach dem Integrationsereignis wiederverwenden zu können. Ein Gen, das in C. tropicalis und seinen Abkömmlingen diese Kriterien erfüllt, ist URA3A, das für Orotidin 5'-phosphat-Decarboxylase codiert. Bei Verwendung als Ziel für die Integration lassen sich ura^–-Varianten von C. tropicalis so transformieren, daß ein URA⁺-Genotyp über homologe Rekombination wiederhergestellt wird (21). Je nach Konstruktion des Integrationsvektors können ein oder mehrere Gene in das Genom gleichzeitig integriert werden. Bei der Verwendung eines gespaltenen, wie in 22 gezeigt orientierten URA3A-Gens würde eine homologe Integration mindestens eine Kopie des (der) interessierenden Gens(e), die zwischen die voneinander getrennten Teile des URA3A-Gens insertiert werden, ergeben. Zudem kann aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen URA3A- und URA3B-Genen die Integration des Konstrukts sowohl am URA3A- als auch am URA3B-Locus stattfinden. Anschließend läßt sich ein Oligonukleotid, das mit einer Deletion in einem Teil des URA-Gens, auf Grundlage der über sowohl das URA3A als auch das URA3B-Gen identischen Sequenz, konstruiert wurde, zur Erzeugung von C. tropicalis-Transformanten nutzen, die wiederum ura^– sind, aber dennoch ein oder mehrere neu integrierte Gene nach Wahl tragen können (21). ura^–-Varianten von C. tropicalis lassen sich auch über andere Verfahren, wie z.B. klassische Mutagenese oder durch Spontanmutation, isolieren. Unter Verwendung allgemein bekannter Vorschriften läßt sich die Selektion von ura^–-Stämmen durch Verwendung von 5-Fluororotsäure (5-FOA) erleichtern, wie beispielsweise in Boeke et al., Mol. Gen. Genet. 197: 345–346 (1984), hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben. Die Nutzung dieses Ansatzes zur Manipulation von C. tropicalis ist gut dokumentiert, wie beispielsweise in Picataggio et al., Mol. and Cell. Biol. 11: 4333–4339 (1991); Rohrer et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 650–654 (1992); Picataggio et al., Bio/Technology 10: 894–898 (1992); US-Patent-Nr. 5,648,247; US-Patent-Nr. 5,620,878; US-Patent-Nr. 5,204,252; US-Patent-Nr. 5,254,466, hiermit jeweils durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben.
A. Konstruktion eines URA-Integrationsvektors, pURAin
Primer wurden auf der Grundlage der 1712 Bp großen Sequenz des URA3A-Gens von C. tropicalis 20336 konstruiert und synthetisiert (siehe 23). Die Nukleotidsequenz des URA3A-Gens von C. tropicalis 20336 ist in SEQ ID NO: 105 angegeben, wobei die Aminosäuresequenz des codierten Proteins in SEQ ID NO: 106 angegeben ist. URA3A Primer Set#1a (SEQ ID NO: 9) und #1b (SEQ ID NO: 10)(Tabelle 4) wurde in der PCR mit genomischer DNA von C. tropicalis 20336 zur Amplifikation von URA3A-Sequenzen zwischen Nukleotid 733 und 1688, wie in 23 gezeigt, verwendet. Die Primer sind so konstruiert, daß einmal vorkommende 5'-AscI- und 3'-PacI-Restriktionsstellen in das erhaltene amplifizierte URA3A-Fragment eingeführt werden. AscI- und PacI-Stellen wurden gewählt, da diese Stellen in den bislang identifizierten CYP- oder CPR-Genen nicht vorhanden sind. URA3A Primer Set#2 wurde in der PCR mit genomischer DNA von C. tropicalis 20336 als Matrize zur Amplifikation von URA3A-Sequenzen zwischen Nukleotid 9 und 758, wie in 23 gezeigt, verwendet. URA3A Primer Set#2a (SEQ ID NO: 11) und #2b (SEQ ID NO: 12)(Tabelle 4) wurden so konstruiert, daß einmal vorkommende 5'-PacI und 3'-PmeI-Restriktionsstellen in das erhaltene amplifizierte URA3A-Fragment eingeführt wurden. Die PmeI-Stelle ist ebenso in den bislang identifizierten CYP- und CPR-Genen nicht vorhanden. PCR-Fragmente des URA3A-Gens wurden gereinigt, einer Restriktion mit den Restriktionsenzymen AscI, PacI und PmeI unterzogen und mit einem Gel-gereinigten, mit QiaexII aufgereinigten AscI-PmeI-Verdau des Plasmids pNEB193 (25), bezogen von New England Biolabs (Beverly, MA), ligiert. Die Ligation wurde mit einer äquimolaren Anzahl an DNA-Termini 16 Std. bei 16°C unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Die Ligationen wurden in E. coli XL1-Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers transformiert. Weiße Kolonien wurden isoliert, wachsen gelassen, und Plasmid-DNA wurde isoliert und zur Bestätigung der Insertion des modifizierten URA3A in pNEB193 mit AscI-PmeI verdaut. Der erhaltene Basenintegrationsvektor wurde mit pURAin bezeichnet (24).
B. Amplifikation von CYP52A2A, CYP52A3A, CYP52A5A und CPRB aus genomischer DNA von C. tropicalis 20336
Die für CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) und CYP52A3A (SEQ ID NO: 88) aus C. tropicalis 20336 codierenden Gene wurden aus genomischen Klonen (pPA15 bzw. pPA57)(26 bzw. 29) über PCR mit Primern (Primer CYP 2A#1, SEQ ID NO: 1 und Primer CYP 2A#2, SEQ ID NO: 2 für CYP52A2A) (Primer CYP 3A#1, SEQ ID NO: 3 und Primer CYP 3A#2, SEQ ID NO: 4 für CYP52A3A) zur Einführung von PacI-Klonierungsstellen amplifiziert. Diese PCR-Primer wurden auf der Grundlage der für CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) bestimmten DNA-Sequenz konstruiert (15). Der PCR-Kit AmpliTaq Gold (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) wurde gemäß den Vorgaben des Herstellers verwendet. Das CYP52A2A-PCR-Amplifikationsprodukt wies eine Länge von 2.230 Basenpaaren auf, wodurch sich 496 Bp DNA stromaufwärts vom CYP52A2A-Startcodon sowie 168 Bp stromabwärts vom Stopcodon für den CYP52A2A-ORF ergaben. Das CYP52A3A-PCR-Amplifikationsprodukt wies eine Länge von 2.154 Basenpaaren auf, wodurch sich 437 Bp DNA stromaufwärts vom CYP52A3A-Startcodon sowie 97 Bp stromabwärts vom Stopcodon des CYP52A3A-ORF ergaben. Das CYP52A3A-PCR-Amplifikationsprodukt wies eine Länge von 2.154 Basenpaaren auf, wodurch sich 437 Bp DNA stromaufwärts vom CYP52A3A-Startcodon sowie 97 Bp stromabwärts vom Stopcodon des CYP52A3A-ORF ergaben.
Das für CYP52A5A (SEQ ID NO: 90) aus C. tropicalis 20336 codierende Gen wurde aus genomischer DNA über PCR mit Primern (Primer CYP 5A#1, SEQ ID NO: 5 und Primer CYP 5A#2, SEQ ID NO: 6) zur Einführung von PacI-Klonierungsstellen amplifiziert. Diese PCR-Primer wurden auf der Grundlage der für CYP52A5A (SEQ ID NO: 90) bestimmten DNA-Sequenz konstruiert. Der PCR-Kit Expand Hi-Fi Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde gemäß den Vorgaben des Herstellers verwendet. Das CYP52A5A-PCR-Amplifikationsprodukt wies eine Länge von 3.298 Basenpaaren auf.
Das für CPRB (SEQ ID NO: 82) aus C. tropicalis 20336 codierende Gen wurde aus genomischer DNA über PCR mit Primern (CPR B#1, SEQ ID NO: 7 und CPR B#2, SEQ ID NO: 8) auf der Grundlage der für CPRB (SEQ ID NO: 82) bestimmten DNA-Sequenz amplifiziert (13). Diese Primer wurden zur Einführung einmal vorkommender PacI-Klonierungsstellen konstruiert. Der PCR-Kit Expand Hi-Fi Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde gemäß den Vorgaben des Herstellers verwendet. Das CPRB-PCR-Produkt wies eine Länge von 3.266 Bp auf, wodurch 747 Bp pf-DNA stromaufwärts vom CPRB-Startcodon sowie 493 Bp stromabwärts vom Stopcodon für den CPRB-ORF erhalten wurden. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden über Agarose-Gelelektrophorese isoliert, mit QiaexII gereinigt und mit PacI verdaut. Die PCR-Fragmente wurden gereinigt, entsalzt und unter Verwendung eines Microcon 100 (Amicon, Beverly, MA) konzentriert.
Die oben beschriebenen Amplifikationsverfahren lassen sich auf die anderen, in Tabelle 5 aufgeführten Gene unter Verwendung der jeweils angegebenen Primer anwenden.
C. Klonierung von CYP- und CPR-Genen in pURAin
Der nächste Schritt bestand darin, die ausgewählten CYP- und CPR-Gene in den Integrationsvektor pURAin zu klonieren. In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird keine Fremd-DNA, mit Ausnahme der von synthetischen Restriktionsstellensequenzen spezifisch bereitgestellten, in die DNA eingebaut, die in das Genom von C. tropicalis kloniert wurde, d.h. mit Ausnahme von Restriktionsstellen-DNA werden lediglich native C. tropicalis-DNR-Sequenzen in das Genom eingebaut. pURAin wurde mit PacI verdaut, mit QiaexII aufgereinigt und mit SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase = alkalische Phosphatase aus Garnelen) (United States Biochemical, Cleveland, OH) gemäß den Empfehlungen des Herstellers dephosphoryliert. Ungefähr 500 ng PacI-linearisiertes pURAin wurde 1 Std. bei 37°C dephosphoryliert, wobei SAP mit einer Konzentration von 0,2 Einheiten Enzym pro 1 pmol DNA-Termini verwendet wurde. Die Reaktion wurde durch 20minütige Hitzeinaktivierung bei 65°C gestoppt.
Das unter Verwendung des in Tabelle 4 gezeigten Primers abgeleitete CYP52A2A-PacI-Fragment wurde mit dem Plasmid pURAin, das ebenso mit PacI verdaut worden war, ligiert. PacI-verdautes pURAin wurde dephosphoryliert und mit dem CYP52A2A-ULTMA-PCR-Produkt wie zuvor beschrieben ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli XL1 Blue MRF' (Stratagene) transformiert, und 2 resistente Kolonien wurden ausgewählt und einem Screening auf die korrekten Konstrukte, die Vektorsequenz, das invertierte URA3A-Gen und das amplifizierte CYP52A2A-Gen (SEQ ID NO: 86) von 20336 enthalten sollten, unterzogen. Durch AscI-PmeI-Verdauung wurde eines der beiden Konstrukte, das Plasmid pURA2in, als Korrekt identifiziert (27). Dieses Plasmid wurde sequenziert und zur Bestätigung, daß durch die PCR keine DNA-Basenänderungen eingeführt wurden, die zu einer Aminosäureänderung führen würden, mit CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) verglichen.
Vor seiner Verwendung wurde das mit den in Tabelle 4 gezeigten Primern abgeleitete CPRB-PacI-Fragment sequenziert und zur Bestätigung, daß durch die PCR keine DNA-Basenpaaränderungen eingeführt wurden, die zu einer Aminosäureänderung führen würden, mit CPRB (SEQ ID NO: 82) verglichen. Nach der Bestätigung wurde CPRB (SEQ ID NO: 82) mit dem Plasmid pURAin, daß ebenso mit PacI verdaut worden war, ligiert. PacI-verdautes pURAin wurde dephosphoryliert und mit dem CPR-Produkt der Expand Hi-Fi-PCR wie zuvor beschrieben ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli XL1 Blue MRF' (Stratagene) transformiert, und mehrere resistente Kolonien wurden ausgewählt und einem Screening auf die korrekten Konstrukte, die Vektorsequenz, das invertierte URA3A-Gen sowie das amplifizierte CPRB-Gen (SEQ ID NO: 82) von 20336 enthalten sollten, unterzogen. AscI-PmeI-Verdauung bestätigte ein erfolgreiches Konstrukt, pURAREDBin.
In ähnlicher Weise wie oben wurden die anderen hier offenbarten CYP- und CPR-Gene jeweils in pURAin kloniert. PacI-Fragmente dieser Gene, deren Sequenzen in den 13 und 15 angegeben sind, lassen sich mit dem Fachmann bekannten Verfahren ableiten.
1) Konstruktion von zur Erzeugung von HDC 20 und HDC 23 verwendeten Vektoren
Ein zuvor konstruierter, CPRB (SEQ ID NO: 82) enthaltender Integrationsvektor, pURAREDBin, wurde als Ausgangsvektor gewählt. Dieser Vektor wurde mit PacI teilweise verdaut, und das linearisierte Fragment wurde über ein Gel isoliert. Das aktive PacI wurde durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase zerstört und der Vektor religiert. Durch die anschließende Isolierung und vollständige Verdauung des neuen Plasmids erhielt man einen Vektor, der nun nur eine aktive PacI-Stelle enthielt. Dieses Fragment wurde über ein Gel isoliert, dephosphoryliert und mit dem CYP52A2A-PacI-Fragment ligiert. Es wurden Vektoren erzeugt, die die Gene CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) und CPRB (SEQ ID NO: 82) in gleicher Richtung orientiert, pURAin CPR 2A S, ebenso wie in entgegengesetzten Richtungen orientiert (5'-Enden verbunden), pURAin CPR 2A O, enthalten.
D. Bestätigung der Integration von CYP (Integratioasschema: 21) in das Genom von C. tropicalis
Auf Grundlage des zur Transformation von H5343 ura^– verwendeten Konstrukts pURA2in wurde ein Schema zum Nachweis der Integration entworfen. Genomische DNA aus Transformanten wurde mit DraIII und SpeI verdaut, bei denen es sich um Enzyme handelt, die innerhalb der Gene URA3A und URA3B, jedoch nicht im integrierten CYP52A2A-Gen schneiden. Man würde erwarten, daß eine Verdauung von genomischer DNA, bei der eine Integration an den URA3A- oder URA3B-Loci stattgefunden hatte, ein 3,5 kb bzw. ein 3,3 kb großes Fragment ergeben sollte (28). Zudem sollte die Verdauung der gleichen genomischen DNA mit PacI ein für das integrierte CYP52A2A-Gen charakteristisches, 2,2 kb großes Fragment ergeben (28). Southern-Hybridisierungen dieser Verdaus mit Fragmenten des CYP52A2A-Gens wurden zum Screening auf diese Integrationsereignisse verwendet. Die Intensität des Bandensignals aus dem Southern-Ansatz mit der PacI-Verdauung wurde als Maß für die Anzahl der Integrationsereignisse verwendet ((d.h. je mehr Kopien des CYP52A2A-Gens (SEQ ID NO: 86) vorhanden sind, desto stärker ist das Hybridisierungssignal)).
C. tropicalis H5343-transformierte URA-Prototrophe wurden bei 30°C, 170 UpM in 10 ml SC-uracil-Medium zur Präparation genomischer DNA angezogen. Die genomische DNA wurde mit dem zuvor beschriebenen Verfahren isoliert. Genomische DNA wurde mit SpeI und DraIII verdaut. Ein 0,95% Agarosegel wurde zur Herstellung eines Southern-Hybridisierungsblots verwendet. Die DNA aus dem Gel wurde auf eine MagnaCharge-Nylonfiltermembran (MSI Technologies, Westboro, MA) gemäß dem alkalischen Transferverfahren von Sambrook et al., supra, übertragen. Für die Southern-Hybridisierung wurde ein 2,2 kb großes CYP52A2A-DNA-Fragment als Hybridisierungssonde verwendet. 300 ng CYP52A2A-DNA wurden mit dem Markierungs- und Nachweissystem ECL Direct (Amersham) markiert, und der Southern wurde gemäß den Vorgaben des ECL-Kits durchgeführt. Der Blot wurde in einem Volumen von 30 ml Hybridisierungsflüssigkeit, entsprechend 0,125 ml/cm², durchgeführt. Nach einer einstündigen Vorhybridisierung bei 42°C wurden 300 ng CYP52A2A-Sonde zugegeben und die Hybridisierung noch 16 Std. bei 42°C fortgesetzt. Nach der Hybridisierung wurden die Blots zweimal jeweils 20 min bei 42°C in der ersten Waschlösung, die Harnstoff enthielt, gewaschen. Zwei 5minütige zweite Waschschritte wurden bei RT ausgeführt, wonach der Nachweis gemäß den Anweisungen erfolgte. Die Blots wurden wie empfohlen 16 Stunden (Std.) exponiert.
Die Integration wurde durch den Nachweis eines 3,5 kb großen SpeI-DraIII-Fragments aus der genomischen DNA der Transformanten, jedoch nicht bei der C. tropicalis-20336-Kontrolle, bestätigt. Anschließend wurde durch eine PacI-Verdauung der genomischen DNA der positiven Transformanten und anschließende Southern-Hybridisierung mit einer CYP52A2A-Gensonde die Integration durch den Nachweis eines 2,2 kb großen Fragments bestätigt. Der erhaltene integrierte CYP52A2A-Stamm wurde HDC1 bezeichnet (siehe Tabelle 1).
Auf ähnliche Weise wie oben wurden die in den PacI-Fragmenten enthaltenen Gene, die in Abschnitt 3c oben beschrieben sind, jeweils hinsichtlich der Integration in das Genom von C. tropicalis bestätigt.
Durch Transformation mit den Vektoren pURAin CPR 2A S bzw. pURAin CPR 2A O erzeugte Transformanten wurden mittels Southern-Hybridisierung auf die Integration der beiden Gene CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) und CPRB (SEQ ID NO: 82) in Tandem-Formation analysiert. Dabei wurden drei Stämme, bei denen die Gene CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) und CPRB (SEQ ID NO: 82) in entgegengesetzter Orientierung integriert sind (HDC 20-1, HDC 20-2 und HDC 20-3), sowie drei, bei denen die Gene CYP52A2A (SEQ ID NO: 86) und CPRB (SEQ ID NO: 82) in gleicher Orientierung vorlagen (HDC 23-1, HDC 23-2 und HDC-23-3), erzeugt, Tabelle 1.
E. Bestätigung der Integration von CPRB in H5343 ura^–
Sieben Transformanten wurden einem Screening mittels Kolonie-PCR unter Verwendung des CPRB-Primers #2 (SEQ ID NO: 8) und eines URA3A-spezifischen Primers unterzogen. In fünf der Transformanten wurde eine erfolgreiche Integration durch das Vorhandensein eines 3.899 Bp großen PCR-Produkts nachgewiesen. Dieses 3.899 Bp große PCR-Produkt stellt das CPRB-Gen in unmittelbarer Nachbarschaft zum URA3A-Gen im Genom von H5343 dar, wodurch die Integration bestätigt wird. Die erhaltenen Stämme mit CPRB-Integration wurden mit HDC10-1 und HDC10-2 bezeichnet (siehe Tabelle 1).
F. Bewertung der Stämme

Wie durch quantitative PCR bestimmt wurde, enthielt HDC10-1 im Vergleich mit dem Ausgangsstamm H5343 drei zusätzliche Kopien des Reduktasegens, wobei HDC10-2 vier zusätzliche Kopien des Reduktasegens enthielt. Auf Grundlage der Southern-Hybridisierungsdaten vorgenommene Beurteilungen von HDC20-1, HDC20-2 und HDC20-3 deuten darauf hin, daß HDC20-1 mehrere Integrationen enthielt, d.h. 2- bis 3mal so viele wie HDC20-2 oder HDC20-3. Auf Grundlage der Southern-Hybridisierungsdaten vorgenommene Beurteilungen von HDC23-1, HDC23-2 und HDC23-3 deuten darauf hin, daß HDC23-1 mehrere Integrationen enthielt, d.h. 2- bis 3mal so viele wie HDC23-1 oder HDC23-3. Die Daten in Tabelle 8 deuten darauf hin, daß die Integration von Komponenten des ω-Hydroxylase-Komplexes eine positive Wirkung auf die Verbesserung von Candida tropicalis ATCC 20962 als Biokatalysator haben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß CYP52A5A (SEQ ID NO: 90) ein wichtiges Gen für die Konvertierung von Ölsäure zur Disäure ist. Überraschenderweise scheinen Tandem- Integrationen von in entgegengesetzter Richtung orientierten CYP- und CPR-Genen (HDC 20-Stämme) weniger produktiv zu sein als in gleicher Richtung orientierte Tandem-Integrationen (HDC 23-Stämme), Tabellen 1 und 8. LISTE Zusammensetzung der Medien LB-Bouillon

Bacto-Trypton	10 g
Bacto-Hefeextrakt	5 g
Natriumchlorid	10 g
Destilliertes Wasser	1000 ml

LB-Agar

Bacto-Trypton	10 g
Bacto-Hefeextrakt	5 g
Natriumchlorid	10 g
Agar	15 g
Destilliertes Wasser	1000 ml

LB-Top-Agarose

Bacto-Trypton	10 g
Bacto-Hefeextrakt	5 g
Natriumchlorid	10 g
Agarose	7 g
Destilliertes Wasser	1000 ml

NZCYM-Bouillon

Bacto-Caseinverdau	10 g
Bacto-Casaminosäuren	1 g
Bacto-Hefeextrakt	5 g
Natriumchlorid	5 g
Magnesiumsulfat (wasserfrei)	0,98 g
Destilliertes Wasser	1000 ml

NZCYM-Agar

Bacto-Caseinverdau	10 g
Bacto-Casaminosäuren	1 g
Bacto-Hefeextrakt	5 g
Natriumchlorid	5 g
Magnesiumsulfat (wasserfrei)	0,98 g
Agar	15 g
Destilliertes Wasser	1000 ml

NZCYM-Top-Agarose

Bacto-Caseinverdau	10 g
Bacto-Casaminosäuren	1 g
Bacto-Hefeextrakt	5 g
Natriumchlorid	5 g
Magnesiumsulfat (wasserfrei)	0,98 g
Agarose	7 g
Destilliertes Wasser	1000 ml

YEPD-Bouillon

Bacto-Hefeextrakt	10 g
Bacto-Pepton	20 g
Glucose	20 g
Destilliertes Wasser	1000 ml

YEPD-Agar*

Bacto-Hefeextrakt	10 g
Bacto-Pepton	20 g
Glucose	20 g
Agar	20 g
Destilliertes Wasser	1000 ml

SC-uracil*

Bacto-Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren	6,7 g
Glucose	20 g
Bacto-Agar	20 g
Drop-out-Mix	2 g
Destilliertes Wasser	1000 ml

DCA2-Medium	g/l
Pepton	3,0
Hefeextrakt	6,0
Natriumacetat	3,0
Yeast Nitrogen Base [Hefe-Stickstoffbasis] (Difco)	6,7
Glucose (wasserfrei)	50,0
Kaliumphosphat (dibasisch, Trihydrat)	7,2
Kaliumphosphat (monobasisch, wasserfrei)	9,3

DCA3-Medium	g/l
0,3 M Phosphatpuffer mit pH 7,5 Glycerin	50
Yeast Nitrogen Base (Difco)	6,7

Drop-out-Mix

Adenin	0,5 g
Arginin	2 g
Asparaginsäure	2 g
Glutamin	2 g
Glycin	2 g
Inositol	2 g
Leucin	10 g
Methionin	2 g
Phenylalanin	2 g
Serin	2 g
Tryptophan	2 g
Valin	2 g
Alanin	2 g
Asparagin	2 g
Cystein	2 g
Glutaminsäure	2 g
Histidin	2 g

Isoleucin	2 g
Lysin	2 g
para-Aminobenzoesäure	0,2 g
Prolin	2 g
Threonin	2 g
Tyrosin	2 g

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die für ein CPRA-Protein mit der in SEQ ID NO: 83 aufgeführten Aminosäuresequenz codiert.
Isolierte Nukleinsäure, die einen durch die Nukleotide 1006–3042, wie in SEQ ID NO: 81 aufgeführt, definierten codierenden Bereich umfaßt.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 2, die die Nukleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO: 81 aufgeführt ist, umfaßt.
Isoliertes Protein, das eine wie in SEQ ID NO: 83 aufgeführte Aminosäuresequenz umfaßt.
Vektor, der eine für CPRA-Protein, einschließlich einer wie in SEQ ID NO: 83 aufgeführten Aminosäuresequenz, codierende Nukleotidsequenz umfaßt.
Vektor nach Anspruch 5, wobei die Nukleotidsequenz in den Nukleotiden 1006–3042 der SEQ ID NO: 81 aufgeführt ist.
Vektor nach Anspruch 5, wobei der Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid, Phagemid, Phage und Cosmid.
Wirtszelle, die mit der Nukleinsäure nach Anspruch 1 transfiziert oder transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, wobei es sich bei der Wirtszelle um eine Hefezelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei es sich bei der Hefezelle um eine Candida sp. handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 10, wobei es sich bei der Candida sp. um Candida tropicalis handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Candida tropicalis um Candida tropicalis 20336 handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei es sich bei der Candida tropicalis um H5343 ura- handelt.
Verfahren zur Produktion eines CPRA-Proteins, einschließlich einer wie in SEQ ID NO: 83 aufgeführten Aminosäuresequenz, bei dem man: a) eine geeignete Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 83 aufgeführt ist, codiert, transformiert; und b) die Zelle unter Bedingungen, die die Expression des Proteins begünstigen, kultiviert.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Schritt der Kultivierung der Zelle die Zugabe eines organischen Substrats zum die Zelle enthaltenden Medium umfaßt.
Isolierte Nukleinsäure, die für CPRB-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 84 aufgeführt ist, codiert.
Isolierte Nukleinsäure, die einen durch die Nukleotide 1033–3069, wie in SEQ ID NO: 82 aufgeführt, definierten codierenden Bereich umfaßt.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 17, die die Nukleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO: 82 aufgeführt ist, umfaßt.
Isoliertes Protein, das eine wie in SEQ ID NO: 84 aufgeführte Aminosäuresequenz umfaßt.
Vektor, der eine für CPRB-Protein, einschließlich einer wie in SEQ ID NO: 84 aufgeführten Aminosäuresequenz, codierende Nukleotidsequenz umfaßt.
Vektor nach Anspruch 20, wobei die Nukleotidsequenz in den Nukleotiden 1033–3069 der SEQ ID NO: 82 aufgeführt ist.
Vektor nach Anspruch 20, wobei der Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid, Phagemid, Phage und Cosmid.
Wirtszelle, die mit der Nukleinsäure nach Anspruch 16 transfiziert oder transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 23, wobei es sich bei der Wirtszelle um eine Hefezelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 24, wobei es sich bei der Hefezelle um eine Candida sp. handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 25, wobei es sich bei der Candida sp. um Candida tropicalis handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 26, wobei es sich bei der Candida tropicalis um Candida tropicalis 20336 handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 27, wobei es sich bei der Candida tropicalis um H5343 ura- handelt.
Verfahren zur Produktion eines CPRB-Proteins, einschließlich einer wie in SEQ ID NO: 84 aufgeführten Aminosäuresequenz, bei dem man: a) eine geeignete Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 84 aufgeführt ist, codiert, transformiert; und b) die Zelle unter Bedingungen, die die Expression des Proteins begünstigen, kultiviert.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Schritt der Kultivierung der Zelle die Zugabe eines organischen Substrats zum die Zelle enthaltenden Medium umfaßt.
Verfahren zur Erhöhung der Produktion einer Dicarbonsäure, bei dem man: a) eine Wirtszelle mit einer natürlich vorkommenden Anzahl an CPRA-Genen bereitstellt; b) in der Wirtszelle die Anzahl an CPRA-Genen, die für ein CPRA-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 83 aufgeführt ist, codieren, erhöht; c) die Wirtszelle in ein organisches Substrat, das die Hochregulierung des CPRA-Gens bewirkt, enthaltenden Medien kultiviert, um so die Dicarbonsäureproduktion zu erhöhen.
Verfahren zur Erhöhung der Produktion eines CPRA-Proteins mit einer wie in SEQ ID NO: 83 aufgeführten Aminosäuresequenz, bei dem man: a) eine natürlich vorkommende Menge an CPRA-Protein aufweisende Wirtszelle mit einer erhöhten Kopienzahl eines CPRA-Gens, das für das CPRA-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 83 aufgeführt ist, codiert, transformiert; und b) die Zelle kultiviert und dadurch die Expression des Proteins im Vergleich mit der einer Wirtszelle, die eine natürlich vorkommende Kopienzahl des CPRA-Gens enthält, erhöht.
Verfahren zur Erhöhung der Produktion einer Dicarbonsäure, bei dem man: a) eine Wirtszelle mit einer natürlich vorkommenden Anzahl an CPRB-Genen bereitstellt; b) in der Wirtszelle die Anzahl an CPRB-Genen, die für ein CPRB-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 84 aufgeführt ist, codieren, erhöht; c) die Wirtszelle in ein organisches Substrat, das die Hochregulierung des CPRB-Gens bewirkt, enthaltenden Medien kultiviert, um so die Dicarbonsäureproduktion zu erhöhen.
Verfahren zur Erhöhung der Produktion eines CPRB-Proteins mit einer wie in SEQ ID NO: 84 aufgeführten Aminosäuresequenz, bei dem man: a) eine natürlich vorkommende Menge an CPRB-Protein aufweisende Wirtszelle mit einer erhöhten Kopienzahl eines CPRB-Gens, das für das CPRB-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 84 aufgeführt ist, codiert, transformiert; und b) die Zelle kultiviert und dadurch die Expression des Proteins im Vergleich mit der einer Wirtszelle, die eine natürlich vorkommende Kopienzahl des CPRB-Gens enthält, erhöht.