DE2140133C2

DE2140133C2 - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von α,ω-n-Alkandicarbonsäuren

Info

Publication number: DE2140133C2
Application number: DE19712140133
Authority: DE
Inventors: Shiro Tokyo Akabori; Isamu Kamakura Kanagawa Shiio; Ryosuke Yokohama Kanagawa Uchio
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1971-08-10
Filing date: 1971-08-10
Publication date: 1984-08-09
Also published as: DE2140133A1

Description

In der R Methyl oder Carboxyl bedeutet und η eine ganze Zahl zwischen 11 und 17 darstellt, In einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert in dem Bereich von 4 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C unter aeroben Bedingungen mit dem Enzym eines der Stämme Candida cloacae, Candida maltosa, Candida lipolytica, Candida parapsilosis, Candida Intermedia, Candida guilllermondii, Candida tropicalis, Pichia etchellsli und Pichia haplophila in Beruh- rung bringt.

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von α,ω-n-Alkandlcarbonsäuren mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen.

Dicarbonsäuren mit langen Kohlenstoffketten sind nützliche Rohstoffe für die Herstellung synthetischer Harze (Polyamide, Alkyde, Polyester), Schmieröle, Träger oder Verdünnungsmittel für Farben und ähnliches. Die Herstellung von Dicarbonsäuren mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen aus einfachen organischen Verbindungen wurde jedoch Im großtechnischen Rahmen bisher noch nie mit Erfolg durchgeführt.

Es wurde nun gefunden, daß Hefen der Gattung Candida und Pichia α,ω-Dlcarbonsäuren mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen in sehr hoher Ausbeute aus gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffen oder Monocarbonsäuren mit geraden Ketten von 12 bis 18 Kohlenstoffatomen unter aeroben Bedingungen erzeugen können.

Gemäß der Erfindung wird somit ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von ar.oi-n-Alkandicarbonsäuren mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen geschaffen, das dadurch gekennzeichnet Ist, daß man eine Verbindung mit einer geraden Kohlenstoffkette der Formel

In der R Methyl oder Carboxyl bedeutet und π eine ganze Zahl zwischen 11 und 17 darstellt. In einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert In dem Bereich von 4 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40° C unter aeroben Bedingungen mit dem Enzym eines der Stämme Candida cloacae, Candida maltosa, Candida lipolytica, Candida parapsilosis. Candida intermedia, Candida qullilermondli, Candida tropicalls, Pichia etchellsli und Pichia haplophila in Berührung bringt.

Die vorstehend aufgeführten Mikroorganismen werden nachstehend durch die Hinterlegungsnummern (FERM P) des Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of Industrial Trade and Industry, Japan, gekennzeichnet, In deren Kulturensammlung die Mikroorganismen hinterlegt worden sind und auf Anfrage zur Verfügung stehen:

Candida cloacae AJ-5341 (FERM P410) Candida cloacae AJ-5463 (FERM P-736) Candida tropicalis AJ-5340 (FERM P-734) Candida maltosa AJ-4718 (FERM P-733) Candida lipolytica A.M546 (FERM P-731) Candida parapsilosis A.M578 (FERM P-408) Candida Intermedia A.M625 (FERM P-732) Candida Intermedia AJ-4626 Candida guilllermondii AM532 (FERM P-730) Pichia haplophila AJ-5078 (FERM P-409) Pichia etchellsii AJ-5342 (FERM P-735)

Die beiden erstgenannten Stämme von Candida cloacae AJ-5341 und AJ-5463 waren neu Isoliert und Identifiziert worden als Candida cloacae durch Vergleich Ihrer Eigenschaften mit denen, die von Komagata und Mitarbeitern (J. Gen. Appl. Microbiology, 10 (1964) 323) für Candida cloacae gefunden wurden; sie unterscheiden sich aber von den bekannten Stämmen von Candida cloacae nur durch Ihr Unvermögen, L-Sorbose, Stärke, SaJlcin und 2-Ketogluconsäure zu assimilieren. Die neuen Stämme haben folgende Eigenschaften:

1. Mikroskopische Beobachtung (Wachstum in Hefeextrakt-Malzextrakt - GlucoseboulIIon bei 25° C während drei Tagen): Zellen sind 2,5 bis 6,5 μπι χ 2,0 bis 6,5 pm, kurz oval, und treten einzeln oder in Paaren auf. Sporen: werden nicht gebildet (In Kleyn Medium, Wlekerham Medium und Hefeextrakt, Malzextrakt, Glucose-Agar Medium).

Mycellen: primitive Pseudomycellen werden ausgebildet (in Kartoffel-Dextrose-Agar Medium durch die Dalmau Platten Methode.)

2. Agar Kolonien (Wachstum In Hefeextrakt, Malzextrakt, Glucosebouillon bei 25^JC während 20 Tagen). Eine Strichkultur Ist blaß gelblich-weiß bis grauweiß, glatt, schwach glänzend, welch oder butterartig und hat einen vollkommenen Rand.

3. Ringbildung: positiv (in Hefeextrakt, Malzextrakt, GlucoseboulIIon)

4. Vergärung von Kohlenwasserstoff

Vergärung von Glucose: positiv (schwach und

verzögert)

Vergärung von Galactose, Saccharose, Maltose, Lactose, Raffinose, Melecltose und Trehalose:

fehlt.

5. Assimilation von KNO₁: fehlt.

6. Abbau von Arbutln: negativ.

7. Vitaminbedarf: Biotin wird benötigt.

8. Verflüssigung von Gelatine: wird nicht verflüssigt.

9. HersteUung einer stärkeähnlichen Verbindung: fehlt.

10. Assimilation von Kohlenstoff Verbindungen:

D-Glucose, D-Galactose, Saccharose, Glycerin, Maltose, Adonlt, D-Mannlt, Cellobiose, D-Sorbit, Trehalose, ct-Methyl-D-Glucosld, Mellblose, Raffinose, Kallum-Gluconat, Melecltose, DL-Mllchsäure, Bernsteinsäure, D-Xylose, Zitronensäure und D-Ribose werden assimiliert. Äthanol, Erythrlt, Milchzucker, DuIcIt, L-Sorbose, SaIIcIn, Calslum-2-Ketogluconat, Inulin, Stärke, L-Arablnose, Inosit, D-Arablnose und L-Rhamnose werden nicht assimiliert.

Die Mikroorganismen werden vorzugsweise zuerst auf einem Medium gezüchtet, welches eine Im wcscntll-

chen assimilierbare Kohienstoffquellc, mit Ausnahme des Kohlenwasserstoffes oder dessen Derivat, enthalt, bis sie Ihre höchste Wachstumsrate erreichen. Der Kohlenwasserstoff oder sein Derivat wird nun dem Medium zugesetzt, welches dann bebrütet wird, bis die gewünschte DicarbonsSure sich bildet. Gewünschtenfails können die Mikrobenzeilen aus dem ursprünglichen Medium geemtet und In ein anderes Medium, welches den Kohlenwasserstoff oder sein Derivat enthält, zur aeroben Oxydation des Substrats durch das Enzym der Hefe übertragen werden.

Die für das Verfahren gemäß der Erfindung geeigneten Substrate, haben eine gerade Kette von 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, die gesättigt sind. Das Substrat kann ein Kohlenwasserstoff sein oder es kann eine endständige Carboxylgruppe haben. Einige der Mikroorganismen können solche Substrate als Kohlenstoffquellen während Ihrer Wachstumsphase verwerten. Die Verbindungen haben somit die vorstehend angegebene Formel.

Das verwendete ^uiturrnediarn soüte assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und die üblichen essentiellen anorganischen Salze und geringfügige organische Nährstoffe enthalten. Die Kohlenstoffquelle kann ein Kohlenwasserstoff, ein sauerstoffhaltiges Derivat davon, zum Beispiel ein Alkohol, Aldehyd, oder Monocarbonsäure, oder ein herkömmliches Kohlehydrat sein. Geeignete assimilierbare Stickstoffquellen umfassen Ammoniumchlorid, -sulfat und -phosphat, Kalium- und Natriumnitrate, Harnstoffe, Ammoniak In der Gasphase oder In wäßriger Lösung, Aminosäuren und Proteine. Als Beispiele für organische Nährstoffe dienen Vitamine, Aminosäuren, Nucleinsäuren, deren Derivate und Vorläuier. Hefeextrakt, Maisquellwasser, Pepton, Protelnhydrolysat, tierisches und pflanzliches Gewebe. Die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die anorganischen Salze und organischen Nährstoffe werden in den Medien gemäß der Erfindung in Mengen verwendet, die in der Technik durchaus üblich sind.

Die Gärung In einem gewöhnlichen Kulturmedium wird bei 20 bis 40° C, unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Indem man das Medium schüttelt, belüftet, und/oder das Medium rührt, um den Kontakt zwischen dem Kohlenwasserstoff oder dessen sauerstoffhaltigem Derivat und den Hefezellen aufrechtzuerhalten. Oberflächenaktive Mittel, Emulgatoren oder organische Lösungsmittel können dem Medium zugesetzt werden. Der pH-Wert des Mediums Hegt zwischen 4 und 9 und wird durch Zugabe von Alkallphosphaten, Kalium- oder Natriumhydroxyd, gasförmigem oder wäßrigem Ammoniak In der üblichen Weise während der Bildung der Dlcarbonsäure im Medium eingehalten. Die Züchtung wird meistens ein bis fünf Tage nach der Beimpfung beendet.

Die In der Bouillon angereicherte Dlcarbonsäure kann durch herkömmliche Methoden wie Lösungsmittelauszug oder Adsorption an einem Ionenaustauscherharz gewonnen werden. Im typischen Fall werden die wasserunlöslichen Bestandteile, hauptsächlich Zellen und das Substrat gemäß der Erfindung, durch Filtration oder Zentrifugieren aus der Bouillon entfernt, und die Dlcarbonsäure wird aus dem Flltrat mit Äther extrahiert und durch Verdampfen des Extraktionsmittels Isoliert.

Um die Dlcarbonsäure in der Bouillon festzustellen, wird ein beliebiger Teil alkalisch gemacht und filtriert, das Flltrat wird angesäuert und mit Äther extrahiert, die Säure In dem Extrakt wird mit Diazomethan verestert und der so gebildete Methylester wird der Gaschromatographie zur Identifizierung und zur quantitativen Bestimmung des Säuregehalts der Bouillon unterworfen. 5

Beispiel 1

Ein Kulturmedium wurde hergestellt durch Auflösen von 20 g (NH^)₂HPO₄, 2 g K₂HPO₄, 0,3 g MgSO₄, 10 jig

ίο FeSO₄, 8,2 g MnSO₄, 8,8 mg ZnSO₄ und 2 g Hefeextrakt in Wasser. Die so erhaltene Lösung wurde auf 900 ml mit Wasser verdünnt, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, und es wurden noch 45 g Sorbit beigemengt. Darn wurde es mit Candida cloacae AJ-5463 beimpft.

10 ml/dl n-Hexadecan wurden, wie in Tabelle I angegeben, bis zu 30 Stunden nach der Beimpfung dem Medium zugegeben und das Medium wurde danach 48 Stunden bei 30° C unter aeroben Bedingungen gehalten. 1 n-NaOH-Lösung wurde je nach Bedarf hinzugesetzt, um den pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5 zu halten. Die Mengen an !,K-Tetradecandicarbonsaure, die nach der Gärung in der Bouillon gefunden wurden, sind ebenfalls In der Tabelle I angeführt.

Tabelle I Zugabe von (Stunden nach Beimpfung)

_M Hergestellte

HOOC-C₁₄H₂₈-COOH (g/l)

8 14

30

11,8 13,4 19,6 18,7

Ein Liter Kullurbouillon, welche 19,6 g/dl 1,14-Tetradecandicarbonsäure enthielt, wurde wie oben beschrie ben hergestellt, mit 200 ml 5n-NaOH vermischt, gekocht und filtriert, um die Zellen zu entfernen. Dem Flltrat wurden 100 ml konzentrierte Salzsäure beigemengt, um die Dlcarbonsäure auszufällec. weiche durch Zentrifugieren und Umkristallisieren aus heißem Äthanol gesammelt wurde. Die kristalline, gereinigte Säure wog 14 g.

Beispiel 2

Es wurden mehrere 22,5 ml-Ansätze des gleichen in Beispiel 1 beschriebenen Kulturmediums in 500 ml Schüttelkolben gefüllt, jeweils mit 2 ml n-Dodecan gemischt und bei 115° C für 10 Minuten sterilisiert. Die Medien wurden dann mit den Suspensionen der jeweiligen In Tabelle II angegebenen Hefezellen, die aus einem Hefeextrakt, Malzextrakt Agarmedlum gewonnen wurden, auf dem sie 24 Stunden bei 30° C gezüchtet wurden, geimpft. Die Suspensionen bestanden aus 5x10' Zellen je ml, und die sterile 0,2 g/dl KCI Lösung wurde in einer Menge von 0,5 ml je Impfung benutzt.

Die einzelnen Gärungsbouillons wurden zweimal täglich auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5 mit 2n-KOH Lösung eingestellt und 72 Stunden unter Schütteln bei 3O⁰C gehalten. Die endgültigen Konzentrationen von 1,10 Decandicarbonsäure sind ebenfalls In Tabelle II angegeben.

Tabelle II

1,10-Decandicarbonsäure, mg/I

Candida cloacae ΛJ-5341 610

Candida mallosa ΛJ-4718 10

Candida Iipolytica AJ-4546 13

Candida parapsifosis AJ-4578 526

Candida intermedia AJ-4626 14

Candida intermedia AJ-4625 98

Pichia haplophila AJ-5078 21

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Beispiel 3

n-Tridftcan wurde gemäß der Arbeltsweise von Beispiel 2 anstelle des n-Dodecans verwendet, und es wurden zum Teil andere Hefen benutzt, wie dies aus Tabelle UI hervorgeht, in der außerdem die Endkonzentrationen der 1,11-Undecandicarbonsäure angegeben sind.

cloacae AJ-5341 und Candida Parapsilosls AJ-4578 wurden auf dem obengenannten Medium für die Dauer von 48 Stunden gezüchtet, und die sterilisierten Ansätze in den Kolben wurden mit den vorgezüchteten Hefen beimpft und bei 30° C für die Dauer von 72 Stunden unter Schütteln bebrütet. Calclumcarbonat wurde vor der Beimpfung zur Kontrolle des pH-Wertes In den in Tabelle V angegebenen Mengen zugesetzt; diese zeigt ebenfalls die Endkonzentrationen an Adipinsäure (C₆), Korksäure (C₈) und 1,10-Decandicarbonsäure (Ci ₂), die sich In der Bouillon fanden.

Tabelle V Tabelle III

1,11-llndcciintliairhonsäure, mg/1

Candida cloaceae AJ-5341	192,3
Candida maltosa AJ-4718	8,4
Candida parapsilosis AJ-4578	53
Candida quilüermondii AJ-4532	13
Candida tropicalis AJ-5340	6
Pichia etchellsii AJ-5342	8
Pichia haplophila AJ-5078	10
Beispiel 4

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Gemäß der Arbeitsweise in Beispiel 2 wurden die Kohlenwasserstoffe variiert, während jeder Ansatz mit Candida parapsilosis beimpft wurde. Die Mengen an α,ω-Alkandisäure mit 12, 13, 14 und 16 Kohlenstoffatomen, die e.us 8 ml/dl jeder der verschiedenen Kohlenwasserstoffe oder der Kohlenwasserstoffgemische hergestellt worden sind, sind in Tabelle IV angegeben.

Hefe α,ω-π-Alkandsäure, mg/1

CaCO₃, C₆ C₈

g/dl

C₁₂

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C. cloacae AJ-5341	12	1000	1000	1324,7
C. cloacae AJ-5341	14	1040	413	1423,3
C. Parapsiiosis AJ-4578	iO			1946,7
C. Parapsilosis AJ-4578	12			1686,6

Beispiel 6

Candida cloacae AJ-5463 wurde auf einem Medium wie in Beispiel 1, welches aber 5g/d> Sorbit enthält, während 24 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet, und Impfstoffen, welche jeweils einer Trokkenmasse von 250 mg entsprachen, wurden 13,5 ml Ansätze von 0,5 ml Phosphatpuffern bei einem pH-Wert von 7,5 zugesetzt, welche als Substrat jeweils die in Tabelle VI aufgeführten Kohlenwasserstoffe und Monocarbonsäuren in Mengen von 10 ml/dl für die Kohlenwasserstoffe und 1 g/dl von Monocarbonsäuren enthielten. (Ζ,ω-n-Alkandisäuren wurden Ii-; den verschiedenen Puffersuspensionen oder Lösungen hergestellt, so wie sie mittels der Länge Ihrer KohlenstoiTketten nach 72 Stunden bei 30° C gekennzeichnet wurden.

Tabelle VI

Substrat α,ω-n-Alkandisauren, g/l

	α,ω-n-Alkanelisäure, mg/1	Cu Cu C₁₆	46,2	n-Dodecan
Tabelle IV	C₁₂		21 1,8	⁵⁰ n-Tridecan
Kohlenwasserstoff		121,3	6	n-Tetadecan
	87	n-Pentadecan
		n-Hexadecan
n-Tetradecan	18	n-Heptadecan
n-Pendadecan		n-Octadecan
n-Hexadecan
Kerosin	Wie aus Bi

8,2	C₁₂	0,60	C,
9,83	Cu
12,4	C₁₄	0,08	C₁₂
16,9	C₁₅	0,06	C₁₃
18,46	C₁₆	0,12	C_l:
8,24	C₁₇	0,13	^ !5
6,46	C₁₈	0,12	C₁₆

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Beispiel 5

900 ml Kulturmedium wurden wie In Beispiel 1 hergestellt und auf den pH-Wert von 7,5 eingestellt. Mengen von 13,3 ml wurden In 500 ml Schüttelkolben abgefüllt, und 1,2 mi T>-Dodecan jedem Kolben zugesetzt, dessen Inhalt dann sterilisiert wurde. Candida :l 6 hervorgeht, sind die Hefen der Erflndung wirksamer bei der Umwandlung von Kohlenwasserstoffen In die entsprechenden Dialkansäuren oder Dialkansäuren mit kürzeren Kohienstoffketteri als bei der Umwandlung von Monocarbonsäuren. Falls nicht die sauerstoffhaltlgen Derivate zu einem besonders günstigen Preis zur Verfügung stehen, werden die Kohlenwasseretoffe bevorzugt, und die gesättigten Verbindungen geben normalerweise höhere Ausbeuten als die Verbindungen mit Doppelbindungen in ihren

Kohlenstoffketten. Es Ist weiterhin aus den Tabellen ersichtlich, daß die Erfindung bei der Umwandlung von Verbindungen mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen In die entsprechenden cr,ai-n-Dialkansäuren sehr vorteilhaft Ist.

Claims

Patentansprüche:

Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von α,ω-n-Alkandicarbonsäuren mit 12 bis 18 Kohlen-Stoffatomen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung mit einer geraden Kohlensloffketle der Formel