DE60132091T2 - Candida tropicalis cytochrom b5 gen und protein und verwendungen davon - Google Patents

Candida tropicalis cytochrom b5 gen und protein und verwendungen davon Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND
  • QUERVERWEISE AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen U.S.-Anmeldung mit der laufenden Nummer 60/220,958, eingereicht am 26. Juli 2000.
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Prozesse und Zusammensetzungen, die in die Herstellung von Dicarbonsäure in Hefe involviert sind. Die Erfindung betrifft insbesondere eine Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäure transformiert ist, die ein Cytochrom-b5-Protein kodiert.
  • 2. Beschreibung des Standes der Technik
  • Aliphatische α,ω-Dicarbonsäuren sind wandlungsfähige chemische Zwischenprodukte, die nützlich als Rohstoffe für die Herstellung von Parfüm, Polymeren, Klebemitteln und makroliden Antibiotika sind. Während einige chemische Synthesewege zur Synthese von langenkettigen α,ω-Dicarbonsäuren verfügbar, ist die Synthese nicht einfach und die meisten Verfahren führen zu Mischungen, die kürzere Kettenlängen enthalten. Demzufolge, sind aufwändige Reinigungsschritte erforderlich. Während bekannt ist, dass langkettige Dicarbonsäuren auch durch mikrobielle Veränderung von Alkanen, Fettsäuren oder deren Ester hergestellt werden können, ist aufgrund der Beschränkung der gegenwärtigen biologischen Ansätze die chemische Synthese der Weg geblieben, der wirtschaftlich am ehesten durchführbar ist.
  • Verschiedene Hefestämme sind dafür bekannt, dass sie α,ω-Dicarbonsäuren als Nebenprodukt ausscheiden, wenn sie auf Alkanen oder Fettsäuren als Kohlenstoffquelle gezüchtet werden. Insbesondere Hefe, die zum Genus Candida, wie C. albicans, C. cloacae, C. guillermondii, C. intermedia, C. lipolytica, C. maltosa, C. paraplilosis und C. zeylenoides gehören, sind dafür bekannt, dass sie solche Dicarbonsäuren produzieren (Agr. Biol. Chem. 35: 2033-2042 (1971)). Ebenfalls sind verschiedene Stämme von C. tropicalis dafür bekannt, dass sie Dicarbonsäuren herstellen, die sich in Kettenlängen von C11 bis C18 bewegen (Okino et al., BM Lawrence, BD Mookherjee und BJ Willis (Herausgeber) in „Flavors and Fragrances: A World Perspective", Proceedings of the 10th International Conference of Essential Oils, Flavors and Fragrances, Elsevier Science Publishers BV Amsterdam (1988), und sind die Basis etlicher Patente, wie dies von Bühler und Schindler, in Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnology, H.J. Rehm und G. Reed (Herausgeber), Vol. 169, Verlag Chemie, Weinheim (1984) dargelegt wird.
  • Studien der biochemischen Prozesse, durch welche Hefen Alkane und Fettsäuren metabolisieren, haben drei Typen von Oxidationsreaktionen offenbart: α-Oxidation von Alkanen zu Alkoholen, ω-Oxidation von Fettsäuren zu α,ω-Dicarbonsäuren und die degradative β-Oxidation von Fettsäuren zu CO2 und Wasser. Die beiden ersten Oxidationstypen werden durch mikrosomale Enzyme katalysiert, während der letzte Typ in den Peroxisomen stattfindet. In C. tropicalis wird der erste Schritt beim ω-Oxidationsstoffwechselweg durch einen membrangebundenen Enzym-Komplex (ω-Hydroxylase-Komplex) katalysiert, umfassend eine Cytochrom-P450-Monooxygenase und eine NADPH-Cytochrom-Reduktase. Dieser Hydroxylase-Komplex ist verantwortlich für die primäre Oxidation der endständigen Methylgruppe in Alkanen und Fettsäuren, wie zum Beispiel beschrieben in Gilewicz et al., Can. J. Mikrobiol. 25: 201 (1979). Die Gene, die die cytochromen P450- und NADPH-Reduktasekomponenten des Komplexes kodieren, wurden vormals jeweils als P450ALK und P450RED identifiziert und wurden ebenfalls geklont und wie zum Beispiel in Sanglard et al., Gene 76: 121-136 (1989) beschrieben, sequenziert. P450ALK wurde auch als P450ALK1 bezeichnet. Seit kurzem werden ALK-Gene mit dem Symbol CYP und RED-Gene wurden mit dem Symbol CPR gekennzeichnet. Siehe zum Beispiel Nelson, Pharmacogenetics 6 (1): 1-42 (1996). Siehe auch Ohkuma et al., DNA and Cell Biology 14: 163-173 (1995), Seghezzi et al., DNA and Cell Biology, 11: 767-780(1992) und Kargel et al., Yeast 12: 333-348 (1996). P450ALK wird auch als CYP52 bezeichnet gemäß der Nomenklatur von Nelson, supra. Fettsäuren werden ultimativ aus Alkanen nach zwei zusätzlichen Oxidationsschritten gebildet, katalysiert durch Alkoholoxidase, wie beispielsweise in Kemp et al., Appl. Microbiol. and Biotechnol. 28: 370-374 (1988) beschrieben, und durch Aldehyddehydrogenase. Die Fettsäuren können weiter durch den gleichen oder einem ähnlichen Weg zur entsprechenden Dicarbonsäure oxidiert werden. Die ω-Oxidation von Fettsäuren läuft über die ω-Hydroxyfettsäure und ihr Aldehyd-Derivat zur entsprechenden Dicarbonsäure, ohne dass eine CoA-Aktivierung nötig ist. Es können jedoch sowohl Fettsäuren als auch Dicarbonsäuren nach der Aktivierung zum korrespondierenden Acyl-CoA-Ester abgebaut werden über den β-Oxidationsstoffwechselweg in den Peroxisomen, was zur Kettenverkürzung führt. In Säugetiersystemen werden sowohl Fettsäure- als auch Dicarbonsäureprodukte aus der ω-Oxidation zu gleichen Teilen zu ihren CoA-Estern aktiviert und sind Substrate sowohl für die Mitochondrien- als auch für die peroxisomale β-Oxidation (J. Biochem., 102: 225-234 (1987)). In Hefe findet die β-Oxidation nur in den Peroxisomen statt (Agr.Biol.Chem. 49: 1821-1828 (1985)).
  • Die Herstellung von Dicarbonsäuren durch Fermentierung von ungesättigten C14-C16-Monocarbonsäuren unter Einsatz eines Stammes der Spezies C. tropicalis wird im U.S.-Patent 4,474,882 offenbart. Die ungesättigen Dicarbonsäuren entsprechen den Ausgangsmaterialien, was die Anzahl und Position der Doppelbindungen betrifft. Gleiche Prozesse, in denen andere spezielle Mikroorganismen eingesetzt werden, werden in den U.S.-Patenten 3,975,234 und 4,339,536 , in der britischen Patentbeschreibung 1,405,026 und in den deutschen Patent-Veröffentlichungen 21 64 626 , 28 53 847 , 29 37 292 , 29 51 177 und 21 40 133 beschrieben. Die US 5,620,878 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Alpha-, Omega-Dicarbonsäuren, umfassend die Züchtung eines C. tropicalis-Stammes, dessen gesamte vier POX-Gene zerstört sind und der eine erhöhte Kopienzahl von mindestens einem P450ALK-Gen, mindestens ein P450RED-Gen, oder eine Kombination dieser Gene in einem Kulturmedium, enthaltend eine Stickstoffquelle, ein organisches Substrat und ein Co-Substrat, aufweist.
  • Cytochrom-P450-Monooxygenasen (P450s) sind terminale Monooxidasen eines Multikomponenten-Enzymsystems, mit umfassend P450 und CPR. In einigen Fällen ist ein zweiter Elektronenträger, Cytochrom b5 (CYTb5) und seine assoziierte Reduktase, wie oben und in Morgan, et al., Drug Metab. Disp. 12: 358-364 (1984), beschrieben, beteiligt. Die P450s umfassen eine Superfamilie von Proteinen, die weit verteilt in der Natur vorhanden sind und die aus einer Vielzahl von Organismen isoliert wurden, wie zum Beispiel in Nelson, supra. beschrieben ist. Diese Organismen schließen verschiedene Säugetiere, Fische, Wirbellose, Pflanzen, Mollusken, Krebse, niedere Eukaryonten und Bakterien (Nelson, supra) mit ein. Nachdem sie zuerst in Mikrosomen von Nagetieren-Lebermikrosomen als ein Kohlenstoff-Monoxid bindendes Pigment, wie beispielsweise beschrieben in Garfinkel, Arch. Biochem. Biophys. 77: 493-509 (1958) entdeckt wurden, wurden P450s später, basierend auf ihrer Absorption bei 450 nm in einem reduzierten-CO-gekoppelten Differenzspektrum, wie beispielsweise in Omura et al., J. Biol. Chem. 239: 2370-2378 (1964) beschrieben, benannt.
  • P450s katalysieren den Stoffwechsel einer Vielzahl von endogenen und exogenen Verbindungen, wie beispielsweise beschrieben in Nelson, supra, und Nebert et al., DNA Cell. Biol. 10: 1-14 (1991). Endogene Verbindungen schließen Steroide, Prostanoide, Eicosanoide, fettlösliche Vitamine, Fettsäuren, Säugetier-Alkaloide, Leukotrine, biogene Amine und Phytolexine (Nelson, supra, and Nebert et al., supra) mit ein. Der Stoffwechsel von P450 umfasst Reaktionen wie Epoxidierung, Hydroxylierung, Dealkylierung, Hydroxylierung, Sulfoxidierung, Desulfuration und reduktive Dehalogenisierung. Im Allgemeinen führen diese Reaktionen dazu, dass die Verbindung wasserlöslicher wird, was förderlich für die Ausscheidung ist, und elektrophiler wird. Diese elektrophilen Produkte können schädliche Wirkungen haben, wenn sie mit der DNA oder anderen zellulären Bestandteilen reagieren. Sie können jedoch durch Konjugation mit hydrophile Substanzen, welche ein niedriges Molekulargewicht aufweisen, reagieren, was zur Glukoronisierung, Sulfatierung, Acetylierung, Aminosäurenkonjugation oder Glutathionkonjugation und typischer Weise zur Inaktivierung und Eliminierung führt, wie dies beispielsweise in Klaassen et al, Toxicology, 3rd ed, Macmillan, New York, 1986 beschrieben ist.
  • P450s sind Hämthiolatproteine, bestehend aus einer Häm-Gruppe, die an einer einzelnen Polypeptidkette von 45,000 bis 55,000 Da gebunden ist. Das Eisen der prosthetischen Häm-Gruppe befindet sich im Zentrum eines Protoporphyrinrings. Dem Porphyrinring können vier Liganden des Häm-Eisens zugeordnet sein. Der fünfte Ligand ist ein Thiolat-Anion von einem Cystein-Rest des Polypeptids. Der sechste Ligand ist wahrscheinlich eine Hydroxylgruppe von einem Aminosäurenrest oder ein Rest mit einer gleichen Feldstärke, wie ein Wassermolekül, wie es beispielsweise bei Goeptar et al, Critical Reviews in Toxicology 25(1): 25-65 (1995) beschrieben ist.
  • Monooxygenierungsreaktionen, die durch Cytochrome P450s in einem eukaryontischen, membrangebundenen System katalysiert werden, erfordern den Transfer von Elektronen von NADPH zu P450 über NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase (CPR), wie beispielsweise beschrieben in Taniguchi et al., Arch. Biochem. Byophys. 232-585 (1984). CPR-Gene werden jetzt auch als NCP-Gene bezeichnet. Siehe beispielsweise Debacker et al., Antimicrobial agents and Chemotherapy, 45: 1660 (2001). CPR ist ein Flavoprotein von etwa 78,000 Da, enthaltend 1 mol Flavinadeninonucleotid (FAD) und 1 mol Flavinmononukleotid (FMN) pro Mol Enzym, wie zum Beispiel beschrieben in Potter et al., J. Biol. Chem. 258: 6906 (1983). Der FAD-Rest von CPR ist der Ort des Elektroneneintritts in das Enzym, wohingegen FMN der Ort der Elektronenabgabe an P450, wie beispielsweise beschrieben in Vermilion et al, J. Biol. Chem. 253: 8812 (1978). Die Gesamtreaktion ist wie folgt: H+ + RH + NADPH + O2 → ROH + NADP+ + H2O
  • Das Binden eines Substrats an die katalytische Stelle des P450 resultiert offensichtlich zu einer konformativen Änderung, wobei der Elektronentransfer von CPR zu P450 eingeleitet wird. Nachfolgend auf den Transfer des ersten Elektrons, geht O2 eine Bindung mit dem Fe2 +-P450-Substrat-Komplex ein, um den Fe3 +-P450-Substratkomplex zu bilden. Dieser Komplex wird dann durch ein zweites Elektron von CPR, oder in einigen Fällen, von NADH über einen zweiten Elektronen-Carrier, Cytochrom b5 (CYTb5), und seiner assoziierten NADH-Cytochrom b5-Reduktase, wie beschrieben, reduziert, wie dies zum Beispiel in Guengerich et al., Arch. Biochem. Biophys. 205: 365 (1980) und Morgan, supra, beschrieben ist. Die meisten der vorstehend genannten Studien implizieren, dass CYTb5 nur zum Zwecke des Transfers des zweiten Elektrons in den Stoffwechselweg involviert ist. Ein Atom dieses reaktiven Sauerstoffs wird in das Substrat eingeführt, während das andere zu Wasser reduziert wird. Das sauerstoffangereicherte Substrat zerfällt dann, wobei es die oxydierte Form des Cytochroms P450 regeneriert, wie beispielsweise in Klassen, Amdur und Doull, Casarett and Doull's Toxicology, Macmillan, New York (1986) beschrieben.
  • Was CYTb5 betrifft, so wurden mehrere andere Modelle in Bezug auf die Rolle dieses Proteins bei der P450-Expression neben seiner Rolle als Elektronenträger vorgeschlagen. Ein weiteres Modell bezüglich der Rolle von CYTb5 bei der P450-Expression basiert auf Effekte der Protein-Protein-Interaktionen, wie zum Beispiel beschrieben in Tamburin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 11-15 (1986). Bei diesem Modell führt die CYTb5-Anbindung mit P450 zu einem Komplex mit erhöhtem Spin-Gehalt. Dieser Komplex hat dann eine höhere Affinität für CPR. Durch diese Interaktion stellt CYTb5 nicht wirklich das zweite Elektron zur Verfügung, reduziert aber die Zeit zwischen dem ersten und zweiten Elektronentransfer. Diese Schlussfolgerungen wurden auf der Basis von Versuchen mit Kaninchen-CYP2B4 gemacht. Außerdem verhinderte CYTb5 nicht die Interaktion von Kaninchen-CYP2B4 mit CPR; deswegen wurde vorgeschlagen, dass die P450-Bindungungsdomainen für CYTb5 und CPR unterschiedlich sein sollten. Die könnte möglicherweise erklären, warum nur bestimmte P450 mit CYTb5 interagieren. Es ist bekannt, dass CYTb5 durch Cytochrom b5-Reduktase oder CPR reduziert werden kann, wie beispielsweise in Enoch et al., J. Bio. Chem, 254: 8976-8981 (1979) beschrieben ist. Jedoch führte in mindestens einem interessanten Fall die Addition von Cytochrom-b5-Reduktase zu einem wiederhergestellten System, enthaltend CYTb5, nicht zu einer erhöhten Substratoxidation, wie beispielsweise in Sugiyama et al., J. Biochem., 87: 1457-1467 (1979) beschrieben.
  • Verschiedene andere Studien gaben ebenfalls an, dass CYTb5 die Phosphorylierung des Cytochroms P450's reguliert, indem es die Phosphorylierung des Cytochroms P450 durch verschiedene Proteinkinasen hemmt, beispielsweise die von cAMP abhängige Proteinkinase und die Proteinkinase C, wie beispielsweise beschrieben in Jansson et al., Arch. Biochem. Biophysm., 259: 441-448 (1987), Epstein et al., Arch. Biochem. Biophys., 271 (2): 424-432 (1989) und Lobanov et al., Biokhimiia, 58 (10): 1529-1537 (1993).
  • Unabhängig vom Mechanismus geben viele Studien an, dass das Miteinbeziehen von CYTb5's vorteilhaft in einigen von P450 unterstützten Reaktionen ist. Eine obligatorische Rolle von CYTb5 wurde in einigen wieder hergestellten P450-Sytemen beschrieben, wie beispielsweise in Sugiyama et al., supra, Sugiyama et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 90: 715-720 (1979), Canova-Davis et al., J. Bio. Chem., 259: 2541-2546 (1983), Kuwahara et al., Biochem and Biophys. Res. Comm., 96: 1562 (1980) and Sasame et al., Life Sciences 14: 35-46 (1974). In all diesen Fällen wurde die Aktivität beseitigt entweder durch das Weglassen von exogen zugeführtem CYTb5 oder seine Inaktivierung durch das Hinzufügen von CYTb5-Antikörper. Wie oben angegeben, ist CYTb5 auch an dem Stoffwechselweg für das zweite Elektron in einigen von P450 unterstützten Reaktionen beteiligt, wie beispielsweise in Hrycay et al., Archv. Biotech., 165: 331-339 (1974), Imai et al., Biochem and Biophys. Res. Comm. 75: 420-426 (1977) and Imai, J. Biochem., 89: 351-362 (1980) sowie die Reduktion von Oxy-Cytochrome P450 zum aktiven Sauerstoff-Komplex, wie beispielsweise beschrieben in Noshiro et al., J. Biochem., 116: 521-526 (1981).
  • In anderen Studien, die wiederhergestellte Systeme einsetzen, erhöhte exogen zugegebenes CYTb5 die Aktivitäten des Kaninchen CYP2B4, wie beispielsweise beschrieben in Sugiyama et al., J. Biochem., 92: 1793-1803 (1982), und Chiang, Archv. Bioch. Biophy., 211: 662-673 (1981). Das Kaninchen-CYP1A2, wie beispielsweise beschrieben in Vatsis et al., J. Biol. Chem., 257: 11221-11229 (1982), Hunde-CYP2B11 und Ratten-CYP2B1, wie zum Beispiel beschrieben in Duignan et al., Arch. Bioch. Biophy., 267: 294-304 (1988), und eine Ratten-P450-Chlorobenzol-Hydroxylierungsreaktion, wie beispielsweise beschrieben in Lu et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 61: 1348-1355 (1974).
  • CYP51, Lanosterol-14α-Demethylase führt eine wichtige Reaktion bei der Biosynthese von Ergosterol aus, wobei das Haupt-Membranstyrol von Saccharomyces cerevisiae (Sc), wie zum Beispiel in Parks, CRC Crit. Rev. Microbiol., 6: 301-341 (1978) beschrieben.
  • Sc-Stämme, die Ergosterin synthetisieren, benutzen kein exogenes Ergosterin, aber diejenigen, die in Vorstufen von Ergosterin oder in der Häm-Biosynthese blockiert sind, können Ergosterin aufnehmen und es als exogenes Ergosterin einsetzen, wie beispielsweise beschrieben in Parks, supra. Anaerob gezüchtete Sc kann keine Styrole synthetisieren, benutzt aber exogenes Ergosterin. Das Zerstören von CYP51 produziert Sc-Stämme, die fortfahren, 14-α-Methyl-Styrole zu produzieren, die kein bestimmbares Ergosterin produzieren und die unfähig sind, aerob zu wachsen, wie beispielsweise beschrieben in Kalb et al., DNA, 6: 529-537 (1987). Sie sind eher obligat anaerob, ein Zustand, in dem sie exogenes Ergosterin sammeln.
  • CPR fungiert als der Elektronen-Donor für diese Demethylase-Reaktion, wie zum Beispiel beschrieben in Aoyama et al., J. Biol. Chem., 259: 1661-1666 (1984). Wenn CPR der alleinige Elektronendonor an CYP51 in Sc. ist, müssten CPR-Null-Mutanten (cprl) phenotypisch den zerstörten CYP51-Stämmen (cyp51) ähneln. Jedoch war eine Sc cprl-Null-Mutante nicht obligatorisch anaerob und produzierte Ergosterin, wie beispielsweise beschrieben in Sutter und Loper, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 160: 1257-1266 (1989). Die Herstellung von Ergosterin zeigt, dass einige CYP51 immer noch funktionell sind. Es ergab sich, das das für diese Wiederherstellung eines cprl-Null-Mutanten verantwortliche Gen das kodierende CYTb5 war, was zeigte, dass in diesem System CYTb5 in der Lage ist, CPR funktionell zu imitieren, wenn es in erhöhter Kopienzahl vorhanden ist, wie beschrieben zum Beispiel in Truan et al., Gene, 142 (1): 123-7 (1994).
  • Die Expression von Säugetier-P450s in Sc. wurde mit verschiedenen Ergebnissen durchgeführt, wie beispielsweise beschrieben in Renau et al., J. Biochem. 194: 889-896 (1990), Urban et al., Biochemie, 72: 463-472 (1990), und Pompon et al., Molecular Endocrinology, 3: 1477-1487 (1989). Studien haben gezeigt, dass die Aktivität von verschiedenen P450s aus Säugetieren, die in Sc exprimiert wurden, sich bei der Zugabe von Kaninchen-CYTb5 zu isolierten Mikrosomen dieser Stämme verbesserte. Insbesondere nahm die Aktivität der mikrosomalen menschlichen CYP3A4 und die Aktivität der Maus-Cypla-1 bei der Zugabe von Kaninchen-CYTb5 zu, wie beispielsweise beschrieben in Renaud et al., supra, und Urban et al., supra.
  • Zusätzlich zu seinen positiven Wirkungen, konnte eine Studie, die sich mit Sc befasste, darauf hinweisen, dass CYTb5 negativ wirken kann, wie beispielsweise beschrieben in Pompon et al., supra. Die Zugabe von Kaninchen-CYTb5 zu isolierten Mikrosomen von Sc die eine menschliche CYP 19 exprimiert, führte zu einer Abnahme der Aromatase-Aktivität.
  • Kurzkettige (≤ C12) aliphatische Dicarbonsäuren (Disäuren) sind wichtige industrielle Zwischenprodukte bei der Herstellung von Diestern und Polymeren, und werden als Thermoplasten, Plastifizierungsmittel, Schmiermittel, hydraulische Fluide, landwirtschaftliche Chemikalien, Pharmazeutika, Farbstoffe, Tenside und als Klebstoffe eingesetzt. Der hohe Preis und die begrenzte Verfügbarkeit von kurzkettigen Disäuren beruhen auf den Beschränkungen, die von der bestehenden chemischen Synthese auferlegt werden.
  • Langkettige Disäuren (aliphatische α,ω-Dicarbonsäuren mit einer Kohlenstoffanzahl von 12 oder mehr, auf die nachfolgend auch als Disäuren Bezug genommen wird) (HOOC-(CH2)n-COOH) sind eine vielseitige Familie von Chemikalien mit nachgewiesener und potentieller Nützlichkeit in einer Vielzahl von chemischen Produkten, mit eingeschlossen Kunststoffe, Klebstoffe und Duftstoffe. Leider kann das komplette Marktpotential von Disäuren nicht realisiert werden, da durch chemische Prozesse nur eine geringe Palette dieser Stoffe zu einem relativ hohen Preis hergestellt werden kann. Weiterhin unterliegen chemische Verfahren zur Herstellung von Disäuren einer Anzahl von Beschränkungen und Nachteilen. Alle chemischen Prozesse sind auf die Herstellung von Disäuren mit einer spezifischen Kohlenstoffkettenlänge beschränkt. Zum Beispiel beginnt das Dodecandionsäure-Verfahren mit Butadien. Das resultierende Disäuren-Produkt ist auf die Vielfachen von Vierer-Kohlenstofflängen beschränkt, in der Praxis wird nur Dodecandionsäure hergestellt. Der Dodecandionsäure-Prozess beruht auf nicht erneuerbare, petrochemische Ausgangsstoffe. Der Multireaktions-Umwandlungsprozess produziert unerwünschte Nebenprodukte, was zu Verlusten bei der Ausbeute, zu NOx-Verseuchung und zu Schwermetallmüll führt. Langkettige Disäuren bieten potentielle Vorteile gegenüber kurzkettigen Disäuren, aber ihr hoher Verkaufspreis und ihre begrenzte kommerzielle Verfügbarkeit verhindern eine ausgedehnte Verbreitung bei vielen dieser Anwendungen. Die Biokatalyse bietet einen innovativen Weg zur Beseitigung dieser Einschränkungen mit einem Verfahren, das eine große Auswahl an Disäure-Produkten aus erneuerbaren Ausgangsstoffen produziert. Es gibt jedoch keinen kommerziell durchführbaren Bioprozess, um langkettige Disäuren aus erneuerbaren Ausgangsstoffen zu produzieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, welche mit einer Nukleinsäure transformiert ist, welche das CYTb5-Protein (SEQ. ID. Nr. 2) kodiert, wobei die Wirtszelle eine Zerstörung des β-Oxidationsstoffwechselweges aufweist.
  • Es wird ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von Dicarbonsäure zur Verfügung gestellt, beinhaltend: das Bereitstellen einer Wirtszelle, die kein, ein oder mehr CYTb5-Gene aufweist; das Erhöhen der Anzahl von CYTb5-Genen in der Wirtszelle, die ein CYTb5-Protein kodieren, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. Nr. 2 aufweist, wobei die Wirtszelle eine Zerstörung des β-Oxidationswegs aufweist; und das Kultivieren der Wirtszelle in einem organisches Substrat enthaltenen Medium, wobei das Substrat die Expression des CYTb5-Gens induziert, um die erhöhte Produktion von Dicarbonsäure zu bewirken.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A-1C stellen die Nukleotidsequenz des CYTb5-Gens (SEQ ID Nr. 1) und die Aminosäurensequenz des CYTb5-Proteins (SEQ. ID. NR. 2) dar.
  • Die 2A-2B stellen die Nuklotidsequenz des CPRA-Gens (SEQ. ID. NR. 3) dar.
  • Die 3A-3C stellen die Aminosäuresequenz des CPRA-Proteins (SEQ. ID. NR. 4) dar.
  • Die 4A-4B stellen die Nukleotidsequenz des CPRB-Gens (SEQ. ID. NR. 5) dar.
  • Die 5A-5C stellen die Aminosäuresequenz des CPRB-Proteins (SEQ. ID. NR. 6) dar.
  • Die 6A-6C stellen die Nukleotidsequenz des CYP52A1A-Gens (SEQ. ID. NR 7) dar.
  • Die 7A-7C stellen die Nukleotidsequenz des CYP52A2A-Gens (SEQ. ID. NR. 8) dar.
  • Die 8A-8C stellen die Nukleotidsequenz des CYP52A2B-Gens (SEQ. ID. NR. 9) dar.
  • Die 9A-9C stellen die Nukleotidsequenz des CYP52A3A-Gens (SEQ. ID. NR. 10) dar.
  • Die 10A-10C stellen die Nukleotidsequenz des CYP52A3B-Gens (SEQ. ID. NR. 11) dar.
  • Die 11A-11C stellen die Nukleotidsequenz des CYP52D4A-Gens (SEQ. ID. NR. 12) dar.
  • Die 12A-12C stellen die Nukleotidsequenz des CYP52A5A-Gens (SEQ. ID. NR. 13) dar.
  • Die 13A-13C stellen die Nukleotidsequenz des CYP52A5B-Gens (SEQ. ID. NR. 14) dar.
  • Die 14A-14B stellen die Nukleotidsequenz des CYP52A8A-Gens (SEQ. ID. NR. 15) dar.
  • Die 15A-15C stellen die Nukleotidsequenz des CYP52A8B-Gens (SEQ. ID. NR. 16) dar.
  • 16 ist eine schematische Darstellung eines Klonvektors pTrip1EX, erhältlich von KlontechTM Laborstories, Inc.. Es werden ausgewählte Restriktionsstellen innerhalb der multiple Klonierungsstellen gezeigt.
  • 17A ist eine Karte des ZAP ExpressTM-Vektors.
  • 17B ist eine schematische Darstellung des Phagemid-Klonierungsvektors pBK-CMV.
  • 18 ist eine schematische Skizze einer Methode zur Extraktion und Analyse von Disäuren und Monosäuren aus Kulturmedien.
  • 19 ist eine schematische Darstellung von Plasmid pCR2.1TM, erhältlich von Invitrogen. Nukleinsäuresequenzen für ausgewählte Restriktionsstellen und von anderen Merkmalen sind angegeben (SEQ. ID. NR. 43 und komplementärer Strang SEQ. ID. NR. 44).
  • 20 ist eine schematische Darstellung des S. cerevisiae-Vectors pYES 2,0, erhältlich von Invitrogen. Ausgewählte Restriktionsstellen sind angegeben.
  • 21 ist eine schematische Darstellung bestimmter konservierter Abschnitte von bestimmten CPR-Genen.
  • 22 ist eine schematische Darstellung eines Plasmids pHKM1. Ausgewählte Restriktionsstellen sowie die Position des CPRA-Gens sind angegeben.
  • 23 ist eine schematische Darstellung eines Plasmids pHKM4. Ausgewählte Restriktionsstellen sowie die Position des CPRA-Gens sind angegeben.
  • 24 ist eine schematische Darstellung eines Plasmids pHKM9. Ausgewählte Restriktionsstellen sowie die Position des CPRB-Gens sind angegeben.
  • 25 ist eine graphische Darstellung des logarithmischen Verhältnisses von unbekanntem Produkt (u) zu einem kompetitiven Produkt © aufgetragen gegen die Konzentration von kompetitiver-RNA in QC-RT-PCR-Reaktionen, die sich auf CYTb5 beziehen.
  • 26 ist eine schematische Darstellung eines Vorganges zur Regenerierung eines URA3A-Gentyps über homologe Rekombination unter Beteiligung von CYTb5- und/oder CPR-Genen.
  • 27 ist eine schematische Darstellung einer homologen Rekombination unter Beteiligung eines Split-URA3A-Gens und das Einbringen von CPR und/oder CYTb5-Genen.
  • 28 stellt die Nuclotidsequenz des URA3A-Gens (SEQ. ID. NR. 45) dar
  • 29 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pNKB193, das von New England Biolabs. Erhältlich ist. Es sind ausgewählte Restriktionsstellen angegeben.
  • 30 ist eine schematische Darstellung des Integrationsvektors pURAin, der modifiziertes URA3A in dem NEB193-Plasmid enthält.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Produktivität der Disäuren durch die selektive Zunahme eines Proteins verbessert, das wichtig für die Oxidation organischer Substrate, wie Fettsäuren, welche in der gewünschten Zuführung enthalten sind. Ein einziges CYTb5-Gen von C. tropicalis 20336 wurde identifiziert und gekennzeichnet, welches an P450-Reaktionen beteiligt ist.
  • Die Nukleotidsequenz (2710 bp) der vollen Länge des CYTb5-Gens beinhaltet einen regulativen Bereich und einen ein Protein kodierenden Bereich, der durch Nukleotide 1109-1495 definiert ist, wie in den 1A-1C gezeigt wird. Die Aminosäuresequenz (129 Aminosäuren) des CYTb5-Proteins wird ebenfalls in den 1A-1C gezeigt.
  • Die Vervielfältigung des CYTb5-Gens in Wirtszellen, beispielsweise Hefe, die Dicarbonsäure ausscheiden, insbesondere α,-ω-Dicarbonsäuren, als ein Nebenprodukt, wenn sie auf Alkan- oder Fettsäure-Substraten kultiviert werden, produziert einen größeren Ertrag an Dicarbonsäuren. Die Expression des CYTb5-Gens von C. tropicalis und seine Induktion durch Alkane oder Fettsäuren kann in Zellen gemessen werden, die im Verkauf der fermentativen Biokonversionen isoliert werden, wobei der nachfolgend beschriebene, quantitative, kompetitive Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktions-Assay(QC-RT-PCR-Assay) verwendet wird (siehe Beispiele 11 und 14).
  • Zudem verursacht die Veränderung von existierenden Promotoren und/oder die Isolierung alternativer Promotoren eine erhöhte Expression des CYTb5-Gens. Starke Promotoren werden von mindestens vier Quellen erhalten: zufällige oder spezifische Veränderungen des CYTb5-Promotors, die Auswahl eines starken Promotors aus zur Verfügung stehenden Genen von Candida β-Oxidations-Genen, wie POX4 und POX5, oder durch das Screenen zur Auswahl von weiteren geeigneten Candida-Promotoren.
  • Die Stärke des Promoters wird unter Einsatz von QT-RT-PCR gemessen, um die CYTb5-Genexpression in Hefe, beispielsweise in Candida-Zellen, die aus Fermentern gewonnen wurden, zu messen. Enzymatische Analysen und Antikörper, die spezifisch für das CYTb5-Protein sind, werden eingesetzt, um zu bestätigen, dass die erhöhte Promotorstärke durch die erhöhte Synthese des entsprechenden Proteins reflektiert wird. Wenn einmal ein geeigneter Promoter identifiziert ist, wird er an das ausgewählte CYTb5-Gen angebunden und in Candida hineingebracht, um einen neuen, verbesserten Produktionsstamme zu konstruieren. Man kann feststellen, dass der kodierende Bereich des CYTb5-Gens an geeignete Promotoren oder andere regulierende Sequenzen, die dem Fachmann bekannt sind, angebunden werden kann.
  • Die Disäure-Bildung wird somit durch selektive Integration, Vervielfältigung und durch die Überexpression des CYTb5-Gens im C. tropicalis-Produktionswirt verbessert.
  • Es sollte zu verstehen sein, dass Wirtszellen, in die eine oder mehr Kopien des gewünschten CYTb5-Gens eingeführt werden, so gestaltet werden können, dass sie mit Hilfe jeder beliebigen, dem Fachmann bekannten Technik ein Gen beinhalten können.
  • Zum Beispiel beinhalten geeignete Wirtszellen Procaryonten wie Bacillus sp., Pseudomous sp., Actinomycdetes sp., Eschericia sp., Mycobacterium sp., und Eucaryonten wie Hefe, Algen, Insektenzellen, Pflanzenzellen und filamentöse Pilze. Geeignete Wirtszellen sind vorzugsweise Hefezellen wie Yarrowia, Bebaromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trychosporan, Cryptococcus, Endomyces, Galactomyces, Williopsis, Waltomyces, und am meisten bevorzugt solche der Candida-Gattung. Bevorzugte Arten von Candida sind tropicalis, maltosa, apicola, paratropicalis, albicans, cloacae, guillermondii, intermedia, lipolytica, parapsilosis und zeylenoides. Besonders bevorzugte Wirte beinhalten C. tropicalis-Stämme, die genetisch verändert wurden, so dass ein oder mehrere der chromosomalen POX4A, POX4B und beide POX5-Gene zerstört wurden, wie beispielsweise in den U.S.-Patenten Nummern 5,254,466 und 5,620,878 beschrieben ist. Die Zerstörungen des POX4- und POX5-Gen blockieren effektiv den β-Oxidationsstoffwechselweg in ihrer ersten Reaktion (die durch Acyl-CoA-Oxidase katalysiert wird) in einem C. tropicalis-Wirtsstamm. Die POX4A und POX5-Gene kodieren voneinander verschiedene Untereinheiten von langkettiger Acyl-CoA-Oxidase, bei denen es sich um die peroxisomalen Polypeptide (PXPs) handelt und die jeweils mit PXP-4 und PXP-5 bezeichnet werden. Die Zerstörung von einem oder mehr dieser Gene führt zu einer teilweisen oder kompletten Inaktivierung des β-Oxidationsstoffwechselwegs und ermöglicht somit bessere Ausbeuten von Dicarbonsäuren, indem das Substrat wieder zum ω-Oxidationsstoffwechselweg hingeführt wird, und verhindert die Wiederverwendung der Dicarbonsäureprodukte durch den β-Oxidationsstoffwechselweg.
  • Beispiele von Stämmen von C. tropicalis, die teilweise beta-oxidationsblockiert sind, beinhalten H41, H41B, H51, H45, H43, H53, H534, H534B und H435, wie in dem oben genannten U.S.-Patent Nr. 5,254,466 beschrieben. Ein Beispiel für einen Stamm von C. tropicalis, der in seiner Beta-Oxidation komplett blockiert ist, wobei alle vier POX4 und POX5-Gene durch einen URA3-selektierbaren Marker zerstört sind, ist H5343 (ATCC 20962), wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,254,466 beschrieben.
  • Vektoren wie Plasmide, Phagemide, Phagen, Cosmide, künstliche Chromosomen aus Hefe, episomale Plasmide aus Hefe, replikative Plasmide aus Hefe u.s.w., können eingesetzt werden, um geeignete Wirtszellen zu transformieren oder zu transfizieren. Wirtszellen können auch durch das Einbringen eines linearen DNA-Vektors/Vektoren in eine Zelle transformiert werden, wobei dieser die gewünschte Gen-Sequenz, zum Beispiel CYTb5 enthält. Solch eine lineare DNA kann vorteilhaft sein, wenn es wünschenswert ist, die Einführung einer nicht-nativen (fremden) DNA in die Zelle hinein, zu verhindern. Zum Beispiel kann eine aus CYTb5 bestehende DNA, die von Sequenzen flankiert wird, die nativ in Bezug auf die ursprüngliche Zelle sind, in die Wirtszelle durch Elektroporation, Lithiumacetat-Umwandlung, Spheroplastizieren und dergleichen eingebracht werden. Flankierende DNA-Sequenzen können selektierbare Marker und/oder andere Werkzeuge zur gentechnischen Veränderung beinhalten. Hefezellen können mit allen hier beschriebenen Expressionsvektoren verändert werden. Der Begriff „Expressionsvektor" wird hier weit genutzt und dient dazu, jedes Medium zu umfassen, welches dazu eingesetzt werden kann, um eine Zielzelle zu transformieren. Der Expressionsvektor umfasst alle Beispiele von Vektoren, die hier aufgelistet sind, beinhaltend zum Beispiel Integrationsvektoren.
  • In einer besonders nützlichen Ausführungsform kann ein Vektor, der das CYTb5-Gen beinhaltet, auch eine oder mehr Kopien eines CPR(NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase)-Gens beinhalten. Zum Beispiel wurde das CPR-Gen von dem Hefestamm C. tropicalis, welches die NADPH-Cytochrom P450-Reduktase-Komponente des ω-Hydroxylasekomplexes kodiert, wie oben beschrieben geklont und sequenziert, wie beispielsweise in Sanglard et al., supra. C. tropicalis-Stämme, welche eine größere Anzahl von CPR-Genen aufweisen als der Stamm des Wildtyps, haben eine erhöhte Bildung von Dicarbonsäuren gezeigt, wie zum Beispiel in dem oben genannten U.S.-Patent 5,620,878 beschrieben wurde.
  • Spezifische Beispiele von CPR-Genen beinhalten die CPRA- und CPRB-Gene von C. tropicalis 20336, wie beispielsweise beschrieben im U.S.-Patent Nr. 6,331,420 und in der WO 00/20566 A2 . Die kompletten regulatorischen und kodierenden Bereiche für das CPRA-Gen von C. tropicalis 20336 und seine Aminosäuren-Sequenz werden jeweils in den 2A-2B und 3A-3C gezeigt. Die kompletten regulatorischen und kodierenden Bereiche für das CPRB-Gen von C. tropicalis 20336 und seine Aminosäuren- Sequenz werden jeweils in den 4A-4B und 5A-5C gezeigt. Es sei angemerkt, dass es einen gewissen Hinweis darauf gibt, dass in C. tropicalis die Codon-CTG nicht als Leucin gemäß dem „universalen genetischen Code" übersetzt wird, aber als Serin. Siehe beispielsweise Ueda et al., Biochemie (1994) 76, 1217-1222. Dieser Vorschlag wurde jedoch nicht endgültig bewiesen. Da entsprechend das CTG-Kodon in der Position 1180-1182 von 4A jeweils als ein Leucin oder ein Serin übersetzt werden kann, ist die 50. Amionosäure, die in 5A gezeigt wird als „X" bezeichnet, wobei „X" ein Leucin oder Serin sein kann. Gleichermaßen, da das CTG-Kodon in Position 1153-1156 von 2A als ein Leucin oder Serin übersetzt werden kann, wird die in 3A gezeigte 50. Aminosäure mit „X" bezeichnet, wobei „X" Leucin oder Serin sein kann. Man sollte beachten, dass die anderen DANN-Sequenzen, die das CTG-Kodon aufnehmen, und die, wie hier beschrieben, ein Protein kodieren, sich ähnlich verhalten können, selbst wenn sie nicht mit „X" bezeichnet sind.
  • Ein Beispiel eines C. tropicalis Stammes, der zusätzliche Kopien der CYTb5 und CPR-Gene von C. tropicalis 20336 enthält, der Stamm HDC11 (siehe Tabelle 2, Beispiele 12 und 15).
  • Der vorstehend genannte Vektor, beinhaltend das CYTb5-Gen kann auch eine oder mehr Kopien eines CYP-(cytochrom-P450-Monooxygenase)-Gens enthalten. Geeignete Gene aus Hefe, beispielsweise der Stamm C. tropicalis 20336, beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, CYP52A1A (6A-6C), CYP52A2A (7A-7B), CYP52A2B (8A-8C), CYP52A3A (9A-9C), CYP52A3B (10A-10C), CYP52D4A (11A-11C), CYP52A5A (12A-12C), CYP52A5B (13A-13C), CYP52A8A (14A-14B) und CYP52A8B (15A-15C), wie in der U.S.-Anmeldung mit der laufenden Nummer 09/302,620 und der internationalen Anmeldenummer PCT/US99/20797 beschrieben.
  • Es wird ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion eines CYTb5-Proteins in einer Wirtszelle vorgesehen. Das Verfahren beinhaltet (a) die Transformation der Wirtszelle, die eine natürlich auftretende Anzahl an CYTb5-Genen hat, mit mindestens einem CYTb5-Gen, das ein CYTb5-Protein kodiert, welches die Aminosäuresequenz aufweist, wie sie in den 1A-1C vorgeschrieben ist, und (b) Kultivieren der transformierten Wirtszelle und dabei Erhöhen der Expression des CYTb5-Proteins verglichen mit derjenigen der Wirtszelle, die die natürlich vorkommende Kopienzahl von CYTb5-Genen enthält. Geeignete Wirtszellen beinhalten diejenigen, die vorstehend beschrieben wurden. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Candida-Zelle und besonders bevorzugt ist der Candida-Stamm ein C. tropicalis-Stamm, wie oben beschrieben. Es versteht sich, dass eine Wirtszelle, die eine natürlich vorkommende Anzahl von CYTb5-Genen hat, auch eine Zelle umfasst, bei der diese Zahl Null (0) ist.
  • Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung der Produktion einer Dicarbonsäure in einer Wirtszelle bereitgestellt. Das Verfahren umfasst (a) das zur Verfügung stellen der Wirtszelle, die kein, ein oder mehr CYTb5-Gene aufweist, (b) das Erhöhen der Zahl der CYTb5-Gene, die ein CYTb5-Protein kodieren, welches eine Aminosäuresequenz hat, wie dies in den 1A-1C gezeigt wird, in der Wirtszelle, wobei die Wirtszelle eine Zerstörung des β-Oxidationswegs aufweist; und (c) das Kultivieren der Wirtszelle in einem Medium, das ein organisches Substrat enthält, das die Expression des CYTb5-Gens induziert, um eine erhöhte Produktion von Dicarbonsäure zu bewirken. Geeignete Wirtszellen beinhalten die oben beschriebenen.
  • Die oben genannte Wirtszelle, die zur Erhöhung der Produktion einer Dicarbonsäure eingesetzt wird, kann im Vergleich mit der Wirtszelle des Wildtyps auch eine erhöhte Anzahl von CPR- oder CYP-Genen enthalten. Solche Gene wurden geklont und charakterisiert, wie dies vorstehend in den U.S.-Patenten 6,331,420 and WO 00/20566 A2 genannte wurde. Durch das Kultivieren der Wirtszelle in einem Medium, enthaltend ein organisches Substrat, wird das CPR-Gen herauf reguliert, was zu einer erhöhten Produktion von Dicarbonsäure führt.
  • Dementsprechend ist die Produktivität (Gramm Dicarbonsäure/Liter/Stunde) von im Wesentlichen reinen α,ω-Dicarbonsäuren durch das Kultivieren einer Wirtszelle, wie beispielsweise eines C. tropicalis-Stamms, die eine größere Zahl von CPR- und/oder CYTb5-Genen als der Wildtyp aufweist und in der die chromosomalen POX4A-, POX4B- sowie beide POX5-Gene auch zerstört sein können, deutlich erhöht.
  • Ein geeignetes organisches Substrat hierbei kann jede organische Verbindung sein, die zu einer Mono- oder Polycarbonsäure bioxidierbar ist. Solch eine Verbindung kann jede beliebige gesättigte oder ungesättigte aliphatische Verbindung oder jede beliebige carbocyclische oder heterocyclische aromatische Verbindung, die mindestens eine Methyl-Endgruppe, eine Carboxyl-Endgruppe und/oder eine funktionelle Endgruppe, die durch Bioxidation zu einer Carboxylgruppe oxidierbar ist, sein. Eine funktionelle Endgruppe, die ein Derivat von einer Carboxylgruppe ist, kann in dem Substratmolekül vorhanden sein und kann durch eine Reaktion anders als die Bioxidation in eine Carboxylgruppe umgewandelt werden. Wenn beispielsweise die Endgruppe ein Ester ist, so dass weder der Wildtyp von C. tropicalis noch die hier beschriebenen, genetischen Veränderungen eine Hydrolyse der Ester-Funktionalität in eine Carboxylgruppe ermöglichen, dann kann während der Fermentationsstufe eine Lipase hinzugefügt werden, um die freien Fettsäuren freizusetzen. Geeignete organische Substrate beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, gesättigte Fettsäuren, ungesättigte Fettsäuren, Alkane, Alkene, Alkine, und deren Kombinationen.
  • Alkane sind ein Typ von gesättigtem organischem Substrat, die hier besonders nützlich sind. Alkane können linear oder zyklisch, verzweigte oder geradekettig, substituiert oder unsubstituiert sein. Besonders bevorzugte Alkane sind diejenigen, die von etwa 4 bis etwa 25 Kohlenstoffatome haben, von denen Beispiele Butan, Hexan, Oktan, Nonan, Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Hexadecan, Octadecan und dergleichen beinhalten, jedoch nicht darauf beschränkt sind.
  • Beispiele ungesättigter organischer Substrate, die hier eingesetzt werden können, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, interne Olefine, wie 2-Penten, 2-Hexen, 3-Hexen, 9-Octadecen und dergleichen; ungesättigte Carbonsäuren, wie 2-Hexensäure und deren Ester, Oleinsäure und deren Ester, beinhaltend die Triglyderylester, die einen relativ hohen Gehalt von Oleinsäure aufweisen, Erukasäure und deren Ester, beinhaltend Triglycerylester, die einen relativ hohen Gehalt an Erukasäure aufweisen, Rizinolsäure und deren Ester, beinhaltend die Triglyderylester, die einen relativ hohen Gehalt an Rizinolsäure aufweisen; ungesättigte Alkohole wie 3-Hexen-1-ol, 9-Octadecen-1-ol und dergleichen; ungesättigte Aldehyde wie 3-Hexen-1-al, 9-Octadecen-1-al und dergleichen. Zusätzlich zu den oben genannten, kann ein organisches Substrat, das hier eingesetzt werden kann, alicyclische Verbindungen beinhalten, die mindestens eine interne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelverbindung und mindestens eine Methyl-Endgruppe, eine Carboxyl-Endgruppe und/oder eine funktionelle Endgruppe, die durch Bioxidation zu einer Carboxyl-Gruppe oxidierbar ist. Beispiele solcher Verbindungen beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, 3,6-Dimethyl-1,4-Cyclohexadien, 3-Methylcyclohexen, 3-Methyl-1,4-Cyclohexadien und dergleichen.
  • Beispiele aromatischer Verbindungen, die hier eingesetzt werden können, beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Arene, wie o-, m-, p-Xylen; o-, m-, p-Methylbenzoesäure; Dimethylpyridin; Sterole und dergleichen. Das organische Substrat kann auch andere funktionelle Gruppen enthalten, die zu Carboxylgruppen, wie einer Aldehyd- oder Alkoholgruppe, bioxidiert werden können. Das organische Substrat kann auch andere funktionelle Gruppen enthalten, die nicht zu Carboxylgruppen bioxidiert werden können und die die Bioxidation nicht störend beeinflussen, wie Halogene, Ether und dergleichen.
  • Beispiele von gesättigten Fettsäuren, die den Zellen zugeführt werden können, welche die CPR, CYP- und/oder CYTb5-Gene gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten, umfassen Capron-, Önanth-, Capryl-, Pelargon-, Capron-, Undecyl-, Dodecan-, Myristin-, Pentadecan-, Palmitin-, Heptadecan-, Stearin-, Arachidin-, Behensäuren und deren Kombinationen. Beispiele ungesättigter Fettsäuren, die Zellen zugeführt werden können, welche die vorliegenden CPR- und/oder CYTb5-Gene enthalten, umfassen Palmitol-, Olein-, Eruca-, Linol-, Linolensäure und deren Kombinationen. Es können Alkane sowie Fraktionen von Alkanen zugeführt werden, die Kettenglieder von C12 zu C24 in jeder Kombination beinhalten. Ein Beispiel von bevorzugten Fettsäuremischungen sind Emersol®, Tallow und HOSFFA (stark Ölsäure-haltiges Sonnenblumenöl, d. h. Fettsäuremischungen, enthaltend etwa 80% Ölsäure, kommerziell zu beziehen als Edenor®), die kommerziell zu beziehen von Cognis Corp., Cincinnati, OH. Die typische Fettsäuremischung von Emersol® und Tallow ist wie folgt:
    TALLOW EMERSOL
    C14:0 3,5% 2,4%
    C14:1 1,0% 0,7%
    C15:0 0,5% -
    C16:0 25,5% 4,6%
    C16:1 4,0% 5,7%
    C17:0 2,5% -
    C17:1 - 5,7%
    C18:0 19,5% 1,0%
    C18:1 41,0% 69,9%
    C18:2 2,5% 8,8%
    C18:3 - 0,3%
    C20:0 0,5% -
    C20:1 - 0,9%
  • Die folgenden Beispiele sind nur zum Zwecke der Veranschaulichung, aber nicht zur Einschränkung der Erfindung. Alle relevanten Bakterienstämme und Plasmide werden jeweils in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschrieben. Tabelle 1. Liste der Stämme von Escherichia coli und Candida tropicalis
    E. Coli STAMM GENOTYP QUELLE
    XL1Blue-MRF endA1, gyrA96, hsdR17, lac–, recA1, relA1, supE44, thi-1, [F'lacIqZM15, proAB, Tn10] Stratagene, La Jolla, CA
    BM25,8 SupE44, thi(lac-proAB) [F'traD36, proAB+,lacIq Z M15] Iimm434(kanR)Pl(camR)lisdR (rk12-mk12-) Clontech, Palo Alto, CA
    XLOLR (mcrA)183 (mcrCB-hsdSMR-Mrr)173 endA1 thi-1recA1gyrA96 relA1 lac[F'proAB lacIq Z M15 Tn10 (Tetr) Su (nonsuppressing Lr (lambda resistant) Stratagene, La Jolla, CA
    C. tropicalis STAMM GENOTYP QUELLE
    ATCC20336 Wildtyp American type Culture Collection, Rockville, MD
    ATCC750 Wildtyp American type Culture Collection, Rockville, MD
    ATCC20962 ura3A/ura3B pox4A::ura3A/pox4B::ura3A, pox5::ura3A/pox5::URA3A, Cognis
    H5343 ura- ura3A/ura3B, pox4A::ura3A/pox4B::ura3A, pox5::ura3A/pox5::URA3A, Ura3- Cognis
    HDC11 ura3A/ura3B pox4A::ura3A/pox4B::ura3A, pox5::ura3A/pox5::URA3A, Ura3::URA3A-CYTb5+CPRB CYTb5 und CPR haben einander entgegengesetzte 5'- nach 3'-Orientierung Cognis Beachte: HDC11-1 enthält weniger integrierte Kopien von dem CYTb5/CPR-Insert als HDC11-2
    Tabelle 2: Liste der Plasmide, die aus Genom-Banken isoliert wurden und die zur Gen-Integrationen gestaltet wurden
    Plasmid Basis-Vektor Insert Insert Größe Plasmid Größe Beschreibung
    pURAin pNEB193 URA3A 1706 bp 4399 bp pNEB193 mit URA3A-Gen eingefügt in die AscI-Pmel-Stelle, wobei eine PacI-Stelle erzeugt wird
    pURA REDB in pURAin CPRB 3266 bp 7665 bp pURAin enthaltend ein PCR CPRB-Allel, enthält PacI-Restriktionsstellen
    pHKM1 pTrip1Ex trunkiertes CPRA-Gen etwa 3,8 kb etwa 7,4 kb Ein trunkiertes CPRA-Gen, gewonnen durch ein erstes Screenen einer Genbank enthaltend den nicht translatierten 5'Bereich und das 1,2 kb offene Leseraster
    pHKM4 pTrip1Ex trunkiertes CPRA-Gen etwa 5 kb etwa 8,6 kb Ein trunkiertes CPRA-Gen, gewonnen durch ein erstes Screenen einer Genbank enthaltend den nicht translatierten 3'-Endsequenzbereich
    pHKM9 pBC-CMV CPRB-Gen etwa 5,3 kb etwa 9,8 kb CPRB-Allel, das aus der dritten Genbank gewonnen wurde
  • BEISPIEL 1
  • Aufreinigen von genomischer DNA aus Candida tropicalis ATCC 20336
  • A: Aufbau von Genbanken
  • 50 ml YEPD-Bouillon (siehe Anlage) wurden mit einer einzelnen Kolonie von C. tropicalis 20336 von einer YEPD-Agarplatte beimpft, und man ließ sie über Nacht bei 30°C wachsen. 5 ml der Übernachtkultur wurden in 100 ml frischen YEPD-Bouillon geimpft und 4 bis 5 Stunden unter Schütteln bei 30°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet, zweimal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und wiederum in 4 ml spheroplastischen Puffer (1 M Sorbit, 50 mM EDTA, 14 mM Mercaptoethanol) resuspendiert und 30 Minuten bei 37°C unter schonendem Schütteln inkubiert. Es wurden 0,5 ml 2 mg/ml Zymolyase (ICN Pharmaceuticals, Inc., Irvine, CA) hinzugefügt und 30 bis 60 min unter schonendem Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Bildung von Spheroplasten wurde durch SDS-Lyse überwacht. Die Spheroplasten wurden durch kurzes Zentrifugieren geerntet (3 min bei 4.000 rpm) (rpm = revolutions per minute, Umdrehungen pro Minute) und einmal mit dem Spheroplasten-Puffer ohne Mercaptoethanol gewaschen. Die geernteten Spheroplasten wurden dann in 4 ml Lyse-Puffer (0,2 M Tris/pH 8,0, 50 mM EDTA, 1% SDS), enthaltend 100 mg/ml RNase (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) suspendiert und 30 bis 60 min lang bei 37°C inkubiert.
  • Die Proteine wurden denaturiert und zweimal mit einem gleichen Volumen von Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) durch schonendes Mischen der beiden Phasen durch Drehen der Hand extrahiert. Die beiden Phasen wurden durch zehnminutiges Zentrifugieren bei 10.000 rpm getrennt und die die hochmolekulare DNA enthaltende wässrige Phase wurde gewonnen. Zu der wässrigen Schicht wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,2 M zugefügt, und die DNA wurde durch Zugabe von 2 vol Ethanol gefällt. Die gefällte DNA wurde mit einem sauberen Glasstab gerührt und wieder in TE-Puffer (10 mM Tris/pH 8,0, 1 mM EDTA) suspendiert, und man ließ sie sich über Nacht bei 4°C lösen. Zu der gelösten DNA wurde RNase, die frei von jeder DNase-Aktivität war (Qiagen Inc.; Chatsworth, CA), bis zu einer Endkonzentration von 50 mg/ml zugefügt, und die gelöste DNA wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde Protease (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) bis zu einer Endkonzentration von 100 mg/ml zugefügt, und es wurde 30 Minuten lang bei 55 bis 60°C inkubiert. Die Lösung wurde einmal mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit einem gleichen Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Zu der wässrigen Phase wurden 0,1 vol 3 M Natriumacetat und 2 Volumen eiskalter Ethanol (Reinheitsgrad 200 (=200 Proof)) hinzugefügt, und die ein hochmolekulare DNA wurde mit einem Glasstab gerührt und in 1 bis 2 ml TE-Puffer gelöst.
  • B Herstellung von genomischer DNA für PCR
  • Vervielfältigung der CYTb5- und CPR-Gene
  • Fünf ml YPD-Medium wurden mit einer einzelnen Kolonie beimpft und über Nacht bei 30°C kultiviert. Die Kultur wurde 5 min lang bei 1.200 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt, und es wurden 0,5 ml einer Sorbitol-Lösung (0,9 M Sorbitol, 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0, 0,1 M EDTA) dem Pellet hinzugefügt. Das Pellet wurde durch Vortexen resuspendiert, und es wurden 1 ml 2-Mercaptoethanol und 50 ml einer 10 mg/ml Zymolyaselösung zur Mischung hinzugefügt. Das Röhrchen wurde eine Stunde lang bei 37°C auf einer Umlaufschüttelmaschine (200 rpm) inkubiert. Das Röhrchen wurde dann 5 min bei 1200 × g zentrifugiert und der Überstand durch Absaugen entfernt. Das Protoplasten-Pellet wurde in 0,5 ml 1 × TE (10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mMol EDTA) resuspendiert und in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenrohr überführt. Die Protoplasten wurden durch die Zugabe von 50 ml 10%iger SDS lysiert, worauf eine 20-minutige Inkubation bei 65°C folgte. Danach wurden 200 ml 5 M Kaliumacetat zugefügt, und nach dem Mischen wurde das Röhrchen mindestens 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Zelltrümmer wurden durch 5-minutiges Zentrifugieren bei 13.000 × g entfernt. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt und in ein neues Microfuge-Röhrchen überführt. Die DNA wurde durch die Zugabe von 1 ml 100%igem (Reinheitsgrad 200) Ethanol gefällt, worauf ein 5-minutiges Zentrifugieren bei 13.000 × g folgte. Das DNA-Pellet wurde mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen, worauf ein 5-minütiges Zentrifugieren bei 13.000 × g folgte. Nachdem die DNA teilweise unter Vakuum getrocknet worden war, wurde diese in 200 ml 1 × TE suspendiert. Die DNA-Konzentration wurde durch den Quotienten des Absorptionsvermögens bei 260 nm/280 nm (A260,280) bestimmt.
  • BEISPIEL 2
  • Aufbau von genomischer Candida tropicalis 20336 Banken Es wurden drei genomische C. tropicalis-Banken aufgebaut, zwei in den Clontech Laborstories, Inc., (Palo Alto, CA) und eine bei der Henkel Corporation (Cincinnati, OH)
  • A. Clontech-Banken
  • Die erste Clontech-Bank wurde wie folgt hergestellt: Es wurde genomische DNA aus C. tropicalis 20336, wie oben beschrieben hergestellt, teilweise mit EcoRI verdaut und durch Elektrophorese größenfraktioniert, um die Fragmente zu beseitigen, die kleiner als 0,6 kb sind. Im Anschluss an die Größenfraktionierung wurden verschiedene Ligationen aus den genomischen DNA-Fragmenten von EcoRI und den Armen des Lambda (λ) Trip1ExTM-Vektors (16), aufweisend klebrige EcoR1-Enden, in λ-Phagen-Köpfe hinein gepackt, unter Bedingungen, die es ermöglichen, eine Million einzelne Klone zu erhalten. Die zweite Genom-Bank wurde wie folgt aufgebaut: genomische DNA wurde teilweise mit Sau3A1 versaut und durch Gel-Elektrophorese größenfraktioniert. Die DNA-Fragmente waren glatt endend, wobei Standardprotokolle eingesetzt wurden, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, USA (1989). Die Strategie bestand darin, dass die Sau3A1-Überhänge mit Klenow Polymerase (Life Technologies, Grand Island, NY) aufgefüllt werden, worauf ein Verdau mit S1 Nuklease (Life Technologies, Grand Island, NY) folgt. Nach dem S1-Nuklease-Verdau wurden die Fragmente noch einmal mit Klenow-Polymerase am Ende aufgefüllt, um die endgültigen glatt endenden DNA-Fragmente zu erhalten. EcoR1-Linker wurden an diese glatt endenden DNA-Fragmente ligiert, worauf eine Ligation in den λTripIEx-Vektor erfolgte. Die sich daraus ergebende Bank enthielt etwa 2 × 106 unabhängige Klone mit einer durchschnittlichen Insert-Größe von 4,5 kb.
  • B. Bank von Cognis
  • Es wurde eine genomische Bank unter Einsatz des λ-ZAPExpressTM-Vektors aufgebaut (Strategen, La Jolla, CA) (17A). Die genomische DNA wurde teilweise mit Sau3A1 verdaut, und es wurden Fragmente im Bereich von 6 bis 12 kb aus einem Agarose-Gel nach der Elektrophorese der verdauten DNA aufgereinigt. Diese DNA-Fragmente wurden dann mit den BamHI-verdauten λ-ZAPExpressTM-Vektorarmen gemäß den Protokollen des Herstellers ligiert. Es wurden drei Ligationen angesetzt, um etwa 9,8 × 105 unabhängige Klone zu erhalten. Alle drei Banken wurden nach den Instruktionen des Herstellers vereinigt und vervielfältigt, um einen Vorrat mit hohem Titer (> 109 plaquebildende Einheiten/ml) für die Langzeitlagerung zu erhalten. Der Titer der gepackten Phagen-Bank wurde nach der Infektion von E. coliXL1Blue-MRF'Zellen bestimmt. E. coli XL1Blue-MRF' wurden über Nacht entweder in LB-Medium oder in NZCYM (Anlage), enthaltend 10 mM MgSO4 und 0,2% Maltose jeweils bei etwa 37°C oder 30°C unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und in 0,5 bis 1 Volumen 10 mM MgSO4 resuspendiert.
  • 200 ml dieser E. coli-Kultur wurden mit verschiedenen Verdünnungen von gepackter Phagen-Bank gemischt und 15 min bei 37°C inkubiert. Zu dieser Mischung wurden 2,5 ml LB Top-Agarose oder NZCYM Top-Agarose (bei 60°C gehalten) (siehe Anhang) hinzugefügt und auf LB-Agar oder NCZYM-Agar (siehe Anhang), der sich in 82 mm Petrischalen befand. Die Phagen konnten sich über Nacht bei 37°C vermehren, um getrennte Plaques zu erhalten, und der Phagen-Titer wurde bestimmt.
  • BEISPIEL 3
  • Das Screenen von genomischen Banken
  • Sowohl der λ Trip1ExTM und der λ ZAP ExpressTM-Vektor sind phagemide Vektoren, die entweder als Phagen-DNA oder als Plasmid-DNA verbreitet werden können (nach der Umwandlung von Phagen zum Plasmid). Deswegen können die in diesen Vektoren aufgebauten genomischen Banken entweder durch Plaque-Hybridisierung (das Screenen der Lambda-Form der Bank) oder durch Hybridisierung der Kolonie (das Screenen der Plasmid-Form der Bank nach der Umwandlung des Phagen zum Plasmid). Beide Vektoren können die geklonten Gene exprimieren, und der Hauptunterschied ist der Mechanismus zum Entfernen des Plasmids aus der Phagen-DNA. Die Klonierungsstelle in λ Trip1ExTM befindet sich in dem Plasmid, das sich in dem Phagen befindet und ist von der loxP-Stelle flankiert (16). Wenn λ Trip1ExTM in den E. coli-Stamm BM25.8 eingeführt wird (von Clontech bereitgestellt), fördert die Cre-Rekombinase, welche in BM25.8 vorliegt, das Herausschneiden und die Zirkularisation des Plasmids pTrip1Ex aus dem Phagen λ Trip1ExTM an den loxP-Stellen. Der Mechanismus des Herausschneidens des Plasmids pBK-CMV (17B) aus dem Phagen λ ZAP ExpressTM ist anders. Der Mechanismus erfordert die Unterstützung eines Helfer-Phagens, wie ExAssistTM (Stratagen) und eines E. coli-Stammes wie XLOR (Stratagen). Sowohl pTrip1Ex als auch pBK-CMV können sich in E. coli autonom replizieren.
  • A. Das Screenen von genomischen Banken (Plasmid-Form)
  • 1) Das Ablösen von Kolonien
  • Eine einzelne Kolonie von E. coli BM25.8 wurde in 5 ml LB angeimpft, enthaltend 50 mg/ml Kanamycin, 10 mM MgSO4 und 0,1% Maltose, und über Nacht bei 31°C, 250 rpm gezüchtet. Zu 200 ml dieser Übernachtkultur (~4 × 108 Zellen) wurde 1 ml der Phagen-Bank (2-5 × 106 plaquebildende Einheiten) und 150 ml LB-Nährlösung zugefügt und für 30 min bei 31°C inkubiert, wonach 400 ml LB-Nährlösung zugefügt wurden, und es wurde 1 Stunde lang bei 31°C, 225 rpm inkubiert. Diese bakterielle Kultur wurde verdünnt und auf LB-Agar aufgestrichen, der 50 mg/ml Ampicillin (Sigma Chemical Company, St Louis, MO) und Kanamycin (Sigma Chemical Company) enthielt, um 500 bis 600 Kolonien pro Platte zu erhalten. Die Platten wurden 6 bis 7 Stunden lang bei 37°C inkubiert, bis die Kolonien sichtbar wurden. Die Platten wurden dann 1,5 Stunden bei 4°C gelagert, bevor eine Kolonien/Plaque-ScreenTM Hybridisierungs-Transfer-Membranscheibe (DuPont NEN Research Products, Boston, MA) auf die Platte in Kontakt mit den Bakterienkolonien gelegt wurde. Der Übergang von Kolonien auf die Membran durfte 3 bis 5 min andauern. Die Membran wurde dann abgehoben und auf eine frische LB-Agar-Platte (siehe Anhang), enthaltend 200 mg/ml Chloramphenicol, mit der Seite nach oben zeigend, die zu den Bakterienkolonien gewandt ist, gelegt. Die die Membran enthaltenden Platten wurden dann über Nacht bei 37°C inkubiert, damit sich die Bakterienkolonien voll entwickeln konnten. Die LB-Agar-Platten, von denen die Kolonien zuerst abgehoben worden waren, wurden über Nacht bei 37°C bebrütet und bei 4°C für den zukünftigen Gebrauch aufbewahrt. Am nächsten Morgen wurden die die Bakterienkolonien enthaltenen Membranen angehoben und auf zwei Bögen von Whatmann 3M-Papier (Whatman, Hillsboro, OR) gelegt, die mit 0,5 N NaOH getränkt waren, und 3 bis 6 min bei Raumtemperatur (RT) belassen, um die Zellen zu lysieren.
  • Eine zusätzliche Behandlung der Membranen fand wie in dem Protokoll beschrieben statt, dass von NEN Research Products zur Verfügung gestellt wurde.
  • 2) DNA-Hybridisierungen
  • Membranen wurden über Nacht getrocknet, bevor sie mit Oligonucleotidproben hybridisiert wurden, wobei ein nicht radioaktives ECLTM3'-Oligo-Labeling- und Detektionssystem von Amersham Life Sciences (Arlington Heights, IL) eingesetzt wurde. Das DNA-Labeling, die Prähybridisierung und die Hybridisierungen wurden gemäß den Protokollen des Herstellers ausgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen zweimal bei Raumtemperatur in 5 × SSC, 0,1% SDS gewaschen (in einem Volumen, das äquivalent mit 2 ml/cm2 der Membran ist), 5 min gewaschen, worauf jeweils zwei Waschungen bei 50°C in 1 × SSC, 0,1% SDS folgten (in einem Volumen, das äquivalent mit 2 ml/cm2 der Membran ist) für jeweils 15 min. Das Hybridisierungssignal wurde dann erzeugt und mit Hyperfilm ECLTM (Amersham) gemäß den Protokollen des Herstellers detektiert. Die Membranen wurden zu Platten ausgerichtet, die Bakterienkolonien enthielten, von denen Kolonieablösungen durchgeführt wurden, und es wurden dann Kolonien entsprechend den positiven Signalen in den Röntgenstrahlen isoliert und in LB-Nährlösung verteilt. Die Plasmid-DNAs wurden aus diesen Kulturen isoliert und durch Verdau mit Restriktionsenzymen und durch DNA-Sequenzierung analysiert.
  • B. Das Screenen von genomischen Banken (Plaque Form)
  • 1) Das Platieren von λ-Banken
  • E. coli XL1Blue-MRF'-Zellen wurden über Nacht in LB-Medium (25 ml), enthaltend 10 mM MgSO4 und 0,2% Maltose, bei 37°C, 250 rpm gezüchtet. Die Zellen wurden dann zentrifugiert (10 min lang bei 2.200 × g) und in 0,5 Volumen 10 mM MgSO4 resuspendiert. 500 ml dieser E. coli-Kultur wurden mit einer Phagen-Suspension, enthaltend 25.000 vervielfältigte Lambda-Phagen-Partikel, gemischt und 15 min bei 37°C inkubiert. Es wurden 6,5 ml NZCYM-Top-Agarose (bei 60°C gehalten) (siehe Anhang) in diese Mischung zugegeben und auf 80-100 ml NCZYM-Agar plattiert (siehe Anhang), der sich in einer 150 mm-Petrischale befand. Die Phagen konnten sich über Nacht bei 37°C vermehren, um deutliche Plaques zu erhalten. Nach dem Wachstum über Nacht wurden die Platten 1-2 Stunden lang in einem Kühlschrank gelagert, bevor Plaque-Ablösungen durchgeführt wurden.
  • 2) Plaque-Ablösungen und DNA-Hybridisierungen
  • Es wurden Magna LiftTM-Nylonmembranen (Micron Separations, Inc., Westborough, MA) auf die Agar-Oberfläche in vollständigem Kontakt mit den Plaques gelegt, und der Übergang von den Plaques auf die Nylon-Membranen konnte 5 min lang bei RT ablaufen. Nach dem Plaque-Übergang wurde die Membran auf 2 Bögen Whatman-3MTM-Filterpapier (Whatmann, Hillsboro, OR) gelegt, das mit einer Lösung aus 0,5 N NaOH, 1,0 M NaCl getränkt war, und für 10 min bei RT belassen, um die DNA zu denaturieren. Überschüssige Denaturierungslösung wurde durch das Blotten auf trockenem Papier von Whatman 3M entfernt.
  • Die Membranen wurden dann auf 2 Bögen Whatman 3MTM-Papier, das mit 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl getränkt war, überführt, und für 5 min stehen gelassen, um sie zu neutralisieren. Die Membranen wurden dann kurz in 200-500 ml 2 × SSC gewaschen, durch Luft getrocknet und für 30-40 min bei 80°C gebacken. Die Membranen wurden dann mit gelabelter DNA untersucht.
  • Die Membranen wurden 1-2 Stunden bei 42°C mit 200-500 ml Lösung von 5 × SSC, 0,5% SDS, 1 mM EDTA (pH 8,0) unter Schütteln (60 rpm) vorgewaschen, um bakterielle Zellreste von den Membranen zu entfernen. Die Membranen wurden 1-2 Stunden lang bei 42°C mit ECL GoldTM-Puffer (Amersham) prähybridisiert (in einem Volumen, das äquivalent zu 0,125-0,25 ml/cm2 Membran ist), enthaltend 0,5 M NaCl und 5% Blocking-Reagenz. Die als Proben eingesetzten DNA-Fragmente wurden aus dem Agarose-Gel aufgereinigt, wobei ein QLAEXIITM-Gelextraktions-Kit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers eingesetzt, und gekennzeichnet wurde, indem ein ECLTM Kit von Amersham verwendet wurde, welcher direkt die Nukleinsäure kennzeichnet. Gekennzeichnete DNA (5-10 ng/ml Hybridisierungslösung) wurde den prähybridisierten Membranen zugegeben, und die Hybridisierung konnte in der Nacht ablaufen. Am nachfolgenden Tage wurden die Membranen mit zweimal unter Schütteln (60 rpm) bei 42°C jeweils 20 min lang in einem Puffer, enthaltend jeweils 0,1 (starke Stringenz) oder 0,5 (niedrige Stringenz) × SSC, 0,4% SDS und 360 g/l Harnstoff, gewaschen (in einem Volumen, das äquivalent zu 2 ml/cm2 der Membran ist). Darauf folgten zwei Waschungen von jeweils 5 min bei Raumtemperatur 2 × SSC (einem Volumen, das äquivalent zu 2 ml/cm2 der Membran ist). Hybridisierungssignale wurden erzeugt, indem die ECLTM-Nukleinsäure-Nachweisreagenz eingesetzt wurde und unter Einsatz von Hyperfilm-ECLTM (Amersham) ermittelt.
  • Agar-Stopfen, welche Plaques enthielten, die den positiven Signalen auf dem Röntgenfilm entsprachen, wurden aus den Master-Platten unter Verwendung des breiten Endes einer Pasteur-Pipette herausgenommen. Die Plaques wurden ausgewählt, indem die Platten mit dem Röntgenfilm aneinandergereiht wurden. In dieser Phase wurde im Allgemeinen eine Vielzahl von Plaques genommen. Die Phagen-Partikel wurden von den Agar-Stopfen durch das Einweichen über Nacht in 1 ml SM-Puffer ausgewaschen (Sambrook et al., supra). Das Phagen-Eluat wurde dann verdünnt und mit frisch gezüchteten E. coli XL1Blue-MRF'Zellen ausplattiert, um 100-500 Plaques pro 85 mm NCZYM-Agarplatte zu erhalten. Die Plaques wurden wie vorher auf Magna Lift-Nylon-Membranen überführt und wieder unter Einsatz derselben Probe getestet. Einzelne, gut isolierte Plaques, die den Signalen auf dem Röntgenfilm entsprachen, wurden durch Entfernen der Agar-Stopfen abgehoben und die Phagen durch das Einweichen über Nacht in 0,5 ml SM-Puffer eluiert.
  • C. Umwandlung von λ-Klone in eine Plasmid-Form
  • Zur weiteren Analyse wurden die gewonnenen λ-Klone in eine Plasmid-Form umgewandelt. Die Umwandlung von der Plaque- zur Plasmid-Form wurde durch Einimpfen der Plaques in den E. Coli-Stamm BM25.8. Der E. coli-Stamm wurde über Nacht bei 31°C, 250 rpm in LB-Nährlösung, enthaltend 10 mM MgSO4 und 0,2% Maltose, kultiviert, bis der OD600 einen Wert von 1.1-1.4 erreichte. Es wurden zehn Milliliter der Übernachtkultur abgenommen und mit 100 ml 1 M MgCl2 gemischt. Ein 200 ml Zellvolumen wurde entnommen, mit 150 ml eluierter Phagen-Suspension gemischt und 30 min bei 31°C inkubiert. Es wurde LB-Nährlösung (400 ml) in das Röhrchen, zugegeben und die Inkubation wurde 1 Stunde bei 31°C unter Schütteln bei 250 rpm fortgesetzt. 1-10 ml der beimpften Zellensuspension wurde auf LB-Agar plattiert, der 100 mg/ml Ampicillin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) enthielt. Gut vereinzelte Kolonien wurden abgenommen und über Nacht in 5 ml LB-Nährlösung bei 37°C und 250 rpm gezüchtet, wobei die Nährlösung 100 mg/ml Ampicillin enthielt. Es wurde Plasmid-DNA aus diesen Kulturen isoliert und analysiert. Zur Umwandlung des λZAP-ExpressTM-Vektors in eine Plasmid-Form, wurden E. coli-Stämme XL1Blue-MRF' und XLOR eingesetzt. Die Umwandlung wurde gemäß den Protokollen des Herstellers (Stratagene) für Einzelplaque-Entfernung, durchgeführt.
  • BEISPIEL 4
  • Umwandlung von C. tropicalis unter Verwendung von Lithiumacetat
  • Das folgende Protokoll wurde verwendet, um C. tropicalis gemäß den in Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 5, 13.7.1 beschriebenen Verfahren umzuwandeln.
  • 5 ml YEPD wurden mit C. tropicalis H5343 ura aus einem gefrorenen Stamm angeimpft und über Nacht auf einer New-Brunswick-Schüttelvorrichtung bei 30°C und 170 rpm gezüchtet. Am nächsten Tag wurden 10 μl der Übernacht-Kultur in 50 ml YEPD geimpft und die Züchtung wurde bei 30°C, 170 rpm fortgesetzt. Am nächsten Tag wurden die Zellen bei einem OD600 von 1,0 geerntet. Die Kultur wurde in ein 50 ml-Polypropylen-Röhrchen überführt und 10 min lang bei 1000 × g 10 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml sterilem TE (10 mMol Tris-Cl und 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert. Die Zellen wurden erneut 10 min bei 1000 × g zentrifugiert, und das Zellpellet wurde in 10 ml steriler Lithiumacetatlösung [LiAc (0,1 M Lithiumacetat, 10mM Tris-Cl, pH 8,0, 1mMol EDTA) resuspendiert. Nach 10-minutigem Zentrifugieren bei 1000 × g wurde das Pellet in 0,5 ml LiAc resuspendiert. Die Lösung wurde 1 Stunde unter schonendem Schütteln bei 50 rpm bei 30°C inkubiert. Ein 0,1 ml Aliquot dieser Suspension wurde 30 min mit 5 μg Transformations-DNA bei 30°C ohne Schütteln inkubiert. Es wurde eine 0,7 ml-PEG-Lösung (40% Gew./Vol. Polyethylenglykol 3340, 0,1 M Lithiumacetat, 10 mMol Tris-Cl, pH 8,0, 1 mMol EDTA) zugegeben und 45 min bei 30°C inkubiert. Die Rohre wurden dann 5 min bei 42°C belassen. Ein Aliquot von 0,2 ml wurde auf synthetischem Fertigmedium ohne Uracil (SC-Uracil) (Kaiser et al. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1994) ausplattiert. Das Wachstum der Transformanten wurde 5 Tage überwacht. Nach drei Tagen wurden verschiedene Transformanten ausgewählt und zur Herstellung genomischer DNA und zum Screenen auf SC-Uracil Platten überführt.
  • BEISPIEL 5
  • Isolierung von Plasmid-DNA
  • Plasmid-DNA wurde aus E. coli-Kulturen isoliert, wobei das Qiagen-Plasmid-Isoloerungs-Kit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers eingesetzt wurde.
  • BEISPIEL 6
  • Sequenzierung und Analyse der DNA
  • Die DNA-Sequenzierung wurde bei der Sequetech Corporation (Mountain View, CA) durchgeführt, indem ein automatisierter Sequenzer für Angewandte Biosysteme (Perkin Elmer, Foster City, CA) eingesetzt wurde. Die DNA-Sequenzen wurden mit den Softwarepaketen von MacVector und GeneWorks (Oxford Molecular Group, Campbell, CA) analysiert.
  • BEISPIEL 7
  • PCR-Protokolle
  • Die PCR-Vervielfältigung wurde in einem Perkin-Elmer–Thermocycler durchgeführt, wobei das AmpliTaqGoldenzym-Kit (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) gemäß den Spezifikationen des Herstellers ausgewählt wurde. Nach der erfolgreichen Vervielfältigung wurden die Produkte in einigen Fällen mit den geeigneten Enzymen verdaut und unter Einsatz von QiaexII (Qiagen, Chatsworth, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers Gel-gereinigt. In speziellen Fällen wurde die Ultra Taq Polymerase (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) oder die Expand Hi-Fi Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) gemäß den Empfehlungen des Herstellers oder wie in Tabelle 3 definiert, eingesetzt. Tabelle 3: PCR-Vervielfältigungsbedingungen, die mit verschiedenen Primer-Kombinationen eingesetzt wurden
    PRIMER KOMBINATION Taq MATRIZENDENAT-URIERUNGS-ZUSTAND ANNEALING TEMP/ZEIT EXTENSION TEMP/ZEIT ZYKLUS NR
    3674-41-1/41-2/41-4 +3674-41-4 Ampli-Taq Gold 94°C/30 sek 55°C/30 sek 72°C/1 min 30
    URA Primer 1a URA Primer 1b Ampli-Taq Gold 95°C/1 min 70°C/1 min 72°C/2 min 35
    URA Primer 2a URA Primer 2b Ampli-Taq Gold 95°C/1 min 70°C/1 min 72°C/2 min 35
    CPR B#1 CPR B#2 Expand Hi-Fi Taq 94°C/15 sek 94°C715 sek 50°C/30 sek 50°C/30 sek 68°C/3 min 68°C/3 min +20 sek/Zyklus 10 15
    CYTb5#1 CYTb5#2 Ultra Taq 95°C/15 sek 45°C/30 sek 72°C/2 min 25
  • Die nachfolgende Tabelle 4 enthält eine Liste von Primern, die für die PCR-Vervielfältigung zum Herstellen von Genintegrationsvektoren eingesetzt werden, oder zur Erzeugung von Proben zur Ermittlung von Genen sowie deren Isolierung.
  • Tabelle 4:
  • Primer-Tabelle für die PCR-Vervielfältigung zur Herstellung von Genintegrationsvektoren, zur Erzeugung von Sonden für die Gen-Isolierung und deren Detektion und um die DNA-Sequenz der Konstrukte zu erhalten.
    (A-Desoxyadenosintriphosphat [dATP], G-Desoxyguanosintriphosphat [dGTP], C-Desoxycytosintriphosphat [dCTP], T-Desoxythymidintriphosphat [dTTP], Y-dCTP oder dTTP, R-dATP oder dGTP, W-dATP oder dTTP, M-dATP oder dCTP).
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • BEISPIEL 8
  • PCR-Verfahren bei Hefekolonien zum Nachweis von einer Gen-Integration in das Genom von C. tropicalis
  • Es wurden einzelne Hefekolonien wurden von der Oberfläche der Umwandlungsplatten entfernt, in 50 μl spheroplastischen Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,0 mg/ml Zymolyase, 5% Glycerin) suspendiert und 30 min bei 37°C inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Lösung 10 min lang bei 95°C zur Lyse der Zellen erhitzt. Fünf μl dieser Lösung wurden als eine Matrize in der PCR eingesetzt. Es wurde Expand-Hi-Fi-Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in der PCR eingesetzt, gekoppelt mit einem genspezifischen Primer (Gen, welches integriert werden soll) und einem URA3-Primer. Wenn die Integration stattgefunden hat, kann die Vervielfältigung ein PCR-Produkt mit einer vorhergesagten Größe erreichen, wobei die Anwesenheit eines integrierten Gens bestätigt wird.
  • BEISPIEL 9
  • Fermentationsverfahren für Studien zur Gen-Induktion
  • Ein Fermenter wurde mit einem semi-synthetischen Wachstumsmedium, das eine Zusammensetzung aus 75 g/l Glukose (wasserfrei), 6,7 g/l Hefe-Stickstoffbasis (Difco Laborstories), 3 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Ammoniumsulfat, 2 g/l Monokaliumphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid aufwies, beschickt. Die Komponenten wurden als konzentrierte Lösungen zum Autoklavieren hergestellt, dann nach dem Abkühlen in den Fermenter verbracht; der endgültige pH-Wert betrug etwa 5,2. Diese Charge wurde mit 5-10% einer in YM-Medium (Difco Laborstories) hergestellten Übernachtkultur von C. tropicalis, ATCC20962 beimpft, wie in den Verfahren der Beispiele 17 und 20 des U.S.-Patents Nr. 5,254,466 beschrieben. C. tropicalis ATCC 20962 ist eine POX4 und POX5 zerstörte C. tropicalis ATCC 20336. Es wurde Luft zugeführt und geschüttelt, um den gelösten Sauerstoff bei einer Sättigung gegenüber Luft von mehr als 40% aufrechtzuerhalten. Der pH-Wert wurde zur Kontrolle bei etwa 5,0 bis 8,5 durch die Zugabe von 5 N Natronlauge aufrechterhalten. Es wurden sowohl ein Fettsäure-Zufuhrstrom (in diesem Beispiel käuflich erhältliche Ölsäure), der eine typische Zusammensetzung aus 2,4% C14; 0,7% C14:1; 4,6% C16; 5,7% C16:1; 5,7% C17:1; 1,0% C18; 69,9% C18:1; 8,8% C18:2; 0,30% C18:3; 0,90% C20:1 aufwies, als auch eine Zufuhr von Glukose-Co-Substrat, im Zuführ-Chargenbetrieb-Modus zugefügt, wobei nahe zum Ende des exponentiellen Wachstums begonnen wurde. Während der Biokonversion von Fettsäuren zu den Disäuren wurde zur pH-Kontrolle Natriumhydroxid zugefügt, um den pH-Wert in dem gewünschten Bereich aufrechtzuerhalten. Typischerweise wurden gerade vor dem Start der Fettsäurezugabe und während der ersten 10 Stunden der Biokonversion Proben zum Studium der Gen-Induktion entnommen. Die Bestimmung des Fettsäuregehalts und des Gehalts an Disäuren erfolgte durch ein Standard-Methylester-Protokoll unter Einsatz von Flüssigkeitsgaschromatographie (GLC) (siehe Beispiel 12). Die Gen-Induktion wurde unter Einsatz der in dieser Anmeldung beschriebenen QC-RT-PCR-Vorschrift gemessen.
  • BEISPIEL 10
  • Die Präparation von RNA
  • Der erste Schritt dieser Prozedur involviert die Isolierung der gesamten zellulären RNA aus Kulturen von C. tropicalis. Die zelluläre RNA wurde unter Verwendung des Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Chatsworth; CA) wie folgt gewonnen: 2 ml-Proben von C. tropicalis-Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Zugabe der Fettsäure oder des Alkansubstrats aus dem Fermenter in einem 2 ml-Eppendorf Standardröhrchen mit Schraubverschluss gesammelt. Die Zellproben wurden nach ihrer Isolierung aus dem Fermenter sofort in flüssigem Stickstoff oder in einem Trockeneis/Alkoholbad eingefroren. Zur Isolierung der gesamten RNA aus den Proben, beließ man die Röhrchen zum Auftauen auf Eis, und die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 4°C durch Zentrifugieren in einer Mikrofuge pelletiert, und der Überstand wurde verworfen, während die Pellets eisgekühlt wurden. Die Microfugen-Röhrchen wurden zu 2/3 mit eisgekühltem Zirkonium-/Silica-Perlen (0,5 mm Durchmesser, Biospec Produkte, Bartlesville, OK) gefüllt, und das Röhrchen bis oben mit eisgekühltem RLT*-Lysepuffer (*der Puffer, der im Qiagen RNeasy-Minikit enthalten war). Der Zellaufschluss wurde erzielt, indem die Proben in eine Mini-Kugelzerkleinerer (Biospec Products, Bartlesville, OK) gegeben und sofort 2,5 min bei einer vollen Geschwindigkeit homogenisiert wurden. Man beließ die Proben 1 min zum Kühlen in einem Eiswasserbad, und der Homogenisierungs-/Kühlprozess wurde zweimal über eine gesamte Homogenisierungszeit von 7,5 min in dem Kugelzerkleinerer wiederholt. Die homogenisierten Zellproben wurden 10 min lang bei voller Geschwindigkeit mikrofugiert und 700 ml des RNA enthaltenden Überstandes entfernt und in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt. Es wurden 700 ml 70%iger Ethanol zu jeder Probe zugefügt, worauf ein Mischen durch Inversion folgte. Dieser Schritt und alle darauf folgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Es wurden siebenhundert Mikroliter von jeder mit Ethanol behandelten Probe in eine Qiagen RNeasy-Spinnkolonne überfährt, worauf eine Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 Sekunden erfolgte. Der Durchfluss wurde verworfen und die Kolonne wurde mit der verbleibenden Probe (700 ml) erneut beladen und erneut bei 8.000 × g für 15 Sekunden zentrifugiert. Die Kolonne wurde einmal mit 700 ml RW1*-Puffer gewaschen, bei 8.000 × g für 15 Sekunden zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Die Säule wurde in ein neues 2 ml-Sammelröhrchen verbracht und mit 500 ml RPE*-Puffer gewaschen und der Durchfluss verworfen. Die RPE*-Waschung wurde durch Zentrifugieren bei 8.000 × g für 2 min wiederholt und der Durchfluss verworfen. Die Spinnkolonne wurde in ein neues 1,5 ml-Sammelröhrchen überführt, und es wurden 100 ml RNase-freies Wasser in die Kolonne zugefügt, worauf ein Zentrifugieren 15 Sekunden lang bei 8.000 × g folgte. Es wurden zusätzliche 75 ml RNase-freies Wasser in die Kolonne gegeben, worauf ein Zentrifugieren bei 8.000 × g für 2 Minuten folgte. Die in dem Wasserdurchfluss eluierte RNA wurde für die weitere Reinigung aufgefangen.
  • Das RNA-Eluat wurde dann zum Entfernen der verunreinigenden DNA behandelt. Es wurden 20 Mikroliter 10 × DNase-I-Puffer (0,5 M Tris (pH 7,5), 50 mM CaCl2, 100 mM MgCl2), 10 ml RNase-freie DNase I (2 Einheiten/ml, Ambion Inc., Austin, Texas) und 40 Einheiten Rnasin (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) zu der RNA-Probe zugefügt. Die Mischung wurde dann 15 bis 30 min bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden auf Eis verbracht, und es wurden 250 ml RLT*-Lyse-Puffer und 250 ml Ethanol (Reinheitsgrad 200) zugefügt. Die Proben wurden dann durch Inversion gemischt. Die Proben wurden in Qiagen-RN-easy-Spinnkolonnen überführt und 15 Sekunden lang bei 8.000 × g zentrifugiert, und der Durchfluss verworfen. Die Kolonnen wurden in neue, 2 ml-Sammelrohre verbracht und zweimal mit 500 ml RPE*-Waschpuffer gewaschen, und der Durchfluss verworfen. Die Kolonnen wurden in neue 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen überführt, und die RNA durch Zugabe von 100 ml mit DEPC behandeltem Wasser eluiert, worauf ein 15 Sekunden langes Zentrifugieren bei 8.000 × g folgte. Die restliche RNA wurde durch die Zugabe von zusätzlichen 50 ml RNase freiem Wasser in die Spinnkolonne gewonnen, worauf ein 2 minutiges Zentrifugieren bei voller Geschwindigkeit erfolgte. Es wurden 10 ml der RNA-Zusammensetzung entfernt und durch die (A260,280)-Methode quantifiziert. Die RNA wurde bei 70°C gelagert. Es wurden Ausbeuten von 30-100 mg Gesamt-RNA pro 2,0 ml Fermentationslösung erzielt.
  • BEISPIEL 11
  • Quantitative kompetitive Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (QC-RT-PCR)-Protokoll
  • QC-RT-PCR ist eine Technik, die zur Quantifizierung der Menge einer spezifischen RNA in einer RNA-Probe verwendet wird. Diese Technik verwendet die Synthese eines spezifischen DNA-Moleküls, welches komplementär zu einem RNA-Molekül in der ursprünglichen Probe ist, durch reverse Transkription und durch dessen anschließende Vervielfältigung durch Polymerase-Kettenreaktion. Durch Zufügen verschiedener Mengen eines kompetitiven RNA-Moleküls in die Probe kann die Konzentration des betreffenden RNA-Moleküls bestimmt werden (zum Beispiel die mRNA-Transkripte des CYTb5-Gens). Die Mengen an spezifischen mRNA-Transkripten wurden zeitlich als Antwort auf die Zugabe von Fettsäuren oder Alkansubstraten zum Wachstumsmedium von durch Inkubation gezüchteten Kulturen von C. tropicalis zur Identifizierung und Charakterisierung der an der Oxydation dieser Substrate involvierten Gene untersucht. Dieses Vorgehen wird dazu eingesetzt, das CYTb5-Gen zu identifizieren, das basierend auf seine Transkriptionsregulierung an der Oxidation jedes beliebigen Substrats beteiligt ist.
  • A. Primer Design
  • Die erste Anforderung für QC-RT-PCR ist das Design der Primerpaare, die in der Rückwärtstranskription und den nachfolgenden PCR-Reaktionen eingesetzt werden. Diese Primer müssen individuell und spezifisch für das betreffende Gen sein. Primer, die zur Messung der Expression des CYTb5-Gens von C. tropicalis 20336 unter Verwendung der QC-RT-PCR-Prozedur, eingesetzt werden, sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5. Primer, die zur Messung der Expression des C. tropicalis-CYTb5-Gens in den QC-RT-PCR-Reaktionen eingesetzt werden
    Figure 00470001
    • F
    = vorwärts
    B
    = rückwärts
  • B Gestaltung und Synthese der kompetitiven DNA-Matritze
  • Die kompetitive RNA-Matritze wird in vitro aus einer kompetitiven DNA-Matritze synthetisiert, die den T7-Polymerase-Promotor hat und vorzugsweise eine kurze Deletion von beispielsweise etwa 10 bis 25 Nukleotide relativ zur natürlich vorkommenden Ziel-RNA-Sequenz aufweist. Die DNA-Matritze zur in-vitro-Synthese der Kompetitor-RNA wird unter Verwendung von PCR-Primern synthetisiert, die eine Länge zwischen 42 und 46 Nukleotide aufweisen. In diesem Beispiel werden die Primerpaare für die Synthese von CYTb5-Kompetitor-DNA in Tabelle 6 gezeigt.
  • Tabelle 6: Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die dazu eingesetzt werden, die Kompetitor-RNA-Matritze für die QC-RT-PCR-Messung der CYTb5-Genexpression zu synthetisieren
    Figure 00480001
  • Der Vorwärtsprimer wurde mit dem korrespondierenden Rückwärtsprimer eingesetzt, um die Kompetitor-DNA-Matritze zu synthetisieren. Die Primerpaare wurden in einer Standard Taq-Gold-Polymerase PCR-Reaktion gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen kombiniert (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Die PCR-Reaktionsmischung enthielt eine endgültige Konzentration von 250 nM für jeden Primer und 10 ng chromosomale DNA von C. tropicalis für die Matritze. Die Reaktionsmischung wurde für 25 bis 35 Zyklen in einen Thermozykler verbracht, wobei die höchst mögliche Annealing-Temperatur während der PCR-Reaktionen eingesetzt wird, um ein homogenes PCR-Produkt zu gewährleisten (in diesem Fall 62°C). Die PCR-Produkte wurden entweder Gel-gereinigt oder durch Filter gereinigt, um nicht eingebaute Nukleotide und Primer zu entfernen. Die Kompetitor-Matritzen-DNA wurde dann unter Einsatz der (A260,280)-Methode quantifiziert.
  • C Synthese der Kompetitor-RNA
  • Die Kompetitor-Matritzen-DNA wurde in vitro unter Verwendung des Megascript-T7-Kits von Ambion Biosciences (Ambion Inc., Austin, Texas) umgeschrieben, um die Kompetitor-RNA herzustellen. 250 Nanogram (ng) der Kompetitor-DNA-Matritze und die in vitro-Transkriptionsreagentien werden gemäß den Vorgaben des Herstellers gemischt. Die Reaktionsmischung wurde 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die sich ergebenden RNA-Zubereitungen wurden dann durch Gel-Elektrophorese im Hinblick auf die Bedingungen untersucht, die die höchsten Ausbeuten und die höchste Qualität der Kompetitor-RNA lieferten. Dies erforderte oft die Optimierung gemäß den Bestimmungen des Herstellers. Die DNA-Matritze wurde dann unter Einsatz von DNase I entfernt, wie dies in dem Kit von Ambion beschrieben ist. Die Kompetitor-RNA wurde dann durch das (A260,280)-Verfahren quantifiziert. Es wurden serielle Verdünnungen der RNA (1 ng/ml bis zu einem Femtogram (fg)/ml) gemacht, für den Einsatz in den QC-RT-PCR-Reaktionen und die eigentlichen Vorräte, die bei –70°C lagern.
  • D QC-RT-PCR-Reaktionen
  • Die QC-RT-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von rTth-Polymerase von Perkin-Elmer (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA) gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt. Die reverse Transkription wurde in einem Volumen von 10 ml mit einer Endkonzentration von 200 mM für jede dNTP, 1,25 Einheiten rTh-Polymerase, 1,0 mM MnCl2, 1 × der 10 ×-Puffer, der vom Hersteller mit dem Enzym zur Verfügung gestellt wird, 100 ng gesamte RNA, die von einer im Fermenter gezüchteten Kultur von C. tropicalis gewonnen wurde und 1,25 mM des geeigneten Rückwärtsprimers. Zur Quantifizierung der CYTb5-Expression in C. tropicalis war ein geeigneter Rückwärtsprimer 5' CTTCCGTGCTGAACGACTGCG 3'(3740-179C). Es wurden verschiedene Reaktionsmischungen für jede charakterisierte RNA-Probe hergestellt. Zur Quantifizierung der CYTb5-Expression wurde eine Reihe von 8 bis 12 der vorstehend beschriebenen QC-RT-PCR-Reaktionsgemische wurden auf verschiedene Reaktionsröhrchen aufgeteilt. In jedes Röhrchen wurden 1 ml einer seriellen Verdünnung, enthaltend von 100 pg bis 100 fg CYTb5- Kompetitor-RNA pro ml, zugefügt, so dass die Endreaktionsmischungen auf ein Endvolumen von 10 μl gebracht werden. Die QC-RT-PCR-Reaktionsmischungen wurden vermischt und 15 min lang gemäß den vom Hersteller empfohlenen Zeiten für die stattzufindende reverse Transkription bei 70°C inkubiert. Bei Beendigung der 15 Minuten langen Inkubation wurde die Probentemperatur auf 4°C reduziert, um die Reaktion zu stoppen, und es wurden 40 μl des PCR-Reaktionsgemisches der Reaktion zugefügt, um das Gesamtvolumen auf 50 μl zu bringen. Das PCR-Reaktionsgemisch besteht aus einer wässrigen Lösung enthaltend 0,3125 mM des Vorwärtsprimers 5' CACACCACCCACGACGACTTGTG 3'(3740-179A), 3,125 mM MgCl2 und 1 × chelatisierender Puffer, der mit dem Enzym von Perkin-Elmer geliefert wird. Die Reaktionsmischungen wurden in einen Thermozykler gegeben (Perkin-Elmer GeneAmp PCR-System 2400, Perkin-Elmer/Applied Biosystems Foster City, CA), und es wurde der folgende PCR-Zyklus durchgeführt: 94°C für 1 min, gefolgt von 10 Sekunden bei 94°C, gefolgt von 40 Sekunden bei 58°C für 17 bis 22 Zyklen. Die PCR-Reaktion wurde mit einer finalen Inkubation von 2 min bei 58°C und anschließend bei 4°C beendet. In einigen Reaktionen, bei denen keine erfassbaren PCR-Produkte produziert wurden, wurden die Proben zurück in den Thermozykler für zusätzliche Zyklen geführt, dieser Prozess wurde solange wiederholt, bis genug PCR-Produkte zur Quantifizierung produziert waren, wobei HPLC benutzt wurde. Die Zahl der Zyklen, die nötig sind, um genug PCR-Produkt herzustellen, ist eine Funktion der Menge an Ziel-mRNA in den 100 ng der totalen zellulären RNA. In Kulturen, in denen das CYTb5-Gen stark exprimiert ist, ist ausreichend CYTb5-mRNA vorhanden und es werden weniger PCR-Zyklen (≤ 17) benötigt, um eine quantifizierbare Menge an PCR-Produkt zu produzieren. Je niedriger die vorhandene Konzentrationen der Ziel-mRNA, je mehr Zyklen werden benötigt, um eine detektierbare Menge an Produkt zu produzieren.
  • HPLC-Quantifizierung
  • Sobald die QC-RT-PCR-Reaktionen beendet waren, wurden die Proben analysiert und durch HPLC quantifiziert. 5 bis 15 Mikroliter des QC-RT-PCR-Reaktionsgemisches wurden in einen Waters Bio-kompatiblen 625-HPLC mit einem daran angeschlossenen, abstimmbaren 484-Detektor von Waters gespritzt. Der Detektor war so eingestellt, dass er eine Wellenlänge von 254 nm misst. Der HPLC enthielt eine DNASepTM-Kolonne von Sarasep (Sarasep, Inc., San Jose, Ca), die in den Ofen verbracht wurde, und die Temperatur wurde auf 52°C eingestellt. Die Kolonne wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers angeordnet, wobei 30 cm beheizte PEEK-Rohre zwischen dem Injektor und der Kolonne angeordnet sind. Das System war mit einer vor dem Injektor angeordneten Sarasep-Guard-Markenkolonne ausgestaltet. Zusätzlich war eine Filterplatte von 0,22 mm in dem Ofen direkt vor der Kolonne vorhanden. Es wurden zwei Puffer eingesetzt, um einen Elutionsgradienten zu bilden, damit die PCR-Produkte aus den QC-RT-PCR-Reaktionen befreit und sie quantifiziert werden. Puffer A besteht aus 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA) und 5% Acetonitril (Volumen zu Volumen). Puffer B besteht aus 0,1 M TEAA und 25% Acetonitril (Volumen zu Volumen). Die QC-RT-PCR-Proben wurden in die HPLC eingespritzt und der lineare Gradient von 75% Puffer A/25% Puffer B zu 45% Puffer A/55% B wurde 6 Minuten lang bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,85 ml pro Minute betätigt. Da das QC-RT-PCR-Produkt der Kompetitor-RNA kleiner ist, wird es aus der HPLC-Kolonne vor dem QC-RT-PCR-Produkt von dem CYTb5mRNA(U) eluiert. Die Menge an QC-RT-PCR-Produkten wird aufgezeichnet und mit einem angeschlossenen Datenmodul 745 von Waters Corporation quantifiziert. Die logarithmischen Verhältnisse der Mengen an CYTb5-mRNA-QC-RT-PCR-Produkt (U) zum Kompetitor-QC-RT-PCR-Produkt © gemessen durch Peakbereiche, wurden aufgezeichnet und die Menge an Kompetitor-RNA musste der Menge an erfasstem CYTb5-mRNA-Produkt entsprechen.
  • BEISPIEL 12
  • Bewertung neuer Stämme in Schüttelkolben
  • Die Stämme, in denen CYTb5 und CPR amplifiziert war, wie die Stämme HDC11-1 und HDC11-2 und H5343 wurden für die Produktion von Disäuren in Schüttelkolben bewertet. Die Produktion von Disäuren durch. die Stämme, in denen CYTb5 und CPR amplifiziert war, wurde auch mit der Produktion von Disäuren von verschiedenen genetisch veränderten Stämmen von C. tropicalis 20336 verglichen (HDC1 enthält zusätzliche Kopien des CYP52A2A-Gens (7A-7B); HDC 10-2 enthält zusätzliche Kopien des CPRB-Gens (4A-4B); HDC-15 enthält zusätzliche Kopien des CYP52A5A-Gens (12A-12C); HDC16-2 enthält zusätzliche Kopien des CPRB-Gens und des CYP52A5A-Gens (jeweils 4A-4B und 12A-12C); und HDC23-3 enthält zusätzliche Kopien des CPRB- und des CYP52A2A-Gens (jeweils 4A-4B und 7A-7B)), die gemäß den in den U.S.-Patenten 6,331,420 und WO 00/20566 A2 beschriebenen Verfahren konstruiert wurden.
  • Standardprozedur für einen Schüttelkolben
  • 100 ml YEPD (Anlage) wurden mit 1 ml vorbereitetem Glycerin-Bestand von C. tropicalis beimpft, worauf die Zugabe eines Tropfens SAG471-Antischaum (Dimethylpolysiloxan, kommerziell zu erwerben bei Osi Specialities, Sistersville, WV) folgte. Man ließ die Kultur 20 Stunden lang in einem Schüttler von 30°C bei 300 rpm wachsen. Die 100 ml-Kultur wurde dann in ein DCA2-Medium (Anlage) verbracht, indem wie folgt kombiniert wurde:
    100 ml YEPD-Kultur
    100 ml Glycerin [500 g/L]
    20 ml YNB (Anlage) [334 g/L]
    780 ml DCA2
  • Die Zellsuspension wurde in fünf mit Einkerbungen versehenen 2000 ml-Schüttelkolben aufgeteilt, worauf die Zugabe eines Tropfens SAG471-Antischaum erfolgte. Die Kultur ließ man 30 Stunden lang bei 30°C in einem Schüttler bei 300 rpm wachsen. Das Medium wurde in autoklavierte Kunststoffflaschen verbracht, und die Zellen 5 min lang bei 4.068 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurde in DCA3 resuspendiert (Anlage):
    100 ml Glycerin [500 g/L]
    20 ml YNB [334 g/L]
    880 ml 0,3 M Kaliumphosphat-Puffer, pH = 7,5
  • Die Zellsuspension wurde in Mengen von 50 ml in mit Einkerbungen versehene 500 ml-Schüttelkolben verbracht, und es wurden 10% w/v-Octadecan (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) oder 3% w/v Ölsäure (Fisher Scientific Co.) zugegeben. Die Biokonversion konnte 48 Stunden lang in einem Schüttelinkubator bei 30°C und 300 rpm stattfinden. Anschließend wurden die Kulturen tiefgefroren bei –20°C in dem Schüttelkolben gelagert. Vor der Analyse wurden die Kulturen aufgetaut und auf 70°C erhitzt, gemischt und in 50 ml-Falcon-Röhrchen überführt. Die Proben wurden geerntet, und es wurden die Konzentrationen an Disäuren durch das nachfolgend beschriebene Verfahren analysiert. In 18 ist das Schema aufgezeichnet, das zur Extraktion und Analyse von Mono- und Disäuren aus Kulturmedien eingesetzt wird.
  • Vorgehen zur Bestimmung der Biomasse
  • 1. Ölsäureproben
  • Die Proben wurden auf 70°C erhitzt und zum Mischen gevortext. Ein Aliquot von jeder Probe (10 ml) wurde dann in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt, worauf eine Zugabe von 2,5 ml KOH (7%) erfolgte. Jedes Falcon-Röhrchen wurde 10 Minuten lang bei 3000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Es wurde dann Wasser (15 ml) in jedes zentrifugierte Zellen enthaltende Falcon-Röhrchen zugegeben. Sobald der Überstand nach Zugabe des Wassers zu den zentrifugierten Zellen klar war, wurden die Zellen dann in einem Ofen bei 80°C getrocknet bis zwei zu unterschiedlichen Zeiten bestimmte Trockengewichte gleich blieben. Wenn der Überstand nach der Zugabe von Wasser zu den zentrifugierten Zellen trüb war, wurden 2,5 ml KOH (7%) zugegeben. Nach der Zugabe von KOH wurden die zentrifugierten Zellen von jedem Röhrchen durch Vortexen resuspendiert und 10 Minuten lang wieder bei 3000 rpm zentrifugiert, worauf die Entfernung des Überstands erfolgte. Die Zellen wurden dann mit 15 ml Wasser gewaschen und durch Vortexen resuspendiert. Die Zellen wurden in Wasser resuspendiert, wieder 10 Minuten lang bei 3000 rpm zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden in einem kleinen Volumen Wasser resuspendiert, gevortext und in trockene, vorgewogene Aluminiumnäpfchen gegossen. Jedes Falcon-Röhrchen wurde dann 1-2 Mal mit Wasser in die Trocknungsnäpfchen hinein ausgewaschen. Die Trocknungsnäpfchen wurden in einem Ofen bei 80°C getrocknet bis zwei im Abstand von zwei Stunden genommene Trockengewichte gleich blieben.
  • 2. Octadecan-Proben
  • Die Proben wurden auf 70°C erhitzt und zum Mischen gevortext. Ein Aliquot von 10 ml von jeder Probe wurde dann in ein 50 ml-Falcon-Röhrchen überführt, worauf die Zugabe von 2,5 ml KOH (7%) erfolgte. Es wurde dann Hexan (5 ml) in jedes Falcon-Röhrchen zugegeben und es erfolgte das Vermischen durch Vortexen. Jedes eine Probe enthaltendes Falcon-Röhrchen wurde dann 10 Minuten lang bei 3000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Es wurde dann Wasser (15 ml) zu den zentrifugierten Zellen gegeben, die durch Vortexen resuspendiert wurden. Die resuspendierten Zellen in jedem Röhrchen wurden dann 10 Minuten lang bei 3000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die zentrifugierten Zellen wurden dann mit 15 ml Wasser gewaschen, in dem Wasser durch Vortexen resuspendiert und 10 Minuten lang bei 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in einem geringen Wasservolumen resuspendiert, gevortext und in trockene, vorgewogene Aluminiumnäpfe gegossen. Jedes Falcon-Röhrchen wurde 1-2 Mal mit Wasser in die Trocknungsnäpfe hinein gespült und dann in einem Ofen bei 80°C getrocknet.
  • C. Extraktionsprotokoll: Extraktion des Kulturmediums unter Einsatz von Methyl-t-butylether
  • Die Proben wurden auf 70°C erhitzt. Ein EPA-Fläschchen mit abgenommener Kappe wurde auf einer zweistelligen Waage tariert. Ein Gramm Probenkulturmedium wurde dann in jedes Fläschchen eingewogen und das Gewicht aufgenommen. Die Waage wurde tariert und 1 Gramm des internen Standards (C15-Monosäure in KOH [10 g/kg]) wurde dann eingewogen. Das Fläschchen wurde verschlossen und zum Mischen verwirbelt. Die vorstehend genanten Schritte wurden für alle Proben wiederholt, üblicherweise in Gruppen von 6 auf einmal. Anschließend wurden die Fläschchen in den Abzug gebracht. Es wurde HCl (6 N, 6,8 ml) in jedes Fläschchen pippetiert und zum Mischen verwirbelt. Es wurde dann Methyl-t-butylether (20 ml) in jedes Fläschchen zugegeben, das verschlossen und 1 Minute lang gevortext wurde. Es wurde wasserfreies Magnesiumsulfat (MgSO4, 5 g) in einer Wägeschale gewogen. Jedes Fläschchen wurde geschüttelt, und es wurde sofort MgSO4 in jedes geschüttelte Fläschchen gegeben. Jedes Fläschchen wurde fest verschlossen und wurde schnell geschüttelt. Anschließend wurde jede Kappe auf jedem Fläschchen vorsichtig gelockert, um den Druck zu senken. Die Kappe auf jedem Fläschchen wurde dann verschlossen, und das Fläschchen 1 Minute lang gevortext. Die Schritte von der Zugabe von MgSO4 in jedes Fläschchen bis zum Vortexen des mit Kappe verschlossenen Fläschchens wurden für jedes Fläschchen wiederholt. Die Fläschchen wurden dann etwa 5 Minuten lang gekühlt und eine Minute lang gevortext. Man ließ den Inhalt der Fläschchen sich absetzen. Ein Fläschchen von 4 ml wurde für jede Probe gekennzeichnet, und es wurde 1 ml Lösung aus jedem EPA-Fläschchen in jedes gekennzeichnete 4 ml-Fläschchen pippetiert.
  • D. Methylierung von extrahiertem Material
  • Bortrifluorid (1 ml) in Methanol-Reagenz (BF3-MeOH) wurde in jedes 4 ml-Fläschchen zugegeben. Die Fläschchen wurden dann verschlossen und zum Mischen gevortext. Anschließend wurden die Fläschchen in einem 50°C-Trockenblock angeordnet und insgesamt 20 Minuten in dem Trockenblock belassen. Die Fläschchen wurden dann aus dem Block entfernt und 5 Minuten lang gekühlt, worauf die Zugabe von 0,5 ml Hexan in jedes Fläschchen erfolgte. Im Anschluss an die nachfolgende Zugabe einer gesättigten NaCl-Lösung (1,5 ml) in jedes Fläschchen (71,5 g NaCl in 200 ml destilliertes Wasser), wurden die Fläschchen verschlossen und 1 Minute lang geschüttelt. Man ließ jedes Fläschchen sich setzen, bis alle Schichten getrennt waren. Anschließend wurde ein Gaschromatographie (GC)-Fläschchen für jede Probe gekennzeichnet. Das meiste von der oberen Schicht aus den 4 ml-Fläschchen wurde dann in das GC-Fläschchen überführt. Die untere Schicht in den 4 ml-Fläschchen wurde nicht in das GC-Fläschchen überführt. Jedes GC-Fläschchen wurde dann vorsichtig verschlossen und in das GC-Autosampler-Gestell platziert. Sobald alle Tagesproben geladen waren, wurde die GC gestartet. Während des Betriebs ließ man eine, im allgemeinen zwei, Methanol-Blindproben mitlaufen, wobei das Verfahren eingesetzt wurde, das zu Beginn des Tages als TEMP.MET auf dem Integrator gespeichert war um die GC vorzubereiten. Eine Methanol-Blindprobe lief nach jedem Lauf von 10 Proben mit, und als letzte Probe, damit die GC-Kolonne sauber blieb. Die GC-Bedingungen waren wie folgt:
    HP-Innwachs 30 m × 0,32 mm ID-Kolonne mit einer Filmdicke von 0,5 m
    Teilungsverhältnis 1:100
    Druck am Kolonnenkopf 13,5 psig
    Injektionstemperatur 240°C
    Temperatur des FID-Detektors 250°C .
    Temperaturprogramm des Ofens: 90°C Hochlaufen bis zu 190°C mit 7°C/min, danach Hochlaufen bis 250°C bei 12°C/min und 30 min halten
  • Dies wird in Integratoren als DCAME2.MET gespeichert.
  • Die Ergebnisse der Fläschchen werden nachfolgend in den Tabellen 7-10 gezeigt. Tabelle 7: Biokonversion von 3% w/v Ölsäure durch verschiedene rekombinante Stämme von Candida tropicalis Versuch 1
    Amplifizierte Gene Durchschnitt von C18:1 Disäure (g/kg) Anzahl der Experimente Standardabweichung (%) Verbesserung (%)
    H5343 17,5 3 7,4 0,0
    HDC1 CYP52A2A 16,5 3 17,5 –5,4
    HDC10-2 CPR B 17,5 3 17,2 0,3
    14DC15 CYP52A5A 21,5 3 16 23,3
    HDC23-3 CPRB+CYP52 A2A 23,3 3 8,7 33,5
    Tabelle 8: Biokonversion von 3% w/v Ölsäure durch verschiedene rekombinante Stämme von Candida tropicalis Versuch 2
    Stamm Amplifizierte Gene Durchschnitt von C18:1 Disäure (g/kg) Anzahl der Versuche Standardabweichung (%) Verbesserung (%)
    H5343 - 13,7 2 7,7 0,0
    HDC11-1 CPRB+CytB5 17,3 2 5,7 25,7
    HDC11-2 CPRB+CytB5 21,0 2 2,4 53,2
    HDC16-2 CPRB+CYP52A5A 16,0 2 8,4 16,3
    HDC23-3 CPRB+CYP52A2A 23,3 2 3,9 70,1
    Tabelle 9: Biokonversion von Octadecan durch verschiedene rekombinante Stämme von Candida tropicalis Versuche 1 und 2
    Stamm Amplifizierte Gene Gesamtprodukt an Mono- u. Disäuren (g/kg) Gesamtprodukt % Verbesserung Gesamtprodukt (Normalisiert) % Verbesserung Gesamtprodukt % Durchschnitt Verbesserung
    H5343 - 6,6/5,2 0,0/0,0 0/0 0
    HDC11-1 CPRB+Cytb5 15,2/10,1 130,6/93,5 74,3/39,1 56,7 ± 17,6
    HDC11-2 CPRB+Cytb5 18,2/17 175,8/225,7 100/94,4 97,2 ± 2,8
    HDC16-2 CPR B+CYP52A5A 17,1/15,2 160,1/191,2 91,1/79,9 85,5 ± 5,6
    HDC23-3 CPR B+CYP52A2A 8,5/17,7 29,8/239,1 16,9/100 58,5 ± 41,5
    Tabelle 10: Biokonversion von Octadecan durch verschiedene rekombinante Stämme von Candida tropicalis Versuch 3
    Stamm Amplifizierte Gene Gesamtprodukt Gesamtprodukt
    Mono- u. Disäuren (g/kg) % Verbesserung
    H5343 - 11,2 0,0
    HDC10-2 CPRB 22,1 98,0
    HDC11-2 CPRB+Cytb5 16,1 44,3
    HDC15 CYP52A5A 13,0 16,5
    HDC16-2 CPRB+CYP52A5A 19,4 73,8
  • Diese Werte zeigen, dass die Produktion der Disäuren in genetisch modifizierten Stämmen von C. tropicalis HDC11 und HDC11-2 erhöht wird, die im Vergleich zum Wildtypstamm H5343 eine erhöhte Zahl von Kopien von CYTb5/CPRB-Genen enthalten. Die Produktion von Disäuren war au in genetisch modifizierten Stämmen von C. tropicalis HDC10-2, HDC15, HDC16-2 und HDC23-3 erhöht.
  • BEISPIEL 13
  • Klonierung und Charakterisierung von C. tropicalis 20336-Genen Cytochrom b5 (CYTb5) und CPR
  • A. Klonierung des CYTb5-Gens von C. tropicalis 20336
  • Das CYTb5-Gen wurde aus der dritten Genom-Bank unter Einsatz eines PCR-Fragments als Sonde isoliert. Die PCR-Fragment-Sonde für CYTb5 wurde nach der PCR-Vervielfältigung von genomischer DNA von Saccharomyces cerevisiae mit Oligonukleotid-Primern erzeugt, die so gestaltet wurden, dass sie eine Region unter Verwendung des CYTb5-Gens von S. cerevisiae des National Center for Biotechnology Information amplifizieren. Ein Vorwärts-Primer 3698-66A 5' ATAAGAATGCGGCCGCTGAACGAGAACCACAT-CCAGGAG 3' und ein Rückwarts-Primer 3698-66B 5' CCTTAATTAAGGATAACCACATCCATACGTCGC 3' wurden auf der Basis der Cytb5-Sequenz von S. cerevisiae hergestellt. Diese Primer wurden in paarweisen Kombinationen in einer PCR-Reaktion mit Taq DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweise eingesetzt. Man erhielt ein PCR-Produkt von etwa 1036 bp. Dieses Produkt wurde aus dem Agar-Gel unter Einsatz von Qiaquick (Qiagen, Chatsworth, CA) aufgereinigt und gemäß der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweise in den pCR2.1TM-Vektor ligiert (19, Invitrogen, LaJolla, CA). Dieses PCR-Fragment wurde als Sonde bei der Isolierung des homologen CYTb5 von C. tropicalis 20336 eingesetzt. Die dritte Genom-Bank wurde unter Einsatz dieser CYTb5-Sonde gescreent, und man erhielt einen Klon, der die volle Länge des CYTb5-Gens enthielt. Der Klon enthielt ein Gen, das regulatorische und Protein-kodierende Regionen hatte (1A-1C). Ein offenes Leseraster von 387 Nukleotiden kodierte ein CYTb5-Protein von 129 Aminosäuren (1A-1C).
  • B. Bestätigung der Funktion des klonierten CYTb5-Gens
  • CYP51, Lanosterol-14α-demethylase, ist der Wirkungsort für Hauptkategorien antifungaler Mittel, die mit DMI als Demethylase-Inhibitoren bezeichnet werden. Therapeutische Mittel, wie Ketoconazole (Kc), ein N-substituiertes Imidazol als antifungales Mittel, stellen eine geeignete Analyse für die CYP51-Aktivität auf der Basis minimaler inhibitorischer Konzentrationen (MIC) zur Verfügung, wie beschrieben in Vanden Bossche et al., Antimicrobial Agents Chemother. 17:922-928, 1980. CPR-Stämme von S. cerevisiae, die einen Mangel an Cytochrom P450-Reduktase (CPR) aufweisen, zeigten sich hypersensitiv gegenüber Kc, wegen einer Reduzierung des Elektronflusses bei CYP51, das Ziel von Kc, wie dies in Sutter und Loper, supra, beschrieben ist. Die Wiederherstellung dieser Hypersensivität wurde durch Genklonieren auf der Basis einer Transformation einer genomischen Wildtyp-Bank auf einem Multikopien-Vektor in einen cprl-Stamm, wie dies in Truan et al., supra beschrieben ist, durchgeführt. Das für die Wiederherstellung dieser Sensibilität gegenüber KC verantwortliche Gen erwies sich als das Cytochrom CYTb5 kodierende Gen, wobei gezeigt wurde, dass in diesem System CYTb5 in der Lage ist, CPR funktionell zu mimen, wenn eine ausreichend hohe Menge an Kopien vorhanden ist. Die Inhibierung von Lanosterol-Demethylase durch eine bestimmte Konzentration von Kc resultiert in einer Wachstumsverzögerung von S. cerevisiae. Bei Fehlen von CPR ist die Wachstumsinhibierung stärker und findet bei einer niedrigeren Konzentration von Kc statt. Beim Fehlen des CPR-Gens kann CYTb5 den Phenotyp unterdrücken, indem es, wenn auch ineffizient, als Elektronendonor für CYP51 dient, und teilweise die wachstumsunterdrückende Wirkung von Kc beseitigt. Deswegen kann rekombinante S. cerevisiae, die C. tropicalis CYTb5 enthält, auf einem Medium wachsen, das zwischenzeitliche Mengen an Kc enthält. Dieser Test wurde dazu angewandt, um zu bestätigen, dass das klonierte C. tropicalis-Gen CYTb5 kodiert.
  • Das vermeintliche CYTb5-Gen wurde unter der Kontrolle eines GAL-Promotors, der in dem S. cerevisiae-Expressionsvektor pYES 2.0 (20, Invitrogen, Karlsbad, CA) nach der PCR-Vervielfältigung des offenen Leserasters vorhanden war, kloniert. Der CYTb5 enthaltende Expressionsvektor wurde in eine S. cerevisiae-Mutante DC10 eingeführt, die ein zerstörtes CPR-Gen enthält, und der rekombinante Stamm wurde auf Minimalmedium ausplattiert, das verschiedene Konzentration von Kc enthielt. Der DC10-Stamm, der das CPR-Wildtyp-Gen von S. cerevisiae (auf Plasmid pPS20) und von C. tropicalis das CYTb5-Gen (auf Plasmid pYES2b5), war in der Lage, auf einem Minimalmedium zu wachsen, das 0,078 mg/ml Kc. enthält. Andererseits war DC10, der pYES2.0 ohne irgendein Insert trägt, nicht in der Lage, bei Konzentrationen von 0,039 mg/ml Kc zu wachsen. Die rekombinanten Stämme wurden in flüssigen Kulturen getestet, um die Ergebnisse der Platten zu bestätigen. Während das pYES2.0 enthaltende DC10 ohne Insert in der Lage war, bei 0,0024 mg/ml Kc zu wachsen, war das DC 10, das b5 von dem GAL-Promoter exprimiert, resistent gegenüber 0,0098 mg/ml Kc. Dies bestätigte, dass das klonierte Gen das CYTb5-Enzym kodierte.
  • C. Klonierung und Charakterisierung des CPR-Gens von C. tropicalis 20336
  • Zum Klonieren von CPR wurde eine heterologe Probe, basierend auf der bekannten DNA-Sequenz für das CPR-Gen von C. tropicalis 750 eingesetzt, um das CPR-Gen von C. tropicalis 20336 zu isolieren.
  • 1) Klonieren des CPRA-Allels
  • Etwa 25.000 Phagen-Partikel aus der ersten genomischen Bank von C. tropicalis 20336 wurden mit einem 1,9 kb BamHI-Ndel-Fragment von dem Plasmid pCU3RED (siehe Picattagio et al., Bio/Technology 10:894-898 (1992) überprüft, das die meisten der 750 CPR-Gene von C. tropicalis enthält. Es wurden fünf Klone, die mit der Sonde hybridisierten, gewonnen, und die Plasmid-DNA aus diesen Lambda-Klonen wurde isoliert und durch Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Die Restriktionsenzym-Analyse legte nahe, dass alle fünf Klone identisch seien, es war aber nicht klar, ob ein komplettes CPR-Gen vorhanden ist.
  • Die PCR-Analyse wurde eingesetzt, um zu bestimmen, ob ein komplettes CPR-Gen in einem der fünf Klone vorhanden ist. Es wurden degenerierte Primer für stark konservierte Bereiche von bekannten CPR-Genen hergestellt (siehe Sutter et al., J. Biol. Chem. 265:16428-16436, 1990, 21). Es wurden zwei Primer für den FMN-bindenden Bereich (FMN1 und FMN2) synthetisiert. Ein Primer wurde für den FAD-bindenden Bereich (FAD) und ein Primer für den NADPH-bindenden Bereich (NADPH) (Tabelle 4) synthetisiert. Diese vier Primer wurden in PCR-Amplifizierungsversuchen eingesetzt, wobei eine Matritzenplasmid-DNA eingesetzt wurde, die aus vier von den oben beschriebenen fünf Klonen gewonnen wurde. Die FMN- und die FAD-Primer dienten als Vorwärts-Primer und die NADPH-Primer als die Rückwärts-Primer in den PCR-Reaktionen. Wenn verschiedene Kombination von Vorwärts- und Rückwärts-Primern eingesetzt wurden, wurden keine PCR-Produkte von irgendeinem Plasmid erhalten. Alle Primer-Kombinationen vervielfältigten jedoch die erwarteten Größenprodukte mit einem Plasmid, enthaltend das C.tropicalis 750 CPR-Gen (positive Kontrolle). Der am meisten wahrscheinliche Grund für das Ausfallen der Primerpaare, ein Produkt zu vervielfältigen, war der, dass alle vier Klone ein trunkiertes CPR-Gen enthielten. Einer der vier Klone (pHKM1) wurde unter Verwendung der Triplex 5'- und Triplex 3'-Primer sequenziert (Tabelle 4), welche das Insert und die multiple Klonierungsstelle auf den Klonvektor flankieren, und des degenerierten Primers basierend auf der oben beschriebenen NADPH-Bindungsstelle. Der NADPH-Primer scheiterte daran, irgendwelche Sequenzwerte zu erreichen, und das ist konsistent mit der PCR-Analyse. Sequenzen, die mit Triplex-Primer erhalten wurden, wurden mit der Sequenz von C. tropicalis 750 CPR unter Verwendung des MacVectorTM-Programms (Oxford Molecular Group, Campbell, CA) verglichen. Die mit den Triplex 3'-Primern erhaltene Sequenz zeigt eine Ähnlichkeit mit einer internen Sequenz des 750 CPR-Gens von C. tropicalis auf, was bestätigt, dass pHKM1 eine trunkierte Version eines 20336-CPR-Gens enthielt. pHKM1 wies ein 3,8 kb-Insert auf, welches einen 1,2 kb kodierenden Bereich des CPR-Gens beinhaltete, begleitet von 2,5 kb Stromaufwärts-DNA (22). Etwa 0,85 kb des 20336-CPR-Gens, das den C-terminalen Abschnitt des CPR-Proteins kodiert, fehlen von diesem Klon.
  • Da die erste Clontec-Bank nur ein gekürztes CPR-Gen erreichte, wurde die zweite von Clontech hergestellte Bank gescreent, um ein die volle Länge aufweisendes CPR-Gen zu gewinnen. Es wurden drei putative CPR-Klone erhalten. Die drei Klone, die Inserts im Bereich von 5-7 kb haben, wurden pHKM2, pHKM3 und pHKM4 genannt. Alle drei waren durch PCR unter Verwendung der oben beschriebenen, degenerierten Primer charakterisiert. Beide, sowohl pHKM2 als auch pHKM4 ergaben PCR-Produkte mit zwei Sätzen innerer Primer. pHKM3 ergab ein PCR-Produkt nur mit den FAD- und NADPH-Primern, wobei angenommen wird, dass dieser Klon wahrscheinlich ein gekürztes CPR-Gen enthält. Alle drei Plasmide wurden teilweise sequenziert, wobei die beiden Triplex-Primer und ein dritter Primer eingesetzt wurde, dessen Sequenz aus der DNA-Sequenz in der Nähe des trunkierten Endes des CPR-Gens gewählt wurde, das sich in dem pHKM1 befand. Diese Analyse bestätigte, dass beide, pHKM2 und 4 Sequenzen aufweisen, die mit pHKM1 überlappen und dass beide die 3'-Gegend des CPR-Gens enthalten, die bei pHKM1 fehlt. Abschnitte der Inserts von pHKM1 und pHKM4 wurden sequenziert, und es wurde ein CPR-Gen voller Länge identifiziert. Basierend auf der DNA-Sequenz und der PCR-Analyse, wurde geschlossen, dass pHKM1 die mutmaßliche Promotorgegend und 1,2 kb einer Sequenz, die einen Abschnitt (5'-Ende) eines CPR-Gens kodieren, enthielt. pHKM4 hatte 1,1 kb DNA, die mit pHKM1 überlappten und den verbleibenden Teil (3'-Ende) des CPR-Gens zusammen mit einer stromabwärts gelegenen, nicht übersetzten Region (23) enthielten. Diese beiden Plasmide enthielten zusammen ein komplettes CPRA-Gen mit einer stromaufwärts gelegenen Promoter-Gegend. CPRA beträgt in der Länge 4206 Nukleotide und umfasst eine regulatorische Region und eine Protein kodierende Region (definiert durch Nukleotide 1006-3042), welche 2037 Basenpaare in der Länge darstellen und für ein mutmaßliches Protein mit 679 Aminosäuren kodiert (jeweils 2A-2B und 3A-3C). Als das CPRA-Protein durch das Programm zum Aufreihen von Proteinen von den GeneWorksTM Softwarepaket (Oxford Molecular Group, Campbell, CA) analysiert wurde, zeigte sich es eine extensive Homologie bezüglich des CPR-Proteins von C.tropicalis 750 und C. maltosa.
  • 2) Klonieren des CPRB-Allels
  • Zum Klonieren des zweiten CPR-Allels, wurde die dritte, von Henkel hergestellte Genom-Bank, unter dem Einsatz von DNA-Fragmenten von pHKM1 und pHKM4 als Sonden gescreent. Es wurden fünf Klone erhalten, und diese wurden mit den drei inneren Primern sequenziert, die dazu eingesetzt wurden, die CPRA zu sequenzieren. Diese Primer wurden mit PRK1.F3, PRK1.F5 und PRK4.R20 bezeichnet (Tabelle 4) und zwei äußere Primer (M13-20 und T3 [Stratagen]) wegen der Polylinker-Region in dem pBK-CMV-Klonierungsvektor. Die Sequenzanalyse deutete darauf hin, dass vier dieser Klone, die mit pHKM5 bis 8 bezeichnet wurden, Inserts enthielten, die identisch mit dem vorher isolierten CPRA-Allel waren. Alle vier schienen die volle Länge des CPRA-Gens zu enthalten. Der fünfte Klon ähnelte ziemlich dem CPRA-Allel, insbesondere in der Region des offenen Leserasters, wo die Identität sehr hoch war. Es bestanden jedoch bedeutende Unterschiede in den nicht-translatierten 5'- und 3'-Bereichen. Daraus wurde geschlossen, dass der fünfte Klon das Allel zu CPRA war. Das Plasmid wurde mit pHKM9 (24) bezeichnet, und eine 4,14-kb-Region dieses Plasmids wurde sequenziert, und die Analyse der Sequenz bestätigte das Vorhandensein des CPRB-Allels, welches eine regulatorische Region und eine Protein kodierende Region beinhaltet (definiert durch die Nukleotide 1033-3069), wie in den 4A-4B gezeigt wird. Die Aminosäurensequenz des CPRB-Proteins wird in den 5A-5C gezeigt.
  • BEISPIEL 14
  • Identifizierung des CYTb5-Gens, das durch ausgewählte Fettsäuren und Alkansubstrate induziert wird
  • Gene, deren Transkription durch das Vorhandensein ausgewählter Fettsäuren oder Alkan-Substrate ausgelöst wird, wurden unter Einsatz des QC-RT-PCR-Assays identifiziert. Dieser Assay wurde zur Messung der CYTb5-Gen-Expression bei Kulturen von im Fermenter gezüchteten Kulturen von C. tropicalis ATCC 20962 verwendet. Dieses Verfahren umfasst die Isolierung der gesamten zellulären RNA aus Kulturen von C. tropicalis, und die Quantifizierung einer spezifischen mRNA in der Probe durch die Gestaltung und die Verwendung sequenzspezifischer QC- RT-PCR-Primer und einer Kompetitor-RNA. Die Quantifizierung wird erreicht durch die Verwendung bekannter Konzentrationen stark homologer Kompetitor-RNA in den QC-RT-PCR-Reaktionen. Die daraus resultierende QC-RT-PCR-vervielfältigten cDNA's werden voneinander getrennt und durch den Einsatz von Ionenpaarungs-Umkehrphasen-HPLC quantifiziert. Diese Analyse wurde dazu eingesetzt, die Expression des CYTb5-Gens von C. tropicalis ATCC20962 als Reaktion auf Fettsäuren und Alkansubstrate. Die induzierten Gene wurden durch die Errechnung ihrer mRNA-Konzentration zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Induktion, identifiziert. 25 stellt ein Beispiel zur Verfügung, wie die Konzentration der mRNA für das CYTb5-Gen unter Verwendung des QC-RT-PCR-Assays errechnet werden kann. Das logarithmische Verhältnis von unbekannten (U) zu Kompetitor-Produkt © wird gegen die Konzentration der Kompetitor-RNA aufgezeichnet, die in den QC-RT-PCR-Reaktionen vorhanden ist. Die Konzentration an Kompetitor, die zu einem logarithmischen Verhältnis von U/C = 0 führt, repräsentiert den Punkt, an dem die unbekannte mRNA-Konzentration der Konzentration des Kompetitors gleicht. 25 ermöglicht die Berechnung der Menge an CYTb5-message, die in 100 ng gesamter RNA vorhanden ist, die aus den Zellproben zur Stunde 0, nach 0,5, 1, 2 und 3 Stunden nach der Zugabe von Emersol® in einem Fermentationslauf isoliert wurde. Ausgehend von dieser Analyse ist es möglich, die Konzentration der CYTb5 mRNA, in 100 ng gesamter zellulärer RNA zu bestimmen. In dem Plot von 25 werden 113,75 pg des Kompetitors benötigt, um die Anzahl von mRNA's von CYTb5 in 100 ng RNA auszugleichen, die gerade vor der Zugabe des Substrats Emersol® (Zeit = 0), aus den Zellen gewonnen worden war. In Zellproben, die zu Zeitpunkten nach 0,5, 1, 2 und 3 Stunden nach der Zugabe von Emersol® genommen wurden, sind jeweils 293,69, 356,01, 372,24 und 264,61 pg Kompetitor-RNA nötig. Die während dieses Fermentationsdurchlaufs erzielten Ergebnisse, wie sie durch QC-RT-PCR gemessen wurden, werden auch als relative Induktion des CYTb5-Gens ausgedrückt, wie dies in der nachfolgenden Tabelle 11 gezeigt wird. Tabelle 11: Relative Induktion des CYTb5-Gens durch Emersol®
    Zeit (h) relative Induktion des CYTb5-Gens
    0 1
    0,5 2,5
    1 3,1
    2 3,3
    3 2,3
  • Diese Werte zeigen, dass CYTb5 um mehr als das 3,0 fache innerhalb einer Stunde nach der Zugabe von Emersol® induziert wird. Diese Analyse zeigt deutlich, dass die Expression von CYTb5 in C. tropicalis 20962 durch die Zugabe von Emersol® in das Aufzuchtmedium hinein induzierbar ist.
  • BEISPIEL 15
  • Die Integration ausgewählter CYTb5- und CPRB-Gene in das Genom von Candida tropicalis
  • Zum Integrieren ausgewählter Gene in das Chromosom von C. tropicalis 20336 oder seine Abkömmlinge, muss es eine Target-DNA-Sequenz geben, die ein intaktes Gen sein kann oder nicht sein kann, in das die Gene eingefügt werden können. Es muss auch ein Verfahren geben, mit dem der Integrationsvorgang ausgewählt wird. In einigen Fällen sind die Target-DNA-Sequenz und der auswählbare Marker gleich und, wenn dies der Fall ist, muss es auch ein Verfahren geben, um das Target-Gen als einen selektierbaren Marker im Anschluss an den Integrationsvorgang wiederzugewinnen. In C. tropicalis und ihren Abkömmlingen ist ein Gen, welches diese Kriterien erfüllt, URA3A, das Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase kodiert. Wenn man es als Target zur Integration benutzt, können die Ura-Varianten von C. tropicalis so umgewandelt werden, dass sie einen URA+-Gentypen via homologer Rekombination wieder regenerieren (26). In Abhängigkeit von der Gestaltung des Integrationsvektors, können ein oder mehr Gene zur selben Zeit in das Genom integriert werden. Bei Verwendung eines URA3A-Spalt-Gens, das wie in 27 gezeigt, orientiert ist, würde die homologe Integration mindestens eine Kopie des/der betreffenden Gens/Gene erzielen, die zwischen die gespaltenen Abschnitte des URA3A-Gens eingefügt sind. Weiterhin kann aufgrund der hohen Sequenzgleichheit zwischen den URA3A- und URA3B-Genen, die Integration des Konstrukts an beiden Stellen, den URA3A- und URA3B-Stellen, stattfinden. Anschließend kann ein Oligonukleotid, dass mit einem Fehlen in einem Abschnitt des URA-Gens gestaltet ist, basierend auf der identischen Sequenz über die URA3A- und URA3B-Gene hinweg, dazu benutzt werden, C. tropicalis-Transformanten zu erzielen, die wieder ura sind, die aber immer noch ein oder mehr neu integrierte Gene nach Wahl tragen (26). URA-Varianten von C. tropicalis können auch über andere Verfahren gewonnen werden, wie die klassische Mutagenese oder durch spontane Mutation. Bei der Verwendung gut etablierter Prozeduren kann die Selektion von ura-Stämmen durch die Verwendung von 5-Fluorooronsäure (5-FOA) vereinfacht werden, wie beispielsweise beschrieben in Boeke et al., Mol. Gen. Genet. 197: 345-346 (1984). Der Nutzen dieses Ansatzes für die Manipulation von C. tropicalis wurde gut dokumentiert, wie beispielsweise beschrieben in Picataggio et al., Mol. And Cell Biol. 11: 4333-4339 (1991); Rohrer et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 650-654 (1992); Picataggio et al., Bio/Technology 10: 894-898 (1992); U.S. Patent-Nr. 5,648,247 ; U.S.-Patent-Nr. 5,620,878 ; U.S.-Patent Nr. 5,204,252 ; U.S.-Patent Nr. 5,254,466 .
  • A. Herstellung eines URA-Integrationsvektors, pURAin.
  • Die Primer wurden auf der Basis der 1712 bp-Sequenz des URA3A-Gens von C. tropicalis 20336 (siehe 28) gestaltet und synthetisiert. Das URA3A-Primer-Set#1a und #1b (Tabelle 4) wurde in der PCR mit genomischer C. tropicalis 20336-DNA eingesetzt, um die URA3A-Sequenzen zwischen den Nukleotiden 733 und 1688 zu amplifizieren, wie in 28 gezeigt ist. Die Primer sind dazu gestaltet, um individuelle 5'AscI und 3'PacI-Spaltstellen in das resultierende amplifizierte URA3A-Fragment einzuführen. Die AscI- und PacI-Stellen wurden ausgewählt, weil diese Stellen nicht in dem CYTb5- oder CPRB-Gen vorhanden sind. Das URA3A-Primer-Set#2 wurde in der PCR mit C. tropicalis 20336-Genom als Matritze eingesetzt, um die URA3A-Sequenzen zwischen den Nukleotiden 9 und 758 zu amplifizieren, wie in 27 gezeigt. Das URA3A-Primer-Set #2a und #2b (Tabelle 4) wurde gestaltet, um die einzelnen 5'PacI und 3'PmeI-Restriktionsstellen in das resultierende amplifizierte URA3A-Fragment einzuführen. Die PmeI-Stelle ist auch nicht vorhanden in den CYTb5- und CPRB-Genen. Die PCR-Fragmente des URA3A-Gens wurden gereinigt, mit AscI, PacI und PmeI-Restriktionsenzymen gekürzt, an ein Gel gebunden und aufgereinigt, während QiaexII den AsCI-PimeI-Verdau des Plasmids pNEB193 (29), welches von New England Biolabs (Beverly, MA) käuflich zu erwerben war, aufreinigte. Die Ligation wurde 16 Stunden lang bei 16°C mit einer equimolaren Zahl DNA, unter Einsatz von T4DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. E. coli XL1-„Blue cells” (Stratagene, LaJolla, CA) wurden mit den Ligationen gemäß den Empfehlungen des Herstellers transformiert. Es wurden weiße Kolonien isoliert, gezüchtet, Plasmid-DNA isoliert und mit AscI-PmeI verdaut, um das Insertieren der modifizierten URA3A in pNEB193 hinein zu bestätigen. Der daraus resultierende Basisintegrationsvektor wurde pURAin (30) genannt.
  • B. Amplifizieren von CYTb5 und CPRB aus der genomischen C tropicalis-DNA
  • Das CYTb5 kodierende Gen wurde via PCR unter Einsatz von Primer amplifiziert (Primer CYTb5#1, GGGTTAATTAACATACTTCAAGCAGTTTGG; und Primer CYTb5#2, CCCTTAATTAAGGGGGGATGGAAGTGGCCG), um die PacI-Klonierungsstellen einzuführen (siehe Tabelle 4). Diese PCR-Primer wurden auf der Basis der DNA-Sequenz gestaltet, die für CYTb5 bestimmt waren. Der Ultma–PCR-Kit (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) wurde gemäß den Spezifikationen des Herstellers angewandt. Das CYTb5-PCR-Amplifizierungsprodukt wies 1998 Basenpaare in der Länge auf, wobei 1088 bp DNA stromaufwärts des CYTb5-Start-Codons und 486 bp stromabwärts des Stop-Codons für CYTb5 ORF erreicht werden sollten. Um ein fehlerfreies PCR-Produkt zum Klonieren zu erzeugen, wurde ein internes BglII-Fragment von einem PCR durch ein BglII-Fragment von einer anderen PCR ersetzt, der keine Mutationen in der Gegend aufwies. Ein endgültiges fehlerfreies CYTb5-Produkt wurde erzeugt, das PacI-sensitive Klonierungsstellen aufwies.
  • Das Gen, das CPRB von C. tropicalis 20336 kodiert, wurde von genomischer DNA über PCR unter Einsatz von Primer (CPRB#1 und CPRB#2) basierend auf der DNA-Sequenz amplifiziert, die für CPRB bestimmt worden war (4A-4B). Diese Primer wurden dazu gestaltet, individuelle PacI-Klonierungsstellen einzuführen. Der Expand-Hi-Fi Taq-PCR-Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde gemäß den Spezifikationen des Herstellers eingesetzt. Das CPRB-PCR-Produkt hatte eine Länge von 3266 bp, wobei es das Produkt auf 747 bp pf DNA stromaufwärts des CPRB-Start-Codons und auf 493 bp stromabwärts des Stop-Codons für das CPRB ORF brachte. Die daraus entstandenen PCR-Produkte wurden via Agarose-Gel-Elektrophorese isoliert, durch Verwendung von QiaexII gereinigt und mit PacI verdaut. Die PCR-Fragmente wurden gereinigt, entsalzt und unter Einsatz eines Microcon 100 (Amicon, Beverly, MA) konzentriert.
  • Die oben beschriebenen Amplifizierungsvorgänge können auch bei dem CPRA-Gen (2A-2B) angewandt werden, wobei die jeweils angegebenen Primer verwendet werden (siehe Tabelle 4).
  • C Klonieren des CPRB-Gens in pURAin
  • Die nächste Stufe war das Klonieren des CPRB-Gens in den pURAin-Integrationsvektor. Bei einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird keine fremde DNA, außer die die spezifisch durch synthetische Restriktionsstellensequenzen zur Verfügung gestellt wurden, in die DNA eingeführt, die in das Genom von C. tropicalis hinein geklont wurde, d. h., nur mit Ausnahme der Restriktionsstellen-DNA, werden nur native DNA-Sequenzen von C. tropicalis in das Genom eingebracht. pURAin wurde mit PacI, verdaut, mit Qiaex II gereinigt und mit alkalischer Phosphatase (SAP) aus Shrimp (United States Biochemical, Cleveland, OH) gemäß den Empfehlungen des Herstellers dephosphoryliert. Es wurden etwa 500 ng durch PacI linearisierte AURA 1 Stunde lang bei 37°C unter Einsatz von SAP bei einer Konzentration von 0,2 Enzymeinheiten pro 1 pmol DNA-terminal dephosphoryliert. Die Reaktion wurde 20 min lang durch Hitzeinaktivierung bei 65°C gestoppt.
  • Vor seinem Gebrauch wurde das abgeleitete CPRB PacI-Fragment, wobei die in Tabelle 4 gezeigten Primer eingesetzt wurden, sequenziert und mit CPRB verglichen, um zu bestätigen, dass PCR keine DNA-Basenpaar-Veränderungen eingebaut hat, was zu einer Aminosäurenveränderung führen würde. Nach der Bestätigung wurde CPRB an die Plasmid-pURA ligiert, welche auch mit PacI verdaut worden war. Mit PacI verdaute pURAin wurde dephosphoryliert und an das CPR Expand-Hi-Fi PCR-Produkt, wie vorstehend beschrieben, ligiert. E. coli XL1 Blue MRF' (Stratagen) wurden mit der Ligationsmischung transformiert, und es wurden einige resistente Kolonien ausgewählt für korrekte Konstrukte gescreent, die die Vektorsequenz, das invertierte URA3A-Gen und das amplifizierte CPRB-Gen (4A-4B) von 20336 enthalten sollten. AscI-PmeI-Verdau bestätigte ein erfolgreiches Konstrukt von pURAREDBin bestätigt.
  • Auf eine Weise, die der oben genannten ähnelt, wird das hier offenbarte URA-Gen in dem pURAin kloniert. Das PacI-Fragment des CPRA-Gens, dessen Nukleotidsequenz in den 2A-2B dargestellt ist, kann durch Methoden abgeleitet werden, die den Fachleuten bekannt ist.
  • 1) Herstellung von Vektoren, die dazu eingesetzt werden, HDC11 zu erzeugen
  • Der vorstehend hergestellte Integrationsvektor, enthaltend CPRB, pURAREDBin, wurde als der Anfangsvektor ausgewählt. Dieser Vektor wurde teilweise mit PacI verdaut, und das linearisierte Fragment Gel-isoliert. Das aktive PacI wurde durch die Behandlung mit T4 DNA-Polymerase zerstört, und der Vektor wurde wieder ligiert. Durch die anschließende Isolierung und den kompletten Aufschluss dieses neuen Plasmids wurde ein Vektor geschaffen, der nun nur eine aktive PacI-Stelle enthielt. Dieses Fragment wurde Gel-isoliert, dephosphoryliert und an das CYTb5-Fragment ligiert. Vektoren, die die CYTb5- und CPRB-Gene enthalten, orientierten sich in die entgegengesetzten Richtungen (5'-Enden sind verbunden), es wurden pURAinCPRb5 0 erzeugt.
  • D. Bestätigung der Integration von CYTb5 in das Genom von C. tropicalis
  • Basierend auf dem Konstrukt pURAin CPRb5 0, welches dazu eingesetzt wird, H5343 ura- zu transformieren, wurde ein Verfahren zum Nachweis der Integration entworfen. Genomische DNA aus Transformanten wurde mit Dra III verdaut, welches ein Enzym ist, das innerhalb der URA3A, URA3B, CPRB und CYTb5-Gene schneidet. Ein Verdau genomischer DNA an einer Stelle, an der eine Integration an dem URA3A-Locus stattgefunden hatte, sollte zu einem Auffinden eines 3,6 kb-Fragments bei einer Southern-Hybridisierung mit einer CPRB-Sonde führen. Southern-Hybridisierungen dieses Verdaus mit Fragmenten des CPRB- Gens wurden verwendet, um diese Integrations-Ereignisse zu screenen. Die Intensität des Bandsignals von dem Southern wurde als ein Maß für die Anzahl der Integrations-Ereignisse aufgefasst (d. h. je mehr Kopien des CYTb5-Gens vorhanden sind, desto stärker ist das Hybridisierungssignal).
  • C. tropicalis H5343-transformierte URA-Prototropen wurden bei 30°C, 170 upm in 10 ml SC-Uracil-Medium zur Herstellung von genomischer DNA gezüchtet. Durch das vorstehend beschriebene Verfahren wurde genomische DNA gewonnen. Die genomische DNA wurde mit DraIII verdaut. Es wurde ein 0,95%iges Agargel eingesetzt, um einen Southern-Hybridisuerungsblot herzustellen. Die DNA aus dem Gel wurde gemäß dem alkalischen Übertragungsverfahren von Sambrook et al., supra in eine MaganCharge Nylonfiltermembran (MSI Technologien, Westborn, MA) überführt. Für die Southern-Hybridisierung wurde ein 3,3 kb CPRB-DNA-Fragment als Hybridisierungsprobe eingesetzt. 300 ng der CPRB DNA wurden durch Verwendung eines ECL Direct Labeling- und Detektionssystem (Amersham) gekennzeichnet, und die Southern wurde gemäß den ECL-Kit Spezifikationen ausgeführt. Der Blot wurde in einem Volumen von 30 ml Hybridisierungsfluid, entsprechend 0,125 ml/cm2, durchgeführt. Im Anschluss an eine Prähybridisierung für 1 Stunde bei 42°C wurden 300 ng CPRB-Sonde zugeführt, und die Hybridisierung wurde für 16 Stunden bei 42°C fortgeführt. Im Anschluss an die Hybridisierung wurden die Blots zweimal jeweils 20 Minuten lang bei 42°C in primärer, Harnstoff enthaltender Waschlösung gewaschen. Es wurden 5 Minuten lange sekundäre Waschungen bei Raumtemperatur ausgeführt, wonach je nach den Richtungen die Erfassung erfolgte. Die Blots wurden 16 Stunden (h) lang, wie empfohlen, ausgesetzt.
  • Die Integration wurde durch die Bestimmung eines DraIII3,6 kb-Fragments aus der genomischen DNA der Transformanten bestätigt, aber nicht mit der C. tropicalis 20336-Kontrolle. Der entstandene CYTb5- und CPRB-integrierte Stamm wurde HDC11 genannt. Varianten des Stammes wurden willkürlich mit 11-1 bis 11-4 bezeichnet, basierend auf der relativen Anzahl von Integrations-Ereignissen, die stattgefunden haben.
  • Verglichen mit den Vorläufern enthielten H5343, HDC11-1, HDC11-3 und HDC11-4 jeweils eine einzelne zusätzliche Kopie des CYTb5-Gens, und HDC11-2 enthielt zwei zusätzliche Kopien des CYTb5-Gens. ANHANG
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    • *Siehe Kaiser et al., Verfahren in der Hefengenetik, Cold Spring Laborstory Press, USA (1994), deren Inhalt auch zum Offenbarungsgehalt gehört
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • SEQUENZPRO
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (12)

  1. Eine Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäure transformiert ist, die das CYTb5-Protein (Cytochromb5) kodiert, welches die Aminosäurensequenz gemäß SEQ. ID. Nr. 2 aufweist, wobei die Wirtszelle eine Zerstörung des β-Oxidationsstoffwechselwegs enthält.
  2. Eine Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist.
  3. Eine Wirtszelle nach Anspruch 2, wobei die Hefezelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Yarrowia, Candida, Bebaromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces und Pichia.
  4. Eine Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei die Candida-Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe von C. tropicalis, C. maltosa, C. apicola, C. paratropicalis, C. albicans, C. cloacae, C. guillermondii, C. intermedia, C. lipolytica, C. parapsilosis und C. zeylenoides.
  5. Eine Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure in einem Expressionsvektor enthalten ist.
  6. Eine Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei der Expressionsvektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid, Phagemid, Phage, Cosmid, künstlichem Hefe-Chromosom, linearem DNA-Vektor und Integrationsvektor.
  7. Eine Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei das Plasmid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus episomalem Hefe-Plasmid und replikativem Hefe-Plasmid
  8. Eine Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure, die das CYTb5-Protein kodiert, SEQ.ID.NR. 1 umfasst.
  9. Eine Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure, die das CYTb5-Protein kodiert, Nukleinsäurereste umfasst, die von 1109 bis 1495 der SEQ.ID.NR. 1 durchnummeriert sind.
  10. Eine Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle eine oder mehr Kopien eines Gens enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem CPR-Gen (P450 RED; Cytochrom P450 Reduktase), dem CYP-Gen (P450 ALK; Cytochrom P450 Monooxygenase) und deren Kombinationen.
  11. Ein Verfahren zum Erhöhen der Produktion von Dicarbonsäure, umfassend: das Bereitstellen einer Wirtszelle, die kein, ein oder mehrere CYTb5-Gene aufweist; das Erhöhen der Anzahl an CYTb5-Genen in der Wirtszelle, wobei die Gene ein CYTb5-Protein kodieren, welches die Aminosäurensequenz gemäß SEQ. ID. Nr. 2 aufweist, wobei die Wirtszelle eine Zerstörung des β-Oxidationsstoffwechselwegs enthält; und das Kultivieren der Wirtszelle in einem Medium, das ein organisches Substrat enthält, welches die Expression des CYTb5-Gens induziert, um die erhöhte Produktion von Dicarbonsäure zu bewirken.
  12. Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion einer Dicarbonsäure nach Anspruch 11, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist.
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