CN115103900A - 产生e8,e10-十二碳二烯基辅酶a、可得蒙及其衍生物的酵母细胞和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经工程化用于产生E8,E10‑十二碳二烯基辅酶A、可得蒙(codlemone，E8,E10‑十二碳二烯‑1‑醇)和任选地其衍生物E8,E10‑十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10‑十二碳二烯醛的酵母细胞。还提供了产生E8,E10‑十二碳二烯基辅酶A、可得蒙(E8,E10‑十二碳二烯‑1‑醇)和任选地其衍生物E8,E10‑十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10‑十二碳二烯醛的方法。还提供了用于获得此类酵母细胞的核酸构建体。

Description

产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A、可得蒙及其衍生物的酵母 细胞和方法
技术领域
本发明涉及经工程化用于产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A、可得蒙(codlemone，E8,E10-十二碳二烯-1-醇)和任选地其衍生物E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛的酵母细胞。还提供了产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A、可得蒙(E8,E10-十二碳二烯-1-醇)和任选地其衍生物E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛的方法。还提供了用于获得此类酵母细胞的核酸构建体。
背景技术
预期有害生物综合治理(IPM)对于增加作物产量和最小化环境影响以及实现有机食品生产发挥主要作用。IPM使用替代有害生物防控方法，如使用信息素干扰交配、使用信息素进行大量诱捕、有益昆虫等。
信息素构成一组不同的化学物质，昆虫(像其他生物体一样)在各种情境下使用这些化学物质与同一物种的个体进行交流，包括伴侣吸引、警报、跟踪标记和聚集。与远距离伴侣寻找相关的昆虫信息素已经在农业和林业应用中用于监测和防控有害生物，作为杀有害生物剂的安全和环保的替代物。
信息素代表杀有害生物剂的健康和环保的替代物。在田地或果园中分配性信息素破坏昆虫交流并防止交配；因此不会产下受精卵，并且不会对作物造成幼虫损害。这种方法被称为“交配干扰”。信息素是杀虫剂的有吸引力的替代物，因为它们是生物可降解的、物种特异性的化合物，其既不损害有益物种也不损害人。
昆虫信息素用于有害生物防控只是在几十年前开始的信息素的工业规模合成后才成为可能。然而，化学合成的信息素的价格仍然很高并且成为扩大它们在农业和林业中的使用的主要障碍。信息素的化学生产的另一个缺点是需要毒性化学品用作前体、催化剂和溶剂，以及在纯化过程中产生大量的有机废物。因此，基于复杂的基于化学合成的方法的当前生产方法使得产品对于在农业和林业中的许多潜在应用中的广泛使用而言过于昂贵。
与化学生产方法相比，生物生产方法有几个优点。首先，所有的反应都是通过工程化细胞在环境温度下在发酵罐中进行的，而不是需要不同前体、催化剂和条件(通常是高温和高压)的多个化学反应步骤。此外，工程化细胞使用廉价的可再生材料，如糖或植物油，而不是使用多种昂贵的专用化学品作为前体。尽管化学反应通常具有低特异性，并因此需要纯化中间体化合物和大量纯化最终产物，但通过酶进行的生物反应通常具有高特异性，并且副产物的形成是有限的，从而减少了用于纯化的有机溶剂和其他有毒化学品的使用。此外，通常对信息素活性而言重要的特定立体化学可能非常难以通过化学方法实现，而酶促方法可利用对顺式或反式异构体中的一种具有特异性的酶。
感兴趣的特定信息素是可得蒙，即一种具有式E8,E10-十二碳二烯-1-醇(E8,E10-C12:OH，CAS nr.33956-49-9)的二不饱和脂肪醇。可得蒙是许多物种的性信息素组分，并且是苹果蠹蛾(Cydia pomonella，codling moth)的主要性信息素，所述苹果蠹蛾属于鳞翅目并且是苹果、梨、李子和其他水果的主要有害生物。
Ding 2014披露了表达去饱和酶的植物细胞，并对其进行测试以确定它们是否可产生蛾信息素。通过使用简并PCR方法，从苹果蠹蛾中发现了三种去饱和酶(Ding等人Onthe way of making plants smell like moths–a synthetic biology approach.LundUniversity,Faculty of Science,Department of Biology)。
因此，需要用于产生昆虫信息素，特别是可得蒙的生物方法。除了低成本益处之外，发酵方法固有地比化学合成危险性更小并且更环保。
发明内容
本发明如权利要求中所限定。
本文提供了能够产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇的酵母细胞，所述酵母细胞表达至少一种异源去饱和酶，所述至少一种异源去饱和酶能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)。
本文提供了能够产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇的酵母细胞，所述酵母细胞表达：
i)至少一种异源去饱和酶，其能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
还提供了一种用于在酵母细胞中产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇的方法，所述方法包括提供酵母细胞和在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞表达：
i)至少一种异源去饱和酶，其能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)任选地至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇，
从而产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
还提供了用于修饰酵母细胞的核酸构建体，所述构建体包含：
i)编码至少一种异源去饱和酶的至少一种第一多核苷酸，所述至少一种异源去饱和酶能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)任选地编码至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)的第二多核苷酸，所述至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
还提供了一种监测有害生物的存在或干扰有害生物交配的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过本文所述的方法产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛；
ii)将所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛配制为信息素组合物；以及
iii)使用所述信息素组合物作为有害生物综合治理组合物。
本文还提供了可通过本文所述方法获得的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A、E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛。
本文还提供了部件试剂盒，其包含使用说明书和：
a)本文所述的酵母细胞；和/或
b)本文所述的用于修饰酵母细胞的核酸构建体和任选地待修饰的酵母细胞，其中在包含在核酸构建体中的多核苷酸表达后，经修饰的酵母细胞能够产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
附图说明
图1.提出了用于在酵母中产生可得蒙(E8,E10-C12:OH)的生物合成途径。ACC：乙酰辅酶A羧化酶；FA：脂肪酸；FAS；脂肪酸合酶；TE：硫酯酶；FAA：脂肪酰辅酶A合成酶；L：脂质；FAE：脂肪酸酯；FAD：脂肪酰去饱和酶；FAR：脂肪酰基还原酶；Comp.β-ox.：完全β-氧化。
图2.用(A)空质粒或(B)含有Cpo_CPRQ的载体(加入12:Me)转化的酵母的FAME提取物的GC-MS分析，(C)E9-12:Me的质谱；用(D)空质粒或(E)Cpo_CPRQ(加入E9-12:Me)转化的酵母的FAME提取物的GC-MS分析：(F)E8,E10-12:Me的质谱。
具体实施方式
定义
生物性杀有害生物剂：术语“生物性杀有害生物剂(biopesticide)”是“生物学杀有害生物剂(biological pesticide)”的缩写，是指几种类型的有害生物治理干预：通过捕食、寄生或化学关系。在欧盟，生物性杀有害生物剂已经被定义为“一种基于微生物或天然产物的杀有害生物剂”。在美国，EPA将其定义为“包括防治有害生物的天然存在的物质(生物化学杀有害生物剂)、防治有害生物的微生物(微生物杀有害生物剂)以及含有添加的遗传材料(植物结合保护剂(plant-incorporated protectant))或PIP的植物产生的杀有害生物物质”。本公开文本更具体地涉及包含天然产物或天然存在的物质的生物性杀有害生物剂。它们通常通过生长和浓缩天然存在的生物体和/或它们的代谢物(包括细菌和其他微生物、真菌、线虫、蛋白质等)产生。它们通常被认为是有害生物综合治理(IPM)方案的重要组成，并且作为合成化学植物保护产品(PPP)的替代物受到很多实际关注。生物防治剂手册(2009年：以前的生物性杀有害生物剂手册)对可用的生物杀虫剂(和其他基于生物学的防治)产品进行了综述。
混浊浓度：所述术语在本文中用于指表面活性剂，特别是非离子溶液或二醇溶液在溶液中的浓度，高于该浓度，在给定温度下，所述表面活性剂和所述溶液的混合物开始相分离并出现两相，从而变得混浊。例如，在给定温度下表面活性剂在水溶液中的混浊浓度是当与水溶液混合时产生两相的所述表面活性剂的最小浓度。混浊浓度可以从表面活性剂的制造商获得，或者可以通过制作剂量曲线并测定混合物相分离时的浓度来经实验测定。
浊点：表面活性剂，特别是非离子溶液或二醇溶液在溶液例如水溶液中的浊点是所述表面活性剂和所述溶液(例如所述水溶液)的混合物开始相分离并出现两相从而变得混浊的温度。这种行为是含有聚氧乙烯链的非离子表面活性剂的特征，其在水中表现出与温度行为相反的溶解度，因此随着温度的升高在某个点“混浊”。展现出这种行为的二醇称为“浊点二醇”。浊点受盐度影响，在含盐量较高的流体中通常较低。
可得蒙：所述术语是指具有式E8,E10-十二碳二烯-1-醇(E8,E10-C12:OH)的二不饱和醇。可得蒙是许多物种尤其是苹果蠹蛾(Cydia pomonella，codling moth)的主要性信息素组分，所述苹果蠹蛾属于鳞翅目并且是苹果、梨、李子和其他水果的主要有害生物。术语“可得蒙”、“E8,E10-十二碳二烯-1-醇”和“E8,E10-C12:OH”在本文中可互换使用。
去饱和的：术语“去饱和的(desaturated)”在本文中将可与术语“不饱和的(unsaturated)”互换使用，是指含有一个或多个碳-碳双碳或碳-碳三键的化合物。
乙氧基化和丙氧基化C16-C18醇基消泡剂：所述术语是指一组聚乙氧基化非离子表面活性剂，其包含以下或主要由以下组成：C16-C18中的乙氧基化和丙氧基化醇，例如CAS号68002-96-0，也称为C16-C18烷基醇乙氧基化物丙氧基化物或C16-C18醇乙氧基化丙氧基化聚合物。
提取剂：如本文所用，术语“提取剂”是指非离子表面活性剂(如消泡剂)，其促进回收发酵中产生的疏水化合物，特别是选自以下的聚乙氧基化表面活性剂：聚氧乙烯聚氧丙烯醚(polyethylene polypropylene glycol)、聚醚分散体的混合物、包含聚乙二醇单硬脂酸酯的消泡剂如二甲硅油以及乙氧基化及丙氧基化C16-C18醇基消泡剂、及其组合。
脂肪酸：术语“脂肪酸”是指具有长脂肪族链(即4与28个之间的碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的脂肪族链)的羧酸。大多数天然存在的脂肪酸是无支链的。它们可以是饱和的或去饱和的。
脂肪醇乙酸酯：所述术语在本文中将可与“脂肪乙酸酯”互换使用，是指具有脂肪碳链(即4与28个之间的碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的脂肪族链)的乙酸酯。脂肪醇乙酸酯可以是饱和的或去饱和的。
脂肪酰基-CoA：所述术语在本文中将可与“脂肪酰辅酶A酯”互换使用，是指通式R-CO-SCoA的化合物，其中R是脂肪碳链。脂肪碳链通过硫酯键与辅酶A的-SH基团连接。脂肪酰辅酶A可以是饱和的或去饱和的，这取决于衍生出它的脂肪酸是饱和的还是去饱和的。
脂肪醇：术语“脂肪醇”在本文中是指衍生自脂肪酰辅酶A的醇，其具有4至28个碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的碳链长。脂肪醇可以是饱和的或去饱和的。
脂肪醛：所述术语在本文中是指衍生自脂肪酰辅酶A的醛，其具有4至28个碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的碳链长。脂肪醛可以是饱和的或去饱和的。
异源的：当提及多肽(如蛋白质或酶)或多核苷酸时，术语“异源的”在本文中应解释为指代不天然存在于野生型细胞中的多肽或多核苷酸。例如，当应用于解脂耶氏酵母时，术语“异源Δ9去饱和酶”是指不天然存在于野生型解脂耶氏酵母细胞中的Δ9去饱和酶，例如衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的Δ9去饱和酶。
聚醚分散体的混合物：所述术语是指一组聚乙氧基化非离子表面活性剂，其包含以下或主要由以下组成：聚醚分散体的混合物，例如来自Sigma Aldrich的有机消泡剂204(产品编号A6426和A8311，MDL编号MFCD00130523)。
天然的：当提及多肽(如蛋白质或酶)或多核苷酸时，术语“天然的”在本文中应解释为指代天然存在于野生型细胞中的多肽或多核苷酸。所述术语可与术语“内源性”互换使用。
有害生物：如本文所用，术语“有害生物”应指代对人类或人类关怀(特别是在农业或畜牧生产的背景下)有害的生物，特别是动物。有害生物是对植物或动物、人类或人类关怀、牲畜、人类结构、野生生态系统等具侵入性或多产、有害、有麻烦、有毒、有破坏性、惹人讨厌的任何活生物。所述术语通常与相关术语害虫、杂草、植物和动物寄生虫和病原体重叠。有可能生物在一种环境中是有害生物，而在另一种环境中是有益的、驯化的或可接受的。
信息素：信息素是由以醇、醛或乙酸酯官能团结尾并且在脂肪族主链中含有最多3个双键的无支链的脂肪族链(9与18个之间的碳)指定的天然存在的化合物。信息素组合物能以化学或生物化学方式产生，例如如本文所述。因此，信息素可以包含去饱和脂肪醇、脂肪醛或脂肪醇乙酸酯，例如可以通过本文所述的方法和细胞获得。
聚乙氧基化表面活性剂：所述术语在本文中是指聚乙氧基化表面活性剂，即非离子表面活性剂。
聚氧乙烯聚氧丙烯醚：所述术语是指一组聚乙氧基化非离子表面活性剂，其包含以下或主要由以下组成：PEG-PPG-PEG嵌段共聚物消泡剂，例如
Figure BDA0003797945770000051
P407(CAS号9003-11-6)，也称为聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)。
降低的活性：术语“降低的活性”在本文中可以指代给定肽(如蛋白质或酶)的活性的完全或部分丧失。在一些情况下，肽由不能被缺失的必需基因编码。在这些情况下，可以通过本领域已知的方法(例如下调转录或翻译、或抑制肽)降低肽的活性。在其他情况下，肽由非必需基因编码，并且活性可能降低或者可能完全丧失，例如由于使编码肽的基因缺失。酶活性的降低还可以通过抑制编码所述酶的基因的转录来实现，如本领域已知的，例如使用阻遏型启动子，通过抑制活性或通过在翻译水平沉默。
饱和的：术语“饱和的”是指不含碳-碳双碳或碳-碳三键的化合物。
二甲硅油：所述术语是指一组聚乙氧基化非离子表面活性剂，其包含以下或主要由以下组成：二甲硅油(也称为西甲硅油(CAS号8050-81-5))、二甲基聚硅氧烷或活化的聚甲基硅氧烷。二甲硅油是还含有1.2％-1.6％聚乙二醇单硬脂酸酯的硅酮基乳液。
表面活性剂：所述术语是指降低两种液体之间、气体与液体之间或液体与固体之间的表面张力(或界面张力)的化合物。表面活性剂可用作洗涤剂、润湿剂、乳化剂、消泡剂和分散剂。表面活性剂通常是两亲性有机化合物，这意指它们含有疏水基团(它们的尾部)和亲水基团(它们的头部)。因此，表面活性剂通常含有水不溶性(或油溶性)组分和水溶性组分。最通常地，表面活性剂根据极性头部基团分类。非离子表面活性剂在其头部没有带电基团。
滴度：化合物的滴度在本文中是指所产生的化合物浓度。当化合物由细胞产生时，所述术语是指由细胞产生的总浓度，即化合物的总量除以培养基的体积。这意指，特别是对于挥发性化合物，滴度包括可能已经从培养基蒸发的化合物部分，并且因此通过从发酵液和从来自发酵罐的潜在废气收集产生的化合物来测定。
可得蒙(E8,E10-C12:OH)
可得蒙的生物合成基于乙酰辅酶A(CoA)，其被羧化为丙二酰辅酶A；该反应由乙酰辅酶A羧化酶(ACC)催化。丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A是脂肪酸合酶(FAS)用来合成链长为C16/C18的脂肪酰辅酶A的前体。假设是苹果蠹蛾过氧化物酶体氧化酶(POX)催化C16:CoA经C14:CoA到C12:CoA(月桂基-CoA)的链缩短(-2C)(Ding,2014)。早前就发现了去饱和酶在苹果蠹蛾中将C12:CoA转化为E9-C12:CoA的证据，但最近仅鉴定了编码该去饱和酶的基因以及编码其他去饱和酶的又两个基因(Cpo_SPTQ/Cpo_NPVE/Cpo_CPRQ)。第一去饱和步骤导致C12:CoA转化为E/Z9-C12:CoA，其在第二去饱和步骤中转化为E8,E10-C12:CoA(E8,E10-十二碳二烯基辅酶A)。然后脂肪酰基还原酶(FAR)可能还原二烯E8,E10-C12:CoA，最终形成可得蒙(E8,E10-C12:OH)。编码苹果蠹蛾中的FAR的基因迄今尚未鉴定出(Ding 2014,
Figure BDA0003797945770000052
等人,1988)。
图1中给出提出的可得蒙生物合成途径。
可得蒙的产生
本公开文本涉及能够产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地可得蒙(E8,E10-C12:OH或E8,E10-十二碳二烯-1-醇)的酵母细胞和用于在酵母细胞中产生可得蒙(E8,E10-C12:OH或E8,E10-十二碳二烯-1-醇)的方法。
诸位发明人已经设计了一种异源途径(通过示例的方式在图1中概述)，用于在酵母中产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
因此，本文提供了一种用于在酵母细胞中产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇的方法，所述方法包括提供酵母细胞和在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞表达：
i)至少一种异源去饱和酶，其能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A的至少一部分转化为E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)任选地至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其能够将所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)的至少一部分转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇，
从而产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
因此，本发明的酵母细胞和方法可用于通过以下产生可得蒙：如文本所述产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A，然后将其通过在酵母细胞中表达还原酶在体内转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇；或者E8,E10-十二碳二烯基辅酶A可被转化为脂质(如甘油三酯)或游离脂肪酸，然后将所述脂质(如甘油三酯)或游离脂肪酸回收并如本领域已知的，例如通过将与还原酶接触而在体外转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。在两种情况下，都产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
酵母细胞
在方法的第一步中，提供了酵母细胞，其可以使用乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A来生物合成更长的酰基辅酶A。任何能够合成酰基辅酶A的酵母细胞都可如本文所述用于产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇。替代性地，可向酵母细胞提供本领域已知的合适碳源。酵母细胞可以是非天然存在的酵母细胞，例如，如本文所述经工程化以产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛的酵母细胞。
乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A可以转化为酰基辅酶A，特别是碳链长度为12的酰基辅酶A。这可以涉及例如通过天然或异源酰基辅酶A硫酯酶(EC 3.1.2.20)的作用将十二酰基辅酶A转化为十二烷酸(月桂酸)的步骤。然后可以通过天然或异源脂肪酰辅酶A合成酶(FAA)(EC 6.2.1.3)的作用将月桂酸转化为十二烷酰基辅酶A。
因此，酵母细胞还能够将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A转化为脂肪酰辅酶A，特别是碳链长度为12的脂肪酰辅酶A。在一些实施方案中，酵母细胞因此表达能够进行所述反应的一种或多种脂肪酰辅酶A合成酶(EC 6.2.1.3)和/或一种或多种酰基辅酶A硫酯酶(EC3.1.2.20)。
在一些实施方案中，在培养基中为酵母细胞提供有月桂酸或月桂酸甲酯或三月桂酰甘油或另一种脂肪酸衍生物。当酵母细胞已被工程化为能够如下文详细描述通过β-氧化缩短碳链时，可以向细胞提供碳链长度长于12的油或脂肪或任何脂肪酸衍生物。
在一些实施方案中，细胞已经在基因组水平上进行了修饰，例如通过在基因组中进行基因编辑。还可以通过插入至少一种核酸构建体(如至少一种载体)来修饰细胞。可以如技术人员所已知的那样设计载体，以使核酸序列能够整合到基因组中，或者能够在不进行基因组整合的情况下表达由包含在载体中的核酸序列编码的多肽。
在本公开文本的一些实施方案中，使用以下属的酵母或真菌，包括但不限于布拉霉属(Blakeslea)、假丝酵母属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、须霉属(Phycomyces)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、丝孢酵母属(Trichosporon)、酵母属(Saccharomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)。在某些特定实施方案中，使用以下物种的生物，包括但不限于三孢布拉霉(Blakeslea trispora)、铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)、C.revkaufi、热带假丝酵母(C.tropicalis)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、雅致小克银汉霉(C.elegans)、山茶小克银汉霉(C.japonica)、斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、深黄被孢霉(M.isabellina)、拉曼被孢霉(M.ramanniana)、葡酒色被孢霉(M.vinacea)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、布拉克须霉(Phycomycesblakesleanus)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、瘦弱红酵母(R.gracilis)、禾本红酵母(R.graminis)、胶红酵母(R.mucilaginosa)、R.pinicola、普鲁兰丝孢酵母(Trichosporonpullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。在一些实施方案中，酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞或酿酒酵母细胞。
待修饰的酵母细胞(也称为宿主细胞)可表达天然酶，其可对可获得的E8,E10-十二碳二烯-1-醇的滴度具有负面影响；天然酶因此可以通过本领域已知的方法(如基因编辑)失活。例如，可以使编码对滴度具有负面影响的天然酶的基因缺失或突变，从而导致天然酶的活性完全或部分丧失，如本文中以下所述。
去饱和酶
本发明的方法依赖于表达用于将碳链长度为12的脂肪酰辅酶A转化为E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇所必需酶的酵母细胞。为此所需的第一酶是去饱和酶，其能够在所述碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为碳链长度为12且具有一个或多个双键的去饱和脂肪酰辅酶A。碳链长度为12的去饱和脂肪酰辅酶A可以是碳链长度为12的去饱和脂肪酰辅酶A的混合物；所述混合物包含E8,E10-C12:CoA，但通常还包括单不饱和脂肪酰辅酶E9-C12:CoA和Z9-C12:CoA。因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A的至少一部分转化为E8,E10-C12:CoA(E8,E10-十二碳二烯基辅酶A)的去饱和酶。EC类别EC 1.14.19.的去饱和酶能够进行这样的反应。
可得蒙的产生依赖于两个去饱和步骤。这些可以通过如本文中以下所述的一种去饱和酶，例如Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ、其突变体和功能变体，或通过两种不同的去饱和酶来进行。在使用两种不同去饱和酶的实施方案中，至少一种去饱和酶是如本文中以下所述的Cpo_CPRQ、其突变体或其功能变体。在使用两种不同去饱和酶的其他实施方案中，至少一种去饱和酶是如本文中以下所述的Gmo_CPRQ、其突变体或其功能变体。另一种去饱和酶能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键，或者可在碳链长度为14的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键，然后可将其缩短为碳链长度为12的去饱和脂肪酰辅酶A，如下文章节“链缩短”部分中所述。具有一个双键的碳链长度为12或14的脂肪酰辅酶A然后可以通过例如Cpo_CPRQ、其突变体或功能变体进一步去饱和。
去饱和酶优选是异源去饱和酶。在一些实施方案中，去饱和酶是Cpo_CPRQ(SEQ IDNO:2)，其是天然存在于苹果蠹蛾中的去饱和酶。如实施例16所展现的，单独的Cpo_CPRQ表达足以产生E8,E10-C12:CoA。单独的Cpo_SPTQ或Cpo_NPVE表达不会导致产生E8,E10-C12:CoA。根据Ding 2014，该发现是出人意料的，其中这三种去饱和酶的功能测定表明它们连续作用以在苹果蠹蛾信息素中形成共轭双键-在酵母中显现不是这种情况。
异源去饱和酶也可以是异源去饱和酶如Cpo_CPRQ的功能变体，即保留将碳链长度为12的脂肪酰辅酶A转化为碳链长度为12的去饱和脂肪酰辅酶A如E8,E10-C12:CoA的能力的变体。在一些实施方案中，功能变体与Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)具有至少60％同源性或同一性，如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
异源去饱和酶也可以是异源去饱和酶如Cpo_CPRQ的功能变体，即保留将碳链长度为12的脂肪酰辅酶A转化为碳链长度为12的去饱和脂肪酰辅酶A如E8,E10-C12:CoA的能力的变体。在一些实施方案中，功能变体与Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)具有至少60％同源性或同一性，如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
去饱和酶优选是异源去饱和酶。在一些实施方案中，去饱和酶是Gmo_CPRQ(SEQ IDNO:77)，其是天然存在于梨小食心虫(Grapholita molesta)中的去饱和酶，或其保留将碳链长度为12的脂肪酰辅酶A转化为碳链长度为12的去饱和脂肪酰辅酶A如E8,E10-C12:CoA的能力的功能变体。在一些实施方案中，功能变体与Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:78)具有至少60％同源性或同一性，如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
在一些实施方案中，如本领域已知的，去饱和酶通过引入编码所述去饱和酶的核酸来表达。如本领域已知的，可以对这样的核酸进行密码子优化。在特定实施方案中，编码去饱和酶的核酸如SEQ ID NO:1所示，或是与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ IDNO:1具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。在其他实施方案中，编码去饱和酶的核酸如SEQ ID NO:78所示，或是与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:78具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在一些实施方案中，酵母细胞表达几种能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键的去饱和酶。在这样的实施方案中，优选地，几种去饱和酶中的至少一种是如下详述的Cpo_CPRQ、其突变体或其功能变体。在其他实施方案中，优选地，几种去饱和酶中的至少一种是Gmo_CPRQ、其突变体或其功能变体。其他去饱和酶可以是例如Cpo_NPVE(登录号：AHW98355，SEQ ID NO:67)或Cpo_SPTQ(登录号：AHW98356，SEQ ID NO:69)，或与其具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。这样的去饱和酶可以在引入核酸后在酵母细胞中表达，可以将所述核酸针对酵母细胞进行密码子优化，例如SEQID NO:66或SEQ ID NO:68中所示的核酸，或与其具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
酵母细胞可以被工程化以表达几个拷贝的异源去饱和酶。这可以如本领域已知的进行。一种或多种去饱和酶也可以如本领域已知以高水平表达，例如通过使用导致强表达水平的组成型启动子-此类启动子是本领域已知的。
在一些实施方案中，去饱和酶是突变体Cpo_CPRQ，如在位置85具有突变的Cpo_CPRQ突变体。在一些实施方案中，突变是S85A突变。去饱和酶也可以是所述突变体的功能变体，并且与在位置85具有突变的突变体Cpo_CPRQ(如S85A突变体)具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。在一些实施方案中，突变体是S85T突变体。
在一些实施方案中，去饱和酶是突变体Cpo_CPRQ，如在位置82具有突变的Cpo_CPRQ突变体。在一些实施方案中，突变是S82A突变。去饱和酶也可以是所述突变体的功能变体，并且与在位置82具有突变的突变体Cpo_CPRQ(如S82A突变体)具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
在一些实施方案中，酵母细胞表达两种或更多种异源去饱和酶。所述两种或更多种去饱和酶可以相同或不同。在特定的实施方案中，酵母细胞表达SEQ ID NO:2所示的Cpo_CPRQ和突变体Cpo_CPRQ(如在位置85具有突变，如S85A突变体)。在一些实施方案中，酵母细胞表达Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)，与其具有至少65％同源性或同一性的其突变体Cpo_CPRQ或功能变体，并且还表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶。在一些实施方案中，酵母细胞表达SEQ ID NO:77所示的Gmo_CPRQ和SEQ IDNO:2所示的Cpo_CPRQ或本文所述的其突变体或功能变体。
在一些实施方案中，其他去饱和酶是SEQ ID NO:67所示的Cpo_NPVE，与其具有至少65％同源性或同一性如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％。例如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其突变体或功能变体。在一些实施方案中，酵母细胞表达Cpo_CPRQ、其突变体或功能变体，和Cpo_NPVE、其突变体或功能变体。在一些实施方案中，酵母细胞表达Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体，和Cpo_NPVE或其突变体或功能变体。
在其他实施方案中，其他去饱和酶是SEQ ID NO:69所示的Cpo_SPTQ，与其具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％。例如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其突变体或功能变体。在一些实施方案中，酵母细胞表达Cpo_CPRQ、其突变体或功能变体，和Cpo_SPTQ、其突变体或功能变体。在一些实施方案中，酵母细胞表达Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体，和Cpo_SPTQ或其突变体或功能变体。
在优选的实施方案中，至少一种异源去饱和酶是Cpo_CPRQ或其突变体或功能变体，如本文以上所述。
除本文所述的能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或两个双键的去饱和酶外，还表达能够在碳链长度>12，例如碳链长度为14或更大的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的去饱和酶的酵母细胞还必须表达能够减少碳链长度>12的去饱和脂肪酰辅酶A的碳链长度的其他酶。这在下文“链缩短”章节中详细描述。
因此，酵母细胞可以表达能够在所述碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为碳链长度为12且具有一个或多个双键的去饱和脂肪酰辅酶A的去饱和酶，如本文以上所述的任何去饱和酶，或其保留将脂肪酰辅酶A转化为碳链长度为12的去饱和脂肪酰辅酶A的能力的功能变体。酵母细胞还可以表达能够在碳链长度>12，如碳链长度为14或更大的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的去饱和酶，或其保留在碳链长度>12，如碳链长度为14或更大的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的能力的功能变体。
为了测试去饱和酶或其功能变体是否具有期望的活性，可以使用本领域已知的方法。例如，可以将待测试的候选酶引入酵母细胞中(例如在载体上或酵母细胞的基因组中)，在适当的培养基中孵育酵母细胞，从培养液中提取脂肪醇和/或脂肪酸甲酯，并进行分析如GC-MS分析以确定是否产生了去饱和化合物。测试缺失了一个或多个天然延伸酶基因的酵母细胞中的活性可以是有利的。在实施例4或Schneiter等人,2000中描述了这种程序的例子。
脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)
术语“脂肪酰辅酶A还原酶”、“还原酶”和“FAR”在本文中可互换使用。FAR催化两步反应：
酰基辅酶A+2NADPH<＝>CoA+醇+2NADP(+)
其中在第一步中，脂肪酰辅酶A被还原成脂肪醛，之后在第二步中脂肪醛被进一步还原成脂肪醇。脂肪酰辅酶A可以是去饱和脂肪酰辅酶A，特别是E8,E10-C12:CoA，然后将其转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
能够催化这种反应的FAR是EC编号为1.2.1.84的成醇脂肪酰辅酶A还原酶。因此，用于本发明方法的酵母细胞可以表达能够催化上述反应的异源FAR。替代性地，在回收E8,E10-C12:CoA并将所述E8,E10-C12:CoA与FAR在体外接触后，E8,E10-C12:CoA可被转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
FAR优选是昆虫FAR，如对于地夜蛾属、实夜蛾属、铃夜蛾属或小卷蛾属昆虫天然的FAR。例如，FAR对于黃地老虎(Agrotis segetum)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、Heliothissubflexa、烟实夜蛾(Helicoverpa assulta)、烟芽夜蛾(Helicoverpa virescens)或苹果蠹蛾是天然的。
在一些实施方案中，FAR是Ase_FAR(SEQ ID NO:10)，即天然存在于黃地老虎中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Ase_FAR的功能变体。例如，功能变体与Ase_FAR(SEQ ID NO:10)具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
在一些实施方案中，FAR是突变体Ase_FAR，如在位置198或413具有突变的突变体。在一些实施方案中，Ase_FAR突变体是T198A突变体。在其他实施方案中，Ase_FAR突变体是S413A突变体。
在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入编码Ase_FAR或其功能变体的核酸来表达Ase_FAR或其功能变体。例如，引入SEQ ID NO:9所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:9具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在其他实施方案中，FAR是Aip_FAR(SEQ ID NO:61)，即天然存在于小地老虎中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Aip_FAR的功能变体。例如，功能变体与Aip_FAR(SEQ ID NO:61)具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入编码Aip_FAR或其功能变体的核酸来表达Aip_FAR或其功能变体。例如，引入SEQ ID NO:60所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:60具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在其他实施方案中，FAR是Hs_FAR(SEQ ID NO:71)，即天然存在于Heliothissubflexa中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Hs_FAR的功能变体。例如，功能变体与Hs_FAR(SEQ ID NO:71)具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入编码Hs_FAR或其功能变体的核酸来表达Hs_FAR或其功能变体。例如，引入SEQ ID NO:70所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:70具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在其他实施方案中，FAR是Has_FAR(SEQ ID NO:73)，即天然存在于烟实夜蛾中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Has_FAR的功能变体。例如，功能变体与Has_FAR(SEQ ID NO:73)具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入编码Has_FAR或其功能变体的核酸来表达Has_FAR或其功能变体。例如，引入SEQ ID NO:72所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:72具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在其他实施方案中，FAR是Hv_FAR(SEQ ID NO:75)，即天然存在于烟芽夜蛾中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Hv_FAR的功能变体。例如，功能变体与Hv_FAR(SEQ ID NO:75)具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入编码Hv_FAR或其功能变体的核酸来表达Hv_FAR或其功能变体。例如，引入SEQ ID NO:74所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:74具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在一些实施方案中，酵母细胞表达来自苹果蠹蛾的FAR。在一些实施方案中，FAR是Cpo_FAR(SEQ ID NO:76)，即天然存在于苹果蠹蛾中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Cpo_FAR的功能变体。例如，功能变体与Cpo_FAR(SEQ ID NO:76)具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入编码Cpo_FAR或其功能变体的核酸来表达Cpo_FAR或其功能变体。例如，引入SEQ ID NO:76所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:76具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在一些实施方案中，FAR是Har_FAR(SEQ ID NO:12)，即天然存在于棉铃虫(Helicoverpa armigera)中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Har_FAR的功能变体。例如，功能变体与Har_FAR(SEQ ID NO:12)具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性。
在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入编码Har_FAR或其功能变体的核酸来表达Har_FAR或其功能变体。例如，引入SEQ ID NO:11所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:11具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在一些实施方案中，酵母细胞表达FAR的几个拷贝。例如，如本领域已知的，FAR以高水平表达。
在一些实施方案中，酵母细胞表达如本文所述的去饱和酶和FAR。在具体的实施方案中，酵母细胞表达Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体，和Ase_FAR(SEQ ID NO:10)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体。在一些实施方案中，酵母细胞表达Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体，并且FAR是突变体Ase_FAR，如在位置198或413具有突变的突变体，例如T198A突变体或S413A突变体。在一些实施方案中，去饱和酶是突变体Cpo_CPRQ，如在位置85具有突变的突变体，例如S85A突变体，并且FAR是Ase_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，去饱和酶是S85A Cpo_CPRQ突变体，并且FAR是突变体Ase_FAR，如在位置198或413具有突变的突变体，例如T198A突变体或S413A突变体。在一些实施方案中，去饱和酶是两种去饱和酶，如两种相同的去饱和酶，例如Cpo_CPRQ或在位置85具有突变的突变体Cpo_CPRQ，例如S85A突变体，并且FAR是Ase_FAR或其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是两种去饱和酶，如两种相同的去饱和酶，例如Cpo_CPRQ或在位置85具有突变的突变体Cpo_CPRQ，例如S85A突变体，并且FAR是突变体Ase_FAR，如在位置198或413具有突变的突变体，例如T198A突变体或S413A突变体。在其他实施方案中，去饱和酶是两种不同的去饱和酶，例如Cpo_CPRQ去饱和酶和在位置85具有突变的突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如S85A突变体，并且FAR是Ase_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，去饱和酶是两种不同的去饱和酶，例如Cpo_CPRQ去饱和酶和在位置85具有突变的突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如S85A突变体，并且FAR是突变体Ase_FAR，如在位置198或413具有突变的突变体，例如T198A突变体或S413A突变体。在其他实施方案中，酵母细胞表达Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)和Ase_FAR或其突变体或功能变体。
在具体的实施方案中，酵母细胞表达Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体，和Aip_FAR(SEQ ID NO:61)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是突变体Cpo_CPRQ，如在位置85具有突变的突变体，例如S85A突变体，并且FAR是Aip_FAR或其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是两种去饱和酶，如两种相同的去饱和酶，例如两种Cpo_CPRQ去饱和酶或在位置85具有突变的两种突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如两种S85A突变体，并且FAR是Aip_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，去饱和酶是两种不同的去饱和酶，例如Cpo_CPRQ去饱和酶和在位置85具有突变的突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如S85A突变体，并且FAR是Aip_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，酵母细胞表达Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)和Aip_FAR或其突变体或功能变体。
在一些实施方案中，酵母细胞表达Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体，和Hs_FAR(SEQ ID NO:71)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是突变体Cpo_CPRQ，如在位置85具有突变的突变体，例如S85A突变体，并且FAR是Hs_FAR或其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是两种去饱和酶，如两种相同的去饱和酶，例如两种Cpo_CPRQ去饱和酶或在位置85具有突变的两种突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如两种S85A突变体，并且FAR是Hs_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，去饱和酶是两种不同的去饱和酶，例如Cpo_CPRQ去饱和酶和在位置85具有突变的突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如S85A突变体，并且FAR是Hs_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，酵母细胞表达Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)和Hs_FAR或其突变体或功能变体。
在具体的实施方案中，酵母细胞表达Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体，和Has_FAR(SEQ ID NO:73)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是突变体Cpo_CPRQ，如在位置85具有突变的突变体，例如S85A突变体，并且FAR是Hs_FAR或其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是两种去饱和酶，如两种相同的去饱和酶，例如两种Cpo_CPRQ去饱和酶或在位置85具有突变的两种突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如两种S85A突变体，并且FAR是Hs_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，去饱和酶是两种不同的去饱和酶，例如Cpo_CPRQ去饱和酶和在位置85具有突变的突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如S85A突变体，并且FAR是Hs_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，酵母细胞表达Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)和Has_FAR或其突变体或功能变体。
在具体的实施方案中，酵母细胞表达Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体，和Hv_FAR(SEQ ID NO:75)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是突变体Cpo_CPRQ，如在位置85具有突变的突变体，例如S85A突变体，并且FAR是Hv_FAR或其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是两种去饱和酶，如两种相同的去饱和酶，例如两种Cpo_CPRQ去饱和酶或在位置85具有突变的两种突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如两种S85A突变体，并且FAR是Hv_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，去饱和酶是两种不同的去饱和酶，例如Cpo_CPRQ去饱和酶和在位置85具有突变的突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如S85A突变体，并且FAR是Hv_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，酵母细胞表达Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)和Hv_FAR或其突变体或功能变体。
在具体的实施方案中，酵母细胞表达Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体，和Cpo_FAR(SEQ ID NO:76)或与其具有至少65％同源性或同一性的其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是突变体Cpo_CPRQ，如在位置85具有突变的突变体，例如S85A突变体，并且FAR是Cpo_FAR或其功能变体。在一些实施方案中，去饱和酶是两种去饱和酶，如两种相同的去饱和酶，例如两种Cpo_CPRQ去饱和酶或在位置85具有突变的两种突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如两种S85A突变体，并且FAR是Cpo_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，去饱和酶是两种不同的去饱和酶，例如Cpo_CPRQ去饱和酶和在位置85具有突变的突变体Cpo_CPRQ去饱和酶，例如S85A突变体，并且FAR是Cpo_FAR或其功能变体。在其他实施方案中，酵母细胞表达Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)和Cpo_FAR或其突变体或功能变体。
在一些实施方案中，酵母细胞表达如上所述的去饱和酶，如Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体，如上所述的FAR，特别是Ase_FAR、Aip_FAR、Hs_AR、Has_FAR或Hv_FAR，或与其具有至少65％同源性或同一性的其突变体或功能变体，并且还表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶，如Cpo_NPVE(SEQ ID NO:67)或Cpo_SPTQ(SEQ ID NO:69)，与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69具有至少65％同源性或同一性，与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69具有如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其突变体或功能变体。
在一些实施方案中，FAR不是Har_FAR(来自棉铃虫的FAR，SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，FAR不是Ta_FAR(来自仓鸮的FAR，SEQ ID NO:8)。
因此，酵母细胞可以表达能够在所述碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为碳链长度为12且具有一个或多个双键的去饱和脂肪酰辅酶A的去饱和酶，如本文以上所述的任何去饱和酶，或其保留将脂肪酰辅酶A转化为碳链长度为12的去饱和脂肪酰辅酶A的能力的功能变体。酵母细胞还可以表达能够在碳链长度>12，如碳链长度为14或更大的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的去饱和酶，或其保留在碳链长度>12，例如碳链长度为14或更大的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的能力的功能变体，如上所述。这些酵母细胞中的任一种还可以表达如本文以上所述的还原酶或其保留还原酶活性的功能变体。
为了测试还原酶或其功能变体是否具有期望的活性，可以使用本领域已知的方法。例如，可以将待测试的候选酶引入酵母细胞中(例如在载体上或酵母细胞的基因组中)，在适当的培养基中孵育酵母细胞，从培养液中提取脂肪醇，并进行分析如GC-MS分析以确定是否产生了去饱和脂肪醇。测试缺失了一个或多个天然延伸酶基因的酵母细胞中的活性可以是有利的。在实施例4或Schneiter等人,2000中描述了这种程序的例子。
增加前体的可用性
为了改善E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇及其衍生物的产生，在酵母细胞中引入另外的修饰以增加所需的前体，特别是E8,E10-C12:CoA的可用性可以是有利的。因此，可以将酵母细胞用下文详述的任何修饰进一步修饰，特别是：
-异源细胞色素b5的表达
-异源细胞色素b5还原酶的表达
-血红蛋白的表达
-一种或多种天然延伸酶的失活，导致活性全部或部分丧失
-一种或多种天然硫酯酶的失活，导致活性全部或部分丧失
-一种或多种天然脂肪醛脱氢酶、一种或多种脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或一种或多种脂肪酰基合酶的失活或活性修饰
-异源硫酯酶基因的表达
-脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白的表达
酶(例如延伸酶、硫酯酶、脂肪醛脱氢酶、脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子或脂肪酰基合酶)可以例如通过在基因中(例如在编码序列、启动子、Kozak序列、终止子或其他调节元件中)引入一个或多个突变(包括全部或部分缺失、插入、置换或无义或错义突变)而失活。例如，天然启动子或天然终止子可以分别被另一个较弱的启动子或另一个终止子替换。导致活性部分或全部丧失的其他失活方法包括阻抑转录以及转录后失活(如沉默)，例如使用RNAi系统或CRISPR/Cas系统导致相关转录物的降解，从而防止或至少减少翻译；以及翻译后失活(如抑制蛋白质)。可以使用本领域已知的方法以其他方式修饰酶活性，例如以修饰酶的特性(如胞内定位)或增加活性。
延伸酶活性可以通过分析脂肪酸谱来测试，例如如Schneiter等人,2000所述。
硫酯酶活性可以通过适当的测定来测试，如Nancolas等人,2017中所述的硫酯酶活性测定。
脂肪醛脱氢酶活性可以通过适当的测定来测试，如Iwama等人,2014中所述的脂肪醛降解测定。
脂肪醇氧化酶活性可以通过适当的测定来测试，如Iwama等人,2015中所述的脂肪醇降解测定。
过氧化物酶体生物发生因子活性可以通过适当的测定来测试，如表达候选脂肪醇氧化酶的酵母细胞在包含脂肪酸作为唯一碳源的培养基中的生长测定。
脂肪酰基合酶活性可以通过测试细胞生长来测试，因为脂肪酰基合酶是必需基因。
可以组合任何所述修饰，即酵母细胞可以包含几种所述修饰。
异源细胞色素b5的表达
诸位发明人发现对产生可得蒙及其衍生物有益的一种修饰是在酵母细胞中表达异源细胞色素b5。该膜结合血红素蛋白充当几种膜结合加氧酶的电子载体。如实施例(特别是实施例6)中所示，发现异源细胞色素b5的表达增加了脂肪酸甲酯(特别是E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me)的可用性。因此，预期这样的修饰增加E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地碳链长度为12的去饱和脂肪醇(如可得蒙)的产生。
在一些实施方案中，细胞色素b5是对于鳞翅目物种天然的细胞色素b5。在特定实施方案中，细胞色素b5是来自铃夜蛾属物种的细胞色素b5，优选如SEQ ID NO:4所示的来自棉铃虫的细胞色素b5，或与其具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
细胞色素b5可以以高水平表达。
细胞色素b5可以通过在酵母细胞中引入编码细胞色素b5或其同源物的核酸来表达。例如，引入SEQ ID NO:3所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ IDNO:3具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
为了测试细胞色素b5的功能变体是否保留期望的活性，可以使用本领域已知的方法；例如，如Lamb等人,1999中所述的分光光度测定法。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达如上所述的去饱和酶和脂肪酰辅酶A还原酶，并进一步表达本文所述的异源细胞色素b5。特别地，酵母细胞可表达一种或多种选自Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)、突变体Cpo_CPRQ(如S82突变体或S85突变体，优选S85突变体如S85A突变体)及其功能变体的去饱和酶，和一种或多种选自Ase_FAR(SEQ ID NO:10)、突变体Ase_FAR(如T198突变体或S413突变体，优选T198A突变体或S413A突变体)、Aip_FAR(SEQID NO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQ ID NO:75)、Har_FAR(SEQ ID NO:12)及其功能变体的还原酶，以及如本文以上所述的细胞色素b5如来自棉铃虫的细胞色素b5(SEQ ID NO:4)或其功能变体。除了Cpo_CPRQ、其突变体或功能变体之外，酵母细胞还可以表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶，如上所述，例如Cpo_NPVE、Cpo_SPTQ、其突变体或功能变体。
可以将酵母细胞用本文所述的任何修饰进一步修饰，特别是通过以下来修饰：异源细胞色素b5还原酶的表达，血红蛋白的表达，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然延伸酶基因的突变，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然硫酯酶基因的突变，编码一种或多种脂肪醛脱氢酶、一种或多种脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或一种或多种脂肪酰基合酶的一个或多个天然基因的突变，异源硫酯酶基因的表达和/或脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白的表达。
异源细胞色素b5还原酶(EC 1.6.2.2)的表达
可导致E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地可得蒙及其衍生物产生增加的另一种修饰是异源细胞色素b5还原酶(EC 1.6.2.2)的表达。
细胞色素b5还原酶(也称为高铁血红蛋白还原酶)是将高铁血红蛋白转化为血红蛋白的NADH依赖性酶：
NADH+H++2高铁细胞色素b5＝NAD++2亚铁细胞色素b5
在一些实施方案中，细胞色素b5还原酶是对于鳞翅目物种天然的细胞色素b5还原酶。在特定实施方案中，细胞色素b5还原酶是来自铃夜蛾属物种的细胞色素b5还原酶，优选来自铃夜蛾属物种如棉铃虫的细胞色素b5还原酶，例如SEQ ID NO:24所示的细胞色素b5还原酶，或与其具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
为了测试细胞色素b5还原酶的功能变体是否保留期望的活性，可以使用本领域已知的方法；例如，如Lamb等人,1999中所述的分光光度测定法。
细胞色素b5还原酶可以以高水平表达。
细胞色素b5还原酶可以通过在酵母细胞中引入编码所述细胞色素b5还原酶或其同源物的核酸来表达。例如，引入SEQ ID NO:23所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:23具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达如上所述的去饱和酶和脂肪酰辅酶A还原酶，并进一步表达本文所述的异源细胞色素b5还原酶。可以将酵母细胞用文中所述的任何修饰进一步修饰。特别地，酵母细胞可表达一种或多种选自Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)、Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)、突变体Cpo_CPRQ(如S82突变体或S85突变体，优选S85突变体如S85A突变体)及其功能变体的去饱和酶，和一种或多种选自Ase_FAR(SEQ ID NO:10)、突变体Ase_FAR(如T198突变体或S413突变体，优选T198A突变体或S413A突变体)、Aip_FAR(SEQ IDNO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQ ID NO:75)、Har_FAR(SEQ ID NO:12)及其功能变体的还原酶，以及如本文以上所述的细胞色素b5还原酶如来自棉铃虫的细胞色素b5还原酶(SEQ ID NO:25)或其功能变体。除了Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体之外，酵母细胞还可以表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶，如上所述，例如Cpo_NPVE、Cpo_SPTQ、其突变体或功能变体。酵母细胞还可以表达如本文以上所述的细胞色素b5。
可以将酵母细胞用本文所述的任何修饰进一步修饰，特别是通过以下来修饰：异源细胞色素b5的表达，血红蛋白的表达，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然延伸酶基因的突变，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然硫酯酶基因的突变，编码一种或多种脂肪醛脱氢酶、一种或多种脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或一种或多种脂肪酰基合酶的一个或多个天然基因的突变，异源硫酯酶基因的表达和/或脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白的表达。
血红蛋白的表达
有利于产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地可得蒙及其衍生物的另一种修饰是在酵母细胞中表达血红蛋白，特别是异源血红蛋白。
如实施例，特别是实施例6中所示，血红蛋白在表达去饱和酶的酵母细胞中的表达增加了E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me的产生。
在一些实施方案中，血红蛋白是对于透明颤菌属物种(如粪透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria))天然的血红蛋白。在特定实施方案中，血红蛋白如以下所示：SEQ ID NO:6，或与其具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
为了测试血红蛋白的功能变体是否保留期望的活性，可以进行本领域已知的适当测定，如比色测定。
血红蛋白可以以高水平表达。
血红蛋白可以通过在酵母细胞中引入编码所述血红蛋白或其同源物的核酸来表达。例如，引入SEQ ID NO:5所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ IDNO:5具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达如上所述的去饱和酶和脂肪酰辅酶A还原酶，并进一步表达本文所述的血红蛋白。特别地，酵母细胞可表达一种或多种选自Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)、Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)、突变体Cpo_CPRQ(如S82突变体或S85突变体，优选S85突变体如S85A突变体)及其功能变体的去饱和酶，和一种或多种选自Ase_FAR(SEQ IDNO:10)、突变体Ase_FAR(如T198突变体或S413突变体，优选T198A突变体或S413A突变体)、Aip_FAR(SEQ ID NO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQID NO:75)、Har_FAR(SEQ ID NO:12)及其功能变体的还原酶，以及如本文以上所述的血红蛋白如来自粪透明颤菌的血红蛋白(SEQ ID NO:6)或其功能变体。除了Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体之外，酵母细胞还可以表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶，如上所述，例如Cpo_NPVE、Cpo_SPTQ、其突变体或功能变体。
可以将酵母细胞用本文所述的任何修饰进一步修饰，特别是通过以下来修饰：异源细胞色素b5的表达，细胞色素b5还原酶的表达，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然延伸酶基因的突变，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然硫酯酶基因的突变，编码一种或多种脂肪醛脱氢酶、一种或多种脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或一种或多种脂肪酰基合酶的一个或多个天然基因的突变，异源硫酯酶基因的表达和/或脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白的表达。
一个或多个延伸酶基因的突变
有利于产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地可得蒙及其衍生物的另一种修饰是酵母细胞中某些基因的突变，特别是一个或多个延伸酶基因的突变，其中所述突变导致相应延伸酶活性的部分或全部丧失。延伸酶催化包括脂肪酸的几种分子的碳链延伸。在一些实施方案中，延伸酶是中链酰基延伸酶。如果使用天然包含编码延伸酶的几个基因的酵母细胞，则酵母细胞可被进一步工程化以在一个或多个所述基因中包含突变，导致一种或多种延伸酶的活性部分或全部丧失。
在一些实施方案中，酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞，并且延伸酶由ELO1基因(SEQID NO:13)编码。
在一些实施方案中，突变是导致相应延伸酶活性完全丧失的缺失。在其他实施方案中，例如通过在基因中(例如在编码序列、启动子、Kozak序列、终止子或其他调节元件中)引入一个或多个突变(包括全部或部分缺失、插入、置换或无义或错义突变)而使延伸酶失活。例如，天然启动子或天然终止子可以分别被另一个较弱的启动子或另一个终止子替换。导致活性部分或全部丧失的其他失活方法包括阻抑转录以及转录后失活(如沉默)，例如使用RNAi系统或CRISPR/Cas系统导致相关转录物的降解，从而防止或至少减少翻译；以及翻译后失活(如抑制蛋白质)。如何测试蛋白质是否保留延伸酶活性的例子描述于实施例4或Schneiter等人,2000中。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达如上所述的去饱和酶和脂肪酰辅酶A还原酶，并且还在编码延伸酶的一个或多个基因中包含一个或多个突变，其中所述突变导致部分或全部功能丧失，如本文所述。特别地，酵母细胞可表达一种或多种选自Cpo_CPRQ(SEQID NO:2)、突变体Cpo_CPRQ(如S82突变体或S85突变体，优选S85突变体如S85A突变体)及其功能变体的去饱和酶，和一种或多种选自Ase_FAR(SEQ ID NO:10)、突变体Ase_FAR(如T198突变体或S413突变体，优选T198A突变体或S413A突变体)、Aip_FAR(SEQ ID NO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQ ID NO:75)、Har_FAR(SEQ ID NO:12)及其功能变体的还原酶，并且还可以包含如本文以上所述的导致延伸酶活性部分或全部丧失的突变。除了Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体之外，酵母细胞还可以表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶，如上所述，例如Cpo_NPVE、Cpo_SPTQ、其突变体或功能变体。
可以将酵母细胞用本文所述的任何修饰进一步修饰，特别是通过以下来修饰：异源细胞色素的表达，异源细胞色素b5还原酶的表达，血红蛋白的表达，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然硫酯酶基因的突变，编码一种或多种脂肪醛脱氢酶、一种或多种脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或一种或多种脂肪酰基合酶的一个或多个天然基因的突变，异源硫酯酶基因的表达和/或脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白的表达。
一个或多个硫酯酶基因的突变
有利于产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地可得蒙及其衍生物的另一种修饰是酵母细胞中某些基因的突变，特别是一个或多个硫酯酶基因的突变，其中所述突变导致相应硫酯酶活性的部分或全部丧失。如果使用天然包含编码硫酯酶的几个基因的酵母细胞，则酵母细胞可被进一步工程化以在一个或多个所述基因中包含突变，导致一种或多种硫酯酶的活性部分或全部丧失。
在一些实施方案中，酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞，并且硫酯酶由YAL10_F14729g基因(SEQ ID NO:19)、YALI0_E18876g(SEQ ID NO:54)或YALI0_D03597g(SEQ ID NO:55)编码。因此，在一些实施方案中，解脂耶氏酵母细胞包含导致相应硫酯酶部分或完全丧失的YAL10_F14729g基因(SEQ ID NO:19)的突变，如缺失。在其他实施方案中，解脂耶氏酵母细胞包含导致相应硫酯酶部分或完全丧失的YALI0_E18876g基因(SEQ ID NO:54)的突变，如缺失。在其他实施方案中，解脂耶氏酵母细胞包含导致相应硫酯酶部分或完全丧失的YALI0_D03597g(SEQ ID NO:55)的突变，如缺失。在一些实施方案中，解脂耶氏酵母细胞包含几个硫酯酶基因中的突变。例如，细胞可包含YAL10_F14729g(SEQ ID NO:19)和YALI0_E18876g(SEQ ID NO:54)的突变，如缺失；或YAL10_F14729g(SEQ ID NO:19)和YALI0_D03597g(SEQ ID NO:55)的突变，如缺失；或YALI0_E18876g(SEQ ID NO:54)和YALI0_D03597g(SEQ ID NO:55)的突变，如缺失。在一些实施方案中，细胞包含YAL10_F14729g(SEQID NO:19)、YALI0_E18876g(SEQ ID NO:54)和YALI0_D03597g(SEQ ID NO:55)的突变，如缺失。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达如上所述的去饱和酶和脂肪酰辅酶A还原酶，并且还在编码硫酯酶的一个或多个基因中包含一个或多个突变，其中所述突变导致部分或全部功能丧失，如本文所述。特别地，酵母细胞可表达一种或多种选自Cpo_CPRQ(SEQID NO:2)、Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)、突变体Cpo_CPRQ(如S82突变体或S85突变体，优选S85突变体如S85A突变体)及其功能变体的去饱和酶，和一种或多种选自Ase_FAR(SEQ ID NO:10)、突变体Ase_FAR(如T198突变体或S413突变体，优选T198A突变体或S413A突变体)、Aip_FAR(SEQ ID NO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQ IDNO:75)、Har_FAR(SEQ ID NO:12)及其功能变体的还原酶，以及编码硫酯酶的一个或多个基因中的一个或多个突变，其中所述突变导致如本文以上所述的部分或全部功能丧失，如YAL10_F14729g(SEQ ID NO:19)、YALI0_E18876g(SEQ ID NO:54)和YALI0_D03597g(SEQ IDNO:55)中的一个或多个中的突变。除了Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体之外，酵母细胞还可以表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶，如上所述，例如Cpo_NPVE、Cpo_SPTQ、其突变体或功能变体。
可以将酵母细胞用本文所述的任何修饰进一步修饰，特别是通过以下来修饰：异源细胞色素b5的表达，异源细胞色素b5还原酶的表达，血红蛋白的表达，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然延伸酶基因的突变，编码一种或多种脂肪醛脱氢酶、一种或多种脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或一种或多种脂肪酰基合酶的一个或多个天然基因的突变，异源硫酯酶基因的表达和/或脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白的表达。
另外的修饰
酵母细胞还可包含其他修饰，如导致参与脂肪酸代谢的酶活性降低的至少一个突变。在一些实施方案中，修饰一种或多种天然脂肪醛脱氢酶、一种或多种脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或一种或多种脂肪酰基合酶的活性，优选降低或消除活性。例如，酵母细胞还可以包含在编码脂肪醛脱氢酶、脂肪醇氧化酶和/或过氧化物酶体生物发生因子的基因中的一个或多个突变。可以例如通过在基因中(例如在编码序列、启动子、Kozak序列、终止子或其他调节元件中)引入一个或多个突变(包括全部或部分缺失、插入、置换或无义或错义突变)来使这些酶中的任一种失活。例如，天然启动子或天然终止子可以分别被另一个较弱的启动子或另一个终止子替换。导致活性部分或全部丧失的其他失活方法包括阻抑转录以及转录后失活(如沉默)，例如使用RNAi系统或CRISPR/Cas系统导致相关转录物的降解，从而防止或至少减少翻译；以及翻译后失活(如抑制蛋白质)。可以使用本领域已知的方法以其他方式修饰酶活性，例如以修饰酶的特性(如胞内定位)或增加活性。
在一些实施方案中，酵母细胞是如本文以上所述的解脂耶氏酵母细胞，其还包含如HFD1、HFD2、HFD3、HFD4、FAO1、GPAT和PEX10中的至少一个中的突变的修饰，或如导致与其具有至少60％同源性或同一性，如至少65％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少75％同源性或同一性、如至少80％同源性或同一性、如至少81％同源性或同一性、如至少82％同源性或同一性、如至少83％同源性或同一性、如至少84％同源性或同一性、如至少85％同源性或同一性、如至少86％同源性或同一性、如至少87％同源性或同一性、如至少88％同源性或同一性、如至少89％同源性或同一性、如至少90％同源性或同一性、如至少91％同源性或同一性、如至少92％同源性或同一性、如至少93％同源性或同一性、如至少94％同源性或同一性、如至少95％同源性或同一性、如至少96％同源性或同一性、如至少97％同源性或同一性、如至少98％同源性或同一性、如至少99％同源性或同一性的至少一种蛋白质的活性降低的突变的修饰。
在解脂耶氏酵母中，脂肪醛脱氢酶Hfd1由HFD1(YALI0_F23793g)编码。它催化脂肪醛氧化成脂肪酸。如申请WO 2018/109163中详细描述的，Hfd1活性的降低导致酵母细胞中去饱和脂肪醇的滴度增加。因此，根据本公开文本的解脂耶氏酵母细胞还可以包含HFD1的突变，如缺失，导致Hfd1活性的部分或全部丧失。Hfd1活性的降低可通过本文所述的其他方法实现。
脂肪醛脱氢酶Hfd2由HFD2(YALI_0E15400g)编码。它催化脂肪醛氧化成脂肪酸。因此，根据本公开文本的解脂耶氏酵母细胞还可以包含HFD2的突变，如缺失，导致Hfd2活性的部分或全部丧失。Hfd2活性的降低可通过本文所述的其他方法实现。
脂肪醛脱氢酶Hfd3由HFD3(YALI0_A17875g)编码。它催化脂肪醛氧化成脂肪酸。因此，根据本公开文本的解脂耶氏酵母细胞还可以包含HFD3的突变，如缺失，导致Hfd3活性的部分或全部丧失。Hfd3活性的降低可通过本文所述的其他方法实现。
在解脂耶氏酵母中，脂肪醛脱氢酶Hfd4由HFD4(YALI0_B01298g)编码。它催化脂肪醛氧化成脂肪酸。如申请WO 2018/109163中详细描述的，Hfd4活性的降低导致酵母细胞中去饱和脂肪醇的滴度增加。因此，根据本公开文本的解脂耶氏酵母细胞还可以包含HFD4的突变，如缺失，导致Hfd4活性的部分或全部丧失。Hfd4活性的降低可通过本文所述的其他方法实现。
在一些实施方案中，酵母细胞还包含修饰，例如突变，如缺失，导致与Hfd1、Hfd2、Hfd3或Hfd4具有至少60％同源性或同一性，与Hfd1、Hfd2、Hfd3或Hfd4具有如至少65％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少75％同源性或同一性、如至少80％同源性或同一性、如至少81％同源性或同一性、如至少82％同源性或同一性、如至少83％同源性或同一性、如至少84％同源性或同一性、如至少85％同源性或同一性、如至少86％同源性或同一性、如至少87％同源性或同一性、如至少88％同源性或同一性、如至少89％同源性或同一性、如至少90％同源性或同一性、如至少91％同源性或同一性、如至少92％同源性或同一性、如至少93％同源性或同一性、如至少94％同源性或同一性、如至少95％同源性或同一性、如至少96％同源性或同一性、如至少97％同源性或同一性、如至少98％同源性或同一性、如至少99％同源性或同一性的脂肪醛脱氢酶的活性部分或全部丧失。
在解脂耶氏酵母中，脂肪醇氧化酶Fao1由FAO1(YALI0B14014g)编码。其缺失导致ω-羟基脂肪酸的积累增加。如申请WO 2018/109163中详细描述的，Fao1活性的降低导致酵母细胞中去饱和脂肪醇的滴度增加。因此，根据本公开文本的解脂耶氏酵母细胞还可以包含FAO1的突变，如缺失，导致Hfd1活性的部分或全部丧失。Fao1活性的降低可通过本文所述的其他方法实现。
在一些实施方案中，酵母细胞还包含突变，如缺失，导致与Fao1具有至少60％同源性或同一性，与Fao1具有如至少65％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少75％同源性或同一性、如至少80％同源性或同一性、如至少81％同源性或同一性、如至少82％同源性或同一性、如至少83％同源性或同一性、如至少84％同源性或同一性、如至少85％同源性或同一性、如至少86％同源性或同一性、如至少87％同源性或同一性、如至少88％同源性或同一性、如至少89％同源性或同一性、如至少90％同源性或同一性、如至少91％同源性或同一性、如至少92％同源性或同一性、如至少93％同源性或同一性、如至少94％同源性或同一性、如至少95％同源性或同一性、如至少96％同源性或同一性、如至少97％同源性或同一性、如至少98％同源性或同一性、如至少99％同源性或同一性的脂肪醇氧化酶的活性部分或全部丧失。
在解脂耶氏酵母中，过氧化物酶体生物发生因子10Pex10由PEX10(YALI0C01023g)编码。如申请WO 2018/109163中详细描述的，Pex10活性的降低导致酵母细胞中去饱和脂肪醇的滴度增加。因此，根据本公开文本的解脂耶氏酵母细胞还可以包含PEX10的突变，如缺失，导致Pex10活性的部分或全部丧失。Pex10活性的降低可通过本文所述的其他方法实现。
在一些实施方案中，酵母细胞还包含突变，如缺失，导致与Pex10具有至少60％同源性或同一性，与Pex10具有如至少65％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少75％同源性或同一性、如至少80％同源性或同一性、如至少81％同源性或同一性、如至少82％同源性或同一性、如至少83％同源性或同一性、如至少84％同源性或同一性、如至少85％同源性或同一性、如至少86％同源性或同一性、如至少87％同源性或同一性、如至少88％同源性或同一性、如至少89％同源性或同一性、如至少90％同源性或同一性、如至少91％同源性或同一性、如至少92％同源性或同一性、如至少93％同源性或同一性、如至少94％同源性或同一性、如至少95％同源性或同一性、如至少96％同源性或同一性、如至少97％同源性或同一性、如至少98％同源性或同一性、如至少99％同源性或同一性的过氧化物酶体生物发生因子的活性部分或全部丧失。
在解脂耶氏酵母中，甘油-3-磷酸酰基转移酶由GPAT(YALI0_C00209g)编码。GPAT催化朝向甘油脂生物合成的第一反应。所述基因在解脂耶氏酵母中是必需的。如申请WO2018/109163中详细描述的，GPAT活性的降低导致酵母细胞中去饱和脂肪醇的滴度增加。因此，根据本公开文本的解脂耶氏酵母细胞还可以包含GPAT的突变，导致GPAT活性的部分或全部丧失。GPAT活性的降低可通过本文所述的其他方法实现。
在一些实施方案中，酵母细胞还包含突变，导致与GPAT具有至少60％同源性或同一性，与GPAT具有如至少65％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少75％同源性或同一性、如至少80％同源性或同一性、如至少81％同源性或同一性、如至少82％同源性或同一性、如至少83％同源性或同一性、如至少84％同源性或同一性、如至少85％同源性或同一性、如至少86％同源性或同一性、如至少87％同源性或同一性、如至少88％同源性或同一性、如至少89％同源性或同一性、如至少90％同源性或同一性、如至少91％同源性或同一性、如至少92％同源性或同一性、如至少93％同源性或同一性、如至少94％同源性或同一性、如至少95％同源性或同一性、如至少96％同源性或同一性、如至少97％同源性或同一性、如至少98％同源性或同一性、如至少99％同源性或同一性的甘油-3-磷酸酰基转移酶的活性部分或全部丧失。
任何上述酶活性的部分或全部丧失也可以例如通过在基因中(例如在编码序列、启动子、Kozak序列、终止子或其他调节元件中)引入一个或多个突变(包括全部或部分缺失、插入、置换或无义或错义突变)来实现。例如，天然启动子或天然终止子可以分别被另一个较弱的启动子或另一个终止子替换。导致活性部分或全部丧失的其他失活方法包括阻抑转录以及转录后失活(如沉默)，例如使用RNAi系统或CRISPR/Cas系统导致相关转录物的降解，从而防止或至少减少翻译；以及翻译后失活(如抑制蛋白质)。为了确定修饰(如突变或本文以上所述的任何修饰)是否导致活性的全部或部分丧失，可使用本领域已知的方法，如上文详述的方法。例如，在导致转录降低的缺失或修饰的情况下，可以使用扩增方法如PCR来证实相关序列的不存在。蛋白质表达可以使用适当的测定(如蛋白质印迹)或使用标记物如荧光标记物测量表达水平来研究。
酵母细胞表达一种或多种修饰的脂肪酰基合酶也可以是有利的。这可以有助于将代谢流引导向产生去饱和产物，如E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和去饱和脂肪醇及其衍生物，如可得蒙及其衍生物。因此，在一些实施方案中，酵母细胞被进一步修饰以表达具有修饰的酮合酶结构域的脂肪酰基合酶。在一些实施方案中，酵母细胞是如本文所述的解脂耶氏酵母细胞，其中细胞还表达经修饰的脂肪酸合酶复合物。在一个实施方案中，通过使编码复合物的α亚基的基因突变来修饰脂肪酸合酶复合物。在一些实施方案中，突变在编码FAS2的基因(SEQ ID NO:18)中。在其他实施方案中，突变在编码FAS1的基因(SEQ ID NO:16)中。突变可导致SEQ ID NO:16的残基123(L123)中的一个或多个的修饰。突变可以导致SEQ IDNO:18的残基1220(I1220)、残基1217(M1217)或残基1226(M1226)中的一个或多个的修饰，产生变体FAS2。技术人员将知道如何设计此类突变。
优选地，FAS2中的突变产生Fas2的I1220F变体、I1220W变体、I1220Y变体或I1220H变体。在具体实施方案中，突变产生I1220F变体。在一些实施方案中，突变产生M1217F变体、M1217W变体、M1217Y变体或M1217H变体。在其他实施方案中，突变产生M1226F变体、M1226W变体、M1226Y变体或M1226H变体。
优选地，FAS1中的突变产生L123V变体。
还考虑了具有多于一个上述突变的酵母细胞，如FAS2的残基I1220、M1217或M1226处的两个突变或三个突变，和/或FAS1的残基123处的一个突变。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达如上所述的去饱和酶和脂肪酰辅酶A还原酶，并且还包含如本章节中所述的一个或多个修饰。特别地，酵母细胞可表达一种或多种选自Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)、Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)、突变体Cpo_CPRQ(如S82突变体或S85突变体，优选S85突变体如S85A突变体)及其功能变体的去饱和酶，和一种或多种选自Ase_FAR(SEQ ID NO:10)、突变体Ase_FAR(如T198突变体或S413突变体，优选T198A突变体或S413A突变体)、Aip_FAR(SEQ ID NO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQ ID NO:75)、Har_FAR(SEQ ID NO:12)及其功能变体的还原酶，以及一个或多个修饰，如导致如上所述的Hfd1、Hfd2、Hfd3、Hfd4、Fao1和Pex10中的一种或多种的功能部分或全部丧失的突变，和/或还表达一种或多种如上所述的经修饰的脂肪酰基合酶。除了Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体之外，酵母细胞还可以表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶，如上所述，例如Cpo_NPVE、Cpo_SPTQ、其突变体或功能变体。
可以将酵母细胞用本文所述的任何修饰进一步修饰，特别是通过以下来修饰：异源细胞色素b5的表达，异源细胞色素b5还原酶的表达，血红蛋白的表达，导致活性完全或部分丧失的一种或多种天然延伸酶的失活，导致活性完全或部分丧失的一种或多种天然硫酯酶的失活，异源硫酯酶基因的表达和/或脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白的表达。
特别地，酵母细胞可表达一种或多种选自Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)、Gmo_CPRQ(SEQID NO:77)、突变体Cpo_CPRQ(如S82突变体或S85突变体，优选S85突变体如S85A突变体)及其功能变体的去饱和酶，和一种或多种选自Ase_FAR(SEQ ID NO:10)、突变体Ase_FAR(如T198突变体或S413突变体，优选T198A突变体或S413A突变体)、Aip_FAR(SEQ ID NO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQ ID NO:75)、Har_FAR(SEQID NO:12)及其功能变体的还原酶，并且还可包含以下中的突变：HFD1和HFD2；HFD1和HFD3；HFD1和HFD4；HFD1和FAO1；HFD1和PEX10；HFD2和HFD3；HFD2和HFD4；HFD2和FAO1；HFD2和PEX10；HFD3和HFD4；HFD3和FAO1；HFD3和PEX10；HFD4和FAO1；HFD4和PEX10；FAO1和PEX10；HFD1、HFD2和HFD3；HFD1、HFD2和HFD4；HFD1、HFD2和FAO1；HFD1、HFD2和PEX10；HFD1、HFD3和HFD4；HFD1、HFD3和FAO1；HFD1、HFD3和PEX10；HFD1、HFD4和FAO1；HFD1、HFD4和PEX10；HFD1、FAO1和PEX10；HFD2、HFD3和HFD4；HFD2、HFD3和FAO1；HFD2、HFD3和PEX10；HFD2、HFD4和FAO1；HFD2、HFD4和PEX10；HFD2、FAO1和PEX10；HFD3、HFD4和FAO1；HFD3、HFD4和PEX10；HFD3、FAO1和PEX10；HFD4、FAO1和PEX10；HFD1、HFD2、HFD3和HFD4；HFD1、HFD2、HFD3和FAO1；HFD1、HFD2、HFD3和PEX10；HFD1、HFD2、HFD4和FAO1；HFD1、HFD2、HFD4和PEX10；HFD1、HFD2、FAO1和PEX10；HFD1、HFD3、HFD4和FAO1；HFD1、HFD3、HFD4和PEX10；HFD1、HFD3、FAO1和PEX10；HFD1、HFD4、FAO1和PEX10；HFD2、HFD3、HFD4和FAO1；HFD2、HFD3、HFD4和PEX10；HFD2、HFD3、FAO1和PEX10；HFD2、HFD4、FAO1和PEX10；HFD3、HFD4、FAO1和PEX10；HFD1、HFD2、HFD3、HFD4和FAO1；HFD1、HFD2、HFD3、HFD4和PEX10；HFD1、HFD3、HFD4、FAO1和PEX10；HFD2、HFD3、HFD4、FAO1和PEX10；HFD1、HFD2、HFD3、HFD4、FAO1和PEX10，或与其具有至少60％同源性或同一性的相应变体的上述组合。此外，酵母细胞还可表达如上所述的经修饰的脂肪酰基合酶，特别是突变体Fas1和/或突变体Fas2。除了Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体之外，酵母细胞还可以表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶，如上所述，例如Cpo_NPVE、Cpo_SPTQ、其突变体或功能变体。
异源硫酯酶的表达
通过引入硫酯酶，特别是异源硫酯酶进一步工程化酵母细胞可以是有利的。因此，在一些实施方案中，将编码硫酯酶的核酸引入酵母细胞中，例如在载体上或通过基因组整合。硫酯酶基因可以处于诱导型启动子的控制下，或者处于组成型启动子的控制下。可以针对酵母细胞对编码硫酯酶的核酸进行密码子优化，如本领域所已知的。特别地，可以针对耶氏酵母属(Yarrowia)细胞(如解脂耶氏酵母细胞)对核酸进行密码子优化。如本领域已知的，硫酯酶可以以高水平表达。
在一些实施方案中，硫酯酶衍生自选自湿地萼距花(Cuphea palustris)、萼距花(Cuphea hookeriana)、香樟(Cinnamomum camphora)或选自大肠杆菌(Escherichia coli)的生物。在优选的实施方案中，硫酯酶衍生自大肠杆菌或香樟。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性或同一性：如SEQ ID NO:33中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:57中所示的衍生自萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:35中所示的衍生自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:26中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:35中所示的衍生自香樟的硫酯酶或如SEQ ID NO:26中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性或同一性。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:35中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性或同一性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:26中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性或同一性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:35中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性或同一性，与如SEQ ID NO:35中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性或同一性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:26中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性或同一性，与如SEQ ID NO:26中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性或同一性。
可以对编码硫酯酶的核酸进行密码子优化，如本领域所已知的。在一个实施方案中，酵母细胞是耶氏酵母属细胞，优选地解脂耶氏酵母细胞，并且相应地对核酸进行密码子优化。
在一个实施方案中，至少一种硫酯酶由如下核酸编码，所述核酸与如SEQ ID NO:34中所示的编码衍生自香樟的硫酯酶的核酸具有至少60％同源性或同一性，与如SEQ IDNO:34中所示的编码衍生自香樟的硫酯酶的核酸具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性或同一性。
在一个实施方案中，至少一种硫酯酶由如下核酸编码，所述核酸与如SEQ ID NO:25中所示的编码衍生自大肠杆菌的硫酯酶的核酸具有至少60％同源性或同一性，与如SEQID NO:25中所示的编码衍生自大肠杆菌的硫酯酶的核酸具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性或同一性。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达如上所述的去饱和酶和脂肪酰辅酶A还原酶，并且还表达一种或多种硫酯酶，如一种或多种异源硫酯酶，如本文所述。特别地，酵母细胞可表达一种或多种选自Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)、Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)、突变体Cpo_CPRQ(如S82突变体或S85突变体，优选S85突变体如S85A突变体)及其功能变体的去饱和酶，和一种或多种选自Ase_FAR(SEQ ID NO:10)、突变体Ase_FAR(如T198突变体或S413突变体，优选T198A突变体或S413A突变体)、Aip_FAR(SEQ ID NO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQ ID NO:75)、Har_FAR(SEQ ID NO:4)及其功能变体的还原酶，以及一种或多种异源硫酯酶如SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:35和/或SEQID NO:26中所示的硫酯酶或其功能变体。除了Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体之外，酵母细胞还可以表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶，如上所述，例如Cpo_NPVE、Cpo_SPTQ、其突变体或功能变体。
可以将酵母细胞用本文所述的任何修饰进一步修饰，特别是通过以下来修饰：异源细胞色素b5、异源细胞色素b5还原酶的表达，血红蛋白的表达，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然延伸酶基因的突变，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然硫酯酶基因的突变，编码一种或多种脂肪醛脱氢酶、一种或多种脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或一种或多种脂肪酰基合酶的一个或多个天然基因的突变，和/或脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白的表达，如本文以上所述。
脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白的表达
在一些实施方案中，酵母细胞还表达截短的脂肪酰基合酶和截短的硫酯酶的融合蛋白，如SEQ ID NO:59中所示的融合蛋白或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。该融合蛋白是来自解脂耶氏酵母的截短形式的Fas1和来自大肠杆菌的截短形式的硫酯酶TesA的融合物。它可以通过引入如SEQ ID NO:58中所示的核酸来表达。融合蛋白可以以高水平表达。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞还表达如SEQ ID NO:59中所示的融合蛋白或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:59具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在一些实施方案中，酵母细胞包含编码所述融合蛋白的核酸，如SEQ ID NO:58中所示的核酸或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:58具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达如上所述的去饱和酶和脂肪酰辅酶A还原酶，并还表达截短的脂肪酰基合酶和截短的硫酯酶的融合蛋白，如SEQ ID NO:59中所示的融合蛋白。特别地，酵母细胞可表达一种或多种选自Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)、突变体Cpo_CPRQ(如S82突变体或S85突变体，优选S85突变体如S85A突变体)及其功能变体的去饱和酶，和一种或多种选自Ase_FAR(SEQ ID NO:10)、突变体Ase_FAR(如T198突变体或S413突变体，优选T198A突变体或S413A突变体)、Aip_FAR(SEQ ID NO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQ ID NO:75)、Har_FAR(SEQ ID NO:12)及其功能变体的还原酶，以及截短的脂肪酰基合酶和截短的硫酯酶的融合蛋白如SEQ ID NO:59中所示的融合蛋白或其功能变体。除了Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ、其突变体或功能变体之外，酵母细胞还可以表达能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的另一种去饱和酶，如上所述，例如Cpo_NPVE、Cpo_SPTQ、其突变体或功能变体。
可以将酵母细胞用本文所述的任何修饰进一步修饰，特别是通过以下来修饰：异源细胞色素b5的表达，异源细胞色素b5还原酶的表达，血红蛋白的表达，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然延伸酶基因的突变，导致活性完全或部分丧失的一个或多个天然硫酯酶基因的突变，编码一种或多种脂肪醛脱氢酶、一种或多种脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或一种或多种脂肪酰基合酶的一个或多个天然基因的突变，和/或异源硫酯酶基因的表达，如本文以上所述。
滴度
本文公开的酵母细胞能够产生滴度为至少0.2mg/L的E8,E10-十二碳二烯-1-醇。在一些实施方案中，E8,E10-十二碳二烯-1-醇的滴度为至少0.25mg/L，如至少0.3mg/L、如至少0.4mg/L、如至少0.5mg/L、如至少0.75mg/L、如至少1mg/L、如至少1.5mg/L、如至少2.5mg/L、如至少5.0mg/L、如至少10mg/L、如至少15mg/L、如至少20mg/L、如25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L或更多。
测定滴度的方法是本领域已知的。
E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的产生
可将可得蒙进一步转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯；如本领域已知的，这可以离体进行，例如通过化学转化，或者它可以通过乙酰基转移酶(EC 2.3.1.84)的作用在体内进行，所述乙酰基转移酶能够将细胞产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇的至少一部分转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。
在一些实施方案中，酵母细胞因此被工程化以使其过表达天然乙酰基转移酶和/或使其表达异源乙酰基转移酶(任选地以高水平表达)。在这样的实施方案中，酵母细胞能够产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇和E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。
在一些实施方案中，酵母细胞表达能够将细胞产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇的至少一部分转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的乙酰基转移酶，如Sc_Atf1乙酰基转移酶(SEQ ID NO:37)或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:37具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
乙酰基转移酶的表达可以通过引入核酸来实现，所述核酸可以经密码子优化以用于在酵母细胞中表达，如SEQ ID NO:36中所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:36具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达如本文以上所述的异源去饱和酶、如本文以上所述的异源脂肪酰基还原酶、和任选地任何上文所述的其他修饰，并且还表达能够将至少部分产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的乙酰基转移酶。
因此，本文公开的酵母细胞能够产生滴度为至少0.2mg/L的E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。在一些实施方案中，E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的滴度为至少0.25mg/L，如至少0.3mg/L、如至少0.4mg/L、如至少0.5mg/L、如至少0.75mg/L、如至少1mg/L、如至少1.5mg/L、如至少2.5mg/L、如至少5.0mg/L、如至少10mg/L、如至少15mg/L、如至少20mg/L、如25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L或更多。
测定滴度的方法是本领域已知的。
E8,E10-十二碳二烯醛的产生
还可能感兴趣的是将细胞产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇的至少一部分进一步转化为E8,E10-十二碳二烯醛。这可以通过化学转化或通过进一步工程化酵母细胞来进行。
在一些实施方案中，酵母细胞可以被进一步工程化以使其能够将至少部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛。这可以通过工程化酵母细胞使得其进一步表达能够将至少部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的成醛脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)和/或脂肪醇氧化酶(EC1.1.3.20)来进行。在这样的实施方案中，酵母细胞能够产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇和E8,E10-十二碳二烯醛。
因此，可以将编码能够将至少部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的成醛脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)和/或脂肪醇氧化酶(EC 1.1.3.20)的核酸引入酵母细胞中。核酸可以经密码子优化并且可以以高水平表达。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞表达如本文以上所述的异源去饱和酶、如本文以上所述的异源脂肪酰基还原酶、和任选地任何上文所述的其他修饰，并且还表达能够将至少部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的成醛脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)和/或脂肪醇氧化酶(EC 1.1.3.20)。
因此，本文公开的酵母细胞能够产生滴度为至少0.2mg/L的E8,E10-十二碳二烯醛。在一些实施方案中，E8,E10-十二碳二烯醛的滴度为至少0.25mg/L，如至少0.3mg/L、如至少0.4mg/L、如至少0.5mg/L、如至少0.75mg/L、如至少1mg/L、如至少1.5mg/L、如至少2.5mg/L、如至少5.0mg/L、如至少10mg/L、如至少15mg/L、如至少20mg/L、如25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L或更多。
测定滴度的方法是本领域已知的。
链缩短
在一些实施方案中，进一步修饰酵母细胞以通过链缩短增加给定链长的脂肪酰辅酶A的可用性。不受理论的束缚，预期这样的修饰增加具有所需碳链长度、特别是具有12的碳链长度的底物的可用性，由此可以增加E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇、和任选地E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和E8,E10-十二碳二烯醛的产生。这可以通过降低微生物产生细胞中天然酰基辅酶A氧化酶的活性和通过表达特定的酰基辅酶A氧化酶、去饱和酶、还原酶和乙酰基转移酶来实现。在EP 19157910.1(由同一申请人于2019年2月19日提交)中详细描述了此类修饰。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞是本文以上所述的任何酵母细胞，并且还：
i)具有导致一种或多种天然酰基辅酶A氧化酶活性降低的一个或多个突变；以及
ii)表达包含至少一种能够氧化脂肪酰辅酶A的酰基辅酶A氧化酶的至少一组酶，其中该组酶能够将第一碳链长度X的脂肪酰辅酶A缩短为具有第二碳链长度X'的缩短的脂肪酰辅酶A，其中X'≤X-2。
在这样的实施方案中，通常存在于酵母细胞中的酰基辅酶A氧化酶(即一种或多种天然酶)的活性通过使细胞中编码所述一种或多种酶的基因发生突变来降低或消除。为了引导碳链缩短以获得期望碳链长度的脂肪醇及其衍生物，在酵母细胞中表达一种或多种酰基辅酶A氧化酶。这些酰基辅酶A氧化酶对于酵母细胞可以是天然的，或者它们可以衍生自另一种生物体。如果细胞已经不表达它们，或者如果需要增加的活性或底物特异性，也可以将编码氧化给定链长的脂肪酰辅酶A所需的其他酶的基因引入细胞中。由此表达的一种或多种酰基辅酶A氧化酶允许脂肪酰辅酶A被氧化并缩短为具有比底物更短的碳链长度的脂肪酰辅酶A。因此，在一些实施方案中，一种或多种天然酰基辅酶A氧化酶的活性降低是对碳链长度小于X，如小于X'的酰基辅酶A的活性降低。
本公开文本中的术语酰基辅酶A氧化酶是指能够催化以下反应的酶，如EC编号1.3.3.6的酶：
Figure BDA0003797945770000301
该酶属于氧化还原酶家族，具体是以氧作为受体作用于供体的CH-CH基团的那些。该酶类的系统名称是酰基辅酶A:氧2-氧化还原酶。使用的其他名称包括脂肪酰辅酶A氧化酶、酰基辅酶A氧化酶和脂肪酰辅酶A氧化酶。
本公开文本的酵母细胞可以从具有一种或多种天然酰基辅酶A氧化酶的酵母细胞开始工程化。本文公开的修饰的酵母细胞优选具有降低的所述一种或多种天然酰基辅酶A氧化酶的活性；这可以通过使用具有一个或多个突变的酵母细胞来实现，所述突变导致其至少一种天然酰基辅酶A氧化酶的活性降低。天然酰基辅酶A氧化酶可以是过氧化物酶体的、线粒体的或胞质的。在一些实施方案中，所述一个或多个突变导致所有天然酰基辅酶A氧化酶的活性降低。对于降低的活性，应当理解酵母细胞由于所述突变而具有降低的催化上述反应，特别是将酰基辅酶A转化为相应的反式-2,3-脱氢酰基辅酶A的能力。在一些实施方案中，“降低的能力”是指完全或部分消除催化所述反应的能力。在一些实施方案中，“降低的能力”是指催化反应的能力限于在正常情况下(即通过使用具有正常能力的酶)可用于反应的底物亚组。
本公开文本的酵母细胞可以表达至少一组酶，所述酶包含至少一种能够氧化脂肪酰辅酶A的酰基辅酶A氧化酶。除了至少一种酰基辅酶A氧化酶之外，该组酶还包含将给定碳链长度的脂肪酰辅酶A转化为较短碳链长度的脂肪酰辅酶A所需的其他酶。这些其他酶可以优选是对于酵母细胞天然的；在这样的实施方案中，酵母细胞表达该组酶仅需要引入编码酰基辅酶A氧化酶的基因。
在酰基辅酶A氧化酶对于酵母细胞是天然的实施方案中，所述酰基辅酶A氧化酶可以如本领域已知的那样被修饰，例如通过引入启动子如组成型或诱导型启动子，或实现过表达酰基辅酶A氧化酶的启动子。重新引入第一组酶中的天然酰基辅酶A氧化酶可以是具有修饰的活性(如修饰的底物特异性)和/或修饰的活性(如增加的反应效率)的突变形式。
在其他实施方案中，酰基辅酶A氧化酶衍生自另一种生物体。第一组酶中包含的酰基辅酶A可以是衍生自酵母、真菌、昆虫、哺乳动物、鸟类或植物的酰基辅酶A氧化酶，如第一组酶中的至少一种酰基辅酶A氧化酶衍生自酵母、真菌、昆虫、哺乳动物、鸟类或植物。例如，酰基辅酶A氧化酶衍生自选自耶氏酵母属、酵母属、地夜蛾属、拟南芥属、曲霉属、南瓜属、人属、类节杆菌属和大鼠属的属的生物体，如第一组酶的至少一种酰基辅酶A氧化酶衍生自选自耶氏酵母属、酵母属、地夜蛾属、拟南芥属、曲霉属、南瓜属、人属、类节杆菌属和大鼠属的属的生物体。在一些实施方案中，所述至少一种第一组酶包含衍生自解脂耶氏酵母、酿酒酵母、黃地老虎、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、笋瓜(Cucurbita maxima)、智人(Homo sapiens)、产脲类节杆菌(Paenarthrobacterureafaciens)或褐家鼠(Rattus norvegicus)的酰基辅酶A氧化酶。
由此引入酵母细胞中的酰基辅酶A氧化酶可以是对于解脂耶氏酵母、黃地老虎、拟南芥、构巢曲霉、笋瓜、智人、产脲类节杆菌或褐家鼠天然的酰基辅酶A氧化酶。酵母细胞可以如本文以上所述。
因此，本公开文本的酵母细胞可以表达包含至少一种能够氧化脂肪酰辅酶A的酰基辅酶A氧化酶的至少一组酶，其中所述至少一种酰基辅酶A氧化酶选自Yli_POX1(XP_504703)、Yli_POX2(XP_505264)、Yli_POX3(XP_503244)、Yli_POX4(XP_504475)、Yli_POX5(XP_502199)、Yli_POX6(XP_503632)、Ase_POX(SEQ ID NO:39)、Ath_POX1(SEQ ID NO:41)、Ath_POX2(SEQ ID NO:43)、Ani_POX(SEQ ID NO:45)、Cma_POX(SEQ ID NO:47)、Hsa_POX1-2(SEQ ID NO:49)、Pur_POX(SEQ ID NO:51)、Sc_POX1(SEQ ID NO:31)和Rno_POX2(SEQ IDNO:53)，或与其具有至少60％同源性或同一性，如至少65％、如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
在一些实施方案中，至少一种酰基辅酶A氧化酶的表达通过引入编码所述至少一种酰基辅酶A氧化酶的核酸来实现。例如，酵母表达编码Yli_POX1的YALI0_E32835g、编码Yli_POX2的YALI0_F10857g、编码Yli_POX3的YALI0_D24750g、编码Yli_POX4的YALI0_E27654g、编码Yli_POX5的YALI0_C23859g、编码Yli_POX6的YALI0_E06567g、编码Ase_POX的SEQ ID NO:38、编码Ath_POX1的SEQ ID NO:40、编码Ath_POX2的SEQ ID NO:42、编码Ani_POX的SEQ ID NO:44、编码Cma_POX的SEQ ID NO:46、编码Hsa_POX的SEQ ID NO:48、编码Pur_POX的SEQ ID NO:50、编码Sc_POX1的SEQ ID NO:30或编码Rno_POX2的SEQ ID NO:52，或与其具有至少60％同源性或同一性，如至少65％、如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在一些实施方案中，X'＝12。
合适的酰基辅酶A氧化酶详细描述于WO 2020/169389(同一申请人于2020年2月10日提交)中，特别是在“酰基辅酶A氧化酶”章节中。
为了获得E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地可得蒙，在利用链缩短的实施方案中，酵母细胞因此除了表达至少一组酶之外，还可以表达能够在具有碳链长度X或X'的脂肪酰辅酶A中引入E/Z构象的至少一个双键的另外的异源去饱和酶。X或X'可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个碳原子。在一些实施方案中，去饱和酶能够在具有X'链长的脂肪酰辅酶A中引入E/Z构象的至少一个双键，其中X'如上所定义。合适的去饱和酶详细描述于WO 2020/169389(同一申请人于2020年2月10日提交)中，特别是在“去饱和酶(FAD)”章节中。特别地，能够将C14:CoA转化为Z11-C14:CoA和/或E11-C14:CoA的去饱和酶是令人感兴趣的。例如，可以使用来自蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana)的去饱和酶CroZ11(SEQ ID NO:63)或来自平行色卷蛾(Choristoneura parallela)的CpaE11(SEQID NO:65)或与其具有至少60％同源性或同一性，如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。所得Z11-C14:CoA和/或E11-C14:CoA然后可以进一步发生链缩短以得到Z9-C12:CoA和/或E9-C12:CoA，其随后通过Cpo_CPRQ进一步去饱和以得到E8,E10-C12:CoA。
在这样的实施方案中，酵母细胞因此表达至少一种如本文上述“去饱和酶”章节中所述的去饱和酶，例如Cpo_CPRQ或Gmo_CPRQ(优选Cpo_CPRQ)、其突变体或功能变体，并且还表达能够在具有碳链长度X或X'的脂肪酰辅酶A中引入E/Z构象的至少一个双键的另外的异源去饱和酶，其中X和X'如上所述。特别地，去饱和酶能够在碳链长度为14的脂肪酰辅酶A中引入E/Z构象的至少一个双键，然后可以如本文以上所述缩短为碳链长度为12的脂肪酰辅酶A-然后其可以进一步去饱和为E8,E10-C12:CoA，然后可通过如本文以上详述的FAR的作用转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
E8,E10-十二碳二烯基辅酶A、E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的产生方法
本文以上所述的酵母细胞可用于产生以下的方法中：E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇，其可进一步转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。
E8,E10-十二碳二烯-1-醇的产生方法
本文提供了一种用于在酵母细胞中产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇的方法，所述方法包括提供酵母细胞和在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞表达：
i)至少一种异源去饱和酶，其能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)任选地至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇，
从而产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
酵母细胞可以是本文以上所述的任何酵母细胞。
本发明的方法优选地允许产生滴度为至少0.2mg/L的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A。在一些实施方案中，E8,E10-十二碳二烯-1-醇的滴度为至少0.25mg/L，如至少0.3mg/L、如至少0.4mg/L、如至少0.5mg/L、如至少0.75mg/L、如至少1mg/L、如至少1.5mg/L、如至少2.5mg/L、如至少5.0mg/L、如至少10mg/L、如至少15mg/L、如至少20mg/L、如25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L或更多。
本发明的方法允许产生滴度为至少0.2mg/L的E8,E10-十二碳二烯-1-醇。在一些实施方案中，E8,E10-十二碳二烯-1-醇的滴度为至少0.25mg/L，如至少0.3mg/L、如至少0.4mg/L、如至少0.5mg/L、如至少0.75mg/L、如至少1mg/L、如至少1.5mg/L、如至少2.5mg/L、如至少5.0mg/L、如至少10mg/L、如至少15mg/L、如至少20mg/L、如25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L或更多。
测定滴度的方法是本领域已知的。
E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的产生方法
在一些实施方案中，所述方法还包括通过乙酰基转移酶的表达或通过化学转化将至少部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的步骤。因此，本文公开了一种在酵母细胞中产生E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供酵母细胞和在培养基中孵育所述酵母细胞，其中所述酵母细胞表达：
i)至少一种异源去饱和酶，其能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇，
b)将至少部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。
在一些实施方案中，E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯通过如本文以上在“E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的产生”中所述对酵母细胞工程化来获得。
在其他实施方案中，将细胞产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯是通过化学方式进行的，如本领域已知的。例如，可以回收细胞产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇，然后将乙酰氯添加到E8,E10-十二碳二烯-1-醇中，混合并例如在室温下孵育，由此将细胞产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇的至少一部分转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。
在其他实施方案中，酵母细胞产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A，其可被转化为脂质(如甘油三酯)或游离脂肪酸，回收所述脂质或游离脂肪酸，可进而被转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。如上所述，然后可将E8,E10-十二碳二烯-1-醇在体外进一步转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。在这样的实施方案中，将细胞产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯是通过化学方式进行的，如本领域已知的。
因此，本发明的方法可以允许产生滴度为至少0.2mg/L的E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。在一些实施方案中，E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的滴度为至少0.25mg/L，如至少0.3mg/L、如至少0.4mg/L、如至少0.5mg/L、如至少0.75mg/L、如至少1mg/L、如至少1.5mg/L、如至少2.5mg/L、如至少5.0mg/L、如至少10mg/L、如至少15mg/L、如至少20mg/L、如25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L或更多。
测定滴度的方法是本领域已知的。
E8,E10-十二碳二烯醛的产生方法
在一些实施方案中，所述方法还包括通过进一步工程化酵母细胞或通过化学转化将至少部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的步骤。因此，本文公开了一种在酵母细胞中产生E8,E10-十二碳二烯醛的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供酵母细胞和在培养基中孵育所述酵母细胞，其中所述酵母细胞表达：
i)至少一种异源去饱和酶，其能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇，
b)将至少部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛。
在一些实施方案中，E8,E10-十二碳二烯醛通过如本文以上在“E8,E10-十二碳二烯醛的产生”中所述对酵母细胞工程化来获得。
在其他实施方案中，所述方法包括通过化学转化将至少部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的步骤。化学转化基于将E8,E10-十二碳二烯-1-醇氧化为E8,E10-十二碳二烯醛。用于进行这种转化的方法在本领域是已知的。优选的方法是环境友好的并且使有害废物的量最小化。
在其他实施方案中，酵母细胞产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A，其可被转化为脂质(如甘油三酯)或游离脂肪酸，然后可将其回收并在体外转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇，如上所述。在这样的实施方案中，将细胞产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛是通过化学方式进行的，如本领域已知的。
因此，在一些实施方案中，化学转化可以是不含金属的，避免有毒的重金属基试剂，如氧化锰、氧化铬(Jones ox.PDC，PCC)或钌化合物(TPAP，Ley-Griffith ox.)。在一些实施方案中，转化不涉及涉及活化的二甲亚砜的反应，如Swern氧化或Pfitzner-Moffat类型。此类反应可能涉及刻板形成痕量的可能难以从目标产物中除去的有强烈气味的有机硫化合物，如二甲基硫醚。在一些实施方案中，所述方法包括Dess-Martin反应(Yadav等人,2004；Meyer等人,1994)。在其他实施方案中，化学转化包括在水/有机两相条件下用次氯酸钠氧化(Okada等人,2014；Tamura等人,2012；Li等人,2009)。在一些实施方案中，可以在含有25％吡啶的二氯甲烷介质中用1-氯苯并三唑进行化学氧化(Ferrell和Yao,1972)。
替代性地，E8,E10-十二碳二烯-1-醇氧化为E8,E10-十二碳二烯醛可通过醇脱氢酶酶促进行。技术人员将知道如何进行酶促氧化。例如，可以通过使纯化的酶、细胞提取物或全细胞与E8,E10-十二碳二烯-1-醇接触来进行酶促氧化。
因此，在一些实施方案中，本文公开的方法允许产生滴度为至少0.2mg/L的E8,E10-十二碳二烯醛。在一些实施方案中，E8,E10-十二碳二烯醛的滴度为至少0.25mg/L，如至少0.3mg/L、如至少0.4mg/L、如至少0.5mg/L、如至少0.75mg/L、如至少1mg/L、如至少1.5mg/L、如至少2.5mg/L、如至少5.0mg/L、如至少10mg/L、如至少15mg/L、如至少20mg/L、如25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L或更多。
测定滴度的方法是本领域已知的。
回收
在一些实施方案中，所述方法还包括回收所获得的产物的步骤。
在一些实施方案中，所述方法用于产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇，因此还包括回收所产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇的步骤。在其他实施方案中，所述方法用于产生E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯，因此还包括回收所产生的E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的步骤。在其他实施方案中，所述方法用于产生E8,E10-十二碳二烯醛，因此还包括回收所产生的E8,E10-十二碳二烯醛的步骤。
用于回收通过本发明方法获得的产物的方法在本领域是已知的，并且可以包括用疏水性溶剂(如癸烷、己烷或植物油)进行提取。
替代性地，申请PCT/EP2020/076351(由同一申请人于2020年9月22日提交)中描述的方法也可用于回收期望的产物。例如，所述方法可用于回收从E8,E10-十二碳二烯基辅酶A的转化中获得的脂质(如甘油三酯)或脂肪酸，或回收产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇、产生的E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或产生的E8,E10-十二碳二烯醛。所述方法利用以等于或大于在培养温度下在水溶液中(如在培养基中)测量的其混浊浓度的量向培养基中添加提取剂，这极大地促进了疏水化合物如脂肪醇、脂肪醇乙酸酯和脂肪醛的回收。因此，这样的方法可有利地用于促进通过由本发明方法产生的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A、E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和E8,E10-十二碳二烯醛的转化获得的脂质(如甘油三酯)或脂肪酸的回收。此外，还发现在培养基中添加提取剂通常增加细胞产生的疏水化合物的滴度，并增加产生的疏水化合物从细胞中的分泌。
因此，在一些实施方案中，本发明方法中使用的培养基包含如下量的提取剂，所述量等于或大于其在培养温度下在水溶液中(如在培养基中)测量的混浊浓度，其中提取剂是非离子表面活性剂，优选非离子乙氧基化表面活性剂如消泡剂，优选选自以下的聚乙氧基化表面活性剂：聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚醚分散体的混合物、包含聚乙二醇单硬脂酸酯的消泡剂如二甲硅油、脂肪醇烷氧基化物、聚乙氧基化表面活性剂和乙氧基化及丙氧基化C16-C18醇基消泡剂、及其组合。
水溶液中的混浊浓度是在给定温度下，优选在室温下或在要进行发酵的温度下，例如30℃，或在室温下测定的。如本文所用，术语“提取剂”是指非离子表面活性剂，特别是消泡剂，其促进回收发酵中产生的疏水化合物。例如，非离子表面活性剂是非离子乙氧基化表面活性剂，例如选自以下的聚乙氧基化表面活性剂：聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚醚分散体的混合物、包含聚乙二醇单硬脂酸酯的消泡剂如二甲硅油、脂肪醇烷氧基化物、聚乙氧基化表面活性剂和乙氧基化及丙氧基化C16-C18醇基消泡剂、及其组合。PCT/EP2020/076351的实施例7描述了如何测定表面活性剂的混浊浓度。
在申请PCT/EP2020/076351(由同一申请人于2020年9月22日提交)中，特别是在标题为“非离子乙氧基化表面活性剂”的章节中详细描述了作为合适的提取剂的非离子表面活性剂和所述非离子表面活性剂的合适量。
在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基因此包含非离子表面活性剂，其为乙氧基化和丙氧基化C16-C18醇基消泡剂，如C16-C18烷基醇乙氧基化物丙氧基化物(CAS号68002-96-0)，并且培养基包含至少1％vol/vol的C16-C18烷基醇乙氧基化物丙氧基化物，如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少12.5％、如至少15％、如至少17.5％、如至少20％、如至少22.5％、如至少25％、如至少27.5％、如至少30％vol/vol的C16-C18烷基醇乙氧基化物丙氧基化物，或更多。
在其他实施方案中，本发明方法中使用的培养基包含非离子表面活性剂，其为聚氧乙烯聚氧丙烯醚，例如
Figure BDA0003797945770000351
P407(CAS号9003-11-6)，并且培养基包含至少10％vol/vol的聚氧乙烯聚氧丙烯醚如
Figure BDA0003797945770000352
P407，如至少11％vol/vol、如至少12％vol/vol、如至少13％vol/vol、如至少14％vol/vol、如至少15％vol/vol、如至少16％vol/vol、如至少17％vol/vol、如至少18％vol/vol、如至少19％vol/vol、如至少20％vol/vol、如至少25％vol/vol、如至少30％vol/vol、如至少35％vol/vol的聚氧乙烯聚氧丙烯醚如
Figure BDA0003797945770000367
P407，或更多。
在其他实施方案中，本发明方法中使用的培养基包含非离子表面活性剂，其为聚醚分散体的混合物如消泡剂204，并且培养基包含至少1％vol/vol的聚醚分散体的混合物如消泡剂204，如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少12.5％、如至少15％、如至少17.5％、如至少20％、如至少22.5％、如至少25％、如至少27.5％、如至少30％vol/vol的聚醚分散体的混合物如消泡剂204，或更多。
在其他实施方案中，本发明方法中使用的培养基包含非离子表面活性剂，其包含聚乙二醇单硬脂酸酯如二甲硅油，并且培养基包含至少1％vol/vol的聚乙二醇单硬脂酸酯或二甲硅油，如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少12.5％、如至少15％、如至少17.5％、如至少20％、如至少22.5％、如至少25％、如至少27.5％、如至少30％vol/vol的聚乙二醇单硬脂酸酯或二甲硅油，或更多。
在其他实施方案中，本发明方法中使用的培养基包含非离子表面活性剂，其为脂肪醇烷氧基化物，并且培养基包含至少1％vol/vol的脂肪醇烷氧基化物，如至少1.5、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少12.5％、如至少15％、如至少17.5％、如至少20％、如至少22.5％、如至少25％、如至少27.5％、如至少30％vol/vol的脂肪醇烷氧基化物，或更多。合适的脂肪醇烷氧基化物包括
Figure BDA0003797945770000361
LF300(CAS号196823-11-7)、
Figure BDA0003797945770000362
LF1300(68002-96-0)、
Figure BDA0003797945770000363
SLF180(CAS号196823-11-7)、
Figure BDA0003797945770000364
2574(CAS号68154-97-2)和Imbentin SG/251(CAS号68002-96-0)，优选
Figure BDA0003797945770000365
LF300或
Figure BDA0003797945770000366
2574。
在其他实施方案中，本发明方法中使用的培养基包含非离子表面活性剂，其为Agnique BP420(CAS号68002-96-0)，并且培养基包含至少1％vol/vol的Agnique BP420，如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少12.5％、如至少15％、如至少17.5％、如至少20％、如至少22.5％、如至少25％、如至少27.5％、如至少30％vol/vol的Agnique BP420，或更多。
在一些实施方案中，培养基包含如下量的提取剂，所述量大于其混浊浓度至少50％如至少100％、如至少150％、如至少200％、如至少250％、如至少300％、如至少350％、如至少400％、如至少500％、如至少750％、如至少1000％或更多，和/或其中所述培养基包含如下量的提取剂，所述量为其混浊浓度的至少2倍如其混浊浓度的至少3倍、如其混浊浓度的至少4倍、如其混浊浓度的至少5倍、如其混浊浓度的至少6倍、如其混浊浓度的至少7倍、如其混浊浓度的至少8倍、如其混浊浓度的至少9倍、如其混浊浓度的至少10倍、如其混浊浓度的至少12.5倍、如其混浊浓度的至少15倍、如其混浊浓度的至少17.5倍、如其混浊浓度的至少20倍、如其混浊浓度的至少25倍、如其混浊浓度的至少30倍。
添加提取剂，即非离子表面活性剂如聚乙氧基化表面活性剂，例如本文所述的任何非离子表面活性剂、消泡剂或聚乙氧基化表面活性剂，导致在发酵液中产生乳液，其中由微生物产生的疏水化合物，即E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(或通过转化E8,E10-十二碳二烯基辅酶A获得的脂质或游离脂肪酸)、E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛存在于乳液中。在本发明方法用包含提取剂的培养基进行的实施方案中，所述方法因此还可以包括破坏乳液以回收包含提取剂和疏水化合物的产物相的步骤。一旦破坏乳液，发酵液则分离成三个相：主要包含水和含水化合物的水相，包含细胞和细胞碎片的相，和主要包含提取剂和E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(或通过转化E8,E10-十二碳二烯基辅酶A获得的脂质或游离脂肪酸)、E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛的产物相。因此，获得由三相组成的组合物。这在申请PCT/EP2020/076351(由同一申请人于2020年9月22日提交)中，特别是在标题为“包含疏水化合物的产物相”的章节中详细描述。
在一些实施方案中，大部分E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(或通过转化E8,E10-十二碳二烯基辅酶A获得的脂质或游离脂肪酸)，和任选地大部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛存在于产物相中。例如，至少50％的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(或通过转化E8,E10-十二碳二烯基辅酶A获得的脂质或游离脂肪酸)和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛存在于产物相中，如至少55％、如至少60％、如至少65％、如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(或通过转化E8,E10-十二碳二烯基辅酶A获得的脂质或游离脂肪酸)和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛存在于产物相中。在一些实施方案中，产物相包含至少50％的最初存在于发酵液中的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(或通过转化E8,E10-十二碳二烯基辅酶A获得的脂质或游离脂肪酸)和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛，如至少55％、如至少60％、如至少65％、如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％的最初存在于发酵液中的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(或通过转化E8,E10-十二碳二烯基辅酶A获得的脂质或游离脂肪酸)和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛。
破坏乳液的步骤可以如本领域已知的那样进行，例如通过使乳液经受相分离步骤，例如通过离心。
在破坏乳液的步骤之后，可以从组合物中回收产物相，所述产物相包含提取剂和通过转化E8,E10-十二碳二烯基辅酶A获得的脂质或游离脂肪酸，和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛。在这样的实施方案中，所述方法还可以包括将通过转化E8,E10-十二碳二烯基辅酶A获得的脂质或游离脂肪酸，和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛与提取剂分离的步骤。这可以通过本领域已知的方法进行，如通过蒸馏(例如在减压下蒸馏)或通过柱纯化，或任何其他合适的方法。提取剂可以再循环到发酵罐或生物反应器中。
核酸构建体
还提供了用于修饰酵母细胞的核酸构建体，所述构建体包含：
i)编码至少一种异源去饱和酶的至少一种第一多核苷酸，所述至少一种异源去饱和酶能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)任选地编码至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)的第二多核苷酸，所述至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
核酸构建体可用于获得本文所述的酵母细胞，即能够产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇的酵母细胞。术语“核酸构建体”在本文中可以指单个物理实体，即单个分子，例如其中包含第一多核苷酸和任选地第二多核苷酸的载体或质粒，或者它可以指多个核酸分子，例如第一多核苷酸包含在一个质粒或载体中而第二多核苷酸包含在另一个质粒或载体中。
核酸构建体还可以包含以下中的一种或多种：
iii)编码异源细胞色素b5的多核苷酸，如SEQ ID NO:3中所示的多核苷酸或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物；
iv)编码异源细胞色素b5还原酶的多核苷酸，如SEQ ID NO:23中所示的多核苷酸或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物；
v)编码血红蛋白的多核苷酸，如SEQ ID NO:5中所示的多核苷酸或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物；和/或
vi)编码硫酯酶的多核苷酸，如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:34中所示的多核苷酸或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
多核苷酸可以包含任何上述基因的几个拷贝，并且可以经密码子优化以在它们将被引入的酵母细胞中正确表达。
在一些实施方案中，能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A(其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA))的至少一种异源去饱和酶是如上所述的Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)或与其具有至少60％同源性或同一性的其功能变体。在这样的实施方案中，第一多核苷酸包含SEQ ID NO:1或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物，如本文以上所述。
在一些实施方案中，至少一种异源去饱和酶是突变体Cpo_CPRQ，如在位置85具有突变的Cpo_CPRQ突变体，或与其具有至少60％同源性或同一性的其功能变体。在一些实施方案中，突变是S85A突变。在一些实施方案中，去饱和酶是突变体Cpo_CPRQ，如在位置82具有突变的Cpo_CPRQ突变体。在一些实施方案中，突变是S82A突变，或与其具有至少60％同源性或同一性的其功能变体。
在其他实施方案中，能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A(其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA))的至少一种异源去饱和酶是Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)或与其具有至少60％同源性或同一性的其功能变体，如上所述。在这样的实施方案中，第一多核苷酸包含SEQ ID NO:78或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物，如本文以上所述。
在一些实施方案中，酵母细胞表达几种能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键的去饱和酶。在这样的实施方案中，优选地，几种去饱和酶中的至少一种是如本文详述的Cpo_CPRQ、Gmo_CPRQ、其突变体或其功能变体，并且第一多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。在这样的实施方案中，核酸构建体可以包含另外的第一多核苷酸，每个编码如本文以上所述的去饱和酶。例如，核酸构建体包含编码Cpo_CPRQ、Gmo_CPRQ或其同源物的第一多核苷酸，并且还包含编码另一种去饱和酶，优选Cpo_NPVE(SEQ ID NO:67)或Cpo_SPTQ(SEQ ID NO:69)或与其具有至少60％同源性或同一性的其功能变体的另外的第一多核苷酸。因此，在一些实施方案中，另外的第一多核苷酸包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68，或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
核酸构建体还可以包含编码FAR的第二多核苷酸。FAR优选是昆虫FAR，如对于地夜蛾属、实夜蛾属、铃夜蛾属或小卷蛾属昆虫天然的FAR。例如，FAR对于黃地老虎(Agrotissegetum)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、Heliothis subflexa、烟实夜蛾(Helicoverpaassulta)、烟芽夜蛾(Helicoverpa virescens)或苹果蠹蛾是天然的。
在一些实施方案中，FAR是Ase_FAR(SEQ ID NO:10)，即天然存在于黃地老虎中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Ase_FAR的功能变体。例如，功能变体与其具有至少65％同源性或同一性。在一些实施方案中，FAR是突变体Ase_FAR，如在位置198或413具有突变的突变体。在一些实施方案中，Ase_FAR突变体是T198A突变体。在其他实施方案中，Ase_FAR突变体是S413A突变体。在这样的实施方案中，第二多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:9或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
在其他实施方案中，FAR是Aip_FAR(SEQ ID NO:61)，即天然存在于小地老虎中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Aip_FAR的功能变体。在这样的实施方案中，第二多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:60或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
在其他实施方案中，FAR是Hs_FAR(SEQ ID NO:71)，即天然存在于Heliothissubflexa中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Hs_FAR的功能变体。在这样的实施方案中，第二多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:70或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
在其他实施方案中，FAR是Has_FAR(SEQ ID NO:73)，即天然存在于烟实夜蛾中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Has_FAR的功能变体。在这样的实施方案中，第二多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:72或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
在其他实施方案中，FAR是Hv_FAR(SEQ ID NO:75)，即天然存在于烟芽夜蛾中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Hv_FAR的功能变体。在这样的实施方案中，第二多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:74或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
在其他实施方案中，FAR是Har_FAR(SEQ ID NO:12)，即天然存在于棉铃虫(Helicoverpa armigera)中的FAR。在一些实施方案中，异源FAR是保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力的Har_FAR的功能变体。在这样的实施方案中，第二多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:13或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
在其他实施方案中，FAR是苹果蠹蛾FAR，例如Cpo_FAR或其功能变体，所述功能变体保留将E8,E10-C12:CoA转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的能力。在这样的实施方案中，第二多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:75或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
在需要表达几种FAR的实施方案中，第二多核苷酸可以是多个第二多核苷酸，每个编码一种FAR。
在一些实施方案中，核酸构建体包含至少一种另外的多核苷酸，其可以是与第一和/或第二多核苷酸不同的核酸分子，或者其可以是与第一和/或第二多核苷酸相同的核酸分子的一部分。
在一些实施方案中，所述另外的多核苷酸编码异源细胞色素b5，如SEQ ID NO:3中所示的细胞色素b5或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。在一些实施方案中，细胞色素b5是对于鳞翅目物种天然的细胞色素b5。在特定实施方案中，细胞色素b5是来自铃夜蛾属物种的细胞色素b5，优选如SEQ ID NO:4中所示的来自棉铃虫的细胞色素b5或与其具有至少60％同源性或同一性的其功能变体。在这样的实施方案中，所述另外的多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3或与其具有至少60％同源性的其同源物。
在一些实施方案中，所述另外的多核苷酸编码异源细胞色素b5还原酶，如SEQ IDNO:24中所示的细胞色素b5还原酶或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。在一些实施方案中，细胞色素b5还原酶是对于铃夜蛾属物种天然的细胞色素b5还原酶。在特定实施方案中，细胞色素b5还原酶是来自铃夜蛾属物种的细胞色素b5还原酶，优选如SEQ IDNO:24中所示的来自棉铃虫的细胞色素b5还原酶或与其具有至少60％同源性或同一性的其功能变体。在这样的实施方案中，所述另外的多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23或与其具有至少60％同源性的其同源物。
在一些实施方案中，所述另外的多核苷酸编码异源血红蛋白，如SEQ ID NO:6中所示的血红蛋白或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。在一些实施方案中，血红蛋白是对于透明颤菌属物种天然的血红蛋白。在特定实施方案中，血红蛋白是如SEQ IDNO:6中所示的来自粪透明颤菌的血红蛋白或与其具有至少60％同源性或同一性的其功能变体。在这样的实施方案中，所述另外的多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:5或与其具有至少60％同源性的其同源物。
在一些实施方案中，所述另外的多核苷酸编码硫酯酶，如SEQ ID NO:6中所示的硫酯酶或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。在一些实施方案中，硫酯酶对于萼距花属(Cuphea)物种、樟属(Cinnamomum)物种或埃希氏菌属(Escherichia)物种是天然的。在特定实施方案中，硫酯酶是如分别在SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:35或SEQID NO:26中所示的来自湿地萼距花、萼距花、香樟或大肠杆菌的血红蛋白，或与其具有至少60％同源性或同一性的其功能变体。在这样的实施方案中，所述另外的多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:25，与其具有至少60％同源性的其同源物。
在一些实施方案中，核酸构建体包含如上所述的第一多核苷酸和任选地如上所述的第二多核苷酸，并且还表达一种或多种如上所述的另外的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸构建体因此包含第一多核苷酸和任选地第二多核苷酸，并且还包含以下中的一个：
·至少一种编码异源细胞色素b5的另外的多核苷酸；或
·至少一种编码异源细胞色素b5还原酶的另外的多核苷酸；或
·至少一种编码血红蛋白的另外的多核苷酸；或
·至少一种编码硫酯酶的另外的多核苷酸。
在其他实施方案中，核酸构建体包含第一多核苷酸和任选地第二多核苷酸，并且还包含：
·至少一种编码异源细胞色素b5的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码异源细胞色素b5还原酶的另外的多核苷酸；
或
·至少一种编码异源细胞色素b5的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码血红蛋白的另外的多核苷酸；
或
·至少一种编码异源细胞色素b5的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码硫酯酶的另外的多核苷酸；
或：
·至少一种编码异源细胞色素b5还原酶的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码血红蛋白的另外的多核苷酸；
或：
·至少一种编码异源细胞色素b5还原酶的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码硫酯酶的另外的多核苷酸；
或：
·至少一种编码血红蛋白的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码硫酯酶的另外的多核苷酸。
在其他实施方案中，核酸构建体包含第一多核苷酸和任选地第二多核苷酸，并且还包含：
·至少一种编码异源细胞色素b5的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码异源细胞色素b5还原酶的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码血红蛋白的另外的多核苷酸；
或
·至少一种编码异源细胞色素b5的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码异源细胞色素b5还原酶的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码硫酯酶的另外的多核苷酸；
或
·至少一种编码异源细胞色素b5还原酶的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码血红蛋白的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码硫酯酶的另外的多核苷酸；
或
·至少一种编码异源细胞色素b5的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码血红蛋白的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码硫酯酶的另外的多核苷酸。
在一些实施方案中，核酸构建体包含第一多核苷酸和任选地第二多核苷酸，并且还包含以下全部：
·至少一种编码异源细胞色素b5的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码异源细胞色素b5还原酶的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码血红蛋白的另外的多核苷酸；和
·至少一种编码硫酯酶的另外的多核苷酸。
核酸构建体还可包含用于将本文以上所述的任何另外的修饰引入酵母细胞的另外的多核苷酸，特别是在引入酵母细胞后导致一种或多种天然脂肪醛脱氢酶、一种或多种脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或一种或多种脂肪酰基合酶的修饰的活性的多核苷酸；优选活性被降低或消除。
如本领域已知的，核酸构建体可以包含其中包含的多核苷酸的表达所需的或促进其表达的另外的元件，如位于包含在多核苷酸中的编码序列的上游的启动子，例如诱导型、阻抑型或组成型启动子。
作为信息素组合物的配制品
在一些实施方案中，本发明方法还包括将酵母细胞产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛配制成信息素组合物的步骤，如本领域已知的。
可通过本发明方法获得的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A、E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛
本公开文本还提供了可通过本发明方法获得的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(或通过转化E8,E10-十二碳二烯基辅酶A获得的脂质或游离脂肪酸)、E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛。当在酵母细胞中表达昆虫去饱和酶和/或还原酶时，得到的产物(例如由细胞产生的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和/或包含E8,E10-十二碳二烯-1-醇的脂肪醇)的混合物通常具有与昆虫的信息素腺体中产生的类似的组成。这允许产生适合于各种昆虫的信息素混合物，而不是在分开的过程中产生单独的信息素组分，所述单独的信息素组分然后需要以适当比例混合。然而，得到的产物(例如E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和/或脂肪醇)的混合物可含有生物产生的特征性副产物。
因此，在进行E8,E10-十二碳二烯基辅酶A产生的一些实施方案中，所产生的脂肪酰辅酶A包含至少1％如至少2％、如至少3％、如至少4％、如至少5％、如至少10％、如至少15％、如至少20％的在不同于所需脂肪酰辅酶A的另一位置具有去饱和度的去饱和脂肪酰辅酶A，和/或至少1％如至少2％、如至少3％、如至少4％、如至少5％、如至少10％、如至少15％、如至少20％的相应饱和脂肪酰辅酶A。
在进行E8,E10-十二碳二烯-1-醇产生的实施方案中，所产生的脂肪醇包含至少1％如至少2％、如至少3％、如至少4％、如至少5％、如至少10％、如至少15％、如至少20％的在不同于所需脂肪醇的另一位置具有去饱和度的去饱和脂肪醇，和/或至少1％如至少2％、如至少3％、如至少4％、如至少5％、如至少10％、如至少15％、如至少20％的相应饱和脂肪醇。如果从发酵液回收的脂肪醇的混合物被化学氧化成醛或乙酰化成乙酸酯，则产生醛和乙酸酯的相应混合物。
在一些实施方案中，本发明方法用于产生E8,E10-十二碳二烯醛。在一些实施方案中，本发明的酵母细胞和方法导致产生脂肪醛的混合物，所述混合物包含E8,E10-十二碳二烯醛，但也包含奇数链脂肪醛。术语“奇数链”脂肪醛是指具有奇数个碳原子(如1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23个碳原子)的碳链长度的脂肪醛。术语“偶数链”脂肪醛是指具有偶数个碳原子(如8、10、12、14、16、18、20或22个碳原子)的碳链长度的脂肪醛。
在一些实施方案中，本发明方法用于产生E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。在一些实施方案中，本发明的酵母细胞和方法导致产生脂肪醇乙酸酯的混合物，所述混合物包含E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯，但也包含奇数链脂肪醇乙酸酯。术语“奇数链”脂肪醇乙酸酯是指具有奇数个碳原子(如1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23个碳原子)的碳链长度的脂肪醇乙酸酯。术语“偶数链”脂肪醇乙酸酯是指具有偶数个碳原子(如8、10、12、14、16、18、20或22个碳原子)的碳链长度的脂肪醇乙酸酯。
信息素组合物
酵母细胞产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛可以被配制成信息素组合物，如本领域已知的。此类信息素组合物可以用作有害生物综合治理产品，其可以用于监测有害生物存在的方法中或用于干扰有害生物交配的方法中。
如本文公开的信息素组合物可以用作生物性杀有害生物剂。可以将此类组合物喷洒或分配在培养物上、在田间或在果园中。如本领域所已知的，也可以将它们浸泡在例如橡胶隔垫上，或者与其他组分混合。这可以导致交配干扰，从而防止有害生物繁殖，或者它可以与诱捕装置组合使用以捕获有害生物。可以使用本发明信息素组合物对抗的有害生物的非限制性例子是：棉铃虫(cotton bollworm/Helicoverpa armigera)、条纹螟虫(stripedstemborer)(二化螟(Chilo suppressalis))、小菜蛾(diamond back moth/Plutellaxylostella)、甘蓝夜蛾(cabbage moth/Mamestra brassicae)、大甘蓝心毛毛虫(largecabbage-heart caterpillar)(大菜螟(Crocidolomia binotalis))、欧洲玉米秆蛀虫(European corn stalk borer)(蛀茎夜蛾(Sesamia nonagrioides))、醋栗透翅蛾(currant clearwing)(茶藨子透翅蛾(Synanthedon tipuliformis))和洋蓟羽蛾(artichoke plume moth/Platyptilia carduidactylal)。因此，将本发明组合物用于培养物可以提高作物产量，基本上没有环境影响。
本发明信息素组合物中不同化合物的相对量可以根据作物的性质和/或待控制的有害生物而变化；也可能存在地理差异。因此，确定最佳相对量可能需要常规优化。
在本公开文本的一些实施方案中，所述信息素组合物还可以包含一种或多种另外的化合物，如液体或固体载体或基质。例如，合适的载体或基质包括植物油、精制矿物油或其馏分、橡胶、塑料、二氧化硅、硅藻土、蜡模和纤维素粉末。
可以如本领域所已知的那样配制信息素组合物。例如，它可以呈溶液、凝胶、粉末的形式。可以配制信息素组合物使得其易于分配，如本领域所已知的。
试剂盒
本文提供了用于进行本发明方法的部件试剂盒。所述部件试剂盒可以包含如本文所述的“即用型”的酵母细胞。在一个实施方案中，酵母细胞是耶氏酵母属细胞(如解脂耶氏酵母细胞)，或酵母属细胞(如酿酒酵母细胞)。
替代性地，所述部件试剂盒还可包含编码待引入酵母细胞中的目的活性的核酸构建体。核酸构建体可以作为多种核酸构建体来提供，如多种载体，其中每种载体编码一种或几种期望的活性。上文已经描述了有用的核酸构建体。
所述部件试剂盒还可包含用于引入突变的核酸构建体，所述突变导致部分或全部功能丧失，如本文以上所述的任何突变。
所述部件试剂盒可以任选地包含待修饰的酵母细胞。
在一些实施方案中，所述部件试剂盒包含所有上述项。
监测有害生物的存在或干扰有害生物交配的方法
由本文公开的酵母细胞和方法产生的E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛可用于监测有害生物的存在或干扰有害生物交配的方法中。
因此，本文还提供了一种监测有害生物的存在或干扰有害生物交配的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过本文所述的方法产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛；
ii)将所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛配制为信息素组合物；以及
iii)使用所述信息素组合物作为有害生物综合治理组合物。
如本文以上所述的任何酵母细胞和方法均可用于此类方法中。
实施例
实施例1：生物积块的构建
所有异源基因均由GeneArt(Life Technologies)在解脂耶氏酵母的密码子优化形式中合成。使用Phusion U热启动DNA聚合酶(ThermoFisher)通过PCR扩增所有基因，以获得用于克隆到酵母表达载体中的片段。引物列于表1，并且所得DNA片段(生物积块)列于表2。在含有Midori Green Advance(Nippon Genetics Europe GmbH)的1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物。从凝胶上切下正确大小的PCR产物，并使用Nucleospin凝胶和PCR清理试剂盒(Macherey-Nagel)纯化。
表1-引物
Figure BDA0003797945770000431
Figure BDA0003797945770000441
Figure BDA0003797945770000451
Figure BDA0003797945770000461
Figure BDA0003797945770000471
表2.使用所指示模板和引物通过PCR获得的DNA片段(生物积块)
Figure BDA0003797945770000472
Figure BDA0003797945770000481
Figure BDA0003797945770000491
Figure BDA0003797945770000501
1Holkenbrink等人2020
2Holkenbrink等人2017
实施例2：质粒的构建
将具有USER盒的整合型酵母载体用FastDigest SfaAI(ThermoFisher)在37℃线性化2小时，然后用Nb.Bsml(New England Biolabs)在65℃切1小时。通过凝胶电泳分离得到的含有粘性末端的载体，从凝胶上切下，并使用Nucleospin凝胶和PCR清理试剂盒(Macherey-Nagel)进行凝胶纯化。如Holkenbrink等人,2017所述，通过USER克隆将DNA片段克隆到如此制备的载体中。将反应转化到化学感受态大肠杆菌DHα细胞中并且将细胞铺板在含100mg/L氨苄青霉素的Lysogeny Broth(LB)琼脂板上。将板在37℃下孵育过夜，并且通过菌落PCR筛选得到的菌落。从过夜大肠杆菌液体培养物中纯化质粒，并且通过测序确认正确的克隆。所构建的载体列于表3中。
表3.整合型表达载体
Figure BDA0003797945770000502
Figure BDA0003797945770000511
实施例3：菌株的构建
如Holkenbrink等人,2017所述，通过转化DNA载体构建酵母菌株。将整合型载体在转化前用FastDigest NotI线性化。当需要时，将促进整合到特定基因组区域中的辅助载体与表4中列出的整合型质粒或DNA修复片段共转化。通过适当抗生素选择在酵母蛋白胨右旋糖(YPD)琼脂上选择菌株。通过菌落PCR和在需要时通过测序确认正确的基因型。用质粒pCfB6364(EP19204554)转化解脂耶氏酵母野生型菌株，产生菌株ST6029，然后使基因HFD1(YALI0_F23793g)、HFD2(YALI0_E15400g)、HFD3(YALI0_A17875g)、HFD4(YALI0_B01298g)、FAO1(YALI0_B14014g)和PEX10(YALI1_C01416g)缺失，产生菌株ST6629(Borodina等人,2018)。菌株ST6029和ST6629用作亲本菌株以构建所有其他菌株。所得菌株列于表5中。
表4.辅助载体
Figure BDA0003797945770000521
Figure BDA0003797945770000531
Figure BDA0003797945770000541
表5.酵母菌株
Figure BDA0003797945770000542
Figure BDA0003797945770000551
Figure BDA0003797945770000561
Figure BDA0003797945770000571
Figure BDA0003797945770000581
实施例4：菌株的培养，脂肪酸甲酯和脂肪醇的提取和分析
将菌株从YPD琼脂板(10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂)接种到24孔板(EnzyScreen)中的2.5mL YPG培养基(10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，40g/L甘油)中，初始OD600为0.1-0.2。将板在28℃下孵育，以300rpm振荡。22h后，将板在4℃和3,000xg下离心5min。弃去上清液，并将细胞重悬于每孔1.25mL生产培养基中(Borodina等人,2018)。用2.5μL十二烷酸甲酯补充培养基。将板在28℃下孵育28小时，以300rpm振荡。
为了分析脂肪醇，用990μL乙酸乙酯:乙醇(84:15)和作为内标的10μL Z10-17:Me(2mg/mL)对200μL培养液进行提取。将样品涡旋20秒并在室温下孵育1小时，然后涡旋5分钟。将300μL H2O添加到每个样品中。将样品涡旋并在21℃和3,000x g下离心5min。通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析上层有机相。在与质量选择检测器HP 5973连接的HewlettPackard 6890GC上进行GC-MS分析。GC配备有INNOWax柱(30m×0.25mm×0.25μm)，并且将氦气用作载气(平均速度：33cm/s)。MS以电子碰撞模式(70eV)操作，在m/z 30与400之间扫描，并且将进样器在220℃下以不分流模式配置。将柱温箱温度设定为80℃，保持1min，然后以10℃/min的速率升至210℃，随后在210℃下保持15min，然后以10℃/min的速率升至230℃，随后在230℃下保持20min。通过将保留时间和质谱与可在实验室收集中获得的参考化合物的保留时间和质谱进行比较来鉴定化合物。通过记录的总离子电流(TIC)定量化合物。通过Agilent ChemStation软件和iWork Numbers分析数据。
为了分析脂肪酸，通过在4℃和3,000xg下离心5min收获每个小瓶的1mL。用1000μL在甲醇(无水)中的1M HCl提取各沉淀物。将样品涡旋20秒并置于80℃水浴中2小时。将样品每30分钟涡旋10秒。将样品冷却至室温后，添加1000μL在甲醇(无水)中的1M NaOH，500μLNaCl饱和水溶液，990μL己烷和作为内标的10μL Z10-17:Me(2mg/mL)。将样品涡旋并在21℃和3,000xg下离心5min。如上所述，通过GC-MS分析上层有机相。
实施例5：解脂耶氏酵母中E8,E10-C12:OH的产生
衍生自菌株ST6629的菌株ST8494表达棉铃虫脂肪酰基还原酶Har_FAR(两个拷贝)和苹果蠹蛾去饱和酶Cpo_CPRQ。菌株ST6629是经工程化以减少脂肪醇降解和储存脂质积累的解脂耶氏酵母菌株(Holkenbrink等人,2020)。
如实施例4中所述培养、提取和分析菌株，不同之处在于为了分析形成的脂肪醇，合并六个小瓶(1.25mL)并通过在4℃和3,000g下离心5min来收获。基于内标计算脂肪醇的浓度。
在经工程化用于降低脂肪醇降解的菌株中组合了去饱和酶CpoCPRQ与脂肪醇还原酶HarFAR的表达的菌株ST8494显示产生4.4mg/L E8,E10-C12:OH(表6)。
表6.菌株ST8494中脂肪醇的浓度。
菌株 E9/Z9-C12:OH(mg/L) E8,E10-C12:OH(mg/L)
ST8494 20.1 4.4
实施例6：解脂耶氏酵母中E8,E10-C12:Me和E8,E10-C12:OH的产量增加
菌株ST8406衍生自菌株ST6629并另外表达CpoCPRQ去饱和酶。衍生自ST8406的菌株ST9066表达两个拷贝的Cpo_CPRQ。如实施例4所述培养、提取和分析菌株。基于内标计算脂肪酸甲酯和脂肪醇的浓度(表7-表10)。
来自苹果蠹蛾的去饱和酶Cpo_CPRQ的额外拷贝的表达(ST9066)分别导致E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me的产量增加2.8倍和1.5倍(表7)。这表明去饱和酶的过表达可导致E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me的产量增加。
表7.菌株ST8406和ST9066中脂肪酸甲酯的浓度
菌株 E9/Z9-C12:Me(mg/L) E8,E10-C12:Me(mg/L)
ST8406 3.81±0.52 0.43±0.00
ST9066 5.75±1.12 1.22±0.52
组合了来自苹果蠹蛾的去饱和酶Cpo_CPRQ的表达与来自棉铃虫的细胞色素b5(HarCyb5，SEQ ID NO:4)的表达或与来自粪透明颤菌的血红蛋白(VHb，SEQ ID NO:6)的表达的菌株ST8411和ST8416分别比仅表达来自苹果蠹蛾的去饱和酶的参考菌株ST8406多产生18％和22％E8,E10-C12:Me。这些菌株还显示E9/Z9-C12:Me的产量增加(表8)。这些数据表明，与仅表达去饱和酶的菌株相比，去饱和酶与细胞色素b5或与血红蛋白的表达可以产生更多的E8,E10-C12:Me。
表8.菌株ST8406、ST8411和ST8416中脂肪酸甲酯的浓度
菌株 E9/Z9-C12:Me(mg/L) E8,E10-C12:Me(mg/L)
ST8406 1.29±0.20 0.22±0.09
ST8411 1.60±0.16 0.26±0.03
ST8416 1.68±0.10 0.27±0.02
除了表达来自棉铃虫的细胞色素b5(HarCyb5)(菌株ST8411)之外，还表达来自粪透明颤菌的血红蛋白(VHb)(ST9115)分别导致E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me滴度额外提高21％和41％(表9)。这些数据表明，与仅表达三种中的一种的菌株相比，去饱和酶与细胞色素b5和血红蛋白的共表达可以产生更多的E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me。
表9.菌株ST8406、ST8411和ST9115中脂肪酸甲酯的浓度
菌株 E9/Z9-C12:Me(mg/L) E8,E10-C12:Me(mg/L)
ST8406 2.99±0.64 0.34±0.04
ST8411 3.40±0.57 0.42±0.00
ST9115 4.83±0.62 0.51±0.05
表达来自黃地老虎的脂肪酰基还原酶(Ase_FAR)的菌株ST9250显示产生C12:OH、E9/Z9-C12:OH和E8,E10-C12:OH，而表达来自仓鸮的脂肪酰基还原酶(Ta_FAR，SEQ ID NO:8)的菌株ST9249仅显示产生C12:OH(表10)。
表10.菌株ST9066、ST9249和ST9250中脂肪醇的浓度。ND：未检测到。
Figure BDA0003797945770000591
Figure BDA0003797945770000601
实施例7：Δelo1解脂耶氏酵母菌株中E8,E10-C12:Me的产量增加
使固有解脂耶氏酵母基因ELO1(YALI0_F06754g，SEQ ID NO:13)在菌株ST8406中缺失，产生菌株ST9060。如实施例4所述培养、提取和分析菌株。基于内标计算脂肪酸甲酯的浓度(表11)。与菌株ST8406相比，菌株ST9060显示E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me产量分别增加2.2倍和1.6倍。这些数据表明，缺失延伸酶基因可以增加E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me的产量。
表11.菌株ST8406和ST9060中脂肪酸甲酯的浓度
菌株 E9/Z9-C12:Me(mg/L) E8,E10-C12:Me(mg/L)
ST8406 4.77±0.65 0.63±0.10
ST9060 7.40±1.93 1.39±0.33
实施例8：在含有基因YALI0_F14729g、YALI0_E18876g或YALI0_D03597g缺失的解脂耶氏酵母菌株中E8,E10-C12:Me的产量增加
使均编码推定的硫酯酶的固有解脂耶氏酵母基因YALI0_F14729g(SEQ ID NO:19)、YALI0_E18876g(SEQ ID NO:54)和YALI0_D03597g(SEQ ID NO:55)在菌株ST8406中缺失，分别产生菌株ST9061、ST9062和ST9063。如实施例4所述培养、提取和分析菌株。基于内标计算脂肪酸甲酯的浓度(表12)。与菌株ST8406相比，菌株ST9061显示E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me产量分别增加1.6倍和1.7倍。与菌株ST8406相比，菌株ST9062显示E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me产量分别增加1.2倍和1.3倍。与菌株ST8406相比，菌株ST9063显示E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me产量增加1.1倍。这些数据表明，内源性推定硫酯酶的缺失可以增加E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me的产量。
表12.菌株ST8406、ST9061、ST9062和ST9063中脂肪酸甲酯的浓度
菌株 E9/Z9-C12:Me(mg/L) E8,E10-C12:Me(mg/L)
ST8406 1.97±0.12 0.29±0.01
ST9061 3.35±0.44 0.46±0.06
ST9062 2.49±0.34 0.35±0.03
ST9063 2.24±0.47 0.31±0.04
实施例9：在去饱和酶Cpo_CPRQ中含有氨基酸修饰的解脂耶氏酵母菌株中E8,E10-C12:Me的产生
在菌株ST8406中，蛋白质Cpo_CPRQ中位置85的氨基酸从丝氨酸(S)修饰为丙氨酸(A)，产生菌株ST9072。如实施例4所述培养、提取和分析菌株。基于内标计算脂肪酸甲酯的浓度(表13)。
与菌株ST8406相比，表达Cpo_CPRQ_S85A的菌株ST9072显示E8,E10-C12:Me的产量增加213％。这些数据表明，Cpo_CPRQ可被工程化以增加E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me的产量。
表13.菌株ST8406和ST9072中脂肪酸甲酯的浓度
Figure BDA0003797945770000602
Figure BDA0003797945770000611
实施例10：在含有去饱和酶Cpo_CPRQ中的氨基酸修饰(S85A)和其他有益修饰的组合的解脂耶氏酵母菌株中E8,E10-C12:Me和E8,E10-C12:OH的产生
衍生自ST9060的菌株ST9278含有两个拷贝的Cpo_CPRQ以及ELO1缺失。衍生自ST9060的菌株ST9279含有一个拷贝的Cpo_CPRQ、一个拷贝的Cpo_CPRQ_S85A以及ELO1缺失。
如实施例4所述培养、提取和分析菌株。基于内标计算脂肪酸甲酯的浓度(表14)。
与表达一个拷贝的Cpo_CPRQ、一个拷贝的Cpo_CPRQ_S85A并缺失ELO1的菌株ST9279相比，表达两个拷贝的Cpo_CPRQ并缺失ELO1基因的菌株ST9278显示E9/Z9-C12:Me和E8,E10-C12:Me的产量更低。
表14.菌株ST9060、ST9278、ST9279中脂肪酸甲酯的浓度
菌株 E9/Z9-C12:Me(mg/L) E8,E10-C12:Me(mg/L)
ST9060 12.63±2.07 2.07±0.10
ST9278 20.70±2.46 5.47±0.74
ST9279 21.91±4.24 6.15±1.62
除其他修饰外，衍生自ST9279的菌株ST9355还表达VHb和HarCyb5。除其他修饰外，衍生自ST9355的菌株ST9356还表达HarCyb5和HarCyb5还原酶(SEQ ID NO:24)。除其他修饰外，衍生自ST9356的菌株ST9357还含有固有解脂耶氏酵母基因YALI0_F14729g的缺失。除其他修饰外，衍生自ST9357的菌株ST9358还表达Ase_FAR。除其他修饰外，衍生自ST9279的菌株ST9387还表达Ase_FAR。如实施例4所述培养、提取和分析菌株。基于内标计算脂肪酸甲酯和脂肪醇的浓度(表15和表16)。
表15.菌株ST9279、ST9355、ST9356中脂肪酸甲酯的浓度
菌株 E9/Z9-C12:Me(mg/L) E8,E10-C12:Me(mg/L)
ST9279 12.6±1.9 5.4±0.7
ST9355 11.9±0.7 6.4±0.5
ST9356 12.8±1.5 7.3±0.1
ST9357 11.3±0.1 7.2±0.2
ST9358 11.1±1.5 6.0±1.2
ST9387 11.0±3.2 4.0±0.7
表16.菌株ST9279、ST9355、ST9356、ST9357、ST9358和ST9387中脂肪醇的浓度
Figure BDA0003797945770000612
Figure BDA0003797945770000621
这些数据表明，可以组合有益的修饰以实现更高滴度的E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me以及E8,E10-C12:OH和E9/Z9-C12:OH。
实施例11：在还原酶Ase_FAR中含有氨基酸修饰的菌株中E8,E10-C12:OH的产生
在菌株ST9250中，蛋白质Ase_FAR中位置198的氨基酸从苏氨酸(T)修饰为丙氨酸(A)，产生菌株ST9335。在菌株ST9250中，蛋白质Ase_FAR中位置423的氨基酸从丝氨酸(S)修饰为丙氨酸(A)，产生菌株ST9336。如实施例4所述培养、提取和分析菌株。基于内标计算脂肪醇的浓度。
实施例12：在含有脂肪酸合酶1(FAS1)和脂肪酸合酶2(FAS2)中的氨基酸修饰的解脂耶氏酵母菌株中E8,E10-C12:OH的产生
在菌株ST9387中，解脂耶氏酵母的FAS2(SEQ ID NO:18)中位置1220的氨基酸从异亮氨酸(I)修饰为苯丙氨酸(F)，产生菌株ST9388。在菌株ST9387中，解脂耶氏酵母的FAS2中位置1220的氨基酸从异亮氨酸(I)修饰为色氨酸(W)，产生菌株ST9420。在菌株ST9420中，解脂耶氏酵母的FAS1(SEQ ID NO:16)中位置123的氨基酸从亮氨酸(L)修饰为缬氨酸(V)，产生菌株ST9421。如实施例4所述培养、提取和分析菌株，不同之处在于不向生产培养基中添加十二烷酸甲酯。基于内标计算脂肪醇的浓度。
实施例13：在含有解脂耶氏酵母的FAS2中的氨基酸修饰(FAS2(I1220F))以及来自大肠杆菌的用于形成C12脂肪酸的硫酯酶的解脂耶氏酵母菌株中E8,E10-C12:OH的产生
菌株ST9397表达来自解脂耶氏酵母的FAS1的截短形式和来自大肠杆菌的硫酯酶TesA的截短形式的融合物(Xu等人,2016)(SEQ ID NO:59)。将菌株ST9397用含有来自解脂耶氏酵母的脂肪酰辅酶A合酶的质粒转化，产生菌株ST9398。如实施例4所述培养、提取和分析菌株，不同之处在于使用玻璃管并且从总培养液中提取脂肪醇。基于内标计算脂肪醇的浓度(表17)。
来自解脂耶氏酵母的脂肪酰辅酶A合酶的表达不显著影响E8,E10-12:OH的产生。
表17：菌株ST9397和ST9398中E9/Z9-12:OH和E8,E10-12:OH的浓度
菌株 E9/Z9-12:OH(mg/L) E8,E10-C12:OH(mg/L)
ST9397 0.2±0 0.1±0
ST9398 0.2±0 0.1±0
实施例14：通过解脂耶氏酵母中过氧化物酶体的链缩短产生E8,E10-C12:OH
为了增加菌株ST9395中C12:CoA前体的量，使解脂耶氏酵母的以下五种内源性过氧化物酶体氧化酶缺失：POX1、POX2、POX3、POX4和POX5(对应YALI0_E32835g、YALI0_F10857g、YALI0_E32835g、YALI0_E27654g、YALI0_E27654g)，并且取而代之表达异源过氧化物酶体氧化酶，例如来自笋瓜的Cma_POX(SEQ ID NO:47)。
为了增加Δ9-12:CoA前体的量，上述菌株另外表达Δ11-14去饱和酶，例如来自蔷薇斜条卷叶蛾的CroZ11(SEQ ID NO:63)或来自平行色卷蛾的CpaE11(SEQ ID NO:65)。由此，产生Z/E11-14:CoA并缩短为Z/E9-12:CoA，然后通过去饱和酶Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:1)进一步转化为E8,E10-C12:Me。
如实施例4所述培养、提取和分析菌株。菌株ST9600、ST9607和ST9616的培养物补充有肉豆蔻酸甲酯。基于内标计算脂肪醇的浓度。
实施例15：酿酒酵母中E8,E10-C12:Me和E8,E10-C12:OH的产生
使用引物attB1_Cpo_CPRQ_F和attB1_Cpo_CPRQ_R，从苹果蠹蛾信息素腺体组织的cDNA扩增去饱和酶基因Cpo_CPRQ。
通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并使用Wizard SV Gel和PCR清理系统(Promega Biotech AB，瑞典)纯化。通过Gateway克隆技术(Life technologies)将纯化的DNA克隆到pDONR221载体中。通过Sanger测序确认所得载体，并将基因亚克隆到载体pYEX-CHT中(Patel等人,2003)，然后将其转化到缺乏OLE1和ELO1的酿酒酵母菌株中(MATaelo1::HIS3 ole1::LEU2 ade2 his3 leu2 ura3)(Schneiter等人,2000)。为了选择阳性转化体，在含有0.7％YNB(含有硫酸铵)、缺乏尿嘧啶和亮氨酸的缺陷型培养基(FormediumLTD，英格兰)、2％葡萄糖、1％tergitol(Nonidet NP-40型，Sigma-Aldrich，瑞典)、0.01％腺嘌呤(Sigma-Aldrich，瑞典)和0.5mM油酸(Sigma-Aldrich，瑞典)的合成完全培养基上培养细胞。将板在30℃下孵育四天后，将单独的菌落接种到10ml选择性培养基中。将培养物在30℃下孵育48h，并用于接种10ml含有2mM CuSO4的补充了0.5mM脂肪酸甲酯前体的选择性培养基，OD600为0.4。孵育48小时后，通过以3000rpm离心收获细胞。弃去培养基上清液，并在玻璃管中使用3.75ml甲醇/氯仿(2:1，v/v)提取总脂质。添加1ml HAc(0.15M)和1.25ml水并将管涡旋。将管以2000rpm离心2min，并将底部氯仿相转移到新的玻璃管中。为了将脂质转化为脂肪酸甲酯(FAME)，在氮气流下蒸发溶剂。添加1ml在甲醇中的2％硫酸，将悬浮液涡旋并在90℃孵育1h。然后添加1ml水，混合，并用1ml己烷提取FAME。在与质量选择检测器HP5973联接的Hewlett Packard 6890GC上对样品进行GC-MS分析。GC配备有HP-88柱(30m×0.25mm×0.25μm)并且将氦气用作载气(平均速度：33ms)。MS以电子碰撞模式(70eV)操作，并且将进样器在220℃下以不分流模式配置。将柱温箱温度设定为80℃，保持1min，然后以10℃/min的速率升至210℃，随后在210℃下保持15min，然后以10℃/min的速率升至230℃，随后在230℃下保持20min。作为参考标准的E8,E10-12:OAc购自美国Bedoukian，并通过使用0.5M KOH在甲醇中的溶液进行水解而转化为相应的醇。如(Bjostad和Roelofs,1984)所述，用在二甲基甲酰胺中的重铬酸吡啶鎓将脂肪醇氧化为相应的酸。
图2中的色谱图显示在表达Cpo_CPRQ的酿酒酵母菌株中，E9-12:Me和E8,E10-12:Me可以分别由12:Me和E9-12:Me产生。
实施例16：在解脂耶氏酵母中通过Cpo_SPTQ、Cpo_NPVE和Cpo_CPRQ产生E8,E10-C12:Me
衍生自ST6629的菌株ST10136表达一个拷贝的Cpo_SPTQ。衍生自ST6629的菌株ST10137表达一个拷贝的Cpo_NPVE。衍生自ST8406的菌株ST9064表达一个拷贝的Cpo_CPRQ和一个拷贝的Cpo_SPTQ。衍生自ST8406的菌株ST9065表达一个拷贝的Cpo_CPRQ和一个拷贝的Cpo_NPVE。衍生自ST8406的菌株ST9066表达两个拷贝的Cpo_CPRQ。衍生自ST9065的菌株ST10138表达一个拷贝的Cpo_CPRQ、一个拷贝的Cpo_NPVE和一个拷贝的Cpo_SPTQ。
如实施例4所述培养、提取和分析菌株。基于内标计算脂肪酸甲酯的浓度(表18)。
Cpo_SPTQ的表达(ST10136)不会导致E9-C12:Me、Z9-C12:Me或E8,E10-C12:Me的产生。Cpo_NPVE的表达(ST10137)导致E9-C12:Me和Z9-C12:Me的产生，但不产生E8,E10-C12:Me。在ST8406中Cpo_SPTQ或Cpo_NPVE的额外表达(分别为ST9064和ST9065)不会导致E8,E10-C12:Me的增加。在ST8406中表达额外拷贝的Cpo_CPRQ(ST9066)分别导致E8,E10-C12:Me和E9/Z9-C12:Me产量增加2.8倍和2.1倍。与ST8406相比，Cpo_CPRQ、Cpo_SPTQ和Cpo_NPVE的组合表达(ST10138)不会导致E8,E10-C12:Me的增加。这表明仅Cpo_CPRQ的表达导致E8,E10-C12:Me的产生。
表18.菌株ST10136、ST10137、ST8406、ST9064、ST9065、ST9066和ST10138中脂肪酸甲酯的浓度
菌株 E9-C12:Me(mg/L) Z9-C12:Me(mg/L) E8,E10-C12:Me(mg/L)
ST10136 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
ST10137 2.06±0.89 3.82±1.80 0.00±0.00
ST8406 5.02±0.88 0.33±0.03 0.66±0.15
ST9064 4.42±0.00 0.29±0.00 0.63±0.00
ST9065 6.04±0.22 2.29±0.10 0.86±0.10
ST9066 10.55±0.07 0.58±0.04 1.87±0.06
ST10138 6.38±0.99 2.66±0.41 0.76±0.06
实施例17：通过表达多拷贝的生物合成酶产生E8,E10-C12:OH
在实施例10中解释了菌株ST9358。菌株ST9495衍生自菌株ST9357(描述于实施例10中)，并且表达额外基因拷贝的去饱和酶Cpo_CPRQ和脂肪酰基还原酶Ase_FAR。如实施例4所述培养、提取和分析菌株，不同之处在于使用玻璃管并且从总培养液中提取脂肪醇。基于内标计算脂肪醇的浓度。
表19显示额外基因拷贝的Cpo_CPRQ和Ase_FAR可增加E8,E10-12:OH的产量至7.1mg/L。
表19.菌株ST9358和ST9495中脂肪醇的浓度
菌株 E9-C12:OH(mg/L) E8,E10-C12:OH(mg/L)
ST9358 0.3±0.0 0.1±0.0
ST9495 22.6±4.5 7.1±1.5
实施例18：通过表达各种脂肪酰基还原酶产生可得蒙
菌株ST9358和ST9623衍生自菌株ST9357。它们另外分别表达来自黃地老虎和小地老虎的脂肪酰基还原酶。如实施例4所述培养、提取和分析菌株。
表20中的结果显示两种脂肪酰基还原酶能够产生E9-C12:OH和E8,E10-C12:OH。
表20.菌株ST9357、ST9358和ST9623中脂肪醇的浓度
菌株 E9-C12:OH(mg/L) E8,E10-C12:OH(mg/L)
ST9357 0±0 0±0
ST9358 1.1±1.2 0.5±0.5
ST9623 1.9±0.3 0.6±0.1
序列
Figure BDA0003797945770000641
Figure BDA0003797945770000651
Figure BDA0003797945770000661
Figure BDA0003797945770000671
Figure BDA0003797945770000681
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条款
1.一种能够产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇的酵母细胞，所述酵母细胞表达至少一种异源去饱和酶，其能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)，任选地其中所述酵母细胞属于选自以下的属：布拉霉属、假丝酵母属、隐球菌属、小克银汉霉属、油脂酵母属、被孢霉属、毛霉属、须霉属、腐霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、丝孢酵母属、酵母属和耶氏酵母属，任选地其中所述酵母细胞属于选自以下的物种：三孢布拉霉、铁红假丝酵母、C.revkaufi、热带假丝酵母、弯曲隐球菌、刺孢小克银汉霉、雅致小克银汉霉、山茶小克银汉霉、斯达油脂酵母、产油油脂酵母、高山被孢霉、深黄被孢霉、拉曼被孢霉、葡酒色被孢霉、卷枝毛霉、布拉克须霉、畸雌腐霉、圆红冬孢酵母、粘红酵母、瘦弱红酵母、禾本红酵母、胶红酵母、R.pinicola、普鲁兰丝孢酵母、皮状丝孢酵母、酿酒酵母和解脂耶氏酵母，优选地，所述酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞或酿酒酵母细胞。
2.一种能够产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇的酵母细胞，所述酵母细胞表达至少一种异源去饱和酶，所述至少一种异源去饱和酶能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)。
3.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇，所述酵母细胞还表达至少一种能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
4.一种能够产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇的酵母细胞，所述酵母细胞表达：
i)至少一种异源去饱和酶，其能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
5.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞属于选自以下的属：布拉霉属、假丝酵母属、隐球菌属、小克银汉霉属、油脂酵母属、被孢霉属、毛霉属、须霉属、腐霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、丝孢酵母属、酵母属和耶氏酵母属。
6.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞属于选自以下的物种：
三孢布拉霉、铁红假丝酵母、C.revkaufi、热带假丝酵母、弯曲隐球菌、刺孢小克银汉霉、雅致小克银汉霉、山茶小克银汉霉、斯达油脂酵母、产油油脂酵母、高山被孢霉、深黄被孢霉、拉曼被孢霉、葡酒色被孢霉、卷枝毛霉、布拉克须霉、畸雌腐霉、圆红冬孢酵母、黏红酵母、瘦弱红酵母、禾本红酵母、胶红酵母、R.pinicola、普鲁兰丝孢酵母、皮状丝孢酵母、酿酒酵母和解脂耶氏酵母。
7.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞属于耶氏酵母属或酵母属，优选地所述酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞或酿酒酵母细胞。
8.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述至少一种去饱和酶是Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)或Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)，或与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:2具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体，优选地所述至少一种去饱和酶是Cpo_CPRQ或其功能变体；或其中所述至少一种去饱和酶是至少两种去饱和酶，其中所述两种去饱和酶中的至少一种是Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)或Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)，或与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:2具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体，优选地所述至少一种去饱和酶是Cpo_CPRQ或其功能变体，并且另一种去饱和酶是能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的去饱和酶，如Z9-12去饱和酶，优选Cpo_NPVE(SEQ ID NO:67)或Cpo_SPTQ(SEQ ID NO:69)或与SEQ ID NO:67或SEQ IDNO:69具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
9.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述去饱和酶是在位置85具有突变如S85A突变的Cpo_CPRQ的突变体。
10.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述至少一种异源去饱和酶是至少两种不同的异源去饱和酶，如SEQ ID NO:2中所示的Cpo_CPRQ和在位置85具有突变如S85A突变的Cpo_CPRQ的突变体。
11.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶选自以下：Ase_FAR(SEQ ID NO:10)、Aip_FAR(SEQ ID NO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQ ID NO:75)、Har_FAR(SEQ ID NO:12)、Cpo_FAR(SEQ ID NO:76)，及与其具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
12.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶是如在位置198或413具有突变(优选T198A突变或S413A突变)的Ase_FAR的突变体。
13.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述异源去饱和酶以高水平表达。
14.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述异源脂肪酰辅酶A还原酶以高水平表达。
15.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞被进一步修饰以增加E8,E10-C12:CoA的可用性。
16.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其还表达异源细胞色素b5，如来自鳞翅目物种的细胞色素b5，如来自棉铃虫的细胞色素b5，优选SEQ ID NO:4中所示的细胞色素b5 HarCyb5或与其具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
17.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其还表达异源细胞色素b5还原酶(EC1.6.2.2)，如来自鳞翅目物种如棉铃虫的细胞色素b5还原酶，优选地所述细胞色素b5还原酶是SEQ ID NO:24所示的来自棉铃虫的细胞色素b5还原酶或与其具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
18.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其还表达血红蛋白，如来自粪透明颤菌的血红蛋白，优选SEQ ID NO:6中所示的来自粪透明颤菌的血红蛋白或与其具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
19.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其还包含导致延伸酶活性部分或全部丧失的编码延伸酶的一个或多个基因的突变，如导致Elo1活性部分或全部丧失的ELO1基因(SEQ ID NO:13)的突变，优选地其中所述突变是缺失。
20.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其还包含导致硫酯酶活性部分或全部丧失的编码硫酯酶的一个或多个基因的突变，如YAL10_F14729g基因(SEQ ID NO:19)的突变、YALI0_E18876g基因(SEQ ID NO:54)的突变或YALI0_D03597g(SEQ ID NO:55)的突变，优选地其中所述突变是缺失。
21.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其还包含至少一个修饰，如导致Hfd1、Hfd2、Hfd3、Hfd4、Fao1、GPAT和Pex10中的至少一种的活性降低的至少一个突变；或具有至少一个修饰，如导致与其具有至少60％同源性或同一性，如至少65％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少75％同源性或同一性、如至少80％同源性或同一性、如至少81％同源性或同一性、如至少82％同源性或同一性、如至少83％同源性或同一性、如至少84％同源性或同一性、如至少85％同源性或同一性、如至少86％同源性或同一性、如至少87％同源性或同一性、如至少88％同源性或同一性、如至少89％同源性或同一性、如至少90％同源性或同一性、如至少91％同源性或同一性、如至少92％同源性或同一性、如至少93％同源性或同一性、如至少94％同源性或同一性、如至少95％同源性或同一性、如至少96％同源性或同一性、如至少97％同源性或同一性、如至少98％同源性或同一性、如至少99％同源性或同一性的至少一种蛋白质的活性降低的至少一个突变。
22.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达具有修饰的酮合酶结构域的脂肪酰基合酶变体，其中所述脂肪酰基合酶变体是Fas1(SEQ ID NO:16)或Fas2(SEQ ID NO:18)的变体，如在位置123具有突变优选L123V突变的突变体Fas1，或在位置1220具有突变优选I1220F或I1220W突变的突变体Fas2。
23.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达硫酯酶如异源硫酯酶，任选地其中所述硫酯酶以高水平表达。
24.根据条款23所述的酵母细胞，其中所述硫酯酶与如SEQ ID NO:33中所示的来自湿地萼距花的硫酯酶、与如SEQ ID NO:57中所示的来自萼距花的硫酯酶、与如SEQ IDNO:35中所示的来自香樟的硫酯酶或与如SEQ ID NO:26中所示的来自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性或同一性，优选地所述硫酯酶与如SEQ ID NO:35中所示的来自香樟的硫酯酶或与如SEQ ID NO:26中所示的来自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性或同一性。
25.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达截短的脂肪酰基合酶和截短的硫酯酶的融合蛋白，如SEQ ID NO:59中所示的融合蛋白或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
26.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含编码所述异源去饱和酶的核酸和编码所述异源脂肪酰辅酶A还原酶的核酸。
27.根据条款26所述的酵母细胞，其中编码所述异源去饱和酶的核酸和/或编码所述异源脂肪酰辅酶A还原酶的核酸以高拷贝数存在。
28.根据条款26至27中任一项所述的酵母细胞，其中编码所述异源去饱和酶的核酸如SEQ ID NO:1或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物所示，或如SEQ ID NO:78或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物所示。
29.根据条款26至28中任一项所述的酵母细胞，其中编码所述异源脂肪酰辅酶A还原酶的核酸如SEQ ID NO:9或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物所示。
30.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含编码所述异源细胞色素b5的核酸、编码所述异源细胞色素b5还原酶的核酸、编码所述血红蛋白的核酸、编码所述脂肪酸合酶变体的核酸、编码所述硫酯酶的核酸和/或编码所述融合蛋白的核酸。
31.根据条款30所述的酵母细胞，其中编码所述异源细胞色素b5的核酸、编码所述异源细胞色素b5还原酶的核酸、编码所述血红蛋白的核酸、编码所述脂肪酸合酶变体的核酸和/或编码所述硫酯酶的核酸以高拷贝数存在。
32.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中编码所述异源去饱和酶的核酸、编码所述异源脂肪酰辅酶A还原酶的核酸、编码所述异源细胞色素b5的核酸、编码所述异源细胞色素b5还原酶的核酸、编码所述血红蛋白的核酸、编码所述脂肪酸合酶变体的核酸和/或编码所述硫酯酶的核酸被密码子优化以用于在酵母细胞中表达。
33.根据条款30至32中任一项所述的酵母细胞，其中编码所述异源细胞色素b5的核酸如SEQ ID NO:3或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物所示，编码所述异源细胞色素b5还原酶的核酸如SEQ ID NO:23或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物所示，编码所述血红蛋白的核酸如SEQ ID NO:5或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物所示，和/或编码所述硫酯酶的核酸如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:34或与其具有至少60％同源性或同一性的SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:34的同源物所示。
34.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够产生以下滴度的E8,E10-十二碳二烯-1-醇：至少0.5mg/L，如至少0.6mg/L，如至少0.7mg/L，如至少0.8mg/L，如至少0.9mg/L，如至少1mg/L，如至少1.5mg/L，如至少2.5mg/L，如至少5.0mg/L，如至少10mg/L，如至少15mg/L，如至少20mg/L，如25mg/L，如至少50mg/L，如至少100mg/L，如至少250mg/L，如至少500mg/L，如至少750mg/L，如至少1g/L，如至少2g/L，如至少3g/L，如至少4g/L，如至少5g/L，如至少6g/L，如至少7g/L，如至少8g/L，如至少9g/L，如至少10g/L或更多。
35.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的乙酰基转移酶(EC 2.3.1.84)，由此所述酵母细胞能够产生E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。
36.根据条款35所述的酵母细胞，其中所述乙酰基转移酶是从所述酵母细胞表达的异源乙酰基转移酶(AcT)或从所述酵母细胞过表达的天然乙酰基转移酶。
37.根据条款35或36中任一项所述的酵母细胞，其中所述乙酰基转移酶是Sc_Atf1(SEQ ID NO:37)或与其具有至少60％同源性或同一性，与Sc_Atf1(SEQ ID NO:37)具有如至少61％同源性或同一性、如至少62％同源性或同一性、如至少63％同源性或同一性、如至少64％同源性或同一性、如至少65％同源性或同一性、如至少66％同源性或同一性、如至少67％同源性或同一性、如至少68％同源性或同一性、如至少69％同源性或同一性、如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的变体。
38.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的成醛脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)和/或脂肪醇氧化酶(EC 1.1.3.20)。
39.根据前述条款中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还：
i)具有导致一种或多种天然酰基辅酶A氧化酶活性降低的一个或多个突变；以及
ii)表达包含至少一种能够氧化脂肪酰辅酶A的酰基辅酶A氧化酶的至少一组酶，其中该组酶能够将第一碳链长度X的脂肪酰辅酶A缩短为具有第二碳链长度X'的缩短的脂肪酰辅酶A，其中X'≤X-2。
40.根据条款39所述的酵母细胞，其中X’＝12。
41.根据条款39至40中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达能够在碳链长度X的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的去饱和酶，如CroZ11去饱和酶(SEQ IDNO:63)或CpaE11去饱和酶(SEQ ID NO:65)或与SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65具有至少65％同源性或同一性，如至少70％同源性或同一性、如至少71％同源性或同一性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
42.根据条款39至42中任一项所述的酵母细胞，其中i)的所述天然酰基辅酶A氧化酶和/或ii)的所述酰基辅酶A氧化酶是过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶。
43.根据条款39至41中任一项所述的酵母细胞，其中ii)的所述至少一种酰基辅酶A氧化酶是天然酰基辅酶A氧化酶或异源酰基辅酶氧化酶，其与不表达所述至少一组酶的参考酵母菌株相比任选地过表达，优选地ii)的酶组中的至少一种酰基辅酶A氧化酶是异源酰基辅酶A氧化酶。
44.根据条款39至43中任一项所述的酵母细胞，其中ii)的酶组包含衍生自选自耶氏酵母属、地夜蛾属、拟南芥属、曲霉属、南瓜属、人属、类节杆菌属和大鼠属的属的生物体的酰基辅酶A氧化酶，优选地，至少一种第一组酶包含衍生自解脂耶氏酵母、黃地老虎、拟南芥、构巢曲霉、笋瓜、智人、产脲类节杆菌或褐家鼠的酰基辅酶A氧化酶，优选地，所述第一组酶的至少一种酰基辅酶A氧化酶是选自Yli_POX1(XP_504703)、Yli_POX2(XP_505264)、Yli_POX3(XP_503244)、Yli_POX4(XP_504475)、Yli_POX5(XP_502199)、Yli_POX6(XP_503632)、Ase_POX(SEQ ID NO:39)、Ath_POX1(SEQ ID NO:41)、Ath_POX2(SEQ ID NO:43)、Ani_POX(SEQ ID NO:45)、Cma_POX(SEQ ID NO:47)、Hsa_POX1-2(SEQ ID NO:49)、Pur_POX(SEQ IDNO:51)、Sc_POX1(SEQ ID NO:31)和Rno_POX2(SEQ ID NO:53)的酰基辅酶A氧化酶，或与其具有至少60％同源性或同一性，如至少65％、如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其功能变体。
45.一种用于在酵母细胞中产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇的方法，所述方法包括提供酵母细胞和在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞表达：
i)至少一种异源去饱和酶，其能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)任选地至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇，
从而产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
46.根据条款45的方法，其中所述酵母细胞如条款1至44中任一项所定义。
47.根据条款45至46中任一项所述的方法，其还包括将E8,E10-十二碳二烯基辅酶A转化为脂质(如甘油三酯)或游离脂肪酸，回收所述脂质或游离脂肪酸并将所述脂质或游离脂肪酸转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的步骤。
48.根据条款45至47中任一项所述的方法，其还包括回收所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇的步骤。
49.根据条款45至48中任一项所述的方法，其还包括通过乙酰基转移酶的表达或通过化学转化将至少部分E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的步骤。
50.根据条款49所述的方法，其中所述乙酰基转移酶是从所述酵母细胞表达的异源乙酰基转移酶(EC 2.3.1.84)或从所述酵母细胞过表达的天然乙酰基转移酶，其中所述乙酰基转移酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯，从而进一步产生E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。
51.根据条款50所述的方法，其中所述乙酰基转移酶是Sc_Atf1(SEQ ID NO:37)或与Sc_Atf1(SEQ ID NO:37)具有至少75％同源性或同一性，如至少80％同源性或同一性、如至少85％同源性或同一性、如至少90％同源性或同一性、如至少91％同源性或同一性、如至少92％同源性或同一性、如至少93％同源性或同一性、如至少94％同源性或同一性、如至少95％同源性或同一性、如至少96％同源性或同一性、如至少97％同源性或同一性、如至少98％同源性或同一性、如至少99％同源性或同一性、如至少100％同源性或同一性的其功能变体。
52.根据条款45至51中任一项所述的方法，其还包括回收所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的步骤。
53.根据条款45至52中任一项所述的方法，其还包括通过表达能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的成醛脂肪酰辅酶A还原酶(EC1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)和/或脂肪醇氧化酶(EC 1.1.3.20)或通过化学转化将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的步骤，从而进一步产生E8,E10-十二碳二烯醛。
54.根据条款53所述的方法，其还包括回收所述E8,E10-十二碳二烯醛的步骤。
55.根据条款45至54中任一项所述的方法，其中所述培养基包含如下量的提取剂，所述量等于或大于其在水溶液中的混浊浓度，其中所述提取剂是非离子乙氧基化表面活性剂如消泡剂，优选选自以下的聚乙氧基化表面活性剂：聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚醚分散体的混合物、包含聚乙二醇单硬脂酸酯的消泡剂如二甲硅油、脂肪醇烷氧基化物、聚乙氧基化表面活性剂和乙氧基化及丙氧基化C16-C18醇基消泡剂、及其组合。
56.根据条款55所述的方法，其中：
-所述非离子乙氧基化表面活性剂为乙氧基化和丙氧基化C16-C18醇基消泡剂，如C16-C18烷基醇乙氧基化物丙氧基化物(CAS号68002-96-0)，并且其中所述培养基包含至少1％vol/vol的C16-C18烷基醇乙氧基化物丙氧基化物，如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少12.5％、如至少15％、如至少17.5％、如至少20％、如至少22.5％、如至少25％、如至少27.5％、如至少30％vol/vol的C16-C18烷基醇乙氧基化物丙氧基化物，或更多，
-所述非离子乙氧基化表面活性剂为聚氧乙烯聚氧丙烯醚，例如
Figure BDA0003797945770000751
P407(CAS号9003-11-6)，并且其中所述培养基包含至少10％vol/vol的聚氧乙烯聚氧丙烯醚，如
Figure BDA0003797945770000752
P407，如至少11％vol/vol、如至少12％vol/vol、如至少13％vol/vol、如至少14％vol/vol、如至少15％vol/vol、如至少16％vol/vol、如至少17％vol/vol、如至少18％vol/vol、如至少19％vol/vol、如至少20％vol/vol、如至少25％vol/vol、如至少30％vol/vol、如至少35％vol/vol的聚氧乙烯聚氧丙烯醚，如
Figure BDA0003797945770000753
P407，或更多，
-所述非离子乙氧基化表面活性剂为聚醚分散体的混合物(如消泡剂204)，并且其中所述培养基包含至少1％vol/vol的聚醚分散体的混合物(如消泡剂204)，如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少12.5％、如至少15％、如至少17.5％、如至少20％、如至少22.5％、如至少25％、如至少27.5％、如至少30％vol/vol的聚醚分散体的混合物(如消泡剂204)，或更多；和/或
-所述非离子乙氧基化表面活性剂为包含聚乙二醇单硬脂酸酯如二甲硅油的非离子乙氧基化表面活性剂，并且其中所述培养基包含至少1％vol/vol的聚乙二醇单硬脂酸酯或二甲硅油，如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少12.5％、如至少15％、如至少17.5％、如至少20％、如至少22.5％、如至少25％、如至少27.5％、如至少30％vol/vol的聚乙二醇单硬脂酸酯或二甲硅油，或更多；
-所述非离子乙氧基化表面活性剂为脂肪醇烷氧基化物，优选选自
Figure BDA0003797945770000754
LF300(CAS号196823-11-7)、
Figure BDA0003797945770000755
LF1300(68002-96-0)、
Figure BDA0003797945770000756
SLF180(CAS号196823-11-7)、
Figure BDA0003797945770000761
2574(CAS号68154-97-2)和Imbentin SG/251(CAS号68002-96-0)，优选
Figure BDA0003797945770000762
LF300或
Figure BDA0003797945770000763
2574，并且其中所述培养基包含至少1％vol/vol的脂肪醇烷氧基化物，如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少12.5％、如至少15％、如至少17.5％、如至少20％、如至少22.5％、如至少25％、如至少27.5％、如至少30％vol/vol的脂肪醇烷氧基化物或更多；
-所述非离子乙氧基化表面活性剂为Agnique BP420(CAS号68002-96-0)，并且其中所述培养基包含至少1％vol/vol的Agnique BP420，如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少12.5％、如至少15％、如至少17.5％、如至少20％、如至少22.5％、如至少25％、如至少27.5％、如至少30％vol/vol的Agnique BP420，或更多。
57.根据条款45至56中任一项所述的方法，其中所述培养基包含如下量的提取剂，所述量大于其混浊浓度至少50％如至少100％、如至少150％、如至少200％、如至少250％、如至少300％、如至少350％、如至少400％、如至少500％、如至少750％、如至少1000％或更多，和/或其中所述培养基包含如下量的提取剂，所述量为其混浊浓度的至少2倍如其混浊浓度的至少3倍、如其混浊浓度的至少4倍、如其混浊浓度的至少5倍、如其混浊浓度的至少6倍、如其混浊浓度的至少7倍、如其混浊浓度的至少8倍、如其混浊浓度的至少9倍、如其混浊浓度的至少10倍、如其混浊浓度的至少12.5倍、如其混浊浓度的至少15倍、如其混浊浓度的至少17.5倍、如其混浊浓度的至少20倍、如其混浊浓度的至少25倍、如其混浊浓度的至少30倍。
58.根据条款45至57中任一项所述的方法，其中将所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A转化为脂质或游离脂肪酸，并且其中由所述酵母细胞产生的所述脂质或游离脂肪酸、所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇、和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛存在于所述发酵液中的乳液中，所述方法还包括破坏所述乳液的步骤，从而获得包含产物相的组合物，所述产物相包含所述提取剂和所述脂质或游离脂肪酸、所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇、和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛，任选地其中：
-破坏所述乳液的步骤包括以下或由以下组成：所述发酵液的相分离步骤，如离心步骤，从而获得由三个相组成的组合物：水相、包含细胞和细胞碎片的相、和产物相，所述产物相包含所述提取剂和所述脂质或游离脂肪酸、E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛，和/或
-其中所述产物相包含最初存在于所述发酵液中的所述脂质或游离脂肪酸、E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛的至少50％，如至少55％、如至少60％、如至少65％、如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％或更多。
59.根据条款45至58中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
-回收所述脂质或游离脂肪酸、所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛，优选通过蒸馏步骤如减压蒸馏、或通过柱纯化来回收，
-将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇化学转化为E8,E10-十二碳二烯醛和/或E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯，
-任选地，回收所述E8,E10-十二碳二烯醛和/或E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。
60.根据条款45至59中任一项所述的方法，其还包括将所回收的E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛配制成信息素组合物的步骤。
61.根据条款45至60中任一项的方法，其中所述信息素组合物还包含一种或多种另外的化合物，如液体或固体载体或基质。
62.一种用于修饰酵母细胞的核酸构建体，所述构建体包含：
i)编码至少一种异源去饱和酶的至少一种第一多核苷酸，所述至少一种异源去饱和酶能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；和
ii)任选地编码至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)的第二多核苷酸，所述至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
63.根据条款62所述的核酸构建体，其中：
a)所述至少一种去饱和酶是Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)、Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)或与其具有至少80％同一性，与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:2具有如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体，优选地所述至少一种去饱和酶是Cpo_CPRQ或其功能变体；或
b)所述至少一种去饱和酶是至少两种去饱和酶，其中所述两种去饱和酶中的至少一种是Gmo_CPRQ(SEQ ID NO:77)、Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)或与其具有至少80％同一性，与SEQ ID NO:2具有如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体，优选地所述至少一种去饱和酶是Cpo_CPRQ或其功能变体，并且所述另一种去饱和酶是能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的去饱和酶，如Z9-12去饱和酶。
64.根据条款62至63中任一项所述的核酸构建体，其中所述至少一种异源去饱和酶是至少两种去饱和酶，并且其中另一种去饱和酶选自Cpo_NPVE(SEQ ID NO:67)、Cpo_SPTQ(SEQ ID NO:69)或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69具有如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体。
65.根据条款62至64中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一多核苷酸包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:78(优选SEQ ID NO:1)，或与其具有至少60％同源性或同一性，与SEQID NO:1或SEQ ID NO:78(优选SEQ ID NO:1)具有如61％、如至少62％、如至少63％、如至少64％、如至少65％、如至少66％、如至少67％、如至少68％、如至少69％、如至少70％、如至少71％、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
66.根据条款62至65中任一项所述的核酸构建体，其中所述至少一种异源去饱和酶是至少两种异源去饱和酶，并且其中所述第一多核苷酸还包含SEQ ID NO:66或SEQ IDNO:68中所示的核酸，或与其具有至少60％同源性或同一性，如61％、如至少62％、如至少63％、如至少64％、如至少65％、如至少66％、如至少67％、如至少68％、如至少69％、如至少70％、如至少71％、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
67.根据条款62至66中任一项所述的核酸构建体，其中所述异源去饱和酶如条款1至44中任一项所定义。
68.根据条款62至67中任一项所述的核酸构建体，其中所述至少一种去饱和酶是在位置85具有突变如S85A突变的Cpo_CPRQ的突变体。
69.根据条款62至68中任一项所述的核酸构建体，其中所述异源脂肪酰辅酶A还原酶如条款1至44中任一项所定义。
70.根据条款62至69中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:76和与其具有至少60％同源性或同一性，如至少65％、如至少70％、如至少71％、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性或同一性的其同源物。
71.根据条款62至70中任一项所述的核酸构建体，其还包含以下中的一种或多种：
iii)编码异源细胞色素b5的多核苷酸，如SEQ ID NO:3中所示的多核苷酸或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物；
iv)编码异源细胞色素b5还原酶的多核苷酸，如SEQ ID NO:23中所示的多核苷酸或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物；
v)编码血红蛋白的多核苷酸，如SEQ ID NO:5中所示的多核苷酸或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物；
vi)编码具有修饰的酮合酶结构域的脂肪酰基合酶变体的多核苷酸；和/或
vii)编码硫酯酶的多核苷酸，如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:34中所示的多核苷酸或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物。
72.根据条款62至71中任一项所述的核酸构建体，其中所述异源细胞色素b5、所述异源细胞色素b5还原酶、所述血红蛋白、所述脂肪酰基合酶变体和/或所述硫酯酶如条款1至44中任一项所定义。
73.一种监测有害生物的存在或干扰有害生物交配的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过根据条款45至61中任一项所述的方法产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛；
ii)将所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛配制为信息素组合物；以及
iii)使用所述信息素组合物作为有害生物综合治理组合物。
74.可通过根据条款45至61中任一项所述的方法获得的E8,E10-十二碳二烯基辅酶A、E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛。
75.一种部件试剂盒，其包含使用说明书和：
a)根据条款1至44中任一项所述的酵母细胞；和/或
b)根据条款62至72中任一项所述的用于修饰酵母细胞的核酸构建体和任选地待修饰的酵母细胞，其中在包含在所述核酸构建体中的多核苷酸表达后，经修饰的酵母细胞能够产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
序列表
<110> 费罗生物公司
<120> 产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A、可得蒙及其衍生物的酵母细胞和方法
<130> P5484PC00
<160> 80
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的苹果蠹蛾CPO_CPRQ去饱和酶(AHW98354)；mRNA编码序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1047)
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的苹果蠹蛾CPO_CPRQ去饱和酶(AHW98354)；mRNA编码序列
<400> 1
atgcctcccc gagagtctaa gaaggtggcc ctgcgatctt acgagacccc tgtcgcttct 60
ctccctcctc gaaagtacga gattatctac ctcaacctct tcctgcacat cgctggacat 120
atctccgccg tctacggcct gtatctgtgc ttcaccgccg cccagtggaa gaccatcttc 180
tttgcctacc tgtggctgtt gatgggcgag ctcggcgtgg tgtgtggcgc tcacagattg 240
tggtctcacc gttctttcaa ggtgaagcct cctctcgaga tcatgctgat gctgttcaac 300
tgtattggat tccagaacac cgccactgac tgggtccgaa accaccggct ccatcacaag 360
cactctgaca ctgacgccga cccccataac tctaaccgag gaatgctgtt ctcccacatt 420
ggctggctgt gtgtgcgaaa gcacccagat gttaaagaac gaggcaagac caccgacatg 480
tctgacatct actctaaccc cgtgctccga ttccagaaga agcacaaggt accccttttc 540
ggcgccatgt gtttcggcct gcccaccctt attcccaccc tgtggggaga ggacatcgtc 600
accgcttggc acgtcaacct gctgcgattc gttcttaatc tgaactctat cctgctggtc 660
aactccattg ctcataagta cggcacccga ccctacgatc gaaccatctg ccctcgacaa 720
aacaccacct gtaacatgat gactcttgga gagggcttcc acaactacca ccacaccttt 780
ccttgggact accgatctgc cgagctggga aagaactacc tgaacttcac caagtggttc 840
atcgacttct tcgccctgat tggatgggcc tacgacctga agaccgttcc tgacgatatg 900
atccagcgac gaatgaaaag aaccggagac ggatccaact cgtggggatg gggagacaag 960
gacatgacta aggaggagcg agactctgct actatcattt atcccgagaa gaaggatgat 1020
attaagatga tctccaaaaa gaactaa 1047
<210> 2
<211> 348
<212> PRT
<213> 苹果蠹蛾(Cydia pomonella)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(348)
<223> 苹果蠹蛾CPO_CPRQ去饱和酶(AHW98354)
<400> 2
Met Pro Pro Arg Glu Ser Lys Lys Val Ala Leu Arg Ser Tyr Glu Thr
1 5 10 15
Pro Val Ala Ser Leu Pro Pro Arg Lys Tyr Glu Ile Ile Tyr Leu Asn
20 25 30
Leu Phe Leu His Ile Ala Gly His Ile Ser Ala Val Tyr Gly Leu Tyr
35 40 45
Leu Cys Phe Thr Ala Ala Gln Trp Lys Thr Ile Phe Phe Ala Tyr Leu
50 55 60
Trp Leu Leu Met Gly Glu Leu Gly Val Val Cys Gly Ala His Arg Leu
65 70 75 80
Trp Ser His Arg Ser Phe Lys Val Lys Pro Pro Leu Glu Ile Met Leu
85 90 95
Met Leu Phe Asn Cys Ile Gly Phe Gln Asn Thr Ala Thr Asp Trp Val
100 105 110
Arg Asn His Arg Leu His His Lys His Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro
115 120 125
His Asn Ser Asn Arg Gly Met Leu Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Cys
130 135 140
Val Arg Lys His Pro Asp Val Lys Glu Arg Gly Lys Thr Thr Asp Met
145 150 155 160
Ser Asp Ile Tyr Ser Asn Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys Lys His Lys
165 170 175
Val Pro Leu Phe Gly Ala Met Cys Phe Gly Leu Pro Thr Leu Ile Pro
180 185 190
Thr Leu Trp Gly Glu Asp Ile Val Thr Ala Trp His Val Asn Leu Leu
195 200 205
Arg Phe Val Leu Asn Leu Asn Ser Ile Leu Leu Val Asn Ser Ile Ala
210 215 220
His Lys Tyr Gly Thr Arg Pro Tyr Asp Arg Thr Ile Cys Pro Arg Gln
225 230 235 240
Asn Thr Thr Cys Asn Met Met Thr Leu Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr
245 250 255
His His Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ser Ala Glu Leu Gly Lys Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Phe Thr Lys Trp Phe Ile Asp Phe Phe Ala Leu Ile Gly
275 280 285
Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Pro Asp Asp Met Ile Gln Arg Arg
290 295 300
Met Lys Arg Thr Gly Asp Gly Ser Asn Ser Trp Gly Trp Gly Asp Lys
305 310 315 320
Asp Met Thr Lys Glu Glu Arg Asp Ser Ala Thr Ile Ile Tyr Pro Glu
325 330 335
Lys Lys Asp Asp Ile Lys Met Ile Ser Lys Lys Asn
340 345
<210> 3
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的棉铃虫细胞色素b5(AAC33731)；mRNA编码序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(384)
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的棉铃虫细胞色素b5(AAC33731)；mRNA编码序列
<400> 3
atgaccgtgc gacagttcac ccgagtcgag gtgtctaagt ggaccactcg agaggaagcc 60
gtgttcatca tcgacaacgt ggtgtacaac gtgaccaagt tcctggacga gcaccccggt 120
ggacacgagg tgctggtgaa cgtggccggc aaggacgcct ctgaggactt cgacgacgtg 180
ggccactctc tggacgccaa ggaactgatg aagaagtacg tcgtcggcga ggtggtcgag 240
gccgagcgac gacacatcca gaagcgacag atctcttggg aagattctaa ggtggactct 300
gactcttctt tcacctcttc gtggaagttc cccgtgctgc tgggcatcgt ggtgaccctg 360
ctgtacacct acctgttcgg ctaa 384
<210> 4
<211> 127
<212> PRT
<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(127)
<223> 棉铃虫细胞色素b5(AAC33731)
<400> 4
Met Thr Val Arg Gln Phe Thr Arg Val Glu Val Ser Lys Trp Thr Thr
1 5 10 15
Arg Glu Glu Ala Val Phe Ile Ile Asp Asn Val Val Tyr Asn Val Thr
20 25 30
Lys Phe Leu Asp Glu His Pro Gly Gly His Glu Val Leu Val Asn Val
35 40 45
Ala Gly Lys Asp Ala Ser Glu Asp Phe Asp Asp Val Gly His Ser Leu
50 55 60
Asp Ala Lys Glu Leu Met Lys Lys Tyr Val Val Gly Glu Val Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Arg His Ile Gln Lys Arg Gln Ile Ser Trp Glu Asp Ser
85 90 95
Lys Val Asp Ser Asp Ser Ser Phe Thr Ser Ser Trp Lys Phe Pro Val
100 105 110
Leu Leu Gly Ile Val Val Thr Leu Leu Tyr Thr Tyr Leu Phe Gly
115 120 125
<210> 5
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的粪透明颤菌血红蛋白(AAT01097)；mRNA编码序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(441)
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的粪透明颤菌血红蛋白(AAT01097)；mRNA编码序列
<400> 5
atgctggacc agcagaccgt ggacacctct aaggccaccg tgcctgtgct gaaggaacac 60
ggcgtgacca tcaccaccac cttctaccag aacctgttcg ctaagcaccc cgaggtgcga 120
cccctgttcg atatgggccg acaggcctct ctcgagcagc ccaaggctct ggccatgacc 180
gtgggagccg ccgctcagaa catcgagaac ctgcctgcca ttctgcccgc cgtgcagaag 240
atcgccgtca agcactgcca ggccggcgtg gccgctcgac actaccccat cgtgggccaa 300
gagctgctgg gcgccatcaa ggaactgctg ggtgacgccg ccaccgacga catcctggac 360
gcctggggca aggcctacgg cgtgatcgcc gacgtgttca tccaggtcga ggccgacctg 420
tacgcccagg acgccgagta a 441
<210> 6
<211> 146
<212> PRT
<213> 粪透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(146)
<223> 粪透明颤菌血红蛋白(AAT01097)
<400> 6
Met Leu Asp Gln Gln Thr Val Asp Thr Ser Lys Ala Thr Val Pro Val
1 5 10 15
Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Gln Asn Leu
20 25 30
Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Gly Ala Ala
50 55 60
Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Gln Lys
65 70 75 80
Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Arg His Tyr Pro
85 90 95
Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Leu Leu Gly Asp
100 105 110
Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val
115 120 125
Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Asp
130 135 140
Ala Glu
145
<210> 7
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的仓鸮脂肪酰基还原酶(NP_001289627)；mRNA编码序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1557)
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的仓鸮脂肪酰基还原酶(NP_001289627)；mRNA编码序列
<400> 7
atggtgtcta tccccgagta ctacgagggc aagaacatcc tgctgaccgg cgccaccggc 60
ttcatgggca aggtgctgct cgagaagctg ctgcgatctt gccccaaggt gaaggccgtg 120
tacgtgctgg tgcgacacaa ggccggacag acccctgagg ctcgaatcga ggaaatcacc 180
aactgcaagc tgttcgaccg actgcgagat gagcagcccg acttcaaggc caagatcatc 240
gtgatcacct ctgagctgac ccagcctgag ctggacctgt ctgagcccat caaggaaaag 300
ctgatcgagc gaatcaacat catcttccac tgcgccgcca ccgtgcgatt caacgagact 360
ctccgagatg ccgtgcagct gaacgtgacc gctactcagc agctcctgtt cctggctcag 420
cgaatgaaga acctggaagt gttcatgcac gtgtctaccg cctacgccta ctgcaaccga 480
aagcagatcg aagagatcgt gtaccctcct ccagtggacc ccaagaagct gattgactct 540
ctcgagtgga tggacgacgg cctggtgaac gacatcaccc ctaagctcat cggcgaccga 600
cctaacacct acacttacac caaggctctg gccgagtacg tggtgcagca agagggcgcc 660
aagctgaaca ccgccatcat tcgaccctct atcgtgggcg cctcttggaa ggaacccttt 720
cctggctgga tcgacaactt caacggcccc tctggcctgt tcattgccgc cggaaagggc 780
atcctgcgaa ccatgcgagc ctctaactct gccgtggccg acctggtgcc tgtggacgtg 840
gtggtgaaca ccactctggc cgctgcctgg tactctggcg tgaaccgacc tcgaaacgtg 900
atgatctaca actgcaccac cggcggcact aaccccttcc actggggcga agtgggctac 960
cacatcaacc tgaacttcaa gatcaaccct ctcgagaacg ccgtgcgaca ccccaactgt 1020
tctctgcagt ctaaccctct gctccatcag tactggaccg ccgtgtctca caccatgcct 1080
gcctttctgc tggacctcct gctgcgactg accggacaca agccctggat gatgaagacc 1140
atcactcgac tgcacaaggc catgatgctc ctcgagtact tcacctccaa ctcttggatc 1200
tggaacaccg agaacatgac catgctgatg aaccagctga accccgagga caagaagacc 1260
ttcaacttcg acgtgcgaca gctgcactgg gctgagtaca tggaaaacta ctgcatgggc 1320
accaagaagt acgtcctgaa cgaggaaatg tctggactgc ccgctgccag aaagcacctg 1380
aacaagctgc gaaacatccg atacggcttc aacaccgtgc tggtcatcct gatctggcga 1440
atcttcattg cccgatctca gatggcccga aacatctggt acttcgtggt gtctctgtgc 1500
tacaagttcc tgtcttactt ccgagcctct tctaccatgc gatactctaa gctgtag 1557
<210> 8
<211> 515
<212> PRT
<213> 仓鸮(Tyto alba)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(515)
<223> 仓鸮脂肪酰基还原酶(NP_001289627)
<400> 8
Met Val Ser Ile Pro Glu Tyr Tyr Glu Gly Lys Asn Ile Leu Leu Thr
1 5 10 15
Gly Ala Thr Gly Phe Met Gly Lys Val Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg
20 25 30
Ser Cys Pro Lys Val Lys Ala Val Tyr Val Leu Val Arg His Lys Ala
35 40 45
Gly Gln Thr Pro Glu Ala Arg Ile Glu Glu Ile Thr Asn Cys Lys Leu
50 55 60
Phe Asp Arg Leu Arg Asp Glu Gln Pro Asp Phe Lys Ala Lys Ile Ile
65 70 75 80
Val Ile Thr Ser Glu Leu Thr Gln Pro Glu Leu Asp Leu Ser Glu Pro
85 90 95
Ile Lys Glu Lys Leu Ile Glu Arg Ile Asn Ile Ile Phe His Cys Ala
100 105 110
Ala Thr Val Arg Phe Asn Glu Thr Leu Arg Asp Ala Val Gln Leu Asn
115 120 125
Val Thr Ala Thr Gln Gln Leu Leu Phe Leu Ala Gln Arg Met Lys Asn
130 135 140
Leu Glu Val Phe Met His Val Ser Thr Ala Tyr Ala Tyr Cys Asn Arg
145 150 155 160
Lys Gln Ile Glu Glu Ile Val Tyr Pro Pro Pro Val Asp Pro Lys Lys
165 170 175
Leu Ile Asp Ser Leu Glu Trp Met Asp Asp Gly Leu Val Asn Asp Ile
180 185 190
Thr Pro Lys Leu Ile Gly Asp Arg Pro Asn Thr Tyr Thr Tyr Thr Lys
195 200 205
Ala Leu Ala Glu Tyr Val Val Gln Gln Glu Gly Ala Lys Leu Asn Thr
210 215 220
Ala Ile Ile Arg Pro Ser Ile Val Gly Ala Ser Trp Lys Glu Pro Phe
225 230 235 240
Pro Gly Trp Ile Asp Asn Phe Asn Gly Pro Ser Gly Leu Phe Ile Ala
245 250 255
Ala Gly Lys Gly Ile Leu Arg Thr Met Arg Ala Ser Asn Ser Ala Val
260 265 270
Ala Asp Leu Val Pro Val Asp Val Val Val Asn Thr Thr Leu Ala Ala
275 280 285
Ala Trp Tyr Ser Gly Val Asn Arg Pro Arg Asn Val Met Ile Tyr Asn
290 295 300
Cys Thr Thr Gly Gly Thr Asn Pro Phe His Trp Gly Glu Val Gly Tyr
305 310 315 320
His Ile Asn Leu Asn Phe Lys Ile Asn Pro Leu Glu Asn Ala Val Arg
325 330 335
His Pro Asn Cys Ser Leu Gln Ser Asn Pro Leu Leu His Gln Tyr Trp
340 345 350
Thr Ala Val Ser His Thr Met Pro Ala Phe Leu Leu Asp Leu Leu Leu
355 360 365
Arg Leu Thr Gly His Lys Pro Trp Met Met Lys Thr Ile Thr Arg Leu
370 375 380
His Lys Ala Met Met Leu Leu Glu Tyr Phe Thr Ser Asn Ser Trp Ile
385 390 395 400
Trp Asn Thr Glu Asn Met Thr Met Leu Met Asn Gln Leu Asn Pro Glu
405 410 415
Asp Lys Lys Thr Phe Asn Phe Asp Val Arg Gln Leu His Trp Ala Glu
420 425 430
Tyr Met Glu Asn Tyr Cys Met Gly Thr Lys Lys Tyr Val Leu Asn Glu
435 440 445
Glu Met Ser Gly Leu Pro Ala Ala Arg Lys His Leu Asn Lys Leu Arg
450 455 460
Asn Ile Arg Tyr Gly Phe Asn Thr Val Leu Val Ile Leu Ile Trp Arg
465 470 475 480
Ile Phe Ile Ala Arg Ser Gln Met Ala Arg Asn Ile Trp Tyr Phe Val
485 490 495
Val Ser Leu Cys Tyr Lys Phe Leu Ser Tyr Phe Arg Ala Ser Ser Thr
500 505 510
Met Arg Tyr
515
<210> 9
<211> 1377
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的黄地老虎脂肪酰基还原酶(AGP26039)；mRNA编码序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1377)
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的黄地老虎脂肪酰基还原酶(AGP26039)；mRNA编码序列
<400> 9
atgcccgtgc tgacctcgcg agaggacgag aagctgtctg tgcccgagtt ctacgccggc 60
aagtctatct tcgtgaccgg cggcaccgga ttcctcggca aggtgttcat tgagaagctg 120
ctctactgct gccccgacat cgacaagatc tacatgctga tccgagagaa gaagaacctg 180
tctatcgacg agcgaatgtc taagttcctg gacgaccctc tgttctctcg actgaaggaa 240
gaacgacccg gcgacctcga gaagatcgtg ctgatccccg gcgacatcac cgctcctaac 300
ctgggcctgt ctgccgagaa cgaacgaatc ctgctcgaga aggtgtccgt gatcatcaac 360
tctgccgcca ccgtgaagtt caacgagccc ctgcctatcg cctggaagat caacgtcgag 420
ggcacccgaa tgctgctggc cctgtctcga cgaatgaagc gaatcgaggt gtttatccac 480
atctctaccg cctactctaa cgcctcttct gaccgaatcg tggtggacga gattctgtac 540
cccgctcctg ccgacatgga ccaggtgtac cagctcgtga aggacggcgt gaccgaggaa 600
gagactgagc gactgctgaa cggactgccc aacacctaca ccttcaccaa ggctctgacc 660
gagcacctgg tggccgagca ccagacctac gtgcccacca tcatcattcg accctccgtg 720
gtggcctcta tcaaggacga gcccatccga ggctggctgt gcaactggtt cggcgccacc 780
ggcatctctg tgttcaccgc caagggcctg aaccgagtgc tgctcggaaa ggcctctaac 840
atcgtggacg tgatccccgt ggactacgtg gccaacctgg tgatcgtggc tggcgccaag 900
tctggcggcc agaagtctga cgagctgaag atctataact gctgttcttc tgactgcaac 960
cccgtgactc tgaagaagat catcaaggaa ttcaccgagg acaccatcaa gaacaagtct 1020
cacatcatgc ctctgcctgg ctggttcgtg ttcaccaagt acaagtggct gctgaccctc 1080
ctgaccatca tcttccagat gctgcccatg tacctggccg acgtgtaccg agtcctgacc 1140
ggcaagattc cccggtacat gaagctgcac cacctggtca ttcagacccg actgggaatc 1200
gacttcttca cctctcactc ttgggtgatg aagaccgacc gagtgcgaga gctgttcggc 1260
tctctgtctc tggccgagaa gcacatgttc ccttgcgacc cctcttccat cgactggacc 1320
gactacctgc agtcttactg ctacggcgtg cgacgattcc tggaaaagaa gaagtag 1377
<210> 10
<211> 458
<212> PRT
<213> 黄地老虎(Agrotis segetum)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(458)
<223> 黄地老虎脂肪酰基还原酶(AGP26039)
<400> 10
Met Pro Val Leu Thr Ser Arg Glu Asp Glu Lys Leu Ser Val Pro Glu
1 5 10 15
Phe Tyr Ala Gly Lys Ser Ile Phe Val Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu
20 25 30
Gly Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Cys Cys Pro Asp Ile Asp
35 40 45
Lys Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Asn Leu Ser Ile Asp Glu
50 55 60
Arg Met Ser Lys Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Ser Arg Leu Lys Glu
65 70 75 80
Glu Arg Pro Gly Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile
85 90 95
Thr Ala Pro Asn Leu Gly Leu Ser Ala Glu Asn Glu Arg Ile Leu Leu
100 105 110
Glu Lys Val Ser Val Ile Ile Asn Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn
115 120 125
Glu Pro Leu Pro Ile Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met
130 135 140
Leu Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His
145 150 155 160
Ile Ser Thr Ala Tyr Ser Asn Ala Ser Ser Asp Arg Ile Val Val Asp
165 170 175
Glu Ile Leu Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Met Asp Gln Val Tyr Gln Leu
180 185 190
Val Lys Asp Gly Val Thr Glu Glu Glu Thr Glu Arg Leu Leu Asn Gly
195 200 205
Leu Pro Asn Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val
210 215 220
Ala Glu His Gln Thr Tyr Val Pro Thr Ile Ile Ile Arg Pro Ser Val
225 230 235 240
Val Ala Ser Ile Lys Asp Glu Pro Ile Arg Gly Trp Leu Cys Asn Trp
245 250 255
Phe Gly Ala Thr Gly Ile Ser Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg
260 265 270
Val Leu Leu Gly Lys Ala Ser Asn Ile Val Asp Val Ile Pro Val Asp
275 280 285
Tyr Val Ala Asn Leu Val Ile Val Ala Gly Ala Lys Ser Gly Gly Gln
290 295 300
Lys Ser Asp Glu Leu Lys Ile Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Asp Cys Asn
305 310 315 320
Pro Val Thr Leu Lys Lys Ile Ile Lys Glu Phe Thr Glu Asp Thr Ile
325 330 335
Lys Asn Lys Ser His Ile Met Pro Leu Pro Gly Trp Phe Val Phe Thr
340 345 350
Lys Tyr Lys Trp Leu Leu Thr Leu Leu Thr Ile Ile Phe Gln Met Leu
355 360 365
Pro Met Tyr Leu Ala Asp Val Tyr Arg Val Leu Thr Gly Lys Ile Pro
370 375 380
Arg Tyr Met Lys Leu His His Leu Val Ile Gln Thr Arg Leu Gly Ile
385 390 395 400
Asp Phe Phe Thr Ser His Ser Trp Val Met Lys Thr Asp Arg Val Arg
405 410 415
Glu Leu Phe Gly Ser Leu Ser Leu Ala Glu Lys His Met Phe Pro Cys
420 425 430
Asp Pro Ser Ser Ile Asp Trp Thr Asp Tyr Leu Gln Ser Tyr Cys Tyr
435 440 445
Gly Val Arg Arg Phe Leu Glu Lys Lys Lys
450 455
<210> 11
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的棉铃虫脂肪酰基还原酶(ATJ44471)；mRNA编码序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1368)
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的棉铃虫脂肪酰基还原酶(ATJ44471)；mRNA编码序列
<400> 11
atggtggtcc tgacctctaa ggagactaag ccctccgtgg ccgagttcta cgctggcaag 60
tctgtcttca tcaccggcgg aaccggtttc ctgggcaagg tcttcattga gaagctgctg 120
tactcctgtc ccgacatcgg caacatctac atgctgatcc gagagaagaa gggactgtct 180
gtgtccgagc gaattaagca cttcctggac gaccccctgt tcacccgact gaaggagaag 240
cgacccgccg acctggagaa gatcgtgctg attcccggag acatcaccgc tcccgacctg 300
ggtattacct ctgagaacga gaagatgctg atcgagaagg tgtctgtcat cattcactcc 360
gccgctaccg tcaagttcaa cgagcccctg cccaccgcct ggaagatcaa cgtggaggga 420
acccgaatga tgctggctct gtctcgacga atgaagcgaa ttgaggtctt catccacatt 480
tccaccgcct acaccaacac caaccgagag gtggtggacg agatcctgta ccctgctcct 540
gctgacattg accaggtgca ccgatacgtc aaggacggta tctctgagga agagactgag 600
aagattctga acggccgacc caacacctac accttcacca aggccctgac cgagcacctg 660
gtggctgaga accaggctta cgtgcccacc atcattgtcc gaccctccgt ggtcgccgct 720
atcaaggacg agcccattaa gggatggctg ggtaactggt acggagctac cggactgacc 780
gtgttcaccg ctaagggtct gaaccgagtc atctacggcc actcttccaa catcgtggac 840
ctgattcccg tggactacgt cgccaacctg gtcattgccg ctggcgctaa gtcttccaag 900
tccaccgagc tgaaggtgta caactgttgc tcttccgcct gcaaccccat caccattgga 960
aagctgatgt ctatgttcgc cgaggacgct atcaagcaga agtcctacgc tatgcccctg 1020
cccggttggt acatcttcac caagtacaag tggctggtcc tgctgctgac cattctgttc 1080
caggtcatcc ccgcctacat taccgacctg taccgacacc tgatcggcaa gaacccccga 1140
tacattaagc tgcagtctct ggtcaaccag acccgatctt ccattgactt cttcacctct 1200
cactcctggg tcatgaaggc tgaccgagtc cgagagctgt tcgcctctct gtcccccgct 1260
gacaagtacc tgttcccctg tgaccccacc gacatcaact ggacccacta cattcaggac 1320
tactgctggg gagtgcgaca cttcctggag aagaagtcct acgagtag 1368
<210> 12
<211> 456
<212> PRT
<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(456)
<223> 棉铃虫脂肪酰基还原酶(ATJ44471)
<400> 12
Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly
20 25 30
Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Gly Asn
35 40 45
Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg
50 55 60
Ile Lys Gln Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr
85 90 95
Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Glu Asn Glu Lys Ile Leu Ile Glu
100 105 110
Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met
130 135 140
Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile
145 150 155 160
Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu
165 170 175
Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val His Gln Tyr Val Lys Asp
180 185 190
Gly Ile Ser Glu Glu Glu Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn
195 200 205
Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val Ala Glu Asn
210 215 220
Gln Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Val Arg Pro Ser Val Val Ala Ala
225 230 235 240
Ile Lys Asp Glu Pro Ile Lys Gly Trp Leu Gly Asn Trp Tyr Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Leu Thr Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg Val Ile Tyr
260 265 270
Gly His Ser Ser Asn Ile Val Asp Leu Ile Pro Val Asp Tyr Val Ala
275 280 285
Asn Leu Val Ile Ala Ala Gly Ala Lys Ser Ser Lys Ser Thr Asp Leu
290 295 300
Lys Val Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Ala Cys Asn Pro Ile Thr Ile Gly
305 310 315 320
Lys Leu Met Ser Met Phe Ala Glu Asp Ala Ile Lys Gln Lys Ser Tyr
325 330 335
Ala Met Pro Leu Pro Gly Trp Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Lys Trp Leu
340 345 350
Val Leu Leu Leu Thr Ile Leu Phe Gln Val Ile Pro Ala Tyr Ile Thr
355 360 365
Asp Leu Tyr Arg His Leu Ile Gly Lys Asn Pro Arg Tyr Ile Lys Leu
370 375 380
Gln Ser Leu Val Asn Gln Thr Arg Ser Ser Ile Asp Phe Phe Thr Ser
385 390 395 400
His Ser Trp Val Met Lys Ala Asp Arg Val Arg Glu Leu Phe Ala Ser
405 410 415
Leu Ser Pro Ala Asp Lys Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Pro Thr Asp Ile
420 425 430
Asn Trp Thr His Tyr Ile Gln Asp Tyr Cys Trp Gly Val Arg His Phe
435 440 445
Leu Glu Lys Lys Thr Thr Asn Lys
450 455
<210> 13
<211> 915
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(915)
<223> 解脂耶氏酵母脂肪酸延伸酶1(YALI0_F06754g)
<400> 13
atgctctcgt caatctcgcc cgacctatac tcgtccttct cgttcaaaaa ctcgctcgcc 60
gaggccatgc cctccgtgcc acacgaactc atcaactcaa aaacactctc atggatgtac 120
aatgcctctc tggacattcg ggttcctctg actatcggaa ccatctacgc cgtctccgtg 180
cacctgacca actcatctga acgaatcaag aaacgccagc ccattgcctt tgccaagacc 240
gcactcttca agtggctctg tgtcctccac aatgcaggtc tgtgtctcta ctcagcatgg 300
acctttgtcg gtatcctcaa cgccgtcaaa cacgcctacc aaatcacagg agacagctcc 360
gcccccttct ccttcaacac cctctgggga tcgttttgtt cacgtgactc cctctgggtc 420
accggcctca actactacgg atactggttc tatctgtcca aattctacga agtggtggac 480
accatgatca tcctcgcaaa gggaaaaccg tcctcaatgc tccagacata ccaccacacc 540
ggcgccatgt tctccatgtg ggccggcatc cgattcgcct ctccccccat ctggatcttt 600
gtggttttca actccctcat ccacacaatc atgtactttt actacaccct caccaccctc 660
aagatcaagg ttcccaagat cctcaaggca tctctgacca ccgcccagat cacccagatt 720
gtcggaggtg gcatcctggc tgcctcccac gcctttattt attacaagga ccaccagact 780
gagaccgtct gttcttgtct cactacccag ggtcagtttt tcgctctcgc cgtcaatgtc 840
atctatctga gtcctctggc ctatctcttt attgccttct ggattcgatc ttacttgaag 900
gccaagtcca actag 915
<210> 14
<211> 304
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(304)
<223> 解脂耶氏酵母脂肪酸延伸酶1(XP_505094)
<400> 14
Met Leu Ser Ser Ile Ser Pro Asp Leu Tyr Ser Ser Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Asn Ser Leu Ala Glu Ala Met Pro Ser Val Pro His Glu Leu Ile Asn
20 25 30
Ser Lys Thr Leu Ser Trp Met Tyr Asn Ala Ser Leu Asp Ile Arg Val
35 40 45
Pro Leu Thr Ile Gly Thr Ile Tyr Ala Val Ser Val His Leu Thr Asn
50 55 60
Ser Ser Glu Arg Ile Lys Lys Arg Gln Pro Ile Ala Phe Ala Lys Thr
65 70 75 80
Ala Leu Phe Lys Trp Leu Cys Val Leu His Asn Ala Gly Leu Cys Leu
85 90 95
Tyr Ser Ala Trp Thr Phe Val Gly Ile Leu Asn Ala Val Lys His Ala
100 105 110
Tyr Gln Ile Thr Gly Asp Ser Ser Ala Pro Phe Ser Phe Asn Thr Leu
115 120 125
Trp Gly Ser Phe Cys Ser Arg Asp Ser Leu Trp Val Thr Gly Leu Asn
130 135 140
Tyr Tyr Gly Tyr Trp Phe Tyr Leu Ser Lys Phe Tyr Glu Val Val Asp
145 150 155 160
Thr Met Ile Ile Leu Ala Lys Gly Lys Pro Ser Ser Met Leu Gln Thr
165 170 175
Tyr His His Thr Gly Ala Met Phe Ser Met Trp Ala Gly Ile Arg Phe
180 185 190
Ala Ser Pro Pro Ile Trp Ile Phe Val Val Phe Asn Ser Leu Ile His
195 200 205
Thr Ile Met Tyr Phe Tyr Tyr Thr Leu Thr Thr Leu Lys Ile Lys Val
210 215 220
Pro Lys Ile Leu Lys Ala Ser Leu Thr Thr Ala Gln Ile Thr Gln Ile
225 230 235 240
Val Gly Gly Gly Ile Leu Ala Ala Ser His Ala Phe Ile Tyr Tyr Lys
245 250 255
Asp His Gln Thr Glu Thr Val Cys Ser Cys Leu Thr Thr Gln Gly Gln
260 265 270
Phe Phe Ala Leu Ala Val Asn Val Ile Tyr Leu Ser Pro Leu Ala Tyr
275 280 285
Leu Phe Ile Ala Phe Trp Ile Arg Ser Tyr Leu Lys Ala Lys Ser Asn
290 295 300
<210> 15
<211> 6337
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(6337)
<223> 解脂耶氏酵母脂肪酸合酶1(YALI0_B15059g)
<400> 15
atggtgagta tcgaccgaag caggatgatc tctacatgag atatgcaacg cgtacgtgat 60
tcaattgatc ctaacacagt accctaccac aggtgtcaac accccccaga gcgccgcctc 120
attaagacca ctggtgctat cgcacggcca aactgagcac tcgctgctgg tgcccacctc 180
tctgtacatc aactgcacca cgctccgaga ccagttctac gcctctctac ctccagccac 240
tgaagacaag gccgacgatg atgagccctc ctcctccaca gagcttctag ctgccttcct 300
gggatttact gccaagaccg tcgaggaaga gcccggacca tacgacgacg ttctctctct 360
cgtgcttaac gagtttgaga cccggtactt gcgaggtaac gacatccacg ctgtggcctc 420
ctccttgtta caagacgagg acgtgcctac caccgttggt aagatcaaga gggtgattcg 480
agcctactac gccgcacgaa ttgcctgcaa ccggcccatc aaggcccact cgtcggctct 540
gttccgagcc gcatctgaag actcggacaa cgtctctctg tacgccatct tcggtggcca 600
gggaaacacc gaggactact ttgaggaact gcgggagatt tacgacatct accaggggct 660
ggtcggcgac ttcattcggg aatgtggagc ccagcttctg gcgctgtctc gagatcacat 720
tgctgctgag aaaatttata ccaagggctt tgatatcgtc aagtggctgg aacaccccga 780
gaccatcccc gactttgagt acctaatttc tgctcccatc tctgtaccca tcatcggtgt 840
tatccagctg gcacactacg ctgtcacctg tcgagttttg ggtcttaatc ctggccaggt 900
ccgagacaac ctcaagggtg ccactggcca ttctcagggt ctgatcaccg caattgccat 960
ctctgcctcc gactcgtggg acgagttcta taactctgcc tctcgaattc tcaagatctt 1020
cttcttcatc ggtgtccgtg tccaacaggc ttacccctcc actttcctgc ctccctccac 1080
tctggaagac agtgtcaagc agggtgaggg caagcccact cccatgctgt ccatccgaga 1140
cctgtctctc aaccaggttc aggagttcgt cgatgccacc aacttgcatt tgcccgaaga 1200
taagcagatc gtcgtgtctc tgatcaatgg tcctcgaaac gttgtcgtta ctggcccccc 1260
ccagtctctg tatggtctgt gtcttgtgct tcgaaaacag aaggccgaga ccggtctgga 1320
ccaaagccga gtgccccaca gtcagcgaaa gctcaaattc acacatcgtt tcctgcccat 1380
cacctctcct ttccactcgt acctgctgga gaagagcacg gatctgatca tcaacgacct 1440
ggagtcttcc ggtgtggagt ttgtgtcctc cgagctcaag gtgcctgttt acgacacctt 1500
tgatggctcc gtgctgtctc agctacccaa gggtatcgtc agccgtctgg tcaacctcat 1560
cactcatctg cccgtcaagt gggagaaggc cactcagttt caggcctccc acattgtgga 1620
ctttggtccc ggtggcgctt ctggtcttgg tctgttgacc cacaagaaca aggatggaac 1680
tggagtgcga actattcttg ctggtgtcat tgaccagccc ctcgagttcg gcttcaagca 1740
ggagctgttt gaccgacagg agtcgtccat tgtttttgct caaaactggg ccaaggagtt 1800
ttctcccaag ctcgtcaaga tctcctccac caacgaggtc tatgtcgaca ccaaattctc 1860
tcgtctgact ggccgagccc ccatcatggt cgctggtatg acccctacca ctgtcaaccc 1920
caaatttgtg gctgccacta tgaactccgg ctaccacatc gagcttggtg gtggaggcta 1980
ctttgccccc ggtatgatga ccaaggccct tgaacacatt gagaagaaca ctcctcccgg 2040
atccggtatc accatcaacc tgatctacgt caaccctcga ctgattcaat ggggtattcc 2100
tctgattcag gagcttcgac agaagggttt ccccattgaa ggtctcacca ttggtgccgg 2160
tgtgccctct ctggaggttg ctaacgagtg gattcaggat ctgggcgtca agcacatcgc 2220
cttcaagcct ggatccatcg aggccatctc ctcggtgatt cgaatcgcca aggccaaccc 2280
agactttcct atcatccttc agtggaccgg aggtcgagga ggaggacatc attcgtttga 2340
ggacttccac gctcccattc tgcagatgta ctccaagatc cgacgatgca gcaacattgt 2400
gctgattgcc ggatctggtt tcggtgcttc taccgactcc tacccatacc tcaccggttc 2460
atggtcccga gactttgact accctcccat gccctttgac ggtatcctgg ttggttctcg 2520
agtcatggtt gccaaggagg ctttcacttc tctgggagcc aagcagctca ttgttgactc 2580
tccgggtgtt gaggattctg agtgggagaa aacctacgac aagcccactg gtggcgtcat 2640
caccgttctc tccgagatgg gtgagcctat ccacaagctc gccactcgag gtgtgctctt 2700
ctggcacgag atggacaaga ccgtgttctc cctgcccaag aagaagcgtc tggaagtgct 2760
caagtccaag cgagcctaca tcatcaagcg tctcaacgac gacttccaga agacttggtt 2820
tgccaagaac gcccagggac aggtgtgtga tctcgaagac ctcacctacg cggaggtcat 2880
ccagcgactt gttgacctca tgtacgtgaa gaaggaaagc cgatggatcg atgtcactct 2940
ccgaaatctt gccggcactt tcattcgacg agttgaggag cgattctcca ccgagacagg 3000
tgcctcttct gtgttgcaga gcttttccga gctggattcc gagcccgaga aggttgtcga 3060
gcgggtgttt gagctcttcc ctgcctctac tacccagatc atcaacgctc aagacaagga 3120
ccacttcctc atgctgtgtc tcaaccccat gcagaagccc gtgcccttca tccctgttct 3180
ggatgacaac tttgagttct tcttcaagaa ggactctctg tggcagtgcg aggacctcgc 3240
agctgttgtg gacgaagacg ttggacgaat ctgtattctt cagggtcccg ttgctgtcaa 3300
gcactccaag attgtcaacg agcccgtcaa ggagattctc gactccatgc acgaaggtca 3360
catcaagcag ctgcttgagg atggcgagta cgctggcaac atggccaaca tcccccaggt 3420
cgaatgcttt ggtggaaagc ctgctcagaa cttcggtgac gttgctctcg actctgtcat 3480
ggttcttgat gacctcaaca agaccgtgtt caagattgag accggcacct ctgctctgcc 3540
ttctgctgca gattggttct ctctgctggc cggtgacaag aactcttggc gacaggtctt 3600
cctgtccact gacaccattg tgcagaccac caagatgatc tccaaccctc tgcatcgact 3660
tctggagccc atcgcaggtt tgcaggttga gattgagcac cctgatgagc ccgagaacac 3720
cgtcatctct gctttcgagc ccatcaacgg caaggtcacc aaggtgctgg agctgcgaaa 3780
gggtgccgga gacgtcattt cgctgcagct gatcgaagcg cgtggcgttg accgagtccc 3840
cgttgctctt cctctggaat tcaagtacca gccccagatt ggctacgctc ccattgttga 3900
ggttatgacc gacaggaaca cccgaatcaa ggagttctac tggaagctgt ggtttggcca 3960
ggactccaag tttgagattg acaccgacat caccgaggaa atcattggcg atgacgttac 4020
catctctggc aaggccattg ccgactttgt ccacgctgtt ggcaacaagg gcgaggcctt 4080
tgttggtcga tctacctctg ctggtactgt cttcgctccc atggactttg ccattgtttt 4140
gggctggaag gccattatca aggcaatctt tccccgagca attgatgctg acattctgcg 4200
tctggtacat ctgtccaacg gcttcaagat gatgcctggc gccgaccctc tgcagatggg 4260
tgatgttgtt tccgccactg ccaagatcga cactgtcaag aactccgcta ccggcaagac 4320
tgttgctgtt cgaggtcttc tcacccgaga cggcaagcct gtcatggagg ttgtttccga 4380
attcttctac cgaggcgaat tctccgactt ccagaacact tttgagcgac gagaggaggt 4440
acccatgcaa ctgaccctca aggacgccaa ggccgtggcc attctctgct ccaaggagtg 4500
gtttgagtac aatggcgacg ataccaagga cctcgagggc aagaccattg tgttccgaaa 4560
ctcgtcattc atcaagtaca agaatgagac cgtcttctct tctgtgcaca ccaccggtaa 4620
ggtattgatg gagctgccct ccaaggaggt cattgagatt gccactgtta actaccaggc 4680
tggcgagtct catggcaatc ccgtcattga ttacctggag cgaaatggaa ccaccattga 4740
gcagcctgtt gagtttgaga agcccatccc tctgtccaag gcagatgatc ttctctcctt 4800
caaggctcct tcttccaacg agccctacgc tggtgtgtcc ggtgactaca atcccatcca 4860
cgtgtctcga gcctttgctt cctatgcatc ccttcctgga accatcaccc acggtatgta 4920
ctcttctgct gctgttcgat ctctgattga ggtctgggct gccgagaaca atgtgtctcg 4980
agttcgagcc ttctcctgtc agttccaggg catggttttg cccaacgacg agattgtgac 5040
tcgactggag cacgttggca tgatcaacgg tcgaaagatc atcaaggtta cctccaccaa 5100
ccgggagacc gaggctgttg ttctgtctgg cgaggctgag gtcgagcagc ccatctccac 5160
ctttgtcttt actggccagg gctctcagga gcagggcatg ggtatggacc tgtacgcctc 5220
ttccgaggtg gccaagaagg tctgggacaa ggctgacgag cacttcttgc agaactacgg 5280
tttctccatc atcaagatcg ttgtggagaa ccccaaggag ctggatattc attttggagg 5340
ccccaagggt aagaagatcc gagacaacta tatctctatg atgttcgaga ccattgatga 5400
gaagaccggc aacctcattt ccgagaagat cttcaaggag attgacgaga ccaccgactc 5460
tttcaccttc aagtccccca ccggtctgct ttctgctacc cagttcactc agcccgctct 5520
gaccctcatg gagaaggcgt cctttgagga catgaaggct aagggtcttg tccccgtgga 5580
tgcaaccttt gctggtcact cccttggtga gtactccgct cttgcttctc ttggtgatgt 5640
catgcccatc gagtctcttg ttgatgtcgt cttctaccga ggtatgacta tgcaggttgc 5700
tgttccccga gatgcccagg gtcggtccaa ttacggtatg tgcgctgtca acccctctcg 5760
aatctctacc accttcaacg acgctgctct tcggtttgtc gttgaccaca tctccgagca 5820
gaccaagtgg ctgcttgaga ttgtcaacta caacgttgag aactctcagt acgtgactgc 5880
cggtgacctg cgagctctcg acaccctcac caatgtgctc aacgtgctca aactcgagaa 5940
gatcaacatt gacaagctgc tcgagtctct gcctctggag aaggtcaagg agcacctttc 6000
tgagatcgtc accgaggtgg ccaagaagtc cgttgctaag cctcagccca ttgagctgga 6060
acgaggcttt gccgtgatcc ctctcaaggg catctctgtg cctttccact cttcgtacct 6120
gcgaaatggt gtcaagccct tccaaaactt cctggtgaag aaggtgccca agaacgctgt 6180
caaacctgcc aacctcattg gcaagtacat ccccaacctc actgccaagc cctttgagat 6240
caccaaggag tactttgaag aggtttacaa gctcaccggt tccgagaagg tcaagagcat 6300
catcaacaac tgggagtctt atgagtccaa gcagtaa 6337
<210> 16
<211> 2086
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2086)
<223> 解脂耶氏酵母脂肪酸合酶1(XP_500912)
<400> 16
Met Tyr Pro Thr Thr Gly Val Asn Thr Pro Gln Ser Ala Ala Ser Leu
1 5 10 15
Arg Pro Leu Val Leu Ser His Gly Gln Thr Glu His Ser Leu Leu Val
20 25 30
Pro Thr Ser Leu Tyr Ile Asn Cys Thr Thr Leu Arg Asp Gln Phe Tyr
35 40 45
Ala Ser Leu Pro Pro Ala Thr Glu Asp Lys Ala Asp Asp Asp Glu Pro
50 55 60
Ser Ser Ser Thr Glu Leu Leu Ala Ala Phe Leu Gly Phe Thr Ala Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Glu Glu Pro Gly Pro Tyr Asp Asp Val Leu Ser Leu Val
85 90 95
Leu Asn Glu Phe Glu Thr Arg Tyr Leu Arg Gly Asn Asp Ile His Ala
100 105 110
Val Ala Ser Ser Leu Leu Gln Asp Glu Asp Val Pro Thr Thr Val Gly
115 120 125
Lys Ile Lys Arg Val Ile Arg Ala Tyr Tyr Ala Ala Arg Ile Ala Cys
130 135 140
Asn Arg Pro Ile Lys Ala His Ser Ser Ala Leu Phe Arg Ala Ala Ser
145 150 155 160
Glu Asp Ser Asp Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Phe Gly Gly Gln Gly
165 170 175
Asn Thr Glu Asp Tyr Phe Glu Glu Leu Arg Glu Ile Tyr Asp Ile Tyr
180 185 190
Gln Gly Leu Val Gly Asp Phe Ile Arg Glu Cys Gly Ala Gln Leu Leu
195 200 205
Ala Leu Ser Arg Asp His Ile Ala Ala Glu Lys Ile Tyr Thr Lys Gly
210 215 220
Phe Asp Ile Val Lys Trp Leu Glu His Pro Glu Thr Ile Pro Asp Phe
225 230 235 240
Glu Tyr Leu Ile Ser Ala Pro Ile Ser Val Pro Ile Ile Gly Val Ile
245 250 255
Gln Leu Ala His Tyr Ala Val Thr Cys Arg Val Leu Gly Leu Asn Pro
260 265 270
Gly Gln Val Arg Asp Asn Leu Lys Gly Ala Thr Gly His Ser Gln Gly
275 280 285
Leu Ile Thr Ala Ile Ala Ile Ser Ala Ser Asp Ser Trp Asp Glu Phe
290 295 300
Tyr Asn Ser Ala Ser Arg Ile Leu Lys Ile Phe Phe Phe Ile Gly Val
305 310 315 320
Arg Val Gln Gln Ala Tyr Pro Ser Thr Phe Leu Pro Pro Ser Thr Leu
325 330 335
Glu Asp Ser Val Lys Gln Gly Glu Gly Lys Pro Thr Pro Met Leu Ser
340 345 350
Ile Arg Asp Leu Ser Leu Asn Gln Val Gln Glu Phe Val Asp Ala Thr
355 360 365
Asn Leu His Leu Pro Glu Asp Lys Gln Ile Val Val Ser Leu Ile Asn
370 375 380
Gly Pro Arg Asn Val Val Val Thr Gly Pro Pro Gln Ser Leu Tyr Gly
385 390 395 400
Leu Cys Leu Val Leu Arg Lys Gln Lys Ala Glu Thr Gly Leu Asp Gln
405 410 415
Ser Arg Val Pro His Ser Gln Arg Lys Leu Lys Phe Thr His Arg Phe
420 425 430
Leu Pro Ile Thr Ser Pro Phe His Ser Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Thr
435 440 445
Asp Leu Ile Ile Asn Asp Leu Glu Ser Ser Gly Val Glu Phe Val Ser
450 455 460
Ser Glu Leu Lys Val Pro Val Tyr Asp Thr Phe Asp Gly Ser Val Leu
465 470 475 480
Ser Gln Leu Pro Lys Gly Ile Val Ser Arg Leu Val Asn Leu Ile Thr
485 490 495
His Leu Pro Val Lys Trp Glu Lys Ala Thr Gln Phe Gln Ala Ser His
500 505 510
Ile Val Asp Phe Gly Pro Gly Gly Ala Ser Gly Leu Gly Leu Leu Thr
515 520 525
His Lys Asn Lys Asp Gly Thr Gly Val Arg Thr Ile Leu Ala Gly Val
530 535 540
Ile Asp Gln Pro Leu Glu Phe Gly Phe Lys Gln Glu Leu Phe Asp Arg
545 550 555 560
Gln Glu Ser Ser Ile Val Phe Ala Gln Asn Trp Ala Lys Glu Phe Ser
565 570 575
Pro Lys Leu Val Lys Ile Ser Ser Thr Asn Glu Val Tyr Val Asp Thr
580 585 590
Lys Phe Ser Arg Leu Thr Gly Arg Ala Pro Ile Met Val Ala Gly Met
595 600 605
Thr Pro Thr Thr Val Asn Pro Lys Phe Val Ala Ala Thr Met Asn Ser
610 615 620
Gly Tyr His Ile Glu Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Phe Ala Pro Gly Met
625 630 635 640
Met Thr Lys Ala Leu Glu His Ile Glu Lys Asn Thr Pro Pro Gly Ser
645 650 655
Gly Ile Thr Ile Asn Leu Ile Tyr Val Asn Pro Arg Leu Ile Gln Trp
660 665 670
Gly Ile Pro Leu Ile Gln Glu Leu Arg Gln Lys Gly Phe Pro Ile Glu
675 680 685
Gly Leu Thr Ile Gly Ala Gly Val Pro Ser Leu Glu Val Ala Asn Glu
690 695 700
Trp Ile Gln Asp Leu Gly Val Lys His Ile Ala Phe Lys Pro Gly Ser
705 710 715 720
Ile Glu Ala Ile Ser Ser Val Ile Arg Ile Ala Lys Ala Asn Pro Asp
725 730 735
Phe Pro Ile Ile Leu Gln Trp Thr Gly Gly Arg Gly Gly Gly His His
740 745 750
Ser Phe Glu Asp Phe His Ala Pro Ile Leu Gln Met Tyr Ser Lys Ile
755 760 765
Arg Arg Cys Ser Asn Ile Val Leu Ile Ala Gly Ser Gly Phe Gly Ala
770 775 780
Ser Thr Asp Ser Tyr Pro Tyr Leu Thr Gly Ser Trp Ser Arg Asp Phe
785 790 795 800
Asp Tyr Pro Pro Met Pro Phe Asp Gly Ile Leu Val Gly Ser Arg Val
805 810 815
Met Val Ala Lys Glu Ala Phe Thr Ser Leu Gly Ala Lys Gln Leu Ile
820 825 830
Val Asp Ser Pro Gly Val Glu Asp Ser Glu Trp Glu Lys Thr Tyr Asp
835 840 845
Lys Pro Thr Gly Gly Val Ile Thr Val Leu Ser Glu Met Gly Glu Pro
850 855 860
Ile His Lys Leu Ala Thr Arg Gly Val Leu Phe Trp His Glu Met Asp
865 870 875 880
Lys Thr Val Phe Ser Leu Pro Lys Lys Lys Arg Leu Glu Val Leu Lys
885 890 895
Ser Lys Arg Ala Tyr Ile Ile Lys Arg Leu Asn Asp Asp Phe Gln Lys
900 905 910
Thr Trp Phe Ala Lys Asn Ala Gln Gly Gln Val Cys Asp Leu Glu Asp
915 920 925
Leu Thr Tyr Ala Glu Val Ile Gln Arg Leu Val Asp Leu Met Tyr Val
930 935 940
Lys Lys Glu Ser Arg Trp Ile Asp Val Thr Leu Arg Asn Leu Ala Gly
945 950 955 960
Thr Phe Ile Arg Arg Val Glu Glu Arg Phe Ser Thr Glu Thr Gly Ala
965 970 975
Ser Ser Val Leu Gln Ser Phe Ser Glu Leu Asp Ser Glu Pro Glu Lys
980 985 990
Val Val Glu Arg Val Phe Glu Leu Phe Pro Ala Ser Thr Thr Gln Ile
995 1000 1005
Ile Asn Ala Gln Asp Lys Asp His Phe Leu Met Leu Cys Leu Asn
1010 1015 1020
Pro Met Gln Lys Pro Val Pro Phe Ile Pro Val Leu Asp Asp Asn
1025 1030 1035
Phe Glu Phe Phe Phe Lys Lys Asp Ser Leu Trp Gln Cys Glu Asp
1040 1045 1050
Leu Ala Ala Val Val Asp Glu Asp Val Gly Arg Ile Cys Ile Leu
1055 1060 1065
Gln Gly Pro Val Ala Val Lys His Ser Lys Ile Val Asn Glu Pro
1070 1075 1080
Val Lys Glu Ile Leu Asp Ser Met His Glu Gly His Ile Lys Gln
1085 1090 1095
Leu Leu Glu Asp Gly Glu Tyr Ala Gly Asn Met Ala Asn Ile Pro
1100 1105 1110
Gln Val Glu Cys Phe Gly Gly Lys Pro Ala Gln Asn Phe Gly Asp
1115 1120 1125
Val Ala Leu Asp Ser Val Met Val Leu Asp Asp Leu Asn Lys Thr
1130 1135 1140
Val Phe Lys Ile Glu Thr Gly Thr Ser Ala Leu Pro Ser Ala Ala
1145 1150 1155
Asp Trp Phe Ser Leu Leu Ala Gly Asp Lys Asn Ser Trp Arg Gln
1160 1165 1170
Val Phe Leu Ser Thr Asp Thr Ile Val Gln Thr Thr Lys Met Ile
1175 1180 1185
Ser Asn Pro Leu His Arg Leu Leu Glu Pro Ile Ala Gly Leu Gln
1190 1195 1200
Val Glu Ile Glu His Pro Asp Glu Pro Glu Asn Thr Val Ile Ser
1205 1210 1215
Ala Phe Glu Pro Ile Asn Gly Lys Val Thr Lys Val Leu Glu Leu
1220 1225 1230
Arg Lys Gly Ala Gly Asp Val Ile Ser Leu Gln Leu Ile Glu Ala
1235 1240 1245
Arg Gly Val Asp Arg Val Pro Val Ala Leu Pro Leu Glu Phe Lys
1250 1255 1260
Tyr Gln Pro Gln Ile Gly Tyr Ala Pro Ile Val Glu Val Met Thr
1265 1270 1275
Asp Arg Asn Thr Arg Ile Lys Glu Phe Tyr Trp Lys Leu Trp Phe
1280 1285 1290
Gly Gln Asp Ser Lys Phe Glu Ile Asp Thr Asp Ile Thr Glu Glu
1295 1300 1305
Ile Ile Gly Asp Asp Val Thr Ile Ser Gly Lys Ala Ile Ala Asp
1310 1315 1320
Phe Val His Ala Val Gly Asn Lys Gly Glu Ala Phe Val Gly Arg
1325 1330 1335
Ser Thr Ser Ala Gly Thr Val Phe Ala Pro Met Asp Phe Ala Ile
1340 1345 1350
Val Leu Gly Trp Lys Ala Ile Ile Lys Ala Ile Phe Pro Arg Ala
1355 1360 1365
Ile Asp Ala Asp Ile Leu Arg Leu Val His Leu Ser Asn Gly Phe
1370 1375 1380
Lys Met Met Pro Gly Ala Asp Pro Leu Gln Met Gly Asp Val Val
1385 1390 1395
Ser Ala Thr Ala Lys Ile Asp Thr Val Lys Asn Ser Ala Thr Gly
1400 1405 1410
Lys Thr Val Ala Val Arg Gly Leu Leu Thr Arg Asp Gly Lys Pro
1415 1420 1425
Val Met Glu Val Val Ser Glu Phe Phe Tyr Arg Gly Glu Phe Ser
1430 1435 1440
Asp Phe Gln Asn Thr Phe Glu Arg Arg Glu Glu Val Pro Met Gln
1445 1450 1455
Leu Thr Leu Lys Asp Ala Lys Ala Val Ala Ile Leu Cys Ser Lys
1460 1465 1470
Glu Trp Phe Glu Tyr Asn Gly Asp Asp Thr Lys Asp Leu Glu Gly
1475 1480 1485
Lys Thr Ile Val Phe Arg Asn Ser Ser Phe Ile Lys Tyr Lys Asn
1490 1495 1500
Glu Thr Val Phe Ser Ser Val His Thr Thr Gly Lys Val Leu Met
1505 1510 1515
Glu Leu Pro Ser Lys Glu Val Ile Glu Ile Ala Thr Val Asn Tyr
1520 1525 1530
Gln Ala Gly Glu Ser His Gly Asn Pro Val Ile Asp Tyr Leu Glu
1535 1540 1545
Arg Asn Gly Thr Thr Ile Glu Gln Pro Val Glu Phe Glu Lys Pro
1550 1555 1560
Ile Pro Leu Ser Lys Ala Asp Asp Leu Leu Ser Phe Lys Ala Pro
1565 1570 1575
Ser Ser Asn Glu Pro Tyr Ala Gly Val Ser Gly Asp Tyr Asn Pro
1580 1585 1590
Ile His Val Ser Arg Ala Phe Ala Ser Tyr Ala Ser Leu Pro Gly
1595 1600 1605
Thr Ile Thr His Gly Met Tyr Ser Ser Ala Ala Val Arg Ser Leu
1610 1615 1620
Ile Glu Val Trp Ala Ala Glu Asn Asn Val Ser Arg Val Arg Ala
1625 1630 1635
Phe Ser Cys Gln Phe Gln Gly Met Val Leu Pro Asn Asp Glu Ile
1640 1645 1650
Val Thr Arg Leu Glu His Val Gly Met Ile Asn Gly Arg Lys Ile
1655 1660 1665
Ile Lys Val Thr Ser Thr Asn Arg Glu Thr Glu Ala Val Val Leu
1670 1675 1680
Ser Gly Glu Ala Glu Val Glu Gln Pro Ile Ser Thr Phe Val Phe
1685 1690 1695
Thr Gly Gln Gly Ser Gln Glu Gln Gly Met Gly Met Asp Leu Tyr
1700 1705 1710
Ala Ser Ser Glu Val Ala Lys Lys Val Trp Asp Lys Ala Asp Glu
1715 1720 1725
His Phe Leu Gln Asn Tyr Gly Phe Ser Ile Ile Lys Ile Val Val
1730 1735 1740
Glu Asn Pro Lys Glu Leu Asp Ile His Phe Gly Gly Pro Lys Gly
1745 1750 1755
Lys Lys Ile Arg Asp Asn Tyr Ile Ser Met Met Phe Glu Thr Ile
1760 1765 1770
Asp Glu Lys Thr Gly Asn Leu Ile Ser Glu Lys Ile Phe Lys Glu
1775 1780 1785
Ile Asp Glu Thr Thr Asp Ser Phe Thr Phe Lys Ser Pro Thr Gly
1790 1795 1800
Leu Leu Ser Ala Thr Gln Phe Thr Gln Pro Ala Leu Thr Leu Met
1805 1810 1815
Glu Lys Ala Ser Phe Glu Asp Met Lys Ala Lys Gly Leu Val Pro
1820 1825 1830
Val Asp Ala Thr Phe Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Tyr Ser Ala
1835 1840 1845
Leu Ala Ser Leu Gly Asp Val Met Pro Ile Glu Ser Leu Val Asp
1850 1855 1860
Val Val Phe Tyr Arg Gly Met Thr Met Gln Val Ala Val Pro Arg
1865 1870 1875
Asp Ala Gln Gly Arg Ser Asn Tyr Gly Met Cys Ala Val Asn Pro
1880 1885 1890
Ser Arg Ile Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ala Ala Leu Arg Phe Val
1895 1900 1905
Val Asp His Ile Ser Glu Gln Thr Lys Trp Leu Leu Glu Ile Val
1910 1915 1920
Asn Tyr Asn Val Glu Asn Ser Gln Tyr Val Thr Ala Gly Asp Leu
1925 1930 1935
Arg Ala Leu Asp Thr Leu Thr Asn Val Leu Asn Val Leu Lys Leu
1940 1945 1950
Glu Lys Ile Asn Ile Asp Lys Leu Leu Glu Ser Leu Pro Leu Glu
1955 1960 1965
Lys Val Lys Glu His Leu Ser Glu Ile Val Thr Glu Val Ala Lys
1970 1975 1980
Lys Ser Val Ala Lys Pro Gln Pro Ile Glu Leu Glu Arg Gly Phe
1985 1990 1995
Ala Val Ile Pro Leu Lys Gly Ile Ser Val Pro Phe His Ser Ser
2000 2005 2010
Tyr Leu Arg Asn Gly Val Lys Pro Phe Gln Asn Phe Leu Val Lys
2015 2020 2025
Lys Val Pro Lys Asn Ala Val Lys Pro Ala Asn Leu Ile Gly Lys
2030 2035 2040
Tyr Ile Pro Asn Leu Thr Ala Lys Pro Phe Glu Ile Thr Lys Glu
2045 2050 2055
Tyr Phe Glu Glu Val Tyr Lys Leu Thr Gly Ser Glu Lys Val Lys
2060 2065 2070
Ser Ile Ile Asn Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Ser Lys Gln
2075 2080 2085
<210> 17
<211> 5947
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(5947)
<223> 解脂耶氏酵母脂肪酸合酶2(YALI0_B19382g)
<400> 17
agtgagtctt gaaatatggg atatgaggag gggtttgaag aggttgcaat cgataactca 60
cgacacggac gaaaaagaat aaggaccaac acgatctcca gacaaccaca gatcagcagt 120
cgaacccccc tcaacagcag acaaatgatg ttgtggaatt gcagtagatg atttcttctg 180
cgacgctagt attggctgtc ggcgacacta ttctctgaca gtgcccaatg gtctttttat 240
tgtgcaccaa ccgctgattt gtggctcagg ttttgtgacg gcgagagtca ttctcgtgat 300
gcatgggatg attggtctct ttgaagccga cagatcgaca tatttccaca cacagcaacg 360
acaatgttat cttatccatt gccattctaa cccagtgcac cccgaagtcg aacaagaact 420
cgcccacgtg ctcctgacgg agctgctggc ctaccaattt gcctcgcccg tgcgatggat 480
cgagacccag gacgtgctgt tcaagcagtt caatgtcgag cgagtcgtcg aagtcggccc 540
atccccaact ctcgccggca tggcccagcg aacccttaag tccaagtacg agtcatacga 600
cgctgctctg tctctgcagc gagagatcct gtgttactcc aaggaccaga aggacatcta 660
ctaccttgcc gatgaggccg atgaagcccc tgcccccgct gctggtggtg atgcccccgc 720
tgctcctgcc gctgccgctc ctgccgccgc tgccgctcct gctgccgctg ccgccccctc 780
tggccccgtt gccaaggttg aggacgcccc cgtcaaggcc caggagattc tccacgccct 840
ggtcgcccat aagctcaaga agacccccga gcaggtgccc ctgtccaagg ccatcaaaga 900
ccttgttggt ggtaagtcta ccatccagaa cgagattctc ggtgatctcg gaaaggaatt 960
tggtgccacc cctgagaagc ccgaggatac tccccttggc gagctggctg agtccttcca 1020
ggcctccttt gacggcaagc tcggtaagca gtcttcttct ctcattgccc gactcatgtc 1080
ctccaagatg cccggagggt tctctctcac ctctgctcga tcctacctcg acagcagatg 1140
gggcctggct gctggccgac aggactccgt tctgcttgtt gctctgatga acgaacccaa 1200
gaaccgactt ggctctgaag ccgaggccaa ggcctacctc gacgagcaga cccagaagta 1260
tgctgcttct gccggtctta acctgtctgc ccccgctggt ggtgccgagg gtggcaatgg 1320
cggtggcgcc gtcattgact ccgctgcctt tgacgctctc accaaggacc agcgatacct 1380
ggtccagcag caactcgagt tgtttgccaa ctacctgaag caggatctgc gacagggctc 1440
caaggtggct gctgcccaga aggaggccat ggatattctg caagctgaac tggatctttg 1500
gaactccgag cacggcgagg tctacgctga gggcatcaag cccgccttct ctgccctgaa 1560
ggcccgtgtc tacgactcgt actggaactg ggctcgacag gactcgctct ccatgtactt 1620
tgacattgtt ttcggtcgtc tctccaccgt tgaccgagag attatggcta agtgtatcca 1680
cctgatgaac cgaaccaacc acaacctgat cgactacatg cagtaccaca tggaccacgt 1740
ccccgttcac aagggagcca cctacgagct tgccaagcag ctcggtctgc agctcctcga 1800
gaactgtaag gagactctca ccgaggcccc cgtctacaag gatgtctctt accccactgg 1860
accccagacc accattgatg tcaagggtaa cattgtttac aacgaggtgc cccgacccaa 1920
tgtccgaaag ctcgagcagt atgtccacga gatggcctgt ggtggtgagc tgaccaagga 1980
cccctctttt gttggagaag gtgtccaggg cgagctcaag aagctgtact ctcagatctc 2040
tgctcttgcc aagacccaga ccggctctac cctcgacatc gaggctctgt actccgacct 2100
ggtcgctaag atctcccagg ccgaggacgc gtccaagcct gtcgttgaga acaaggctgt 2160
ttctgcctcc atcactcccg gcactctccc ttttctccac atcaagaaga agaccgaact 2220
tggtgcctgg aattacgaca gcgagaccac cgccacctac ctcgatggtc ttgaggttgc 2280
tgcccgtgat ggtctcactt tccagggcaa gactgctctg atcaccggtg ctggtgctgg 2340
ctccattggt gcctcaatcc tccagggtct catttccgga ggctgcaaag tcattgtcac 2400
aacctctcga tactcccgaa aggtgaccga gtactaccag tccctctaca ccaagttcgg 2460
tgctaagggt tccactctga ttgttgtccc cttcaaccaa ggctccaaga aggacgtgga 2520
cgagctggtg tcgttcatct acaacgaccc caagaacggc ggtcttggct gggatctgga 2580
ctttgttgtt ccctttgctg ctctgcccga gaacggtatt gagctggagc acattgactc 2640
aaagtccgag cttgcccatc gaatcatgct caccaacctc ctgcgtctgc ttggtaacgt 2700
caagaagcag aaagtggccc attcctacga gactcgaccc gcccaggtca tgctgcccct 2760
gtcgcccaac catggcaact tcggctccga tggtctgtac tccgagtcca agatctctct 2820
cgagactctg ttcaaccggt ggcacaccga gtcctggggc tcttatctca ccattgttgg 2880
tgtggtgatt ggctggaccc gaggtaccgg tctgatgagc gccaacaaca tcaccgccga 2940
gggtctggag cagctcggcg tccgaacctt ctcccagact gagatggcct tttccatcat 3000
gggtctcatg accaaggaca ttgtgcgact ggcccagaac tcccccgtgt gggccgatct 3060
caacggtggc ttccagtaca ttcccgacct caagggagtt gttggaaaga tccgacgaga 3120
cattgtggag acctccgaga tccgacgggc tgtggctcag gagactgcca ttgaacagaa 3180
ggtggtcaac ggcccccacg ccgatcttcc ttaccagaag gtcgaggtca agccccgagc 3240
caacctcaag tttgacttcc ccaccctcaa atcctacgcc gaggtcaagg agctgtctcc 3300
tgctggtgat gctctggagg gtcttctgga tctctcttcc gtcattgttg tcactggttt 3360
cgccgaggtc ggtccttggg gtaacgcccg aacccgatgg gacatggagg ccaacggtgt 3420
cttctccctt gagggtgcca ttgagatggc ctggatcatg ggtctgatca agcaccacaa 3480
tggtcccctg cccggcatgc ctcagtactc tggctggatc gataccaaga ccaagcagcc 3540
cgtcgatgac cgagatatca agaccaagta cgaggactac ctgcttgagc acgccggtat 3600
ccgactcatt gagcctgagc tgttccacgg ctacaacccc aagaagaaga ccttcctcca 3660
ggaggttatt gtggagcacg atctcgagcc ctttgaggcc tccaaggagt ctgctgagca 3720
atttgctctc gagcagggcg cgaacgttga gatcttcgcc gtccccgagt ccgaccagtg 3780
gactgtgcga cttctcaagg gcgccaagct cctcattccc aaggccctca agtttgaccg 3840
acttgtggcc ggccagattc ccactggatg ggatgcccga cgatacggta ttcccgagga 3900
catttgtgac caggttgacc ccatcactct gtacgctctt gtctccactg ttgaggctct 3960
gttggcctcc ggtattaccg acccctacga gttctacaag tacgtccacg tgtccgaggt 4020
cggtaactgt tccggttccg gtatgggtgg tatcaccgcc ctgcgaggca tgttcaagga 4080
ccggttcatg gacaagcctg ttcagaacga tattctccag gagtccttca tcaacaccat 4140
gtctgcctgg gtcaacatgt tgctgctctc ctcttccggt cccatcaaga cccccgttgg 4200
agcttgtgcc actgctgtcg agtctgtgga cattggttgc gaaaccattc tgtccggcaa 4260
ggccagaatc tgtctggtcg gtggttacga tgatttccag gaggagtctt ctcaggagtt 4320
tgcaaacatg aacgcaacat ccaacgctga gaccgagatc actcacggcc gaactccggc 4380
cgagatgtct cgacccatca cttccacacg agccggtttc atggaggctc agggtgctgg 4440
aacccaggtg ctgatggccg ccgacctcgc catcgccatg ggtgtgccca tctactgtat 4500
cgttggttac gtcaacactg ccaccgacaa gattggccga tctgtgcctg ctcccggtaa 4560
gggtatcctg accactgctc gagagcacca gactctcaaa cacgccaacc ctctcctcaa 4620
catcaagtac cgaaagcgac agctcgattc tcgactccga gacattaagc gatgggctga 4680
gggcgaaatg gaggctattg acattgagct tgacgacgtg tctgacgccg acaaggagtc 4740
cttcatccag gagcgatctg cccacatcca gtctcagtcc gatcgaatga tccgagaggc 4800
taagaactct tggggtaacg cctttttcaa gcaggacgcc cgaatctccc ccatccgagg 4860
agcgctggca acctacggtc tcaccattga tgacatctcc gtcgcttctt tccatggtac 4920
atccaccaag gccaacgaga agaacgagac caccaccgtc aacgccatgc tggagcatct 4980
cggcagaacc cggggtaacc ctgtctacgg tatcttccag aagtacctta ctggtcaccc 5040
caagggagct gctggtgcct ggatgctcaa cggagccatc caatgcctca actctggtat 5100
catccctggt aaccgaaacg ccgataacgt ggatgcctac tttgagcagt gccagcacgt 5160
ggtgttcccc tcgcgatctc tgcagaccga tggcctcaag gctgcttccg tgacctcctt 5220
tggtttcggt cagaagggtg cccaggccat tgtcatccac cccgactacc tgtacgctgc 5280
cctgacaccc tccgagtact ccgagtacac cacccgagtc gcccagcgat acaagaaggc 5340
ttaccgatac taccacaacg ccattgccga ggagtccatg ttccaggcca aggacaaggc 5400
tccctactct gctgagctgg agcaggaggt ctacctggat cctcttgtgc gagtccacca 5460
gaacgaggac accgagcagt actccttcaa cgccaaggac ctcgctgcct ccgcctttgt 5520
caagaactcc cacaaggaca ccgccaaggt gcttgccaac ctcacctccc aggtgtccgg 5580
ttctggtaag aacgttggtg tcgacgttga ggccatctcc gccatcaaca ttgataacga 5640
caccttcctt gaccgaaact tcaccgccaa cgagcaggcc tactgcttca aggccccctc 5700
cccccagtct tctttcgctg gcacttggtc tgccaaggag gctgttttca agtctctggg 5760
cgtcaagtcc cagggcggag gagctgagct caagtccatt gagatcactc gagatggcaa 5820
cggagctccc gtcgtggttc ttcacggagc tgccaaggac gctgctgctt ctaagggtat 5880
ctccaccgtc aaggtgtcca tttcccatga cgactctcag gccgtggctg ttgctgttgc 5940
cgagtag 5947
<210> 18
<211> 1850
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1850)
<223> 解脂耶氏酵母脂肪酸合酶2(XP_501096)
<400> 18
Met His Pro Glu Val Glu Gln Glu Leu Ala His Val Leu Leu Thr Glu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Tyr Gln Phe Ala Ser Pro Val Arg Trp Ile Glu Thr Gln
20 25 30
Asp Val Leu Phe Lys Gln Phe Asn Val Glu Arg Val Val Glu Val Gly
35 40 45
Pro Ser Pro Thr Leu Ala Gly Met Ala Gln Arg Thr Leu Lys Ser Lys
50 55 60
Tyr Glu Ser Tyr Asp Ala Ala Leu Ser Leu Gln Arg Glu Ile Leu Cys
65 70 75 80
Tyr Ser Lys Asp Gln Lys Asp Ile Tyr Tyr Leu Ala Asp Glu Ala Asp
85 90 95
Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ala Gly Gly Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Gly Pro Val Ala Lys Val Glu Asp Ala Pro Val Lys Ala Gln Glu
130 135 140
Ile Leu His Ala Leu Val Ala His Lys Leu Lys Lys Thr Pro Glu Gln
145 150 155 160
Val Pro Leu Ser Lys Ala Ile Lys Asp Leu Val Gly Gly Lys Ser Thr
165 170 175
Ile Gln Asn Glu Ile Leu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Phe Gly Ala Thr
180 185 190
Pro Glu Lys Pro Glu Asp Thr Pro Leu Gly Glu Leu Ala Glu Ser Phe
195 200 205
Gln Ala Ser Phe Asp Gly Lys Leu Gly Lys Gln Ser Ser Ser Leu Ile
210 215 220
Ala Arg Leu Met Ser Ser Lys Met Pro Gly Gly Phe Ser Leu Thr Ser
225 230 235 240
Ala Arg Ser Tyr Leu Asp Ser Arg Trp Gly Leu Ala Ala Gly Arg Gln
245 250 255
Asp Ser Val Leu Leu Val Ala Leu Met Asn Glu Pro Lys Asn Arg Leu
260 265 270
Gly Ser Glu Ala Glu Ala Lys Ala Tyr Leu Asp Glu Gln Thr Gln Lys
275 280 285
Tyr Ala Ala Ser Ala Gly Leu Asn Leu Ser Ala Pro Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Glu Gly Gly Asn Gly Gly Gly Ala Val Ile Asp Ser Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Leu Thr Lys Asp Gln Arg Tyr Leu Val Gln Gln Gln Leu Glu Leu
325 330 335
Phe Ala Asn Tyr Leu Lys Gln Asp Leu Arg Gln Gly Ser Lys Val Ala
340 345 350
Ala Ala Gln Lys Glu Ala Met Asp Ile Leu Gln Ala Glu Leu Asp Leu
355 360 365
Trp Asn Ser Glu His Gly Glu Val Tyr Ala Glu Gly Ile Lys Pro Ala
370 375 380
Phe Ser Ala Leu Lys Ala Arg Val Tyr Asp Ser Tyr Trp Asn Trp Ala
385 390 395 400
Arg Gln Asp Ser Leu Ser Met Tyr Phe Asp Ile Val Phe Gly Arg Leu
405 410 415
Ser Thr Val Asp Arg Glu Ile Met Ala Lys Cys Ile His Leu Met Asn
420 425 430
Arg Thr Asn His Asn Leu Ile Asp Tyr Met Gln Tyr His Met Asp His
435 440 445
Val Pro Val His Lys Gly Ala Thr Tyr Glu Leu Ala Lys Gln Leu Gly
450 455 460
Leu Gln Leu Leu Glu Asn Cys Lys Glu Thr Leu Thr Glu Ala Pro Val
465 470 475 480
Tyr Lys Asp Val Ser Tyr Pro Thr Gly Pro Gln Thr Thr Ile Asp Val
485 490 495
Lys Gly Asn Ile Val Tyr Asn Glu Val Pro Arg Pro Asn Val Arg Lys
500 505 510
Leu Glu Gln Tyr Val His Glu Met Ala Cys Gly Gly Glu Leu Thr Lys
515 520 525
Asp Pro Ser Phe Val Gly Glu Gly Val Gln Gly Glu Leu Lys Lys Leu
530 535 540
Tyr Ser Gln Ile Ser Ala Leu Ala Lys Thr Gln Thr Gly Ser Thr Leu
545 550 555 560
Asp Ile Glu Ala Leu Tyr Ser Asp Leu Val Ala Lys Ile Ser Gln Ala
565 570 575
Glu Asp Ala Ser Lys Pro Val Val Glu Asn Lys Ala Val Ser Ala Ser
580 585 590
Ile Thr Pro Gly Thr Leu Pro Phe Leu His Ile Lys Lys Lys Thr Glu
595 600 605
Leu Gly Ala Trp Asn Tyr Asp Ser Glu Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Asp
610 615 620
Gly Leu Glu Val Ala Ala Arg Asp Gly Leu Thr Phe Gln Gly Lys Thr
625 630 635 640
Ala Leu Ile Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ser Ile Gly Ala Ser Ile Leu
645 650 655
Gln Gly Leu Ile Ser Gly Gly Cys Lys Val Ile Val Thr Thr Ser Arg
660 665 670
Tyr Ser Arg Lys Val Thr Glu Tyr Tyr Gln Ser Leu Tyr Thr Lys Phe
675 680 685
Gly Ala Lys Gly Ser Thr Leu Ile Val Val Pro Phe Asn Gln Gly Ser
690 695 700
Lys Lys Asp Val Asp Glu Leu Val Ser Phe Ile Tyr Asn Asp Pro Lys
705 710 715 720
Asn Gly Gly Leu Gly Trp Asp Leu Asp Phe Val Val Pro Phe Ala Ala
725 730 735
Leu Pro Glu Asn Gly Ile Glu Leu Glu His Ile Asp Ser Lys Ser Glu
740 745 750
Leu Ala His Arg Ile Met Leu Thr Asn Leu Leu Arg Leu Leu Gly Asn
755 760 765
Val Lys Lys Gln Lys Val Ala His Ser Tyr Glu Thr Arg Pro Ala Gln
770 775 780
Val Met Leu Pro Leu Ser Pro Asn His Gly Asn Phe Gly Ser Asp Gly
785 790 795 800
Leu Tyr Ser Glu Ser Lys Ile Ser Leu Glu Thr Leu Phe Asn Arg Trp
805 810 815
His Thr Glu Ser Trp Gly Ser Tyr Leu Thr Ile Val Gly Val Val Ile
820 825 830
Gly Trp Thr Arg Gly Thr Gly Leu Met Ser Ala Asn Asn Ile Thr Ala
835 840 845
Glu Gly Leu Glu Gln Leu Gly Val Arg Thr Phe Ser Gln Thr Glu Met
850 855 860
Ala Phe Ser Ile Met Gly Leu Met Thr Lys Asp Ile Val Arg Leu Ala
865 870 875 880
Gln Asn Ser Pro Val Trp Ala Asp Leu Asn Gly Gly Phe Gln Tyr Ile
885 890 895
Pro Asp Leu Lys Gly Val Val Gly Lys Ile Arg Arg Asp Ile Val Glu
900 905 910
Thr Ser Glu Ile Arg Arg Ala Val Ala Gln Glu Thr Ala Ile Glu Gln
915 920 925
Lys Val Val Asn Gly Pro His Ala Asp Leu Pro Tyr Gln Lys Val Glu
930 935 940
Val Lys Pro Arg Ala Asn Leu Lys Phe Asp Phe Pro Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Tyr Ala Glu Val Lys Glu Leu Ser Pro Ala Gly Asp Ala Leu Glu Gly
965 970 975
Leu Leu Asp Leu Ser Ser Val Ile Val Val Thr Gly Phe Ala Glu Val
980 985 990
Gly Pro Trp Gly Asn Ala Arg Thr Arg Trp Asp Met Glu Ala Asn Gly
995 1000 1005
Val Phe Ser Leu Glu Gly Ala Ile Glu Met Ala Trp Ile Met Gly
1010 1015 1020
Leu Ile Lys His His Asn Gly Pro Leu Pro Gly Met Pro Gln Tyr
1025 1030 1035
Ser Gly Trp Ile Asp Thr Lys Thr Lys Gln Pro Val Asp Asp Arg
1040 1045 1050
Asp Ile Lys Thr Lys Tyr Glu Asp Tyr Leu Leu Glu His Ala Gly
1055 1060 1065
Ile Arg Leu Ile Glu Pro Glu Leu Phe His Gly Tyr Asn Pro Lys
1070 1075 1080
Lys Lys Thr Phe Leu Gln Glu Val Ile Val Glu His Asp Leu Glu
1085 1090 1095
Pro Phe Glu Ala Ser Lys Glu Ser Ala Glu Gln Phe Ala Leu Glu
1100 1105 1110
Gln Gly Ala Asn Val Glu Ile Phe Ala Val Pro Glu Ser Asp Gln
1115 1120 1125
Trp Thr Val Arg Leu Leu Lys Gly Ala Lys Leu Leu Ile Pro Lys
1130 1135 1140
Ala Leu Lys Phe Asp Arg Leu Val Ala Gly Gln Ile Pro Thr Gly
1145 1150 1155
Trp Asp Ala Arg Arg Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Cys Asp Gln
1160 1165 1170
Val Asp Pro Ile Thr Leu Tyr Ala Leu Val Ser Thr Val Glu Ala
1175 1180 1185
Leu Leu Ala Ser Gly Ile Thr Asp Pro Tyr Glu Phe Tyr Lys Tyr
1190 1195 1200
Val His Val Ser Glu Val Gly Asn Cys Ser Gly Ser Gly Met Gly
1205 1210 1215
Gly Ile Thr Ala Leu Arg Gly Met Phe Lys Asp Arg Phe Met Asp
1220 1225 1230
Lys Pro Val Gln Asn Asp Ile Leu Gln Glu Ser Phe Ile Asn Thr
1235 1240 1245
Met Ser Ala Trp Val Asn Met Leu Leu Leu Ser Ser Ser Gly Pro
1250 1255 1260
Ile Lys Thr Pro Val Gly Ala Cys Ala Thr Ala Val Glu Ser Val
1265 1270 1275
Asp Ile Gly Cys Glu Thr Ile Leu Ser Gly Lys Ala Arg Ile Cys
1280 1285 1290
Leu Val Gly Gly Tyr Asp Asp Phe Gln Glu Glu Ser Ser Gln Glu
1295 1300 1305
Phe Ala Asn Met Asn Ala Thr Ser Asn Ala Glu Thr Glu Ile Thr
1310 1315 1320
His Gly Arg Thr Pro Ala Glu Met Ser Arg Pro Ile Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Arg Ala Gly Phe Met Glu Ala Gln Gly Ala Gly Thr Gln Val Leu
1340 1345 1350
Met Ala Ala Asp Leu Ala Ile Ala Met Gly Val Pro Ile Tyr Cys
1355 1360 1365
Ile Val Gly Tyr Val Asn Thr Ala Thr Asp Lys Ile Gly Arg Ser
1370 1375 1380
Val Pro Ala Pro Gly Lys Gly Ile Leu Thr Thr Ala Arg Glu His
1385 1390 1395
Gln Thr Leu Lys His Ala Asn Pro Leu Leu Asn Ile Lys Tyr Arg
1400 1405 1410
Lys Arg Gln Leu Asp Ser Arg Leu Arg Asp Ile Lys Arg Trp Ala
1415 1420 1425
Glu Gly Glu Met Glu Ala Ile Asp Ile Glu Leu Asp Asp Val Ser
1430 1435 1440
Asp Ala Asp Lys Glu Ser Phe Ile Gln Glu Arg Ser Ala His Ile
1445 1450 1455
Gln Ser Gln Ser Asp Arg Met Ile Arg Glu Ala Lys Asn Ser Trp
1460 1465 1470
Gly Asn Ala Phe Phe Lys Gln Asp Ala Arg Ile Ser Pro Ile Arg
1475 1480 1485
Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Gly Leu Thr Ile Asp Asp Ile Ser Val
1490 1495 1500
Ala Ser Phe His Gly Thr Ser Thr Lys Ala Asn Glu Lys Asn Glu
1505 1510 1515
Thr Thr Thr Val Asn Ala Met Leu Glu His Leu Gly Arg Thr Arg
1520 1525 1530
Gly Asn Pro Val Tyr Gly Ile Phe Gln Lys Tyr Leu Thr Gly His
1535 1540 1545
Pro Lys Gly Ala Ala Gly Ala Trp Met Leu Asn Gly Ala Ile Gln
1550 1555 1560
Cys Leu Asn Ser Gly Ile Ile Pro Gly Asn Arg Asn Ala Asp Asn
1565 1570 1575
Val Asp Ala Tyr Phe Glu Gln Cys Gln His Val Val Phe Pro Ser
1580 1585 1590
Arg Ser Leu Gln Thr Asp Gly Leu Lys Ala Ala Ser Val Thr Ser
1595 1600 1605
Phe Gly Phe Gly Gln Lys Gly Ala Gln Ala Ile Val Ile His Pro
1610 1615 1620
Asp Tyr Leu Tyr Ala Ala Leu Thr Pro Ser Glu Tyr Ser Glu Tyr
1625 1630 1635
Thr Thr Arg Val Ala Gln Arg Tyr Lys Lys Ala Tyr Arg Tyr Tyr
1640 1645 1650
His Asn Ala Ile Ala Glu Glu Ser Met Phe Gln Ala Lys Asp Lys
1655 1660 1665
Ala Pro Tyr Ser Ala Glu Leu Glu Gln Glu Val Tyr Leu Asp Pro
1670 1675 1680
Leu Val Arg Val His Gln Asn Glu Asp Thr Glu Gln Tyr Ser Phe
1685 1690 1695
Asn Ala Lys Asp Leu Ala Ala Ser Ala Phe Val Lys Asn Ser His
1700 1705 1710
Lys Asp Thr Ala Lys Val Leu Ala Asn Leu Thr Ser Gln Val Ser
1715 1720 1725
Gly Ser Gly Lys Asn Val Gly Val Asp Val Glu Ala Ile Ser Ala
1730 1735 1740
Ile Asn Ile Asp Asn Asp Thr Phe Leu Asp Arg Asn Phe Thr Ala
1745 1750 1755
Asn Glu Gln Ala Tyr Cys Phe Lys Ala Pro Ser Pro Gln Ser Ser
1760 1765 1770
Phe Ala Gly Thr Trp Ser Ala Lys Glu Ala Val Phe Lys Ser Leu
1775 1780 1785
Gly Val Lys Ser Gln Gly Gly Gly Ala Glu Leu Lys Ser Ile Glu
1790 1795 1800
Ile Thr Arg Asp Gly Asn Gly Ala Pro Val Val Val Leu His Gly
1805 1810 1815
Ala Ala Lys Asp Ala Ala Ala Ser Lys Gly Ile Ser Thr Val Lys
1820 1825 1830
Val Ser Ile Ser His Asp Asp Ser Gln Ala Val Ala Val Ala Val
1835 1840 1845
Ala Glu
1850
<210> 19
<211> 1062
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1062)
<223> 解脂耶氏酵母YALI0_F14729g
<400> 19
atgtctcttc ttgaacgaga gcttcaaatt gaggagattg atatcaatct ctaccggtct 60
gccaaggagc tttggcgacc tatcggtcag cgaggtatct ttggcggctc tgtcattgct 120
caggccctga tggctgctac caaaactgtg cccccagagt tcattatcca ttccatgcac 180
tgctactttg tgttatctgg aaaccccgac caccccgtgc tctaccacgt tgagcgggtc 240
cgagatggca gaagcttcgc tacccgaaca gtccaggcca aacagcgggg acgtgtgatc 300
ttcaccacta catgctcttt ccaggttgac aagggcaacg gaaacatgca tcatcagagc 360
cgaatgtacg agcgagaggt caagagcagt ggaaaggctt ttgatggcga acacgaggcc 420
accaacggaa ttcctgctcc cgagaattgc gtctcctcgc tggaggtgtc caagtacctc 480
aacaagcagg gcgtgatcag tgacgatatt ctcaagaaga tggtggatcg atcagttgag 540
gatcccattg aaattagact agtgaccggt cttctgaaca aggacgatgg tctgcttcct 600
catgaacgaa gaatcaagtt ctgggttcga tgcaaacctg ttattgagcg agacgacgtt 660
cagtcggtcg gtattgctta cctcagtgac tctttcctgc tgggaacagc tatccgagtc 720
cagcccctca atcccggtgc tgcctctatg gttgtttccc tggaccacac aatctacttt 780
catggcaagt tccgagctga tgaatggctg ctgcacgtga ttgattccaa ctggagtgga 840
aacgagcggg cactggtccg aggacgactc tacaaccaac agggagtctt ggtcgccaca 900
gtgttccagg agggtgtcat tcgattgaag gagaaataca aaggcaaggc tgtagagacc 960
acagatgact atcttagcag cggaacgaga actgatgctg agaaggagga gtctaagaag 1020
aagggagcca tggctgctaa gagtattgac agtaagctgt aa 1062
<210> 20
<211> 353
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(353)
<223> 解脂耶氏酵母XP_505426
<400> 20
Met Ser Leu Leu Glu Arg Glu Leu Gln Ile Glu Glu Ile Asp Ile Asn
1 5 10 15
Leu Tyr Arg Ser Ala Lys Glu Leu Trp Arg Pro Ile Gly Gln Arg Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Gly Ser Val Ile Ala Gln Ala Leu Met Ala Ala Thr Lys
35 40 45
Thr Val Pro Pro Glu Phe Ile Ile His Ser Met His Cys Tyr Phe Val
50 55 60
Leu Ser Gly Asn Pro Asp His Pro Val Leu Tyr His Val Glu Arg Val
65 70 75 80
Arg Asp Gly Arg Ser Phe Ala Thr Arg Thr Val Gln Ala Lys Gln Arg
85 90 95
Gly Arg Val Ile Phe Thr Thr Thr Cys Ser Phe Gln Val Asp Lys Gly
100 105 110
Asn Gly Asn Met His His Gln Ser Arg Met Tyr Glu Arg Glu Val Lys
115 120 125
Ser Ser Gly Lys Ala Phe Asp Gly Glu His Glu Ala Thr Asn Gly Ile
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Asn Cys Val Ser Ser Leu Glu Val Ser Lys Tyr Leu
145 150 155 160
Asn Lys Gln Gly Val Ile Ser Asp Asp Ile Leu Lys Lys Met Val Asp
165 170 175
Arg Ser Val Glu Asp Pro Ile Glu Ile Arg Leu Val Thr Gly Leu Leu
180 185 190
Asn Lys Asp Asp Gly Leu Leu Pro His Glu Arg Arg Ile Lys Phe Trp
195 200 205
Val Arg Cys Lys Pro Val Ile Glu Arg Asp Asp Val Gln Ser Val Gly
210 215 220
Ile Ala Tyr Leu Ser Asp Ser Phe Leu Leu Gly Thr Ala Ile Arg Val
225 230 235 240
Gln Pro Leu Asn Pro Gly Ala Ala Ser Met Val Val Ser Leu Asp His
245 250 255
Thr Ile Tyr Phe His Gly Lys Phe Arg Ala Asp Glu Trp Leu Leu His
260 265 270
Val Ile Asp Ser Asn Trp Ser Gly Asn Glu Arg Ala Leu Val Arg Gly
275 280 285
Arg Leu Tyr Asn Gln Gln Gly Val Leu Val Ala Thr Val Phe Gln Glu
290 295 300
Gly Val Ile Arg Leu Lys Glu Lys Tyr Lys Gly Lys Ala Val Glu Thr
305 310 315 320
Thr Asp Asp Tyr Leu Ser Ser Gly Thr Arg Thr Asp Ala Glu Lys Glu
325 330 335
Glu Ser Lys Lys Lys Gly Ala Met Ala Ala Lys Ser Ile Asp Ser Lys
340 345 350
Leu
<210> 21
<211> 2076
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2076)
<223> 解脂耶氏酵母脂肪酰辅酶A合酶(YALI0_D17864g)
<400> 21
atggtcggat acacaatttc ctcaaagccc gtgtcggtgg aggtcggccc cgccaagcct 60
ggcgagactg ccccccgacg aaacgtcatt gccaaggacg cccctgtcgt cttccccgac 120
aacgactcgt ccctgaccac cgtctacaag ctgttcaaaa agtacgccga gatcaacagc 180
gagcgaaagg ccatgggatg gcgagacacc atcgacatcc acgtggagac caaacaggtg 240
accaaggtcg tggacggagt ggagaagaag gtgcccaagg aatggaagta ctttgagatg 300
ggcccttaca agtggctctc atacaaggag gcccttaagc tggtccatga ttatggagct 360
ggtcttcgac acctcggaat caagcccaag gagaagatgc acatttacgc ccagacctcc 420
caccgatgga tgctctctgg cctggcttct ctgtctcagg gtattcccat tgtcactgcc 480
tacgacactc ttggagagga gggtctcact cgatctctcc aggagaccaa ctcggtcatc 540
atgtttaccg acaaggctct gctgagctct ctcaaggtct ctctcaagaa gggcaccgat 600
ctgcgaatca tcatctacgg aggtgatctg acccccgacg acaagaaggc cggaaacacg 660
gagattgacg ccatcaagga gattgttcca gatatgaaga tctacaccat ggacgaggtt 720
gtcgctctcg gccgagaaca cccccacccc gtggaggagg tcgactatga ggacctggcc 780
ttcatcatgt acacctctgg ttctaccggt gtccccaagg gtgtggttct gcagcacaag 840
cagatcctcg cctctgtggc cggtgtcacc aagatcattg accgatctat catcggcaac 900
acagaccggc ttctcaactt cctgcccctc gcacacattt tcgagtttgt gttcgagatg 960
gtcaccttct ggtggggtgc ttctctgggt tacggaaccg tcaagaccat ttccgatctg 1020
tccatgaaga actgtaaggg agacattcga gagctcaagc ccaccatcat ggtcggcgtt 1080
cccgctgtct gggaacctat gcgaaagggt attcttggca agatcaagga gctgtctcct 1140
ctgatgcagc gggtcttctg ggcctcattt gccgccaagc agcgtctcga cgagaacgga 1200
ctccctggtg gatctatcct cgactcgctc attttcaaga aggtcaagga cgccactgga 1260
ggctgtctcc gatacgtgtg taacggaggt gctccagtat ctgtcgacac ccagaagttc 1320
atcaccactc tcatctgtcc catgctgatt ggatgcggtc tgaccgagac tacagccaac 1380
accaccatca tgtcgcctaa atcgtacgcc tttggcacca ttggtgagcc caccgccgcc 1440
gtgaccctca agctcattga cgtgcctgaa gccggctact tcgccgagaa caaccaggga 1500
gagctgtgca tcaagggcaa cgtcgtgatg aaggagtact acaagaacga ggaggagacc 1560
aagaaggcgt tctccgacga tggctatttc ctcaccggtg atattgccga gtggaccgcc 1620
aatggccagc tcagaatcat tgaccgacga aagaacctcg tcaagaccca gaacggagag 1680
tacattgctc tggagaagct cgagacacag taccgatcgt cgtcgtacgt ggccaacctg 1740
tgtgtgtacg ccgaccagaa ccgagtcaag cccattgctc tggtcattcc taacgagggc 1800
cccaccaaga agcttgccca gagcttgggc gtcgattctg acgactggga cgccgtctgt 1860
tccaacaaaa aggtggtcaa ggctgtgctc aaggacatgc tcgataccgg ccgatctctg 1920
ggtctgtccg gcattgagct gctgcaaggc attgtgttgc tgcctggcga gtggactcct 1980
cagaacagct acctgactgc tgcccagaag ctcaaccgaa agaagattgt ggatgataac 2040
aagaaggaaa ttgatgagtg ctacgagcag tcttag 2076
<210> 22
<211> 691
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(691)
<223> 解脂耶氏酵母脂肪酰辅酶A合酶(XP_502959)
<400> 22
Met Val Gly Tyr Thr Ile Ser Ser Lys Pro Val Ser Val Glu Val Gly
1 5 10 15
Pro Ala Lys Pro Gly Glu Thr Ala Pro Arg Arg Asn Val Ile Ala Lys
20 25 30
Asp Ala Pro Val Val Phe Pro Asp Asn Asp Ser Ser Leu Thr Thr Val
35 40 45
Tyr Lys Leu Phe Lys Lys Tyr Ala Glu Ile Asn Ser Glu Arg Lys Ala
50 55 60
Met Gly Trp Arg Asp Thr Ile Asp Ile His Val Glu Thr Lys Gln Val
65 70 75 80
Thr Lys Val Val Asp Gly Val Glu Lys Lys Val Pro Lys Glu Trp Lys
85 90 95
Tyr Phe Glu Met Gly Pro Tyr Lys Trp Leu Ser Tyr Lys Glu Ala Leu
100 105 110
Lys Leu Val His Asp Tyr Gly Ala Gly Leu Arg His Leu Gly Ile Lys
115 120 125
Pro Lys Glu Lys Met His Ile Tyr Ala Gln Thr Ser His Arg Trp Met
130 135 140
Leu Ser Gly Leu Ala Ser Leu Ser Gln Gly Ile Pro Ile Val Thr Ala
145 150 155 160
Tyr Asp Thr Leu Gly Glu Glu Gly Leu Thr Arg Ser Leu Gln Glu Thr
165 170 175
Asn Ser Val Ile Met Phe Thr Asp Lys Ala Leu Leu Ser Ser Leu Lys
180 185 190
Val Ser Leu Lys Lys Gly Thr Asp Leu Arg Ile Ile Ile Tyr Gly Gly
195 200 205
Asp Leu Thr Pro Asp Asp Lys Lys Ala Gly Asn Thr Glu Ile Asp Ala
210 215 220
Ile Lys Glu Ile Val Pro Asp Met Lys Ile Tyr Thr Met Asp Glu Val
225 230 235 240
Val Ala Leu Gly Arg Glu His Pro His Pro Val Glu Glu Val Asp Tyr
245 250 255
Glu Asp Leu Ala Phe Ile Met Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Val Pro
260 265 270
Lys Gly Val Val Leu Gln His Lys Gln Ile Leu Ala Ser Val Ala Gly
275 280 285
Val Thr Lys Ile Ile Asp Arg Ser Ile Ile Gly Asn Thr Asp Arg Leu
290 295 300
Leu Asn Phe Leu Pro Leu Ala His Ile Phe Glu Phe Val Phe Glu Met
305 310 315 320
Val Thr Phe Trp Trp Gly Ala Ser Leu Gly Tyr Gly Thr Val Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Asp Leu Ser Met Lys Asn Cys Lys Gly Asp Ile Arg Glu Leu
340 345 350
Lys Pro Thr Ile Met Val Gly Val Pro Ala Val Trp Glu Pro Met Arg
355 360 365
Lys Gly Ile Leu Gly Lys Ile Lys Glu Leu Ser Pro Leu Met Gln Arg
370 375 380
Val Phe Trp Ala Ser Phe Ala Ala Lys Gln Arg Leu Asp Glu Asn Gly
385 390 395 400
Leu Pro Gly Gly Ser Ile Leu Asp Ser Leu Ile Phe Lys Lys Val Lys
405 410 415
Asp Ala Thr Gly Gly Cys Leu Arg Tyr Val Cys Asn Gly Gly Ala Pro
420 425 430
Val Ser Val Asp Thr Gln Lys Phe Ile Thr Thr Leu Ile Cys Pro Met
435 440 445
Leu Ile Gly Cys Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ala Asn Thr Thr Ile Met
450 455 460
Ser Pro Lys Ser Tyr Ala Phe Gly Thr Ile Gly Glu Pro Thr Ala Ala
465 470 475 480
Val Thr Leu Lys Leu Ile Asp Val Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Glu
485 490 495
Asn Asn Gln Gly Glu Leu Cys Ile Lys Gly Asn Val Val Met Lys Glu
500 505 510
Tyr Tyr Lys Asn Glu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Phe Ser Asp Asp Gly
515 520 525
Tyr Phe Leu Thr Gly Asp Ile Ala Glu Trp Thr Ala Asn Gly Gln Leu
530 535 540
Arg Ile Ile Asp Arg Arg Lys Asn Leu Val Lys Thr Gln Asn Gly Glu
545 550 555 560
Tyr Ile Ala Leu Glu Lys Leu Glu Thr Gln Tyr Arg Ser Ser Ser Tyr
565 570 575
Val Ala Asn Leu Cys Val Tyr Ala Asp Gln Asn Arg Val Lys Pro Ile
580 585 590
Ala Leu Val Ile Pro Asn Glu Gly Pro Thr Lys Lys Leu Ala Gln Ser
595 600 605
Leu Gly Val Asp Ser Asp Asp Trp Asp Ala Val Cys Ser Asn Lys Lys
610 615 620
Val Val Lys Ala Val Leu Lys Asp Met Leu Asp Thr Gly Arg Ser Leu
625 630 635 640
Gly Leu Ser Gly Ile Glu Leu Leu Gln Gly Ile Val Leu Leu Pro Gly
645 650 655
Glu Trp Thr Pro Gln Asn Ser Tyr Leu Thr Ala Ala Gln Lys Leu Asn
660 665 670
Arg Lys Lys Ile Val Asp Asp Asn Lys Lys Glu Ile Asp Glu Cys Tyr
675 680 685
Glu Gln Ser
690
<210> 23
<211> 968
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的棉铃虫细胞色素b5还原酶(XP_021183830)；mRNA编码序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(968)
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的棉铃虫细胞色素b5还原酶(XP_021183830)；mRNA编码序列
<400> 23
tgtctaacgt cgaggtggcc gtggacgacg ccttcggcat cctgaccgtg ctgcccatcg 60
tggtgggcgt gtctgccgcc gtggtgctgg tgtctgtgat cgccaactgc ttctggggca 120
agaaggacaa gaaggctgct cccaagaagt cctctcagct gatcaccctg gtggacccca 180
acgtgaagta cgctctgccc ctgatcgagc gagaggaaat ctctcacgac acccgacgat 240
tccgattcgg actgccctct tcggagcacg tcctgggact gcccattggc cagcacatcc 300
acctgtctgc caagatcgac gacgacctgg tgatccgatc ttacacccct gtgtcctctg 360
acgaagagaa gggctacgtc gagctggtga tcaaggtgta cttcaagaac gtgcacccta 420
agttccccga cggcggcaag atgtctcagc acctgaactc cctgaagatc aacgacacca 480
tcgacgtgcg aggcccctct ggccgactgc agtacgccgg caacggcctg ttcctgatca 540
agaagatgcg aaaggaccct cctgtcgagc tgcgagccaa gaagctgaac atgattgccg 600
gcggaaccgg aatcgctccc atgctgcagc tgatccgaca catctgcaag gacgcctctg 660
atcccaccga gatgcgactg ctgttcgcca accagaccga agaggacatc ctgctgcgaa 720
acgagctgga aaagtaccag gctgagcacc ccgagcagtt caagctgtgg tacaccctgg 780
accgacctaa cgaaggctgg aagtactctg tgggcttcat caacgacgag atgatcaagg 840
aacacctgtt cgctcccgcc gacgacgtgc tggtgctgat gtgcggccct cctcctatga 900
tcaacttcgc ttgcaacccc gctctcgaga agctgggcta ccccgagtct cagcgattcg 960
cctactaa 968
<210> 24
<211> 322
<212> PRT
<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(322)
<223> 棉铃虫细胞色素b5还原酶(XP_021183830)
<400> 24
Met Ser Asn Val Glu Val Ala Val Asp Asp Ala Phe Gly Ile Leu Thr
1 5 10 15
Val Leu Pro Ile Val Val Gly Val Ser Ala Ala Val Val Leu Val Ser
20 25 30
Val Ile Ala Asn Cys Phe Trp Gly Lys Lys Asp Lys Lys Ala Ala Pro
35 40 45
Lys Lys Ser Ser Gln Leu Ile Thr Leu Val Asp Pro Asn Val Lys Tyr
50 55 60
Ala Leu Pro Leu Ile Glu Arg Glu Glu Ile Ser His Asp Thr Arg Arg
65 70 75 80
Phe Arg Phe Gly Leu Pro Ser Ser Glu His Val Leu Gly Leu Pro Ile
85 90 95
Gly Gln His Ile His Leu Ser Ala Lys Ile Asp Asp Asp Leu Val Ile
100 105 110
Arg Ser Tyr Thr Pro Val Ser Ser Asp Glu Glu Lys Gly Tyr Val Glu
115 120 125
Leu Val Ile Lys Val Tyr Phe Lys Asn Val His Pro Lys Phe Pro Asp
130 135 140
Gly Gly Lys Met Ser Gln His Leu Asn Ser Leu Lys Ile Asn Asp Thr
145 150 155 160
Ile Asp Val Arg Gly Pro Ser Gly Arg Leu Gln Tyr Ala Gly Asn Gly
165 170 175
Leu Phe Leu Ile Lys Lys Met Arg Lys Asp Pro Pro Val Glu Leu Arg
180 185 190
Ala Lys Lys Leu Asn Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly Ile Ala Pro Met
195 200 205
Leu Gln Leu Ile Arg His Ile Cys Lys Asp Ala Ser Asp Pro Thr Glu
210 215 220
Met Arg Leu Leu Phe Ala Asn Gln Thr Glu Glu Asp Ile Leu Leu Arg
225 230 235 240
Asn Glu Leu Glu Lys Tyr Gln Ala Glu His Pro Glu Gln Phe Lys Leu
245 250 255
Trp Tyr Thr Leu Asp Arg Pro Asn Glu Gly Trp Lys Tyr Ser Val Gly
260 265 270
Phe Ile Asn Asp Glu Met Ile Lys Glu His Leu Phe Ala Pro Ala Asp
275 280 285
Asp Val Leu Val Leu Met Cys Gly Pro Pro Pro Met Ile Asn Phe Ala
290 295 300
Cys Asn Pro Ala Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Pro Glu Ser Gln Arg Phe
305 310 315 320
Ala Tyr
<210> 25
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的大肠杆菌硫酯酶(AAB40248)；mRNA编码序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(627)
<223> 针对解脂耶氏酵母进行密码子优化的大肠杆菌硫酯酶(AAB40248)；mRNA编码序列
<400> 25
atgatgaact tcaacaacgt gttccgatgg catctgccct ttctgtttct ggtgctgctg 60
accttccgag ccgccgctgc tgacaccctg ctgatcctgg gcgactctct gtctgccggc 120
taccgaatgt ctgcctctgc cgcttggccc gctctgctga acgacaagtg gcagtctaag 180
acctctgtgg tgaacgcctc tatctctggc gacacctctc agcagggcct cgctcgactg 240
cctgctctgc tcaagcagca tcagccccga tgggtgctcg tcgagcttgg cggcaacgac 300
ggcctgcgag gcttccagcc tcagcagacc gagcagaccc tgcgacagat tctgcaggac 360
gtgaaggccg ccaacgctga gcctctgctg atgcagattc gactgcccgc caactacggc 420
cgacgataca acgaggcctt ctctgctatc taccccaagc tggccaagga attcgacgtg 480
cccctgctgc cattcttcat ggaagaggtg tacctgaagc ctcagtggat gcaggacgac 540
ggcattcacc ccaaccgaga tgctcagccc ttcattgccg actggatggc caagcagctg 600
cagcctctgg tgaaccacga ctcttaa 627
<210> 26
<211> 218
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(218)
<223> 大肠杆菌硫酯酶(AAB40248)
<400> 26
Met Leu Pro Leu Thr Asp Gly Leu Leu Lys Met Met Asn Phe Asn Asn
1 5 10 15
Val Phe Arg Trp His Leu Pro Phe Leu Phe Leu Val Leu Leu Thr Phe
20 25 30
Arg Ala Ala Ala Ala Asp Thr Leu Leu Ile Leu Gly Asp Ser Leu Ser
35 40 45
Ala Gly Tyr Arg Met Ser Ala Ser Ala Ala Trp Pro Ala Leu Leu Asn
50 55 60
Asp Lys Trp Gln Ser Lys Thr Ser Val Val Asn Ala Ser Ile Ser Gly
65 70 75 80
Asp Thr Ser Gln Gln Gly Leu Ala Arg Leu Pro Ala Leu Leu Lys Gln
85 90 95
His Gln Pro Arg Trp Val Leu Val Glu Leu Gly Gly Asn Asp Gly Leu
100 105 110
Arg Gly Phe Gln Pro Gln Gln Thr Glu Gln Thr Leu Arg Gln Ile Leu
115 120 125
Gln Asp Val Lys Ala Ala Asn Ala Glu Pro Leu Leu Met Gln Ile Arg
130 135 140
Leu Pro Ala Asn Tyr Gly Arg Arg Tyr Asn Glu Ala Phe Ser Ala Ile
145 150 155 160
Tyr Pro Lys Leu Ala Lys Glu Phe Asp Val Pro Leu Leu Pro Phe Phe
165 170 175
Met Glu Glu Val Tyr Leu Lys Pro Gln Trp Met Gln Asp Asp Gly Ile
180 185 190
His Pro Asn Arg Asp Ala Gln Pro Phe Ile Ala Asp Trp Met Ala Lys
195 200 205
Gln Leu Gln Pro Leu Val Asn His Asp Ser
210 215
<210> 27
<211> 531
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(531)
<223> 解脂耶氏酵母TEFintron启动子
<400> 27
agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60
cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120
aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180
cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240
gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300
aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360
cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaatgg tgagtttcag 420
aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480
acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt actaaccgca g 531
<210> 28
<211> 1002
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1002)
<223> 解脂耶氏酵母EXP启动子
<400> 28
aaggagtttg gcgcccgttt tttcgagccc cacacgtttc ggtgagtatg agcggcggca 60
gattcgagcg tttccggttt ccgcggctgg acgagagccc atgatggggg ctcccaccac 120
cagcaatcag ggccctgatt acacacccac ctgtaatgtc atgctgttca tcgtggttaa 180
tgctgctgtg tgctgtgtgt gtgtgttgtt tggcgctcat tgttgcgtta tgcagcgtac 240
accacaatat tggaagctta ttagcctttc tattttttcg tttgcaaggc ttaacaacat 300
tgctgtggag agggatgggg atatggaggc cgctggaggg agtcggagag gcgttttgga 360
gcggcttggc ctggcgccca gctcgcgaaa cgcacctagg accctttggc acgccgaaat 420
gtgccacttt tcagtctagt aacgccttac ctacgtcatt ccatgcatgc atgtttgcgc 480
cttttttccc ttgcccttga tcgccacaca gtacagtgca ctgtacagtg gaggttttgg 540
gggggtctta gatgggagct aaaagcggcc tagcggtaca ctagtgggat tgtatggagt 600
ggcatggagc ctaggtggag cctgacagga cgcacgaccg gctagcccgt gacagacgat 660
gggtggctcc tgttgtccac cgcgtacaaa tgtttgggcc aaagtcttgt cagccttgct 720
tgcgaaccta attcccaatt ttgtcacttc gcacccccat tgatcgagcc ctaacccctg 780
cccatcaggc aatccaatta agctcgcatt gtctgccttg tttagtttgg ctcctgcccg 840
tttcggcgtc cacttgcaca aacacaaaca agcattatat ataaggctcg tctctccctc 900
ccaaccacac tcactttttt gcccgtcttc ccttgctaac acaaaagtca agaacacaaa 960
caaccacccc aaccccctta cacacaagac atatctacag ca 1002
<210> 29
<211> 1029
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1029)
<223> 解脂耶氏酵母YEF3启动子
<400> 29
gatagctgag ggatatggtg tagataaggg gtgtccgagg gccgtgttag cactccagag 60
agagtgcaca tggagctcgg gctggggtct cgaagcgttg tccggcagct tttttgccac 120
ccccaaaact gaacatcacc ctttgaccct gtcccacaat cagccgtata cttgggttca 180
gcaactctgg atactacagg aaaactatgc agagatccaa ccacacacgg ccaatgtcct 240
ctatggagct gcgtgggaga tattgggtaa gtcctaagtg gctggaaaag ggggattgag 300
cccgcgtcct aggccatggt ccatcccgtt gctctcaatg ccggcctata gaacgggttc 360
caacactaca cacacccact aatgcacccc tccccctcgt gttagccgag gagagatggt 420
atgagtgagt agacaagaag agatggtgat gaccgagaac gccgatagta tcagcgagat 480
acacgccaac aaccaaacaa cttggttgcc ctcaaatcaa gcccctcttc gccattcggt 540
tccttccaga ccattccaga tcaatccacc tcttcttatc tcaggtgggt gtgctgacat 600
cagaccccgt agcccttctc ccagtggcga acagcaggca taaaacaggg ccattgagca 660
gagcaaacaa ggtcggtgaa atcgtcgaaa aagtcggaaa acggttgcaa gaaattggag 720
cgtcacctgc caccctccag gctctatata aagcattgcc ccaattgcta acgcttcata 780
tttacacctt tggcacccca gtccatccct ccaataaaat gtactacatg ggacacaaca 840
agagaggatg cgcgcccaaa ccctaaccta gcacatgcac gatgattctc tttgtctgtg 900
aaaaaatttt tccaccaaaa tttccccatt gggatgaaac cctaaccgca accaaaagtt 960
tttaactatc atcttgtacg tcacggtttc cgattcttct cttctctttc atcatcatca 1020
cttgtgacc 1029
<210> 30
<211> 2247
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 30
atgacgagac gtactactat taatcccgat tcggtggttc tgaatcctca aaaatttatc 60
cagaaagaaa gggcggattc gaaaatcaaa gttgaccaag ttaacacatt tttagagtca 120
tccccggaga ggagaactct gacgcacgcc ttaatagacc aaatagtgaa tgatcctata 180
ttgaaaactg atacggacta ttacgatgct aaaaaaatgc aagagagaga aattactgcc 240
aaaaaaatag ctaggcttgc tagttatatg gagcacgata tcaaaacagt gcgcaaacac 300
tttcgcgaca ctgacctgat gaaagagttg caagcaaatg atccagacaa agcttcgcct 360
ttaacaaaca aagacctttt tatattcgat aagagattgt cacttgtagc aaatattgat 420
cctcaattgg gtacgcgcgt gggtgtacac ttggggctat ttggtaattg tatcaagggc 480
aatggtactg atgagcaaat ccggtattgg ttgcaggaga gaggtgccac tttgatgaaa 540
ggtatatatg gctgttttgc aatgactgag ttaggacatg gttccaatgt tgcccagctg 600
cagactaggg ctgtgtacga taagcaaaat gatacttttg taattgatac acctgatcta 660
actgccacca aatggtggat tggtggggct gcccattctg ccacgcacgc tgccgtgtac 720
gccagattga tcgttgaagg taaagactac ggtgtaaaaa cattcgttgt tcctctgaga 780
gacccttcga ctttccaact gttagctggt gtttccatag gggatattgg agcgaagatg 840
ggtcgtgacg gtattgataa tggctggatc cagttcagaa acgtagttat ccctagagaa 900
tttatgctaa gtagatttac caaagttgtc cgttctccag atggttcagt caccgtcaaa 960
actgagccac aattggatca aatttctggt tatagtgcat tgttaagtgg tagagttaac 1020
atggtcatgg attcatttag gtttggctcc aaatttgcta ctattgctgt acgttacgcg 1080
gttggtcgtc agcaattcgc acctagaaag ggattgtctg aaacacaatt aatcgactat 1140
ccccttcacc aatatcgtgt tttaccacaa ttgtgtgttc catatttggt gtcacctgta 1200
gcttttaagt taatggacaa ctattattcc actttggacg agttatacaa cgcttcctca 1260
tctgcataca aagctgctct ggttaccgtg agtaaaaagt tgaagaattt atttattgat 1320
agcgccagct tgaaagccac caatacttgg ttaattgcta cactgattga tgagttgaga 1380
cagacttgcg gaggacatgg gtattcacag tataacggat ttggtaaagg ctatgacgac 1440
tgggtggttc agtgcacatg ggagggtgat aataatgttt tatctttaac ttcagcaaaa 1500
tcaatattga aaaaatttat cgattcagcc acaaagggta gatttgacaa cacactggat 1560
gtggactcat tctcttactt aaaacctcag tacataggat ctgtggtttc tggagaaata 1620
aagagtggtt taaaggagtt gggtgattat actgaaattt ggtctatcac cttaatcaaa 1680
ttactggcac atattggtac tttagttgaa aaatcaagaa gtattgatag cgtttctaag 1740
cttttagtct tagtatccaa atttcatgcc ttgcgctgca tgttgaaaac ctattacgac 1800
aagttaaact ctcgtgattc acatatttcc gatgaaatta caaaggaatc tatgtggaat 1860
gtttataagt tattttcctt gtattttatt gacaagcatt ccggagaatt ccaacaattc 1920
aagatcttca ctcctgatca gatctctaaa gttgtgcagc cacaactatt ggctcttttg 1980
ccaattgtga ggaaagactg tataggtctg acagactcct ttgaattacc tgacgcgatg 2040
ttaaattctc ctataggtta ctttgatggc gatatctatc acaattactt caatgaagtt 2100
tgccgcaata atccagtgga ggcagatggg gcagggaagc cttcttatca tgcgctgttg 2160
agcagcatgc tcggtagagg tttcgaattt gaccaaaagt taggtggtgc agctaatgcg 2220
gaaattttat cgaaaataaa caagtga 2247
<210> 31
<211> 748
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 31
Met Thr Arg Arg Thr Thr Ile Asn Pro Asp Ser Val Val Leu Asn Pro
1 5 10 15
Gln Lys Phe Ile Gln Lys Glu Arg Ala Asp Ser Lys Ile Lys Val Asp
20 25 30
Gln Val Asn Thr Phe Leu Glu Ser Ser Pro Glu Arg Arg Thr Leu Thr
35 40 45
His Ala Leu Ile Asp Gln Ile Val Asn Asp Pro Ile Leu Lys Thr Asp
50 55 60
Thr Asp Tyr Tyr Asp Ala Lys Lys Met Gln Glu Arg Glu Ile Thr Ala
65 70 75 80
Lys Lys Ile Ala Arg Leu Ala Ser Tyr Met Glu His Asp Ile Lys Thr
85 90 95
Val Arg Lys His Phe Arg Asp Thr Asp Leu Met Lys Glu Leu Gln Ala
100 105 110
Asn Asp Pro Asp Lys Ala Ser Pro Leu Thr Asn Lys Asp Leu Phe Ile
115 120 125
Phe Asp Lys Arg Leu Ser Leu Val Ala Asn Ile Asp Pro Gln Leu Gly
130 135 140
Thr Arg Val Gly Val His Leu Gly Leu Phe Gly Asn Cys Ile Lys Gly
145 150 155 160
Asn Gly Thr Asp Glu Gln Ile Arg Tyr Trp Leu Gln Glu Arg Gly Ala
165 170 175
Thr Leu Met Lys Gly Ile Tyr Gly Cys Phe Ala Met Thr Glu Leu Gly
180 185 190
His Gly Ser Asn Val Ala Gln Leu Gln Thr Arg Ala Val Tyr Asp Lys
195 200 205
Gln Asn Asp Thr Phe Val Ile Asp Thr Pro Asp Leu Thr Ala Thr Lys
210 215 220
Trp Trp Ile Gly Gly Ala Ala His Ser Ala Thr His Ala Ala Val Tyr
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ile Val Glu Gly Lys Asp Tyr Gly Val Lys Thr Phe Val
245 250 255
Val Pro Leu Arg Asp Pro Ser Thr Phe Gln Leu Leu Ala Gly Val Ser
260 265 270
Ile Gly Asp Ile Gly Ala Lys Met Gly Arg Asp Gly Ile Asp Asn Gly
275 280 285
Trp Ile Gln Phe Arg Asn Val Val Ile Pro Arg Glu Phe Met Leu Ser
290 295 300
Arg Phe Thr Lys Val Val Arg Ser Pro Asp Gly Ser Val Thr Val Lys
305 310 315 320
Thr Glu Pro Gln Leu Asp Gln Ile Ser Gly Tyr Ser Ala Leu Leu Ser
325 330 335
Gly Arg Val Asn Met Val Met Asp Ser Phe Arg Phe Gly Ser Lys Phe
340 345 350
Ala Thr Ile Ala Val Arg Tyr Ala Val Gly Arg Gln Gln Phe Ala Pro
355 360 365
Arg Lys Gly Leu Ser Glu Thr Gln Leu Ile Asp Tyr Pro Leu His Gln
370 375 380
Tyr Arg Val Leu Pro Gln Leu Cys Val Pro Tyr Leu Val Ser Pro Val
385 390 395 400
Ala Phe Lys Leu Met Asp Asn Tyr Tyr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Tyr
405 410 415
Asn Ala Ser Ser Ser Ala Tyr Lys Ala Ala Leu Val Thr Val Ser Lys
420 425 430
Lys Leu Lys Asn Leu Phe Ile Asp Ser Ala Ser Leu Lys Ala Thr Asn
435 440 445
Thr Trp Leu Ile Ala Thr Leu Ile Asp Glu Leu Arg Gln Thr Cys Gly
450 455 460
Gly His Gly Tyr Ser Gln Tyr Asn Gly Phe Gly Lys Gly Tyr Asp Asp
465 470 475 480
Trp Val Val Gln Cys Thr Trp Glu Gly Asp Asn Asn Val Leu Ser Leu
485 490 495
Thr Ser Ala Lys Ser Ile Leu Lys Lys Phe Ile Asp Ser Ala Thr Lys
500 505 510
Gly Arg Phe Asp Asn Thr Leu Asp Val Asp Ser Phe Ser Tyr Leu Lys
515 520 525
Pro Gln Tyr Ile Gly Ser Val Val Ser Gly Glu Ile Lys Ser Gly Leu
530 535 540
Lys Glu Leu Gly Asp Tyr Thr Glu Ile Trp Ser Ile Thr Leu Ile Lys
545 550 555 560
Leu Leu Ala His Ile Gly Thr Leu Val Glu Lys Ser Arg Ser Ile Asp
565 570 575
Ser Val Ser Lys Leu Leu Val Leu Val Ser Lys Phe His Ala Leu Arg
580 585 590
Cys Met Leu Lys Thr Tyr Tyr Asp Lys Leu Asn Ser Arg Asp Ser His
595 600 605
Ile Ser Asp Glu Ile Thr Lys Glu Ser Met Trp Asn Val Tyr Lys Leu
610 615 620
Phe Ser Leu Tyr Phe Ile Asp Lys His Ser Gly Glu Phe Gln Gln Phe
625 630 635 640
Lys Ile Phe Thr Pro Asp Gln Ile Ser Lys Val Val Gln Pro Gln Leu
645 650 655
Leu Ala Leu Leu Pro Ile Val Arg Lys Asp Cys Ile Gly Leu Thr Asp
660 665 670
Ser Phe Glu Leu Pro Asp Ala Met Leu Asn Ser Pro Ile Gly Tyr Phe
675 680 685
Asp Gly Asp Ile Tyr His Asn Tyr Phe Asn Glu Val Cys Arg Asn Asn
690 695 700
Pro Val Glu Ala Asp Gly Ala Gly Lys Pro Ser Tyr His Ala Leu Leu
705 710 715 720
Ser Ser Met Leu Gly Arg Gly Phe Glu Phe Asp Gln Lys Leu Gly Gly
725 730 735
Ala Ala Asn Ala Glu Ile Leu Ser Lys Ile Asn Lys
740 745
<210> 32
<211> 1236
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1236)
<223> 来自湿地萼距花的硫酯酶CpFATB2的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 32
atggtggccg ctgccgcctc cgccgccttc ttctctgtgg ccacccctcg aactaacatc 60
tctccctcgt ctctgtctgt gcccttcaag cccaagtcta accacaacgg cggcttccag 120
gtgaaggcca acgcctctgc ccaccccaag gccaacggat ctgccgtgtc tctgaagtct 180
ggctctctcg agactcagga ggacaagacc tcttcttcgt cgcctcctcc ccgaaccttc 240
atcaaccagc tgcccgtgtg gtctatgctg ctgtctgccg tgaccaccgt gttcggcgtg 300
gccgagaagc agtggcccat gctggaccga aagtctaagc gacccgacat gctggtcgag 360
cccctgggcg tggaccgaat cgtgtacgac ggcgtgtctt tccgacagtc tttctctatc 420
cgatcttacg agatcggcgc tgaccgaacc gcctctatcg agactctgat gaacatgttc 480
caggagactt ctctgaacca ctgcaagatc atcggcctgc tgaacgacgg cttcggccga 540
acccctgaga tgtgcaagcg agatctgatt tgggtggtga ccaagatgca gatcgaggtg 600
aaccgatacc ccacctgggg cgacaccatt gaggtgaaca cctgggtgtc tgcctctggc 660
aagcacggca tgggccgaga ctggctgatc tctgactgcc acaccggcga gatcctgatc 720
cgagccacct ctgtgtgggc catgatgaac cagaagaccc gacgactgtc taagatcccc 780
tacgaggtgc gacaggagat cgagccccag ttcgtggact ctgctcccgt gatcgtggac 840
gaccgaaagt tccacaagct ggacctcaag accggcgact ctatctgcaa cggcctgacc 900
cctcgatgga ccgacctgga cgtgaaccag cacgtgaaca acgtgaagta catcggctgg 960
atcctgcagt ctgtgcccac cgaggtgttt gagactcagg agctgtgcgg cctgaccctc 1020
gagtaccgac gagagtgcgg ccgagactct gtgctcgagt ctgtgaccgc catggacccc 1080
tctaaggagg gcgaccgatc tctgtaccag cacctcctgc gactcgagga cggcgccgac 1140
atcgtgaagg gccgaaccga gtggcgaccc aagaacgctg gcgccaaggg cgccatcctg 1200
accggcaaga cctctaacgg caactctatc tcttaa 1236
<210> 33
<211> 411
<212> PRT
<213> 湿地萼距花(Cuphea palustris)
<400> 33
Met Val Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Phe Phe Ser Val Ala Thr Pro
1 5 10 15
Arg Thr Asn Ile Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Pro Phe Lys Pro Lys
20 25 30
Ser Asn His Asn Gly Gly Phe Gln Val Lys Ala Asn Ala Ser Ala His
35 40 45
Pro Lys Ala Asn Gly Ser Ala Val Ser Leu Lys Ser Gly Ser Leu Glu
50 55 60
Thr Gln Glu Asp Lys Thr Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Arg Thr Phe
65 70 75 80
Ile Asn Gln Leu Pro Val Trp Ser Met Leu Leu Ser Ala Val Thr Thr
85 90 95
Val Phe Gly Val Ala Glu Lys Gln Trp Pro Met Leu Asp Arg Lys Ser
100 105 110
Lys Arg Pro Asp Met Leu Val Glu Pro Leu Gly Val Asp Arg Ile Val
115 120 125
Tyr Asp Gly Val Ser Phe Arg Gln Ser Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu
130 135 140
Ile Gly Ala Asp Arg Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Met Asn Met Phe
145 150 155 160
Gln Glu Thr Ser Leu Asn His Cys Lys Ile Ile Gly Leu Leu Asn Asp
165 170 175
Gly Phe Gly Arg Thr Pro Glu Met Cys Lys Arg Asp Leu Ile Trp Val
180 185 190
Val Thr Lys Met Gln Ile Glu Val Asn Arg Tyr Pro Thr Trp Gly Asp
195 200 205
Thr Ile Glu Val Asn Thr Trp Val Ser Ala Ser Gly Lys His Gly Met
210 215 220
Gly Arg Asp Trp Leu Ile Ser Asp Cys His Thr Gly Glu Ile Leu Ile
225 230 235 240
Arg Ala Thr Ser Val Trp Ala Met Met Asn Gln Lys Thr Arg Arg Leu
245 250 255
Ser Lys Ile Pro Tyr Glu Val Arg Gln Glu Ile Glu Pro Gln Phe Val
260 265 270
Asp Ser Ala Pro Val Ile Val Asp Asp Arg Lys Phe His Lys Leu Asp
275 280 285
Leu Lys Thr Gly Asp Ser Ile Cys Asn Gly Leu Thr Pro Arg Trp Thr
290 295 300
Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp
305 310 315 320
Ile Leu Gln Ser Val Pro Thr Glu Val Phe Glu Thr Gln Glu Leu Cys
325 330 335
Gly Leu Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu
340 345 350
Glu Ser Val Thr Ala Met Asp Pro Ser Lys Glu Gly Asp Arg Ser Leu
355 360 365
Tyr Gln His Leu Leu Arg Leu Glu Asp Gly Ala Asp Ile Val Lys Gly
370 375 380
Arg Thr Glu Trp Arg Pro Lys Asn Ala Gly Ala Lys Gly Ala Ile Leu
385 390 395 400
Thr Gly Lys Thr Ser Asn Gly Asn Ser Ile Ser
405 410
<210> 34
<211> 1149
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1149)
<223> 来自香樟的硫酯酶CcFatB1的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 34
atggctacca cctctctggc ctctgccttc tgctctatga aggccgtgat gctggcccga 60
gatggccgag gaatgaagcc ccgatcttct gacctgcagc tgcgagccgg caacgcccag 120
acctctctga agatgatcaa cggcaccaag ttctcttaca ccgagtcgct gaagaagctg 180
cccgactggt ctatgctgtt cgccgtgatc accaccatct tctctgccgc cgagaagcag 240
tggaccaacc tcgagtggaa gcccaagcct aaccctcctc agctgctgga cgaccacttc 300
ggaccccacg gcctggtgtt ccgacgaacc ttcgccatcc gatcttacga ggtgggcccc 360
gaccgatcta cctctatcgt ggccgtcatg aaccacctcc aagaggccgc tctgaaccac 420
gccaagtctg tgggcatcct cggcgacggc ttcggcacca ctctcgagat gtctaagcga 480
gatctgattt gggtcgtgaa gcgaacccac gtcgccgtcg agcgataccc cgcctggggc 540
gacaccgtcg aggtcgagtg ctgggtgggc gcctctggca acaacggccg acgacacgac 600
tttctggtgc gagactgcaa gaccggcgag attctgaccc gatgtacctc tctgtctgtg 660
atgatgaaca cccgaactcg acgactgtct aagatccccg aggaagtgcg aggcgagatc 720
ggacccgcct tcatcgacaa cgtggccgtg aaggacgagg aaatcaagaa gccccagaag 780
ctgaacgact ctaccgccga ctacatccaa ggcggactga cccctcgatg gaacgacctg 840
gacatcaacc agcacgtgaa caacatcaag tacgtggact ggatcctcga gactgtgccc 900
gactctatct tcgagtctca ccacatctct tcgttcacca tcgagtaccg acgagagtgc 960
accatggact ctgtgctgca gtctctgacc accgtgtctg gcggctcctc tgaggccgga 1020
ctggtgtgcg agcacctcct gcagctcgaa ggcggctctg aggtcctgcg agccaagacc 1080
gagtggcgac ccaagctgac tgactctttc cgaggcatct ctgtgatccc cgccgagtcc 1140
tctgtgtaa 1149
<210> 35
<211> 382
<212> PRT
<213> 香樟(Cinnamomum camphora)
<400> 35
Met Ala Thr Thr Ser Leu Ala Ser Ala Phe Cys Ser Met Lys Ala Val
1 5 10 15
Met Leu Ala Arg Asp Gly Arg Gly Met Lys Pro Arg Ser Ser Asp Leu
20 25 30
Gln Leu Arg Ala Gly Asn Ala Gln Thr Ser Leu Lys Met Ile Asn Gly
35 40 45
Thr Lys Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Lys Lys Leu Pro Asp Trp Ser
50 55 60
Met Leu Phe Ala Val Ile Thr Thr Ile Phe Ser Ala Ala Glu Lys Gln
65 70 75 80
Trp Thr Asn Leu Glu Trp Lys Pro Lys Pro Asn Pro Pro Gln Leu Leu
85 90 95
Asp Asp His Phe Gly Pro His Gly Leu Val Phe Arg Arg Thr Phe Ala
100 105 110
Ile Arg Ser Tyr Glu Val Gly Pro Asp Arg Ser Thr Ser Ile Val Ala
115 120 125
Val Met Asn His Leu Gln Glu Ala Ala Leu Asn His Ala Lys Ser Val
130 135 140
Gly Ile Leu Gly Asp Gly Phe Gly Thr Thr Leu Glu Met Ser Lys Arg
145 150 155 160
Asp Leu Ile Trp Val Val Lys Arg Thr His Val Ala Val Glu Arg Tyr
165 170 175
Pro Ala Trp Gly Asp Thr Val Glu Val Glu Cys Trp Val Gly Ala Ser
180 185 190
Gly Asn Asn Gly Arg Arg His Asp Phe Leu Val Arg Asp Cys Lys Thr
195 200 205
Gly Glu Ile Leu Thr Arg Cys Thr Ser Leu Ser Val Met Met Asn Thr
210 215 220
Arg Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pro Glu Glu Val Arg Gly Glu Ile
225 230 235 240
Gly Pro Ala Phe Ile Asp Asn Val Ala Val Lys Asp Glu Glu Ile Lys
245 250 255
Lys Pro Gln Lys Leu Asn Asp Ser Thr Ala Asp Tyr Ile Gln Gly Gly
260 265 270
Leu Thr Pro Arg Trp Asn Asp Leu Asp Ile Asn Gln His Val Asn Asn
275 280 285
Ile Lys Tyr Val Asp Trp Ile Leu Glu Thr Val Pro Asp Ser Ile Phe
290 295 300
Glu Ser His His Ile Ser Ser Phe Thr Ile Glu Tyr Arg Arg Glu Cys
305 310 315 320
Thr Met Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Thr Val Ser Gly Gly Ser
325 330 335
Ser Glu Ala Gly Leu Val Cys Glu His Leu Leu Gln Leu Glu Gly Gly
340 345 350
Ser Glu Val Leu Arg Ala Lys Thr Glu Trp Arg Pro Lys Leu Thr Asp
355 360 365
Ser Phe Arg Gly Ile Ser Val Ile Pro Ala Glu Ser Ser Val
370 375 380
<210> 36
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1578)
<223> 来自酿酒酵母的醇乙酰基转移酶ATF1的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 36
atgaacgaga tcgacgagaa gaaccaggct cctgtgcagc aagagtgcct gaaggaaatg 60
atccagaacg gacacgcccg acgaatgggc tctgtcgagg acctgtacgt ggccctgaac 120
cgacagaacc tgtaccgaaa cttctgcacc tacggcgagc tgtctgacta ctgcacccga 180
gatcagctga ccctggctct gcgagagatc tgcctgaaga accctactct gctgcatatc 240
gtgctgccca ctcgatggcc caaccacgag aactactacc gatcttctga gtactactct 300
cgaccccatc ctgtgcacga ctacatctcc gtgctgcaag agctgaagct gtctggcgtg 360
gtgctgaacg agcagcccga gtactctgcc gtgatgaagc agatcctgga agagttcaag 420
aactctaagg gctcttacac cgccaagatc ttcaagctga ctactaccct gaccattcct 480
tacttcggcc ccactggacc ctcttggcga ctgatctgtc tgcccgagga acacaccgag 540
aagtggaaga agttcatctt cgtttctaac cactgcatgt ctgacggacg atcctctatc 600
cacttctttc acgacctgcg agatgagctg aacaacatca agacccctcc aaagaagctg 660
gactacattt tcaagtacga agaggactac cagctgctgc gaaagctgcc cgagcctatc 720
gagaaggtga tcgacttccg acctccttac ctgttcatcc ccaagtctct gctgtctgga 780
ttcatctaca accacctccg attctcttcg aagggcgtgt gcatgcgaat ggacgacgtg 840
gaaaagaccg acgacgttgt gaccgagatc atcaacatct ctcccaccga gttccaggcc 900
atcaaggcca acattaagtc taacatccag ggcaagtgta ccatcactcc ctttctgcac 960
gtgtgctggt tcgtgtctct gcacaagtgg ggcaagttct ttaagcccct gaacttcgag 1020
tggctgaccg acatcttcat ccccgccgac tgccgatctc agctgcctga cgacgacgag 1080
atgcgacaga tgtaccgata cggcgccaac gtgggcttca tcgacttcac cccttggatc 1140
tctgagttcg acatgaacga caacaaggaa aacttctggc ccctgatcga gcactaccac 1200
gaggtgattt ctgaggccct gcgaaacaag aagcacctcc acggcctggg cttcaacatt 1260
cagggcttcg tccagaagta cgtcaacatt gacaaggtga tgtgcgaccg agccatcggc 1320
aagcgacgag gcggcaccct gctgtctaac gtgggcctgt tcaaccagct cgaggaaccc 1380
gacgccaagt actctatctg cgacctggcc ttcggccagt tccaaggctc ttggcaccag 1440
gctttctccc tgggcgtgtg ttctaccaac gtgaagggca tgaacatcgt ggtggcctct 1500
accaagaacg tggtgggctc tcaagagtct ctggaagaac tgtgctctat ctacaaggcc 1560
ctgctgctgg gcccctaa 1578
<210> 37
<211> 525
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 37
Met Asn Glu Ile Asp Glu Lys Asn Gln Ala Pro Val Gln Gln Glu Cys
1 5 10 15
Leu Lys Glu Met Ile Gln Asn Gly His Ala Arg Arg Met Gly Ser Val
20 25 30
Glu Asp Leu Tyr Val Ala Leu Asn Arg Gln Asn Leu Tyr Arg Asn Phe
35 40 45
Cys Thr Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Tyr Cys Thr Arg Asp Gln Leu Thr
50 55 60
Leu Ala Leu Arg Glu Ile Cys Leu Lys Asn Pro Thr Leu Leu His Ile
65 70 75 80
Val Leu Pro Thr Arg Trp Pro Asn His Glu Asn Tyr Tyr Arg Ser Ser
85 90 95
Glu Tyr Tyr Ser Arg Pro His Pro Val His Asp Tyr Ile Ser Val Leu
100 105 110
Gln Glu Leu Lys Leu Ser Gly Val Val Leu Asn Glu Gln Pro Glu Tyr
115 120 125
Ser Ala Val Met Lys Gln Ile Leu Glu Glu Phe Lys Asn Ser Lys Gly
130 135 140
Ser Tyr Thr Ala Lys Ile Phe Lys Leu Thr Thr Thr Leu Thr Ile Pro
145 150 155 160
Tyr Phe Gly Pro Thr Gly Pro Ser Trp Arg Leu Ile Cys Leu Pro Glu
165 170 175
Glu His Thr Glu Lys Trp Lys Lys Phe Ile Phe Val Ser Asn His Cys
180 185 190
Met Ser Asp Gly Arg Ser Ser Ile His Phe Phe His Asp Leu Arg Asp
195 200 205
Glu Leu Asn Asn Ile Lys Thr Pro Pro Lys Lys Leu Asp Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Tyr Glu Glu Asp Tyr Gln Leu Leu Arg Lys Leu Pro Glu Pro Ile
225 230 235 240
Glu Lys Val Ile Asp Phe Arg Pro Pro Tyr Leu Phe Ile Pro Lys Ser
245 250 255
Leu Leu Ser Gly Phe Ile Tyr Asn His Leu Arg Phe Ser Ser Lys Gly
260 265 270
Val Cys Met Arg Met Asp Asp Val Glu Lys Thr Asp Asp Val Val Thr
275 280 285
Glu Ile Ile Asn Ile Ser Pro Thr Glu Phe Gln Ala Ile Lys Ala Asn
290 295 300
Ile Lys Ser Asn Ile Gln Gly Lys Cys Thr Ile Thr Pro Phe Leu His
305 310 315 320
Val Cys Trp Phe Val Ser Leu His Lys Trp Gly Lys Phe Phe Lys Pro
325 330 335
Leu Asn Phe Glu Trp Leu Thr Asp Ile Phe Ile Pro Ala Asp Cys Arg
340 345 350
Ser Gln Leu Pro Asp Asp Asp Glu Met Arg Gln Met Tyr Arg Tyr Gly
355 360 365
Ala Asn Val Gly Phe Ile Asp Phe Thr Pro Trp Ile Ser Glu Phe Asp
370 375 380
Met Asn Asp Asn Lys Glu Asn Phe Trp Pro Leu Ile Glu His Tyr His
385 390 395 400
Glu Val Ile Ser Glu Ala Leu Arg Asn Lys Lys His Leu His Gly Leu
405 410 415
Gly Phe Asn Ile Gln Gly Phe Val Gln Lys Tyr Val Asn Ile Asp Lys
420 425 430
Val Met Cys Asp Arg Ala Ile Gly Lys Arg Arg Gly Gly Thr Leu Leu
435 440 445
Ser Asn Val Gly Leu Phe Asn Gln Leu Glu Glu Pro Asp Ala Lys Tyr
450 455 460
Ser Ile Cys Asp Leu Ala Phe Gly Gln Phe Gln Gly Ser Trp His Gln
465 470 475 480
Ala Phe Ser Leu Gly Val Cys Ser Thr Asn Val Lys Gly Met Asn Ile
485 490 495
Val Val Ala Ser Thr Lys Asn Val Val Gly Ser Gln Glu Ser Leu Glu
500 505 510
Glu Leu Cys Ser Ile Tyr Lys Ala Leu Leu Leu Gly Pro
515 520 525
<210> 38
<211> 2088
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2088)
<223> 过氧化物酶体氧化酶的DNA密码子优化序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2088)
<223> 黄地老虎过氧化物酶体氧化酶的DNA密码子优化序列
<400> 38
atgcccattt tcatctgtat catcacctcg caagccatca tccgatcgaa cgtggaacga 60
gtggcagtca ttcttaacat caacatgggt aaggtgaacg aggacctggt tcgagagcgt 120
gcaaagtgta ccttcaacat tgaggagctc acctactttc ttgacggagg aaaagataaa 180
accttggaaa gaaaggagac cgaacgagct atgttgacca agcgagaaga gctctttgga 240
ggcgttcccg acgaatacct gtcacacaag gagaagtacg agaactccat gcgaaaggct 300
gttattctct tcggaatcct tagaaagatc caaaaggata acaacaccga cctcaccaac 360
taccggaatc tgctgagcgg agtgctgtcc gtgtccatct cccaggatgg ctctcctttc 420
ggcctccact acatcatgtt catgcctgtg ctgctgtctc aggctgatga aaaacaacaa 480
gagaagtggc tgaagcgagc catgaactgt gaaatcatcg gctcttacgc ccagaccgag 540
ctgggccacg gcactttcat ccgaggcctt gagactactg ccacttacga tcccgccacc 600
caggagttcg tgctgcactc tcctgctctt tcgtcctaca agtggtggcc tggaggcctc 660
ggaaacactg tcaattactg catcgttatt gcccagctgt actctaaggg cgtctgtcac 720
ggcattcatt ccttcatcgt gcaggtgcga gacgaggaca ctcacatgcc gttgcccggc 780
atcaaggtcg gagagatcgg tgtgaagatg ggtctgaact ctgtcaacaa cggattcctg 840
ggattcgaga acgtccgaat cccccgagtg aacatgctta tgaagcacgc caagatcctg 900
gaggatggaa cttacgttaa gtcgaagaac aacaagctca tctacggagc aatggtgttc 960
gtccgagtgg tgatcgtgtt cgactctgtg aactacctgg ccaaggccat caccattggc 1020
gcacgatact ccctggtgcg gcgacagtcg caattaaaag ctggagaacc tgagcgacag 1080
atcctcgact atgtcaccca gcagcacaag attctgcccg ctatcgctgg atgctacgcc 1140
atgaagatga acgcttggag gttgtgggac accttcaacc tgatcaacgg acaactgcat 1200
cagggcaaca tggaacggct gggcgagctg catgccctcg cgtgctgcct caaggctatc 1260
tctaccaccg acgcggctat gttcacctct ctgtgtcgac tcggatgcgg aggtcacggt 1320
tacatgactt cttccaacct ccctcccaca tacgctttga cttctgcctc gtgcacttac 1380
gagggagaca acaccgttct gctgctgcag accgctcgat ttcttctcaa gacctggcga 1440
cagattgaca cccaccctct gactagaacc gtggcctacc tgaagaccgt gtctgcccct 1500
ggattctctg acagatggga gtcttccgtg gagggcatca ttcgaggctt ccagaccgtc 1560
gctatgaaaa agatttcttc ctgtctggac atcatgactt ctaaggtgat gtctggaatg 1620
tcccaggagg atgcatggaa cgctatttct atccagctgg tttcggccgc tgaatcccat 1680
tctcgaggca ccgtgatctc tacgttttac gaagacatgt ctaaggccat gcgatccatg 1740
actgctccct tggcgaaggt gatgggtcag ctggttgagc tgtacgcggt ttattggact 1800
ctagagcgac tgggagacat gttgcagtac accagtattt ctcacaccga cgttgttgac 1860
ctccgatcct ggtacgaaga gctcctccga aagatccgac ctaacactat cggactggtg 1920
gacgcgtttg atattattga tgaactgctc cagtccaccc tgggtgctta tgacggtcgt 1980
gtttacgaac gactgatgga agaagctttg aagtctcccc tgaacgctga gcccgtgaac 2040
cagtccttcc acaagtacct caagcccttt atgcagtcta agctgtaa 2088
<210> 39
<211> 695
<212> PRT
<213> 黄地老虎(Agrotis segetum)
<400> 39
Met Pro Ile Phe Ile Cys Ile Ile Thr Ser Gln Ala Ile Ile Arg Ser
1 5 10 15
Asn Val Glu Arg Val Ala Val Ile Leu Asn Ile Asn Met Gly Lys Val
20 25 30
Asn Glu Asp Leu Val Arg Glu Arg Ala Lys Cys Thr Phe Asn Ile Glu
35 40 45
Glu Leu Thr Tyr Phe Leu Asp Gly Gly Lys Asp Lys Thr Leu Glu Arg
50 55 60
Lys Glu Thr Glu Arg Ala Met Leu Thr Lys Arg Glu Glu Leu Phe Gly
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Glu Tyr Leu Ser His Lys Glu Lys Tyr Glu Asn Ser
85 90 95
Met Arg Lys Ala Val Ile Leu Phe Gly Ile Leu Arg Lys Ile Gln Lys
100 105 110
Asp Asn Asn Thr Asp Leu Thr Asn Tyr Arg Asn Leu Leu Ser Gly Val
115 120 125
Leu Ser Val Ser Ile Ser Gln Asp Gly Ser Pro Phe Gly Leu His Tyr
130 135 140
Ile Met Phe Met Pro Val Leu Leu Ser Gln Ala Asp Glu Lys Gln Gln
145 150 155 160
Glu Lys Trp Leu Lys Arg Ala Met Asn Cys Glu Ile Ile Gly Ser Tyr
165 170 175
Ala Gln Thr Glu Leu Gly His Gly Thr Phe Ile Arg Gly Leu Glu Thr
180 185 190
Thr Ala Thr Tyr Asp Pro Ala Thr Gln Glu Phe Val Leu His Ser Pro
195 200 205
Ala Leu Ser Ser Tyr Lys Trp Trp Pro Gly Gly Leu Gly Asn Thr Val
210 215 220
Asn Tyr Cys Ile Val Ile Ala Gln Leu Tyr Ser Lys Gly Val Cys His
225 230 235 240
Gly Ile His Ser Phe Ile Val Gln Val Arg Asp Glu Asp Thr His Met
245 250 255
Pro Leu Pro Gly Ile Lys Val Gly Glu Ile Gly Val Lys Met Gly Leu
260 265 270
Asn Ser Val Asn Asn Gly Phe Leu Gly Phe Glu Asn Val Arg Ile Pro
275 280 285
Arg Val Asn Met Leu Met Lys His Ala Lys Ile Leu Glu Asp Gly Thr
290 295 300
Tyr Val Lys Ser Lys Asn Asn Lys Leu Ile Tyr Gly Ala Met Val Phe
305 310 315 320
Val Arg Val Val Ile Val Phe Asp Ser Val Asn Tyr Leu Ala Lys Ala
325 330 335
Ile Thr Ile Gly Ala Arg Tyr Ser Leu Val Arg Arg Gln Ser Gln Leu
340 345 350
Lys Ala Gly Glu Pro Glu Arg Gln Ile Leu Asp Tyr Val Thr Gln Gln
355 360 365
His Lys Ile Leu Pro Ala Ile Ala Gly Cys Tyr Ala Met Lys Met Asn
370 375 380
Ala Trp Arg Leu Trp Asp Thr Phe Asn Leu Ile Asn Gly Gln Leu His
385 390 395 400
Gln Gly Asn Met Glu Arg Leu Gly Glu Leu His Ala Leu Ala Cys Cys
405 410 415
Leu Lys Ala Ile Ser Thr Thr Asp Ala Ala Met Phe Thr Ser Leu Cys
420 425 430
Arg Leu Gly Cys Gly Gly His Gly Tyr Met Thr Ser Ser Asn Leu Pro
435 440 445
Pro Thr Tyr Ala Leu Thr Ser Ala Ser Cys Thr Tyr Glu Gly Asp Asn
450 455 460
Thr Val Leu Leu Leu Gln Thr Ala Arg Phe Leu Leu Lys Thr Trp Arg
465 470 475 480
Gln Ile Asp Thr His Pro Leu Thr Arg Thr Val Ala Tyr Leu Lys Thr
485 490 495
Val Ser Ala Pro Gly Phe Ser Asp Arg Trp Glu Ser Ser Val Glu Gly
500 505 510
Ile Ile Arg Gly Phe Gln Thr Val Ala Met Lys Lys Ile Ser Ser Cys
515 520 525
Leu Asp Ile Met Thr Ser Lys Val Met Ser Gly Met Ser Gln Glu Asp
530 535 540
Ala Trp Asn Ala Ile Ser Ile Gln Leu Val Ser Ala Ala Glu Ser His
545 550 555 560
Ser Arg Gly Thr Val Ile Ser Thr Phe Tyr Glu Asp Met Ser Lys Ala
565 570 575
Met Arg Ser Met Thr Ala Pro Leu Ala Lys Val Met Gly Gln Leu Val
580 585 590
Glu Leu Tyr Ala Val Tyr Trp Thr Leu Glu Arg Leu Gly Asp Met Leu
595 600 605
Gln Tyr Thr Ser Ile Ser His Thr Asp Val Val Asp Leu Arg Ser Trp
610 615 620
Tyr Glu Glu Leu Leu Arg Lys Ile Arg Pro Asn Thr Ile Gly Leu Val
625 630 635 640
Asp Ala Phe Asp Ile Ile Asp Glu Leu Leu Gln Ser Thr Leu Gly Ala
645 650 655
Tyr Asp Gly Arg Val Tyr Glu Arg Leu Met Glu Glu Ala Leu Lys Ser
660 665 670
Pro Leu Asn Ala Glu Pro Val Asn Gln Ser Phe His Lys Tyr Leu Lys
675 680 685
Pro Phe Met Gln Ser Lys Leu
690 695
<210> 40
<211> 2031
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2031)
<223> 过氧化物酶体氧化酶1的DNA密码子优化序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2031)
<223> 拟南芥过氧化物酶体氧化酶1的DNA密码子优化序列
<400> 40
atggaaggca tcgaccacct ggccgacgag cgaaacaagg ccgagttcga cgttgaggac 60
atgaagatcg tgtgggccgg ctctcgacac gccttcgagg tgtctgaccg aatcgcccga 120
ctggtggctt ctgaccccgt gttcgagaag tctaaccgag ccagactgtc tcgaaaggaa 180
ctgttcaagt ctaccctgcg aaagtgcgcc cacgccttca agcgaatcat cgagctgcga 240
ctgaacgagg aagaggccgg acgactgcga cacttcattg accagcctgc ctacgtggac 300
ctgcactggg gcatgttcgt gcccgccatc aagggccagg gcaccgagga acagcagaag 360
aagtggctgt ctctggccaa caagatgcag atcatcggct gctacgccca gaccgagctt 420
ggccacggct ctaacgtgca gggcctcgag actaccgcca ctttcgaccc caagaccgac 480
gagttcgtga ttcacacccc tactcagacc gcctctaagt ggtggcccgg tggcctcggc 540
aaggtgtcta cccacgccgt ggtgtacgct cgactgatca ccaacggcaa ggactacggc 600
atccacggct tcatcgtgca gctgcgatct ctcgaggacc actctcctct gcctaacatc 660
accgtgggcg acatcggcac caagatgggc aacggcgcct acaactctat ggacaacggc 720
ttcctgatgt tcgaccacgt gcgaattccc cgagatcaga tgctgatgcg actgtctaag 780
gtgacccgag agggcgagta cgtgccctct gacgtgccca agcagctggt gtacggaacc 840
atggtgtacg tgcgacagac catcgtggcc gacgcttcta acgccctgtc tcgagccgtg 900
tgtatcgcta cccgatactc tgccgtgcga cgacagttcg gcgcccacaa cggcggcatc 960
gagactcagg tgatcgacta caagacccag cagaaccgac tgttccctct gctggcctcc 1020
gcctacgcct tccgattcgt cggcgagtgg ctgaagtggc tctacaccga cgtgaccgag 1080
cgactggccg cctctgactt cgccactctg cccgaggctc acgcctgcac cgccggactg 1140
aagtctctga ccaccaccgc caccgctgac ggcatcgaag agtgccgaaa gctgtgtggc 1200
ggccacggat acctgtggtg ctctggactg cccgagctgt tcgccgtgta cgtccccgcc 1260
tgtacctacg agggcgacaa cgtggtgctg cagctccagg tggcccgatt cctgatgaag 1320
accgtcgctc agctcggctc tggcaaggtg cccgtgggaa ccaccgccta catgggccga 1380
gccgctcacc tcctgcagtg ccgatctggc gtgcagaagg ccgaggactg gctgaacccc 1440
gacgtcgtgc tcgaggcttt cgaggcccga gcactgcgaa tggccgtgac ctgcgccaag 1500
aacctgtcta agttcgagaa ccaggaacag ggcttccaag agctgctggc cgacctggtc 1560
gaggccgcta tcgcccactg ccagctgatc gtggtgtcca agttcattgc taagctcgag 1620
caggacatcg gcggcaaggg cgtgaagaag cagctgaaca acctgtgcta catctacgcc 1680
ctgtacctgc tgcacaagca cctgggcgac tttctgtcta ccaactgcat tacccctaag 1740
caggcctctc tggctaacga ccagctccga tcgctgtaca cccaggtgcg acccaacgct 1800
gtggccctgg tggacgcttt caactacact gaccactacc tgaactctgt gctgggccga 1860
tacgacggca acgtgtaccc caagctgttc gaagaggccc tgaaggaccc tctgaacgac 1920
tctgtggtgc ccgacggcta ccaagagtac ctgcgacctg tcctgcagca gcagctccga 1980
accgctcgac tcgaccagat tacctctgtg ggatcttctt cgaagctgta g 2031
<210> 41
<211> 676
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 41
Met Glu Gly Ile Asp His Leu Ala Asp Glu Arg Asn Lys Ala Glu Phe
1 5 10 15
Asp Val Glu Asp Met Lys Ile Val Trp Ala Gly Ser Arg His Ala Phe
20 25 30
Glu Val Ser Asp Arg Ile Ala Arg Leu Val Ala Ser Asp Pro Val Phe
35 40 45
Glu Lys Ser Asn Arg Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Phe Lys Ser
50 55 60
Thr Leu Arg Lys Cys Ala His Ala Phe Lys Arg Ile Ile Glu Leu Arg
65 70 75 80
Leu Asn Glu Glu Glu Ala Gly Arg Leu Arg His Phe Ile Asp Gln Pro
85 90 95
Ala Tyr Val Asp Leu His Trp Gly Met Phe Val Pro Ala Ile Lys Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Glu Glu Gln Gln Lys Lys Trp Leu Ser Leu Ala Asn Lys
115 120 125
Met Gln Ile Ile Gly Cys Tyr Ala Gln Thr Glu Leu Gly His Gly Ser
130 135 140
Asn Val Gln Gly Leu Glu Thr Thr Ala Thr Phe Asp Pro Lys Thr Asp
145 150 155 160
Glu Phe Val Ile His Thr Pro Thr Gln Thr Ala Ser Lys Trp Trp Pro
165 170 175
Gly Gly Leu Gly Lys Val Ser Thr His Ala Val Val Tyr Ala Arg Leu
180 185 190
Ile Thr Asn Gly Lys Asp Tyr Gly Ile His Gly Phe Ile Val Gln Leu
195 200 205
Arg Ser Leu Glu Asp His Ser Pro Leu Pro Asn Ile Thr Val Gly Asp
210 215 220
Ile Gly Thr Lys Met Gly Asn Gly Ala Tyr Asn Ser Met Asp Asn Gly
225 230 235 240
Phe Leu Met Phe Asp His Val Arg Ile Pro Arg Asp Gln Met Leu Met
245 250 255
Arg Leu Ser Lys Val Thr Arg Glu Gly Glu Tyr Val Pro Ser Asp Val
260 265 270
Pro Lys Gln Leu Val Tyr Gly Thr Met Val Tyr Val Arg Gln Thr Ile
275 280 285
Val Ala Asp Ala Ser Asn Ala Leu Ser Arg Ala Val Cys Ile Ala Thr
290 295 300
Arg Tyr Ser Ala Val Arg Arg Gln Phe Gly Ala His Asn Gly Gly Ile
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Glu Thr Gln Val Ile Asp Tyr Lys Thr Gln Gln Asn Arg Leu Phe Pro
325 330 335
Leu Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Phe Arg Phe Val Gly Glu Trp Leu Lys
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Trp Leu Tyr Thr Asp Val Thr Glu Arg Leu Ala Ala Ser Asp Phe Ala
355 360 365
Thr Leu Pro Glu Ala His Ala Cys Thr Ala Gly Leu Lys Ser Leu Thr
370 375 380
Thr Thr Ala Thr Ala Asp Gly Ile Glu Glu Cys Arg Lys Leu Cys Gly
385 390 395 400
Gly His Gly Tyr Leu Trp Cys Ser Gly Leu Pro Glu Leu Phe Ala Val
405 410 415
Tyr Val Pro Ala Cys Thr Tyr Glu Gly Asp Asn Val Val Leu Gln Leu
420 425 430
Gln Val Ala Arg Phe Leu Met Lys Thr Val Ala Gln Leu Gly Ser Gly
435 440 445
Lys Val Pro Val Gly Thr Thr Ala Tyr Met Gly Arg Ala Ala His Leu
450 455 460
Leu Gln Cys Arg Ser Gly Val Gln Lys Ala Glu Asp Trp Leu Asn Pro
465 470 475 480
Asp Val Val Leu Glu Ala Phe Glu Ala Arg Ala Leu Arg Met Ala Val
485 490 495
Thr Cys Ala Lys Asn Leu Ser Lys Phe Glu Asn Gln Glu Gln Gly Phe
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Gln Glu Leu Leu Ala Asp Leu Val Glu Ala Ala Ile Ala His Cys Gln
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Leu Ile Val Val Ser Lys Phe Ile Ala Lys Leu Glu Gln Asp Ile Gly
530 535 540
Gly Lys Gly Val Lys Lys Gln Leu Asn Asn Leu Cys Tyr Ile Tyr Ala
545 550 555 560
Leu Tyr Leu Leu His Lys His Leu Gly Asp Phe Leu Ser Thr Asn Cys
565 570 575
Ile Thr Pro Lys Gln Ala Ser Leu Ala Asn Asp Gln Leu Arg Ser Leu
580 585 590
Tyr Thr Gln Val Arg Pro Asn Ala Val Ala Leu Val Asp Ala Phe Asn
595 600 605
Tyr Thr Asp His Tyr Leu Asn Ser Val Leu Gly Arg Tyr Asp Gly Asn
610 615 620
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Gln Gln Leu Arg Thr Ala Arg Leu Asp Gln Ile Thr Ser Val Gly Ser
660 665 670
Ser Ser Lys Leu
675
<210> 42
<211> 2115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2115)
<223> 过氧化物酶体氧化酶2的DNA密码子优化序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2115)
<223> 拟南芥过氧化物酶体氧化酶2的DNA密码子优化序列
<400> 42
atggaatctc gacgagagaa gaaccccatg accgaggaag agtctgacgg cctgatcgcc 60
gctcgacgaa tccagcgact gtctctgcac ctgtcgcctt ctctgacccc ttctccttcg 120
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ttcttcaact ctcgacccga cctgcagacc cctatcgaga tctctaagga cgaccaccga 300
gagctgtgca tgaaccagct gatcggcctg gtgcgagagg ccggcgtgcg acccttccga 360
tacgtggctg acgaccctga gaagtacttt gccatcatgg aagccgtggg ctctgtggac 420
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attctgccca ctcacgactc taagggcgtg tctgacatgg gagtgcacgc cttcatcgtg 780
cccatccgag acatgaagac ccaccagact ctgcccggcg tcgagatcca ggactgcggc 840
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tactccctgc tgcgacagca gttcggccct cctaagcagc ccgaggtgtc tattctggac 1140
taccagtctc agcagcacaa gctgatgccc atgctggcct ctacctacgc ctaccacttc 1200
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accctgaccg tcacctggtc ttacctgcga gagtctatga acacctacct ctcgcagccc 1560
aaccctgtga ccgctcgatg ggaaggcgag gaccatctgc gagatcccaa gtttcagctg 1620
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cactctaaga ccctcggcgg cttcggcgcc tggaaccgat gcctgaacca tctgctgacc 1740
ctggccgagt ctcacatcga gactgtgatc ctggccaagt tcatcgaggc cgtgaagaac 1800
tgccccgatc cttctgccaa ggccgctctg aagctggcct gcgacctgta cgccctggac 1860
cgaatctgga aggacatcgg cacctaccga aacgtggact acgtggctcc caacaaggcc 1920
aaggccatcc acaagctcac cgagtacctg tctttccagg tgcgaaacgt cgccaaggaa 1980
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tcttcgaagc tgtag 2115
<210> 43
<211> 704
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 43
Met Glu Ser Arg Arg Glu Lys Asn Pro Met Thr Glu Glu Glu Ser Asp
1 5 10 15
Gly Leu Ile Ala Ala Arg Arg Ile Gln Arg Leu Ser Leu His Leu Ser
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Pro Ser Leu Thr Pro Ser Pro Ser Leu Pro Leu Val Gln Thr Glu Thr
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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Ile Leu Pro Thr His Asp Ser Lys Gly Val Ser Asp Met Gly Val His
245 250 255
Ala Phe Ile Val Pro Ile Arg Asp Met Lys Thr His Gln Thr Leu Pro
260 265 270
Gly Val Glu Ile Gln Asp Cys Gly His Lys Val Gly Leu Asn Gly Val
275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
Val Gly Gly Arg Val Gly Leu Ala Tyr Ala Ser Val Gly Val Leu Lys
340 345 350
Ile Ser Ala Thr Ile Ala Ile Arg Tyr Ser Leu Leu Arg Gln Gln Phe
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Gly Pro Pro Lys Gln Pro Glu Val Ser Ile Leu Asp Tyr Gln Ser Gln
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Asp Glu Gln Leu Val Ala Asp Val His Ala Leu Ser Ala Gly Leu Lys
420 425 430
Ser Tyr Val Thr Ser Tyr Thr Ala Lys Ala Leu Ser Val Cys Arg Glu
435 440 445
Ala Cys Gly Gly His Gly Tyr Ala Ala Val Asn Arg Phe Gly Ser Leu
450 455 460
Arg Asn Asp His Asp Ile Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Asn Thr Val
465 470 475 480
Leu Leu Gln Gln Val Ala Ala Asp Leu Leu Lys Arg Tyr Lys Glu Lys
485 490 495
Phe Gln Gly Gly Thr Leu Thr Val Thr Trp Ser Tyr Leu Arg Glu Ser
500 505 510
Met Asn Thr Tyr Leu Ser Gln Pro Asn Pro Val Thr Ala Arg Trp Glu
515 520 525
Gly Glu Asp His Leu Arg Asp Pro Lys Phe Gln Leu Asp Ala Phe Arg
530 535 540
Tyr Arg Thr Ser Arg Leu Leu Gln Asn Val Ala Ala Arg Leu Gln Lys
545 550 555 560
His Ser Lys Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ala Trp Asn Arg Cys Leu Asn
565 570 575
His Leu Leu Thr Leu Ala Glu Ser His Ile Glu Thr Val Ile Leu Ala
580 585 590
Lys Phe Ile Glu Ala Val Lys Asn Cys Pro Asp Pro Ser Ala Lys Ala
595 600 605
Ala Leu Lys Leu Ala Cys Asp Leu Tyr Ala Leu Asp Arg Ile Trp Lys
610 615 620
Asp Ile Gly Thr Tyr Arg Asn Val Asp Tyr Val Ala Pro Asn Lys Ala
625 630 635 640
Lys Ala Ile His Lys Leu Thr Glu Tyr Leu Ser Phe Gln Val Arg Asn
645 650 655
Val Ala Lys Glu Leu Val Asp Ala Phe Glu Leu Pro Asp His Val Thr
660 665 670
Arg Ala Pro Ile Ala Met Gln Ser Asp Ala Tyr Ser Gln Tyr Thr Gln
675 680 685
Val Val Gly Phe Asp Gln Ile Thr Ser Val Gly Ser Ser Ser Lys Leu
690 695 700
<210> 44
<211> 2091
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2091)
<223> 过氧化物酶体氧化酶的DNA密码子优化序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2091)
<223> 构巢曲霉过氧化物酶体氧化酶的DNA密码子优化序列
<400> 44
atgcccaacc ctccgcctgc ctgggtgcaa gctctgaagc ccgcttcgcc ccagggcacc 60
gagctgctga cccaagagcg agcccagtct aacatcgacg tggacaccct gggcgacctg 120
ctgcacacca aggaagccct gaagaagcag gacgagatcc tgtctgtgct gaagtctgag 180
aaggtgttcg acaagtctcg aaaccacgtg ctgggccgaa ccgagaagat ccagctggcc 240
ctggctcgag gcaagcgact gcagcagctg aagaaggccc acaactggtc tgacgaggac 300
gtccacgtgg ccaacgacct ggtgtctgag cccactcctt acggcctgca cgcctctatg 360
tttctggtga ccctgcgaga gcagggcacc cctgagcagc acaagctgtt ctacgaacga 420
gcccgaaact acgagatcat cggctgctac gcccagaccg agcttggcca cggctctaac 480
gtgcgaggac tcgagactac cgccacttgg gacccctctg accagacctt catcattcac 540
tctcccactc tgaccgcctc taagtggtgg atcggctctc tgggacgaac cgccaaccac 600
gccgtggtga tggcccagct gtacatcggc ggcaagaact acggacccca tcctttcgtg 660
gtgcagatcc gagacatgga aacccaccag cctctcgaga acgtgtacgt gggcgacatc 720
ggccccaagt tcggctacaa caccatggac aacggctttc tgctgttcaa caagctgaag 780
attccccacg tgaacatgct ggcccgattc gcccaggtgg acaaggccac caacaagtac 840
attcgacccg cttctccctc tctgatgtac ggcaccatga cctgggtgcg atccaacatc 900
gtgctgcagg ctggcggcgt gctcgcccga ggcgtgacca ttgccgtgcg atactgcgcc 960
gtgcgacgac agttccagga ccgagatgcc aaggccaacg ccgaagagaa ccaggtgctg 1020
aactacaaga tggtccagat tcgactgctg cccctgctgg ccgccatgta cgccctgcac 1080
ttcaccggcc gaggcatgat gcgactgtac gaagaaaacc aagaacgaat gaaggctgcc 1140
gctcaggccg accaagagaa gcgaggcgct ggccccgagc agctgcgagc cggatctgac 1200
ctgctggctg acctgcacgc tacctcttgc ggcctgaagg ccctggcctc taccaccgct 1260
ggcgagggcc tcgaggtgtg ccgacgagcc tgtggcggcc acggatactc taactactct 1320
ggcatcggac cctggtacgc cgactacctg cctactctga cctgggaggg cgacaactac 1380
atgctgactc agcaggttgc ccgatacctg ctcaagtctg cccgagccgt gctggccggc 1440
aagggcaccg ccaacgacac ctctcgaatc ctgcaggcct acctcgctcg acgagacaag 1500
ggcgcctctt tcgacatcct gggcaacgac gccgacattg tggccgcctt cgcctggcga 1560
accgctcacc tgaccttcga gactctgaag taccgagatg tcgagaagcg atcttggaac 1620
tctctgctga tcaacttctg gcgactgtct accgctctgt ctcagtacct ggtggtgaag 1680
aacttctacg aggccgtgaa ctctcccgag atccgatctt ctctggacaa ggacactgct 1740
tctaccctgc gatctctgtt ccgactgcac gctctgcaca ccctggaccg agaggcctcc 1800
gagttcttct cttctgccgc cgtgaccgtg cgacagatcg gactgaccca gacctctgag 1860
gtgcccaagc tgctggacga gattcgaccc cacgccgtcc gactggtgga ctcttggaag 1920
atccccgact ggcagctgga ctctgccctg ggccgatctg acggcgacgt gtaccccgac 1980
ctgttcaagc gagcctctat gcagaacccc gtgaacgacc tcgtgttcga cccctatcct 2040
tggaacgaga acgtcctgaa gaacgccggt gagatcaagt ctaagctgta g 2091
<210> 45
<211> 696
<212> PRT
<213> 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)
<400> 45
Met Pro Asn Pro Pro Pro Ala Trp Val Gln Ala Leu Lys Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Gln Gly Thr Glu Leu Leu Thr Gln Glu Arg Ala Gln Ser Asn Ile
20 25 30
Asp Val Asp Thr Leu Gly Asp Leu Leu His Thr Lys Glu Ala Leu Lys
35 40 45
Lys Gln Asp Glu Ile Leu Ser Val Leu Lys Ser Glu Lys Val Phe Asp
50 55 60
Lys Ser Arg Asn His Val Leu Gly Arg Thr Glu Lys Ile Gln Leu Ala
65 70 75 80
Leu Ala Arg Gly Lys Arg Leu Gln Gln Leu Lys Lys Ala His Asn Trp
85 90 95
Ser Asp Glu Asp Val His Val Ala Asn Asp Leu Val Ser Glu Pro Thr
100 105 110
Pro Tyr Gly Leu His Ala Ser Met Phe Leu Val Thr Leu Arg Glu Gln
115 120 125
Gly Thr Pro Glu Gln His Lys Leu Phe Tyr Glu Arg Ala Arg Asn Tyr
130 135 140
Glu Ile Ile Gly Cys Tyr Ala Gln Thr Glu Leu Gly His Gly Ser Asn
145 150 155 160
Val Arg Gly Leu Glu Thr Thr Ala Thr Trp Asp Pro Ser Asp Gln Thr
165 170 175
Phe Ile Ile His Ser Pro Thr Leu Thr Ala Ser Lys Trp Trp Ile Gly
180 185 190
Ser Leu Gly Arg Thr Ala Asn His Ala Val Val Met Ala Gln Leu Tyr
195 200 205
Ile Gly Gly Lys Asn Tyr Gly Pro His Pro Phe Val Val Gln Ile Arg
210 215 220
Asp Met Glu Thr His Gln Pro Leu Glu Asn Val Tyr Val Gly Asp Ile
225 230 235 240
Gly Pro Lys Phe Gly Tyr Asn Thr Met Asp Asn Gly Phe Leu Leu Phe
245 250 255
Asn Lys Leu Lys Ile Pro His Val Asn Met Leu Ala Arg Phe Ala Gln
260 265 270
Val Asp Lys Ala Thr Asn Lys Tyr Ile Arg Pro Ala Ser Pro Ser Leu
275 280 285
Met Tyr Gly Thr Met Thr Trp Val Arg Ser Asn Ile Val Leu Gln Ala
290 295 300
Gly Gly Val Leu Ala Arg Gly Val Thr Ile Ala Val Arg Tyr Cys Ala
305 310 315 320
Val Arg Arg Gln Phe Gln Asp Arg Asp Ala Lys Ala Asn Ala Glu Glu
325 330 335
Asn Gln Val Leu Asn Tyr Lys Met Val Gln Ile Arg Leu Leu Pro Leu
340 345 350
Leu Ala Ala Met Tyr Ala Leu His Phe Thr Gly Arg Gly Met Met Arg
355 360 365
Leu Tyr Glu Glu Asn Gln Glu Arg Met Lys Ala Ala Ala Gln Ala Asp
370 375 380
Gln Glu Lys Arg Gly Ala Gly Pro Glu Gln Leu Arg Ala Gly Ser Asp
385 390 395 400
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Thr Ser Cys Gly Leu Lys Ala Leu Ala
405 410 415
Ser Thr Thr Ala Gly Glu Gly Leu Glu Val Cys Arg Arg Ala Cys Gly
420 425 430
Gly His Gly Tyr Ser Asn Tyr Ser Gly Ile Gly Pro Trp Tyr Ala Asp
435 440 445
Tyr Leu Pro Thr Leu Thr Trp Glu Gly Asp Asn Tyr Met Leu Thr Gln
450 455 460
Gln Val Ala Arg Tyr Leu Leu Lys Ser Ala Arg Ala Val Leu Ala Gly
465 470 475 480
Lys Gly Thr Ala Asn Asp Thr Ser Arg Ile Leu Gln Ala Tyr Leu Ala
485 490 495
Arg Arg Asp Lys Gly Ala Ser Phe Asp Ile Leu Gly Asn Asp Ala Asp
500 505 510
Ile Val Ala Ala Phe Ala Trp Arg Thr Ala His Leu Thr Phe Glu Thr
515 520 525
Leu Lys Tyr Arg Asp Val Glu Lys Arg Ser Trp Asn Ser Leu Leu Ile
530 535 540
Asn Phe Trp Arg Leu Ser Thr Ala Leu Ser Gln Tyr Leu Val Val Lys
545 550 555 560
Asn Phe Tyr Glu Ala Val Asn Ser Pro Glu Ile Arg Ser Ser Leu Asp
565 570 575
Lys Asp Thr Ala Ser Thr Leu Arg Ser Leu Phe Arg Leu His Ala Leu
580 585 590
His Thr Leu Asp Arg Glu Ala Ser Glu Phe Phe Ser Ser Ala Ala Val
595 600 605
Thr Val Arg Gln Ile Gly Leu Thr Gln Thr Ser Glu Val Pro Lys Leu
610 615 620
Leu Asp Glu Ile Arg Pro His Ala Val Arg Leu Val Asp Ser Trp Lys
625 630 635 640
Ile Pro Asp Trp Gln Leu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Ser Asp Gly Asp
645 650 655
Val Tyr Pro Asp Leu Phe Lys Arg Ala Ser Met Gln Asn Pro Val Asn
660 665 670
Asp Leu Val Phe Asp Pro Tyr Pro Trp Asn Glu Asn Val Leu Lys Asn
675 680 685
Ala Gly Glu Ile Lys Ser Lys Leu
690 695
<210> 46
<211> 1977
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1977)
<223> 笋瓜过氧化物酶体氧化酶的DNA密码子优化序列
<400> 46
atggccgctg gcaaggccaa ggctaagatc gaggtggaca tgggatctct gtctctgtac 60
atgcgaggca agcaccgaga gatccaagag cgagtgttcg agtacttcaa ctctcgaccc 120
gagctgcaga cccctgtggg catctctatg gccgaccacc gagagctgtg catgaagcag 180
ctggtcggcc tggtgcgaga ggccggcatt cgacccttcc gattcgtgaa cgaggacccc 240
gccaagtact tcgccatcat ggaagccgtg ggctctgtgg acgtgtctct ggccatcaag 300
atgggcgtgc agttctctct gtggggcggc tctgtgatca acctgggcac caagaagcac 360
cgggaccgat tcttcgacgg catcgacaac gtggactacc ccggctgctt cgccatgact 420
gagctgcacc acggctctaa cgtgcagggc ctgcagacca ccgccacttt cgaccccatc 480
accgacgagt tcatcatcaa cacccctaac gacggcgcca tcaagtggtg gatcggcaac 540
gccgccgtcc acggcaagtt cgccaccgtg ttcgccaagc tggtgctgcc cactcacgac 600
tctcgaaaga ccgccgacat gggagtgcac gccttcatcg tgcccatccg agatctgaag 660
tctcacaaga ccctgcctgg catcgagatc cacgactgcg gccacaaggt gggcctgaac 720
ggcgtggaca acggcgccct gcgattccga tctgtgcgaa ttccccgaga caacctgctg 780
aaccgattcg gcgaggtgtc tcgagatggc aagtacaagt cctctctgcc ctctatcaac 840
aagcgattcg ccgccactct gggcgagctg gttggcggcc gagtcggact ggcctactct 900
tctgcctctg tgctgaagat cgcctctact atcgccatcc gatactccct gctgcgacag 960
cagttcggcc ctcctaagca gcccgaggtg tccatcctgg actaccagtc tcagcagcac 1020
aagctgatgc ccatgctggc ctctacctac gccttccact tctctaccat gcagctcgtc 1080
gagaagtacg cccagatgaa gaagacccac gacgaggaac tggtgggcga cgtgcacgcc 1140
ctgtctgccg gcctgaaggc ctacgtgacc tcttacaccg ccaagtctct gtctacctgc 1200
cgagaggcct gtggcggcca cggatacgcc gtggtcaacc gatttggcac cctgcgaaac 1260
gaccacgaca tcttccagac cttcgagggc gacaacaccg tgctgctcca gcaggtcgcc 1320
gcctacctgc tcaagcagta ccaagagaag ttccaaggcg gcaccctggc cgtgacctgg 1380
aactacctgc gagaatctat gaacacctac ctctcgcagc ccaaccctgt gaccgctcga 1440
tgggagtctg ccgaccatct gcgagatccc aagtttcagc tggacgcttt ccagtaccga 1500
acctctcgac tgctgcagtc tgtggccgtg cgactgcgaa agcacaccaa gaacctggga 1560
tctttcggcg cctggaaccg atgcctgaac catctgctga ccctggctga gtctcacatc 1620
gagtctgtga ttctggccca gttcatcgag tccgtgcaga gatgtcccaa cgctaacacc 1680
caggctaccc tgaagctggt gtgcgacctg tacgctctgg accgaatctg gaacgacatc 1740
ggcacctacc gaaacgtcga ctacgtggct cccaacaagg caaaggccat ccacaagctc 1800
accgagtacc tgtgcttcca ggtgcgaaac attgcccaag agctggtgga cgccttcgac 1860
ctgcctgacc acgtgactcg agcccctatt gccatgaagt ctaacgccta ctctcagtac 1920
acccagtaca tcggcttcga ccagattacc tctgtgggat cttcgtctaa gctgtag 1977
<210> 47
<211> 658
<212> PRT
<213> 笋瓜(Cucurbita maxima)
<400> 47
Met Ala Ala Gly Lys Ala Lys Ala Lys Ile Glu Val Asp Met Gly Ser
1 5 10 15
Leu Ser Leu Tyr Met Arg Gly Lys His Arg Glu Ile Gln Glu Arg Val
20 25 30
Phe Glu Tyr Phe Asn Ser Arg Pro Glu Leu Gln Thr Pro Val Gly Ile
35 40 45
Ser Met Ala Asp His Arg Glu Leu Cys Met Lys Gln Leu Val Gly Leu
50 55 60
Val Arg Glu Ala Gly Ile Arg Pro Phe Arg Phe Val Asn Glu Asp Pro
65 70 75 80
Ala Lys Tyr Phe Ala Ile Met Glu Ala Val Gly Ser Val Asp Val Ser
85 90 95
Leu Ala Ile Lys Met Gly Val Gln Phe Ser Leu Trp Gly Gly Ser Val
100 105 110
Ile Asn Leu Gly Thr Lys Lys His Arg Asp Arg Phe Phe Asp Gly Ile
115 120 125
Asp Asn Val Asp Tyr Pro Gly Cys Phe Ala Met Thr Glu Leu His His
130 135 140
Gly Ser Asn Val Gln Gly Leu Gln Thr Thr Ala Thr Phe Asp Pro Ile
145 150 155 160
Thr Asp Glu Phe Ile Ile Asn Thr Pro Asn Asp Gly Ala Ile Lys Trp
165 170 175
Trp Ile Gly Asn Ala Ala Val His Gly Lys Phe Ala Thr Val Phe Ala
180 185 190
Lys Leu Val Leu Pro Thr His Asp Ser Arg Lys Thr Ala Asp Met Gly
195 200 205
Val His Ala Phe Ile Val Pro Ile Arg Asp Leu Lys Ser His Lys Thr
210 215 220
Leu Pro Gly Ile Glu Ile His Asp Cys Gly His Lys Val Gly Leu Asn
225 230 235 240
Gly Val Asp Asn Gly Ala Leu Arg Phe Arg Ser Val Arg Ile Pro Arg
245 250 255
Asp Asn Leu Leu Asn Arg Phe Gly Glu Val Ser Arg Asp Gly Lys Tyr
260 265 270
Lys Ser Ser Leu Pro Ser Ile Asn Lys Arg Phe Ala Ala Thr Leu Gly
275 280 285
Glu Leu Val Gly Gly Arg Val Gly Leu Ala Tyr Ser Ser Ala Ser Val
290 295 300
Leu Lys Ile Ala Ser Thr Ile Ala Ile Arg Tyr Ser Leu Leu Arg Gln
305 310 315 320
Gln Phe Gly Pro Pro Lys Gln Pro Glu Val Ser Ile Leu Asp Tyr Gln
325 330 335
Ser Gln Gln His Lys Leu Met Pro Met Leu Ala Ser Thr Tyr Ala Phe
340 345 350
His Phe Ser Thr Met Gln Leu Val Glu Lys Tyr Ala Gln Met Lys Lys
355 360 365
Thr His Asp Glu Glu Leu Val Gly Asp Val His Ala Leu Ser Ala Gly
370 375 380
Leu Lys Ala Tyr Val Thr Ser Tyr Thr Ala Lys Ser Leu Ser Thr Cys
385 390 395 400
Arg Glu Ala Cys Gly Gly His Gly Tyr Ala Val Val Asn Arg Phe Gly
405 410 415
Thr Leu Arg Asn Asp His Asp Ile Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Asn
420 425 430
Thr Val Leu Leu Gln Gln Val Ala Ala Tyr Leu Leu Lys Gln Tyr Gln
435 440 445
Glu Lys Phe Gln Gly Gly Thr Leu Ala Val Thr Trp Asn Tyr Leu Arg
450 455 460
Glu Ser Met Asn Thr Tyr Leu Ser Gln Pro Asn Pro Val Thr Ala Arg
465 470 475 480
Trp Glu Ser Ala Asp His Leu Arg Asp Pro Lys Phe Gln Leu Asp Ala
485 490 495
Phe Gln Tyr Arg Thr Ser Arg Leu Leu Gln Ser Val Ala Val Arg Leu
500 505 510
Arg Lys His Thr Lys Asn Leu Gly Ser Phe Gly Ala Trp Asn Arg Cys
515 520 525
Leu Asn His Leu Leu Thr Leu Ala Glu Ser His Ile Glu Ser Val Ile
530 535 540
Leu Ala Gln Phe Ile Glu Ser Val Gln Arg Cys Pro Asn Ala Asn Thr
545 550 555 560
Gln Ala Thr Leu Lys Leu Val Cys Asp Leu Tyr Ala Leu Asp Arg Ile
565 570 575
Trp Asn Asp Ile Gly Thr Tyr Arg Asn Val Asp Tyr Val Ala Pro Asn
580 585 590
Lys Ala Lys Ala Ile His Lys Leu Thr Glu Tyr Leu Cys Phe Gln Val
595 600 605
Arg Asn Ile Ala Gln Glu Leu Val Asp Ala Phe Asp Leu Pro Asp His
610 615 620
Val Thr Arg Ala Pro Ile Ala Met Lys Ser Asn Ala Tyr Ser Gln Tyr
625 630 635 640
Thr Gln Tyr Ile Gly Phe Asp Gln Ile Thr Ser Val Gly Ser Ser Ser
645 650 655
Lys Leu
<210> 48
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2019)
<223> 智人过氧化物酶体氧化酶的DNA密码子优化序列
<400> 48
atgaaccccg acctgcgacg agagcgagac tctgcctctt tcaaccccga gctgctgacc 60
cacatcctgg acggctctcc cgaaaagacc cgacgacgac gagaaatcga gaacatgatc 120
ctgaacgacc ccgacttcca gcacgaggac ctgaactttc tgacccgatc tcagcgatac 180
gaggtggccg tgcgaaagtc tgccatcatg gtgaagaaga tgcgagagtt cggaatcgct 240
gaccccgacg agatcatgtg gttcaagaac ttcgtgcacc gaggacgacc cgagcctctg 300
gacctgcacc tgggcatgtt tctgcccact ctgctgcacc aggccaccgc cgagcagcaa 360
gagcgattct tcatgcccgc ctggaacctc gagatcatcg gcacctacgc tcagaccgag 420
atgggccacg gcacccacct ccgaggactc gagactaccg ccacctacga tcccgagact 480
caagagttca tcctgaactc tcccaccgtg acctctatca agtggtggcc cggtggactg 540
ggcaagacct ctaaccacgc catcgtgctg gcccagctga tcaccaaggg caagtgctac 600
ggcctgcacg ccttcatcgt gcccatccga gagatcggaa cccacaagcc tctgcctggc 660
atcaccgtgg gcgacatcgg ccccaagttc ggctacgacg agattgacaa cggctacctg 720
aagatggaca accaccgaat tcctcgagag aacatgctga tgaagtacgc ccaggtgaag 780
cccgacggaa cctacgtgaa gcccctgtct aacaagctga cctacggaac catggtgttc 840
gtgcgatctt tcctggtcgg cgaggccgct cgagccctgt ccaaggcctg caccattgcc 900
atccgatact ctgccgtgcg acaccagtct gagatcaagc ccggcgagcc tgagcctcag 960
atcctggact ttcagaccca gcagtacaag ctgttccctc tgctggccac cgcttacgcc 1020
ttccagttcg tgggcgccta catgaaggaa acctaccatc gaatcaacga aggcatcggc 1080
cagggcgacc tgtctgagct gcccgaactg cacgccctga ccgccggact gaaggctttc 1140
acctcttgga ccgccaacac cggcatcgag gcctgccgaa tggcctgtgg cggccacggc 1200
tactctcact gctctggact gcccaacatc tacgtgaact tcaccccttc gtgtaccttc 1260
gagggcgaga acaccgtgat gatgctgcag accgctcgat tcctcatgaa gtcttacgac 1320
caggtgcact ctggcaagct ggtgtgcggc atggtgtctt acctgaacga tctgccctct 1380
cagcgaattc agcctcagca ggttgccgtg tggcccacca tggtcgacat caactctccc 1440
gagtctctga ccgaggccta caagctgcga gctgctcgac tggtcgagat cgccgccaag 1500
aacctgcaga aggaagtcat ccaccgaaag tctaaggaag tggcttggaa cctgacctct 1560
gtggacctgg tgcgagcttc tgaggcccac tgccactacg tggtggtgaa gctgttctct 1620
gagaagctgc tgaagatcca ggacaaggcc atccaggccg tgctgcgatc tctgtgcctg 1680
ctgtactctc tgtacggcat ctctcagaac gccggcgact tcctgcaggg ctctatcatg 1740
actgagcccc agattaccca ggtcaaccag cgagtgaagg aactgctcac cctgatccga 1800
tctgacgccg tggctctggt ggacgccttc gactttcagg acgtgaccct gggctctgtg 1860
ctgggccgat acgacggcaa cgtgtacgag aacctgttcg agtgggccaa gaactcgccc 1920
ctgaacaagg ccgaggtgca cgagtcttac aagcacctga agtctctgca gtctaagctg 1980
gaccagatta cttctgtggg atcttcttcg aagctgtag 2019
<210> 49
<211> 672
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Met Asn Pro Asp Leu Arg Arg Glu Arg Asp Ser Ala Ser Phe Asn Pro
1 5 10 15
Glu Leu Leu Thr His Ile Leu Asp Gly Ser Pro Glu Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Arg Arg Glu Ile Glu Asn Met Ile Leu Asn Asp Pro Asp Phe Gln His
35 40 45
Glu Asp Leu Asn Phe Leu Thr Arg Ser Gln Arg Tyr Glu Val Ala Val
50 55 60
Arg Lys Ser Ala Ile Met Val Lys Lys Met Arg Glu Phe Gly Ile Ala
65 70 75 80
Asp Pro Asp Glu Ile Met Trp Phe Lys Asn Phe Val His Arg Gly Arg
85 90 95
Pro Glu Pro Leu Asp Leu His Leu Gly Met Phe Leu Pro Thr Leu Leu
100 105 110
His Gln Ala Thr Ala Glu Gln Gln Glu Arg Phe Phe Met Pro Ala Trp
115 120 125
Asn Leu Glu Ile Ile Gly Thr Tyr Ala Gln Thr Glu Met Gly His Gly
130 135 140
Thr His Leu Arg Gly Leu Glu Thr Thr Ala Thr Tyr Asp Pro Glu Thr
145 150 155 160
Gln Glu Phe Ile Leu Asn Ser Pro Thr Val Thr Ser Ile Lys Trp Trp
165 170 175
Pro Gly Gly Leu Gly Lys Thr Ser Asn His Ala Ile Val Leu Ala Gln
180 185 190
Leu Ile Thr Lys Gly Lys Cys Tyr Gly Leu His Ala Phe Ile Val Pro
195 200 205
Ile Arg Glu Ile Gly Thr His Lys Pro Leu Pro Gly Ile Thr Val Gly
210 215 220
Asp Ile Gly Pro Lys Phe Gly Tyr Asp Glu Ile Asp Asn Gly Tyr Leu
225 230 235 240
Lys Met Asp Asn His Arg Ile Pro Arg Glu Asn Met Leu Met Lys Tyr
245 250 255
Ala Gln Val Lys Pro Asp Gly Thr Tyr Val Lys Pro Leu Ser Asn Lys
260 265 270
Leu Thr Tyr Gly Thr Met Val Phe Val Arg Ser Phe Leu Val Gly Glu
275 280 285
Ala Ala Arg Ala Leu Ser Lys Ala Cys Thr Ile Ala Ile Arg Tyr Ser
290 295 300
Ala Val Arg His Gln Ser Glu Ile Lys Pro Gly Glu Pro Glu Pro Gln
305 310 315 320
Ile Leu Asp Phe Gln Thr Gln Gln Tyr Lys Leu Phe Pro Leu Leu Ala
325 330 335
Thr Ala Tyr Ala Phe Gln Phe Val Gly Ala Tyr Met Lys Glu Thr Tyr
340 345 350
His Arg Ile Asn Glu Gly Ile Gly Gln Gly Asp Leu Ser Glu Leu Pro
355 360 365
Glu Leu His Ala Leu Thr Ala Gly Leu Lys Ala Phe Thr Ser Trp Thr
370 375 380
Ala Asn Thr Gly Ile Glu Ala Cys Arg Met Ala Cys Gly Gly His Gly
385 390 395 400
Tyr Ser His Cys Ser Gly Leu Pro Asn Ile Tyr Val Asn Phe Thr Pro
405 410 415
Ser Cys Thr Phe Glu Gly Glu Asn Thr Val Met Met Leu Gln Thr Ala
420 425 430
Arg Phe Leu Met Lys Ser Tyr Asp Gln Val His Ser Gly Lys Leu Val
435 440 445
Cys Gly Met Val Ser Tyr Leu Asn Asp Leu Pro Ser Gln Arg Ile Gln
450 455 460
Pro Gln Gln Val Ala Val Trp Pro Thr Met Val Asp Ile Asn Ser Pro
465 470 475 480
Glu Ser Leu Thr Glu Ala Tyr Lys Leu Arg Ala Ala Arg Leu Val Glu
485 490 495
Ile Ala Ala Lys Asn Leu Gln Lys Glu Val Ile His Arg Lys Ser Lys
500 505 510
Glu Val Ala Trp Asn Leu Thr Ser Val Asp Leu Val Arg Ala Ser Glu
515 520 525
Ala His Cys His Tyr Val Val Val Lys Leu Phe Ser Glu Lys Leu Leu
530 535 540
Lys Ile Gln Asp Lys Ala Ile Gln Ala Val Leu Arg Ser Leu Cys Leu
545 550 555 560
Leu Tyr Ser Leu Tyr Gly Ile Ser Gln Asn Ala Gly Asp Phe Leu Gln
565 570 575
Gly Ser Ile Met Thr Glu Pro Gln Ile Thr Gln Val Asn Gln Arg Val
580 585 590
Lys Glu Leu Leu Thr Leu Ile Arg Ser Asp Ala Val Ala Leu Val Asp
595 600 605
Ala Phe Asp Phe Gln Asp Val Thr Leu Gly Ser Val Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Asp Gly Asn Val Tyr Glu Asn Leu Phe Glu Trp Ala Lys Asn Ser Pro
625 630 635 640
Leu Asn Lys Ala Glu Val His Glu Ser Tyr Lys His Leu Lys Ser Leu
645 650 655
Gln Ser Lys Leu Asp Gln Ile Thr Ser Val Gly Ser Ser Ser Lys Leu
660 665 670
<210> 50
<211> 2148
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2148)
<223> 产脲类节杆菌过氧化物酶体氧化酶的DNA密码子优化序列
<400> 50
atgaccgagg tggtggaccg agcctcttct cccgcctctc ctggctctac caccgccgct 60
gccgacggcg ccaaggtggc cgtcgagcct cgagtggacg tggccgctct gggcgagcag 120
ctcctcggcc gatgggccga catccgactg cacgcccgag atctggccgg acgagaggtg 180
gtgcagaagg tcgagggact gacccacacc gagcaccgat ctcgagtgtt cggccagctg 240
aagtacctgg tggacaacaa cgccgtgcac cgagctttcc cttctcgact cggcggatct 300
gacgaccacg gcggcaacat tgccggcttc gaggaactgg tgactgctga cccctcgctg 360
cagatcaagg ccggcgtcca gtggggcctg ttcggctctg ccgtgatgca cctgggcacc 420
cgagagcacc acgacaagtg gctgcccggc atcatgtctc tcgagatccc cggctgcttc 480
gccatgaccg agactggcca cggctctgac gtggcctcta tcgccaccac cgccacctac 540
gacgaagaga ctcaagagtt cgtgatcgac acacccttcc gagccgcctg gaaggactac 600
atcggcaacg ccgccaacga cggcctggcc gccgtcgtgt tcgctcagct gatcacccga 660
aaggtgaacc acggcgtcca cgccttctac gtggacctgc gagatcccgc caccggcgac 720
tttctgcccg gaatcggcgg cgaggacgac ggcatcaagg gcggcctgaa cggcatcgac 780
aacggacgac tgcacttcac caacgtgcga attccccgaa ctaacctgct gaaccgatac 840
ggcgacgtgg ctgtggacgg cacctactct tctaccatcg agtctcccgg ccgacgattc 900
ttcaccatgc tgggaaccct ggtgcagggc cgagtgtctc tggacggcgc tgccgtggcc 960
gcctctaagg tggccctgca gtctgccatc cactacgccg ccgagcgacg acagttcaac 1020
gccacctctc ctaccgagga agaggtgctg ctggactacc agcgacatca gcgacgactg 1080
tttacccgac tggctactac ctacgctgcc tctttcgccc acgaacagct gctgcaaaag 1140
ttcgacgacg tgttctctgg cgcccacgac accgacgccg accgacagga cctcgagact 1200
ctggctgccg ctctgaagcc cctgtctacc tggcacgccc tggacaccct gcaagagtgc 1260
cgagaggcct gcggcggagc cggcttcctg atcgagaacc gattcgcctc tctgcgagct 1320
gacctggacg tgtacgtgac cttcgagggc gacaacaccg tgctgctgca gctggtggcc 1380
aagcgactgc tggccgacta cgccaaggaa ttccgaggcg ccaacttcgg cgtgctggcc 1440
cgatacgtcg tggaccaggc cgctggcgtg gctctgcacc gaaccggcct gcgacaggtg 1500
gcccagttcg tggccgactc cggctctgtg cagaagtctg ccctggctct gcgagatgag 1560
gaaggccagc gaaccctgct gaccgaccga gtgcagtcta tggtggccga ggtgggcgct 1620
gccctgaagg gcgctggcaa gctgccccag caccaggctg ctgccctgtt caaccagcat 1680
cagaacgagc tgatcgaggc cgctcaggcc cacgccgagc tgctccagtg ggaagccttc 1740
accgaggctc tggccaaggt cgacgacgcc ggcaccaagg aagtgctgac ccgactgcgg 1800
gacctgttcg gactgtctct gattgagaag cacctgtctt ggtatctgat gaacggccga 1860
ctgtctatgc agcggggacg aaccgtgggc acctacatca accgactgct cgtgaagatt 1920
cgaccccacg ctctggacct ggtcgacgcc ttcggctacg gcgctgagca tctgcgagcc 1980
gccattgcca ccggtgccga ggccactcga caggacgagg cccgaaccta cttccgacag 2040
cagcgagcct ctggatctgc ccctgccgac gaaaagaccc tgctggccat taaggccggc 2100
aagtcccgag atcagattac ctctgtggga tcttcttcga agctgtag 2148
<210> 51
<211> 715
<212> PRT
<213> 产脲类节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)
<400> 51
Met Thr Glu Val Val Asp Arg Ala Ser Ser Pro Ala Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Ala Ala Asp Gly Ala Lys Val Ala Val Glu Pro Arg Val
20 25 30
Asp Val Ala Ala Leu Gly Glu Gln Leu Leu Gly Arg Trp Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Leu His Ala Arg Asp Leu Ala Gly Arg Glu Val Val Gln Lys Val
50 55 60
Glu Gly Leu Thr His Thr Glu His Arg Ser Arg Val Phe Gly Gln Leu
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Val Asp Asn Asn Ala Val His Arg Ala Phe Pro Ser Arg
85 90 95
Leu Gly Gly Ser Asp Asp His Gly Gly Asn Ile Ala Gly Phe Glu Glu
100 105 110
Leu Val Thr Ala Asp Pro Ser Leu Gln Ile Lys Ala Gly Val Gln Trp
115 120 125
Gly Leu Phe Gly Ser Ala Val Met His Leu Gly Thr Arg Glu His His
130 135 140
Asp Lys Trp Leu Pro Gly Ile Met Ser Leu Glu Ile Pro Gly Cys Phe
145 150 155 160
Ala Met Thr Glu Thr Gly His Gly Ser Asp Val Ala Ser Ile Ala Thr
165 170 175
Thr Ala Thr Tyr Asp Glu Glu Thr Gln Glu Phe Val Ile Asp Thr Pro
180 185 190
Phe Arg Ala Ala Trp Lys Asp Tyr Ile Gly Asn Ala Ala Asn Asp Gly
195 200 205
Leu Ala Ala Val Val Phe Ala Gln Leu Ile Thr Arg Lys Val Asn His
210 215 220
Gly Val His Ala Phe Tyr Val Asp Leu Arg Asp Pro Ala Thr Gly Asp
225 230 235 240
Phe Leu Pro Gly Ile Gly Gly Glu Asp Asp Gly Ile Lys Gly Gly Leu
245 250 255
Asn Gly Ile Asp Asn Gly Arg Leu His Phe Thr Asn Val Arg Ile Pro
260 265 270
Arg Thr Asn Leu Leu Asn Arg Tyr Gly Asp Val Ala Val Asp Gly Thr
275 280 285
Tyr Ser Ser Thr Ile Glu Ser Pro Gly Arg Arg Phe Phe Thr Met Leu
290 295 300
Gly Thr Leu Val Gln Gly Arg Val Ser Leu Asp Gly Ala Ala Val Ala
305 310 315 320
Ala Ser Lys Val Ala Leu Gln Ser Ala Ile His Tyr Ala Ala Glu Arg
325 330 335
Arg Gln Phe Asn Ala Thr Ser Pro Thr Glu Glu Glu Val Leu Leu Asp
340 345 350
Tyr Gln Arg His Gln Arg Arg Leu Phe Thr Arg Leu Ala Thr Thr Tyr
355 360 365
Ala Ala Ser Phe Ala His Glu Gln Leu Leu Gln Lys Phe Asp Asp Val
370 375 380
Phe Ser Gly Ala His Asp Thr Asp Ala Asp Arg Gln Asp Leu Glu Thr
385 390 395 400
Leu Ala Ala Ala Leu Lys Pro Leu Ser Thr Trp His Ala Leu Asp Thr
405 410 415
Leu Gln Glu Cys Arg Glu Ala Cys Gly Gly Ala Gly Phe Leu Ile Glu
420 425 430
Asn Arg Phe Ala Ser Leu Arg Ala Asp Leu Asp Val Tyr Val Thr Phe
435 440 445
Glu Gly Asp Asn Thr Val Leu Leu Gln Leu Val Ala Lys Arg Leu Leu
450 455 460
Ala Asp Tyr Ala Lys Glu Phe Arg Gly Ala Asn Phe Gly Val Leu Ala
465 470 475 480
Arg Tyr Val Val Asp Gln Ala Ala Gly Val Ala Leu His Arg Thr Gly
485 490 495
Leu Arg Gln Val Ala Gln Phe Val Ala Asp Ser Gly Ser Val Gln Lys
500 505 510
Ser Ala Leu Ala Leu Arg Asp Glu Glu Gly Gln Arg Thr Leu Leu Thr
515 520 525
Asp Arg Val Gln Ser Met Val Ala Glu Val Gly Ala Ala Leu Lys Gly
530 535 540
Ala Gly Lys Leu Pro Gln His Gln Ala Ala Ala Leu Phe Asn Gln His
545 550 555 560
Gln Asn Glu Leu Ile Glu Ala Ala Gln Ala His Ala Glu Leu Leu Gln
565 570 575
Trp Glu Ala Phe Thr Glu Ala Leu Ala Lys Val Asp Asp Ala Gly Thr
580 585 590
Lys Glu Val Leu Thr Arg Leu Arg Asp Leu Phe Gly Leu Ser Leu Ile
595 600 605
Glu Lys His Leu Ser Trp Tyr Leu Met Asn Gly Arg Leu Ser Met Gln
610 615 620
Arg Gly Arg Thr Val Gly Thr Tyr Ile Asn Arg Leu Leu Val Lys Ile
625 630 635 640
Arg Pro His Ala Leu Asp Leu Val Asp Ala Phe Gly Tyr Gly Ala Glu
645 650 655
His Leu Arg Ala Ala Ile Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Arg Gln Asp
660 665 670
Glu Ala Arg Thr Tyr Phe Arg Gln Gln Arg Ala Ser Gly Ser Ala Pro
675 680 685
Ala Asp Glu Lys Thr Leu Leu Ala Ile Lys Ala Gly Lys Ser Arg Asp
690 695 700
Gln Ile Thr Ser Val Gly Ser Ser Ser Lys Leu
705 710 715
<210> 52
<211> 2022
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2022)
<223> 褐家鼠过氧化物酶体氧化酶的DNA密码子优化序列
<400> 52
atgaaccccg acctgcgaaa ggaacgagcc tctgccactt tcaaccccga gctgatcacc 60
cacatcctgg acggctctcc cgagaacacc cgacgacgac gagaaatcga gaacctgatc 120
ctgaacgacc ccgacttcca gcacgaggac tacaactttc tgacccgatc tcagcgatac 180
gaggtggccg tgaagaagtc tgccaccatg gtcaagaaga tgcgagagta cggcatctct 240
gaccccgaag agatcatgtg gttcaagaac tctgtgcacc gaggacaccc tgagcctctg 300
gacctgcacc tgggcatgtt tctgcccact ctgctgcacc aggctaccgc cgagcagcaa 360
gagcgattct tcatgcccgc ctggaacctc gagatcaccg gcacctacgc tcagaccgag 420
atgggccacg gcacccacct ccgaggactc gagactaccg ccacttacga ccccaagact 480
caagagttca tcctgaactc tcccaccgtg acctctatca agtggtggcc cggtggcctg 540
ggcaagacct ctaaccacgc catcgtgctg gcccagctga ttacccaggg cgagtgctac 600
ggcctgcacg ccttcgtggt gcccatccga gagatcggaa cccacaagcc actgcctggc 660
atcaccgtgg gcgacatcgg ccccaagttc ggctacgagg aaatggacaa cggctacctg 720
aagatggaca actaccgaat tcctcgagag aacatgctga tgaagtacgc ccaggtgaag 780
cccgacggaa cctacgtgaa gcccctgtct aacaagctga cctacggaac catggtgttc 840
gtgcgatctt tcctggtggg caacgccgct cagtctctgt ctaaggcctg caccattgcc 900
atccgatact ctgccgtgcg acgacagtct gagatcaagc agtctgagcc cgagcctcag 960
atcctggact ttcagaccca gcagtacaag ctgttccctc tgctggccac cgcctacgcc 1020
ttccacttcg tgggccgata tatgaaggaa acctacctgc gaatcaacga gtctatcggc 1080
cagggcgacc tgtctgagct gcccgagctg cacgccctga ccgccggact gaaggctttc 1140
accacctgga ccgccaacgc cggcatcgag gaatgccgaa tggcctgtgg cggccacggc 1200
tactctcact cctctggcat ccccaacatc tacgtgacct tcactcccgc ctgcaccttc 1260
gagggtgaga acaccgtgat gatgctgcag accgctcgat tcctgatgaa gatctacgac 1320
caggtgcgat ctggcaagct ggtcggcggc atggtgtctt acctgaacga tctgccctct 1380
cagcgaattc agcctcagca ggttgccgtg tggcccacta tggtggacat caactcgctc 1440
gagggcctga ccgaggccta caagctgcga gccgctcgac tggtcgagat cgccgccaag 1500
aacctgcaga cccacgtgtc tcaccgaaag tctaaggaag tggcttggaa cctgacctct 1560
gtggacctgg tgcgagcttc tgaggcccac tgccactacg tggtggtgaa ggtgttctct 1620
gacaagctgc ccaagatcca ggacaaggct gtccaggccg tgctgcgaaa cctgtgcctg 1680
ctgtactctc tgtacggaat ctctcagaag ggcggcgact tcctcgaggg ctctatcatc 1740
accggcgctc agctgtctca ggtcaacgct cgaatcctcg agctgctgac cctgattcga 1800
cccaacgccg tggctctggt ggacgctttc gacttcaagg acatgaccct gggctctgtg 1860
ctgggacgat acgacggcaa cgtgtacgag aacctcttcg agtgggccaa gaagtctccc 1920
ctgaacaaga ccgaggtgca cgagtcttac cacaagcacc tgaagcctct gcagtctaag 1980
ctggaccaga ttacctccgt gggatcttct tcgaagctgt ag 2022
<210> 53
<211> 673
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 53
Met Asn Pro Asp Leu Arg Lys Glu Arg Ala Ser Ala Thr Phe Asn Pro
1 5 10 15
Glu Leu Ile Thr His Ile Leu Asp Gly Ser Pro Glu Asn Thr Arg Arg
20 25 30
Arg Arg Glu Ile Glu Asn Leu Ile Leu Asn Asp Pro Asp Phe Gln His
35 40 45
Glu Asp Tyr Asn Phe Leu Thr Arg Ser Gln Arg Tyr Glu Val Ala Val
50 55 60
Lys Lys Ser Ala Thr Met Val Lys Lys Met Arg Glu Tyr Gly Ile Ser
65 70 75 80
Asp Pro Glu Glu Ile Met Trp Phe Lys Asn Ser Val His Arg Gly His
85 90 95
Pro Glu Pro Leu Asp Leu His Leu Gly Met Phe Leu Pro Thr Leu Leu
100 105 110
His Gln Ala Thr Ala Glu Gln Gln Glu Arg Phe Phe Met Pro Ala Trp
115 120 125
Asn Leu Glu Ile Thr Gly Thr Tyr Ala Gln Thr Glu Met Gly His Gly
130 135 140
Thr His Leu Arg Gly Leu Glu Thr Thr Ala Thr Tyr Asp Pro Lys Thr
145 150 155 160
Gln Glu Phe Ile Leu Asn Ser Pro Thr Val Thr Ser Ile Lys Trp Trp
165 170 175
Pro Gly Gly Leu Gly Lys Thr Ser Asn His Ala Ile Val Leu Ala Gln
180 185 190
Leu Ile Thr Gln Gly Glu Cys Tyr Gly Leu His Ala Phe Val Val Pro
195 200 205
Ile Arg Glu Ile Gly Thr His Lys Pro Leu Pro Gly Ile Thr Val Gly
210 215 220
Asp Ile Gly Pro Lys Phe Gly Tyr Glu Glu Met Asp Asn Gly Tyr Leu
225 230 235 240
Lys Met Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Arg Glu Asn Met Leu Met Lys Tyr
245 250 255
Ala Gln Val Lys Pro Asp Gly Thr Tyr Val Lys Pro Leu Ser Asn Lys
260 265 270
Leu Thr Tyr Gly Thr Met Val Phe Val Arg Ser Phe Leu Val Gly Asn
275 280 285
Ala Ala Gln Ser Leu Ser Lys Ala Cys Thr Ile Ala Ile Arg Tyr Ser
290 295 300
Ala Val Arg Arg Gln Ser Glu Ile Lys Gln Ser Glu Pro Glu Pro Gln
305 310 315 320
Ile Leu Asp Phe Gln Thr Gln Gln Tyr Lys Leu Phe Pro Leu Leu Ala
325 330 335
Thr Ala Tyr Ala Phe His Phe Val Gly Arg Tyr Met Lys Glu Thr Tyr
340 345 350
Leu Arg Ile Asn Glu Ser Ile Gly Gln Gly Asp Leu Ser Glu Leu Pro
355 360 365
Glu Leu His Ala Leu Thr Ala Gly Leu Lys Ala Phe Thr Thr Trp Thr
370 375 380
Ala Asn Ala Gly Ile Glu Glu Cys Arg Met Ala Cys Gly Gly His Gly
385 390 395 400
Tyr Ser His Ser Ser Gly Ile Pro Asn Ile Tyr Val Thr Phe Thr Pro
405 410 415
Ala Cys Thr Phe Glu Gly Glu Asn Thr Val Met Met Leu Gln Thr Ala
420 425 430
Arg Phe Leu Met Lys Ile Tyr Asp Gln Val Arg Ser Gly Lys Leu Val
435 440 445
Gly Gly Met Val Ser Tyr Leu Asn Asp Leu Pro Ser Gln Arg Ile Gln
450 455 460
Pro Gln Gln Val Ala Val Trp Pro Thr Met Val Asp Ile Asn Ser Leu
465 470 475 480
Glu Gly Leu Thr Glu Ala Tyr Lys Leu Arg Ala Ala Arg Leu Val Glu
485 490 495
Ile Ala Ala Lys Asn Leu Gln Thr His Val Ser His Arg Lys Ser Lys
500 505 510
Glu Val Ala Trp Asn Leu Thr Ser Val Asp Leu Val Arg Ala Ser Glu
515 520 525
Ala His Cys His Tyr Val Val Val Lys Val Phe Ser Asp Lys Leu Pro
530 535 540
Lys Ile Gln Asp Lys Ala Val Gln Ala Val Leu Arg Asn Leu Cys Leu
545 550 555 560
Leu Tyr Ser Leu Tyr Gly Ile Ser Gln Lys Gly Gly Asp Phe Leu Glu
565 570 575
Gly Ser Ile Ile Thr Gly Ala Gln Leu Ser Gln Val Asn Ala Arg Ile
580 585 590
Leu Glu Leu Leu Thr Leu Ile Arg Pro Asn Ala Val Ala Leu Val Asp
595 600 605
Ala Phe Asp Phe Lys Asp Met Thr Leu Gly Ser Val Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Asp Gly Asn Val Tyr Glu Asn Leu Phe Glu Trp Ala Lys Lys Ser Pro
625 630 635 640
Leu Asn Lys Thr Glu Val His Glu Ser Tyr His Lys His Leu Lys Pro
645 650 655
Leu Gln Ser Lys Leu Asp Gln Ile Thr Ser Val Gly Ser Ser Ser Lys
660 665 670
Leu
<210> 54
<211> 1152
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 54
atggaaccgt tcaagctagc tcccacgccc gtcactctgc ccgagtactt tgcttttaaa 60
gaattcactc ctaagaaccc cgaacagggt gtgagatact tccactccgt catcaagccg 120
tggcgccctt tctcgtctcc tggcaccttt ggaggattct gtctgagcca gggagctctt 180
tgcgccgcct acacatgccc caagggcttt gttgtgcaca accagcactc gtacttcctt 240
cttccgggtc gttgggacgt gccgttccta tggagagtgg aatctgtgcg agacggccga 300
tcttactgca cccgagaagt caaggcgtac cagcccgatc tcggattcga attccccgag 360
tctccttacc aacagccctc tgacttcgac ttcacagacc ccgccagcaa aaaatggctc 420
gcctacacag cccattcctc catcaagcta ccccacaaag acaccatgtt ccacgaaaag 480
aagctacgac aggatttttt cgccaaaaac gtgcctggag gagctgaggg acacgatctg 540
gcacccgaca ttgacatccc catgtgggtg gactggtcca aggaccctgc taacggctac 600
aagctggaac ctcatccgat agagatgcgc aaggtggaca tggacaaggt gcttcctgca 660
gtcaacaagg gcaaggacgt ggccgagaga cgtcagctgt actttttccg agtgccctac 720
aagctgcctg acgacatgaa ctaccatgtg gcagccatgc tctatctgtc agatcgaaac 780
tcgctcttca cctgtatgaa cctgagagac aaggtgccca ctttggcgcg cctggcatcg 840
ctggaccatc agtttactat gcatgacatg cactctcgtg tggacgaggg ctggatgcct 900
atggagacct ggactgactg ggctggagac tgtcgaggac agtaccaggg ccgactattt 960
acagatgaag gcaagcttgt atgcacattt atgcaagacg gtctgattcg aaccgttgag 1020
gaggaccacg atgacgacga cgacaagaag gaggatgaca aggctgataa caccacccga 1080
caggttcctc gaagaagaaa gaagaagact cctgctcaga atttgtttct caagttcaaa 1140
gctgtgcttt aa 1152
<210> 55
<211> 630
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 55
atgtttcgtc acgcgatcag atcaattggc ctcgtgactc ctgtcagagt cattaccccc 60
actctacgtg cttctctggt tctcggggca gttcgttctc agagttcgca cgccaaaccc 120
caagcacccg attggatcca gaatctgctc gatgagcacg agggcaaagg atacttgctt 180
gccgacgctg ggctgccgtc tcagggcgtc tcttggggag aaattgactc cttccagcat 240
gttaacaaca aggtgtatct ggcttggttc gagaccgccc gtgttaacat gtttctcaag 300
tggggcacgg actttcagcg gttcatgagt ggccagtcgg tggcaccggt catgcggtcg 360
gtcaatctag cttggcgata ccccatcaaa ttccccgacc aggtgacggt cgtccacaaa 420
attgaccaga ttctcgatga ccggttcatt ctcaagggcg tcgtgatagg ccacaagtcc 480
aagaaggtgt gtgcacgaat tgaagaggtg attgtcgctg tcgattacac taagggtgcc 540
accaagtgtt ctattccgga cgatatgaga gagtttctgg agcagaaaaa gagagagcaa 600
ggcgcggggg agtatgatgc gcagatttag 630
<210> 56
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1185)
<223> 来自萼距花的硫酯酶ChFatB3的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 56
atggtggccg ctgccgcctc ttctgccttc ttctcggtgc ccactcctgg catctctccc 60
aagcctggca agttcggcaa cggcggcttc caggtgaagg ccaacgccaa cgctcacccc 120
tcgctgaagt ctggctctct cgagactgag gacgacacct cttcctcttc tccaccacct 180
cgaaccttca tcaaccagct gcctgactgg tctatgctgc tgtctgccat caccaccatc 240
ttcggagccg ccgagaagca gtggatgatg ctggaccgaa agtctaagcg acccgacatg 300
ctgatggaac ccttcggcgt ggactctatc gtgcaggacg gcgtgttctt ccgacagtct 360
ttctctatcc gatcttacga gattggcgcc gaccgaacca cctctatcga gactctgatg 420
aacatgtttc aagagacttc tctgaaccac tgcaagtcta acggcctgct gaacgacggc 480
ttcggacgaa cccctgagat gtgcaagaag ggcctgatct gggtcgtgac caagatgcag 540
gtcgaggtga acagataccc catctggggc gactctattg aggtcaacac ctgggtgtct 600
gagtctggca agaacggcat gggccgagac tggctgatct ctgactgctc taccggcgag 660
atcctggtgc gagccacctc tgtgtgggcc atgatgaacc agaagacccg acgactgtct 720
aagttcccat tcgaggtgcg acaagagatc gctcccaact tcgtcgactc tgtccccgtg 780
atcgaggacg accgaaagct gcacaagctg gacgtcaaga ccggcgactc catccacaac 840
ggactgaccc ctcgatggaa cgacctggac gtgaaccagc acgtgaacaa cgtgaagtac 900
atcggctgga tcctgaagtc ggtgcccacc gacgtgttcg aggcccaaga gctgtgcggc 960
gtgaccctcg agtaccgacg agagtgcgga cgagactccg tgatggaatc tgtgaccgct 1020
atggacccct ctaaagaagg cgaccgatct gtctaccagc acctcctgcg actcgaggac 1080
ggcgccgaca ttgccatcgg ccgaaccgag tggcgaccca agaacgctgg cgccaacggc 1140
gccatctcta ccggaaagac ctctaaccga aactctgtgt cttaa 1185
<210> 57
<211> 394
<212> PRT
<213> 萼距花(Cuphea hookeriana)
<400> 57
Met Val Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ala Phe Phe Ser Val Pro Thr Pro
1 5 10 15
Gly Ile Ser Pro Lys Pro Gly Lys Phe Gly Asn Gly Gly Phe Gln Val
20 25 30
Lys Ala Asn Ala Asn Ala His Pro Ser Leu Lys Ser Gly Ser Leu Glu
35 40 45
Thr Glu Asp Asp Thr Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Arg Thr Phe Ile
50 55 60
Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu Ser Ala Ile Thr Thr Ile
65 70 75 80
Phe Gly Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met Leu Asp Arg Lys Ser Lys
85 90 95
Arg Pro Asp Met Leu Met Glu Pro Phe Gly Val Asp Ser Ile Val Gln
100 105 110
Asp Gly Val Phe Phe Arg Gln Ser Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile
115 120 125
Gly Ala Asp Arg Thr Thr Ser Ile Glu Thr Leu Met Asn Met Phe Gln
130 135 140
Glu Thr Ser Leu Asn His Cys Lys Ser Asn Gly Leu Leu Asn Asp Gly
145 150 155 160
Phe Gly Arg Thr Pro Glu Met Cys Lys Lys Gly Leu Ile Trp Val Val
165 170 175
Thr Lys Met Gln Val Glu Val Asn Arg Tyr Pro Ile Trp Gly Asp Ser
180 185 190
Ile Glu Val Asn Thr Trp Val Ser Glu Ser Gly Lys Asn Gly Met Gly
195 200 205
Arg Asp Trp Leu Ile Ser Asp Cys Ser Thr Gly Glu Ile Leu Val Arg
210 215 220
Ala Thr Ser Val Trp Ala Met Met Asn Gln Lys Thr Arg Arg Leu Ser
225 230 235 240
Lys Phe Pro Phe Glu Val Arg Gln Glu Ile Ala Pro Asn Phe Val Asp
245 250 255
Ser Val Pro Val Ile Glu Asp Asp Arg Lys Leu His Lys Leu Asp Val
260 265 270
Lys Thr Gly Asp Ser Ile His Asn Gly Leu Thr Pro Arg Trp Asn Asp
275 280 285
Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile
290 295 300
Leu Lys Ser Val Pro Thr Asp Val Phe Glu Ala Gln Glu Leu Cys Gly
305 310 315 320
Val Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Met Glu
325 330 335
Ser Val Thr Ala Met Asp Pro Ser Lys Glu Gly Asp Arg Ser Val Tyr
340 345 350
Gln His Leu Leu Arg Leu Glu Asp Gly Ala Asp Ile Ala Ile Gly Arg
355 360 365
Thr Glu Trp Arg Pro Lys Asn Ala Gly Ala Asn Gly Ala Ile Ser Thr
370 375 380
Gly Lys Thr Ser Asn Arg Asn Ser Val Ser
385 390
<210> 58
<211> 5449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(5549)
<223> 来自解脂耶氏酵母的截短形式的FAS1和来自大肠杆菌的截短形式的硫酯酶TesA的融合物
<400> 58
gtgagtatcg accgaagcag gatgatctct acatgagata tgcaacgcgt acgtgattca 60
attgatccta acacagtacc ctaccacagg tgtcaacacc ccccagagcg ccgcctcatt 120
aagaccactg gtgctatcgc acggccaaac tgagcactcg ctgctggtgc ccacctctct 180
gtacatcaac tgcaccacgc tccgagacca gttctacgcc tctctacctc cagccactga 240
agacaaggcc gacgatgatg agccctcctc ctccacagag cttctagctg ccttcctggg 300
atttactgcc aagaccgtcg aggaagagcc cggaccatac gacgacgttc tctctctcgt 360
gcttaacgag tttgagaccc ggtacttgcg aggtaacgac atccacgctg tggcctcctc 420
cttgttacaa gacgaggacg tgcctaccac cgttggtaag atcaagaggg tgattcgagc 480
ctactacgcc gcacgaattg cctgcaaccg gcccatcaag gcccactcgt cggctctgtt 540
ccgagccgca tctgaagact cggacaacgt ctctctgtac gccatcttcg gtggccaggg 600
aaacaccgag gactactttg aggaactgcg ggagatttac gacatctacc aggggctggt 660
cggcgacttc attcgggaat gtggagccca gcttctggcg ctgtctcgag atcacattgc 720
tgctgagaaa atttatacca agggctttga tatcgtcaag tggctggaac accccgagac 780
catccccgac tttgagtacc taatttctgc tcccatctct gtacccatca tcggtgttat 840
ccagctggca cactacgctg tcacctgtcg agttttgggt cttaatcctg gccaggtccg 900
agacaacctc aagggtgcca ctggccattc tcagggtctg atcaccgcaa ttgccatctc 960
tgcctccgac tcgtgggacg agttctataa ctctgcctct cgaattctca agatcttctt 1020
cttcatcggt gtccgtgtcc aacaggctta cccctccact ttcctgcctc cctccactct 1080
ggaagacagt gtcaagcagg gtgagggcaa gcccactccc atgctgtcca tccgagacct 1140
gtctctcaac caggttcagg agttcgtcga tgccaccaac ttgcatttgc ccgaagataa 1200
gcagatcgtc gtgtctctga tcaatggtcc tcgaaacgtt gtcgttactg gcccccccca 1260
gtctctgtat ggtctgtgtc ttgtgcttcg aaaacagaag gccgagaccg gtctggacca 1320
aagccgagtg ccccacagtc agcgaaagct caaattcaca catcgtttcc tgcccatcac 1380
ctctcctttc cactcgtacc tgctggagaa gagcacggat ctgatcatca acgacctgga 1440
gtcttccggt gtggagtttg tgtcctccga gctcaaggtg cctgtttacg acacctttga 1500
tggctccgtg ctgtctcagc tacccaaggg tatcgtcagc cgtctggtca acctcatcac 1560
tcatctgccc gtcaagtggg agaaggccac tcagtttcag gcctcccaca ttgtggactt 1620
tggtcccggt ggcgcttctg gtcttggtct gttgacccac aagaacaagg atggaactgg 1680
agtgcgaact attcttgctg gtgtcattga ccagcccctc gagttcggct tcaagcagga 1740
gctgtttgac cgacaggagt cgtccattgt ttttgctcaa aactgggcca aggagttttc 1800
tcccaagctc gtcaagatct cctccaccaa cgaggtctat gtcgacacca aattctctcg 1860
tctgactggc cgagccccca tcatggtcgc tggtatgacc cctaccactg tcaaccccaa 1920
atttgtggct gccactatga actccggcta ccacatcgag cttggtggtg gaggctactt 1980
tgcccccggt atgatgacca aggcccttga acacattgag aagaacactc ctcccggatc 2040
cggtatcacc atcaacctga tctacgtcaa ccctcgactg attcaatggg gtattcctct 2100
gattcaggag cttcgacaga agggtttccc cattgaaggt ctcaccattg gtgccggtgt 2160
gccctctctg gaggttgcta acgagtggat tcaggatctg ggcgtcaagc acatcgcctt 2220
caagcctgga tccatcgagg ccatctcctc ggtgattcga atcgccaagg ccaacccaga 2280
ctttcctatc atccttcagt ggaccggagg tcgaggagga ggacatcatt cgtttgagga 2340
cttccacgct cccattctgc agatgtactc caagatccga cgatgcagca acattgtgct 2400
gattgccgga tctggtttcg gtgcttctac cgactcctac ccatacctca ccggttcatg 2460
gtcccgagac tttgactacc ctcccatgcc ctttgacggt atcctggttg gttctcgagt 2520
catggttgcc aaggaggctt tcacttctct gggagccaag cagctcattg ttgactctcc 2580
gggtgttgag gattctgagt gggagaaaac ctacgacaag cccactggtg gcgtcatcac 2640
cgttctctcc gagatgggtg agcctatcca caagctcgcc actcgaggtg tgctcttctg 2700
gcacgagatg gacaagaccg tgttctccct gcccaagaag aagcgtctgg aagtgctcaa 2760
gtccaagcga gcctacatca tcaagcgtct caacgacgac ttccagaaga cttggtttgc 2820
caagaacgcc cagggacagg tgtgtgatct cgaagacctc acctacgcgg aggtcatcca 2880
gcgacttgtt gacctcatgt acgtgaagaa ggaaagccga tggatcgatg tcactctccg 2940
aaatcttgcc ggcactttca ttcgacgagt tgaggagcga ttctccaccg agacaggtgc 3000
ctcttctgtg ttgcagagct tttccgagct ggattccgag cccgagaagg ttgtcgagcg 3060
ggtgtttgag ctcttccctg cctctactac ccagatcatc aacgctcaag acaaggacca 3120
cttcctcatg ctgtgtctca accccatgca gaagcccgtg cccttcatcc ctgttctgga 3180
tgacaacttt gagttcttct tcaagaagga ctctctgtgg cagtgcgagg acctcgcagc 3240
tgttgtggac gaagacgttg gacgaatctg tattcttcag ggtcccgttg ctgtcaagca 3300
ctccaagatt gtcaacgagc ccgtcaagga gattctcgac tccatgcacg aaggtcacat 3360
caagcagctg cttgaggatg gcgagtacgc tggcaacatg gccaacatcc cccaggtcga 3420
atgctttggt ggaaagcctg ctcagaactt cggtgacgtt gctctcgact ctgtcatggt 3480
tcttgatgac ctcaacaaga ccgtgttcaa gattgagacc ggcacctctg ctctgccttc 3540
tgctgcagat tggttctctc tgctggccgg tgacaagaac tcttggcgac aggtcttcct 3600
gtccactgac accattgtgc agaccaccaa gatgatctcc aaccctctgc atcgacttct 3660
ggagcccatc gcaggtttgc aggttgagat tgagcaccct gatgagcccg agaacaccgt 3720
catctctgct ttcgagccca tcaacggcaa ggtcaccaag gtgctggagc tgcgaaaggg 3780
tgccggagac gtcatttcgc tgcagctgat cgaagcgcgt ggcgttgacc gagtccccgt 3840
tgctcttcct ctggaattca agtaccagcc ccagattggc tacgctccca ttgttgaggt 3900
tatgaccgac aggaacaccc gaatcaagga gttctactgg aagctgtggt ttggccagga 3960
ctccaagttt gagattgaca ccgacatcac cgaggaaatc attggcgatg acgttaccat 4020
ctctggcaag gccattgccg actttgtcca cgctgttggc aacaagggcg aggcctttgt 4080
tggtcgatct acctctgctg gtactgtctt cgctcccatg gactttgcca ttgttttggg 4140
ctggaaggcc attatcaagg caatctttcc ccgagcaatt gatgctgaca ttctgcgtct 4200
ggtacatctg tccaacggct tcaagatgat gcctggcgcc gaccctctgc agatgggtga 4260
tgttgtttcc gccactgcca agatcgacac tgtcaagaac tccgctaccg gcaagactgt 4320
tgctgttcga ggtcttctca cccgagacgg caagcctgtc atggaggttg tttccgaatt 4380
cttctaccga ggcgaattct ccgacttcca gaacactttt gagcgacgag aggaggtacc 4440
catgcaactg accctcaagg acgccaaggc cgtggccatt ctctgctcca aggagtggtt 4500
tgagtacaat ggcgacgata ccaaggacct cgagggcaag accattgtgt tccgaaactc 4560
gtcattcatc aagtacaaga atgagaccgt cttctcttct gtgcacacca ccggtaaggt 4620
attgatggag ctgccctcca aggaggtcat tgagattgcc actgttaact accaggctgg 4680
cgagtctcat ggcaatcccg tcattgatta cctggagcga aatggaacca ccattgagca 4740
gcctgttgag tttgagaagc ccatccctct gtccaaggca gatgatcttc tctccttcaa 4800
ggctccttct tccaacgagc cctacgctgg tgtgtccggt gactacaatc ccatccacgt 4860
gtctcgagcc tttgcttcct atgcatccct tcctggagca gcggacacgt tattgattct 4920
gggtgatagc ctgagcgccg ggtatcgaat gtctgccagc gcggcctggc ctgccttgtt 4980
gaatgataag tggcagagta aaacgtcggt agttaatgcc agcatcagcg gcgacacctc 5040
gcaacaagga ctggcgcgcc ttccggctct gctgaaacag catcagccgc gttgggtgct 5100
ggttgaactg ggcggcaatg acggtttgcg tggttttcag ccacagcaaa ccgagcaaac 5160
gctgcgccag attttgcagg atgtcaaagc cgccaacgct gaaccattgt taatgcaaat 5220
acgtctgcct gcaaactatg gtcgccgtta taatgaagcc tttagcgcca tttaccccaa 5280
actcgccaaa gagtttgatg ttccgctgct gccctttttt atggaagagg tctacctcaa 5340
gccacaatgg atgcaggatg acggtattca tcccaaccgc gacgcccagc cgtttattgc 5400
cgactggatg gcgaagcagt tgcagccttt agtaaatcat gactcataa 5449
<210> 59
<211> 2268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2268)
<223> 来自解脂耶氏酵母的截短形式的FAS1和来自大肠杆菌的截短形式的硫酯酶TesA的融合物
<400> 59
Tyr Pro Thr Thr Gly Val Asn Thr Pro Gln Ser Ala Ala Ser Leu Arg
1 5 10 15
Pro Leu Val Leu Ser His Gly Gln Thr Glu His Ser Leu Leu Val Pro
20 25 30
Thr Ser Leu Tyr Ile Asn Cys Thr Thr Leu Arg Asp Gln Phe Tyr Ala
35 40 45
Ser Leu Pro Pro Ala Thr Glu Asp Lys Ala Asp Asp Asp Glu Pro Ser
50 55 60
Ser Ser Thr Glu Leu Leu Ala Ala Phe Leu Gly Phe Thr Ala Lys Thr
65 70 75 80
Val Glu Glu Glu Pro Gly Pro Tyr Asp Asp Val Leu Ser Leu Val Leu
85 90 95
Asn Glu Phe Glu Thr Arg Tyr Leu Arg Gly Asn Asp Ile His Ala Val
100 105 110
Ala Ser Ser Leu Leu Gln Asp Glu Asp Val Pro Thr Thr Val Gly Lys
115 120 125
Ile Lys Arg Val Ile Arg Ala Tyr Tyr Ala Ala Arg Ile Ala Cys Asn
130 135 140
Arg Pro Ile Lys Ala His Ser Ser Ala Leu Phe Arg Ala Ala Ser Glu
145 150 155 160
Asp Ser Asp Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Phe Gly Gly Gln Gly Asn
165 170 175
Thr Glu Asp Tyr Phe Glu Glu Leu Arg Glu Ile Tyr Asp Ile Tyr Gln
180 185 190
Gly Leu Val Gly Asp Phe Ile Arg Glu Cys Gly Ala Gln Leu Leu Ala
195 200 205
Leu Ser Arg Asp His Ile Ala Ala Glu Lys Ile Tyr Thr Lys Gly Phe
210 215 220
Asp Ile Val Lys Trp Leu Glu His Pro Glu Thr Ile Pro Asp Phe Glu
225 230 235 240
Tyr Leu Ile Ser Ala Pro Ile Ser Val Pro Ile Ile Gly Val Ile Gln
245 250 255
Leu Ala His Tyr Ala Val Thr Cys Arg Val Leu Gly Leu Asn Pro Gly
260 265 270
Gln Val Arg Asp Asn Leu Lys Gly Ala Thr Gly His Ser Gln Gly Leu
275 280 285
Ile Thr Ala Ile Ala Ile Ser Ala Ser Asp Ser Trp Asp Glu Phe Tyr
290 295 300
Asn Ser Ala Ser Arg Ile Leu Lys Ile Phe Phe Phe Ile Gly Val Arg
305 310 315 320
Val Gln Gln Ala Tyr Pro Ser Thr Phe Leu Pro Pro Ser Thr Leu Glu
325 330 335
Asp Ser Val Lys Gln Gly Glu Gly Lys Pro Thr Pro Met Leu Ser Ile
340 345 350
Arg Asp Leu Ser Leu Asn Gln Val Gln Glu Phe Val Asp Ala Thr Asn
355 360 365
Leu His Leu Pro Glu Asp Lys Gln Ile Val Val Ser Leu Ile Asn Gly
370 375 380
Pro Arg Asn Val Val Val Thr Gly Pro Pro Gln Ser Leu Tyr Gly Leu
385 390 395 400
Cys Leu Val Leu Arg Lys Gln Lys Ala Glu Thr Gly Leu Asp Gln Ser
405 410 415
Arg Val Pro His Ser Gln Arg Lys Leu Lys Phe Thr His Arg Phe Leu
420 425 430
Pro Ile Thr Ser Pro Phe His Ser Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Thr Asp
435 440 445
Leu Ile Ile Asn Asp Leu Glu Ser Ser Gly Val Glu Phe Val Ser Ser
450 455 460
Glu Leu Lys Val Pro Val Tyr Asp Thr Phe Asp Gly Ser Val Leu Ser
465 470 475 480
Gln Leu Pro Lys Gly Ile Val Ser Arg Leu Val Asn Leu Ile Thr His
485 490 495
Leu Pro Val Lys Trp Glu Lys Ala Thr Gln Phe Gln Ala Ser His Ile
500 505 510
Val Asp Phe Gly Pro Gly Gly Ala Ser Gly Leu Gly Leu Leu Thr His
515 520 525
Lys Asn Lys Asp Gly Thr Gly Val Arg Thr Ile Leu Ala Gly Val Ile
530 535 540
Asp Gln Pro Leu Glu Phe Gly Phe Lys Gln Glu Leu Phe Asp Arg Gln
545 550 555 560
Glu Ser Ser Ile Val Phe Ala Gln Asn Trp Ala Lys Glu Phe Ser Pro
565 570 575
Lys Leu Val Lys Ile Ser Ser Thr Asn Glu Val Tyr Val Asp Thr Lys
580 585 590
Phe Ser Arg Leu Thr Gly Arg Ala Pro Ile Met Val Ala Gly Met Thr
595 600 605
Pro Thr Thr Val Asn Pro Lys Phe Val Ala Ala Thr Met Asn Ser Gly
610 615 620
Tyr His Ile Glu Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Phe Ala Pro Gly Met Met
625 630 635 640
Thr Lys Ala Leu Glu His Ile Glu Lys Asn Thr Pro Pro Gly Ser Gly
645 650 655
Ile Thr Ile Asn Leu Ile Tyr Val Asn Pro Arg Leu Ile Gln Trp Gly
660 665 670
Ile Pro Leu Ile Gln Glu Leu Arg Gln Lys Gly Phe Pro Ile Glu Gly
675 680 685
Leu Thr Ile Gly Ala Gly Val Pro Ser Leu Glu Val Ala Asn Glu Trp
690 695 700
Ile Gln Asp Leu Gly Val Lys His Ile Ala Phe Lys Pro Gly Ser Ile
705 710 715 720
Glu Ala Ile Ser Ser Val Ile Arg Ile Ala Lys Ala Asn Pro Asp Phe
725 730 735
Pro Ile Ile Leu Gln Trp Thr Gly Gly Arg Gly Gly Gly His His Ser
740 745 750
Phe Glu Asp Phe His Ala Pro Ile Leu Gln Met Tyr Ser Lys Ile Arg
755 760 765
Arg Cys Ser Asn Ile Val Leu Ile Ala Gly Ser Gly Phe Gly Ala Ser
770 775 780
Thr Asp Ser Tyr Pro Tyr Leu Thr Gly Ser Trp Ser Arg Asp Phe Asp
785 790 795 800
Tyr Pro Pro Met Pro Phe Asp Gly Ile Leu Val Gly Ser Arg Val Met
805 810 815
Val Ala Lys Glu Ala Phe Thr Ser Leu Gly Ala Lys Gln Leu Ile Val
820 825 830
Asp Ser Pro Gly Val Glu Asp Ser Glu Trp Glu Lys Thr Tyr Asp Lys
835 840 845
Pro Thr Gly Gly Val Ile Thr Val Leu Ser Glu Met Gly Glu Pro Ile
850 855 860
His Lys Leu Ala Thr Arg Gly Val Leu Phe Trp His Glu Met Asp Lys
865 870 875 880
Thr Val Phe Ser Leu Pro Lys Lys Lys Arg Leu Glu Val Leu Lys Ser
885 890 895
Lys Arg Ala Tyr Ile Ile Lys Arg Leu Asn Asp Asp Phe Gln Lys Thr
900 905 910
Trp Phe Ala Lys Asn Ala Gln Gly Gln Val Cys Asp Leu Glu Asp Leu
915 920 925
Thr Tyr Ala Glu Val Ile Gln Arg Leu Val Asp Leu Met Tyr Val Lys
930 935 940
Lys Glu Ser Arg Trp Ile Asp Val Thr Leu Arg Asn Leu Ala Gly Thr
945 950 955 960
Phe Ile Arg Arg Val Glu Glu Arg Phe Ser Thr Glu Thr Gly Ala Ser
965 970 975
Ser Val Leu Gln Ser Phe Ser Glu Leu Asp Ser Glu Pro Glu Lys Val
980 985 990
Val Glu Arg Val Phe Glu Leu Phe Pro Ala Ser Thr Thr Gln Ile Ile
995 1000 1005
Asn Ala Gln Asp Lys Asp His Phe Leu Met Leu Cys Leu Asn Pro
1010 1015 1020
Met Gln Lys Pro Val Pro Phe Ile Pro Val Leu Asp Asp Asn Phe
1025 1030 1035
Glu Phe Phe Phe Lys Lys Asp Ser Leu Trp Gln Cys Glu Asp Leu
1040 1045 1050
Ala Ala Val Val Asp Glu Asp Val Gly Arg Ile Cys Ile Leu Gln
1055 1060 1065
Gly Pro Val Ala Val Lys His Ser Lys Ile Val Asn Glu Pro Val
1070 1075 1080
Lys Glu Ile Leu Asp Ser Met His Glu Gly His Ile Lys Gln Leu
1085 1090 1095
Leu Glu Asp Gly Glu Tyr Ala Gly Asn Met Ala Asn Ile Pro Gln
1100 1105 1110
Val Glu Cys Phe Gly Gly Lys Pro Ala Gln Asn Phe Gly Asp Val
1115 1120 1125
Ala Leu Asp Ser Val Met Val Leu Asp Asp Leu Asn Lys Thr Val
1130 1135 1140
Phe Lys Ile Glu Thr Gly Thr Ser Ala Leu Pro Ser Ala Ala Asp
1145 1150 1155
Trp Phe Ser Leu Leu Ala Gly Asp Lys Asn Ser Trp Arg Gln Val
1160 1165 1170
Phe Leu Ser Thr Asp Thr Ile Val Gln Thr Thr Lys Met Ile Ser
1175 1180 1185
Asn Pro Leu His Arg Leu Leu Glu Pro Ile Ala Gly Leu Gln Val
1190 1195 1200
Glu Ile Glu His Pro Asp Glu Pro Glu Asn Thr Val Ile Ser Ala
1205 1210 1215
Phe Glu Pro Ile Asn Gly Lys Val Thr Lys Val Leu Glu Leu Arg
1220 1225 1230
Lys Gly Ala Gly Asp Val Ile Ser Leu Gln Leu Ile Glu Ala Arg
1235 1240 1245
Gly Val Asp Arg Val Pro Val Ala Leu Pro Leu Glu Phe Lys Tyr
1250 1255 1260
Gln Pro Gln Ile Gly Tyr Ala Pro Ile Val Glu Val Met Thr Asp
1265 1270 1275
Arg Asn Thr Arg Ile Lys Glu Phe Tyr Trp Lys Leu Trp Phe Gly
1280 1285 1290
Gln Asp Ser Lys Phe Glu Ile Asp Thr Asp Ile Thr Glu Glu Ile
1295 1300 1305
Ile Gly Asp Asp Val Thr Ile Ser Gly Lys Ala Ile Ala Asp Phe
1310 1315 1320
Val His Ala Val Gly Asn Lys Gly Glu Ala Phe Val Gly Arg Ser
1325 1330 1335
Thr Ser Ala Gly Thr Val Phe Ala Pro Met Asp Phe Ala Ile Val
1340 1345 1350
Leu Gly Trp Lys Ala Ile Ile Lys Ala Ile Phe Pro Arg Ala Ile
1355 1360 1365
Asp Ala Asp Ile Leu Arg Leu Val His Leu Ser Asn Gly Phe Lys
1370 1375 1380
Met Met Pro Gly Ala Asp Pro Leu Gln Met Gly Asp Val Val Ser
1385 1390 1395
Ala Thr Ala Lys Ile Asp Thr Val Lys Asn Ser Ala Thr Gly Lys
1400 1405 1410
Thr Val Ala Val Arg Gly Leu Leu Thr Arg Asp Gly Lys Pro Val
1415 1420 1425
Met Glu Val Val Ser Glu Phe Phe Tyr Arg Gly Glu Phe Ser Asp
1430 1435 1440
Phe Gln Asn Thr Phe Glu Arg Arg Glu Glu Val Pro Met Gln Leu
1445 1450 1455
Thr Leu Lys Asp Ala Lys Ala Val Ala Ile Leu Cys Ser Lys Glu
1460 1465 1470
Trp Phe Glu Tyr Asn Gly Asp Asp Thr Lys Asp Leu Glu Gly Lys
1475 1480 1485
Thr Ile Val Phe Arg Asn Ser Ser Phe Ile Lys Tyr Lys Asn Glu
1490 1495 1500
Thr Val Phe Ser Ser Val His Thr Thr Gly Lys Val Leu Met Glu
1505 1510 1515
Leu Pro Ser Lys Glu Val Ile Glu Ile Ala Thr Val Asn Tyr Gln
1520 1525 1530
Ala Gly Glu Ser His Gly Asn Pro Val Ile Asp Tyr Leu Glu Arg
1535 1540 1545
Asn Gly Thr Thr Ile Glu Gln Pro Val Glu Phe Glu Lys Pro Ile
1550 1555 1560
Pro Leu Ser Lys Ala Asp Asp Leu Leu Ser Phe Lys Ala Pro Ser
1565 1570 1575
Ser Asn Glu Pro Tyr Ala Gly Val Ser Gly Asp Tyr Asn Pro Ile
1580 1585 1590
His Val Ser Arg Ala Phe Ala Ser Tyr Ala Ser Leu Pro Gly Thr
1595 1600 1605
Ile Thr His Gly Met Tyr Ser Ser Ala Ala Val Arg Ser Leu Ile
1610 1615 1620
Glu Val Trp Ala Ala Glu Asn Asn Val Ser Arg Val Arg Ala Phe
1625 1630 1635
Ser Cys Gln Phe Gln Gly Met Val Leu Pro Asn Asp Glu Ile Val
1640 1645 1650
Thr Arg Leu Glu His Val Gly Met Ile Asn Gly Arg Lys Ile Ile
1655 1660 1665
Lys Val Thr Ser Thr Asn Arg Glu Thr Glu Ala Val Val Leu Ser
1670 1675 1680
Gly Glu Ala Glu Val Glu Gln Pro Ile Ser Thr Phe Val Phe Thr
1685 1690 1695
Gly Gln Gly Ser Gln Glu Gln Gly Met Gly Met Asp Leu Tyr Ala
1700 1705 1710
Ser Ser Glu Val Ala Lys Lys Val Trp Asp Lys Ala Asp Glu His
1715 1720 1725
Phe Leu Gln Asn Tyr Gly Phe Ser Ile Ile Lys Ile Val Val Glu
1730 1735 1740
Asn Pro Lys Glu Leu Asp Ile His Phe Gly Gly Pro Lys Gly Lys
1745 1750 1755
Lys Ile Arg Asp Asn Tyr Ile Ser Met Met Phe Glu Thr Ile Asp
1760 1765 1770
Glu Lys Thr Gly Asn Leu Ile Ser Glu Lys Ile Phe Lys Glu Ile
1775 1780 1785
Asp Glu Thr Thr Asp Ser Phe Thr Phe Lys Ser Pro Thr Gly Leu
1790 1795 1800
Leu Ser Ala Thr Gln Phe Thr Gln Pro Ala Leu Thr Leu Met Glu
1805 1810 1815
Lys Ala Ser Phe Glu Asp Met Lys Ala Lys Gly Leu Val Pro Val
1820 1825 1830
Asp Ala Thr Phe Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Tyr Ser Ala Leu
1835 1840 1845
Ala Ser Leu Gly Asp Val Met Pro Ile Glu Ser Leu Val Asp Val
1850 1855 1860
Val Phe Tyr Arg Gly Met Thr Met Gln Val Ala Val Pro Arg Asp
1865 1870 1875
Ala Gln Gly Arg Ser Asn Tyr Gly Met Cys Ala Val Asn Pro Ser
1880 1885 1890
Arg Ile Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ala Ala Leu Arg Phe Val Val
1895 1900 1905
Asp His Ile Ser Glu Gln Thr Lys Trp Leu Leu Glu Ile Val Asn
1910 1915 1920
Tyr Asn Val Glu Asn Ser Gln Tyr Val Thr Ala Gly Asp Leu Arg
1925 1930 1935
Ala Leu Asp Thr Leu Thr Asn Val Leu Asn Val Leu Lys Leu Glu
1940 1945 1950
Lys Ile Asn Ile Asp Lys Leu Leu Glu Ser Leu Pro Leu Glu Lys
1955 1960 1965
Val Lys Glu His Leu Ser Glu Ile Val Thr Glu Val Ala Lys Lys
1970 1975 1980
Ser Val Ala Lys Pro Gln Pro Ile Glu Leu Glu Arg Gly Phe Ala
1985 1990 1995
Val Ile Pro Leu Lys Gly Ile Ser Val Pro Phe His Ser Ser Tyr
2000 2005 2010
Leu Arg Asn Gly Val Lys Pro Phe Gln Asn Phe Leu Val Lys Lys
2015 2020 2025
Val Pro Lys Asn Ala Val Lys Pro Ala Asn Leu Ile Gly Lys Tyr
2030 2035 2040
Ile Pro Asn Leu Thr Ala Lys Pro Phe Glu Ile Thr Lys Glu Tyr
2045 2050 2055
Phe Glu Glu Val Tyr Lys Leu Thr Gly Ser Glu Lys Val Lys Ser
2060 2065 2070
Ile Ile Asn Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Ser Lys Gln Ala Ala Asp
2075 2080 2085
Thr Leu Leu Ile Leu Gly Asp Ser Leu Ser Ala Gly Tyr Arg Met
2090 2095 2100
Ser Ala Ser Ala Ala Trp Pro Ala Leu Leu Asn Asp Lys Trp Gln
2105 2110 2115
Ser Lys Thr Ser Val Val Asn Ala Ser Ile Ser Gly Asp Thr Ser
2120 2125 2130
Gln Gln Gly Leu Ala Arg Leu Pro Ala Leu Leu Lys Gln His Gln
2135 2140 2145
Pro Arg Trp Val Leu Val Glu Leu Gly Gly Asn Asp Gly Leu Arg
2150 2155 2160
Gly Phe Gln Pro Gln Gln Thr Glu Gln Thr Leu Arg Gln Ile Leu
2165 2170 2175
Gln Asp Val Lys Ala Ala Asn Ala Glu Pro Leu Leu Met Gln Ile
2180 2185 2190
Arg Leu Pro Ala Asn Tyr Gly Arg Arg Tyr Asn Glu Ala Phe Ser
2195 2200 2205
Ala Ile Tyr Pro Lys Leu Ala Lys Glu Phe Asp Val Pro Leu Leu
2210 2215 2220
Pro Phe Phe Met Glu Glu Val Tyr Leu Lys Pro Gln Trp Met Gln
2225 2230 2235
Asp Asp Gly Ile His Pro Asn Arg Asp Ala Gln Pro Phe Ile Ala
2240 2245 2250
Asp Trp Met Ala Lys Gln Leu Gln Pro Leu Val Asn His Asp Ser
2255 2260 2265
<210> 60
<211> 1402
<212> DNA
<213> 小地老虎(Agrotis ipsilon)
<400> 60
aataaatagc cacaatggcc gtgatcatct cccgagagga agagaagctg tctgtccccg 60
agttctacgc cggcaagtct atcttcatta ccggcggcac cggattcctc ggcaaggtgt 120
tcatcgagaa gctgctctac tcttgccccg acatcgacaa gatctacatg ctgatccgag 180
agaagaagaa cctctctatc gacgagcgaa tgaccatgtt cctggacgac cctctgttct 240
ctcgactgaa ggaaaagcga cccggcgacg tcgagaagat cgtgctgatc cccggcgaca 300
tctcttctcc caacctgggc ctgtctgccg agaacgaacg aatcctgatc gagaacgtgt 360
ctgtgatcat ccactctgcc gccaccatca agttcaacga gcccctgcct atcgcctgga 420
agatcaacgt cgagggcacc cgaatgctga tggacctgtc tcgacgaatg aagcgaatca 480
aggtgtttat ccacatctct accgcctact ctaacgccaa ctctgagcga gccgccgtgg 540
aagagattct gtaccccgct cctgccgaca tggaccaggt gtaccagctc gtgaaggacg 600
gcgtgaccga ggaagaaacc gagatcctgc tgaacggact gcccaacacc tacaccttca 660
ccaaggctct ggccgagcac ctggccgctg agcaccaggt gcacgtgccc accgtgatta 720
ttcgaccctc tatcgtgggc tctatcaagg acgagcccat ccgaggctgg ctgtgcaact 780
ggttcggcgc caccggcatc tctgtgttca ccgccaaggg cctgaaccga gtgctgctcg 840
gaaaggcctc taacatcgtg gacgtgatcc ccgtggacta cgtggccaac ctggtgatcg 900
tggctggcgc caagaacggc ggcgagaagt ctgaggaact gaagatctat aactgctgtt 960
cttctgactg caaccccgtg accgtgaaga agatcctgaa ggaattcatc gacgacacca 1020
ttaagaacaa gtctcacatc atgcctctgc ctggctggtt cgtgttcacc aagtacaagt 1080
ggctgatgac cctgctgacc atcatcttcc agatgatccc catgtacctg gccgacgtgt 1140
accgagtcct gatgggcaag aaccctcggt acatgaagct gcaccacctg gtcattcaga 1200
cccgactggt gatcaacttc ttcaccttcc actcttgggt gatgaagacc gatcgagccc 1260
gagagctgtt cggctctctg tctcccgttg agaagcacat gttcccttgg gacccctctg 1320
gcatcgactg gaccgagtac ctgcagtctt actgctacgg cgtgcgacac ttcctcgaga 1380
agcgaaagta gaatataaat tt 1402
<210> 61
<211> 458
<212> PRT
<213> 小地老虎(Agrotis ipsilon)
<400> 61
Met Ala Val Ile Ile Ser Arg Glu Glu Glu Lys Leu Ser Val Pro Glu
1 5 10 15
Phe Tyr Ala Gly Lys Ser Ile Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu
20 25 30
Gly Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Asp
35 40 45
Lys Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Asn Leu Ser Ile Asp Glu
50 55 60
Arg Met Thr Met Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Ser Arg Leu Lys Glu
65 70 75 80
Lys Arg Pro Gly Asp Val Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile
85 90 95
Ser Ser Pro Asn Leu Gly Leu Ser Ala Glu Asn Glu Arg Ile Leu Ile
100 105 110
Glu Asn Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Ile Lys Phe Asn
115 120 125
Glu Pro Leu Pro Ile Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met
130 135 140
Leu Met Asp Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Lys Val Phe Ile His
145 150 155 160
Ile Ser Thr Ala Tyr Ser Asn Ala Asn Ser Glu Arg Ala Ala Val Glu
165 170 175
Glu Ile Leu Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Met Asp Gln Val Tyr Gln Leu
180 185 190
Val Lys Asp Gly Val Thr Glu Glu Glu Thr Glu Ile Leu Leu Asn Gly
195 200 205
Leu Pro Asn Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Ala Glu His Leu Ala
210 215 220
Ala Glu His Gln Val His Val Pro Thr Val Ile Ile Arg Pro Ser Ile
225 230 235 240
Val Gly Ser Ile Lys Asp Glu Pro Ile Arg Gly Trp Leu Cys Asn Trp
245 250 255
Phe Gly Ala Thr Gly Ile Ser Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg
260 265 270
Val Leu Leu Gly Lys Ala Ser Asn Ile Val Asp Val Ile Pro Val Asp
275 280 285
Tyr Val Ala Asn Leu Val Ile Val Ala Gly Ala Lys Asn Gly Gly Glu
290 295 300
Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ile Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Asp Cys Asn
305 310 315 320
Pro Val Thr Val Lys Lys Ile Leu Lys Glu Phe Ile Asp Asp Thr Ile
325 330 335
Lys Asn Lys Ser His Ile Met Pro Leu Pro Gly Trp Phe Val Phe Thr
340 345 350
Lys Tyr Lys Trp Leu Met Thr Leu Leu Thr Ile Ile Phe Gln Met Ile
355 360 365
Pro Met Tyr Leu Ala Asp Val Tyr Arg Val Leu Met Gly Lys Asn Pro
370 375 380
Arg Tyr Met Lys Leu His His Leu Val Ile Gln Thr Arg Leu Val Ile
385 390 395 400
Asn Phe Phe Thr Phe His Ser Trp Val Met Lys Thr Asp Arg Ala Arg
405 410 415
Glu Leu Phe Gly Ser Leu Ser Pro Val Glu Lys His Met Phe Pro Trp
420 425 430
Asp Pro Ser Gly Ile Asp Trp Thr Glu Tyr Leu Gln Ser Tyr Cys Tyr
435 440 445
Gly Val Arg His Phe Leu Glu Lys Arg Lys
450 455
<210> 62
<211> 1008
<212> DNA
<213> 蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana)
<400> 62
atggctccca acgtcgagga catggaatct gacctgcctg agtctgagga aaagctcgag 60
aagctggtgg ctccccaggc tgctccccga aagtaccaga tcatctacac caacctgctg 120
accttcggct actggcacat tgccggcctg tacggactgt acctgtgctt cacctctgcc 180
aagtggcaga ccatcattct ggccctgatc ctgaacgaga tggccattct gggcatcacc 240
gctggcgccc accgactgtg ggctcaccga tcttacaagg ccaccgtgcc tctgcagatc 300
atcctgatca tcttcaactc cctgtctttc cagaactctg ccatccactg gatccgagat 360
caccgaatgc accacaagta ctctgacacc gacggcgacc ctcacaacgc ctctcgaggc 420
ttcttctact ctcacgtcgg ctggctgctg gtgaagaagc accccgaggt caagaagcga 480
gccaagacca tcgacatgtc tgacatctac tctaacccca tcctgcgatt ccagaagaag 540
tacgctatcc ccttcatcgg catgatctgc ttcgtgctgc ccactattat ccctatgtac 600
ttctggggcg agactctgtc taacgcctgg cacatcacca tgctgcgata cgtgttctct 660
ctgaactcta tcttcctggt gaactccgcc gctcacctgt acggctaccg accttacgac 720
aagaacattc tgcccgccga gaacaagatg accttcattg cctgcctggg cgagaacttc 780
cacaactacc accacgtgtt cccttgggac taccgagcct ctgagctggg caacatcgga 840
atgaactgga ccgccaagtt catcgacttt ttcgcctgga tcggctgggc ctacgacctc 900
aagaccgcct ctgacgagaa catcaagtct cgaatgaagc gaaccggcga cggcaccgac 960
gtgtctggac agaagtactc ttgcgagtcc tctgaggtgc tgcagtaa 1008
<210> 63
<211> 335
<212> PRT
<213> 蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana)
<400> 63
Met Ala Pro Asn Val Glu Asp Met Glu Ser Asp Leu Pro Glu Ser Glu
1 5 10 15
Glu Lys Leu Glu Lys Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Pro Arg Lys Tyr
20 25 30
Gln Ile Ile Tyr Thr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Trp His Ile Ala
35 40 45
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr
50 55 60
Ile Ile Leu Ala Leu Ile Leu Asn Glu Met Ala Ile Leu Gly Ile Thr
65 70 75 80
Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Ser Tyr Lys Ala Thr Val
85 90 95
Pro Leu Gln Ile Ile Leu Ile Ile Phe Asn Ser Leu Ser Phe Gln Asn
100 105 110
Ser Ala Ile His Trp Ile Arg Asp His Arg Met His His Lys Tyr Ser
115 120 125
Asp Thr Asp Gly Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser
130 135 140
His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Lys Arg
145 150 155 160
Ala Lys Thr Ile Asp Met Ser Asp Ile Tyr Ser Asn Pro Ile Leu Arg
165 170 175
Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Met Ile Cys Phe Val
180 185 190
Leu Pro Thr Ile Ile Pro Met Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Leu Ser Asn
195 200 205
Ala Trp His Ile Thr Met Leu Arg Tyr Val Phe Ser Leu Asn Ser Ile
210 215 220
Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Tyr Gly Tyr Arg Pro Tyr Asp
225 230 235 240
Lys Asn Ile Leu Pro Ala Glu Asn Lys Met Thr Phe Ile Ala Cys Leu
245 250 255
Gly Glu Asn Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg
260 265 270
Ala Ser Glu Leu Gly Asn Ile Gly Met Asn Trp Thr Ala Lys Phe Ile
275 280 285
Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Ala Ser
290 295 300
Asp Glu Asn Ile Lys Ser Arg Met Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp
305 310 315 320
Val Ser Gly Gln Lys Tyr Ser Cys Glu Ser Ser Glu Val Leu Gln
325 330 335
<210> 64
<211> 1005
<212> DNA
<213> 平行色卷蛾(Choristoneura parallela)
<400> 64
atggctccca acgtcgagga catggaatct gacatgcccg agtctgagaa gtgggagaag 60
ctggtggctc cccaggctgc tccccgaaag tacgagatca tctacaccaa cctgctgacc 120
ttcggctacg gccacattgc cggcctgtac ggactgtacc tgtgcttcac ctctgccaag 180
tggcagaccg tgatcctggc catcatcctg aacgagatgg ccattctggg catcaccgct 240
ggcgcccacc gactgtggtc ccaccgatct tacaaggccg ctgtgcccct gcagatcatt 300
ctgatgatct tcaactctct ggccttccag aactctgcca tcaactgggt gcgagatcac 360
cgaatgcacc acaagtactc tgacaccgac ggcgaccctc acaacgcctc tcgaggcttc 420
ttctactctc acgtcggctg gctgctggtg aagaagcacc ccgaggtcaa aaagcgaggc 480
aagatgatcg acatgagcga catctactct aaccccgtgc tgcgattcca gaagaagtac 540
gctatcccct tcatcggcat gatctgcttc gtgctgccca ctattatccc tatgtacttc 600
tggggcgaga ctctgtctaa cgcctggcac atcaccatgc tgcgatacgt gttctctctg 660
aactctatct tcctggtgaa ctccgccgct cacctgtacg gctaccgacc ttacgacaag 720
aacattctgc ccgccgagaa caagatcgcc ctgatcgcct gcctgggcga ctctttccac 780
aactaccacc acgtgttccc ttgggactac cgagcctctg agctgggcaa catcggaatg 840
aactggaccg ctcagttcat cgactttttc gcctggatcg gctgggccta cgacctcaag 900
accgcctctg acgagaacat caactctcga atgaagcgaa ccggcgacgg caccgacatc 960
tctggacaga agtactcttg cgagtcctct gaggtgctgc agtaa 1005
<210> 65
<211> 334
<212> PRT
<213> 平行色卷蛾(Choristoneura parallela)
<400> 65
Met Ala Pro Asn Val Glu Asp Met Glu Ser Asp Met Pro Glu Ser Glu
1 5 10 15
Lys Trp Glu Lys Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Pro Arg Lys Tyr Glu
20 25 30
Ile Ile Tyr Thr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Gly His Ile Ala Gly
35 40 45
Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr Val
50 55 60
Ile Leu Ala Ile Ile Leu Asn Glu Met Ala Ile Leu Gly Ile Thr Ala
65 70 75 80
Gly Ala His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Lys Ala Ala Val Pro
85 90 95
Leu Gln Ile Ile Leu Met Ile Phe Asn Ser Leu Ala Phe Gln Asn Ser
100 105 110
Ala Ile Asn Trp Val Arg Asp His Arg Met His His Lys Tyr Ser Asp
115 120 125
Thr Asp Gly Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His
130 135 140
Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Lys Arg Gly
145 150 155 160
Lys Met Ile Asp Met Ser Asp Ile Tyr Ser Asn Pro Val Leu Arg Phe
165 170 175
Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Met Ile Cys Phe Val Leu
180 185 190
Pro Thr Ile Ile Pro Met Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Leu Ser Asn Ala
195 200 205
Trp His Ile Thr Met Leu Arg Tyr Val Phe Ser Leu Asn Ser Ile Phe
210 215 220
Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Tyr Gly Tyr Arg Pro Tyr Asp Lys
225 230 235 240
Asn Ile Leu Pro Ala Glu Asn Lys Ile Ala Leu Ile Ala Cys Leu Gly
245 250 255
Asp Ser Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ala
260 265 270
Ser Glu Leu Gly Asn Ile Gly Met Asn Trp Thr Ala Gln Phe Ile Asp
275 280 285
Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Ala Ser Asp
290 295 300
Glu Asn Ile Asn Ser Arg Met Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp Ile
305 310 315 320
Ser Gly Gln Lys Tyr Ser Cys Glu Ser Ser Glu Val Leu Gln
325 330
<210> 66
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1050)
<223> Cpo_NPVE，针对解脂耶氏酵母进行了密码子优化
<400> 66
atgccccctc agggacagcc tcccgcctgg gtcctggacg agtccgatgc agtgaccgag 60
gacaaggacg tggccacccc cgctcccgaa gccgagaagc gaaagctgca gatcgtttgg 120
agaaacgtga ccctgttcgt gtttctgcac atcggagctc tgtacggagg atacctgttc 180
tttaccaagg ccatgtggac tacccgaatt ttcactgtgc tgctgtacat tatgtctggg 240
ctgggtatca ccgccggcgc ccatcgactc tgggctcaca agtcttacaa ggcccgactg 300
cccctgcgac tgctgctgac cctcttcaac accatcgcct ttcaggactc cgttctggat 360
tgggcccgag atcaccgaat gcaccataag tactctgaaa ccgacgcaga tccccacaat 420
gctacccgag gcttcttctt ctctcacgtg ggctggctgc tggtgcgaaa gcacccccag 480
atcaaggcca agggacatac tatcgacatg tctgacctgc tggccgatcc cgtgctgcga 540
ttccagaaga agtactacct gacactgatg cccttgtgct gcttcatcct gccctcttac 600
attcccaccc tctggggaga gtctctgtgg aacgcttact ttgtgtgcgc catcttccga 660
tactgttacg ttctgaacgt gacttggctg gtgaactccg ctgcccacaa atggggtgac 720
cgaccttacg acaagaacat caaccctgtg gagactaagc ctgtgtctct ggtggttttc 780
ggagagggat tccacaacta ccaccacacc ttcccctggg attacaagac cgccgagctg 840
ggcggatact ctctgaacct ttccaaactg ttcatcgata ctatgtccaa gattggatgg 900
gcctacgacc tgaagtccgt ttcccctgac atcgtggaga agcgagtgaa gcgcaccggc 960
gacggatctc accacgtgtg gggatgggac gatgctccct ctgagcaaaa ggtggctgcc 1020
accatcgtga accccgataa gaccgagtaa 1050
<210> 67
<211> 349
<212> PRT
<213> 苹果蠹蛾(Cydia pomonella)
<400> 67
Met Pro Pro Gln Gly Gln Pro Pro Ala Trp Val Leu Asp Glu Ser Asp
1 5 10 15
Ala Val Thr Glu Asp Lys Asp Val Ala Thr Pro Ala Pro Glu Ala Glu
20 25 30
Lys Arg Lys Leu Gln Ile Val Trp Arg Asn Val Thr Leu Phe Val Phe
35 40 45
Leu His Ile Gly Ala Leu Tyr Gly Gly Tyr Leu Phe Phe Thr Lys Ala
50 55 60
Met Trp Thr Thr Arg Ile Phe Thr Val Leu Leu Tyr Ile Met Ser Gly
65 70 75 80
Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Ser Tyr
85 90 95
Lys Ala Arg Leu Pro Leu Arg Leu Leu Leu Thr Leu Phe Asn Thr Ile
100 105 110
Ala Phe Gln Asp Ser Val Leu Asp Trp Ala Arg Asp His Arg Met His
115 120 125
His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly
130 135 140
Phe Phe Phe Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Gln
145 150 155 160
Ile Lys Ala Lys Gly His Thr Ile Asp Met Ser Asp Leu Leu Ala Asp
165 170 175
Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr Leu Thr Leu Met Pro Leu
180 185 190
Cys Cys Phe Ile Leu Pro Ser Tyr Ile Pro Thr Leu Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Leu Trp Asn Ala Tyr Phe Val Cys Ala Ile Phe Arg Tyr Cys Tyr Val
210 215 220
Leu Asn Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Lys Trp Gly Asp
225 230 235 240
Arg Pro Tyr Asp Lys Asn Ile Asn Pro Val Glu Thr Lys Pro Val Ser
245 250 255
Leu Val Val Phe Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Thr Phe Pro
260 265 270
Trp Asp Tyr Lys Thr Ala Glu Leu Gly Gly Tyr Ser Leu Asn Leu Ser
275 280 285
Lys Leu Phe Ile Asp Thr Met Ser Lys Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu
290 295 300
Lys Ser Val Ser Pro Asp Ile Val Glu Lys Arg Val Lys Arg Thr Gly
305 310 315 320
Asp Gly Ser His His Val Trp Gly Trp Asp Asp Ala Pro Ser Glu Gln
325 330 335
Lys Val Ala Ala Thr Ile Val Asn Pro Asp Lys Thr Glu
340 345
<210> 68
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1005)
<223> Cpo_SPTQ，针对解脂耶氏酵母进行了密码子优化
<400> 68
atggccccct actctgagga gtacgagatc ctgaaggaga atactaagcc cgtatctccc 60
caggccgccc ccagagagta caccgttgtg tactctgtgg tgcttatctt tgtttactgg 120
cacatcggag ccctgtacgg actgtacctg ggcttcacct ccgccaagtg ggccaccatc 180
atctttaact acctgatcta cgtgtctggc ggcttcgcca ttactgctgg atcccatcga 240
ctgtggtctc accgagcctt caaggctaag ctccccctgc agatcctgct catgcttctg 300
cagaccatgt cttgtcagaa gtctgtgctg aactgggtgc gagatcaccg actgcaccac 360
atgtactgtg ataccgatgc cgacccttac aactctactc gaggaatctt ctactctcac 420
atcggctggc tgatggtgaa gaagcatcct gaggtgatcc gaaagggccg aaccatcgac 480
atgtccgatc tggagaacaa ccctgtgctg aagttccaga agaagttcta ccccatcctc 540
gtgaccctga tggcctttat cctgcctgcc ctgatccccg ttattttctg gcaggagtct 600
ctgaacatcg ctcaccacgt ttctcttgtg cacctggtcg tgggctccca catgaccttt 660
gccattaact ctattgccca cgccttcgga tctaagcctt gcgacaagac catctctccc 720
actcagtcca tttccctgtc tctggtgacc ttcggcgaag gctaccataa ctaccaccac 780
gtgttcccct ttgattaccg agtggccgag ctgggcaaca actacctgaa cctgaccacc 840
aacttcatcg acttcttcgc ctggattggc tgggcctacg acctgaagta cgcctctccc 900
gatatggttg ctaagcgagc caagcgaacc ggcgacggaa ctgacctgtg gggacgagct 960
attgagcacg ccgatattca ggctaagcgg gtgcacccct cttaa 1005
<210> 69
<211> 334
<212> PRT
<213> 苹果蠹蛾(Cydia pomonella)
<400> 69
Met Ala Pro Tyr Ser Glu Glu Tyr Glu Ile Leu Lys Glu Asn Thr Lys
1 5 10 15
Pro Val Ser Pro Gln Ala Ala Pro Arg Glu Tyr Thr Val Val Tyr Ser
20 25 30
Val Val Leu Ile Phe Val Tyr Trp His Ile Gly Ala Leu Tyr Gly Leu
35 40 45
Tyr Leu Gly Phe Thr Ser Ala Lys Trp Ala Thr Ile Ile Phe Asn Tyr
50 55 60
Leu Ile Tyr Val Ser Gly Gly Phe Ala Ile Thr Ala Gly Ser His Arg
65 70 75 80
Leu Trp Ser His Arg Ala Phe Lys Ala Lys Leu Pro Leu Gln Ile Leu
85 90 95
Leu Met Leu Leu Gln Thr Met Ser Cys Gln Lys Ser Val Leu Asn Trp
100 105 110
Val Arg Asp His Arg Leu His His Met Tyr Cys Asp Thr Asp Ala Asp
115 120 125
Pro Tyr Asn Ser Thr Arg Gly Ile Phe Tyr Ser His Ile Gly Trp Leu
130 135 140
Met Val Lys Lys His Pro Glu Val Ile Arg Lys Gly Arg Thr Ile Asp
145 150 155 160
Met Ser Asp Leu Glu Asn Asn Pro Val Leu Lys Phe Gln Lys Lys Phe
165 170 175
Tyr Pro Ile Leu Val Thr Leu Met Ala Phe Ile Leu Pro Ala Leu Ile
180 185 190
Pro Val Ile Phe Trp Gln Glu Ser Leu Asn Ile Ala His His Val Ser
195 200 205
Leu Val His Leu Val Val Gly Ser His Met Thr Phe Ala Ile Asn Ser
210 215 220
Ile Ala His Ala Phe Gly Ser Lys Pro Cys Asp Lys Thr Ile Ser Pro
225 230 235 240
Thr Gln Ser Ile Ser Leu Ser Leu Val Thr Phe Gly Glu Gly Tyr His
245 250 255
Asn Tyr His His Val Phe Pro Phe Asp Tyr Arg Val Ala Glu Leu Gly
260 265 270
Asn Asn Tyr Leu Asn Leu Thr Thr Asn Phe Ile Asp Phe Phe Ala Trp
275 280 285
Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Tyr Ala Ser Pro Asp Met Val Ala
290 295 300
Lys Arg Ala Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp Leu Trp Gly Arg Ala
305 310 315 320
Ile Glu His Ala Asp Ile Gln Ala Lys Arg Val His Pro Ser
325 330
<210> 70
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1362)
<223> Heliothis subflexa脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
<400> 70
atggttgtct tgacctccaa agaaactaag ccatctgttg ctgaatttta cgctggtaag 60
tctgttttca ttactggtgg tactggtttc ttgggtaagg ttttcattga aaagttgttg 120
tactcctgcc cagatatcgg taatatctac atgttgatca gagaaaagaa gggtttgtcc 180
gtttccgaaa gaatcaagca ctttttggat gatcctttgt tcaccagatt gaaagaaaaa 240
agaccagccg acttggaaaa gatcgttttg attccaggtg atattactgc tccagatttg 300
ggtattacct ccgaaaacga aaagatgttg atcgaaaagg tcagtgtcat tattcattct 360
gctgctaccg ttaagttcaa cgaaccattg ccaactgctt ggaagattaa cgttgaaggt 420
actagaatga tgttggcctt gtctagaaga atgaagagaa tcgaagtttt catccatatc 480
tctaccgctt acactaacac caacagagaa gttgttgacg aaatcttgta tccagctcca 540
gctgatattg atcaagttca ccaatatgtt aaggacggta tctctgaaga agaaactgaa 600
aaaatcttga acggtagacc aaacacttac actttcacta aggctttgac cgaacatttg 660
gttgctgaaa atcaagctta cgttccaacc attatcgtta gaccatcagt tgttgctgcc 720
attaaggatg aacctattaa gggttggttg ggtaattggt atggtgctac aggtttgact 780
gtttttactg ctaagggttt gaacagagtt atctacggtc actcttctaa catcgttgat 840
ttgatcccag ttgattacgt tgccaacttg gttattgctg ctggtgctaa atcttctaag 900
tctactgaat tgaaggtcta caactgctgt tcttctgctt gtaacccaat tactatcggt 960
aagttgatgt ccatgtttgc tgaagatgct atcaagcaaa agtcttacgc tatgccattg 1020
ccaggttggt acatttttac taagtacaag tggttggtct tgttgttgac cattttgttc 1080
caagttattc cagcctacat taccgacttg tacagacatt tgattggtaa gaacccaaga 1140
tatatcaagt tgcaatcctt ggtcaatcaa accagatcct ccattgattt cttcaccaac 1200
cattcttggg ttatgaaggc tgatagagtc agagaattat tcgcttcttt gtctccagca 1260
gataagtact tgtttccatg tgatccagtc aacatcaatt ggagacaata tatccaagat 1320
tactgctggg gtgttagaca tttcttggaa aaaaagactt aa 1362
<210> 71
<211> 453
<212> PRT
<213> Heliothis subflexa
<400> 71
Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly
20 25 30
Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Gly Asn
35 40 45
Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg
50 55 60
Ile Lys His Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr
85 90 95
Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Glu Asn Glu Lys Met Leu Ile Glu
100 105 110
Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met
130 135 140
Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile
145 150 155 160
Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu
165 170 175
Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val His Gln Tyr Val Lys Asp
180 185 190
Gly Ile Ser Glu Glu Glu Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn
195 200 205
Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val Ala Glu Asn
210 215 220
Gln Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Val Arg Pro Ser Val Val Ala Ala
225 230 235 240
Ile Lys Asp Glu Pro Ile Lys Gly Trp Leu Gly Asn Trp Tyr Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Leu Thr Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg Val Ile Tyr
260 265 270
Gly His Ser Ser Asn Ile Val Asp Leu Ile Pro Val Asp Tyr Val Ala
275 280 285
Asn Leu Val Ile Ala Ala Gly Ala Lys Ser Ser Lys Ser Thr Glu Leu
290 295 300
Lys Val Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Ala Cys Asn Pro Ile Thr Ile Gly
305 310 315 320
Lys Leu Met Ser Met Phe Ala Glu Asp Ala Ile Lys Gln Lys Ser Tyr
325 330 335
Ala Met Pro Leu Pro Gly Trp Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Lys Trp Leu
340 345 350
Val Leu Leu Leu Thr Ile Leu Phe Gln Val Ile Pro Ala Tyr Ile Thr
355 360 365
Asp Leu Tyr Arg His Leu Ile Gly Lys Asn Pro Arg Tyr Ile Lys Leu
370 375 380
Gln Ser Leu Val Asn Gln Thr Arg Ser Ser Ile Asp Phe Phe Thr Asn
385 390 395 400
His Ser Trp Val Met Lys Ala Asp Arg Val Arg Glu Leu Phe Ala Ser
405 410 415
Leu Ser Pro Ala Asp Lys Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Pro Val Asn Ile
420 425 430
Asn Trp Arg Gln Tyr Ile Gln Asp Tyr Cys Trp Gly Val Arg His Phe
435 440 445
Leu Glu Lys Lys Thr
450
<210> 72
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1371)
<223> 烟实夜蛾脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
<400> 72
atggttgtct tgacctccaa agaaactaag ccatctgttg ctgaatttta cgctggtaag 60
tctgttttca ttactggtgg tactggtttc ttgggtaaga tcttcattga aaagttgttg 120
tactcctgcc cagatatcgg taatatctac atgttgatca gagaaaagaa gggtttgtcc 180
gtttccgaaa gaatcaagca atttttggat gaccctttgt tcaccagatt gaaagaaaaa 240
agaccagccg acttggaaaa gatcgttttg attccaggtg atattactgc tccagatttg 300
ggtattacct ccgaaaacga aaagatgttg atcgaaaagg tcagtgtcat tattcattct 360
gctgctaccg ttaagttcaa cgaaccattg ccaactgctt ggaagattaa cgttgaaggt 420
actagaatga tgttggcctt gtctagaaga atgaagagaa tcgaagtttt catccatatc 480
tctaccgctt acactaacac caacagagaa gttgttgacg aaatcttgta tccagctcca 540
gctgatattg atcaagttca ccaatatgtt aaggacggta tctctgaaga agaaactgaa 600
aaaatcttga acggtagacc aaacacttac actttcacta aggctttgac cgaacatttg 660
gttgctgaaa atcaagctta cgttccaacc attatcgtta gaccatcagt tgttgctgcc 720
attaaggatg aacctattaa gggttggttg ggtaattggt atggtgctac aggtttgact 780
gtttttactg ctaagggttt gaacagagtt atctacggtc attcctctta catcgttgat 840
ttgatcccag ttgattacgt tgccaacttg gttattgctg ctggtgctaa atcttctaag 900
tctactgaat tgaaggtcta caactgctgt tcttctgctt gtaacccaat tactatcggt 960
aagttgatgt ccatgtttgc tgaagatgct atcaagcaaa agtcttacgc tatgccattg 1020
ccaggttggt atgtttttac aaagtacaag tggttggtct tgttgttgac cattttgttc 1080
caagttattc cagcctacat taccgacttg tacagacatt tgattggtaa gaacccaaga 1140
tatatcaagt tgcaatcctt ggtcaatcaa accagatcct ccattgattt cttcacctct 1200
cattcttggg ttatgaaggc tgatagagtc agagaattat tcgcttcttt gtctccagca 1260
gataagtact tgtttccatg tgatccaacc gatattaact ggacccatta cattcaagat 1320
tactgctggg gtgttagaca cttcttggaa aaaaagacta ccaacaagta a 1371
<210> 73
<211> 456
<212> PRT
<213> 烟实夜蛾(Helicoverpa assulta)
<400> 73
Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly
20 25 30
Lys Ile Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Gly Asn
35 40 45
Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg
50 55 60
Ile Lys Gln Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr
85 90 95
Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Glu Asn Glu Lys Met Leu Ile Glu
100 105 110
Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met
130 135 140
Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile
145 150 155 160
Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu
165 170 175
Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val His Gln Tyr Val Lys Asp
180 185 190
Gly Ile Ser Glu Glu Glu Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn
195 200 205
Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val Ala Glu Asn
210 215 220
Gln Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Val Arg Pro Ser Val Val Ala Ala
225 230 235 240
Ile Lys Asp Glu Pro Ile Lys Gly Trp Leu Gly Asn Trp Tyr Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Leu Thr Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg Val Ile Tyr
260 265 270
Gly His Ser Ser Tyr Ile Val Asp Leu Ile Pro Val Asp Tyr Val Ala
275 280 285
Asn Leu Val Ile Ala Ala Gly Ala Lys Ser Ser Lys Ser Thr Glu Leu
290 295 300
Lys Val Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Ala Cys Asn Pro Ile Thr Ile Gly
305 310 315 320
Lys Leu Met Ser Met Phe Ala Glu Asp Ala Ile Lys Gln Lys Ser Tyr
325 330 335
Ala Met Pro Leu Pro Gly Trp Tyr Val Phe Thr Lys Tyr Lys Trp Leu
340 345 350
Val Leu Leu Leu Thr Ile Leu Phe Gln Val Ile Pro Ala Tyr Ile Thr
355 360 365
Asp Leu Tyr Arg His Leu Ile Gly Lys Asn Pro Arg Tyr Ile Lys Leu
370 375 380
Gln Ser Leu Val Asn Gln Thr Arg Ser Ser Ile Asp Phe Phe Thr Ser
385 390 395 400
His Ser Trp Val Met Lys Ala Asp Arg Val Arg Glu Leu Phe Ala Ser
405 410 415
Leu Ser Pro Ala Asp Lys Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Pro Thr Asp Ile
420 425 430
Asn Trp Thr His Tyr Ile Gln Asp Tyr Cys Trp Gly Val Arg His Phe
435 440 445
Leu Glu Lys Lys Thr Thr Asn Lys
450 455
<210> 74
<211> 1362
<212> DNA
<213> 烟芽夜蛾(Helicoverpa virescens)
<400> 74
atggttgtct tgacctccaa agaaactaag ccatctgttg ctgaatttta cgctggtaag 60
tctgttttca ttactggtgg tactggtttc ttgggtaagg ttttcattga aaagttgttg 120
tactcctgcc cagatatcgt taacatctac atgttgatca gagaaaagaa gggtttgtcc 180
gtttccgaaa gaatcaagca atttttggat gaccctttgt tcaccagatt gaaggacaaa 240
agaccagctg atttggaaaa gatcgttttg attccaggtg atattaccgc tccagatttg 300
ggtattactg ctgctaacga aaagatgttg atcgaaaagg tttccgtcat tattcattct 360
gctgctaccg ttaagttcaa cgaaccattg ccaactgctt ggaagattaa cgttgaaggt 420
actagaatga tgttggcctt gtctagaaga atgaagagaa tcgaagtttt catccatatc 480
tctaccgctt acactaacac caacagagaa gttgttgacg aaatcttgta tccagctcca 540
gctgatattg atcaagttta ccaatacgtc aaagaaggta tctccgaaga agataccgaa 600
aaaatcttga acggtagacc aaacacttac actttcacta aggctttgac cgaacatttg 660
gttgctgaaa atcaagctta cgttccaacc attatcgtta gaccatcagt tgttgctgcc 720
attaaggatg aaccattgaa aggttggttg ggtaattggt ttggtgctac aggtttgact 780
gtttttactg ctaagggttt gaacagagtt atctacggtc attccaacta catcgttgat 840
ttgatcccag ttgattacgt tgccaacttg gttattgctg ctggtgctaa atctaacacc 900
tcttctgaat tgaaggtcta caactgttgt tcctcatcat gtaacccagt taagatcggt 960
actttgatgt ctatgtttgc tgatgatgcc atcaagcaaa agtcttatgc tatgccattg 1020
ccaggttggt acatttttac taagtacaag tggttggtct tgttgttgac cttcttgttc 1080
caagttattc cagcctacat taccgatttg tcaagacact tggttggtaa gagtccaaga 1140
tatatcaagt tgcaatcctt ggtcaatcaa accagatcct ccattgattt cttcaccaat 1200
cattcttggg ttatgaaggc cgatagagtc agagaattat acgcttcttt gtctccagca 1260
gataagtact tgtttccatg tgatccagtt aacatcaact ggacccaata cttgcaagat 1320
tactgttggg gtgttagaaa cttcttggaa aaaaagactt aa 1362
<210> 75
<211> 453
<212> PRT
<213> 烟芽夜蛾(Helicoverpa virescens)
<400> 75
Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly
20 25 30
Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Val Asn
35 40 45
Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg
50 55 60
Ile Lys Gln Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Asp Lys
65 70 75 80
Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr
85 90 95
Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ala Ala Asn Glu Lys Met Leu Ile Glu
100 105 110
Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met
130 135 140
Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile
145 150 155 160
Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu
165 170 175
Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val Tyr Gln Tyr Val Lys Glu
180 185 190
Gly Ile Ser Glu Glu Asp Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn
195 200 205
Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val Ala Glu Asn
210 215 220
Gln Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Val Arg Pro Ser Val Val Ala Ala
225 230 235 240
Ile Lys Asp Glu Pro Leu Lys Gly Trp Leu Gly Asn Trp Phe Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Leu Thr Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg Val Ile Tyr
260 265 270
Gly His Ser Asn Tyr Ile Val Asp Leu Ile Pro Val Asp Tyr Val Ala
275 280 285
Asn Leu Val Ile Ala Ala Gly Ala Lys Ser Asn Thr Ser Ser Glu Leu
290 295 300
Lys Val Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Ser Cys Asn Pro Val Lys Ile Gly
305 310 315 320
Thr Leu Met Ser Met Phe Ala Asp Asp Ala Ile Lys Gln Lys Ser Tyr
325 330 335
Ala Met Pro Leu Pro Gly Trp Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Lys Trp Leu
340 345 350
Val Leu Leu Leu Thr Phe Leu Phe Gln Val Ile Pro Ala Tyr Ile Thr
355 360 365
Asp Leu Ser Arg His Leu Val Gly Lys Ser Pro Arg Tyr Ile Lys Leu
370 375 380
Gln Ser Leu Val Asn Gln Thr Arg Ser Ser Ile Asp Phe Phe Thr Asn
385 390 395 400
His Ser Trp Val Met Lys Ala Asp Arg Val Arg Glu Leu Tyr Ala Ser
405 410 415
Leu Ser Pro Ala Asp Lys Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Pro Val Asn Ile
420 425 430
Asn Trp Thr Gln Tyr Leu Gln Asp Tyr Cys Trp Gly Val Arg Asn Phe
435 440 445
Leu Glu Lys Lys Thr
450
<210> 76
<211> 507
<212> PRT
<213> 苹果蠹蛾(Cydia pomonella)
<400> 76
Met Asp Met Ile Asp Glu Ala Glu Ala Arg Gly Glu Ser Gln Ile Gln
1 5 10 15
Lys Phe Leu Ser Gly Ser Thr Ile Leu Leu Thr Gly Gly Thr Gly Phe
20 25 30
Leu Gly Lys Leu Leu Val Glu Lys Leu Leu Arg Thr Cys Pro Asp Ile
35 40 45
Lys Lys Ile Tyr Leu Leu Ala Arg Pro Lys Lys Asn Lys Glu Ile Gln
50 55 60
Lys Arg Leu Gln Glu Gln Phe Glu Asp Pro Leu Tyr Glu Arg Leu Arg
65 70 75 80
Lys Gln Val Pro Asp Phe Met Ser Lys Ile Gly Val Val Glu Gly Asp
85 90 95
Val Gly Lys Leu Gly Leu Gly Ile Ser Glu Ser Asp Arg Gln Thr Val
100 105 110
Val Asp Glu Val Asp Val Ile Phe His Gly Ala Ala Thr Leu Arg Phe
115 120 125
Asn Glu Pro Leu Arg Asp Ala Val Phe Ile Asn Val Arg Gly Thr Arg
130 135 140
Glu Met Met Leu Leu Ala Arg Ala Cys Thr Lys Leu Lys Ala Met Val
145 150 155 160
His Ile Ser Thr Ala Tyr Ser Asn Cys Thr Leu Ser Glu Ile Asp Glu
165 170 175
Val Phe Tyr Glu Ser Pro Ile Pro Gly Asp Lys Leu Ile Asp Leu Ala
180 185 190
Glu Ser Leu Asp Glu Lys Thr Ile Asn Ser Ile Thr Pro Gly Leu Ile
195 200 205
Gly Asp Phe Pro Asn Thr Tyr Ala Tyr Thr Lys Gly Val Ala Glu Asp
210 215 220
Val Leu Gln Lys Tyr Ser Gln Gly Leu Pro Val Ala Val Val Arg Pro
225 230 235 240
Ser Ile Val Ile Gly Thr Ala Lys Asp Pro Val Ala Gly Trp Ile Asp
245 250 255
Asn Val Tyr Gly Pro Thr Gly Val Ile Val Gly Ala Glu Leu Gly Leu
260 265 270
Leu His Val Leu His Ala Ala Pro Asn Ala Ser Ala Ser Leu Val Pro
275 280 285
Gly Asp Ala Val Ala Ala Ala Cys Val Ala Ala Ala Trp Ser Val Ser
290 295 300
Arg Ala Glu Asn His Gln Ala Pro Ala Arg Asp Ala Pro Pro Leu Tyr
305 310 315 320
His Cys Val Cys Ser Glu Lys Ala Pro Ile Thr Trp Ser Gln Phe Met
325 330 335
Ser Leu Ala Glu Thr His Gly Leu Val Val Pro Pro Met Gln Ala Met
340 345 350
Trp Tyr Tyr Met Leu Thr Leu Thr Asn Ser Lys Ala Met Tyr Thr Leu
355 360 365
Leu Ala Leu Leu Met His Trp Ile Pro Ala Tyr Ile Ile Asp Gly Val
370 375 380
Cys Met Val Leu Gly Lys Lys Pro Gln Leu Arg Lys Ala Tyr Thr Lys
385 390 395 400
Ile Glu Gln Phe Ala Ala Val Ile Glu Phe Phe Ala Leu Arg Glu Trp
405 410 415
Arg Phe His Asn Asn Asn Met Thr Arg Leu Tyr Asn Glu Leu Cys Asp
420 425 430
Ala Asp Lys His Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Ser Ala Ile Asp Trp Asn
435 440 445
Glu Phe Phe Ala Asn Tyr Met Lys Gly Ile Arg Val Tyr Leu Leu Lys
450 455 460
Asp Pro Val Ser Thr Ile Pro Glu Ser Leu Lys Arg His Lys Arg Leu
465 470 475 480
Lys Trp Leu His Tyr Ala Leu Leu Thr Val Leu Ser Leu Leu Val Leu
485 490 495
Arg Leu Leu Trp Phe Phe Val Ser Phe Leu Phe
500 505
<210> 77
<211> 346
<212> PRT
<213> 梨小食心虫(Grapholita molesta)
<400> 77
Met Pro Pro Glu Ser Lys Asn Val Pro Ile Gln Gln Asn Phe Arg Lys
1 5 10 15
Pro Leu Glu Phe Leu Pro Arg Lys Tyr Asp Val Val Tyr Glu Asn Val
20 25 30
Phe Leu His Ile Ala Gly His Ile Ser Ala Ala Tyr Gly Leu Tyr Leu
35 40 45
Cys Phe Thr Val Ala Lys Trp Gln Thr Ile Ala Leu Ala Phe Val Trp
50 55 60
Tyr His Leu Gly Lys Ile Gly Ile Ile Cys Gly Ala His Arg Leu Trp
65 70 75 80
Ser His Arg Cys Tyr Lys Ala Lys Met Pro Leu His Ile Ile Leu Met
85 90 95
Ile Cys Asn Cys Ile Gly Phe Glu Asn Thr Ala Ile Asn Trp Val Arg
100 105 110
Asn His Arg Met His His Lys His Ser Asp Thr Asp Gly Asp Pro His
115 120 125
Asn Ser Asn Arg Gly Ala Phe Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Cys Val
130 135 140
Arg Lys His Pro Glu Thr Arg Asn Cys Lys Val Asp Met Ser Asp Ile
145 150 155 160
Tyr Ser Asn Pro Val Leu Val Phe Gln Lys Arg Tyr Lys Tyr Pro Leu
165 170 175
Val Gly Phe Leu Cys Tyr Gly Leu Pro Thr Phe Ile Pro Met Tyr Phe
180 185 190
Trp Gly Glu Thr Leu Val Thr Ala Trp His Val Asn Ile Leu Arg Tyr
195 200 205
Phe Leu Ser Met Asn Ala Val Phe Leu Val Asn Ser Leu Ala His Leu
210 215 220
Tyr Gly Asn Lys Pro Tyr Asp Ile Ser Ile Cys Pro Arg Gln Ser Pro
225 230 235 240
Phe Val Ser Leu Leu Thr Ile Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His
245 250 255
Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ala Ala Glu Leu Gly Asn Asn Tyr Leu
260 265 270
Asn Val Gly Lys Trp Val Ile Asp Phe Phe Ala Met Ile Gly Trp Ala
275 280 285
Tyr Asp Leu Lys Thr Val Pro Asp Glu Thr Ile Lys Arg Arg Met Lys
290 295 300
Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asn Cys Trp Gly Trp Gly Asp Lys Asp Met
305 310 315 320
Thr Arg Glu Asp Arg Asp Ile Ala Lys Ile Ile Tyr Pro Glu Ser Ile
325 330 335
Ser Lys Glu Glu Arg Asp Ile Ile Ala Met
340 345
<210> 78
<211> 1040
<212> DNA
<213> 梨小食心虫(Grapholita molesta)
<400> 78
atgcctccgg agtccaaaaa cgttcctatc cagcaaaatt ttaggaaacc actagaattt 60
ctcccgagga aatatgatgt ggtgtacgag aatgtatttc ttcacatcgc tggacatata 120
tctgcagctt acggcttata tctctgcttc actgtggcta aatggcagac tatcgccctt 180
gcattcgtct ggtaccacct gggcaagatt ggtataatct gtggcgccca ccggctttgg 240
tctcatcgct gctacaaagc caagatgcct ctgcatatta ttcttatgat atgtaattgt 300
ataggtttcg aaaacacagc cattaattgg gtaaggaatc atagaatgca ccacaagcac 360
agcgacacgg acggtgatcc ccacaactcg aatagaggag ctttcttttc ccacatcggt 420
tggctgtgtg tcaggaaaca tccggagact agaaactgta aagtcgacat gagtgatata 480
tacagcaatc ctgtattggt gtttcagaag agatataaat atcctttggt cggatttctc 540
tgttacggtc tacctacgtt tatacccatg tatttttggg gagagacttt ggtaacagct 600
tggcatgtga atattctgcg ttacttttta agtatgaatg ccgtttttct ggtcaacagc 660
ttggcgcatt tgtacggaaa taagccttat gacatatcaa tttgtccgcg acaaagtcct 720
tttgtgtcac ttttgaccat aggcgaggga ttccacaatt atcaccatac gtttccttgg 780
gactataggg cggcagaact aggcaataac tatctgaatg ttggaaaatg ggtcatagac 840
ttcttcgcta tgatcggctg ggcgtatgac ctcaaaacag ttccagatga aacgataaag 900
agaagaatga aaaggactgg agatggcacc aactgctggg gatgggggga caaggacatg 960
actagggagg acagagatat cgctaaaatc atctatcctg agtcgatatc gaaagaagaa 1020
agagatataa ttgcgatgga 1040
<210> 79
<211> 1041
<212> DNA
<213> 梨小食心虫(Grapholita molesta)
<400> 79
atgcctccgg agtccaaaaa cgttcctatc cagcaaaatt ttaggaaacc actagaattt 60
ctcccgagga aatatgatgt ggtgtacgag aatgtatttc ttcacatcgc tggacatata 120
tctgcagctt acggcttata tctctgcttc actgtggcta aatggcagac tatcgccctt 180
gcattcgtct ggtaccacct gggcaagatt ggtataatct gtggcgccca ccggctttgg 240
tctcatcgct gctacaaagc caagatgcct ctgcatatta ttcttatgat atgtaattgt 300
ataggtttcg aaaacacagc cattaattgg gtaaggaatc atagaatgca ccacaagcac 360
agcgacacgg acggtgatcc ccacaactcg aatagaggag ctttcttttc ccacatcggt 420
tggctgtgtg tcaggaaaca tccggagact agaaactgta aagtcgacat gagtgatata 480
tacagcaatc ctgtattggt gtttcagaag agatataaat atcctttggt cggatttctc 540
tgttacggtc tacctacgtt tatacccatg tatttttggg gagagacttt ggtaacagct 600
tggcatgtga atattctgcg ttacttttta agtatgaatg ccgtttttct ggtcaacagc 660
ttggcgcatt tgtacggaaa taagccttat gacatatcaa tttgtccgcg acaaagtcct 720
tttgtgtcac ttttgaccat aggcgaggga ttccacaatt atcaccatac gtttccttgg 780
gactataggg cggcagaact aggcaataac tatctgaatg ttggaaaatg ggtcatagac 840
ttcttcgcta tgatcggctg ggcgtatgac ctcaaaacag ttccagatga aacgataaag 900
agaagaatga aaaggactgg agatggcacc aactgctggg gatgggggga caaggacatg 960
actagggagg acagagatat cgctaaaatc atctatcctg agtcgatatc gaaagaagaa 1020
agagatataa ttgcgatgtg a 1041
<210> 80
<211> 1524
<212> DNA
<213> 苹果蠹蛾(Cydia pomonella)
<400> 80
atggacatga tcgacgaggc cgaggctcga ggcgagtctc agatccagaa gttcctgtct 60
ggctctacca tcctgctgac cggcggaacc ggcttcctgg gcaagctgct ggtcgagaag 120
ctgctgcgaa cctgtcctga catcaagaag atctacctgc tggctcgacc caagaagaac 180
aaggaaatcc agaagcgact gcaagagcag ttcgaggacc ctctgtacga gcgactccga 240
aagcaggtcc ccgacttcat gtctaagatc ggcgtggtcg agggcgacgt gggaaagctc 300
ggcctgggca tctctgagtc tgaccgacag accgtggtgg acgaggtgga cgtgatcttc 360
cacggcgctg ctaccctgcg attcaacgag cccctgcgag atgccgtgtt catcaacgtg 420
cgaggcaccc gagagatgat gctgctggcc cgagcctgca ccaagctgaa ggccatggtg 480
cacatctcta ccgcctactc taactgcacc ctgtctgaga ttgacgaggt gttctacgag 540
tctcccattc ctggcgacaa gctgatcgac ctggccgagt ctctggacga aaagaccatc 600
aactctatca cccctggcct gatcggcgac ttccccaaca cctacgccta caccaagggc 660
gtcgccgagg acgtgctgca gaagtactct cagggactgc ccgtggccgt ggtgcgaccc 720
tctatcgtga tcggcaccgc taaggacccc gtcgccggct ggatcgacaa cgtgtacggt 780
cccaccggtg tgattgtggg tgctgagctg ggcctgctgc acgtgctcca cgctgctccc 840
aacgcctctg cctctctggt gcccggtgac gctgtggctg ctgcttgcgt ggctgctgct 900
tggtctgtgt ctcgagccga gaaccatcag gctcccgctc gagatgcccc tcctctgtac 960
cactgcgtgt gctctgagaa ggctcccatc acctggtcgc agttcatgtc tctggccgag 1020
actcacggcc tggtggtgcc tccaatgcag gccatgtggt actacatgct gaccctgacc 1080
aactctaagg ccatgtacac cctgctcgcc ctgctgatgc actggatccc cgcctacatc 1140
atcgacggcg tgtgcatggt gctgggcaag aagccccagc tgcgaaaggc ttacaccaag 1200
atcgagcagt ttgccgccgt gatcgagttc ttcgctctgc gagagtggcg attccacaac 1260
aacaacatga cccgactgta caacgagctg tgcgacgccg acaagcacat ctacgacttc 1320
gacacctctg ccatcgactg gaacgagttc tttgccaact acatgaaggg catccgagtg 1380
tacctgctga aggaccctgt gtctactatc cctgagtctc tgaagcgaca caagcgactg 1440
aagtggctgc actacgccct gctcaccgtg ctgtctctgc tggtgctgcg actgctgtgg 1500
ttcttcgtgt ctttcctgtt ttag 1524

Claims (25)

1.一种能够产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇的酵母细胞，所述酵母细胞表达至少一种异源去饱和酶，所述至少一种异源去饱和酶能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)，其中：
a)所述至少一种去饱和酶是Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)，或与其具有至少80％同一性，与SEQ ID NO:2具有如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体；或
b)所述至少一种去饱和酶是至少两种去饱和酶，其中所述两种去饱和酶中的至少一种是Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)，或与其具有至少80％同一性，与SEQ ID NO:2具有如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体；所述另一种去饱和酶是能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的去饱和酶，如Z9-12去饱和酶。
2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中所述至少一种去饱和酶是至少两种去饱和酶，其中所述另一种去饱和酶选自Cpo_NPVE(SEQ ID NO:67)、Cpo_SPTQ(SEQ ID NO:69)或与其具有至少80％同一性，与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69具有如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体。
3.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞属于选自以下的属：布拉霉属、假丝酵母属、隐球菌属、小克银汉霉属、油脂酵母属、被孢霉属、毛霉属、须霉属、腐霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、丝孢酵母属、酵母属和耶氏酵母属，任选地其中所述酵母细胞属于选自以下的物种：三孢布拉霉、铁红假丝酵母、C.revkaufi、热带假丝酵母、弯曲隐球菌、刺孢小克银汉霉、雅致小克银汉霉、山茶小克银汉霉、斯达油脂酵母、产油油脂酵母、高山被孢霉、深黄被孢霉、拉曼被孢霉、葡酒色被孢霉、卷枝毛霉、布拉克须霉、畸雌腐霉、圆红冬孢酵母、粘红酵母、瘦弱红酵母、禾本红酵母、胶红酵母、R.pinicola、普鲁兰丝孢酵母、皮状丝孢酵母、酿酒酵母和解脂耶氏酵母，优选地，所述酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞或酿酒酵母细胞。
4.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够产生E8,E10-十二碳二烯-1-醇，所述酵母细胞还表达至少一种能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
5.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其中所述去饱和酶是在位置85具有突变如S85A突变的Cpo_CPRQ突变体，和/或其中所述至少一种异源去饱和酶是至少两种不同的异源去饱和酶，如SEQ ID NO:2中所示的Cpo_CPRQ和在位置85具有突变如S85A突变的Cpo_CPRQ的突变体。
6.根据权利要求4至5中任一项所述的酵母细胞，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶选自以下：Ase_FAR(SEQ ID NO:10)、Aip_FAR(SEQ ID NO:61)、Hs_FAR(SEQ ID NO:71)、Has_FAR(SEQ ID NO:73)、Hv_FAR(SEQ ID NO:75)、Har_FAR(SEQ ID NO:12)、Cpo_FAR(SEQ ID NO:76)及与其具有至少80％同一性，如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体，任选地其中所述脂肪酰辅酶A还原酶是Ase_FAR的突变体，所述突变体如在位置198或413具有突变，优选T198A突变或S413A突变。
7.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其还具有以下中的一种或多种：
-表达异源细胞色素b5，如来自鳞翅目物种的细胞色素b5，如来自棉铃虫的细胞色素b5，优选SEQ ID NO:4中所示的细胞色素b5 HarCyb5或与其具有至少80％同一性，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体；
-表达异源细胞色素b5还原酶(EC 1.6.2.2)，如来自鳞翅目物种如棉铃虫的细胞色素b5还原酶，优选地所述细胞色素b5还原酶是SEQ ID NO:24所示的来自棉铃虫的细胞色素b5还原酶或与其具有至少80％同一性，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体，
-表达血红蛋白，如来自粪透明颤菌的血红蛋白，优选SEQ ID NO:6中所示的来自粪透明颤菌的血红蛋白或与其具有至少80％同一性，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体，
-包含导致延伸酶活性部分或全部丧失的编码延伸酶的一个或多个基因的突变，如导致Elo1活性部分或全部丧失的ELO1基因(SEQ ID NO:13)的突变，优选地其中所述突变是缺失，
-包含导致硫酯酶活性部分或全部丧失的编码硫酯酶的一个或多个基因的突变，如YAL10_F14729g基因(SEQ ID NO:19)的突变、YALI0_E18876g基因(SEQ ID NO:54)的突变或YALI0_D03597g(SEQ ID NO:55)的突变，优选地其中所述突变是缺失，
-包含导致Hfd1、Hfd2、Hfd3、Hfd4、Fao1和Pex10中的至少一种的活性降低的至少一个突变，或具有导致与其具有至少80％同一性，如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的至少一种蛋白质的活性降低的突变，
-表达具有修饰的酮合酶结构域的脂肪酰基合酶变体，其中所述脂肪酰基合酶变体是Fas1(SEQ ID NO:16)或Fas2(SEQ ID NO:18)的变体，如在位置123具有突变优选L123V突变的突变体Fas1，或在位置1220具有突变优选I1220F或I1220W突变的突变体Fas2，
-表达硫酯酶如异源硫酯酶，任选地其中所述硫酯酶以高水平表达，如与如SEQ ID NO:33中所示的来自湿地萼距花的硫酯酶、与如SEQ ID NO:57中所示的来自萼距花的硫酯酶、与如SEQ ID NO:35中所示的来自香樟的硫酯酶或与如SEQ ID NO:26中所示的来自大肠杆菌的硫酯酶具有至少80％同一性的硫酯酶，优选地所述硫酯酶与如SEQ ID NO:35中所示的来自香樟的硫酯酶或与如SEQ ID NO:26中所示的来自大肠杆菌的硫酯酶具有至少80％同一性。
-表达截短的脂肪酰基合酶和截短的硫酯酶的融合蛋白，如SEQ ID NO:59中所示的融合蛋白或与其具有至少80％同一性的其同源物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其还包含导致Hfd1、Hfd2、Hfd3、Hfd4、Fao1、GPAT和Pex10中的至少一种的活性降低的至少一个突变，或具有导致与其具有至少80％同一性，如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的至少一种蛋白质的活性降低的至少一个突变。
9.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够产生以下滴度的E8,E10-十二碳二烯-1-醇：至少0.5mg/L，如至少0.6mg/L，如至少0.7mg/L，如至少0.8mg/L，如至少0.9mg/L，如至少1mg/L，如至少1.5mg/L，如至少2.5mg/L，如至少5.0mg/L，如至少10mg/L，如至少15mg/L，如至少20mg/L，如25mg/L，如至少50mg/L，如至少100mg/L，如至少250mg/L，如至少500mg/L，如至少750mg/L，如至少1g/L，如至少2g/L，如至少3g/L，如至少4g/L，如至少5g/L，如至少6g/L，如至少7g/L，如至少8g/L，如至少9g/L，如至少10g/L或更多。
10.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的乙酰基转移酶(EC 2.3.1.84)，从而所述酵母细胞能够产生E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯，优选地其中所述乙酰基转移酶是从所述酵母细胞表达的异源乙酰基转移酶(AcT)或从所述酵母细胞过表达的天然乙酰基转移酶，优选地其中所述乙酰基转移酶是Sc_Atf1(SEQ ID NO:37)或与其具有至少80％同一性，与Sc_Atf1(SEQ ID NO:37)具有如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的成醛脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)和/或脂肪醇氧化酶(EC 1.1.3.20)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还：
i)具有导致一种或多种天然酰基辅酶A氧化酶活性降低的一个或多个突变；以及
ii)表达包含至少一种能够氧化脂肪酰辅酶A的酰基辅酶A氧化酶的至少一组酶，其中该组酶能够将第一碳链长度X的脂肪酰辅酶A缩短为具有第二碳链长度X'的缩短的脂肪酰辅酶A，其中X'≤X-2，优选地其中X’＝12。
13.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其还表达能够在碳链长度X的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的去饱和酶，如CroZ11去饱和酶(SEQ ID NO:63)或CpaE11去饱和酶(SEQ ID NO:65)或与SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:65具有至少80％同一性、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体。
14.一种用于在酵母细胞中产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇的方法，所述方法包括提供酵母细胞和在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞表达：
i)至少一种异源去饱和酶，其能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入一个或多个双键，从而将所述脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪酰辅酶A，其中所述去饱和脂肪酰辅酶A的至少一部分是E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)；其中：
a)所述至少一种去饱和酶是Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)，或与其具有至少80％同一性，与SEQ ID NO:2具有如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体；或
b)所述至少一种去饱和酶是至少两种去饱和酶，其中所述两种去饱和酶中的至少一种是Cpo_CPRQ(SEQ ID NO:2)，或与其具有至少80％同一性，与SEQ ID NO:2具有如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的其功能变体；并且所述另一种去饱和酶是能够在碳链长度为12的脂肪酰辅酶A中引入至少一个双键的去饱和酶，如Z9-12去饱和酶；
和
ii)任选地至少一种异源脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)，其能够将至少部分所述去饱和脂肪酰辅酶A转化为去饱和脂肪醇，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A(E8,E10-C12:CoA)转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇，
从而产生E8,E10-十二碳二烯基辅酶A和任选地E8,E10-十二碳二烯-1-醇。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法还包括将E8,E10-十二碳二烯基辅酶A转化为脂质如甘油三酯或游离脂肪酸、回收所述脂质或游离脂肪酸并将所述脂质或游离脂肪酸转化为E8,E10-十二碳二烯-1-醇的步骤。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的方法，其中所述方法还包括回收所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇的步骤，
任选地，其中所述酵母细胞如权利要求1至13中任一项所定义。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
通过乙酰基转移酶的表达或通过化学转化将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯，从而进一步产生E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯，并且任选地还包括回收所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯的步骤。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其还包括通过表达能够将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的成醛脂肪酰辅酶A还原酶(EC1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)和/或脂肪醇氧化酶(EC 1.1.3.20)或通过化学转化将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇转化为E8,E10-十二碳二烯醛的步骤，从而进一步产生E8,E10-十二碳二烯醛，并且任选地还包括回收所述E8,E10-十二碳二烯醛的步骤。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其中所述培养基包含如下量的提取剂，所述量等于或大于其在培养温度下在水溶液中如培养基中的混浊浓度，其中所述提取剂是非离子乙氧基化表面活性剂如消泡剂，优选选自以下的聚乙氧基化表面活性剂：聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚醚分散体的混合物、包含聚乙二醇单硬脂酸酯的消泡剂如二甲硅油、脂肪醇烷氧基化物、聚乙氧基化表面活性剂和乙氧基化及丙氧基化C16-C18醇基消泡剂、及其组合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述培养基包含如下量的提取剂，所述量大于其混浊浓度至少50％如至少100％、如至少150％、如至少200％、如至少250％、如至少300％、如至少350％、如至少400％、如至少500％、如至少750％、如至少1000％或更多，和/或其中所述培养基包含如下量的提取剂，所述量为其混浊浓度的至少2倍如其混浊浓度的至少3倍、如其混浊浓度的至少4倍、如其混浊浓度的至少5倍、如其混浊浓度的至少6倍、如其混浊浓度的至少7倍、如其混浊浓度的至少8倍、如其混浊浓度的至少9倍、如其混浊浓度的至少10倍、如其混浊浓度的至少12.5倍、如其混浊浓度的至少15倍、如其混浊浓度的至少17.5倍、如其混浊浓度的至少20倍、如其混浊浓度的至少25倍、如其混浊浓度的至少30倍，其中所述混浊浓度是在所述培养基中，优选在培养温度下测量的。
21.根据权利要求19至20中任一项所述的方法，其还包括将所述E8,E10-十二碳二烯基辅酶A转化为脂质或游离脂肪酸的步骤，并且其中由所述酵母细胞产生的所述脂质或游离脂肪酸、所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛存在于发酵液中的乳液中，所述方法还包括破坏所述乳液的步骤，从而获得包含产物相的组合物，所述产物相包含所述提取剂和所述脂质或游离脂肪酸、所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛。
22.根据权利要求21所述的方法，其中破坏所述乳液的步骤包括以下或由以下组成：所述发酵液的相分离步骤，如离心步骤，从而获得由三个相组成的组合物：水相、包含细胞和细胞碎片的相、和产物相，所述产物相包含所述提取剂和所述脂质或游离脂肪酸、E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛。
23.根据权利要求21至22中任一项所述的方法，其中所述产物相包含最初存在于所述发酵液中的所述脂质或游离脂肪酸、E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛的至少50％，如至少55％、如至少60％、如至少65％、如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％或更多。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
-回收所述脂质或游离脂肪酸、所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇和任选地所述E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或所述E8,E10-十二碳二烯醛，优选通过蒸馏步骤如减压蒸馏、或通过柱纯化来回收，
-将至少部分所述E8,E10-十二碳二烯-1-醇化学转化为E8,E10-十二碳二烯醛和/或E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯，
-任选地，回收所述E8,E10-十二碳二烯醛和/或E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯。
25.根据权利要求14至24中任一项所述的方法，其还包括将所回收的E8,E10-十二碳二烯-1-醇、E8,E10-十二碳二烯基乙酸酯和/或E8,E10-十二碳二烯醛配制成信息素组合物的步骤。
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