KR20220118442A - E8,e10-도데카디에닐 코엔자임 a, 코들레몬 및 이의 유도체를 생산하기 위한 효모 세포 및 방법 - Google Patents

E8,e10-도데카디에닐 코엔자임 a, 코들레몬 및 이의 유도체를 생산하기 위한 효모 세포 및 방법 Download PDF

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크리스터 뢰프스테트
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레오니 웬닝
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바이오페로 에이피에스
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Abstract

본 발명은 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A, 코들레몬 (E8,E10-도데카디엔-1-올), 및 임의로, 이의 유도체 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날의 생산을 위해 조작된 효모 세포에 관한 것이다. E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A, 코들레몬 (E8,E10-도데카디엔-1-올), 및 임의로, 이의 유도체 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날의 생산 방법 또한 제공한다. 상기 효모 세포를 수득하는 데 유용한 핵산 구축물 또한 제공한다.

Description

E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A, 코들레몬 및 이의 유도체를 생산하기 위한 효모 세포 및 방법
기술 분야
본 발명은 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A, 코들레몬 (E8,E10-도데카디엔-1-올), 및 임의로, 이의 유도체 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날의 제조를 위해 조작된 효모 세포에 관한 것이다. E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A, 코들레몬 (E8,E10-도데카디엔-1-올), 및 임의로, 이의 유도체 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날의 생산 방법 또한 제공한다. 상기 효모 세포를 수득하는 데 유용한 핵산 구축물 또한 제공한다.
배경
통합 병해충 관리 (IPM)는 작물 수확량을 증가시키고, 환경에 미치는 영향을 최소화하며, 유기농 식품 생산을 가능하게 하는 데 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. IPM은 예컨대, 페로몬을 사용한 교미 교란, 페로몬, 유익한 곤충 등을 사용한 대량 포획과 같은 대안적 병해충 방제 방법을 사용한다.
페로몬은 곤충 (다른 유기체와 마찬가지로)이 짝 유인, 경보, 흔적 표시 및 집합을 비롯한 다양한 상황에서 동일한 종의 개체와 의사 소통하는 데 사용하는 다양한 화학 물질 군을 구성한다. 장거리 짝 찾기와 연관된 곤충 페로몬은 살충제에 대한 안전하고 환경 친화적인 대안으로서 이미 농업 및 임업 분야에서 병해충 모니터링 및 방제에 사용되고 있다.
페로몬은 살충제에 대한 건강 및 환경 친화적 대안을 나타낸다. 들판 또는 과수원에 성 페로몬을 뿌리면 곤충의 의사 소통은 파괴되고, 교미가 방지되며; 따라서, 수정란은 낳지 않을 것이며, 작물에 유충 피해가 발생할 것이다. 이 방법은 "교미 교란"으로 불린다. 페로몬은 유익한 종 또는 인간에게 해를 끼치지 않는 생분해성, 종 특이적 화합물이기 때문에, 살곤충제에 대한 매력적인 대안이다.
병해충 방제를 위한 곤충 페로몬의 적용은 수십 년 전 오직 산업적 규모의 페로몬 합성이 시작된 후에만 가능해졌다. 그럼에도 불구하고, 화학적으로 합성된 페로몬의 가격은 여전히 높으며, 농업 및 임업에서의 이의 사용을 확장시키는 데 주요 장벽이 되고 있다. 페로몬의 화학적 생산의 또 다른 단점은 독성 화학물질이 전구체, 촉매제 및 용매로 사용되어야 하고, 정제 동안 많은 양의 유기 폐기물이 생성된다는 점이다. 따라서, 복잡한 화학 합성 기반 프로세스를 기반으로 하는 현 생산 방법은 농업 및 임업의 많은 잠재적 응용 분야에서 광범위하게 사용하기 위해 제품을 엄청나게 비싸게 만든다.
화학적 생산 방법과 비교하여 생물학적 생산 방법에는 몇 가지 장점이 있다. 첫째, 모든 반응은 상이한 전구체, 촉매제 및 조건 (종종 고온 및 고압)을 필요로 하는 다중 화학 반응 단계 대신, 발효 탱크 중 주변 온도하에서 조작된 세포에 의해 수행된다. 더욱이, 조작된 세포는 여러 고가의 특수 화학물질을 전구체로 사용하는 대신, 설탕 또는 식물성 오일과 같은 저렴한 재생가능한 물질을 사용한다. 화학 반응은 종종 낮은 특이성으로 어려움을 겪게 되고, 따라서, 중간 화합물의 정제와 최종 생성물의 광범위한 정제를 필요로 하지만, 효소에 의해 수행되는 생물학적 반응은 전형적으로 매우 특이적이고, 부산물의 형성이 제한되고, 이로써, 정제를 위한 유기 용매 및 다른 독성 화학물질의 사용이 감소된다. 더욱이, 페로몬 활성에 종종 중요한 특정 입체 화학은 화학적 방법으로 달성하기가 매우 어려울 수 있는 반면, 효소적 방법은 시스 또는 트랜스 이성질체 중 하나에 대해 특이적인 효소를 이용할 수 있다.
관심의 대상이 되는 특정 페로몬은 화학식 E8,E10-도데카디엔-1-올 (E8,E10-C12:OH, CAS nr. 33956-49-9)을 갖는 이-불포화 지방 알콜인 코들레몬이다. 코들레몬은 여러 종의 성 페로몬 성분이며, 레피도프테라(Lepidoptera) 목에 속하며, 사과, 배, 자두 및 다른 과일의 주요 병해충인 시디아 포모넬라(Cydia pomonella) (코들링 나방)의 주요 성 페로몬이다.
문헌 [Ding 2014]에는 데사투라제가 발현된 식물 세포가 개시되어 있고, 여기서, 나방 페로몬을 생산할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 시험하였다. 축퇴성 PCR 접근법을 사용하여, C. 포모넬라(C. pomonella)로부터 3개의 데사투라제를 발견하였다 (문헌 [Ding et al. On the way of making plants smell like moths - a synthetic biology approach. Lund University, Faculty of Science, Department of Biology]).
따라서, 곤충 페로몬, 특히, 코들몬의 제조를 위한 생물학적 프로세스가 요구된다. 비용면에서 더 저렴하다는 이점 외에도, 발효 프로세스는 화학적 합성보다 본질적으로 덜 위험하고, 환경 친화적이다.
요약
본 발명은 청구범위에 정의된 바와 같다.
본원에서는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 효모 세포로서, 상기 효모 세포는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된(desaturated) 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제(heterologous desaturase)를 발현하고, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 효모 세포를 제공한다.
본원에서는 E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 효모 세포로서, 상기 효모 세포는
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 이종성 데사투라제; 및
ii) 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 발현하는 것인 효모 세포를 제공한다.
효모 세포를 제공하는 단계, 및 배지 중에서 효모 세포를 인큐베이션(incubation)시켜 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 제조하는 단계를 포함하고, 여기서, 효모 세포는
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 이종성 데사투라제; 및
ii) 임의로, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 발현하는 것인,
효모 세포에서 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 제조하는 방법 또한 제공한다.
효모 세포를 변형시키기 위한 핵산 구축물로서,
상기 구축물은
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제를 코딩하는 적어도 하나의 제1 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 제1 폴리뉴클레오티드; 및
ii) 임의로, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산 구축물 또한 제공한다.
i) 본원에 기술된 방법에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 제조하는 단계;
ii) 상기 E8,E10-도데카디엔-1-올 및 임의로, 상기 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 상기 E8,E10-도데카디에날을 페로몬 조성물로서 제제화(formulating)하는 단계; 및
iii) 상기 페로몬 조성물을 통합 병해충 관리 조성물로서 사용하는 단계를 포함하는, 병해충의 존재를 모니터링하거나, 또는 병해충의 교미를 교란시키는 방법 또한 제공한다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 방법에 의해 수득가능한 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A, E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 제공한다.
본원에서는 또한 사용 설명서, 및
a) 본원에 기술된 효모 세포; 및/또는
b) 효모 세포를 변형시키기 위한 본원에 기술된 핵산 구축물 및 임의로, 변형시키고자 하는 효모 세포로서, 핵산 구축물 내에 포함된 폴리뉴클레오티드 발현시, 변형된 효모 세포는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 것인 핵산 구축물 및 임의로, 효모 세포를 포함하는 부품들의 키트를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1. 효소에서의 코들레몬 생산 (E8,E10-C12:OH)를 위해 제안된 생합성 경로. ACC: 아세틸-CoA-카르복실라제; FA: 지방산; FAS; 지방산 신타제; TE: 티오에스테라제; FAA: 지방 아실-CoA 신테타제; L: 지질; FAE: 지방산 에스테르; FAD: 지방 아실 데사투라제; FAR: 지방 아실 리덕타제; Comp. β-ox.: 완전 β-산화.
도 2. (a) 공 플라스미드 또는 (b) 12:Me가 공급된 Cpo_CPRQ 함유 벡터로 형질전환된 효모로부터의 FAME 추출물의 GC-MS 분석, (c) E9-12:Me의 질량 스펙트럼; 으로 형질전환된 효모에서 FAME 추출물의 GC-MS 분석; (d) 공 플라스미드 또는 (e) E9-12:Me가 공급된 Cpo_CPRQ로 형질전환된 효모로부터의 FAME 추출물의 GC-MS 분석, (f) E8,E10-12:Me의 질량 스펙트럼.
상세한 설명
정의
생물농약: 용어 '생물농약'은 '생물학적 살충제'의 줄임말이며, 포식, 기생 또는 화학적 관계를 통한 여러 유형의 병해충 관리 개입을 지칭한다. EU에서, 생물농약은 "미생물 또는 천연물에 기반한 살충제의 한 형태"로 정의되었다. 미국에서는 EPA에 의해 "병해충을 방제하는 자연적으로 발생된 물질 (생화학적 살충제), 병해충을 방제하는 미생물 (미생물 살충제) 및 유전 물질이 첨가된 식물에 의해 생산된 살충 물질 (식물 통합 보호제), 또는 PIP를 포함하는 것"으로 정의된다. 본 개시내용은 더욱 특히 천연물 또는 자연적으로 발생된 물질을 포함하는 생물농약에 관한 것이다. 이는 전형적으로 박테리아 및 다른 미생물, 진균, 선충류, 단백질 등을 비롯한, 자연적으로 발생된 유기체 및/또는 대사 산물을 성장 및 농축시킴으로써 생성된다. 이는 종종 통합 병해충 관리 (IPM) 프로그램의 중요한 성분인 것으로 간주되며, 합성 화학 식물 보호 제품 (PPP)의 대체물로서 많은 실질적인 관심을 받고 있다. 문헌 [Manual of Biocontrol Agents] (2009: 이전 [Biopesticide Manual])는 이용가능한 생물학적 살곤충제 (및 다른 생물 기반 방제) 제품에 관산 리뷰를 제공한다.
클라우드 농도(Cloud concentration): 본원에서 용어는 이보다 높은 농도일 경우, 주어진 온도에서 계면활성제, 특히, 비이온성 계면활성제, 또는 글리콜 용액의 혼합물이 상 분리를 시작하고, 2개의 상이 출현하여 클라우드화되는 용액 중 상기 계면활성제, 또는 상기 용액의 농도를 지칭하는 데 사용될 것이다. 예를 들어, 주어진 온도에서 수용액 중 계면활성제의 클라우드 농도는 수용액과 혼합될 때, 2개의 상을 생산하는 상기 계면활성제의 최소 농도이다. 클라우드 농도는 계면활성제 제조업체로부터 수득할 수 있거나, 투여량 곡선을 작성하고, 혼합물 상이 분리되는 농도를 측정함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
담점: 예를 들어, 수용액과 같은 용액 중 계면활성제, 특히, 비이온성 계면활성제, 또는 글리콜 용액의 담점은 상기 계면활성제 및 상기 용액의 혼합물이 상 분리를 시작하고, 2개의 상이 출현하여 클라우드화되는 온도이다. 이러한 거동은 이 거동은 폴리옥시에틸렌 쇄를 포함하는 비이온성 계면활성제의 특징으로, 이는 물에서의 가역 용해도 대 온도 거동을 나타내는 바, 온도가 상승함에 따라, 특정 지점에서 "클라우드화된다." 이러한 거동을 나타내는 글리콜은 "담점 글리콜"로 공지되어 있다. 담점은 염도의 영향을 받으며, 이는 일반적으로 염수액이 많을수록 낮아진다.
코들레몬: 용어는 화학식 E8,E10-도데카디엔-1-올 (E8,E10-C12:OH)을 갖는 이-불포화 지방 알콜을 지칭한다. 코들레몬은 레피도프테라 목에 속하고, 사과, 배, 자두 및 다른 과일의 주요 병해충인 다른 시디아 포모넬라 (코들링 나방) 중의 여러 종의 주요 성 페로몬 성분이다. 용어 "코들레몬," "E8,E10-도데카디엔-1-올" 및 "E8,E10-C12:OH"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 것이다.
탈포화된: "탈포화된"이라는 용어는 본원에서 "불포화"라는 용어와 상호교환적으로 사용될 것이며, 이는 하나 이상의 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합을 함유하는 화합물을 지칭한다.
에톡실화 및 프로폭실화된 C16-C18 알콜계 소포제(antifoaming agent): 본 용어는 C16-C18 알킬 알콜 에톡실레이트 프로폭실레이트 또는 C16-C18 알콜 에톡실화된 프로폭실화된 중합체로도 명명되는, C16-C18의 에톡실화 및 프로폭실화된 알콜, 예를 들어, CAS 번호 68002-96-0을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리에톡실화된, 비이온성 계면활성제 군을 지칭한다.
추출제(extrant): 본원에서 사용되는 바, 용어 "추출제"는 예컨대, 발효에서 생성된 소수성 화합물의 회수를 촉진시키는 소포제와 같은 비이온성 계면활성제, 특히, 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 폴레에테르 분산액의 혼합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트를 포함하는 소포제, 예컨대, 시메티콘(simethicone) 및 에톡실화 및 프로폭실화된 C16-C18 알콜계 소포제 및 이의 조합으로부터 선택되는 폴리에톡실화된 계면활성제를 지칭한다.
지방산: 용어 "지방산"은 긴 지방족 쇄, 즉, 4 내지 28개의 탄소 원자, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 탄소 원자의 지방족 쇄를 갖는 카르복실산을 지칭한다. 대부분의 자연적으로 발생된 지방산은 비분지형이다. 이는 포화, 또는 탈포화일 수 있다.
지방 알콜 아세테이트: 본 용어는 본원에서 "지방 아세테이트"와 상호교환적으로 사용될 것이며, 이는 지방 탄소 쇄, 즉, 4 내지 28개의 탄소 원자, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 탄소 원자의 지방족 쇄를 갖는 아세테이트를 지칭한다. 지방 알콜 아세테이트는 포화, 또는 탈포화일 수 있다.
지방 아실-CoA: 본 용어는 본원에서 "지방 아실-CoA 에스테르"와 상호교환적으로 사용될 것이며, 이는 일반 화학식 R-CO-SCoA (여기서, R은 지방 탄소 쇄이다)의 화합물을 지칭한다. 지방 탄소 쇄는 티오에스테르 결합에 의해 코엔자임 A의 -SH 기에 연결된다. 지방 아실-CoA는 유도 기점이 되는 지방산이 포화 또는 탈포화인지 여부에 따라 포화, 또는 탈포화일 수 있다.
지방 알콜: 용어 "지방 알콜"은 본원에서 탄소 쇄 길이가 4 내지 28개의 탄소 원자, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 탄소 원자인, 지방 아실-CoA로부터 유도된 알콜을 지칭한다. 지방 알콜은 포화, 또는 탈포화일 수 있다.
지방 알데히드: 본 용어은 본원에서 탄소 쇄 길이가 4 내지 28개의 탄소 원자, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 탄소 원자인, 지방 아실-CoA로부터 유도된 알데히드를 지칭한다. 지방 알데히드는 포화, 또는 탈포화일 수 있다.
이종성: 폴리펩티드, 예컨대, 단백질 또는 효소, 또는 폴리뉴클레오티드를 언급할 때 "이종성"이라는 용어는 본원에서 야생형 세포에 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에 적용될 때, "이종성 Δ9 데사투라제"라는 용어는 야생형 Y. 리폴리티카(Y. lipolytica) 세포에 자연적으로 존재하지 않는 Δ9 데사투라제, 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)로부터 유래된 Δ9 데사투라제를 지칭한다.
폴레에테르 분산액의 혼합물: 본 용어는 예를 들어, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터의 유기 안티폼 204(antifoam 204) (제품 번호 A6426 및 A8311, MDL 번호 MFCD00130523)와 같은, 폴레에테르 분산액의 혼합물을 포함하거나, 또는 주로 그로 구성된 폴리에톡실화된 비이온성 계면활성제 군을 지칭한다.
천연: 폴리펩티드, 예컨대, 단백질 또는 효소, 또는 폴리뉴클레오티드를 언급할 때 "천연"라는 용어는 야생형 세포에 자연적으로 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 본 용어는 "내재"라는 용어와 상호교환적으로 사용될 것이다.
병해충: 본원에서 사용되는 바, 용어 '병해충'은 특히, 농업 또는 가축 생산과 관련하여 인간 또는 인간의 관심사에 해로운 유기체, 특히, 동물을 지칭한다. 병해충은 급속히 퍼지거나, 또는 다산성이고, 유해하고, 골칫거리이며, 유독성이고, 파괴적이며, 식물 또는 동물, 인간 또는 인간의 관심사, 가축, 인간 구조, 야생 생태계 등을 괴롭히는 모든 살아있는 유기체이다. 본 용어는 종종 관련 용어인 해충, 잡초, 식물 및 동물 기생충 및 병원체와 중복된다. 유기체가 한 환경에서는 병해충이 될 수 있지만, 다른 환경에서는 유익하거나, 순화되거나, 또는 허용될 수 있다.
페로몬: 페로몬은 알콜, 알데히드 또는 아세테이트 작용기로 종료되고, 지방족 백본에 최대 3개의 이중 결합을 포함하는 비분지형 지방족 쇄 (9 내지 18개의 탄소)로 지정된 자연적으로 발생된 화합물이다. 페로몬 조성물은 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 화학적으로 또는 생화학적으로 생성될 수 있다. 따라서, 페로몬은 탈포화된 지방 알콜, 지방 알데히드 또는 지방 알콜 아세테이트를 포함할 수 있고, 본원에 기술된 방법 및 세포에 의해 수득될 수 있다.
폴리에톡실화된 계면활성제: 본 용어는 본원에서 폴리에톡실화된 계면활성제, 즉, 비이온성 계면활성제를 지칭한다.
폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜: 본 용어는 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(프로필렌 글리콜)-블록-폴리(에틸렌 글리콜)로도 또한 명명되는 PEG-PPG-PEG 블록 공중합체 소포제, 예를 들어, 콜리포르(Kollliphor)® P407 (CAS 번호 9003-11-6)을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리에톡실화된 비이온성 계면활성제 군을 지칭한다.
활성 감소: 본원에서 용어 "활성 감소"란, 주어진 펩티드, 예컨대, 단백질 또는 효소 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 펩티드가 결실될 수 없는 필수 유전자에 의해 인코딩(encoding)된다. 이러한 경우, 펩티드의 활성은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대, 전사 또는 번역의 하향 조절, 또는 펩티드의 억제에 의해 감소될 수 있다. 다른 경우에, 펩티드는 비필수 유전자에 의해 인코딩되고, 활성은 감소될 수 있거나, 또는 활성은 예컨대, 펩티드를 인코딩하는 유전자의 결실의 결과로서 완전히 손실될 수 있다. 효소의 활성 감소는 또한 당업계에 공지된 바와 같이, 예를 들어, 억제성 프로모터를 사용하여, 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 전사를 억제시킴으로써, 활성을 억제시킴으로써, 또는 번역 수준에서 침묵화시킴으로써 달성될 수 있다.
포화된: "포화된"이라는 용어는 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합이 없는 화합물을 지칭한다.
시메티콘: 본 용어는 시메티콘(simeticone) (CAS 번호 8050-81-5), 디메틸 폴리실록산, 또는 활성화된 폴리메틸실록산으로도 또한 명명되는, 시메티콘을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리에톡실화된 비이온성 계면활성제 군을 지칭한다. 시메티콘은 또한 1.2-1.6% 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트를 함유하는 실리콘 기반 에멀젼이다.
계면활성제: 본 용어는 두 액체 사이, 기체와 액체 사이, 또는 액체와 고체 사이의 표면 장력 (또는 계면 장력)을 낮추는 화합물을 지칭한다. 계면활성제는 세제, 습윤화제, 유화제, 소포제 및 분산제로 작용할 수 있다. 계면활성제는 일반적으로 양친매성인 유기 화합물이며, 이는 계면활성제가 소수성 기 (이의 테일)와 친수성 기 (이의 헤드), 둘 모두를 함유한다는 것을 의미한다. 따라서, 계면활성제는 전형적으로 수불용성 (또는 유용성) 성분 및 수용성 성분, 둘 모두를 포함한다. 가장 일반적으로, 계면활성제는 극성 헤드 기에 따라 분류된다. 비이온성 계면활성제에는 이의 헤드에 하전된 기가 없다.
역가: 본원에서 화합물의 역가란, 제조된 화합물의 농도를 지칭한다. 화합물이 세포에 의해 생산될 때, 본 용어는 세포에 의해 생산되는 총 농도, 즉, 화합물의 총량을 배양 배지의 부피로 나눈 것을 의미한다. 이는 특히 휘발성 화합물인 경우, 역가는 배양 배지로부터 증발했을 수 있는 화합물의 일부를 포함한다는 것을 의미하며, 따라서, 발효 브로쓰(fermentation broth)로부터 및 발효기로부터의 잠재적인 오프-가스로부터 생성된 화합물을 수집함으로써 결정된다.
코들레몬 ( E8,E10 - C12:OH )
코들레몬의 생합성은 말로닐-CoA로 카르복실화되는 아세틸-코엔자임 A (CoA)를 기반으로 하며; 상기 반응은 아세틸-CoA-카르복실라제 (ACC)에 의해 촉매화된다. 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA는 쇄 길이가 최대 C16/C18인 지방 아실-CoA를 합성하는 데 지방산 신타제 (FAS)에 의해 사용되는 전구체이다. C. 포모넬라 퍼옥시좀 옥시다제 (POX)는 C14:CoA를 통해 C12:CoA (라우릴-CoA)로 C16:CoA의 쇄 단축 (-2C)을 촉매화한다고 가정하였다 (문헌 [Ding, 2014]). C. 포모넬라에서 C12:CoA를 E9-C12:CoA로 전환시키는 데사투라제에 대한 증거는 초기에 발견되었지만, 상기 데사투라제를 인코딩하는 유전자는 추가 데사투라제를 코딩하는 2개의 추가 유전자와 함께 최근에야 확인되었다 (Cpo_SPTQ/Cpo_NPVE/Cpo_CPRQ). 제1 불포화 단계에서는 C12:CoA가 E/Z9-C12:CoA로 전환되고, 제2 불포화 단계에서는 E8,E10-C12:CoA (E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A)로 전환된다. 이어서, 지방 아실 리덕타제 (FAR)는 가정컨대, 디엔 E8,E10-C12:CoA를 환원시켜 최종적으로 코들레몬 (E8,E10-C12:OH)을 형성한다. C. 포모넬라에서 FAR을 인코딩하는 유전자는 지금까지 확인되지 않았다 (문헌 [Ding 2014, Lofstedt et al., 1988]).
코들레몬 생합성에 대해 제안된 경로는 도 1에 제시되어 있다.
코들레몬 생산
본 개시내용은 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, 코들레몬 (E8,E10-C12:OH 또는 E8,E10-도데카디엔-1-올)을 생산할 수 있는 효모 세포, 및 효모 세포에서 코들레몬 (E8,E10-C12:OH 또는 E8,E10-도데카디엔-1-올)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 효모에서 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올의 제조를 위한 이종성 경로 (예로서, 도 1에 개략적으로 제시)를 디자인하였다.
따라서, 본원에서는
효모 세포를 제공하는 단계, 및 배지 중에서 효모 세포를 인큐베이션시켜 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 제조하는 단계를 포함하고, 여기서, 효모 세포는
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제; 및
ii) 임의로, 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 발현하는 것인, 효모 세포에서 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 제조하는 방법 또한 제공한다.
따라서, 본 효모 세포 및 방법은 생체내에서 효모 세포에서 리덕타제를 발현함으로써 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환될 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A를 제조함으로써 코들레몬을 제조하는 데 사용될 수 있거나, 또는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A는 지질, 예컨대, 트리아실글리세리드로, 또는 유리 지방산으로 전환될 수 있고, 이는 이어서, 회수되고, 시험관내에서 당업계에 공지된 바와 같이, 예컨대, 리덕타제와 접촉시킴으로써 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환될 수 있다. 상기 두 경우 모두, E8,E10-도데카디엔-1-올이 생성된다.
효모 세포
본 방법의 제1 단계에서, 더 긴 장쇄의 아실-CoA의 생합성을 위해 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA를 사용할 수 있는 효모 세포를 제공한다. 아실-CoA를 합성할 수 있는 임의의 효모 세포가 본원에 기술된 바와 같은 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 제조하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 효모 세포는 당업계에 공지된 바와 같은 적합한 탄소원과 함께 제공될 수 있다. 효모 세포는 비-자연적으로 발생된 효모 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 생산하도록 조작된 효모 세포일 수 있다.
아세틸-CoA 및 말로닐-CoA는 아실-CoA, 특히, 탄소 쇄 길이가 12인 아실-CoA로 전환될 수 있다. 이는 예를 들어, 천연 또는 이종성 아실-CoA 티오에스테라제 (EC 3.1.2.20)의 작용에 의해 도데카노일-CoA를 도데칸산 (라우르산)으로 전환시키는 단계를 포함할 수 있다. 이어서, 라우르산은 천연 또는 이종성 지방 아실-코엔자임 A 신테타제 (FAA) (EC 6.2.1.3)의 작용에 의해 도데카노일-CoA로 전환될 수 있다.
따라서, 효모 세포는 또한 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA를 지방 아실-CoA, 특히, 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 따라서, 효모 세포는 상기 반응을 수행할 수 있는 하나 이상의 지방 아실-코엔자임 신테타제 (EC 6.2.1.3) 및/또는 하나 이상의 아실-CoA 티오에스테라제 (EC 3.1.2.20)를 발현한다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 배양 배지에 라우르산 또는 메틸 라우레이트 또는 트리라우로일글리세롤 또는 또 다른 지방산 유도체와 함께 제공된다. 효모 세포가 하기 기술되는 바와 같은 β-산화를 통해 탄소 쇄를 단축시킬 수 있도록조작된 경우, 세포는 탄소 쇄 길이가 12보다 긴 오일 또는 지방 또는 임의의 지방산 유도체와 함께 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 예컨대, 게놈에서의 유전자 편집에 의해 게놈 수준에서 변형될 수 있다. 세포는 또한 적어도 하나의 핵산 구축물, 예컨대, 적어도 하나의 벡터의 삽입에 의해 변형될 수 있다. 벡터는 당업자에게 공지된 바와 같이, 게놈에서 핵산 서열의 통합이 가능하도록, 또는 게놈 통합 없이, 벡터에 포함된 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현이 가능하도록 디자인될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 블라케슬레아(Blakeslea), 칸디다(Candida), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 쿤닝하멜라(Cunninghamella), 리포마이세스(Lipomyces), 모르티에렐라(Mortierella), 무코르(Mucor), 피코마이세스(Phycomyces), 피시움(Pythium), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 로도토룰라(Rhodotorula), 트리코스포론(Trichosporon), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 야로위아를 포함하는, 하지만 이에 제한되지 않는, 속의 효소 또는 진균이 사용된다. 특정의 특별한 실시양태에서, 블라케슬레아 트리스포라(Blakeslea trispora), 칸디다 풀케리마(Candida pulcherrima), C. 레브카우피(C. revkaufi), C. 트로피칼리스(C. tropicalis), 크립토코쿠스 쿠르바투스(Cryptococcus curvatus), 쿤닝하멜라 에키눌라타(Cunninghamella echinulata), C. 엘레간스(C. elegans), C. 자포니카(C. japonica), 리포마이세스 스타키(Lipomyces starkeyi), L. 리포페루스(L. lipoferus), 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina), M. 이사벨리나(M. isabellina), M. 라만니아나(M. ramanniana), M. 비나세아(M. vinacea), 무코르 키르키넬로이데스(Mucor circinelloides), 피코마이세스 블라케스레아누스(Phycomyces blakesleanus), 피시움 이레굴라레(Pythium irregulare), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), R. 그라실리스(R. gracilis), R. 그라미니스(R. graminis), R. 무실라기노사(R. mucilaginosa), R. 피니콜라(R. pinicola), 트리코스포론 풀란스(Trichosporon pullans), T. 쿠타네움(T. cutaneum), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 야로위아 리폴리티카를 포함하나, 이에 제한되지 않는 종의 유기체가 사용된다. 일부 실시양태에서, 효모 세포는 야로위아 리폴리티카 세포 또는 사카로마이세스 세레비지아에 세포이다.
숙주 세포로도 또한 지칭될 수 있는, 변형시키고자 하는 효모 세포는 수득할 수 있는 E8,E10-도데카디엔-1-올의 역가에 부정적인 영향을 줄 수 있는 천연 효소를 발현할 수 있고; 따라서, 천연 효소는 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 유전자 편집에 의해 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 역가에 부정적인 영향을 미치는 천연 효소를 코딩하는 유전자는 본원 하기에서 기술되는 바와 같이, 천연 효소의 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 유도하기 위해 결실되거나, 또는 돌연변이화될 수 있다.
데사투라제
본 방법은 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA를 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시키는 데 필요한 효소를 발현하는 효모 세포에 의존한다. 상기를 위해 필요한 제1 효소는 탄소 쇄 길이가 12인 상기 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탄소 쇄 길이가 12이고, 하나 이상의 이중 결합을 갖는 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 데사투라제이다. 탄소 쇄 길이가 12인 탈포화된 지방 아실-CoA는 탄소 쇄 길이가 12인 탈포화된 지방 아실-CoA의 혼합물일 수 있고; 상기 혼합물은 E8,E10-C12:CoA를 포함하지만, 이는 전형적으로는 또한 단일불포화 지방 아실-CoA E9-C12:CoA 및 Z9-C12:CoA도 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 E8,E10-C12:CoA (E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A)로 전환시킬 수 있는 데사투라제를 발현한다. EC 부류 EC 1.14.19의 데사투라제는 상기 반응을 수행할 수 있다.
코들레몬의 제조는 2개의 탈포화 단계에 의존한다. 이는 본원 하기에 기술된 바와 같은 한 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 돌연변이체(mutant) 및 이의 기능성 변이체(functional variant)에 의해, 또는 2개의 상이한 데사투라제에 의해 수행될 수 있다. 2개의 상이한 데사투라제가 사용되는 실시양태에서, 데사투라제 중 적어도 하나는 본원 하기에 기술된 바와 같은 Cpo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 이의 기능성 변이체이다. 2개의 상이한 데사투라제가 사용되는 다른 실시양태에서, 데사투라제 중 적어도 하나는 본원 하기에 기술된 바와 같은 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 데사투라제는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있거나, 또는 이는 이어서, 탄소 쇄 길이가 14인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있고, 이는 하기 "쇄 단축" 섹션에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이 탄소 쇄 길이가 12인 탈포화된 지방 아실-CoA로 단축될 수 있다. 이어서, 탄소 쇄 길이가 12 또는 14이고, 한 이중 결합을 갖는 지방 아실-CoA는 예컨대, Cpo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체에 의해 추가로 탈포화될 수 있다.
데사투라제는 바람직하게 이종성 데사투라제이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는, C. 포모넬라에서 자연적으로 발견된 데사투라제인 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2)이다. 실시예 16에서 입증되는 바와 같이, Cpo_CPRQ 단독 발현은 E8,E10-C12:CoA를 제조하는 데 충분하다. Cpo_SPTQ이든, 또는 Cpo_NPVE이든, 이의 단독 발현은 E8,E10-C12:CoA를 생성하지 못했다. 상기 관찰결과는 문헌 [Ding 2014]에 비추어 보면 놀라운 것이며, 여기서, 상기 3개의 데사투라제에 대한 기능적 검정법 결과, C. 포모넬라 페로몬에서 연속적으로 접합된 이중 결합을 형성하는 작용을 하는 것으로 나타났으며 - 이는 효소에서의 경우는 아닌 것으로 보인다.
이종성 데사투라제는 또한 이종성 데사투라제, 예컨대, Cpo_CPRQ의 기능성 변이체, 즉, 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA를 탄소 쇄 길이가 12인 탈포화된 지방 아실-CoA, 예컨대, E8,E10-C12:CoA로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 변이체는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2)와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성(identity), 예컨대, 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
이종성 데사투라제는 또한 이종성 데사투라제, 예컨대, Cpo_CPRQ의 기능성 변이체, 즉, 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA를 탄소 쇄 길이가 12인 탈포화된 지방 아실-CoA, 예컨대, E8,E10-C12:CoA로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 변이체는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2)와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
데사투라제는 바람직하게 이종성 데사투라제이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 그라폴리타 몰레스타(Grapholita molesta)에서 자연적으로 발견된 데사투라제인 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77), 또는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA를 탄소 쇄 길이가 12인 탈포화된 지방 아실-CoA, 예컨대, E8,E10-C12:CoA로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 기능성 변이체는 Gmo_CPRQ (서열 번호: 78)와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 데사투라제는 당업계에 공지된 바와 같이, 상기 데사투라제를 코딩하는 핵산을 도입함으로써 발현된다. 이러한 핵산은 당업계에 공지된 바와 같이 코돈 최적화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 데사투라제를 코딩하는 핵산은 서열 번호: 1에 기재되어 있는 바와 같거나, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 1과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체(homologue)이다. 다른 실시양태에서, 데사투라제를 코딩하는 핵산은 서열 번호: 78에 기재되어 있는 바와 같거나, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 78과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체이다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입할 수 있는 수개의 데사투라제를 발현한다. 상기 실시양태에서, 바람직하게, 수개의 데사투라제 중 적어도 하나는 하기 상세하게 설명되는 바와 같은, Cpo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 바람직하게, 수개의 데사투라제 중 적어도 하나는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 데사투라제는 예를 들어, Cpo_NPVE (수탁 번호: AHW98355, 서열 번호: 67), 또는 Cpo_SPTQ (수탁 번호: AHW98356, 서열 번호: 69), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체일 수 있다. 상기 데사투라제는 효모 세포에 코돈 최적화될 수 있는 핵산, 예를 들어, 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 68에 기재되어 있는 바와 같은 핵산, 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체의 도입 후, 효모 세포에서 발현될 수 있다.
효모 세포는 수개의 이종성 데사투라제 카피를 발현하도록 조작될 수 있다. 이는 당업계에 공지된 바와 같이 수행될 수 있다. 데사투라제 또는 데사투라제들은 또한 당업계에 공지된 바와 같이, 예를 들어, 강력한 발현 수준을 유도하는 구성적 프로모터 (상기 프로모터는 당업계에 공지되어 있어 있다)의 사용에 의해 높은 수준으로 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, 데사투라제는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, 85번 위치에 돌연변이를 갖는 Cpo_CPRQ 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 S85A 돌연변이이다. 데사투라제는 또한 상기 돌연변이체의 기능성 변이체일 수 있고, 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S85A 돌연변이체와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체는 S85T 돌연변이체이다.
일부 실시양태에서, 데사투라제는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, 82번 위치에 돌연변이를 갖는 Cpo_CPRQ 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 S82A 돌연변이이다. 데사투라제는 또한 상기 돌연변이체의 기능성 변이체일 수 있고, 82번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S82A 돌연변이체와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 2개 이상의 이종성 데사투라제를 발현한다. 상기 2개 이상의 데사투라제는 동일하거나, 또는 상이할 수 있다. 특정 실시양태에서, 효모 세포는 서열 번호: 2에 기재된 바와 같은 Cpo_CPRQ, 및 예컨대, 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S85A 돌연변이체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 돌연변이체 Cpo_CPRQ 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현하고, 이는 또한 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제를 발현한다. 일부 실시양태에서, 효모 세포는 서열 번호: 77에 기재된 바와 같은 Gmo_CPRQ 및 서열 번호: 2에 기재된 바와 같은 Cpo_CPRQ 또는 본원에 기술된 바와 같은, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다.
일부 실시양태에서, 다른 데사투라제는 서열 번호: 67에 기재된 바와 같은 Cpo_NPVE, 이의 돌연변이체 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 효모 세포는 Cpo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체, 및 Cpo_NPVE, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 효모 세포는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체, 및 Cpo_NPVE 또는 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다.
다른 실시양태에서, 다른 데사투라제는 서열 번호: 69에 기재된 바와 같은 Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체, 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 효모 세포는 Cpo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체, 및 Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 효모 세포는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체, 및 Cpo_SPTQ 또는 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 이종성 데사투라제는 본원 상기에 기술된 바와 같은 Cpo_CPRQ 또는 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체이다.
탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 1 또는 2개의 이중 결합을 도입할 수 있는, 본원에 기술된 데사투라제 이외에도, 탄소 쇄 길이가 >12, 예컨대, 탄소 쇄 길이가 14 이상인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 데사투라제를 발현하는 효모 세포는 또한 탄소 쇄 길이가 >12인 탈포화된 지방 아실-CoA의 탄소 쇄 길이를 줄일 수 있는 다른 효소도 발현하여야 한다. 이는 하기 "쇄 단축" 섹션에 상세하게 설명되어 있다.
따라서, 효모 세포는 따라서, 효모 세포는 탄소 쇄 길이가 12인 상기 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탄소 쇄 길이가 12이고, 하나 이상의 이중 결합을 갖는 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 데사투라제, 예컨대, 본원 상기에 기술된 데사투라제 중 임의의 것, 또는 지방 아실-CoA를 탄소 쇄 길이가 12인 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, 이의 기능성 변이체를 발현할 수 있다. 효모 세포는 추가로 탄소 쇄 길이가 >12, 예컨대, 탄소 쇄 길이가 14 이상인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 데사투라제, 또는 탄소 쇄 길이가 >12, 예컨대, 탄소 쇄 길이가 14 이상인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 능력을 보유하는, 이의 기능성 변이체를 발현할 수 있다.
데사투라제 또는 이의 기능성 변이체가 원하는 활성을 갖는지 여부를 시험하기 위해, 당업계에 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험하고자하는 후보 효소를 효모 세포에, 예컨대, 벡터 상에, 또는 효모 세포의 게놈에 도입하고, 적절한 배지 중에서 효모 세포를 인큐베이션시키고, 브로쓰로부터 지방 알콜 및/또는 지방산 메틸 에스테르를 추출하고, 예컨대, 탈포화된 화합물이 제조되는지 여부를 측정하는 GC-MS 분석과 같은 분석을 수행할 수 있다. 천연 엘롱가제(elongase) 유전자(들)가 결핍된 효모 세포에서 활성을 시험하는 것이 유리할 수 있다. 상기 방법의 예는 실시예 4에, 또는 문헌 [Schneiter et al., 2000]에 기술되어 있다.
지방 아실- CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)
용어 "지방 아실-CoA 리덕타제," "리덕타제" 및 "FAR"은 본원에서 상호교환적으로 사용될 것이다. FAR은 2 단계 반응을 촉매화한다:
아실-CoA + 2 NADPH <=> CoA + 알콜 + 2 NADP(+)
여기서, 제1 단계에서, 지방 아실-CoA는 제2 단계에서 지방 알데히드가 지방 알콜로 추가로 환원되기 전, 지방 알데히드로 환원된다. 지방 아실-CoA는 탈포화된 지방 아실-CoA, 특히, E8,E10-C12:CoA일 수 있으며, 이는 이어서, E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환된다.
상기 반응을 촉매화할 수 있는 FAR은 EC 번호가 1.2.1.84인 알콜 형성 지방 아실-CoA 리덕타제이다. 따라서, 본 방법에 사용된 효모 세포는 상기 반응을 촉매화할 수 있는 이종성 FAR을 발현할 수 있다. 대안적으로, E8,E10-C12:CoA는 E8,E10-C12:CoA의 회수, 및 시험관내에서 상기 E8,E10-C12:CoA와 FAR의 접촉 후, E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환될 수 있다.
FAR은 바람직하게 곤충 FAR, 예컨대, 아그로티스(Agrotis) 속, 헬리오티스(Heliothis) 속, 헬리코베르파(Helicoverpa) 속 또는 시디아(Cydia) 속의 곤충에 고유한 FAR일 수 있다. 예를 들어, FAR은 아그로티스 세게툼(Agrotis segetum), 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon), 헬리오티스 서브플렉사(Heliothis subflexa), 헬리코베르파 아술타(Helicoverpa assulta), 헬리코베르파 비레센스(Helicoverpa virescens) 또는 시디아 포모넬라(Cydia pomonella)에 고유한 것이다.
일부 실시양태에서, FAR은 Ase_FAR (서열 번호: 10), 즉, 아그로티스 세게툼에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Ase_FAR의 기능성 변이체이다. 예를 들어, 기능성 변이체는 Ase_FAR (서열 번호: 10)과 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, FAR은 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, 198번 또는 413번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, Ase_FAR 돌연변이체는 T198A 돌연변이체이다. 다른 실시양태에서, Ase_FAR 돌연변이체는 S413A 돌연변이체이다.
일부 실시양태에서, Ase_FAR 또는 이의 기능성 변이체는 Ase_FAR 또는 이의 기능성 변이체를 코딩하는 핵산을 효모 세포에 도입함으로써 발현된다. 예를 들어, 서열 번호: 9에 기재되어 있는 바와 같은 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 9와 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체가 도입된다.
다른 실시양태에서, FAR은 Aip_FAR (서열 번호: 61), 즉, 아그로티스 입실론에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Aip_FAR의 기능성 변이체이다. 예를 들어, 기능성 변이체는 Aip_FAR (서열 번호: 61)과 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, Aip_FAR 또는 이의 기능성 변이체는 Aip_FAR 또는 이의 기능성 변이체를 인코딩하는 핵산을 효모 세포에 도입함으로써 발현된다. 예를 들어, 서열 번호: 60에 기재되어 있는 바와 같은 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 60과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체가 도입된다.
다른 실시양태에서, FAR은 Hs_FAR (서열 번호: 71), 즉, 헬리오티스 서브플렉사에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Hs_FAR의 기능성 변이체이다. 예를 들어, 기능성 변이체는 Hs_FAR (서열 번호: 71)과 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, Hs_FAR 또는 이의 기능성 변이체는 Hs_FAR 또는 이의 기능성 변이체를 인코딩하는 핵산을 효모 세포에 도입함으로써 발현된다. 예를 들어, 서열 번호: 70에 기재되어 있는 바와 같은 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 70과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체가 도입된다.
다른 실시양태에서, FAR은 Has_FAR (서열 번호: 73), 즉, 헬리코베르파 아술타에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Has_FAR의 기능성 변이체이다. 예를 들어, 기능성 변이체는 Has_FAR (서열 번호: 73)과 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, Has_FAR 또는 이의 기능성 변이체는 Has_FAR 또는 이의 기능성 변이체를 인코딩하는 핵산을 효모 세포에 도입함으로써 발현된다. 예를 들어, 서열 번호: 72에 기재되어 있는 바와 같은 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 72와 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체가 도입된다.
다른 실시양태에서, FAR은 Hv_FAR (서열 번호: 75), 즉, 헬리코베르파 비레센스에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Hv_FAR의 기능성 변이체이다. 예를 들어, 기능성 변이체는 Hv_FAR (서열 번호: 75)과 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, Hv_FAR 또는 이의 기능성 변이체는 Hv_FAR 또는 이의 기능성 변이체를 인코딩하는 핵산을 효모 세포에 도입함으로써 발현된다. 예를 들어, 서열 번호: 74에 기재되어 있는 바와 같은 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 74와 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체가 도입된다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 시디아 포모넬라로부터의 FAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, FAR은 Cpo_FAR (서열 번호: 76), 즉, 시디아 포모넬라에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Cpo_FAR의 기능성 변이체이다. 예를 들어, 기능성 변이체는 Cpo_FAR (서열 번호: 76)과 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, Cpo_FAR 또는 이의 기능성 변이체는 Cpo_FAR 또는 이의 기능성 변이체를 인코딩하는 핵산을 효모 세포에 도입함으로써 발현된다. 예를 들어, 서열 번호: 76에 기재되어 있는 바와 같은 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 76과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체가 도입된다.
일부 실시양태에서, FAR은 Har_FAR (서열 번호: 12), 즉, 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera)에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Har_FAR의 기능성 변이체이다. 예를 들어, 기능성 변이체는 Har_FAR (서열 번호: 12)와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, Har_FAR 또는 이의 기능성 변이체는 Har_FAR 또는 이의 기능성 변이체를 인코딩하는 핵산을 효모 세포에 도입함으로써 발현된다. 예를 들어, 서열 번호: 11에 기재되어 있는 바와 같은 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 11과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%을 갖는, 이의 동족체가 도입된다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 수개의 FAR 카피를 발현한다. 예를 들어, FAR은 당업계에 공지된 바와 같이 높은 수준으로 발현된다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 본원에 기술된 바와 같은 데사투라제 및 FAR을 발현한다. 구체적인 실시양태에서, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체, 및 Ase_FAR (서열 번호: 10), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현하고, FAR은 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, 198번 또는 413번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체, 예를 들어, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은 Ase_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 데사투라제는 S85A Cpo_CPRQ 돌연변이체이고, FAR은 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, 198번 또는 413번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체, 예를 들어, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 데사투라제, 예컨대, 2개의 동일한 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ, 또는 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은 Ase_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 데사투라제, 예컨대, 2개의 동일한 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ, 또는 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, 198번 또는 413번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체, 예를 들어, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체이다. 다른 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 상이한 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ 데사투라제, 및 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은 Ase_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 상이한 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ 데사투라제, 및 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, 198번 또는 413번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체, 예를 들어, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체이다. 다른 실시양태에서, 효모 세포는 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77) 및 Ase_FAR 또는 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다.
구체적인 실시양태에서, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체, 및 Aip_FAR (서열 번호: 61), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은Aip_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 데사투라제, 예컨대, 2개의 동일한 데사투라제, 예를 들어, 2개의 Cpo_CPRQ 데사투라제 또는 2개의 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, 2개의 S85A 돌연변이체이고, FAR은 Aip_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 상이한 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ 데사투라제, 및 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은 Aip_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 효모 세포는 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77) 및 Aip_FAR 또는 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체, 및 Hs_FAR (서열 번호: 71), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은Hs_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 데사투라제, 예컨대, 2개의 동일한 데사투라제, 예를 들어, 2개의 Cpo_CPRQ 데사투라제 또는 2개의 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, 2개의 S85A 돌연변이체이고, FAR은 Hs_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 상이한 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ 데사투라제, 및 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은Hs_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 효모 세포는 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77) 및 Hs_FAR 또는 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다.
구체적인 실시양태에서, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체, 및 Has_FAR (서열 번호: 73), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은Hs_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 데사투라제, 예컨대, 2개의 동일한 데사투라제, 예를 들어, 2개의 Cpo_CPRQ 데사투라제 또는 2개의 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, 2개의 S85A 돌연변이체이고, FAR은 Hs_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 상이한 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ 데사투라제, 및 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은Hs_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 효모 세포는 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77) 및 Has_FAR 또는 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다.
구체적인 실시양태에서, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체, 및 Hv_FAR (서열 번호: 75), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은Hv_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 데사투라제, 예컨대, 2개의 동일한 데사투라제, 예를 들어, 2개의 Cpo_CPRQ 데사투라제 또는 2개의 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, 2개의 S85A 돌연변이체이고, FAR은 Hv_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 상이한 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ 데사투라제, 및 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은Hv_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 효모 세포는 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77) 및 Hv_FAR 또는 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다.
구체적인 실시양태에서, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체, 및 Cpo_FAR (서열 번호: 76), 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은Cpo_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 데사투라제, 예컨대, 2개의 동일한 데사투라제, 예를 들어, 2개의 Cpo_CPRQ 데사투라제 또는 2개의 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, 2개의 S85A 돌연변이체이고, FAR은 Cpo_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 데사투라제는 2개의 상이한 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ 데사투라제, 및 85번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cpo_CPRQ 데사투라제, 예를 들어, S85A 돌연변이체이고, FAR은 Cpo_FAR 또는 이의 기능성 변이체이다. 다른 실시양태에서, 효모 세포는 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77) 및 Cpo_FAR 또는 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현한다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 상기 기술된 바와 같은 데사투라제, 예컨대, Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체, 본원 상기에서 기술된 바와 같은 FAR, 특히, Ase_FAR, Aip_FAR, Hs_AR, Has_FAR 또는 Hv_FAR, 또는 이의 돌연변이체, 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현하고, 이는 또한 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제, 예컨대, Cpo_NPVE (서열 번호: 67), 또는 Cpo_SPTQ (서열 번호: 69), 이의 돌연변이체, 또는 서열 번호: 67 또는 서열 번호: 69와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 67 또는 서열 번호: 69와 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현한다.
일부 실시양태에서, FAR은 Har_FAR (헬리코베르파 아르미게라로부터의 FAR, 서열 번호: 12)이 아니다. 일부 실시양태에서, FAR은 Ta_FAR (티토 알바(Tyto alba)로부터의 FAR, 서열 번호: 8)이 아니다.
따라서, 효모 세포는 탄소 쇄 길이가 12인 상기 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탄소 쇄 길이가 12이고, 하나 이상의 이중 결합을 갖는 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 데사투라제, 예컨대, 본원 상기에 기술된 데사투라제 중 임의의 것, 또는 지방 아실-CoA를 탄소 쇄 길이가 12인 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, 이의 기능성 변이체를 발현할 수 있다. 효모 세포는 추가로 상기 기술된 바와 같이, 탄소 쇄 길이가 >12, 예컨대, 탄소 쇄 길이가 14 이상인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 데사투라제, 또는 탄소 쇄 길이가 >12, 예컨대, 탄소 쇄 길이가 14 이상인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 능력을 보유하는, 이의 기능성 변이체를 발현할 수 있다. 이들 효모 세포 중 임의의 것은 본원 상기에서 기술된 바와 같은 리덕타제, 또는 리덕타제 활성을 보유하는 이의 기능성 변이체를 추가로 발현할 수 있다.
리덕타제 또는 이의 기능성 변이체가 원하는 활성을 갖는지 여부를 시험하기 위해, 당업계에 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험하고자하는 후보 효소를 효모 세포에, 예컨대, 벡터 상에, 또는 효모 세포의 게놈에 도입하고, 적절한 배지 중에서 효모 세포를 인큐베이션시키고, 브로쓰로부터 지방 알콜을 추출하고, 예컨대, 탈포화된 지방 알콜이 제조되는지 여부를 측정하는 GC-MS 분석과 같은 분석을 수행할 수 있다. 천연 엘롱가제 유전자(들)가 결핍된 효모 세포에서 활성을 시험하는 것이 유리할 수 있다. 상기 방법의 예는 실시예 4에, 또는 문헌 [Schneiter et al., 2000]에 기술되어 있다.
전구체 이용가능성 증가
E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올 및 이의 유도체 제조를 개선시키기 위해, 특히, E8,E10-C12:CoA의 필요한 전구체의 이용가능성을 증가시키기 위하여 효모 세포에 추가 변형을 도입하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 효모 세포는 특히 하기에 상세히 설명된 임의의 변형으로 추가 변형될 수 있다:
- 이종성 시토크롬 b5의 발현
- 이종성 시토크롬 b5 리덕타제의 발현
- 헤모글로빈의 발현
- 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 엘롱가제(들)(elongase(s))의 불활성화
- 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 티오에스테라제(들)의 불활성화
- 천연 지방 알데히드 데히드로게나제(들), 지방 알콜 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 신타제(들)의 활성 불활성화 또는 변형
- 이종성 티오에스테라제 유전자의 발현
- 지방 아실 신타제 및 티오에스테라제의 융합 단백질의 발현.
효소, 예를 들어, 엘롱가제, 티오에스테라제, 지방 알데히드 데히드로게나제, 지방 알콜 옥시다제, 퍼옥시좀 생물발생 인자 또는 지방 아실 신타제는 예를 들어, 유전자에, 예를 들어, 코딩 서열에 전체 또는 부분적 결실, 삽입, 치환 또는 넌센스 또는 미스센스 돌연변이를 비롯한, 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써, 프로모터, 코작(Kozak) 서열, 종결인자 또는 다른 조절 요소를 도입함으로써 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 천연 프로모터 또는 천연 종결인자는 각각 또 다른, 더 약한 프로모터에 의해 또는 또 다른 종결인자에 의해 대체될 수 있다. 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 다른 불활성화 방법으로는 전사 억제 및 전사 후 불활성화, 예를 들어, 관련 전사체의 분해를 초래하는 RNAi 시스템 또는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 침묵화하여 번역을 억제 또는 적어도 감소시키는 것 뿐만 아니라, 번역 후 불활성화, 예컨대, 단백질 억제를 포함한다. 효소 활성은 예컨대, 효소 특성, 예컨대, 세포내 국재화를 변형시키기 위해, 또는 활성을 증가시키기 위해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다르게 변형될 수 있다.
엘롱가제 활성은 예를 들어, 문헌 [Schneiter et al., 2000]에 기술된 바와 같이, 지방산 프로파일을 분석함으로써 시험될 수 있다.
티오에스테라제 활성은 예컨대, 문헌 [Nancolas et al., 2017]에 기술된 티오에스테라제 활성 검정법과 같은 적절한 검정법에 의해 시험될 수 있다.
지방 알데히드 데히드로게나제 활성은 예컨대, 문헌 [Iwama et al., 2014]에 기술된 지방 알데히드 분해 검정법과 같은 적절한 검정법에 의해 시험될 수 있다.
지방 알콜 옥시다제 활성은 예컨대, 문헌 [Iwama et al., 2014]에 기술된 지방 알데히드 분해 검정법과 같은 적절한 검정법에 의해 시험될 수 있다.
퍼옥시좀 생물발생 인자 활성은 유일한 탄소원으로서 지방산을 포함하는 배지에서 후보 지방 알콜 옥시다제를 발현하는 효모 세포의 성장 검정법과 같은 적절한 검정법에 의해 시험될 수 있다.
지방 아실 신타제 활성은 지방 아실 신타제가 필수 유전자인 바, 세포 성장을 시험함으로써 시험될 수 있다.
상기 변형 중 임의의 것이 조합될 수 있고, 즉, 효모 세포는 상기 변형 중 수개를 포함할 수 있다.
이종성 시토크롬 b5의 발현
본 발명자들이 코들레몬 및 이의 유도체의 제조에 유리한 것으로 밝혀진 한 변형은 효모 세포에서 이종성 시토크롬 b5의 발현이다. 상기 막 결합 헴단백질(hemoprotein)은 여러 막 결합 옥시게나제에 대한 전자 운반체로서 작용한다. 실시예 (특히, 실시예 6)에 제시된 바와 같이, 이종성 시토크롬 b5의 발현은 지방산 메틸 에스테르, 특히, E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12: Me의 이용가능성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 변형은 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A, 및 임의로, 탄소 쇄 길이가 12인 탈포화된 지방 알콜, 예컨대, 코들레몬의 제조를 증가시키는 것으로 예상된다.
일부 실시양태에서, 시토크롬 b5는 레피도프테라 종에 고유한 시토크롬 b5이다. 특정 실시양태에서, 시토크롬 b5는 헬리코베르파 종으로부터의 시토크롬 b5, 바람직하게, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5, 예컨대, 서열 번호: 4에 기재되어 있는 것, 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다.
시토크롬 b5는 높은 수준으로 발현될 수 있다.
시토크롬 b5는 시토크롬 b5를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 동족체를 효모 세포에 도입함으로써 발현될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호: 3에 기재된 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 3과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체가 도입된다.
시토크롬 b5의 기능성 변이체가 원하는 활성을 보유하는지 여부를 시험하기 위해, 당업계에 공지된 방법; 예를 들어, 문헌 [Lamb et al., 1999]에 기술된 바와 같은 분광광도 검정법이 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 상기 기술된 바와 같은 데사투라제 및 지방 아실-CoA 리덕타제를 발현하고, 이는 추가로 본원에 기술된 바와 같은 이종성 시토크롬 b5를 발현한다. 특히, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S82 돌연변이체 또는 S85 돌연변이체, 바람직하게, S85 돌연변이체, 예컨대, S85A 돌연변이체, 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 데사투라제, 및 Ase_FAR (서열 번호: 10), 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, T198 돌연변이체 또는 S413 돌연변이체, 바람직하게, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체, Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호: 12) 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 리덕타제, 및 본원 상기에서 기술된 바와 같은 시토크롬 b5, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5 (서열 번호: 4) 또는 이의 기능성 변이체를 발현할 수 있다. 효모 세포는 Cpo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체 이외에도 또한 상기 기술된 바와 같은 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제, 예를 들어, Cpo_NPVE, Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현할 수 있다.
효모 세포는 특히, 이종성 시토크롬 b5 리덕타제의 발현, 헤모글로빈의 발현, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 엘롱가제 유전자(들)의 돌연변이, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 티오에스테라제 유전자(들)의 돌연변이, 지방 알데히드 데히드로게나제(들), 지방 알콜 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 신타제(들)를 인코딩하는 천연 유전자(들)의 돌연변이, 이종성 티오에스테라제 유전자의 발현, 및/또는 지방 아실 신타제 및 티오에스테라제의 융합 단백질의 발현에 의해 본원에 기술된 변형 중 임의의 것으로 추가로 변형될 수 있다.
이종성 시토크롬 b5 리덕타제 (EC 1.6.2.2)의 발현
E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, 코들레몬 및 이의 유도체의 제조를 증가시킬 수 있는 또 다른 변형은 이종성 시토크롬 b5 리덕타제 (EC 1.6.2.2)의 발현이다.
메트헤모글로빈 리덕타제으로도 또한 공지되어 있는 시토크롬 b5 리덕타제는 메트헤모글로빈을 헤모글로빈으로 전환시키는 NADH 의존성 효소이다:
NADH + H+ + 2 페리시토크롬 b5 = NAD+ + 2 페로시토크롬 b5
일부 실시양태에서, 시토크롬 b5 리덕타제는
레피도프테라 종에 고유한 시토크롬 b5 리덕타제이다. 특정 실시양태에서, 시토크롬 b5 리덕타제는 헬리코베르파 종으로부터의 시토크롬 b5 리덕타제, 바람직하게, 헬리코베르파 종, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5 리덕타제, 예를 들어, 서열 번호: 24에 기재되어 있는 시토크롬 b5 리덕타제, 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다.
시토크롬 b5 리덕타제의 기능성 변이체가 원하는 활성을 보유하는지 여부를 시험하기 위해, 당업계에 공지된 방법; 예를 들어, 문헌 [Lamb et al., 1999]에 기술된 바와 같은 분광광도 검정법이 사용될 수 있다.
시토크롬 b5 리덕타제는 높은 수준으로 발현될 수 있다.
시토크롬 b5 리덕타제는 상기 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 동족체를 효모 세포에 도입함으로써 발현될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호: 23에 기재된 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 23과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체가 도입된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 상기 기술된 바와 같은 데사투라제 및 지방 아실-CoA 리덕타제를 발현하고, 이는 추가로 본원에 기술된 바와 같은 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 발현한다. 효모 세포는 본원에 기술된 변형 중 임의의 것으로 추가로 변형될 수 있다. 특히, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), Gmo_CPRQ (서열 번호: 77), 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S82 돌연변이체 또는 S85 돌연변이체, 바람직하게, S85 돌연변이체, 예컨대, S85A 돌연변이체, 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 데사투라제, 및 Ase_FAR (서열 번호: 10), 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, T198 돌연변이체 또는 S413 돌연변이체, 바람직하게, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체, Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호: 12) 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 리덕타제, 및 본원 상기에서 기술된 바와 같은 시토크롬 b5 리덕타제, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5 리덕타제 (서열 번호: 25) 또는 이의 기능성 변이체를 발현할 수 있다. 효모 세포는 Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체 이외에도 또한 상기 기술된 바와 같은 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제, 예를 들어, Cpo_NPVE, Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현할 수 있다. 효모 세포는 추가로 본원 상기에서 기술된 바와 같은 시토크롬 b5를 발현할 수 있다.
효모 세포는 특히, 이종성 시토크롬 b5의 발현, 헤모글로빈의 발현, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 엘롱가제 유전자(들)의 돌연변이, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 티오에스테라제 유전자(들)의 돌연변이, 지방 알데히드 데히드로게나제(들), 지방 알콜 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 신타제(들)를 코딩하는 천연 유전자(들)의 돌연변이, 이종성 티오에스테라제 유전자의 발현, 및/또는 지방 아실 신타제 및 티오에스테라제의 융합 단백질의 발현에 의해 본원에 기술된 변형 중 임의의 것으로 추가로 변형될 수 있다.
헤모글로빈의 발현
E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, 코들레몬 및 이의 유도체의 제조에 유리할 수 있는 또 다른 변형은 효모 세포에서 헤모글로빈, 특히, 이종성 헤모글로빈의 발현이다.
실시예, 특히, 실시예 6에 제시된 바와 같이, 데사투라제를 발현하는 효모 세포에서의 헤모글로빈의 발현은 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me의 제조를 증가시켰다.
일부 실시양태에서, 헤모글로빈은 비트레오스킬라(Vitreoscilla) 종, 예컨대, 비트레오스킬라 스테르코라리아(Vitreoscilla stercoraria)에 고유한 헤모글로빈이다. 특정 실시양태에서, 헤모글로빈은 서열 번호: 6에 기재되어 있는 것, 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다.
헤모글로빈의 기능성 변이체가 원하는 활성을 보유하는지 여부를 시험하기 위해, 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 적절한 검정법, 예컨대, 비색 검정법이 수행될될 수 있다.
헤모글로빈이 높은 수준으로 발현될 수 있다.
헤모글로빈은 상기 헤모글로빈을 인코딩하는 핵산, 또는 이의 동족체를 효모 세포에 도입함으로써 발현될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호: 5에 기재된 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 5와 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체가 도입된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 상기 기술된 바와 같은 데사투라제 및 지방 아실-CoA 리덕타제를 발현하고, 이는 추가로 본원에 기술된 바와 같은 헤모글로빈을 발현한다. 특히, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), Gmo_CPRQ (서열 번호: 77), 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S82 돌연변이체 또는 S85 돌연변이체, 바람직하게, S85 돌연변이체, 예컨대, S85A 돌연변이체, 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 데사투라제, 및 Ase_FAR (서열 번호: 10), 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, T198 돌연변이체 또는 S413 돌연변이체, 바람직하게, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체, Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호: 12) 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 리덕타제, 및 본원 상기에서 기술된 바와 같은 헤모글로빈, 예컨대, 비트레오스킬라 스테르코라리아로부터의 헤모글로빈 (서열 번호: 6) 또는 이의 기능성 변이체를 발현할 수 있다. 효모 세포는 Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체 이외에도 또한 상기 기술된 바와 같은 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제, 예를 들어, Cpo_NPVE, Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현할 수 있다.
효모 세포는 특히, 이종성 시토크롬 b5의 발현, 이종성 시토크롬 b5 리덕타제의 발현, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 엘롱가제 유전자(들)의 돌연변이, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 티오에스테라제 유전자(들)의 돌연변이, 지방 알데히드 데히드로게나제(들), 지방 알콜 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 신타제(들)를 인코딩하는 천연 유전자(들)의 돌연변이, 이종성 티오에스테라제 유전자의 발현, 및/또는 지방 아실 신타제 및 티오에스테라제의 융합 단백질의 발현에 의해 본원에 기술된 변형 중 임의의 것으로 추가로 변형될 수 있다.
엘롱가제 유전자(들)의 돌연변이
E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, 코들레몬 및 이의 유도체의 제조에 유리할 수 있는 또 다른 변형은 돌연변이가 상응하는 엘롱가제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 것인, 효모 세포에서의 특정 유전자의 돌연변이, 특히, 하나 이상의 엘롱가제 유전자의 돌연변이이다. 엘롱가제는 지방산을 비롯한, 여러 분자의 탄소 쇄 연장을 촉매화한다. 일부 실시양태에서, 엘롱가제는 중간 쇄 아실 엘롱가제이다. 자연적으로 엘롱가제를 코딩하는 여러 유전자를 포함하는 효모 세포가 사용되는 경우, 효모 세포는 하나 이상의 엘롱가제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 상기 유전자 중 하나 이상의 것에 돌연변이를 포함하도록 추가로 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 야로위아 리폴리티카 세포이고, 엘롱가제는 ELO1 유전자 (서열 번호: 13)에 의해 인코딩된 것이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이는 상응하는 엘롱가제의 활성의 전체적인 손실을 초래하는 결실이다. 다른 실시양태에서, 엘롱가제는 예를 들어, 유전자에, 예를 들어, 코딩 서열에 전체 또는 부분적 결실, 삽입, 치환 또는 넌센스 또는 미스센스 돌연변이를 비롯한, 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써, 프로모터, 코작 서열, 종결인자 또는 다른 조절 요소를 도입함으로써 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 천연 프로모터 또는 천연 종결인자는 각각 또 다른, 더 약한 프로모터에 의해 또는 또 다른 종결인자에 의해 대체될 수 있다. 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 다른 불활성화 방법으로는 전사 억제 및 전사 후 불활성화, 예를 들어, 관련 전사체의 분해를 초래하는 RNAi 시스템 또는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 침묵화하여 번역을 억제 또는 적어도 감소시키는 것 뿐만 아니라, 번역 후 불활성화, 예컨대, 단백질 억제를 포함한다. 단백질이 엘롱가제 활성을 보유하는지 여부를 시험하는 방법의 예는 실시예 4, 또는 문헌 [Schneiter et al., 2000]에 기술되어 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 상기 기술된 바와 같은 데사투라제 및 지방 아실-CoA 리덕타제를 발현하고, 이는 추가로 본원에 기술된 바와 같이, 돌연변이가 부분적 또는 전체 기능 상실을 초래하는 것인, 엘롱가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특히, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S82 돌연변이체 또는 S85 돌연변이체, 바람직하게, S85 돌연변이체, 예컨대, S85A 돌연변이체, 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 데사투라제, 및 Ase_FAR (서열 번호: 10), 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, T198 돌연변이체 또는 S413 돌연변이체, 바람직하게, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체, Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호: 12) 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 리덕타제를 발현할 수 있고, 본원 상기에서 기술된 바와 같이 엘롱가제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 효모 세포는 Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체 이외에도 또한 상기 기술된 바와 같은 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제, 예를 들어, Cpo_NPVE, Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현할 수 있다.
효모 세포는 특히, 이종성 시토크롬의 발현, 이종성 시토크롬 b5 리덕타제의 발현, 헤모글로빈의 발현, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 티오에스테라제 유전자(들)의 돌연변이, 지방 알데히드 데히드로게나제(들), 지방 알콜 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 신타제(들)를 인코딩하는 천연 유전자(들)의 돌연변이, 이종성 티오에스테라제 유전자의 발현, 및/또는 지방 아실 신타제 및 티오에스테라제의 융합 단백질의 발현에 의해 본원에 기술된 변형 중 임의의 것으로 추가로 변형될 수 있다.
티오에스테라제 유전자(들)의 돌연변이
E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, 코들레몬 및 이의 유도체의 제조에 유리할 수 있는 또 다른 변형은 돌연변이가 상응하는 티오에스테라제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 것인, 효모 세포에서의 특정 유전자의 돌연변이, 특히, 하나 이상의 티오에스테라제 유전자의 돌연변이이다. 자연적으로 티오에스테라제를 인코딩하는 여러 유전자를 포함하는 효모 세포가 사용되는 경우, 효모 세포는 하나 이상의 티오에스테라제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 상기 유전자 중 하나 이상의 것에 돌연변이를 포함하도록 추가로 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 야로위아 리폴리티카 세포이고, 티오에스테라제는 YAL10 _ F14729g 유전자 (서열 번호: 19), YALI0 _ E18876g (서열 번호: 54), 또는 YALI0 _ D03597g (서열 번호: 55)에 의해 코딩된 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 야로위아 리폴리티카 세포는 상응하는 티오에스테라제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는, YAL10 _ F14729g 유전자 (서열 번호: 19)의 돌연변이, 예컨대, 결실을 포함한다. 다른 실시양태에서, 야로위아 리폴리티카 세포는 상응하는 티오에스테라제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는, YALI0_E18876g 유전자 (서열 번호: 54)의 돌연변이, 예컨대, 결실을 포함한다. 다른 실시양태에서, 야로위아 리폴리티카 세포는 티오에스테라제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는, YALI0 _ D03597g (서열 번호: 55)의 돌연변이, 예컨대, 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 야로위아 리폴리티카 세포는 여러 티오에스테라제 유전자에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 세포는 YAL10 _ F14729g (서열 번호: 19)의 및 YALI0 _ E18876g (서열 번호: 54)의 돌연변이, 예컨대, 결실; 또는 YAL10 _ F14729g (서열 번호: 19)의 및 YALI0 _ D03597g (서열 번호: 55)의 돌연변이, 예컨대, 결실; 또는 YALI0_E18876g (서열 번호: 54)의 및 YALI0 _ D03597g (서열 번호: 55)의 돌연변이, 예컨대, 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 YAL10 _ F14729g (서열 번호: 19), YALI0_E18876g (서열 번호: 54) 및 YALI0 _ D03597g (서열 번호: 55)의 돌연변이, 예컨대, 결실을 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 상기 기술된 바와 같은 데사투라제 및 지방 아실-CoA 리덕타제를 발현하고, 이는 추가로 본원에 기술된 바와 같이, 돌연변이가 부분적 또는 전체 기능 상실을 초래하는 것인, 티오에스테라제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특히, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), Gmo_CPRQ (서열 번호: 77) 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S82 돌연변이체 또는 S85 돌연변이체, 바람직하게, S85 돌연변이체, 예컨대, S85A 돌연변이체, 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 데사투라제, 및 Ase_FAR (서열 번호: 10), 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, T198 돌연변이체 또는 S413 돌연변이체, 바람직하게, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체, Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호: 12) 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 리덕타제, 및 본원 상기에서 기술된 바와 같이, 부분적 또는 전체 기능 상실을 초래하는 것인, 티오에스테라제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, YAL10 _ F14729g (서열 번호: 19), YALI0 _ E18876g (서열 번호: 54) 및 YALI0 _ D03597g (서열 번호: 55) 중 하나 이상의 것의 돌연변이를 발현할 수 있다. 효모 세포는 Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체 이외에도 또한 상기 기술된 바와 같은 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제, 예를 들어, Cpo_NPVE, Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현할 수 있다.
효모 세포는 특히, 이종성 시토크롬 b5의 발현, 이종성 시토크롬 b5 리덕타제의 발현, 헤모글로빈의 발현, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 엘롱가제 유전자(들)의 돌연변이, 지방 알데히드 데히드로게나제(들), 지방 알콜 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 신타제(들)를 인코딩하는 천연 유전자(들)의 돌연변이, 이종성 티오에스테라제 유전자의 발현, 및/또는 지방 아실 신타제 및 티오에스테라제의 융합 단백질의 발현에 의해 본원에 기술된 변형 중 임의의 것으로 추가로 변형될 수 있다.
추가 변형
효모 세포는 다른 변형, 예컨대, 지방산 대사에 관여하는 효소의 활성을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 지방 알데히드 데히드로게나제(들), 지방 알콜 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 신타제(들)의 활성은 변형되고, 바람직하게, 활성은 감소 또는 제거된다. 예를 들어, 효모 세포는 지방 알데히드 데히드로게나제, 지방 알콜 옥시다제, 및/또는 퍼옥시좀 생물발생 인자를 인코딩하는 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 상기 효소 중 임의의 것은 예를 들어, 유전자에, 예를 들어, 코딩 서열에 전체 또는 부분적 결실, 삽입, 치환 또는 넌센스 또는 미스센스 돌연변이를 비롯한, 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써, 프로모터, 코작 서열, 종결인자 또는 다른 조절 요소를 도입함으로써 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 천연 프로모터 또는 천연 종결인자는 각각 또 다른, 더 약한 프로모터에 의해 또는 또 다른 종결인자에 의해 대체될 수 있다. 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 다른 불활성화 방법으로는 전사 억제 및 전사 후 불활성화, 예를 들어, 관련 전사체의 분해를 초래하는 RNAi 시스템 또는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 침묵화하여 번역을 억제 또는 적어도 감소시키는 것 뿐만 아니라, 번역 후 불활성화, 예컨대, 단백질 억제를 포함한다. 효소 활성은 예컨대, 효소 특성, 예컨대, 세포내 국재화를 변형시키기 위해, 또는 활성을 증가시키기 위해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다르게 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 HFD1 , HFD2 , HFD3 , HFD4 , FAO1 , GPAT PEX10 중 적어도 하나의 변형, 예컨대, 돌연변이, 또는 적어도 하나의 단백질과 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 75%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 81%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 82%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 83%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 84%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 85%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 86%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 87%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 88%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 89%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 90%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 91%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 92%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 93%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 94%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 95%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 96%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 97%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 98%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 상기 적어도 하나의 단백질의 활성을 감소시키는 변형, 예컨대, 돌연변이를 추가로 포함하는, 본원 상기에서 기술된 바와 같은 야로위아 리폴리티카 세포이다.
야로위아 리폴리티카에서, 지방 알데히드 데히드로게나제 Hfd1은 HFD1 (YALI0_F23793g)에 의해 인코딩된다. 이는 지방 알데히드의 지방산으로의 산화를 촉매화한다. 출원 WO 2018/109163에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, Hfd1의 활성 감소는 효모 세포에서 탈포화된 지방 알콜의 역가를 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 세포는 HFD1의 돌연변이, 예컨대, 결실을 추가로 포함할 수 있고, 이는 Hfd1의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래할 수 있다. Hfd1의 활성 감소는 본원에 기술된 바와 같은 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
지방 알데히드 데히드로게나제 Hfd2는 HFD2 (YALI_0E15400g)에 의해 인코딩된다. 이는 지방 알데히드의 지방산으로의 산화를 촉매화한다. 따라서, 본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 세포는 HFD2의 돌연변이, 예컨대, 결실을 추가로 포함할 수 있고, 이는 Hfd2의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래할 수 있다. Hfd2의 활성 감소는 본원에 기술된 바와 같은 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
지방 알데히드 데히드로게나제 Hfd3은 HFD3 (YALI0_A17875g)에 의해 코딩된다. 이는 지방 알데히드의 지방산으로의 산화를 촉매화한다. 따라서, 본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 세포는 HFD3의 돌연변이, 예컨대, 결실을 추가로 포함할 수 있고, 이는 Hfd3의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래할 수 있다. Hfd3의 활성 감소는 본원에 기술된 바와 같은 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
야로위아 리폴리티카에서, 지방 알데히드 데히드로게나제 Hfd4는 HFD4 (YALI0_B01298g)에 의해 코딩된다. 이는 지방 알데히드의 지방산으로의 산화를 촉매화한다. 출원 WO 2018/109163에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, Hfd4의 활성 감소는 효모 세포에서 탈포화된 지방 알콜의 역가를 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 세포는 HFD4의 돌연변이, 예컨대, 결실을 추가로 포함할 수 있고, 이는 Hfd4의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래할 수 있다. Hfd4의 활성 감소는 본원에 기술된 바와 같은 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 지방 알데히드 데히드로게나제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는, Hfd1, Hfd2, Hfd3 또는 Hfd4와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, Hfd1, Hfd2, Hfd3 또는 Hfd4와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 75%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 81%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 82%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 83%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 84%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 85%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 86%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 87%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 88%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 89%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 90%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 91%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 92%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 93%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 94%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 95%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 96%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 97%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 98%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 변형, 예를 들어, 돌연변이, 예컨대, 결실을 추가로 포함한다.
야로위아 리폴리티카에서, 지방 알콜 옥시다제 Fao1은 FAO1 (YALI0B14014g)에 의해 인코딩된다. 이의 결실은 ω-히드록시 지방산의 축적을 증가시킨다. 출원 WO 2018/109163에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, Fao1의 활성 감소는 효모 세포에서 탈포화된 지방 알콜의 역가를 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 세포는 FAO1의 돌연변이, 예컨대, 결실을 추가로 포함할 수 있고, 이는 Fao1의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래할 수 있다. Fao1의 활성 감소는 본원에 기술된 바와 같은 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 지방 알콜 옥시다제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는, Fao1과 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, Fao1과 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 75%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 81%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 82%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 83%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 84%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 85%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 86%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 87%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 88%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 89%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 90%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 91%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 92%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 93%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 94%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 95%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 96%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 97%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 98%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성의 상동성 또는 동일성을 갖는, 변형, 예를 들어, 돌연변이, 예컨대, 결실을 추가로 포함한다.
야로위아 리폴리티카에서, 퍼옥시좀 생물발생 인자 10 Pex10은 PEX10 (YALI0C01023g)에 의해 코딩된다. 출원 WO 2018/109163에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, Pex10의 활성 감소는 효모 세포에서 탈포화된 지방 알콜의 역가를 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 세포는 PEX10의 돌연변이, 예컨대, 결실을 추가로 포함할 수 있고, 이는 Pex10의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래할 수 있다. Pex10의 활성 감소는 본원에 기술된 바와 같은 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 퍼옥시좀 생물발생 인자의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는, Pex10과 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, Pex10과 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, Pex10과 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 75%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 81%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 82%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 83%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 84%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 85%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 86%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 87%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 88%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 89%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 90%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 91%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 92%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 93%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 94%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 95%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 96%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 97%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 98%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성의 상동성 또는 동일성을 갖는, 변형, 예를 들어, 돌연변이, 예컨대, 결실을 추가로 포함한다.
야로위아 리폴리티카에서, 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제는 GPAT (YALI0_C00209g)에 의해 인코딩된다. GPAT는 글리세로지질 생합성으로의 제1 반응을 촉매화한다. 유전자는 야로위아 리폴리티카에서 필수적인 것이다. 출원 WO 2018/109163에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, GPAT의 활성 감소는 효모 세포에서 탈포화된 지방 알콜의 역가를 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 세포는 GPAT의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있고, 이는 GPAT의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래할 수 있다. GPAT의 활성 감소는 본원에 기술된 바와 같은 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는, GPAT와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, GPAT와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 75%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 81%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 82%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 83%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 84%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 85%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 86%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 87%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 88%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 89%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 90%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 91%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 92%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 93%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 94%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 95%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 96%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 97%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 98%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 변형, 예를 들어, 돌연변이를 추가로 포함한다.
상기 효소 중 임의의 것의 활성의 부분적 또는 전체적인 손실은 또한 예를 들어, 예를 들어, 유전자에, 예를 들어, 코딩 서열에 전체 또는 부분적 결실, 삽입, 치환 또는 넌센스 또는 미스센스 돌연변이를 비롯한, 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써, 프로모터, 코작 서열, 종결인자 또는 다른 조절 요소를 도입함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 천연 프로모터 또는 천연 종결인자는 각각 또 다른, 더 약한 프로모터에 의해 또는 또 다른 종결인자에 의해 대체될 수 있다. 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 다른 불활성화 방법으로는 전사 억제 및 전사 후 불활성화, 예를 들어, 관련 전사체의 분해를 초래하는 RNAi 시스템 또는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 침묵화하여 번역을 억제 또는 적어도 감소시키는 것 뿐만 아니라, 번역 후 불활성화, 예컨대, 단백질 억제를 포함한다. 변형, 예컨대, 돌연변이, 또는 본원 상기 기술된 임의의 변형이 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는지 여부를 시험하기 위해, 예컨대, 본원 상기에 상세하게 설명되어 있는, 당업계에 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 결실 또는 전사를 감소시키는 변형인 경우, 관련 서열의 부재를 확인하기 위해, 예컨대, PCR과 같은 증폭 방법이 사용될 수 있다. 단백질 발현은 예컨대, 웨스턴 블롯과 같은 적절한 검정법을 사용하거나, 또는 예컨대, 형광 마커와 같은 마커를 사용하여 발현 수준을 측정하여 조사할 수 있다.
효모 세포가 하나 이상의 변형된 지방 아실 신타제를 발현하는 것 또한 유리할 수 있다. 이는 탈포화된 생성물, 예컨대, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 탈포화된 지방 알콜 및 이의 유도체, 예컨대, 코들레몬 및 이의 유도체 생산으로의 대사 플럭스를 유도하는 데 도움이 될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 변형된 케톤 신타제 도메인을 갖는 지방 아실 신타제를 발현하도록 추가로 변형된다. 일부 실시양태에서, 효모 세포는 세포가 변형된 지방산 신타제 복합체를 추가로 발현하는 것인, 본원에 기술된 바와 같은 야로위아 리폴리티카 세포이다. 한 실시양태에서, 지방산 신타제 복합체는 상기 복합체의 알파 서브유닛을 인코딩하는 유전자를 돌연변이화함으로써 변형된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 FAS2를 인코딩하는 유전자 (서열 번호: 18) 중에 존재한다. 다른 실시양태에서, 돌연변이는 FAS1을 인코딩하는 유전자 (서열 번호: 16) 중에 존재한다. 돌연변이는 서열 번호: 16의 잔기 123 (L123) 중 하나 이상의 것의 변형을 초래할 수 있다. 돌연변이는 서열 번호: 18의 잔기 1220 (I1220), 잔기 1217 (M1217), 또는 잔기 1226 (M1226) 중 하나 이상의 것의 변형을 초래하여 변이체 FAS2를 생성할 수 있다. 당업자는 상기 돌연변이를 디자인하는 방법을 알 것이다.
바람직하게, FAS2의 돌연변이는 Fas2의 I1220F 변이체, I1220W 변이체, I1220Y 변이체, 또는 I1220H 변이체를 생성한다. 구체적인 실시양태에서, 돌연변이는 I1220F 변이체를 생성한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 M1217F 변이체, M1217W 변이체, M1217Y 변이체, 또는 M1217H 변이체를 생성한다. 다른 실시양태에서, 돌연변이는 M1226F 변이체, M1226W 변이체, M1226Y 변이체, 또는 M1226H 변이체를 생성한다.
바람직하게, FAS1의 돌연변이는 L123V 변이체를 생성한다.
상기 돌연변이 중 1 초과의 돌연변이를 갖는 효모 세포, 예컨대, FAS2의 잔기 I1220, M1217 또는 M1226에 2개의 돌연변이 또는 3개의 돌연변이, 및/또는 FAS1의 잔기 123에 한 돌연변이를 갖는 효모 세포 또한 고려된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 상기 기술된 바와 같은 데사투라제 및 지방 아실-CoA 리덕타제를 발현하고, 이는 추가로 본 섹션에서 기술된 바와 같은 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), Gmo_CPRQ (서열 번호: 77), 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S82 돌연변이체 또는 S85 돌연변이체, 바람직하게, S85 돌연변이체, 예컨대, S85A 돌연변이체, 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 데사투라제, 및 Ase_FAR (서열 번호: 10), 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, T198 돌연변이체 또는 S413 돌연변이체, 바람직하게, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체, Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호: 12) 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 리덕타제, 및 하나 이상의 변형, 예컨대, 상기 기술된 바와 같이, Hfd1, Hfd2, Hfd3, Hfd4, Fao1 및 Pex10 중 하나 이상의 것의 부분적 또는 전체 기능 상실을 초래하는 돌연변이를 발현할 수 있고/거나, 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 변형된 지방 아실 신타제를 추가로 발현한다. 효모 세포는 Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체 이외에도 또한 상기 기술된 바와 같은 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제, 예를 들어, Cpo_NPVE, Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현할 수 있다.
효모 세포는 특히, 이종성 시토크롬 b5의 발현, 이종성 시토크롬 b5 리덕타제의 발현, 헤모글로빈의 발현, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 엘롱가제 유전자(들)의 불활성화, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 티오에스테라제(들)의 불활성화, 이종성 티오에스테라제 유전자의 발현, 및/또는 지방 아실 신타제 및 티오에스테라제의 융합 단백질의 발현에 의해 본원에 기술된 변형 중 임의의 것으로 추가로 변형될 수 있다.
특히, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), Gmo_CPRQ (서열 번호: 77) 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S82 돌연변이체 또는 S85 돌연변이체, 바람직하게, S85 돌연변이체, 예컨대, S85A 돌연변이체, 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 데사투라제, 및 Ase_FAR (서열 번호: 10), 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, T198 돌연변이체 또는 S413 돌연변이체, 바람직하게, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체, Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호: 12) 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 리덕타제를 발현할 수 있고, 이는 HFD1 및 HFD2; HFD1 및 HFD3; HFD1 및 HFD4; HFD1 및 FAO1; HFD1 및 PEX10; HFD2 및 HFD3; HFD2 및 HFD4; HFD2 및 FAO1; HFD2 및 PEX10; HFD3 및 HFD4; HFD3 및 FAO1; HFD3 및 PEX10; HFD4 및 FAO1; HFD4 및 PEX10; FAO1 및 PEX10; HFD1, HFD2 및 HFD3; HFD1, HFD2 및 HFD4; HFD1, HFD2 및 FAO1; HFD1, HFD2 및 PEX10; HFD1, HFD3 및 HFD4; HFD1, HFD3 및 FAO1; HFD1, HFD3 및 PEX10; HFD1, HFD4 및 FAO1; HFD1, HFD4 및 PEX10; HFD1, FAO1 및 PEX10; HFD2, HFD3 및 HFD4; HFD2, HFD3 및 FAO1; HFD2, HFD3 및 PEX10; HFD2, HFD4 및 FAO1; HFD2, HFD4 및 PEX10; HFD2, FAO1 및 PEX10; HFD3, HFD4 및 FAO1; HFD3, HFD4 및 PEX10; HFD3, FAO1 및 PEX10; HFD4, FAO1 및 PEX10; HFD1, HFD2, HFD3 및 HFD4; HFD1, HFD2, HFD3 및 FAO1; HFD1, HFD2, HFD3 및 PEX10; HFD1, HFD2, HFD4 및 FAO1; HFD1, HFD2, HFD4 및 PEX10; HFD1, HFD2, FAO1 및 PEX10; HFD1, HFD3, HFD4 및 FAO1; HFD1, HFD3, HFD4 및 PEX10; HFD1, HFD3, FAO1 및 PEX10; HFD1, HFD4, FAO1 및 PEX10; HFD2, HFD3, HFD4 및 FAO1; HFD2, HFD3, HFD4 및 PEX10; HFD2, HFD3, FAO1 및 PEX10; HFD2, HFD4, FAO1 및 PEX10; HFD3, HFD4, FAO1 및 PEX10; HFD1, HFD2, HFD3, HFD4 및 FAO1; HFD1, HFD2, HFD3, HFD4 및 PEX10; HFD1, HFD3, HFD4, FAO1 및 PEX10; HFD2, HFD3, HFD4, FAO1 및 PEX10; HFD1, HFD2, HFD3, HFD4, FAO1 및 PEX10의 돌연변이, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는 상응하는 변이체의 상기 언급된 조합을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 효모 세포는 상기 기술된 바와 같은 변형된 지방 아실 신타제, 특히, 돌연변이체 Fas1 및/또는 돌연변이체 Fas2를 추가로 발현할 수 있다. 효모 세포는 Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체 이외에도 또한 상기 기술된 바와 같은 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제, 예를 들어, Cpo_NPVE, Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현할 수 있다.
이종성 티오에스테라제의 발현
티오에스테라제, 특히, 이종성 티오에스테라제를 도입함으로써 효모 세포를 추가로 조작하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 티오에스테라제를 인코딩하는 핵산은 효모 세포에 예컨대, 벡터 상에 또는 게놈 통합에 의해 도입된다. 티오에스테라제 유전자는 유도성 프로모터의 제어하에 있거나, 또는 구성적 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 티오에스테라제를 인코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 바와 같이 효모 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 특히, 핵산은 예컨대, 야로위아 리폴리티카 세포와 같은 야로위아 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 티오에스테라제는 당업계에 공지된 바와 같이 높은 수준으로 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, 티오에스테라제는 쿠페아 팔루스트리스(Cuphea palustris), 쿠페아 후케리아나(Cuphea hookeriana), 신나모멈 캠포라(Cinnamomum camphora)로부터, 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 선택되는 유기체로부터 유래된 것이다. 바람직한 실시양태에서, 티오에스테라제는 에스케리키아 콜라이 또는 신나모멈 캠포라로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 티오에스테라제는 서열 번호: 33에 기재된, 쿠페아 팔루스트리스로부터 유래된 티오에스테라제, 서열 번호: 57에 기재된, 쿠페아 후케리아나로부터 유래된 티오에스테라제, 서열 번호: 35에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터 유래된 티오에스테라제, 및 서열 번호: 26에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 티오에스테라제로부터 선택되는 티오에스테라제와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는다. 바람직하게, 티오에스테라제는 서열 번호: 35에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터 또는 서열 번호: 26에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 티오에스테라제와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 티오에스테라제는 서열 번호: 35에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터 유래된 티오에스테라제와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 티오에스테라제는 서열 번호: 26에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 티오에스테라제와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 티오에스테라제는 서열 번호: 35에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터 유래된 티오에스테라제와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 35에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터 유래된 티오에스테라제와 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 티오에스테라제는 서열 번호: 26에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 티오에스테라제와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 26에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 티오에스테라제와 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
티오에스테라제를 인코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 바와 같이 최적화될 수 있다. 한 실시양태에서, 효모 세포는 야로위아 세포, 바람직하게, 야로위아 리폴리티카 세포이고, 이에 따라 핵산은 코돈 최적화된다.
한 실시양태에서, 적어도 하나의 티오에스테라제는 서열 번호: 34에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터 유래된 티오에스테라제를 인코딩하는 핵산과 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 34에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터 유래된 티오에스테라제를 코딩하는 핵산과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100%의 상동성 또는 동일성을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
한 실시양태에서, 적어도 하나의 티오에스테라제는 서열 번호: 25에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 티오에스테라제를 인코딩하는 핵산과 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 25에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 티오에스테라제를 인코딩하는 핵산과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100%의 상동성 또는 동일성을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 상기 기술된 바와 같은 데사투라제 및 지방 아실-CoA 리덕타제를 발현하고, 이는 추가로 본원에 기술된 바와 같은, 하나 이상의 티오에스테라제, 예컨대, 하나 이상의 이종성 티오에스테라제를 추가로 발현한다. 특히, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), Gmo_CPRQ (서열 번호: 77), 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S82 돌연변이체 또는 S85 돌연변이체, 바람직하게, S85 돌연변이체, 예컨대, S85A 돌연변이체, 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 데사투라제, 및 Ase_FAR (서열 번호: 10), 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, T198 돌연변이체 또는 S413 돌연변이체, 바람직하게, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체, Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호. 4) 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 리덕타제, 및 하나 이상의 이종성 티오에스테라제, 예컨대, 서열 번호: 33, 서열 번호: 57, 서열 번호: 35 및/또는 서열 번호: 26에 기재된 티오에스테라제, 또는 이의 기능성 변이체를 발현할 수 있다. 효모 세포는 Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체 이외에도 또한 상기 기술된 바와 같은 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제, 예를 들어, Cpo_NPVE, Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현할 수 있다.
효모 세포는 본원 상기에서 기술된 바와 같이, 특히, 이종성 시토크롬 b5의 발현, 이종성 시토크롬 b5 리덕타제의 발현, 헤모글로빈의 발현, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 엘롱가제 유전자(들)의 돌연변이, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 티오에스테라제(들)의 돌연변이, 지방 알데히드 데히드로게나제(들), 지방 알콜 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 신타제(들)를 코딩하는 천연 유전자(들)의 돌연변이, 및/또는 지방 아실 신타제 및 티오에스테라제의 융합 단백질의 발현에 의해 본원에 기술된 변형 중 임의의 것으로 추가로 변형될 수 있다.
지방 아실 신타제 티오에스테라제의 융합 단백질의 발현
일부 실시양태에서, 효모 세포는 말단절단된 지방 아실 신타제 및 말단절단된 티오에스테라제의 융합 단백질, 예컨대, 서열 번호: 59에 기재된 융합 단백질, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 추가로 발현한다. 상기 융합 단백질은 Y. 리폴리티카로부터의 Fas1의 말단절단된 버전 및 E. 콜라이(E. coli)로부터의 티오에스테라제 TesA의 말단절단된 버전의 융합물이다. 이는 예컨대, 서열 번호: 58에 기재된 핵산의 도입에 의해 발현될 수 있다. 융합 단백질은 높은 수준으로 발현될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 서열 번호: 59에 기재된 융합 단백질, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 59와 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 추가로 발현한다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 예컨대, 서열 번호: 58에 기재된 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 58과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 상기 기술된 바와 같은 데사투라제 및 지방 아실-CoA 리덕타제를 발현하고, 이는 추가로 말단절단된 지방 아실 신타제 및 말단절단된 티오에스테라제의 융합 단백질, 예컨대, 서열 번호: 59에 기재된 융합 단백질을 추가로 발현한다. 특히, 효모 세포는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, S82 돌연변이체 또는 S85 돌연변이체, 바람직하게, S85 돌연변이체, 예컨대, S85A 돌연변이체, 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 데사투라제, 및 Ase_FAR (서열 번호: 10), 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, T198 돌연변이체 또는 S413 돌연변이체, 바람직하게, T198A 돌연변이체 또는 S413A 돌연변이체, Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호: 12) 및 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 리덕타제, 및 말단절단된 지방 아실 신타제 및 말단절단된 티오에스테라제의 융합 단백질, 예컨대, 서열 번호: 59에 기재된 융합 단백질 또는 이의 기능성 변이체를 발현할 수 있다. 효모 세포는 Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체 이외에도 또한 상기 기술된 바와 같은 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 또 다른 데사투라제, 예를 들어, Cpo_NPVE, Cpo_SPTQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현할 수 있다.
효모 세포는 본원 상기에서 기술된 바와 같이, 특히, 이종성 시토크롬의 발현, 이종성 시토크롬 b5 리덕타제의 발현, 헤모글로빈의 발현, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 엘롱가제 유전자(들)의 돌연변이, 활성의 전체 또는 부분적인 손실을 초래하는 천연 티오에스테라제 유전자(들)의 돌연변이, 지방 알데히드 데히드로게나제(들), 지방 알콜 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 신타제(들)를 코딩하는 천연 유전자(들)의 돌연변이, 및/또는 이종성 티오에스테라제 유전자의 발현에 의해 본원에 기술된 변형 중 임의의 것으로 추가로 변형될 수 있다.
역가
본원에 개시된 효모 세포는 적어도 0.2 mg/L의 역가로 E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, E8,E10-도데카디엔-1-올의 역가는 적어도 0.25 mg/L, 예컨대, 적어도 0.3 mg/L, 예컨대, 적어도 0.4 mg/L, 예컨대, 적어도 0.5 mg/L, 예컨대, 적어도 0.75 mg/L, 예컨대, 적어도 1 mg/L, 예컨대, 적어도 1.5 mg/L, 예컨대, 적어도 2.5 mg/L, 예컨대, 적어도 5.0 mg/L, 예컨대, 적어도 10 mg/L, 예컨대, 적어도 15 mg/L, 예컨대, 적어도 20 mg/L, 예컨대, 25 mg/L, 예컨대, 적어도 50 mg/L, 예컨대, 적어도 100 mg/L, 예컨대, 적어도 250 mg/L, 예컨대, 적어도 500 mg/L, 예컨대, 적어도 750 mg/L, 예컨대, 적어도 1 g/L, 예컨대, 적어도 2 g/L, 예컨대, 적어도 3 g/L, 예컨대, 적어도 4 g/L, 예컨대, 적어도 5 g/L, 예컨대, 적어도 6 g/L, 예컨대, 적어도 7 g/L, 예컨대, 적어도 8 g/L, 예컨대, 적어도 9 g/L, 예컨대, 적어도 10 g/L 이상이다.
역가를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
E8,E10 - 도데카디에닐 아세테이트 생산
코들레몬은 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 추가로 전환될 수 있고; 이는 생체외에서 당업계에 공지된 바와 같이, 예컨대, 화학적 전환에 의해 수행될 수 있거나, 또는 생체내에서 세포에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환시킬 수 있는 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.84)의 작용에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는, 효모 세포가 천연 아세틸트랜스퍼라제를 과다발현하도록 및/또는 임의로, 높은 수준으로 발현되는 이종성 아세틸트랜스퍼라제를 발현하도록 조작된다. 상기 실시양태에서, 효모 세포는 E8,E10-도데카디엔-1-올 및 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 세포에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환시킬 수 있는 아세틸트랜스퍼라제, 예컨대, Sc_Atf1 아세틸트랜스퍼라제 (서열 번호: 37), 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 37과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 발현한다.
아세틸트랜스퍼라제의 발현은 효모 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있는 핵산, 예컨대, 서열 번호: 36에 기재된 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 36과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 도입함으로써 달성될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 본원 상기에서 기술된 바와 같은 이종성 데사투라제, 본원 상기에서 기술된 바와 같은 이종성 지방 아실 리덕타제, 및 임의로, 상기 기술된 추가 변형 중 임의의 것을 발현하고, 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환시킬 수 있는 아세틸트랜스퍼라제 또한 발현한다.
따라서, 본원에 개시된 효모 세포는 적어도 0.2 mg/L의 역가로 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트의 역가는 적어도 0.25 mg/L, 예컨대, 적어도 0.3 mg/L, 예컨대, 적어도 0.4 mg/L, 예컨대, 적어도 0.5 mg/L, 예컨대, 적어도 0.75 mg/L, 예컨대, 적어도 1 mg/L, 예컨대, 적어도 1.5 mg/L, 예컨대, 적어도 2.5 mg/L, 예컨대, 적어도 5.0 mg/L, 예컨대, 적어도 10 mg/L, 예컨대, 적어도 15 mg/L, 예컨대, 적어도 20 mg/L, 예컨대, 25 mg/L, 예컨대, 적어도 50 mg/L, 예컨대, 적어도 100 mg/L, 예컨대, 적어도 250 mg/L, 예컨대, 적어도 500 mg/L, 예컨대, 적어도 750 mg/L, 예컨대, 적어도 1 g/L, 예컨대, 적어도 2 g/L, 예컨대, 적어도 3 g/L, 예컨대, 적어도 4 g/L, 예컨대, 적어도 5 g/L, 예컨대, 적어도 6 g/L, 예컨대, 적어도 7 g/L, 예컨대, 적어도 8 g/L, 예컨대, 적어도 9 g/L, 예컨대, 적어도 10 g/L 이상이다.
역가를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
E8,E10 - 도데카디에날 생산
세포에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 추가로 전환시키는 것 또한 관심의 대상이 될 수 있다. 이는 화학적 변환에 의해, 또는 효모 세포 추가 조작에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는, 효모 세포가 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시킬 수 있도록 추가로 조작될 수 있다. 이는 효모 세포가 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시킬 수 있는 알데히드 형성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.50), 알콜 데히드로게나제 (EC 1.1.1.2) 및/또는 지방 알콜 옥시다제 (EC 1.1.3.20)를 추가 발현하도록 효모 세포를 조작함으로써 수행될 수 있다. 상기 실시양태에서, 효모 세포는 E8,E10-도데카디엔-1-올 및 E8,E10-도데카디에날을 생산할 수 있다.
따라서, E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시킬 수 있는 알데히드 형성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.50), 알콜 데히드로게나제 (EC 1.1.1.2) 및/또는 지방 알콜 옥시다제 (EC 1.1.3.20)를 인코딩하는 핵산이 효모 세포에 도입될 수 있다. 핵산은 코돈 최적화될 수 있고, 높은 수준으로 발현될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 본원 상기에서 기술된 바와 같은 이종성 데사투라제, 본원 상기에서 기술된 바와 같은 이종성 지방 아실 리덕타제, 및 임의로, 상기 기술된 추가 변형 중 임의의 것을 발현하고, E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시킬 수 있는 알데히드 형성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.50), 알콜 데히드로게나제 (EC 1.1.1.2) 및/또는 지방 알콜 옥시다제 (EC 1.1.3.20) 또한 발현한다.
따라서, 본원에 개시된 효모 세포는 적어도 0.2 mg/L의 역가로 E8,E10-도데카디에날를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, E8,E10-도데카디에날의 역가는 적어도 0.25 mg/L, 예컨대, 적어도 0.3 mg/L, 예컨대, 적어도 0.4 mg/L, 예컨대, 적어도 0.5 mg/L, 예컨대, 적어도 0.75 mg/L, 예컨대, 적어도 1 mg/L, 예컨대, 적어도 1.5 mg/L, 예컨대, 적어도 2.5 mg/L, 예컨대, 적어도 5.0 mg/L, 예컨대, 적어도 10 mg/L, 예컨대, 적어도 15 mg/L, 예컨대, 적어도 20 mg/L, 예컨대, 25 mg/L, 예컨대, 적어도 50 mg/L, 예컨대, 적어도 100 mg/L, 예컨대, 적어도 250 mg/L, 예컨대, 적어도 500 mg/L, 예컨대, 적어도 750 mg/L, 예컨대, 적어도 1 g/L, 예컨대, 적어도 2 g/L, 예컨대, 적어도 3 g/L, 예컨대, 적어도 4 g/L, 예컨대, 적어도 5 g/L, 예컨대, 적어도 6 g/L, 예컨대, 적어도 7 g/L, 예컨대, 적어도 8 g/L, 예컨대, 적어도 9 g/L, 예컨대, 적어도 10 g/L 이상이다.
역가를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
쇄 단축
일부 실시양태에서, 효모 세포는 쇄 단축에 의해 주어진 쇄 길이의 지방 아실-CoA의 이용가능성을 증가시키기 위해 추가로 변형된다. 이론에 얽매이지 않고, 상기 변형은 원하는 탄소 쇄 길이를 갖는, 특히, 탄소 쇄 길이가 12인 기질의 이용가능성을 증가시킬 것으로 예상되며, 이를 통해 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올의 생산, 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및 E8,E10-도데카디에날의 생산은 증가될 수 있다. 이는 미생물 생산 세포에서 천연 아실-CoA 옥시다제의 활성을 감소시킴으로써, 및 특정 아실-CoA 옥시다제, 데사투라제, 리덕타제, 및 아세틸트랜스퍼라제를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 변형은 (동일한 출원인에 의해 2019년 2월 19일 출원된) EP 19157910.1에 상세하게 기술되어 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 효모 세포는 본원 상기에 기술된 효모 세포 중 임의의 것이고, 추가로
i) 하나 이상의 천연 아실-CoA 옥시다제의 활성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖고;
ii) 지방 아실-CoA를 산화시킬 수 있는 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제를 포함하는 적어도 하나의 효소 군을 발현하고, 여기서, 효소 군은 제1 탄소 쇄 길이가 X인 지방 아실-CoA를 제2 탄소 쇄 길이 X'인 단축된 지방 아실-CoA로 단축시킬 수 있다 (여기서, X' ≤ X-2).
상기 실시양태에서, 일반적으로 효모 세포에 존재하는 아실-CoA 옥시다제, 즉, 천연 효소(들)의 활성은 세포에서 상기 효소(들)를 인코딩하는 유전자를 돌연변이화시킴으로써 감소 또는 제거된다. 탄소 쇄 단축을 유도하여 탄소 쇄 길이의 지방 알콜 및 이의 유도체를 수득하기 위해, 하나 이상의 아실-CoA 옥시다제가 효모 세포에서 발현된다. 상기 아실-coA 옥시다제는 효모 세포에 고유한 것일 수 있거나, 또는 또 다른 유기체로부터 유래된 것일 수 있다. 주어진 쇄 길이의 지방 아실-CoA를 산화시키는 데 요구되는 다른 효소를 인코딩하는 유전자는, 세포가 그를 이미 발현하지 않은 경우, 또는 활성 증가 또는 기질 특이성이 요구되는 경우에 이 또한 세포에 도입될 수 있다. 이렇게 발현된 아실-CoA 옥시다제(들)를 통해 지방 아실-CoA는 산화될 수 있고, 탄소 쇄 길이가 상기 기질보다 더 짧은 지방 아실-CoA로 단축될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 천연 아실-CoA 옥시다제의 활성 감소는 탄소 쇄 길이가 X보다 짧은, 예컨대, X'보다 짧은 아실-CoA에 대한 활성 감소이다.
본 개시내용에서 아실-CoA 옥시다제라는 용어는 하기 반응을 촉매화할 수 있는 효소, 예컨대, EC 번호 1.3.3.6인 효소를 지칭한다:
아실-CoA + O2 ↔ 트랜스-2,3-데히드로아실-CoA + H2O2.
상기 효소는 옥시도리덕타제 패밀리, 구체적으로, 산소를 수용자로 사용하여 공여자의 CH-CH 기에 작용하는 것에 속하는 것이다. 상기 효소 부류의 계통명은 아실-CoA:산소 2-옥시도리덕타제이다. 사용되는 다른 명칭으로는 지방 아실-CoA 옥시다제, 아실 코엔자임 A 옥시다제, 및 지방 아실-코엔자임 A 옥시다제를 포함한다.
본 개시내용의 효모 세포는 하나 이상의 천연 아실-CoA 옥시다제를 갖는 효모 세포로부터 출발하여 조작될 수 있다. 본원에 개시된 변형된 효모 세포는 바람직하게 상기 하나 이상의 천연 아실-CoA 옥시다제의 감소된 활성을 갖고; 이는 이의 천연 아실-CoA 옥시다제 중 적어도 하나의 활성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 효모 세포를 사용함으로써 달성될 수 있다. 천연 아실-CoA 옥시다제는 퍼옥시좀, 미토콘드리아 또는 세포질 아실-CoA 옥시다제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 모든 천연 아실-CoA 옥시다제의 활성을 감소시킨다. 활성 감소는, 상기 돌연변이에 기인하여 효모 세포가 상기 반응을 촉매화할 수 있는 능력, 특히, 아실-CoA를 상응하는 트랜스-2,3-데히드로아실-CoA로 전환시킬 수 있는 능력이 감소되었다는 것으로 이해되어야 한다. 일부 실시양태에서, "능력 감소"는 상기 반응을 촉매화할 수 있는 능력이 완전히 또는 부분적으로 제거되었다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, "능력 감소"는 반응을 촉매화할 수 있는 능력이 일반적인 상황, 즉, 일반적인 능력을 갖는 효소를 사용함으로써 반응에 사용될 수 있는 기질의 서브군으로 제한된다는 것을 의미한다.
본 개시내용의 효모 세포는 지방 아실-CoA를 산화시킬 수 있는 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제를 포함하는 적어도 하나의 효소 군을 발현할 수 있다. 효소 군은 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제 이외에도, 주어진 탄소 쇄 길이의 지방 아실-CoA를 더 짧은 탄소 쇄 길이의 지방 아실-CoA로 전환시키는 데 요구되는 다른 효소도 포함한다. 이들 다른 효소는 바람직하게, 효모 세포에 고유한 것일 수 있고; 상기 실시양태에서, 효모 세포가 효소 군을 발현하는 데 아실-CoA 옥시다제를 코딩하는 유전자 도입만이 요구된다.
아실-CoA 옥시다제가 효모 세포에 고유한 것인 실시양태에서, 상기 아실-CoA 옥시다제는 당업계에 공지된 바와 같이, 예컨대, 프로모터, 예컨대, 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 아실-CoA 옥시다제의 과다발현을 가능하게 하는 프로모터의 도입에 의해 변형될 수 있다. 제1 효소 군에 재도입된 천연 아실-CoA 옥시다제는 활성이 변형된, 예컨대, 기질 특이성이 변형되고/거나, 활성이 변형된, 예컨대, 반응 효율이 증가된 돌연변이화된 버전일 수 있다.
다른 실시양태에서, 아실-CoA 옥시다제는 또 다른 유기체로부터 유래된 것이다. 제1 효소 군에 포함된 아실-CoA는 효모, 진균, 곤충, 포유동물, 조류 또는 식물로부터 유래된 아실-CoA 옥시다제일 수 있고, 예컨대, 제1 효소 군의 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제는 효모, 진균, 곤충, 포유동물, 조류 또는 식물로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 아실-CoA 옥시다제는 야로위아, 사카로마이세스, 아그로티스, 아라비돕시스(Arabidopsis), 아스페르길루스(Aspergillus), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 호모(Homo), 파에나트로박터(Paenarthrobacter) 및 라투스(Rattus) 로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래된 것이고, 예컨대, 제1 효소 군의 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제는 야로위아, 사카로마이세스, 아그로티스, 아라비돕시스 , 아스페르길루스, 쿠쿠르비타, 호모, 파에나트로박터, 및 라투스로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 제1 효소 군은 야로위아 리폴리티카, 사카로마이세스 세레비지아에, 아그로티스 세게툼, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 쿠쿠르비타 막시마(Cucurbita maxima), 호모 사피엔스(Homo sapiens), 파에나트로박터 우레아파키엔스(Paenarthrobacter ureafaciens) 또는 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)로부터 유래된 아실-CoA 옥시다제를 포함한다.
상기와 같이 효모 세포에 도입된 아실-CoA 옥시다제는 야로위아 리폴리티카, 아그로티스 세게툼, 아라비돕시스 탈리아나, 아스페르길루스 니둘란스, 쿠쿠르비타 막시마, 호모 사피엔스, 파에나트로박터 우레아파키엔스 또는 라투스 노르베기쿠스에 고유한 아실-CoA 옥시다제일 수 있다. 효모 세포는 본원 상기에서 기술된 바와 같을 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 효모 세포는 지방 아실-CoA를 산화시킬 수 있는 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제를 포함하는 적어도 하나의 효소 군을 발현할 수 있고, 여기서, 상기 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제는 군 Yli_POX1 (XP_504703), Yli_POX2 (XP_505264), Yli_POX3 (XP_503244), Yli_POX4 (XP_504475), Yli_POX5 (XP_502199), Yli_POX6 (XP_503632), Ase_POX (서열 번호: 39), Ath_POX1 (서열 번호: 41), Ath_POX2 (서열 번호: 43), Ani_POX (서열 번호: 45), Cma_POX (서열 번호: 47), Hsa_POX1-2 (서열 번호: 49), Pur_POX (서열 번호: 51), Sc_POX1 (서열 번호: 31) 및 Rno_POX2 (서열 번호: 53), 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 65%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제의 발현은 상기 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제를 인코딩하는 핵산을 도입함으로써 달성된다. 예를 들어, 효모는 Yli_POX1을 코딩하는 YALI0_E32835g, Yli_POX2를 인코딩하는 YALI0_F10857g, Yli_POX3을 인코딩하는 YALI0_D24750g, Yli_POX4를 인코딩하는 YALI0_E27654g, Yli_POX5를 인코딩하는 YALI0_C23859g, Yli_POX6을 인코딩하는 YALI0_E06567g, Ase_POX를 인코딩하는 서열 번호: 38, Ath_POX1을 인코딩하는 서열 번호: 40, Ath_POX2를 인코딩하는 서열 번호: 42, Ani_POX를 인코딩하는 서열 번호: 44, Cma_POX를 인코딩하는 서열 번호: 46, Hsa_POX를 인코딩하는 서열 번호: 48, Pur_POX를 인코딩하는 서열 번호: 50, Sc_POX1을 인코딩하는 서열 번호: 30, 또는 Rno_POX2를 인코딩하는 서열 번호: 52, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 65%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 발현한다.
일부 실시양태에서, X'=12이다.
적합한 아실-CoA 옥시다제는 (동일한 출원인에 의해 2020년 2월 10일 출원된) WO 2020/169389에, 특히, "아실-CoA 옥시다제" 섹션에 상세하게 기술되어 있다.
E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, 코들레몬을 수득하기 위해, 쇄 단축이 이용되는 실시양태에서, 따라서, 효모 세포는 적어도 하나의 효소 군 이외에도 또한 탄소 쇄 길이가 X 또는 X'인 지방 아실-CoA에 E/Z 입체형태로 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 추가의 이종성 데사투라제도 발현할 수 있다. X 또는 X'는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 탄소 원자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 쇄 길이가 X'인 지방 아실-CoA에 E/Z 입체형태로 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있고, 여기서, X'는 상기 정의된 바와 같다. 적합한 데사투라제는 (동일한 출원인에 의해 2020년 2월 10일 출원된) WO 2020/169389에, 특히, "데사투라제 (FAD)" 섹션에 상세하게 기술되어 있다. 특히, C14:CoA를 Z11-C14:CoA 및/또는 E11-C14:CoA로 전환시킬 수 있는 데사투라제가 관심의 대상이 된다. 예를 들어, 코리스토네우라 로사세아나(Choristoneura rosaceana)로부터의 데사투라제 CroZ11 (서열 번호: 63), 또는 코리스토네우라 파랄레라(Choristoneura parallela)로부터의 데사투라제 CpaE11 (서열 번호: 65), 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체가 사용될 수 있다. 이어서, 생성된 Z11-C14:CoA 및/또는 E11-C14:CoA는 추가로 쇄 단축되어 Z9-C12:CoA 및/또는 E9-C12:CoA가 수득될 수 있고, 이는 이어서, Cpo_CPRQ에 의해 추가로 탈포화되어 E8,E10-C12:CoA가 수득된다.
상기 실시양태에서, 따라서, 효모 세포는 본원 상기 섹션 "데사투라제"에서 기술된 바와 같은 적어도 하나의 데사투라제, 예를 들어, Cpo_CPRQ 또는 Gmo_CPRQ, 바람직하게 Cpo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 기능성 변이체를 발현하고, 탄소 쇄 길이가 X 또는 X'인 지방 아실-CoA에 E/Z 입체형태로 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 추가의 이종성 데사투라제를 추가로 발현하고, 여기서, X 및 X'는 상기 기술된 바와 같다. 특히, 데사투라제는 탄소 쇄 길이가 14인 지방 아실-CoA에 E/Z 입체형태로 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있고, 이는 이어서, 본원 상기에서 기술된 바와 같이 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA로 단축될 수 있고 - 이는 이어서, E8,E10-C12:CoA로 추가로 탈포화될 수 있고, 이는 이어서, 본원 상기에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이 FAR의 작용에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환될 수 있다.
E8,E10 - 도데카디에닐 코엔자임 A, E8,E10 - 도데카디엔 -1-올, E8,E10 - 도데카디 에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 생산 방법
본원 상기에 기술된 효모 세포는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올 생산 방법에 사용될 수 있으며, 이는 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 추가로 전환될 수 있다.
E 8, E 10 - 도데카디엔 -1-올 생산 방법
본원에서는 효모 세포를 제공하는 단계, 및 배지 중에서 효모 세포를 인큐베이션시켜 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 제조하는 단계를 포함하고, 여기서, 효모 세포는
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 이종성 데사투라제; 및
ii) 임의로, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 발현하는 것인, 효모 세포에서 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 제조하는 방법을 제공한다.
효모 세포는 본원 상기에 기술된 효모 세포 중 임의의 것일 수 있다.
본 방법을 통해 바람직하게는 적어도 0.2 mg/L의 역가로 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A를 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, E8,E10-도데카디엔-1-올의 역가는 적어도 0.25 mg/L, 예컨대, 적어도 0.3 mg/L, 예컨대, 적어도 0.4 mg/L, 예컨대, 적어도 0.5 mg/L, 예컨대, 적어도 0.75 mg/L, 예컨대, 적어도 1 mg/L, 예컨대, 적어도 1.5 mg/L, 예컨대, 적어도 2.5 mg/L, 예컨대, 적어도 5.0 mg/L, 예컨대, 적어도 10 mg/L, 예컨대, 적어도 15 mg/L, 예컨대, 적어도 20 mg/L, 예컨대, 25 mg/L, 예컨대, 적어도 50 mg/L, 예컨대, 적어도 100 mg/L, 예컨대, 적어도 250 mg/L, 예컨대, 적어도 500 mg/L, 예컨대, 적어도 750 mg/L, 예컨대, 적어도 1 g/L, 예컨대, 적어도 2 g/L, 예컨대, 적어도 3 g/L, 예컨대, 적어도 4 g/L, 예컨대, 적어도 5 g/L, 예컨대, 적어도 6 g/L, 예컨대, 적어도 7 g/L, 예컨대, 적어도 8 g/L, 예컨대, 적어도 9 g/L, 예컨대, 적어도 10 g/L 이상이다.
본 방법을 통해 적어도 0.2 mg/L의 역가로 E8,E10-도데카디엔-1-올을 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, E8,E10-도데카디엔-1-올의 역가는 적어도 0.25 mg/L, 예컨대, 적어도 0.3 mg/L, 예컨대, 적어도 0.4 mg/L, 예컨대, 적어도 0.5 mg/L, 예컨대, 적어도 0.75 mg/L, 예컨대, 적어도 1 mg/L, 예컨대, 적어도 1.5 mg/L, 예컨대, 적어도 2.5 mg/L, 예컨대, 적어도 5.0 mg/L, 예컨대, 적어도 10 mg/L, 예컨대, 적어도 15 mg/L, 예컨대, 적어도 20 mg/L, 예컨대, 25 mg/L, 예컨대, 적어도 50 mg/L, 예컨대, 적어도 100 mg/L, 예컨대, 적어도 250 mg/L, 예컨대, 적어도 500 mg/L, 예컨대, 적어도 750 mg/L, 예컨대, 적어도 1 g/L, 예컨대, 적어도 2 g/L, 예컨대, 적어도 3 g/L, 예컨대, 적어도 4 g/L, 예컨대, 적어도 5 g/L, 예컨대, 적어도 6 g/L, 예컨대, 적어도 7 g/L, 예컨대, 적어도 8 g/L, 예컨대, 적어도 9 g/L, 예컨대, 적어도 10 g/L 이상이다.
역가를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
E 8, E 10 - 도데카디에닐 아세테이트 생산 방법
일부 실시양태에서, 본 방법은 아세틸트랜스퍼라제의 발현에 의해, 또는 화학적 전환에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환시키는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 본원에서는
a) 효모 세포를 제공하고, 배지 중에서 효모 세포를 인큐베이션시키는 단계로서, 여기서, 효모 세포는
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 이종성 데사투라제; 및
ii) 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 발현하는 것인 단계,
b) E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환시키는 단계를 포함하는, 효모 세포에서 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 제조하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트는 본원 상기 "E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 제조"에 기술된 바와 같이 효모 세포를 조작함으로써 수득된다.
다른 실시양태에서, 세포에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올의 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로의 전환은 당업계에 공지된 바와 같이 화학적으로 수행된다. 예를 들어, 세포에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올은 회수될 수 있고, 이후, 아세틸 클로라이드를 E8,E10-도데카디엔-1-올에 첨가하고, 혼합하고, 예컨대, 실온에서 인큐베이션시키고, 이로써, 세포에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환된다.
다른 실시양태에서, 효모 세포는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A를 생산하고, 이는 지질, 예컨대, 트리아실글리세리드로, 또는 유리 지방산으로 전환될 수 있고, 상기 지질 또는 유리 지방산 회수 후, 이는 차례로 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환될 수 있다. 이어서, E8,E10-도데카디엔-1-올은 시험관내에서 상기 기술된 바와 같이 E8,E10-도데카디엔-1-올로 추가로 전환될 수 있다. 상기 실시양태에서, 세포에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올의 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로의 전환은 당업계에 공지된 바와 같이 화학적으로 수행된다.
따라서, 본 방법을 통해 적어도 0.2 mg/L의 역가로 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트의 역가는 적어도 0.25 mg/L, 예컨대, 적어도 0.3 mg/L, 예컨대, 적어도 0.4 mg/L, 예컨대, 적어도 0.5 mg/L, 예컨대, 적어도 0.75 mg/L, 예컨대, 적어도 1 mg/L, 예컨대, 적어도 1.5 mg/L, 예컨대, 적어도 2.5 mg/L, 예컨대, 적어도 5.0 mg/L, 예컨대, 적어도 10 mg/L, 예컨대, 적어도 15 mg/L, 예컨대, 적어도 20 mg/L, 예컨대, 25 mg/L, 예컨대, 적어도 50 mg/L, 예컨대, 적어도 100 mg/L, 예컨대, 적어도 250 mg/L, 예컨대, 적어도 500 mg/L, 예컨대, 적어도 750 mg/L, 예컨대, 적어도 1 g/L, 예컨대, 적어도 2 g/L, 예컨대, 적어도 3 g/L, 예컨대, 적어도 4 g/L, 예컨대, 적어도 5 g/L, 예컨대, 적어도 6 g/L, 예컨대, 적어도 7 g/L, 예컨대, 적어도 8 g/L, 예컨대, 적어도 9 g/L, 예컨대, 적어도 10 g/L 이상이다.
역가를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
E 8, E 10 - 도데카디에날 생산 방법
일부 실시양태에서, 본 방법은 효모 세포를 추가로 조작하거나, 또는 화학적 전환에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시키는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 본원에서는
a) 효모 세포를 제공하고, 배지 중에서 효모 세포를 인큐베이션시키는 단계로서, 여기서, 효모 세포는
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 이종성 데사투라제; 및
ii) 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 발현하는 것인 단계,
b) E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시키는 단계를 포함하는, 효모 세포에서 E8,E10-도데카디에날을 제조하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, E8,E10-도데카디에날은 본원 상기 "E8,E10-도데카디에날 제조"에 기술된 바와 같이 효모 세포를 조작함으로써 수득된다.
다른 실시양태에서, 본 방법은 화학적 전환에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시키는 단계를 포함한다. 화학적 전환은 E8,E10-도데카디엔-1-올의 E8,E10-도데카디에날로의 산화에 기초한다. 상기 전환을 수행하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 방법은 환경 친화적이고, 유해 폐기물의 양을 최소화한다.
다른 실시양태에서, 효모 세포는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A를 지질, 예컨대, 트리아실글리세리드로, 또는 유리 지방산으로 전환시킬 수 있고, 이는 이어서, 회수되고, 상기 기술된 바와 같이, 시험관내에서 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환될 수 있다. 상기 실시양태에서, 세포에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올의 E8,E10-도데카디에날로의 전환은 당업계에 공지된 바와 같이 화학적으로 수행된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 화학적 전환은 금속 비함유일 수 있고, 이로써, 예컨대, 산화망가니즈, 산화크로뮴 (존스(Jones) ox. PDC, PCC), 또는 루테늄 화합물 (TPAP, 레이-그리피스(Ley-Griffith) ox.)과 같은 독성 중금속 기반 시약을 피할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 전환은 예컨대, 스완(Swern) 산화 또는 피츠너-모파트(Pfitzner-moffat) 타입과 같은 활성화된 디메틸 술폭시드를 포함하는 반응을 포함하지 않는다. 상기 방법은 표적 생성물로부터 제거하기 어려운 디메틸 술피드와 같은, 미량의 강한 냄새가 나는 유기 황 화합물의 전형적인 형성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 데스 마틴(Dess-Martin) 반응 (문헌 [Yadav et al., 2004], [Meyer et al., 1994])을 포함한다. 다른 실시양태에서, 화학적 전환은 수성/유기 2상 조건하에서 차아염소산나트륨으로 산화시키는 것을 포함한다 (문헌 [Okada et al., 2014]; [Tamura et al., 2012]; [Li et al., 2009]). 일부 실시양태에서, 화학적 산화는 25% 피리딘을 함유하는 메틸렌 클로라이드로 이루어진 매질 중에서 1-클로로벤조트리아졸로 수행될 수 있다 (문헌 [Ferrell and Yao, 1972]).
대안적으로, E8,E10-도데카디엔-1-올의 E8,E10-도데카디에날로의 전환은 알콜 데히드로게나제에 의해 효소적으로 수행될 수 있다. 당업자는 효소적 산화를 수행하는 방법을 알 것이다. 예를 들어, 효소적 산화는 정제된 효소, 세포 추출물 또는 전체 세포를 E8,E10-도데카디엔-1-올과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 본 방법을 통해 적어도 0.2 mg/L의 역가로 E8,E10-도데카디에날을 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, E8,E10-도데카디에날의 역가는 적어도 0.25 mg/L, 예컨대, 적어도 0.3 mg/L, 예컨대, 적어도 0.4 mg/L, 예컨대, 적어도 0.5 mg/L, 예컨대, 적어도 0.75 mg/L, 예컨대, 적어도 1 mg/L, 예컨대, 적어도 1.5 mg/L, 예컨대, 적어도 2.5 mg/L, 예컨대, 적어도 5.0 mg/L, 예컨대, 적어도 10 mg/L, 예컨대, 적어도 15 mg/L, 예컨대, 적어도 20 mg/L, 예컨대, 25 mg/L, 예컨대, 적어도 50 mg/L, 예컨대, 적어도 100 mg/L, 예컨대, 적어도 250 mg/L, 예컨대, 적어도 500 mg/L, 예컨대, 적어도 750 mg/L, 예컨대, 적어도 1 g/L, 예컨대, 적어도 2 g/L, 예컨대, 적어도 3 g/L, 예컨대, 적어도 4 g/L, 예컨대, 적어도 5 g/L, 예컨대, 적어도 6 g/L, 예컨대, 적어도 7 g/L, 예컨대, 적어도 8 g/L, 예컨대, 적어도 9 g/L, 예컨대, 적어도 10 g/L 이상이다.
역가를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
회수
일부 실시양태에서, 본 방법은 수득된 생성물을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 E8,E10-도데카디엔-1-올 생산 방법이고, 따라서, 제조된 E8,E10-도데카디엔-1-올을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 생산 방법이고, 따라서, 제조된 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 E8,E10-도데카디에날 생산 방법이고, 따라서, 제조된 E8,E10-도데카디에날을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
본 방법에 의해 수득된 생성물을 회수하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 데칸, 헥산 또는 식물성 오일과 같은 소수성 용매로 추출하는 것을 포함할 수 있다.
대안적으로, 원하는 생성물을 회수하는 데 (동일한 출원인에 의해 2020년 9월 22일 출원된) 출원 PCT/EP2020/076351에 기술된 방법 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A의 전환으로부터 수득된, 지질, 예컨대, 트리아실글리세리드, 또는 지방산을 회수하는 데, 또는 제조된 E8,E10-도데카디엔-1-올, 제조된 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 제조된 E8,E10-도데카디에날을 회수하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법은 소수성 화합물, 예컨대, 지방 알콜, 지방 알콜 아세테이트 및 지방 알데히드의 회수를 크게 촉진시키는 배양 온도에서 예컨대, 배양 배지와 같은 수용액 중에서 측정된 이의 클라우드 농도 이상인 양으로 배양 배지 중 추출제 첨가를 이용한다. 따라서, 상기 방법은 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A의 전환으로부터 수득된, 지질, 예컨대, 트리아실글리세리드, 또는 지방산의 회수, 본 방법에 의해 제조된, E8,E10-도데카디엔-1-올의 회수, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트의 회수 및 E8,E10-도데카디에날의 회수를 촉진시키는 데 유리하게 사용될 수 있다. 추가로, 배양 배지 중 추출제 첨가는 또한 일반적으로 세포에 의해 생산된 소수성 화합물의 역가를 증가시키고, 세포로부터의 제조된 소수성 화합물의 분지를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 방법에서 사용된 배지는 배양 온도에서 예컨대, 배양 배지와 같은 수용액 중에서 측정된 이의 클라우드 농도 이상인 양으로 추출제를 포함하고, 여기서, 추출제는 비이온성 계면활성제, 바람직하게, 비이온성 에톡실화된 계면활성제, 예컨대, 소포제, 바람직하게, 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 폴레에테르 분산액의 혼합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트를 포함하는 소포제, 예컨대, 시메티콘, 지방 알콜 알콕실레이트, 폴리에톡실화된 계면활성제 및 에톡실화 및 프로폭실화된 C16-C18 알콜계 소포제 및 이의 조합으로부터 선택되는 폴리에톡실화된 계면활성제이다.
수용액 중 클라우드 농도는 주어진 온도, 바람직하게 실온에서, 또는 발효가 수행되는 온도, 예를 들어, 30℃에서, 또는 실온에서 측정된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "추출제"는 발효에서 생산된 소수성 화합물의 회수를 촉진시키는 비이온성 계면활성제, 특히, 소포제를 지칭한다. 예를 들어, 비이온성 계면활성제는 비이온성 에톡실화된 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 폴레에테르 분산액의 혼합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트를 포함하는 소포제, 예컨대, 시메티콘, 지방 알콜 알콕실레이트, 폴리에톡실화된 계면활성제 및 에톡실화 및 프로폭실화된 C16-C18 알콜계 소포제 및 이의 조합으로부터 선택되는 폴리에톡실화된 계면활성제이다. PCT/EP2020/076351의 실시예 7에는 계면활성제의 클라우드 농도를 측정하는 방법이 기술되어 있다.
적합한 추출제인 비이온성 계면활성제 및 상기 비이온성 계면활성제의 적합한 양은 (동일한 출원인에 의해 2020년 9월 22일 출원된) 출원 PCT/EP2020/076351에, 특히, 표제 "비이온성 에톡실화된 계면활성제"인 섹션에 상세하게 기술되어 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 방법에서 사용되는 배양 배지는 에톡실화 및 프로폭실화된 C16-C18 알콜계 소포제인 비이온성 계면활성제, 예컨대, C16-C18 알킬 알콜 에톡실레이트 프로폭실레이트 (CAS 번호 68002-96-0)를 포함하고, 배양 배지는 적어도 1% vol/vol의 C16-C18 알킬 알콜 에톡실레이트 프로폭실레이트, 예컨대, 적어도 1.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 2% vol/vol, 예컨대, 적어도 2.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 3% vol/vol, 예컨대, 적어도 3.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 4% vol/vol, 예컨대, 적어도 5% vol/vol, 예컨대, 적어도 6% vol/vol, 예컨대, 적어도 7% vol/vol, 예컨대, 적어도 8% vol/vol, 예컨대, 적어도 9% vol/vol, 예컨대, 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 12.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 17.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 22.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 27.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 C16-C18 알킬 알콜 에톡실레이트 프로폭실레이트를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 방법에서 사용되는 배양 배지는 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜인 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 콜리포르® P407 (CAS 번호 9003-11-6)을 포함하고, 배양 배지는 적어도 10% vol/vol의 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 예컨대, 콜리포르® P407, 예컨대, 적어도 11% vol/vol, 예컨대, 적어도 12% vol/vol, 예컨대, 적어도 13% vol/vol, 예컨대, 적어도 14% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 16% vol/vol, 예컨대, 적어도 17% vol/vol, 예컨대, 적어도 18% vol/vol, 예컨대, 적어도 19% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol, 예컨대, 적어도 35% vol/vol 이상의 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 예컨대, 콜리포르® P407을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 방법에서 사용되는 배양 배지는 폴레에테르 분산액의 혼합물인 비이온성 계면활성제, 예컨대, 안티폼 204를 포함하고, 배양 배지는 적어도 1% vol/vol의 폴레에테르 분산액의 혼합물, 예컨대, 안티폼 204, 예컨대, 적어도 1.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 2% vol/vol, 예컨대, 적어도 2.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 3% vol/vol, 예컨대, 적어도 3.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 4% vol/vol, 예컨대, 적어도 5% vol/vol, 예컨대, 적어도 6% vol/vol, 예컨대, 적어도 7% vol/vol, 예컨대, 적어도 8% vol/vol, 예컨대, 적어도 9% vol/vol, 예컨대, 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 12.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 17.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 22.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 27.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 폴레에테르 분산액의 혼합물, 예컨대, 안티폼 204를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 방법에서 사용되는 배양 배지는 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 예컨대, 시메티콘를 포함하는 비이온성 계면활성제를 포함하고, 배양 배지는 적어도 1% vol/vol의 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 또는 시메티콘, 예컨대, 적어도 1.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 2% vol/vol, 예컨대, 적어도 2.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 3% vol/vol, 예컨대, 적어도 3.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 4% vol/vol, 예컨대, 적어도 5% vol/vol, 예컨대, 적어도 6% vol/vol, 예컨대, 적어도 7% vol/vol, 예컨대, 적어도 8% vol/vol, 예컨대, 적어도 9% vol/vol, 예컨대, 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 12.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 17.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 22.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 27.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 또는 시메티콘을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 방법에서 사용되는 배양 배지는 지방 알콜 알콕실레이트인 비이온성 계면활성제를 포함하고, 배양 배지는 적어도 1% vol/vol의 지방 알콜 알콕실레이트, 예컨대, 적어도 1.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 2% vol/vol, 예컨대, 적어도 2.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 3% vol/vol, 예컨대, 적어도 3.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 4% vol/vol, 예컨대, 적어도 5% vol/vol, 예컨대, 적어도 6% vol/vol, 예컨대, 적어도 7% vol/vol, 예컨대, 적어도 8% vol/vol, 예컨대, 적어도 9% vol/vol, 예컨대, 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 12.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 17.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 22.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 27.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 지방 알콜 알콕실레이트를 포함한다. 적합한 지방 알콜 알콕실레이트는 플루라팍(Plurafac)® LF300 (CAS 번호 196823-11-7), 플루라팍® LF1300 (68002-96-0), 플루라팍® SLF180 (CAS 번호 196823-11-7), 데히폰(Dehypon)® 2574 (CAS 번호 68154-97-2), 및 임벤틴 SG/251 (CAS 번호 68002-96-0), 바람직하게 플루라팍® LF300 또는 데히폰® 2574를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 방법에서 사용되는 배양 배지는 아그니크(Agnique) BP420 (CAS 번호 68002-96-0)인 비이온성 계면활성제를 포함하고, 배양 배지는 적어도 1% vol/vol의 아그니크 BP420, 예컨대, 적어도 1.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 2% vol/vol, 예컨대, 적어도 2.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 3% vol/vol, 예컨대, 적어도 3.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 4% vol/vol, 예컨대, 적어도 5% vol/vol, 예컨대, 적어도 6% vol/vol, 예컨대, 적어도 7% vol/vol, 예컨대, 적어도 8% vol/vol, 예컨대, 적어도 9% vol/vol, 예컨대, 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 12.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 17.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 22.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 27.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 아그니크 BP420을 포함한다.
일부 실시양태에서, 배양 배지는 이의 클라우드 농도보다 적어도 50%, 예컨대, 적어도 100%, 예컨대, 적어도 150%, 예컨대, 적어도 200%, 예컨대, 적어도 250%, 예컨대, 적어도 300%, 예컨대, 적어도 350%, 예컨대, 적어도 400%, 예컨대, 적어도 500%, 예컨대, 적어도 750%, 예컨대, 적어도 1000% 이상 만큼 더 큰 양으로 추출제를 포함하고/거나, 여기서, 배양 배지는 이의 클라우드 농도의 적어도 2배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 3배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 4배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 5배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 6배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 7배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 8배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 9배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 10배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 12.5배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 15배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 17.5배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 20배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 25배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 30배인 양으로 추출제를 포함한다.
추출제, 즉, 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에톡실화된 계면활성제, 예를 들어, 본원에 기술된 비이온성 계면활성제, 소포제 또는 폴리에톡실화된 계면활성제 중 임의의 것을 첨가하면, 발효 브로쓰 중 에멀젼이 생성되고, 여기서, 미생물에 의해 생산된 소수성 화합물, 즉, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (또는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 전환에 의해 수득된 지질 또는 유리 지방산), E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날이 에멀젼으로 존재한다. 따라서, 본 방법이 추출제를 포함하는 배양 배지를 이용하여 수행되는 실시양태에서, 본 방법은 또한 에멀젼을 파괴하여 추출제 및 소수성 화합물을 포함하는 생성물 상(product phase)을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 일단 에멀젼이 파괴되고 나면, 발효 브로쓰는 3개 상: 주로 물 및 수성 화합물을 포함하는 수상, 세포 및 세포 파편(cell debris)을 포함하는 상, 및 주로 추출제 및 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (또는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 전환에 의해 수득된 지질 또는 유리 지방산), E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 포함하는 생성물 상으로 분리된다. 따라서, 3개 상으로 이루어진 조성물이 수득된다. 이는 (동일한 출원인에 의해 2020년 9월 22일 출원된) 출원 PCT/EP2020/076351에, 특히, 표제 "소수성 화합물을 포함하는 생성물 상"인 섹션에 상세하게 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (또는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 전환에 의해 수득된 지질 또는 유리 지방산) 대부분, 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날 대부분은 생성물 상에 존재한다. 예를 들어, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (또는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 전환에 의해 수득된 지질 또는 유리 지방산), 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날의 적어도 50%가 생성물 상에 존재하고, 예컨대, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (또는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 전환에 의해 수득된 지질 또는 유리 지방산), 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날의 적어도 55%, 예컨대, 적어도 60%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100%가 생성물 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 생성물 상은 처음 발효 브로쓰에 존재하는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (또는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 전환에 의해 수득된 지질 또는 유리 지방산), 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날의 적어도 50%를 포함하고, 예컨대, 처음 발효 브로쓰에 존재하는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (또는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 전환에 의해 수득된 지질 또는 유리 지방산), 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날의 적어도 55%, 예컨대, 적어도 60%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100%를 포함한다.
에멀젼을 파괴시키는 단계는 당업계에 공지된 바와 같이, 예를 들어, 원심분리에 의해 에멀젼에 대해 상 분리 단계를 실시함으로써 수행될 수 있다.
에멀젼 파괴 단계 후, 추출제 및 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 전환에 의해 수득된 지질 또는 유리 지방산, 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 포함하는 생성물 상이 조성물로부터 회수될 수 있다. 상기 실시양태에서, 본 방법은 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 전환에 의해 수득된 지질 또는 유리 지방산, 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 추출제로부터 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이는 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 증류, 예를 들어, 감압하에서의 증류에 의해, 또는 칼럼 정제에 의해, 또는 임의의 다른 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 추출제는 발효기 또는 생물반응기로 재순환될 수 있다.
핵산 구축물
효모 세포를 변형시키기 위한 핵산 구축물로서, 상기 구축물은
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제를 코딩하는 적어도 하나의 제1 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 제1 폴리뉴클레오티드; 및
ii) 임의로, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산 구축물 또한 제공한다.
핵산 구축물은 본원에 기술된 바와 같은 효모 세포, 즉, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 효모 세포를 수득하는 데 사용될 수 있다. 용어 "핵산 구축물"은 본원에서 제1 폴리뉴클레오티드 및 임의로, 제2 폴리뉴클레오티드가 포함되어 있는 단일 물리적 엔티티, 즉, 단일 분자, 예를 들어, 벡터 또는 플라스미드를 지칭할 수 있거나, 또는 복수의 핵산 분자, 예컨대, 한 플라스미드 또는 벡터 내에 제1 폴리뉴클레오티드가 포함되고, 또 다른 플라스미드 또는 벡터 내에 제2 폴리뉴클레오티드가 포함된 것을 지칭할 수 있다.
핵산 구축물은
iii) 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 서열 번호: 3에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체;
iv) 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 서열 번호: 23에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체;
v) 헤모글로빈을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 서열 번호: 5에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체; 및/또는
vi) 티오에스테라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 서열 번호: 25에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체 중 하나 이상의 것을 추가로 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 상기 유전자 중 임의의 것의 카피를 수개 포함할 수 있고, 그 내부로의 도입이 이루어지는 효모 세포에서의 적절한 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같이, 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 이종성 데사투라제는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 본원 상기에서 기술된 바와 같이, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 1, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 이종성 데사투라제는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, 85번 위치에 돌연변이를 갖는 Cpo_CPRQ 돌연변이체, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 S85A 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 데사투라제는 돌연변이체 Cpo_CPRQ, 예컨대, 82번 위치에 돌연변이를 갖는 Cpo_CPRQ 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 S82A 돌연변이, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다.
다른 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같이, 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 이종성 데사투라제는 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77) 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 본원 상기에서 기술된 바와 같이, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 78, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입할 수 있는 수개의 데사투라제를 발현한다. 상기 실시양태에서, 바람직하게, 수개의 데사투라제 중 적어도 하나는 본원에 상세하게 설명되어 있는 Cpo_CPRQ, Gmo_CPRQ, 이의 돌연변이체 또는 이의 기능성 변이체이고, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 1, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 상기 실시양태에서, 핵산 구축물은 각각의 것이 본원 상기에서 기술된 바와 같은 데사투라제를 코딩하는 것인 추가의 제1 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 핵산 구축물은 Cpo_CPRQ, Gmo_CPRQ를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 동족체를 포함하고, 추가의 데사투라제, 바람직하게 Cpo_NPVE (서열 번호: 67), 또는 Cpo_SPTQ (서열 번호: 69)를 코딩하는 추가의 제1 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 추가의 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 68, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함한다.
핵산 구축물은 또한 FAR을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. FAR은 바람직하게 곤충 FAR, 예컨대, 아그로티스 속, 헬리오티스 속, 헬리코베르파 속 또는 시디아 속의 곤충에 고유한 FAR이다. 예를 들어, FAR은 아그로티스 세게툼, 아그로티스 입실론, 헬리오티스 서브플렉사, 헬리코베르파 아술타, 헬리코베르파 비레센스 또는 시디아 포모넬라에 고유한 것이다.
일부 실시양태에서, FAR은 Ase_FAR (서열 번호: 10), 즉, 아그로티스 세게툼에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Ase_FAR의 기능성 변이체이다. 예를 들어, 기능성 변이체는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, FAR은 돌연변이체 Ase_FAR, 예컨대, 198번 또는 413번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, Ase_FAR 돌연변이체는 T198A 돌연변이체이다. 다른 실시양태에서, Ase_FAR 돌연변이체는 S413A 돌연변이체이다. 상기 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 9, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
다른 실시양태에서, FAR은 Aip_FAR (서열 번호: 61), 즉, 아그로티스 입실론에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Aip_FAR의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 60, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
다른 실시양태에서, FAR은 Hs_FAR (서열 번호: 71), 즉, 헬리오티스 서브플렉사에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Hs_FAR의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 70, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
다른 실시양태에서, FAR은 Has_FAR (서열 번호: 73), 즉, 헬리코베르파 아술타에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Has_FAR의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 72, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
다른 실시양태에서, FAR은 Hv_FAR (서열 번호: 75), 즉, 헬리코베르파 비레센스에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Hv_FAR의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 74, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
다른 실시양태에서, FAR은 Har_FAR (서열 번호: 12), 즉, 헬리코베르파 아르미게라에서 자연적으로 발생된 FAR이다. 일부 실시양태에서, 이종성 FAR은 E8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는, Har_FAR의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 13, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
다른 실시양태에서, FAR은 시디아 포모넬라 FAR, 예를 들어, Cpo_FAR 또는 8,E10-C12:CoA를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 능력을 보유하는 이의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 75, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
수개의 FAR을 발현하는 것이 바람직한 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 각각의 것이 한 FAR을 코딩하는 것인 복수의 제2 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이는 제1 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드와 상이한 핵산 분자일 수 있거나, 또는 제1 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드와 동일한 핵산 분자의 일부분일 수 있다.
일부 실시양태에서, 추가의 폴리뉴클레오티드는 이종성 시토크롬 b5, 예컨대, 서열 번호: 3에 기재된 시토크롬 b5, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 시토크롬 b5는 레피도프테라 종에 고유한 시토크롬 b5이다. 특정 실시양태에서, 시토크롬 b5는 헬리코베르파 종으로부터의 시토크롬 b5, 바람직하게, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5, 예컨대, 서열 번호: 4에 기재되어 있는 것, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 추가의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 3, 또는 이와 적어도 60%의 상동성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
일부 실시양태에서, 추가의 폴리뉴클레오티드는 이종성 시토크롬 b5 리덕타제, 예컨대, 서열 번호: 24에 기재된 시토크롬 b5 리덕타제, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 시토크롬 b5 리덕타제는 헬리코베르파 종에 고유한 시토크롬 b5 리덕타제이다. 특정 실시양태에서, 시토크롬 b5 리덕타제는 헬리코베르파 종으로부터의 시토크롬 b5 리덕타제, 바람직하게, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5 리덕타제, 예컨대, 서열 번호: 24에 기재되어 있는 시토크롬 b5 리덕타제, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 추가의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 또는 이와 적어도 60%의 상동성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
일부 실시양태에서, 추가의 폴리뉴클레오티드는 이종성 헤모글로빈, 예컨대, 서열 번호: 6에 기재된 헤모글로빈, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 헤모글로빈은 비트레오스킬라 종에 고유한 헤모글로빈이다. 특정 실시양태에서, 헤모글로빈은 비트레오스킬라 스테르코라리아로부터의 헤모글로빈, 예컨대, 서열 번호: 6에 기재되어 있는 헤모글로빈, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 추가의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 5, 또는 이와 적어도 60%의 상동성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
일부 실시양태에서, 추가의 폴리뉴클레오티드는 티오에스테라제, 예컨대, 서열 번호: 6에 기재된 티오에스테라제, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 티오에스테라제는 쿠페아 종에, 신나모멈 종에, 또는 에스케리키아 종에 고유한 것이다. 특정 실시양태에서, 티오에스테라제는 쿠페아 팔루스트리스, 쿠페아 후케리아나, 신나모멈 캠포라, 또는 에스케리키아 콜라이로부터의 헤모글로빈, 예컨대, 각각 서열 번호: 33, 서열 번호: 57, 서열 번호: 35 또는 서열 번호: 26에 기재되어 있는 것, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이다. 상기 실시양태에서, 추가의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 34, 서열 번호: 56, 서열 번호: 34 또는 서열 번호: 25, 이와 적어도 60%의 상동성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 상기 기술된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드, 및 임의로, 상기 기술된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이는 추가로 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 추가의 폴리뉴클레오티드를 발현한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 제1 폴리뉴클레오티드 및 임의로, 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
· 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 또는
· 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 또는
· 헤모글로빈을 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 또는
· 티오에스테라제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드 중 하나를 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, 핵산 구축물은 제1 폴리뉴클레오티드 및 임의로, 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
· 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드;
또는
· 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 헤모글로빈을 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드;
또는
· 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 티오에스테라제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드;
또는:
· 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 헤모글로빈을 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드;
또는:
· 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 티오에스테라제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드;
또는:
· 헤모글로빈을 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 티오에스테라제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, 핵산 구축물은 제1 폴리뉴클레오티드 및 임의로, 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
· 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 헤모글로빈을 코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드;
또는_
· 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 티오에스테라제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드;
또는
· 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 헤모글로빈을 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 티오에스테라제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드;
또는
· 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 헤모글로빈을 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 티오에스테라제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 제1 폴리뉴클레오티드 및 임의로, 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이는
· 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 헤모글로빈을 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드; 및
· 티오에스테라제를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드를 모두 추가로 포함한다.
핵산 구축물은 효모 세포에 본원 상기에 기술된 추가 변형 중 임의의 것을 도입하기 위한 추가의 폴리뉴클레오티드, 특히, 효모 세포에의 도입시, 천연 지방 알데히드 데히드로게나제(들), 지방 알콜 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 신타제(들)의 활성 변형을 초래하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있고; 바람직하게, 활성은 감소 또는 제거된다.
핵산 구축물은 당업계에 공지된 바와 같이, 그 안에 포함된 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 요구되거나, 또는 그를 촉진시키기 위한 것으로서, 폴리뉴클레오티드에 포함된 코딩 서열 상류에 위치하는 추가 요소, 예컨대, 프로모터, 예를 들어, 유도성, 억제성, 또는 구성적 프로모터를 포함할 수 있다.
페로몬 조성물로서의 제제
일부 실시양태에서, 본 방법은 당업계에 공지된 바와 같이, 효모 세포에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 페로몬 조성물로서 제제화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 방법에 의해 수득가능한 E8,E10 - 도데카디에닐 코엔자임 A, E8,E10 - 도데카 디엔-1-올, E8,E10 - 도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10 - 도데카디에날
본 개시내용은 또한 본 방법에 의해 수득가능한 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (또는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 전환에 의해 수득된 지질 또는 유리 지방산), E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 제공한다. 효모 세포에서의 곤충 데사투라제 및/또는 리덕타제 발현시, 생성된 생성물 믹스, 예컨대, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및/또는 E8,E10-도데카디엔-1-올을 포함하고, 세포에 의해 생산된 지방 알콜은 전형적으로 곤충의 페로몬 샘에서 생산된 것과 유사한 조성을 가질 것이다. 이를 통해, 별도의 프로세스에서 후속하여 적절한 비율로 혼합되어야 하는 개별 페로몬 성분을 제조하는 대신, 다양한 곤충에 적합한 페로몬 믹스를 제조할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 생성된 생성물 혼합물, 예컨대, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및/또는 지방 알콜은 생물학적 생산의 특징적인 부산물을 함유할 수 있다.
따라서, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 제조가 수행되는 일부 실시양태에서, 제조된 지방 아실-CoA는 적어도 1%, 예컨대, 적어도 2%, 예컨대, 적어도 3%, 예컨대, 적어도 4%, 예컨대, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 10%, 예컨대, 적어도 15%, 예컨대, 적어도 20%의, 원하는 지방 아실-CoA와 다른 또 다른 위치에서 탈포화된 탈포화된 지방 아실-CoA 및/또는 적어도 1%, 예컨대, 적어도 2%, 예컨대, 적어도 3%, 예컨대, 적어도 4%, 예컨대, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 10%, 예컨대, 적어도 15%, 예컨대, 적어도 20%의 상응하는 포화된 지방 아실-CoA를 포함한다.
E8,E10-도데카디엔-1-올 제조가 수행되는 일부 실시양태에서, 제조된 지방 알콜은 적어도 1%, 예컨대, 적어도 2%, 예컨대, 적어도 3%, 예컨대, 적어도 4%, 예컨대, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 10%, 예컨대, 적어도 15%, 예컨대, 적어도 20%의, 원하는 지방 알콜와 다른 또 다른 위치에서 탈포화된 탈포화된 지방 알콜, 및/또는 적어도 1%, 예컨대, 적어도 2%, 예컨대, 적어도 3%, 예컨대, 적어도 4%, 예컨대, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 10%, 예컨대, 적어도 15%, 예컨대, 적어도 20%의 상응하는 포화된 지방 알콜을 포함한다. 발효 브로쓰로부터 회수된 지방 알콜의 믹스가 화학적으로 알데히드로 산화되거나, 또는 아세테이트로 아세틸화되면, 이때 알데히드와 아세테이트의 상응하는 믹스가 생성된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 E8,E10-도데카디에날을 제조하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 효모 세포 및 방법을 통해 E8,E10-도데카디에날을 포함할 뿐만 아니라, 홀수 쇄 지방 알데히드도 포함하는 지방 알데히드 혼합물이 생성된다. 용어 "홀수 쇄" 지방 알데히드란, 탄소 쇄 길이가 홀수 개의 탄소 원자, 예컨대, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 또는 23개의 탄소 원자인 것인 지방 알데히드를 지칭한다. 용어 "짝수 쇄" 지방 알데히드란, 탄소 쇄 길이가 짝수 개의 탄소 원자, 예컨대, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 또는 22개의 탄소 원자인 것인 지방 알데히드를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 제조하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 효모 세포 및 방법을 통해 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 포함할 뿐만 아니라, 홀수 쇄 지방 알콜 아세테이트도 포함하는 지방 알콜 아세테이트 혼합물이 생성된다. 용어 "홀수 쇄" 지방 알콜 아세테이트란, 탄소 쇄 길이가 홀수 개의 탄소 원자, 예컨대, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 또는 23개의 탄소 원자인 것인 지방 알콜 아세테이트를 지칭한다. 용어 "짝수 쇄" 지방 알콜 아세테이트란, 탄소 쇄 길이가 짝수 개의 탄소 원자, 예컨대, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 또는 22개의 탄소 원자인 것인 지방 알콜 아세테이트를 지칭한다.
페로몬 조성물
효모 세포에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날은 당업계에 공지된 바와 같이 페로몬 조성물로서 제제화될 수 있다. 상기 페로몬 조성물은 병해충의 존재를 모니터링하는 방법, 또는 병해충의 교미를 교란시키는 방법에서 사용될 수 있는 통합 병해충 관리 생성물로서 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 페로몬 조성물은 생물농약으로서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 배양물 상에, 들판에서, 또는 과수원에서 분무 또는 분주될 수 있다. 이는 또한 당업계에 공지된 바와 같이, 예컨대, 고무 셉타 상에 침지될 수 있거나, 또는 다른 성분과 함께 혼합될 수 있다. 이는 교미를 교란시켜 병해충 번식을 방지할 수 있거나, 또는 병해충 포획용 포획 장치와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 페로몬 조성물이 사용될 수 있는 병해충의 비제한적 예로는 왕담배나방(cotton bollworm) (헬리코베르파 아르미게라), 이화명나방(striped stemborer) (킬로 수프레살리스(Chilo suppressalis)), 배추좀나방(diamond back moth) (플루텔라 크실로스텔라(Plutella xylostella)), 도둑나방(cabbage moth) (마메스트라 브라시카에(Mamestra brassicae)), 큰 양배추 송이 애벌레(large cabbage-heart caterpillar) (크로시돌로미아 비노탈리스(Crocidolomia binotalis)), 유럽 조명 나방(European corn stalk borer) (세사미아 노나그리오이데스(Sesamia nonagrioides)), 포도 유리날개알락나방(currant clearwing) (시난테돈 티풀리포르미스(Synanthedon tipuliformis)) 및 아티초크 털날개 나방(artichoke plume moth) (플라티프틸리아 카르두이닥틸라(Platyptilia carduidactyla))이 있다. 따라서, 배양시 본 발명의 조성물의 사용으로 실질적으로 환경에는 영향을 주지 않으면서, 작물 수확량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 페로몬 조성물중의 상이한 화합물의 상대적인 양은 작물 및/또는 방제하고자 하는 병해충의 성질에 따라 달라질 수 있으며; 지리적 변동도 존재할 수 있다. 따라서, 최적의 상대량을 결정하려면 통상의 최적화가 요구될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 페로몬 조성물은 예컨대, 액체 또는 고체 담체 또는 기질과 같은 하나 이상의 추가 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 담체 또는 기질은 식물성 오일, 정제된 광유 또는 이의 분획, 고무, 플라스틱, 실리카, 규조토, 왁스 매트릭스 및 셀룰로스 분말을 포함한다.
페로몬 조성물은 당업계에 공지된 바와 같이 제제화될 수 있다. 예를 들어, 이는 액제, 겔, 산제 형태일 수 있다. 페로몬 조성물은 당업계에 공지된 바와 같이 용이하게 분주될 수 있도록 제제화될 수 있다.
키트
본원에서는 본 방법을 수행하기 위한 부품들의 키트를 제공한다. 부품들의 키트는 본원에 기술된 바와 같은 "사용 준비가 된" 효모 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 효모 세포는 야로위아 세포, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 세포, 또는 사카로마이세스 세포, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지아에 세포이다.
대안적으로, 부품들의 키트는 또한 효모 세포에 도입시키고자 하는 관심 활성을 인코딩하는 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 핵산 구축물은 복수의 핵산 구축물로서, 예컨대, 각 벡터가 하나 또는 수개의 원하는 활성을 인코딩하는 것인 복수의 벡터로서 제공될 수 있다. 유용한 핵산 구축물은 상기에서 기술되었다.
부품들의 키트는 또한 부분적 또는 전체 기능 상실을 초래하는 돌연변이, 예컨대, 본원 상기 기술된 바와 같은 돌연변이 중 임의의 것을 도입하는 데 유용한 핵산 구축물을 포함할 수 있다.
부품들의 키트는 임의로, 변형시키고자 하는 효모 세포를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 부품들의 키트는 상기의 모든 것을 포함한다.
병해충의 존재를 모니터링하거나 , 또는 병해충의 교미를 교란시키는 방법
본원에 개시된 효모 세포 및 방법에 의해 생산된 E8,E10-도데카디엔-1-올 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날은 병해충의 존재를 모니터링하거나, 또는 병해충의 교미를 교란시키는 방법에 사용될 수 있다.
따라서, 본원에서는 또한
i) 본원에 기술된 방법에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 제조하는 단계;
ii) 상기 E8,E10-도데카디엔-1-올 및 임의로, 상기 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 상기 E8,E10-도데카디에날을 페로몬 조성물로서 제제화하는 단계; 및
iii) 상기 페로몬 조성물을 통합 병해충 관리 조성물로서 사용하는 단계를 포함하는, 병해충의 존재를 모니터링하거나, 또는 병해충의 교미를 교란시키는 방법도 제공한다.
본원 상기에 기술된 효모 세포 및 방법 중 임의의 것은 상기 방법에서 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 바이오브릭 구축
진아트(GeneArt) (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies))에 의해 모든 이종성 유전자를 야로위아 리폴리티카에 대해 코돈 최적화된 버전으로 합성하였다. 퓨전 U 핫 스타트 DNA 폴리머라제(Phusion U Hot Start DNA Polymerase) (써모피셔(ThermoFisher))를 이용하여 PCR에 의해 모든 유전자를 증폭시켜 효모 발현 벡터로의 클로닝을 위한 단편을 수득하였다. 프라이머는 표 1에 열거되어 있고, 생성된 DNA 단편 (바이오브릭스(BioBricks))은 표 2에 열거되어 있다. PCR 생성물을 미도리 그린 어드반스(Midori Green Advance) (니폰 제네틱스 유럽 게엠베하(Nippon Genetics Europe GmbH))를 함유하는 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 정확한 크기의 PCR 생성물을 젤로부터 절제하고, 뉴클레오스핀 겔(Nucleospin Gel) 및 PCR 클린-업(PCR Clean-up) 키트 (마쇼레이-나겔(Macherey-Nagel))를 이용하여 정제하였다.
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실시예 2: 플라스미드 구축
USER 카세트를 포함하는 통합 효모 벡터를 37℃에서 2시간 동안 패스트다이제스트(FastDigest) SfaAI (써모피셔)로 선형화한 후, 이어서, 65℃에서 1시간 동안 Nb.Bsml (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))로 닉킹하였다. 점착성 말단을 함유하는 생성된 벡터를 전기영동에 의해 분리하고, 겔로부터 절제하고, 뉴클레오스핀 겔 및 PCR 클린-업 키트 (마쇼레이-나겔)를 이용하여 겔-정제하였다. DNA 단편을 문헌 [Holkenbrink et al., 2017]에 기술된 바와 같이 USER-클로닝에 의해 상기 제조된 벡터로 클로닝하였다. 반응물을 화학적 컴피턴트 E. 콜라이 DHα 세포로 형질전환시키고, 세포를 100 mg/L 암피실린을 포함하는 리소제니 브로쓰(Lysogeny Broth: LB) 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시키고, 생성된 콜로니를 콜로니 PCR에 의해 스크리닝하였다. 밤새도록 배양된 E. 콜라이 액체 배양물로부터 플라스미드를 정제하고, 시퀀싱하여 정확한 클로닝을 확인하였다. 구축된 벡터는 표 3에 열거되어 있다.
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실시예 3: 균주 구축
문헌 [Holkenbrink et al., 2017]에 기술된 바와 같이 DNA 벡터의 형질전환에 의해 효모 균주를 구축하였다. 형질전환 전에 패스트다이제스트 NotI로 통합 벡터를 선형화하였다. 필요할 경우, 특정 게놈 영역으로의 통합을 촉진시키는 헬퍼 벡터를 표 4에 열거된 통합 플라스미드 또는 DNA 수복 단편과 함께 공동으로 형질전환시켰다. 적절한 항생제 선별을 이용하여 효모 펩톤 덱스트로스 (YPD) 아가 상에서 균주를 선별하였다. 클로니 PCR에 의해, 및 필요할 경우, 시퀀싱에 의해 정확한 유전자형을 확인하였다. Y. 리폴리티카 야생형 균주를 플라스미드 pCfB6364 (EP19204554로 형질전환시켜 균주 ST6029를 수득한 후, 이어서, 유전자 HFD1 (YALI0_F23793g), HFD2 (YALI0_E15400g), HFD3 (YALI0_A17875g), HFD4 (YALI0_B01298g), FAO1 (YALI0_B14014g), 및 PEX10 (YALI1_C01416g)을 결실시켜 균주 ST6629를 수득하였다 (문헌 [Borodina et al., 2018]). 균주 ST6029 및 ST6629는 모든 다른 균주를 구축하기 위한 모체 균주로서 사용하였다.
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실시예 4: 균주 배양, 지방산 메틸 에스테르 및 지방 알콜 추출 및 분석
균주를 YPD 아가 플레이트 (10 g/L 효모 추출물, 10 g/L 펩톤, 20 g/L 글루코스, 15 g/L 아가 아가)로부터 초기 OD600 0.1-0.2로 2.5 mL YPG 배지 (10 g/L 효모 추출물, 10 g/L 펩톤, 40 g/L 글리세롤)로 24웰 플레이트 (이지스크린(EnzyScreen))에 접종하였다. 플레이트를 28℃에서 인큐베이션시키고, 300 rpm으로 진탕시켰다. 22 h 후, 플레이트를 4℃에서 5 min 동안 3,000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 세포를 웰당 1.25 mL 생산 배지에 재현탁시켰다 (문헌 [Borodina et al., 2018]). 배지를 2.5 ㎕ 메틸 도데카노에이트로 보충하였다. 플레이트를 28℃에서 28시간 동안 인큐베이션시키고, 300 rpm으로 진탕시켰다.
지방 알콜 분석을 위해, 내부 표준으로서 990 ㎕의 에틸 아세테이트:에탄올 (84:15) 및 10 ㎕의 Z10-17:Me (2 mg/mL)를 이용하여 200 ㎕의 브로쓰를 추출하였다. 샘플을 20 sec 동안 와동시키고, 실온에서 1 h 동안 인큐베이션시킨 후, 5 min 동안 와동시켰다. 300 ㎕의 H2O를 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 와동시키고, 21℃에서 5 min 동안 3,000 x g로 원심분리하였다. 기체 크로마토그래피-질량 분석법 (GC-MS)을 통해 상부 유기상을 분석하였다. 질량 선택 검출기 HP 5973에 커플링된 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) 6890 GC 상에서 GC-MS 분석을 수행하였다. GC에 INNOWax 칼럼 (30 m x 0.25 mm x 0.25 ㎛)을 장착하였고, 헬륨을 운반 기체로 사용하였다 (평균 속도: 33 cm/초). MS는 m/z 30과 400 사이에서 스캐닝하는 전자 충격 모드 (70 eV)로 작동시켰고, 주입기는 220℃에서 비분할 모드로 구성하였다. 오븐 온도를 1 min 동안 80℃로 설정한 후, 이어서, 10℃/min의 비율로 210℃까지 증가시킨 후, 210℃에서 15 min 동안 유지시킨 후, 이어서, 10℃/min의 비율로 230℃까지 증가시킨 후, 230℃에서 20 min 동안 유지시켰다. 실험실 수집물에서 이용가능한 참조 화합물의 것과 머무름 시간 및 질량 스펙트럼을 비교함으로써 화합물을 확인하였다. 화합물을 기록된 총 이온 전류 (TIC)에 의해 정량화하였다. 애질런트 켐스테이션(Agilent ChemStation) 소프트웨어 및 iWork 넘버스(iWork Numbers)에 의해 데이터를 분석하였다.
지방산 분석을 위해, 4℃에서 5 min 동안 3,000 x g로 원심분리하여 수확하였다. 메탄올 (무수) 중 1000 ㎕ 1 M HCl로 각 펠릿을 추출하였다. 샘플을 20 sec 동안 와동시키고, 80℃ 수조에 2 h 동안 두었다. 샘플을 매 30 min마다 10 sec 동안 와동시켰다. 샘플을 실온으로 냉각시킨 후, 메탄올 (무수) 중 1000 ㎕의 1 M NaOH, 500 ㎕의 NaCl 포화된 H2O, 990 ㎕의 헥산 및 10 ㎕의 Z10-17:Me (2 mg/mL)를 내부 표준으로서 첨가하였다. 샘플을 와동시키고, 21℃에서 5 min 동안 3,000 x g로 원심분리하였다. 상기 기술된 바와 같이 GC-MS를 통해 상부 유기상을 분석하였다.
실시예 5: Y. 리폴리티카에서의 E8,E10 - C12:OH 생산
균주 ST6629로부터 유래된 균주 ST8494는 헬리코베르파 아르미게라 지방 아실 리덕타제 Har_FAR (2개의 카피로) 및 시디아 포모넬라 데사투라제 Cpo_CPRQ를 발현한다. 균주 ST6629는 지방 알콜 분해 및 저장 지질 축적 감소를 위해 조작된 Y. 리폴리티카 균주이다 (문헌 [Holkenbrink et al., 2020]).
균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하되, 단, 예외적으로, 형성된 지방 알콜 분석을 위해, 6개의 바이알 (1.25 mL)을 조합하고, 4℃에서 5 min 동안 3,000 g로 원심분리하여 수확하였다. 내부 표준에 기초하여 지방 알콜의 농도를 계산하였다.
감소된 지방 알콜 분해를 위해 조작된 균주 중에서 데사투라제 CpoCPRQ 및 지방 알콜 리덕타제 HarFAR의 발현을 조합한 균주 ST8494는 4.4 mg/L E8,E10-C12:OH를 생산하는 것으로 나타났다 (표 6).
Figure pct00025
실시예 6: Y. 리폴리티카에서의 E8,E10 - C12:Me E8,E10 - C12:OH의 생산
균주 ST8406은 균주 ST6629로부터 유래된 것이고, 이는 추가로 CpoCPRQ 데사투라제를 발현한다. ST8406으로부터 유래된 균주 ST9066은 Cpo_CPRQ를 2개의 카피로 발현한다. 균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하였다. 내부 표준에 기초하여 지방산 메틸 에스테르 및 지방 알콜의 농도를 계산하였다 (표 7-10).
C. 포모넬라 (ST9066)로부터의 데사투라제 Cpo_CPRQ의 추가 카피의 발현은 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 생산을 각각 2.8배 및 1.5배 증가시켰다 (표 7). 이는 데사투라제의 과다발현이 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 생산을 증가시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
Figure pct00026
C. 포모넬라로부터의 데사투라제 Cpo_CPRQ의 발현을, H. 아르미게라로부터의 시토크롬 b5 (HarCyb5, 서열 번호: 4)의 발현과, 또는 V. 스테르코라리아(V. stercoraria)로부터의 헤모글로빈 (VHb, 서열 번호: 6)의 발현과 조합한 균주 ST8411 및 ST8416은 C. 포모넬라로부터 데사투라제만을 발현하는 참조 균주 ST8406보다 E8,E10-C12:Me를 각각 18% 및 22% 더 많이 생산하였다. 상기 균주는 또한 E9/Z9-C12:Me 생산 증가도 보였다 (표 8). 상기 데이터는 시토크롬 b5와, 또는 헤모글로빈과 함께 데사투라제를 발현하는 것이 데사투라제만을 발현하는 균주보다 E8,E10-C12:Me를 더 많이 생산할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
Figure pct00027
H. 아르미게라 (HarCyb5) (균주 ST8411)로부터의 시토크롬 b5 이외에도 V. 스테르코라리아 (VHb) (ST9115)로부터의 헤모글로빈 발현은 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 역가를 각각 21% 및 41%씩 각각 개선시켰다 (표 9). 상기 데이터는 시토크롬 b5 및 헤모글로빈과 데사투라제의 공동 발현이 상기 3개 중 단 하나만을 발현하는 균주보다 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me를 더 많이 생산할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
Figure pct00028
A. 세게툼으로부터의 지방 아실 리덕타제 (Ase_FAR)를 발현하는 균주 ST9250은 C12:OH, E9/Z9-C12:OH 및 E8,E10-C12:OH를 생산한 반면, T. 알바(T. alba)로부터의 지방 아실 리덕타제 (Ta_FAR, 서열 번호: 8)를 발현하는 균주 ST9249는 오직 C12:OH만을 생산하는 것으로 나타났다 (표 10).
Figure pct00029
실시예 7: Δelo1 Y. 리폴리티카 균주에서의 E8,E10 - C12:Me 생산 증가
균주 ST8406에서 내재 Y. 리폴리티카 유전자 ELO1 (YALI0_F06754g, 서열 번호: 13)을 결실시켜 균주 ST9060을 수득하였다. 균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하였다. 내부 표준에 기초하여 지방산 메틸 에스테르의 농도를 계산하였다 (표 11). 균주 ST9060은 균주 ST8406과 비교하여 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 생산을 각각 2.2배 및 1.6배 증가시키는 것으로 나타났다. 상기 데이터는 엘롱가제 유전자의 결실이 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 생산을 증가시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
Figure pct00030
실시예 8: 유전자 YALI0 _ F14729g , YALI0 _ E18876g 또는 YALI0 _ D03597g의 결실을 함유하는 Y. 리폴리티카 균주에서의 E8,E10-C12:Me의 생산 증가
균주 ST8406에서 모두가 추정 티오에스테라제를 인코딩하는 것인, 내재 Y. 리폴리티카 유전자 YALI0_F14729g (서열 번호: 19), YALI0_E18876g (서열 번호: 54) 및 YALI0_D03597g (서열 번호: 55)를 결실시켜 각각 균주 ST9061, ST9062 및 ST9063을 수득하였다. 균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하였다. 내부 표준에 기초하여 지방산 메틸 에스테르의 농도를 계산하였다 (표 12). 균주 ST9061은 균주 ST8406과 비교하여 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 생산을 각각 1.6배 및 1.7배 증가시키는 것으로 나타났다. 균주 ST9062는 균주 ST8406과 비교하여 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 생산을 각각 1.2배 및 1.3배 증가시키는 것으로 나타났다. 균주 ST9063은 균주 ST8406과 비교하여 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 생산을 1.1배 증가시키는 것으로 나타났다. 상기 데이터는 내재 추정 티오에스테라제의 결실이 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 생산을 증가시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
Figure pct00031
실시예 9: 데사투라제 Cpo _ CPRQ에 아미노산 변형을 함유하는 Y. 리폴리티카 균주에서의 E8,E10-C12:Me 생산
균주 ST8406에서 단백질 Cpo_CPRQ 중 85번 위치의 아미노산을 세린 (S)에서 알라닌 (A)으로 변형시켜 균주 ST9072를 수득하였다. 균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하였다. 내부 표준에 기초하여 지방산 메틸 에스테르의 농도를 계산하였다 (표 13).
Cpo_CPRQ_S85A를 발현하는 균주 ST9072는 균주 ST8406과 비교하여 E8,E10-C12:Me 생산을 213% 증가시키는 것으로 나타났다. 상기 데이터는 Cpo_CPRQ를 조작하여 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 생산을 증가시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
Figure pct00032
실시예 10: 다른 유익한 변형과 함께 조합하여 데사투라제 Cpo _ CPRQ 중의 아미노산 변형 ( S85A )을 함유하는 Y. 리폴리티카 균주에서의 E8,E10 - C12:Me 및 E8,E10-C12:OH 생산
ST9060으로부터 유래된 균주 ST9278은 2 카피의 Cpo_CPRQ 및 ELO1 결실을 함유한다. ST9060으로부터 유래된 균주 ST9279는 1 카피의 Cpo_CPRQ, 1 카피의 Cpo_CPRQ_S85A 및 ELO1 결실을 함유한다.
균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하였다. 내부 표준에 기초하여 지방산 메틸 에스테르의 농도를 계산하였다 (표 14).
2 카피의 Cpo_CPRQ를 발현하고, ELO1 유전자에 결실을 갖는 균주 ST9278은 1 카피의 Cpo_CPRQ, 1 카피의 Cpo_CPRQ_S85A를 발현하고, ELO1 유전자에 결실을 갖는 균주 ST9279와 비교하여 E9/Z9-C12:Me 및 E8,E10-C12:Me를 더 적게 생산하는 것으로 나타났다.
Figure pct00033
ST9279로부터 유래된 균주 ST9355는 다른 변형 이외에도 VHb 및 HarCyb5를 발현한다. ST9355로부터 유래된 균주 ST9356은 다른 변형 이외에도 HarCyb5 및 HarCyb5 리덕타제 (서열 번호: 24)를 발현한다. ST9356으로부터 유래된 균주 ST9357은 다른 변형 이외에도 내재 Y. 리폴리티카 유전자 YALI0_F14729g의 결실을 함유한다. ST9357로부터 유래된 균주 ST9358은 다른 변형 이외에도 Ase_FAR을 발현한다. ST9279로부터 유래된 균주 ST9387은 다른 변형 이외에도 Ase_FAR을 발현한다. 균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하였다. 내부 표준에 기초하여 지방산 메틸 에스테르 및 지방 알콜의 농도를 계산하였다 (표 15 및 16).
Figure pct00034
Figure pct00035
상기 데이터는 유익한 변형을 조합하여 더 높은 역가의 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 뿐만 아니라, E8,E10-C12:OH 및 E9/Z9-C12:OH를 달성할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 11: 리덕타제 Ase _FAR에 아미노산 변형을 함유하는 균주에서의 E8,E10-C12:OH 생산
균주 ST9250에서 단백질 Ase_FAR 중 198번 위치의 아미노산을 트레오닌 (T)에서 알라닌 (A)으로 변형시켜 균주 ST9335를 수득하였다. 균주 ST9250에서 단백질 Ase_FAR 중 423번 위치의 아미노산을 세린 (S)에서 알라닌 (A)으로 변형시켜 균주 ST9336을 수득하였다. 균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하였다. 내부 표준에 기초하여 지방 알콜의 농도를 계산한다 (표 13).
실시예 12: 지방산 신타제 1 ( FAS1 ) 및 지방산 신타제 2 ( FAS2 )에 아미노산 변형을 함유하는 Y. 리폴리티카 균주에서의 E8,E10 - C12:OH 생산
균주 ST9387에서 Y. 리폴리티카의 FAS2 (서열 번호: 18) 중 1220번 위치의 아미노산을 이소류신 (I)에서 페닐알라닌 (F)으로 변형시켜 균주 ST9388을 수득하였다. 균주 ST9387에서 Y. 리폴리티카의 FAS2 중 1220번 위치의 아미노산을 이소류신 (I)에서 트립토판 (W)으로 변형시켜 균주 ST9420을 수득하였다. 균주 ST9420에서 Y. 리폴리티카의 FAS1 (서열 번호: 16) 중 123번 위치의 아미노산을 류신 (L)에서 발린 (V)으로 변형시켜 균주 ST9421을 수득하였다. 균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하되, 단, 예외적으로, 생산 배지에 메틸 도데카노에이트를 첨가하지 않는다. 내부 표준에 기초하여 지방 알콜의 농도를 계산한다.
실시예 13: Y. 리폴리티카의 FAS2 중 아미노산 변형을 함유하는 Y. 리폴리티 카 균주에서의 E8,E10 - C12:OH 뿐만 아니라 , C12 지방산 형성을 위해 E. 콜라이로부 터의 티오에스테라제
균주 ST9397은 Y. 리폴리티카로부터의 FAS1의 말단절단된 버전 및 E. 콜라이로부터의 티오에스테라제 TesA의 말단절단된 버전의 융합물을 발현한다 (Xu et al., 2016) (서열 번호: 59). 균주 ST9397을 Y. 리폴리티카로부터의 지방 아실-CoA 신타제를 함유하는 플라스미드로 형질전환시켜 균주 ST9398을 수득한다. 균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하되, 단, 예외적으로, 유리관을 사용하였고, 지방 알콜을 전체 브로쓰로부터 추출하였다. 내부 표준에 기초하여 지방 알콜의 농도를 계산한다 (표 17).
Y. 리폴리티카로부터의 지방 아실-CoA 신타제의 발현은 E8,E10-12:OH 생산에 유의적인 영향을 미치지 않았다.
Figure pct00036
실시예 14: Y. 리폴리티카에서 퍼옥시좀에서의 쇄 단축을 통한 E8,E10 -C12:OH 생산
균주 ST9395에서 C12:CoA 전구체의 양을 증가시키기 위해, Y. 리폴리티카의 내재 퍼옥시좀 옥시다제 5개: POX1, POX2, POX3, POX4 및 POX5 (각각 YALI0_E32835g, YALI0_F10857g, YALI0_E32835g, YALI0_E27654g, YALI0_E27654g)를 결실시키고, 대신 예를 들어, 쿠쿠르비타 막시마로부터의 Cma_POX (서열 번호: 47)와 같은 이종성 퍼옥시좀 옥시다제를 발현한다.
Δ9-12:CoA 전구체의 양을 증가시키기 위해, 상기 언급된 균주는 추가로 예를 들어, 코리스토네우라 로사세아나로부터의 CroZ11 (서열 번호: 63), 또는 코리스토네우라 파랄레라로부터의 CpaE11 (서열 번호: 65)과 같은 Δ11-14 데사투라제를 발현한다. 이에 의해, Z/E11-14:CoA가 생산되고, Z/E9-12:CoA로 단축되고, 이는 이어서, 데사투라제 Cpo_CPRQ (서열 번호: 1)에 의해 E8,E10-C12로 추가로 전환된다.
균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석한다. 균주 ST9600, ST9607 및 ST9616의 배양물을 메틸 미리스테이트로 보충한다. 내부 표준에 기초하여 지방 알콜의 농도를 계산한다.
실시예 15: 사카로마이세스 세레비지아에에서의 E8,E10 - C12:Me E8,E10 -C12:OH 생산
프라이머 attB1_Cpo_CPRQ_F 및 attB1_Cpo_CPRQ_R을 사용하여 시디아 포모넬라 페로몬 샘 조직의 cDNA로부터 데사투라제 유전자 Cpo_CPRQ를 증폭시켰다.
PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 위자드 SV 겔(Wizard SV Gel) 및 PCR 클린 업 시스템(PCR Clean up system) (프로메가 바이오테크 AB(Promega Biotech AB: 스웨덴))을 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA는 게이트웨이 클로닝(Gateway Cloning) 기술 (라이프 테크놀러지즈)에 의해 pDONR221 벡터로 클로닝하였다. 생성된 벡터를 생어(Sanger) 시퀀싱에 의해 확인하고, 유전자를 벡터 pYEX-CHT로 서브클로닝하고 (문헌 [Patel et al, 2003]), 이어서, OLE1 및 ELO1 결핍 (MATa elo1 :: HIS3 ole1 :: LEU2 ade2 his3 leu2 ura3) 사카로마이세스 세레비지아에 균주로 형질전환하였다 (문헌 [Schneiter et al., 2000]). 양성 형질전환체의 선별을 위해, 세포를 0.7% YNB (황산암모늄 포함), 우라실 및 류신이 결여된 드롭-아웃(drop-out) 배지 (포르미디엄 LTD(Formedium LTD: 영국)), 2% 글루코스, 1% 테르지톨 (타입 노니데트 NP-40(Nonidet NP-40), 시그마-알드리치: 스웨덴), 0.01% 아데닌 (시그마-알드리치: 스웨덴) 및 0.5 mM 올레산 (시그마-알드리치: 스웨덴)을 함유하는 합성 완전 배지 상에서 배양하였다. 30℃에서 4일 동안 플레이트를 인큐베이션시킨 후, 개별 콜로니를 10 ml 선별 배지에 접종하였다. 배양물을 30℃에서 48 h 동안 인큐베이션시키고, 이를 사용하여 0.5 mM 지방산 메틸 에스테르 전구체 보충과 함께 2 mM CuSO4를 함유하는 10 ml 선별 배지에 OD600 0.4로 접종하였다. 48 h 동안의 인큐베이션 후, 3000 rpm으로 원심분리하여 세포를 수확하였다. 배지 상청액을 폐기하고, 유리관 중에서 3.75 ml의 메탄올/클로로포름 (2:1, v/v)을 사용하여 전체 지질을 추출하였다. 1 ml의 HAc (0.15 M) 및 1.25 ml의 물을 첨가하고, 상기 관을 와동시켰다. 상기 관을 2 min 동안 2000 rpm으로 원심분리하고, 하단의 클로로포름 상을 새 유리관으로 옮겼다. 지질을 지방산 메틸 에스테르 (FAME)로 전환시키기 위해, 질소 유동하에 용매를 증발시켰다. 메탄올 중 1 ml의 2% 황산을 첨가하고, 현탁액을 와동시키고, 90℃에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 1 ml의 물을 첨가하고, 혼합하고, 1 ml의 헥산을 사용하여 FAME를 추출하였다. 질량 선택 검출기 HP 5973에 커플링된 휴렛 팩커드 6890 GC 상에서 샘플에 대해 GC-MS 분석을 수행하였다. GC에 HP-88 칼럼 (30 m x 0.25 mm x 0.25 ㎛)을 장착하였고, 헬륨을 운반 기체로 사용하였다 (평균 속도: 33 ms). MS는 전자 충격 모드 (70 eV)로 작동시켰고, 주입기는 220℃에서 비분할 모드로 구성하였다. 오븐 온도를 1 min 동안 80℃로 설정한 후, 이어서, 10℃/min의 비율로 210℃까지 증가시킨 후, 210℃에서 15 min 동안 유지시킨 후, 이어서, 10℃/min의 비율로 230℃까지 증가시킨 후, 230℃에서 20 min 동안 유지시켰다. 참조 표준으로서, 베도우키안(Bedoukian: 미국)로부터 E8,E10-12:OAc를 구입하고, 메탄올 중 0.5 M KOH 용액을 사용하여 가수분해하여 상응하는 알콜로 전환시켰다. 지방 알콜을 (문헌 [Bjostad and Roelofs, 1984])에 기술된 바와 같이 디메틸포름아미드 중 피리디늄 디크로메이트를 이용하여 상응하는 산으로 산화시켰다.
도 2의 크로마토그램은 E9-12:Me 및 E8,E10-12:Me가 Cpo_CPRQ를 발현하는 S. 세레비지아에 균주에서 각각 12:Me 및 E9-12:Me로부터 생성될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 16: Y. 리폴리티카에서의 Cpo _ SPTQ , Cpo _ NPVE Cpo _ CPRQ에 의한 E8,E10-C12:Me 생산
ST6629로부터의 유래된 균주 ST10136은 1 카피의 Cpo_SPTQ를 발현한다. ST6629로부터의 유래된 균주 ST10137은 1 카피의 Cpo_NPVE를 발현한다. ST8406으로부터의 유래된 균주 ST9064는 1 카피의 Cpo_CPRQ 및 1 카피의 Cpo_SPTQ를 발현한다. ST8406으로부터의 유래된 균주 ST9065는 1 카피의 Cpo_CPRQ 및 1 카피의 Cpo_NPVE를 발현한다. ST8406으로부터의 유래된 균주 ST9066은 2 카피의 Cpo_CPRQ를 발현한다. ST9065로부터의 유래된 균주 ST10138은 1 카피의 Cpo_CPRQ, 1 카피의 Cpo_NPVE 및 1 카피의 Cpo_SPTQ를 발현한다.
균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하였다. 내부 표준에 기초하여 지방산 메틸 에스테르의 농도를 계산하였다 (표 18).
Cpo_SPTQ (ST10136)의 발현은 E9-C12:Me, Z9-C12:Me 또는 E8,E10-C12:Me 생산으로 이어지지 못했다. Cpo_NPVE (ST10137)의 발현으로 E9-C12:Me 및 Z9-C12:Me는 생산되었지만, E8,E10-C12:Me는 생산되지 못했다. ST8406 (각각 ST9064 및 ST9065)에서의 Cpo_SPTQ 또는 Cpo_NPVE의 추가 발현은 E8,E10-C12:Me를 증가시키지 못했다. ST8406 (ST9066)에서의 Cpo_CPRQ의 추가 카피의 발현은 E8,E10-C12:Me 및 E9/Z9-C12:Me 생산을 각각 2.8배 및 2.1배 증가시켰다. Cpo_CPRQ, Cpo_SPTQ 및 Cpo_NPVE (ST10138)의 조합 발현은 ST8406과 비교하여 E8,E10-C12:Me를 증가시키지 못했다. 이는 오직 Cpo_CPRQ의 발현만이 E8,E10-C12:Me를 생산한다는 것을 보여주는 것이다.
Figure pct00037
실시예 17: 다중 카피의 생합성 효소를 발현함으로써 E8,E10 - C12:OH 생산
균주 ST9358은 실시예 10에 설명되어 있다. 균주 ST9495는 균주 ST9357 (실시예 10에 기술)로부터 유래된 것이고, 이는 데사투라제 Cpo_CPRQ 및 지방 아실 리덕타제 Ase_FAR 유전자의 추가 카피를 발현한다. 균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하되, 단, 예외적으로, 유리관을 사용하였고, 지방 알콜을 전체 브로쓰로부터 추출하였다. 내부 표준에 기초하여 지방 알콜의 농도를 계산한다.
표 19는 추가 카피의 Cpo_CPRQ 및 Ase_FAR 유전자의 추가 카피가 E8,E10-12:OH 생산을 7.1 mg/L로 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다.
Figure pct00038
실시예 18: 다양한 지방 아실 리덕타제 발현에 의해 코들레몬 생산
균주 ST9358 및 ST9623은 균주 ST9357로부터 유래된 것이다. 이는 각각 아그로티스 세게툼 및 아그로티스 입실론으로부터의 지방 아실 리덕타제를 추가로 발현한다. 균주를 실시예 4에 기술된 바와 같이 배양하고, 추출하고, 분석하였다.
표 20의 결과는 두 지방 아실 리덕타제 모두 E9-C12:OH 및 E8,E10-C12:OH를 생산할 수 있다는 것을 보여준다.
Figure pct00039
서열
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
참고문헌
Figure pct00044
Figure pct00045
항목
1. E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 효모 세포로서, 상기 효모 세포는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제를 발현하고, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)이고, 임의로, 여기서, 효모 세포는 블라케슬레아, 칸디다, 크립토코쿠스, 쿤닝하멜라, 리포마이세스, 모르티에렐라, 무코르, 피코마이세스, 피시움, 로도스포리디움, 로도토룰라, 트리코스포론, 사카로마이세스 및 야로위아로부터 선택되는 속에 속하고, 임의로, 여기서, 효모 세포는 블라케슬레아 트리스포라, 칸디다 풀케리마, C. 레브카우피, C. 트로피칼리스, 크립토코쿠스 쿠르바투스, 쿤닝하멜라 에키눌라타, C. 엘레간스, C. 자포니카, 리포마이세스 스타키, L. 리포페루스, 모르티에렐라 알피나, M. 이사벨리나, M. 라만니아나, M. 비나세아, 무코르 키르키넬로이데스, 피코마이세스 블라케스레아누스, 피시움 이레굴라레, 로도스포리디움 토룰로이데스, 로도토룰라 글루티니스, R. 그라실리스, R. 그라미니스, R. 무실라기노사, R. 피니콜라, 트리코스포론 풀란스, T. 쿠타네움, 사카로마이세스 세레비지아에 및 야로위아 리폴리티카로부터 선택되는 종에 속하고, 바람직하게, 효모 세포는 야로위아 리폴리티카 세포 또는 사카로마이세스 세레비지아에 세포인 것인 효모 세포.
2. E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 효모 세포로서, 상기 효모 세포는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제를 발현하고, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 효모 세포.
3. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있고, 상기 효모 세포는 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 추가로 발현하는 것인 효모 세포.
4. E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 효모 세포로서, 상기 효모 세포는
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 이종성 데사투라제; 및
ii) 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 발현하는 것인 효모 세포.
5. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 블라케슬레아 속, 칸디다 속, 크립토코쿠스 속, 쿤닝하멜라 속, 리포마이세스 속, 모르티에렐라 속, 무코르 속, 피코마이세스 속, 피시움 속, 로도스포리디움 속, 로도토룰라 속, 트리코스포론 속, 사카로마이세스 속 및 야로위아 속으로부터 선택되는 속에 속하는 것인 효모 세포.
6. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 블라케슬레아 트리스포라, 칸디다 풀케리마, C. 레브카우피, C. 트로피칼리스, 크립토코쿠스 쿠르바투스, 쿤닝하멜라 에키눌라타, C. 엘레간스, C. 자포니카, 리포마이세스 스타키, L. 리포페루스, 모르티에렐라 알피나, M. 이사벨리나, M. 라만니아나, M. 비나세아, 무코르 키르키넬로이데스, 피코마이세스 블라케스레아누스, 피시움 이레굴라레, 로도스포리디움 토룰로이데스, 로도토룰라 글루티니스, R. 그라실리스, R. 그라미니스, R. 무실라기노사, R. 피니콜라, 트리코스포론 풀란스, T. 쿠타네움, 사카로마이세스 세레비지아에 및 야로위아 리폴리티카로부터 선택되는 종에 속하는 것인 효모 세포.
7. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 야로위아 속 또는 사카로마이세스 속의 것이고, 바람직하게, 효모 세포가 야로위아 리폴리티카 세포 또는 사카로마이세스 세레비지아에 세포인 것인 효모 세포.
8. 전술한 항목 중 하나에 따라, 적어도 하나의 데사투라제가 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77), 또는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 서열 번호: 77 또는 서열 번호: 2와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이고, 바람직하게, 적어도 하나의 데사투라제가 Cpo_CPRQ 또는 이의 기능성 변이체이거나; 또는 적어도 하나의 데사투라제가 적어도 2개의 데사투라제이고, 여기서, 상기 2개의 데사투라제 중 적어도 하나는 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77), 또는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 서열 번호: 77 또는 서열 번호: 2와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이고, 바람직하게, 적어도 하나의 데사투라제는 Cpo_CPRQ 또는 이의 기능성 변이체이고, 및 다른 데사투라제는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 데사투라제, 예컨대, Z9-12 데사투라제, 바람직하게 Cpo_NPVE (서열 번호: 67), 또는 Cpo_SPTQ (서열 번호: 69), 또는 서열 번호: 67 또는 서열 번호: 69와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체인 것인 효모 세포.
9. 전술한 항목 중 하나에 따라, 데사투라제가 85번 위치에 돌연변이, 예컨대 S85A 돌연변이, 를 갖는 Cpo_CPRQ의 돌연변이체인 효모 세포.
10. 전술한 항목 중 하나에 따라, 적어도 하나의 이종성 데사투라제가 적어도 2개의 상이한 이종성 데사투라제, 예컨대, 서열 번호: 2에 기재된 바와 같은 Cpo_CPRQ, 및 85번 위치에 돌연변이, 예컨대 S85A 돌연변이, 를 갖는 Cpo_CPRQ의 돌연변이체인 효모 세포.
11. 전술한 항목 중 하나에 따라, 지방 아실-CoA 리덕타제가 Ase_FAR (서열 번호: 10), Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호: 12), Cpo_FAR (서열 번호: 76), 및 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 효모 세포.
12. 전술한 항목 중 하나에 따라, 지방 아실-CoA 리덕타제가 Ase_FAR의 돌연변이체, 예컨대, 198번 또는 413번 위치에 돌연변이, 바람직하게 T198A 돌연변이 또는 S413A 돌연변이, 를 갖는 돌연변이체인 효모 세포.
13. 전술한 항목 중 하나에 따라, 이종성 데사투라제가 높은 수준으로 발현되는 것인 효모 세포.
14. 전술한 항목 중 하나에 따라, 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제가 높은 수준으로 발현되는 것인 효모 세포.
15. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 E8,E10-C12:CoA의 이용가능성을 증가시키도록 추가로 변형되는 것인 효모 세포.
16. 전술한 항목 중 하나에 따라, 이종성 시토크롬 b5, 예컨대, 레피도프테라 종으로부터의 시토크롬 b5, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5, 바람직하게, 서열 번호: 4에 기재된 시토크롬 b5 HarCyb5, 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 추가로 발현하는 효모 세포.
17. 전술한 항목 중 하나에 따라, 이종성 시토크롬 b5 리덕타제 (EC 1.6.2.2), 예컨대, 레피도프테라 종, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5 리덕타제를 추가로 발현하고, 바람직하게, 시토크롬 b5 리덕타제는 서열 번호: 24에 기재된, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5 리덕타제, 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체인 것인 효모 세포.
18. 전술한 항목 중 하나에 따라, 헤모글로빈, 예컨대, 비트레오스킬라 스테르코라리아로부터의 헤모글로빈, 바람직하게, 서열 번호: 6에 기재된, 비트레오스킬라 스테르코라리아로부터의 헤모글로빈, 또는 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 추가로 발현하는 효모 세포.
19. 전술한 항목 중 하나에 따라, 엘롱가제를 인코딩하고, 엘롱가제 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 예컨대, Elo1 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 ELO1 유전자 (서열 번호: 13)의 돌연변이를 추가로 포함하고, 바람직하게, 여기서, 상기 돌연변이는 결실인 것인 효모 세포.
20. 전술한 항목 중 하나에 따라, 티오에스테라제를 코딩하고, 티오에스테라제 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 예컨대, YAL10_F14729g 유전자 (서열 번호: 19)의 돌연변이, YALI0_E18876g 유전자 (서열 번호: 54)의 돌연변이, 또는 YALI0 _ D03597g (서열 번호: 55)의 돌연변이를 추가로 포함하고, 바람직하게, 여기서, 상기 돌연변이는 결실인 것인 효모 세포.
21. 전술한 항목 중 하나에 따라, 적어도 하나의 변형, 예컨대, Hfd1, Hfd2, Hfd3, Hfd4, Fao1, GPAT 및 Pex10 중 적어도 하나의 활성 감소를 초래하는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하거나, 또는 적어도 하나의 변형, 예컨대, 적어도 하나의 단백질의 활성 감소를 초래하고, 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 75%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 81%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 82%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 83%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 84%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 85%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 86%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 87%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 88%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 89%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 90%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 91%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 92%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 93%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 94%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 95%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 96%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 97%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 98%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 효모 세포.
22. 전술한 항목 중 하나에 따라, 여기서, 효모 세포가 변형된 케톤 신타제 도메인을 갖는 지방 아실 신타제 변이체를 추가로 발현하고, 여기서, 상기 지방 아실 신타제 변이체는 Fas1 (서열 번호: 16), 또는 Fas2 (서열 번호: 18)의 변이체, 예컨대, 123번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Fas1, 바람직하게, L123V 돌연변이, 또는 1220번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Fas2, 바람직하게, I1220F 또는 I1220W 돌연변이인 것인 효모 세포.
23. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 티오에스테라제, 예컨대, 이종성 티오에스테라제를 추가로 발현하고, 임의로, 여기서, 티오에스테라제가 높은 수준으로 발현하는 것인 효모 세포.
24. 항목 23에 따라, 티오에스테라제가 서열 번호: 33에 기재된, 쿠페아 팔루스트리스로부터의 티오에스테라제, 서열 번호: 57에 기재된, 쿠페아 후케리아나로부터의 티오에스테라제, 서열 번호: 35에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터의 티오에스테라제, 또는 서열 번호: 26에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터의 티오에스테라제와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖고, 바람직하게, 티오에스테라제가 서열 번호: 35에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터의 티오에스테라제, 또는 서열 번호: 26에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터의 티오에스테라제와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
25. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 말단절단된 지방 아실 신타제 및 말단절단된 티오에스테라제의 융합 단백질, 예컨대, 서열 번호: 59에 기재된 융합 단백질, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 추가로 발현하는 것인 효모 세포.
26. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 상기 이종성 데사투라제를 인코딩하는 핵산 및 상기 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인 효모 세포.
27. 항목 26에 따라, 이종성 데사투라제를 인코딩하는 핵산 및/또는 상기 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제를 인코딩하는 핵산이 높은 카피수로 존재하는 것인 효모 세포.
28. 항목 26 내지 27 중 하나에 따라, 상기 이종성 데사투라제를 인코딩하는 핵산이 서열 번호: 1에 기재된 것, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체, 또는 서열 번호: 78에 기재된 것, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체인 것인 효모 세포.
29. 항목 26 내지 28 중 하나에 따라, 상기 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제를 인코딩하는 핵산이 서열 번호: 9에 기재된 것, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체인 것인 효모 세포.
30. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 상기 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 핵산, 상기 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 핵산, 상기 헤모글로빈을 인코딩하는 핵산, 상기 지방산 신타제 변이체를 인코딩하는 핵산, 상기 티오에스테라제를 인코딩하는 핵산, 및/또는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인 효모 세포.
31. 항목 30에 따라, 상기 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 핵산, 상기 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 핵산, 상기 헤모글로빈을 인코딩하는 핵산, 상기 지방산 신타제 변이체를 인코딩하는 핵산, 및/또는 상기 티오에스테라제를 인코딩하는 핵산이 높은 카피수로 존재하는 것인 효모 세포.
32. 전술한 항목 중 하나에 따라, 상기 이종성 데사투라제를 코딩하는 핵산, 상기 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제를 인코딩하는 핵산, 상기 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 핵산, 상기 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 핵산, 상기 헤모글로빈을 인코딩하는 핵산, 상기 지방산 신타제 변이체를 인코딩하는 핵산, 및/또는 상기 티오에스테라제를 인코딩하는 핵산이 효모 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인 효모 세포.
33. 항목 30 내지 32 중 하나에 따라, 상기 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 핵산이 서열 번호: 3에 기재된 것, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체이고/거나, 상기 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 핵산이 서열 번호: 23에 기재된 것, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체이고/거나, 상기 헤모글로빈을 인코딩하는 핵산이 서열 번호: 5에 기재된 것, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체이고/거나, 상기 티오에스테라제를 코딩하는 핵산이 서열 번호: 25 또는 서열 번호: 34에 기재된 것, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 서열 번호: 25 또는 서열 번호: 34의 동족체인 것인 효모 세포.
34. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 적어도 0.5 mg/L, 예컨대, 적어도 0.6 mg/L, 예컨대, 적어도 0.7 mg/L, 예컨대, 적어도 0.8 mg/L, 예컨대, 적어도 0.9 mg/L, 예컨대, 적어도 1 mg/L, 예컨대, 적어도 1.5 mg/L, 예컨대, 적어도 2.5 mg/L, 예컨대, 적어도 5.0 mg/L, 예컨대, 적어도 10 mg/L, 예컨대, 적어도 15 mg/L, 예컨대, 적어도 20 mg/L, 예컨대, 25 mg/L, 예컨대, 적어도 50 mg/L, 예컨대, 적어도 100 mg/L, 예컨대, 적어도 250 mg/L, 예컨대, 적어도 500 mg/L, 예컨대, 적어도 750 mg/L, 예컨대, 적어도 1 g/L, 예컨대, 적어도 2 g/L, 예컨대, 적어도 3 g/L, 예컨대, 적어도 4 g/L, 예컨대, 적어도 5 g/L, 예컨대, 적어도 6 g/L, 예컨대, 적어도 7 g/L, 예컨대, 적어도 8 g/L, 예컨대, 적어도 9 g/L, 예컨대, 적어도 10 g/L 이상의 역가로 E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 것인 효모 세포.
35. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환시킬 수 있는 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.84)를 추가로 발현하고, 이로써, 효모 세포는 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 생산할 수 있는 것인 효모 세포.
36. 항목 35에 따라, 아세틸트랜스퍼라제가 상기 효모 세포로부터 발현된 이종성 아세틸트랜스퍼라제 (AcT), 또는 상기 효모 세포로부터 과다발현된 천연 아세틸트랜스퍼라제인 것인 효모 세포.
37. 항목 35 또는 36 중 하나에 따라, 아세틸트랜스퍼라제가 Sc_Atf1 (서열 번호: 37), 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, Sc_Atf1 (서열 번호: 37)과 적어도 61%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 62%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 63%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 64%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 66%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 67%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 68%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 69%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 변이체인 것인 효모 세포.
38. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시킬 수 있는 알데히드 형성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.50), 알콜 데히드로게나제 (EC 1.1.1.2) 및/또는 지방 알콜 옥시다제 (EC 1.1.3.20)를 추가로 발현하는 것인 효모 세포.
39. 전술한 항목 중 하나에 따라, 효모 세포가 추가로
i) 하나 이상의 천연 아실-CoA 옥시다제의 활성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖고;
ii) 지방 아실-CoA를 산화시킬 수 있는 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제를 포함하는 적어도 하나의 효소 군을 발현하고, 여기서, 효소 군은 제1 탄소 쇄 길이가 X인 지방 아실-CoA를 제2 탄소 쇄 길이 X'인 단축된 지방 아실-CoA로 단축시킬 수 있고, 여기서, X' ≤ X-2인 것인 것인 효모 세포.
40. 항목 39에 따라, X'=12인 것인 효모 세포.
41. 항목 39 내지 40 중 하나에 따라, 효모 세포가 탄소 쇄 길이가 X인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 데사투라제, 예컨대, CroZ11 데사투라제 (서열 번호: 63), 또는 CpaE11 데사투라제 (서열 번호: 65), 또는 서열 번호: 63, 서열 번호: 65와 적어도 65%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 71%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 추가로 발현하는 것인 효모 세포.
42. 항목 39 내지 42 중 하나에 따라, i)의 천연 아실-CoA 옥시다제 및/또는 ii)의 아실-CoA 옥시다제가 퍼옥시좀 아실-CoA 옥시다제인 것인 효모 세포.
43. 항목 39 내지 41 중 하나에 따라, ii)의 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제가 천연 아실-CoA 옥시다제 또는 이종성 아실-CoA 옥시다제이고, 이는 임의로, 상기 적어도 하나의 효소 군을 발현하지 않는 참조 효모 균주와 비교하여 과다발현되고, 바람직하게, ii)의 효소 군의 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제가 이종성 아실-CoA 옥시다제인 것인 효모 세포.
44. 항목 39 내지 43 중 하나에 따라, ii)의 효소 군이 야로위아 속, 아그로티스 속, 아라비돕시스 속, 아스페르길루스 속, 쿠쿠르비타 속, 호모 사피엔스 속, 파에나트로박터 속 및 라투스 속으로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래된 아실-CoA 옥시다제를 포함하고, 바람직하게, 적어도 하나의 제1 효소 군이 야로위아 리폴리티카, 아그로티스 세게툼, 아라비돕시스 탈리아나, 아스페르길루스 니둘란스, 쿠쿠르비타 막시마, 호모 사피엔스, 파에나트로박터 우레아파키엔스 또는 라투스 노르베기쿠스로부터 유래된 아실-CoA 옥시다제를 포함하고, 바람직하게, 제1 효소 군의 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제가 Yli_POX1 (XP_504703), Yli_POX2 (XP_505264), Yli_POX3 (XP_503244), Yli_POX4 (XP_504475), Yli_POX5 (XP_502199), Yli_POX6 (XP_503632), Ase_POX (서열 번호: 39), Ath_POX1 (서열 번호: 41), Ath_POX2 (서열 번호: 43), Ani_POX (서열 번호: 45), Cma_POX (서열 번호: 47), Hsa_POX1-2 (서열 번호: 49), Pur_POX (서열 번호: 51), Sc_POX1 (서열 번호: 31) 및 Rno_POX2 (서열 번호: 53)로 구성된 군으로부터 선택되는 아실-CoA 옥시다제, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 65%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체인 것인 효모 세포.
45. 효모 세포를 제공하는 단계, 및 배지 중에서 효모 세포를 인큐베이션시켜 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 제조하는 단계를 포함하고, 여기서, 효모 세포는
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 이종성 데사투라제; 및
ii) 임의로, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 발현하는 것인,
효모 세포에서 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 제조하는 방법.
46. 항목 45에 따라, 효모 세포가 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 것인 방법.
47. 항목 45 내지 46 중 하나에 따라, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A를 지질, 예컨대, 트리아실글리세리드로, 또는 유리 지방산으로 전환시키는 단계, 상기 지질 또는 유리 지방산을 회수하는 단계, 및 상기 지질 또는 유리 지방산을 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
48. 항목 45 내지 47 중 하나에 따라, 상기 E8,E10-도데카디엔-1-올을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
49. 항목 45 내지 48 중 하나에 따라, 아세틸트랜스퍼라제의 발현에 의해, 또는 화학적 전환에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
50. 항목 49에 따라, 아세틸트랜스퍼라제가 상기 효모 세포로부터 발현된 이종성 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.84) 또는 상기 효모 세포로부터 과다발현된 천연 아세틸트랜스퍼라제이고, 여기서, 상기 아세틸트랜스퍼라제가 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환시켜 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 추가로 생성할 수 있는 것인 방법.
51. 항목 50에 따라, 아세틸트랜스퍼라제가 Sc_Atf1 (서열 번호: 37), 또는 Sc_Atf1 (서열 번호: 37)과 적어도 75%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 85%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 90%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 91%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 92%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 93%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 94%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 95%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 96%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 97%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 98%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 100%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 변이체인 것인 방법.
52. 항목 45 내지 51에 따라, 상기 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
53. 항목 45 내지 52에 따라, E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시킬 수 있는 알데히드 형성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.50), 알콜 데히드로게나제 (EC 1.1.1.2) 및/또는 지방 알콜 옥시다제 (EC 1.1.3.20)의 발현에 의해, 또는 화학적 전환에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시켜 E8,E10-도데카디에날을 추가로 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
54. 항목 53에 따라, 상기 E8,E10-도데카디에날을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
55. 항목 45 내지 54 중 하나에 따라, 배지가 수용액 중 이의 클라우드 농도 이상인 양으로 추출제를 포함하고, 여기서, 추출제는 비이온성 에톡실화된 계면활성제, 예컨대, 소포제, 바람직하게, 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 폴레에테르 분산액의 혼합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트를 포함하는 소포제, 예컨대, 시메티콘, 지방 알콜 알콕실레이트, 폴리에톡실화된 계면활성제 및 에톡실화 및 프로폭실화된 C16-C18 알콜계 소포제 및 이의 조합으로부터 선택되는 폴리에톡실화된 계면활성제인 것인 방법.
56. 항목 55에 따라,
- 비이온성 에톡실화된 계면활성제가 에톡실화 및 프로폭실화된 C16-C18 알콜계 소포제, 예컨대, C16-C18 알킬 알콜 에톡실레이트 프로폭실레이트 (CAS 번호 68002-96-0)이고, 여기서, 배양 배지가 적어도 1% vol/vol의 C16-C18 알킬 알콜 에톡실레이트 프로폭실레이트, 예컨대, 적어도 1.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 2% vol/vol, 예컨대, 적어도 2.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 3% vol/vol, 예컨대, 적어도 3.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 4% vol/vol, 예컨대, 적어도 5% vol/vol, 예컨대, 적어도 6% vol/vol, 예컨대, 적어도 7% vol/vol, 예컨대, 적어도 8% vol/vol, 예컨대, 적어도 9% vol/vol, 예컨대, 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 12.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 17.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 22.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 27.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol이상의 C16-C18 알킬 알콜 에톡실레이트 프로폭실레이트를 포함하고/거나,
- 비이온성 에톡실화된 계면활성제가 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 예를 들어, 콜리포르® P407 (CAS 번호 9003-11-6)이고, 여기서, 배양 배지가 적어도 10% vol/vol의 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 예컨대, 콜리포르® P407, 예컨대, 적어도 11% vol/vol, 예컨대, 적어도 12% vol/vol, 예컨대, 적어도 13% vol/vol, 예컨대, 적어도 14% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 16% vol/vol, 예컨대, 적어도 17% vol/vol, 예컨대, 적어도 18% vol/vol, 예컨대, 적어도 19% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol, 예컨대, 적어도 35% vol/vol 이상의 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 예컨대, 콜리포르® P407을 포함하고/거나,
- 비이온성 에톡실화된 계면활성제가 폴레에테르 분산액의 혼합물, 예컨대, 안티폼 204이고, 여기서, 배양 배지가 적어도 1% vol/vol의 폴레에테르 분산액의 혼합물, 예컨대, 안티폼 204, 예컨대, 적어도 1.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 2% vol/vol, 예컨대, 적어도 2.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 3% vol/vol, 예컨대, 적어도 3.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 4% vol/vol, 예컨대, 적어도 5% vol/vol, 예컨대, 적어도 6% vol/vol, 예컨대, 적어도 7% vol/vol, 예컨대, 적어도 8% vol/vol, 예컨대, 적어도 9% vol/vol, 예컨대, 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 12.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 17.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 22.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 27.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 폴레에테르 분산액의 혼합물, 예컨대, 안티폼 204을 포함하고/거나;
- 비이온성 에톡실화된 계면활성제가 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트를 포함하는 비이온성 에톡실화된 계면활성제, 예컨대, 시메티콘이고, 여기서, 배양 배지가 적어도 1% vol/vol의 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 또는 시메티콘, 예컨대, 적어도 1.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 2% vol/vol, 예컨대, 적어도 2.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 3% vol/vol, 예컨대, 적어도 3.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 4% vol/vol, 예컨대, 적어도 5% vol/vol, 예컨대, 적어도 6% vol/vol, 예컨대, 적어도 7% vol/vol, 예컨대, 적어도 8% vol/vol, 예컨대, 적어도 9% vol/vol, 예컨대, 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 12.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 17.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 22.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 27.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 또는 시메티콘을 포함하고/거나;
- 비이온성 에톡실화된 계면활성제가 지방 알콜 알콕실레이트, 바람직하게, 플루라팍® LF300 (CAS 번호 196823-11-7), 플루라팍® LF1300 (68002-96-0), 플루라팍® SLF180 (CAS 번호 196823-11-7), 데히폰® 2574 (CAS 번호 68154-97-2), 및 임벤틴 SG/251 (CAS 번호 68002-96-0)로부터 선택되는 것, 바람직하게, 플루라팍® LF300 또는 데히폰® 2574이고, 여기서, 배양 배지가 적어도 1% vol/vol의 지방 알콜 알콕실레이트, 예컨대, 적어도 1.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 2% vol/vol, 예컨대, 적어도 2.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 3% vol/vol, 예컨대, 적어도 3.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 4% vol/vol, 예컨대, 적어도 5% vol/vol, 예컨대, 적어도 6% vol/vol, 예컨대, 적어도 7% vol/vol, 예컨대, 적어도 8% vol/vol, 예컨대, 적어도 9% vol/vol, 예컨대, 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 12.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 17.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 22.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 27.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 지방 알콜 알콕실레이트를 포함하고/거나;
- 비이온성 에톡실화된 계면활성제가 아그니크 BP420 (CAS 번호 68002-96-0)이고, 여기서, 배양 배지가 적어도 1% vol/vol의 아그니크 BP420, 예컨대, 적어도 1.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 2% vol/vol, 예컨대, 적어도 2.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 3% vol/vol, 예컨대, 적어도 3.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 4% vol/vol, 예컨대, 적어도 5% vol/vol, 예컨대, 적어도 6% vol/vol, 예컨대, 적어도 7% vol/vol, 예컨대, 적어도 8% vol/vol, 예컨대, 적어도 9% vol/vol, 예컨대, 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 12.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 17.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 22.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 27.5% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 아그니크 BP420을 포함하는 것인 방법.
57. 항목 45 내지 56 중 하나에 Ekkf, 배양 배지가 이의 클라우드 농도보다 적어도 50%, 예컨대, 적어도 100%, 예컨대, 적어도 150%, 예컨대, 적어도 200%, 예컨대, 적어도 250%, 예컨대, 적어도 300%, 예컨대, 적어도 350%, 예컨대, 적어도 400%, 예컨대, 적어도 500%, 예컨대, 적어도 750%, 예컨대, 적어도 1000% 이상 만큼 더 큰 양으로 추출제를 포함하고/거나, 여기서, 배양 배지가 이의 클라우드 농도의 적어도 2배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 3배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 4배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 5배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 6배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 7배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 8배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 9배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 10배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 12.5배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 15배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 17.5배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 20배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 25배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 30배인 양으로 추출제를 포함하는 것인 방법.
58. 항목 45 내지 57 중 하나에 따라, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A가 지질 또는 유리 지방산으로 전환되고, 여기서, 효모 세포에 의해 생산된 상기 지질 또는 유리 지방산, 상기 E8,E10-도데카디엔-1-올, 및 임의로, 상기 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 상기 E8,E10-도데카디에날이 발효 브로쓰 중 에멀젼으로 존재하고, 본 방법은 상기 에멀젼을 파괴시켜 추출제 및 지질 또는 유리 지방산, E8,E10-도데카디엔-1-올, 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 포함하는 생성물 상을 포함하는 조성물을 수득하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로, 여기서,:
- 에멀젼을 파괴시키는 단계가 발효 브로쓰의 상 분리 단계, 예컨대, 원심분리 단계를 거쳐 3개 상: 수상, 세포 및 세포 파편을 포함하는 상, 및 추출제 및 지질 또는 유리 지방산, E8,E10-도데카디엔-1-올, 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 포함하는 생성물 상으로 구성된 조성물을 수득하는 단계를 포함하거나, 또는 그로 구성되고/거나
- 여기서, 생성물 상은 처음 발효 브로쓰에 존재하는 지질 또는 유리 지방산, E8,E10-도데카디엔-1-올, 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날의 적어도 50%, 예컨대, 적어도 55%, 예컨대, 적어도 60%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95% 이상을 포함하는 것인 방법.
59. 항목 45 내지 58 중 하나에 따라,
- 바람직하게, 증류 단계, 예컨대, 감압하에서의 증류 단계에 의해, 또는 칼럼 정제에 의해 지질 또는 유리 지방산, E8,E10-도데카디엔-1-올, 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 회수하는 단계,
- E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 및/또는 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 화학적으로 전환시키는 단계,
- 임의로, 상기 E8,E10-도데카디에날 및/또는 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
60. 항목 45 내지 59 중 하나에 따라, 회수된 E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 페로몬 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
61. 항목 45 내지 60 중 하나에 따라, 페로몬 조성물이 하나 이상의 추가 성분, 예컨대, 액체 또는 고체 담체를 추가로 포함하는 것인 방법.
62. 효모 세포를 변형시키기 위한 핵산 구축물로서, 상기 구축물은
i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제를 코딩하는 적어도 하나의 제1 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)인 것인 적어도 하나의 제1 폴리뉴클레오티드; 및
ii) 임의로, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산 구축물.
63. 항목 62에 따라,
a) 적어도 하나의 데사투라제가 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77), Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 서열 번호: 77 또는 서열 번호: 2와 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이고, 바람직하게, 적어도 하나의 데사투라제가 Cpo_CPRQ 또는 이의 기능성 변이체이거나; 또는
b) 적어도 하나의 데사투라제가 적어도 2개의 데사투라제이고, 여기서, 상기 2개의 데사투라제 중 적어도 하나는 Gmo_CPRQ (서열 번호: 77), Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 서열 번호: 2와 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이고, 바람직하게, 적어도 하나의 데사투라제가 Cpo_CPRQ 또는 이의 기능성 변이체이고, 다른 데사투라제가 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 데사투라제, 예컨대, Z9-12 데사투라제인 것인 핵산 구축물.
64. 항목 62 내지 63 중 하나에 따라, 적어도 하나의 이종성 데사투라제가 적어도 2개의 데사투라제이고, 여기서, 다른 데사투라제는 Cpo_NPVE (서열 번호: 67), Cpo_SPTQ (서열 번호: 69) 및 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 67 또는 서열 번호: 69와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 것인 핵산 구축물.
65. 항목 62 내지 64 중 하나에 따라, 제1 폴리뉴클레오티드가 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 78, 바람직하게 서열 번호: 1, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 78, 바람직하게, 서열 번호: 1과 61%, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함하는 것인 핵산 구축물.
66. 항목 62 내지 65 중 하나에 따라, 적어도 하나의 이종성 데사투라제가 적어도 2개의 이종성 데사투라제이고, 여기서, 제1 폴리뉴클레오티드가 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 68에 기재된 핵산, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 이와 61%, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 추가로 포함하는 것인 핵산 구축물.
67. 항목 62 내지 66 중 하나에 따라, 이종성 데사투라제가 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 것인 핵산 구축물.
68. 항목 62 내지 67 중 하나에 따라, 적어도 하나의 데사투라제가 85번 위치에 돌연변이를 갖는 Cpo_CPRQ의 돌연변이체, 예컨대, S85A 돌연변이인 것인 핵산 구축물.
69. 항목 62 내지 68 중 하나에 따라, 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제가 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 것인 핵산 구축물.
70. 항목 62 내지 69 중 하나에 따라, 제2 폴리뉴클레오티드가 서열 번호: 9, 서열 번호: 60, 서열 번호: 70, 서열 번호: 72, 서열 번호: 74, 서열 번호: 11, 서열 번호: 76, 및 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 65%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체를 포함하거나, 또는 그로 구성된 것인 핵산 구축물.
71. 항목 62 내지 70 중 하나에 따라,
iii) 이종성 시토크롬 b5를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 서열 번호: 3에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체;
iv) 이종성 시토크롬 b5 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 서열 번호: 23에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체;
v) 헤모글로빈을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 서열 번호: 5에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체;
vi) 변형된 케톤 신타제 도메인을 갖는, 지방 아실 신타제 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및/또는
vii) 티오에스테라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 서열 번호: 25 또는 서열 번호: 34에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 적어도 60%의 상동성 또는 동일성을 갖는, 이의 동족체 중 하나 이상의 것을 추가로 포함하는 핵산 구축물.
72. 항목 62 내지 71 중 하나에 따라, 이종성 시토크롬 b5, 이종성 시토크롬 b5 리덕타제, 헤모글로빈, 지방 아실 신타제 변이체 및/또는 티오에스테라제가 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 것인 핵산 구축물.
73. i) 제45항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 제조하는 단계;
ii) 상기 E8,E10-도데카디엔-1-올 및 임의로, 상기 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 상기 E8,E10-도데카디에날을 페로몬 조성물로서 제제화하는 단계; 및
iii) 상기 페로몬 조성물을 통합 병해충 관리 조성물로서 사용하는 단계를 포함하는,
병해충의 존재를 모니터링하거나, 또는 병해충의 교미를 교란시키는 방법.
74. 제45항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A, E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날.
75. 사용 설명서, 및
a) 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 효모 세포; 및/또는
b) 효모 세포를 변형시키기 위한 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구축물 및 임의로, 변형시키고자 하는 효모 세포로서, 핵산 구축물 내에 포함된 폴리뉴클레오티드 발현시, 변형된 효모 세포는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 것인 핵산 구축물 및 임의로, 효모 세포를 포함하는 부품들의 키트.
SEQUENCE LISTING <110> BioPhero ApS <120> Yeast cells and methods for production of E8,E10-dodecadienyl coenzyme A, codlemone and derivatives thereof <130> P5484PC00 <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1047 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C. pomonella CPO_CPRQ desaturase (AHW98354) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1047) <223> C. pomonella CPO_CPRQ desaturase (AHW98354) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <400> 1 atgcctcccc gagagtctaa gaaggtggcc ctgcgatctt acgagacccc tgtcgcttct 60 ctccctcctc gaaagtacga gattatctac ctcaacctct tcctgcacat cgctggacat 120 atctccgccg tctacggcct gtatctgtgc ttcaccgccg cccagtggaa gaccatcttc 180 tttgcctacc tgtggctgtt gatgggcgag ctcggcgtgg tgtgtggcgc tcacagattg 240 tggtctcacc gttctttcaa ggtgaagcct cctctcgaga tcatgctgat gctgttcaac 300 tgtattggat tccagaacac cgccactgac tgggtccgaa accaccggct ccatcacaag 360 cactctgaca ctgacgccga cccccataac tctaaccgag gaatgctgtt ctcccacatt 420 ggctggctgt gtgtgcgaaa gcacccagat gttaaagaac gaggcaagac caccgacatg 480 tctgacatct actctaaccc cgtgctccga ttccagaaga agcacaaggt accccttttc 540 ggcgccatgt gtttcggcct gcccaccctt attcccaccc tgtggggaga ggacatcgtc 600 accgcttggc acgtcaacct gctgcgattc gttcttaatc tgaactctat cctgctggtc 660 aactccattg ctcataagta cggcacccga ccctacgatc gaaccatctg ccctcgacaa 720 aacaccacct gtaacatgat gactcttgga gagggcttcc acaactacca ccacaccttt 780 ccttgggact accgatctgc cgagctggga aagaactacc tgaacttcac caagtggttc 840 atcgacttct tcgccctgat tggatgggcc tacgacctga agaccgttcc tgacgatatg 900 atccagcgac gaatgaaaag aaccggagac ggatccaact cgtggggatg gggagacaag 960 gacatgacta aggaggagcg agactctgct actatcattt atcccgagaa gaaggatgat 1020 attaagatga tctccaaaaa gaactaa 1047 <210> 2 <211> 348 <212> PRT <213> Cydia pomonella <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(348) <223> C. pomonella CPO_CPRQ desaturase (AHW98354) <400> 2 Met Pro Pro Arg Glu Ser Lys Lys Val Ala Leu Arg Ser Tyr Glu Thr 1 5 10 15 Pro Val Ala Ser Leu Pro Pro Arg Lys Tyr Glu Ile Ile Tyr Leu Asn 20 25 30 Leu Phe Leu His Ile Ala Gly His Ile Ser Ala Val Tyr Gly Leu Tyr 35 40 45 Leu Cys Phe Thr Ala Ala Gln Trp Lys Thr Ile Phe Phe Ala Tyr Leu 50 55 60 Trp Leu Leu Met Gly Glu Leu Gly Val Val Cys Gly Ala His Arg Leu 65 70 75 80 Trp Ser His Arg Ser Phe Lys Val Lys Pro Pro Leu Glu Ile Met Leu 85 90 95 Met Leu Phe Asn Cys Ile Gly Phe Gln Asn Thr Ala Thr Asp Trp Val 100 105 110 Arg Asn His Arg Leu His His Lys His Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro 115 120 125 His Asn Ser Asn Arg Gly Met Leu Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Cys 130 135 140 Val Arg Lys His Pro Asp Val Lys Glu Arg Gly Lys Thr Thr Asp Met 145 150 155 160 Ser Asp Ile Tyr Ser Asn Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys Lys His Lys 165 170 175 Val Pro Leu Phe Gly Ala Met Cys Phe Gly Leu Pro Thr Leu Ile Pro 180 185 190 Thr Leu Trp Gly Glu Asp Ile Val Thr Ala Trp His Val Asn Leu Leu 195 200 205 Arg Phe Val Leu Asn Leu Asn Ser Ile Leu Leu Val Asn Ser Ile Ala 210 215 220 His Lys Tyr Gly Thr Arg Pro Tyr Asp Arg Thr Ile Cys Pro Arg Gln 225 230 235 240 Asn Thr Thr Cys Asn Met Met Thr Leu Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr 245 250 255 His His Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ser Ala Glu Leu Gly Lys Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Phe Thr Lys Trp Phe Ile Asp Phe Phe Ala Leu Ile Gly 275 280 285 Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Pro Asp Asp Met Ile Gln Arg Arg 290 295 300 Met Lys Arg Thr Gly Asp Gly Ser Asn Ser Trp Gly Trp Gly Asp Lys 305 310 315 320 Asp Met Thr Lys Glu Glu Arg Asp Ser Ala Thr Ile Ile Tyr Pro Glu 325 330 335 Lys Lys Asp Asp Ile Lys Met Ile Ser Lys Lys Asn 340 345 <210> 3 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H. armigera cytochrome b5 (AAC33731) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(384) <223> H. armigera cytochrome b5 (AAC33731) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <400> 3 atgaccgtgc gacagttcac ccgagtcgag gtgtctaagt ggaccactcg agaggaagcc 60 gtgttcatca tcgacaacgt ggtgtacaac gtgaccaagt tcctggacga gcaccccggt 120 ggacacgagg tgctggtgaa cgtggccggc aaggacgcct ctgaggactt cgacgacgtg 180 ggccactctc tggacgccaa ggaactgatg aagaagtacg tcgtcggcga ggtggtcgag 240 gccgagcgac gacacatcca gaagcgacag atctcttggg aagattctaa ggtggactct 300 gactcttctt tcacctcttc gtggaagttc cccgtgctgc tgggcatcgt ggtgaccctg 360 ctgtacacct acctgttcgg ctaa 384 <210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> Helicoverpa armigera <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(127) <223> H. armigera cytochrome b5 (AAC33731) <400> 4 Met Thr Val Arg Gln Phe Thr Arg Val Glu Val Ser Lys Trp Thr Thr 1 5 10 15 Arg Glu Glu Ala Val Phe Ile Ile Asp Asn Val Val Tyr Asn Val Thr 20 25 30 Lys Phe Leu Asp Glu His Pro Gly Gly His Glu Val Leu Val Asn Val 35 40 45 Ala Gly Lys Asp Ala Ser Glu Asp Phe Asp Asp Val Gly His Ser Leu 50 55 60 Asp Ala Lys Glu Leu Met Lys Lys Tyr Val Val Gly Glu Val Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Arg Arg His Ile Gln Lys Arg Gln Ile Ser Trp Glu Asp Ser 85 90 95 Lys Val Asp Ser Asp Ser Ser Phe Thr Ser Ser Trp Lys Phe Pro Val 100 105 110 Leu Leu Gly Ile Val Val Thr Leu Leu Tyr Thr Tyr Leu Phe Gly 115 120 125 <210> 5 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> V. stercoraria hemoglobin (AAT01097) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(441) <223> V. stercoraria hemoglobin (AAT01097) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <400> 5 atgctggacc agcagaccgt ggacacctct aaggccaccg tgcctgtgct gaaggaacac 60 ggcgtgacca tcaccaccac cttctaccag aacctgttcg ctaagcaccc cgaggtgcga 120 cccctgttcg atatgggccg acaggcctct ctcgagcagc ccaaggctct ggccatgacc 180 gtgggagccg ccgctcagaa catcgagaac ctgcctgcca ttctgcccgc cgtgcagaag 240 atcgccgtca agcactgcca ggccggcgtg gccgctcgac actaccccat cgtgggccaa 300 gagctgctgg gcgccatcaa ggaactgctg ggtgacgccg ccaccgacga catcctggac 360 gcctggggca aggcctacgg cgtgatcgcc gacgtgttca tccaggtcga ggccgacctg 420 tacgcccagg acgccgagta a 441 <210> 6 <211> 146 <212> PRT <213> Vitreoscilla stercoraria <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(146) <223> V. stercoraria hemoglobin (AAT01097) <400> 6 Met Leu Asp Gln Gln Thr Val Asp Thr Ser Lys Ala Thr Val Pro Val 1 5 10 15 Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Gln Asn Leu 20 25 30 Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln 35 40 45 Ala Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Gly Ala Ala 50 55 60 Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Gln Lys 65 70 75 80 Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Arg His Tyr Pro 85 90 95 Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Leu Leu Gly Asp 100 105 110 Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val 115 120 125 Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Asp 130 135 140 Ala Glu 145 <210> 7 <211> 1557 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> T. alba fatty acyl reductase (NP_001289627) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1557) <223> T. alba fatty acyl reductase (NP_001289627) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <400> 7 atggtgtcta tccccgagta ctacgagggc aagaacatcc tgctgaccgg cgccaccggc 60 ttcatgggca aggtgctgct cgagaagctg ctgcgatctt gccccaaggt gaaggccgtg 120 tacgtgctgg tgcgacacaa ggccggacag acccctgagg ctcgaatcga ggaaatcacc 180 aactgcaagc tgttcgaccg actgcgagat gagcagcccg acttcaaggc caagatcatc 240 gtgatcacct ctgagctgac ccagcctgag ctggacctgt ctgagcccat caaggaaaag 300 ctgatcgagc gaatcaacat catcttccac tgcgccgcca ccgtgcgatt caacgagact 360 ctccgagatg ccgtgcagct gaacgtgacc gctactcagc agctcctgtt cctggctcag 420 cgaatgaaga acctggaagt gttcatgcac gtgtctaccg cctacgccta ctgcaaccga 480 aagcagatcg aagagatcgt gtaccctcct ccagtggacc ccaagaagct gattgactct 540 ctcgagtgga tggacgacgg cctggtgaac gacatcaccc ctaagctcat cggcgaccga 600 cctaacacct acacttacac caaggctctg gccgagtacg tggtgcagca agagggcgcc 660 aagctgaaca ccgccatcat tcgaccctct atcgtgggcg cctcttggaa ggaacccttt 720 cctggctgga tcgacaactt caacggcccc tctggcctgt tcattgccgc cggaaagggc 780 atcctgcgaa ccatgcgagc ctctaactct gccgtggccg acctggtgcc tgtggacgtg 840 gtggtgaaca ccactctggc cgctgcctgg tactctggcg tgaaccgacc tcgaaacgtg 900 atgatctaca actgcaccac cggcggcact aaccccttcc actggggcga agtgggctac 960 cacatcaacc tgaacttcaa gatcaaccct ctcgagaacg ccgtgcgaca ccccaactgt 1020 tctctgcagt ctaaccctct gctccatcag tactggaccg ccgtgtctca caccatgcct 1080 gcctttctgc tggacctcct gctgcgactg accggacaca agccctggat gatgaagacc 1140 atcactcgac tgcacaaggc catgatgctc ctcgagtact tcacctccaa ctcttggatc 1200 tggaacaccg agaacatgac catgctgatg aaccagctga accccgagga caagaagacc 1260 ttcaacttcg acgtgcgaca gctgcactgg gctgagtaca tggaaaacta ctgcatgggc 1320 accaagaagt acgtcctgaa cgaggaaatg tctggactgc ccgctgccag aaagcacctg 1380 aacaagctgc gaaacatccg atacggcttc aacaccgtgc tggtcatcct gatctggcga 1440 atcttcattg cccgatctca gatggcccga aacatctggt acttcgtggt gtctctgtgc 1500 tacaagttcc tgtcttactt ccgagcctct tctaccatgc gatactctaa gctgtag 1557 <210> 8 <211> 515 <212> PRT <213> Tyto alba <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(515) <223> T. alba fatty acyl reductase (NP_001289627) <400> 8 Met Val Ser Ile Pro Glu Tyr Tyr Glu Gly Lys Asn Ile Leu Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Thr Gly Phe Met Gly Lys Val Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg 20 25 30 Ser Cys Pro Lys Val Lys Ala Val Tyr Val Leu Val Arg His Lys Ala 35 40 45 Gly Gln Thr Pro Glu Ala Arg Ile Glu Glu Ile Thr Asn Cys Lys Leu 50 55 60 Phe Asp Arg Leu Arg Asp Glu Gln Pro Asp Phe Lys Ala Lys Ile Ile 65 70 75 80 Val Ile Thr Ser Glu Leu Thr Gln Pro Glu Leu Asp Leu Ser Glu Pro 85 90 95 Ile Lys Glu Lys Leu Ile Glu Arg Ile Asn Ile Ile Phe His Cys Ala 100 105 110 Ala Thr Val Arg Phe Asn Glu Thr Leu Arg Asp Ala Val Gln Leu Asn 115 120 125 Val Thr Ala Thr Gln Gln Leu Leu Phe Leu Ala Gln Arg Met Lys Asn 130 135 140 Leu Glu Val Phe Met His Val Ser Thr Ala Tyr Ala Tyr Cys Asn Arg 145 150 155 160 Lys Gln Ile Glu Glu Ile Val Tyr Pro Pro Pro Val Asp Pro Lys Lys 165 170 175 Leu Ile Asp Ser Leu Glu Trp Met Asp Asp Gly Leu Val Asn Asp Ile 180 185 190 Thr Pro Lys Leu Ile Gly Asp Arg Pro Asn Thr Tyr Thr Tyr Thr Lys 195 200 205 Ala Leu Ala Glu Tyr Val Val Gln Gln Glu Gly Ala Lys Leu Asn Thr 210 215 220 Ala Ile Ile Arg Pro Ser Ile Val Gly Ala Ser Trp Lys Glu Pro Phe 225 230 235 240 Pro Gly Trp Ile Asp Asn Phe Asn Gly Pro Ser Gly Leu Phe Ile Ala 245 250 255 Ala Gly Lys Gly Ile Leu Arg Thr Met Arg Ala Ser Asn Ser Ala Val 260 265 270 Ala Asp Leu Val Pro Val Asp Val Val Val Asn Thr Thr Leu Ala Ala 275 280 285 Ala Trp Tyr Ser Gly Val Asn Arg Pro Arg Asn Val Met Ile Tyr Asn 290 295 300 Cys Thr Thr Gly Gly Thr Asn Pro Phe His Trp Gly Glu Val Gly Tyr 305 310 315 320 His Ile Asn Leu Asn Phe Lys Ile Asn Pro Leu Glu Asn Ala Val Arg 325 330 335 His Pro Asn Cys Ser Leu Gln Ser Asn Pro Leu Leu His Gln Tyr Trp 340 345 350 Thr Ala Val Ser His Thr Met Pro Ala Phe Leu Leu Asp Leu Leu Leu 355 360 365 Arg Leu Thr Gly His Lys Pro Trp Met Met Lys Thr Ile Thr Arg Leu 370 375 380 His Lys Ala Met Met Leu Leu Glu Tyr Phe Thr Ser Asn Ser Trp Ile 385 390 395 400 Trp Asn Thr Glu Asn Met Thr Met Leu Met Asn Gln Leu Asn Pro Glu 405 410 415 Asp Lys Lys Thr Phe Asn Phe Asp Val Arg Gln Leu His Trp Ala Glu 420 425 430 Tyr Met Glu Asn Tyr Cys Met Gly Thr Lys Lys Tyr Val Leu Asn Glu 435 440 445 Glu Met Ser Gly Leu Pro Ala Ala Arg Lys His Leu Asn Lys Leu Arg 450 455 460 Asn Ile Arg Tyr Gly Phe Asn Thr Val Leu Val Ile Leu Ile Trp Arg 465 470 475 480 Ile Phe Ile Ala Arg Ser Gln Met Ala Arg Asn Ile Trp Tyr Phe Val 485 490 495 Val Ser Leu Cys Tyr Lys Phe Leu Ser Tyr Phe Arg Ala Ser Ser Thr 500 505 510 Met Arg Tyr 515 <210> 9 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> A. segetum fatty acyl reductase (AGP26039) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1377) <223> A. segetum fatty acyl reductase (AGP26039) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <400> 9 atgcccgtgc tgacctcgcg agaggacgag aagctgtctg tgcccgagtt ctacgccggc 60 aagtctatct tcgtgaccgg cggcaccgga ttcctcggca aggtgttcat tgagaagctg 120 ctctactgct gccccgacat cgacaagatc tacatgctga tccgagagaa gaagaacctg 180 tctatcgacg agcgaatgtc taagttcctg gacgaccctc tgttctctcg actgaaggaa 240 gaacgacccg gcgacctcga gaagatcgtg ctgatccccg gcgacatcac cgctcctaac 300 ctgggcctgt ctgccgagaa cgaacgaatc ctgctcgaga aggtgtccgt gatcatcaac 360 tctgccgcca ccgtgaagtt caacgagccc ctgcctatcg cctggaagat caacgtcgag 420 ggcacccgaa tgctgctggc cctgtctcga cgaatgaagc gaatcgaggt gtttatccac 480 atctctaccg cctactctaa cgcctcttct gaccgaatcg tggtggacga gattctgtac 540 cccgctcctg ccgacatgga ccaggtgtac cagctcgtga aggacggcgt gaccgaggaa 600 gagactgagc gactgctgaa cggactgccc aacacctaca ccttcaccaa ggctctgacc 660 gagcacctgg tggccgagca ccagacctac gtgcccacca tcatcattcg accctccgtg 720 gtggcctcta tcaaggacga gcccatccga ggctggctgt gcaactggtt cggcgccacc 780 ggcatctctg tgttcaccgc caagggcctg aaccgagtgc tgctcggaaa ggcctctaac 840 atcgtggacg tgatccccgt ggactacgtg gccaacctgg tgatcgtggc tggcgccaag 900 tctggcggcc agaagtctga cgagctgaag atctataact gctgttcttc tgactgcaac 960 cccgtgactc tgaagaagat catcaaggaa ttcaccgagg acaccatcaa gaacaagtct 1020 cacatcatgc ctctgcctgg ctggttcgtg ttcaccaagt acaagtggct gctgaccctc 1080 ctgaccatca tcttccagat gctgcccatg tacctggccg acgtgtaccg agtcctgacc 1140 ggcaagattc cccggtacat gaagctgcac cacctggtca ttcagacccg actgggaatc 1200 gacttcttca cctctcactc ttgggtgatg aagaccgacc gagtgcgaga gctgttcggc 1260 tctctgtctc tggccgagaa gcacatgttc ccttgcgacc cctcttccat cgactggacc 1320 gactacctgc agtcttactg ctacggcgtg cgacgattcc tggaaaagaa gaagtag 1377 <210> 10 <211> 458 <212> PRT <213> Agrotis segetum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(458) <223> A. segetum fatty acyl reductase (AGP26039) <400> 10 Met Pro Val Leu Thr Ser Arg Glu Asp Glu Lys Leu Ser Val Pro Glu 1 5 10 15 Phe Tyr Ala Gly Lys Ser Ile Phe Val Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu 20 25 30 Gly Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Cys Cys Pro Asp Ile Asp 35 40 45 Lys Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Asn Leu Ser Ile Asp Glu 50 55 60 Arg Met Ser Lys Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Ser Arg Leu Lys Glu 65 70 75 80 Glu Arg Pro Gly Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile 85 90 95 Thr Ala Pro Asn Leu Gly Leu Ser Ala Glu Asn Glu Arg Ile Leu Leu 100 105 110 Glu Lys Val Ser Val Ile Ile Asn Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn 115 120 125 Glu Pro Leu Pro Ile Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met 130 135 140 Leu Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His 145 150 155 160 Ile Ser Thr Ala Tyr Ser Asn Ala Ser Ser Asp Arg Ile Val Val Asp 165 170 175 Glu Ile Leu Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Met Asp Gln Val Tyr Gln Leu 180 185 190 Val Lys Asp Gly Val Thr Glu Glu Glu Thr Glu Arg Leu Leu Asn Gly 195 200 205 Leu Pro Asn Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val 210 215 220 Ala Glu His Gln Thr Tyr Val Pro Thr Ile Ile Ile Arg Pro Ser Val 225 230 235 240 Val Ala Ser Ile Lys Asp Glu Pro Ile Arg Gly Trp Leu Cys Asn Trp 245 250 255 Phe Gly Ala Thr Gly Ile Ser Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg 260 265 270 Val Leu Leu Gly Lys Ala Ser Asn Ile Val Asp Val Ile Pro Val Asp 275 280 285 Tyr Val Ala Asn Leu Val Ile Val Ala Gly Ala Lys Ser Gly Gly Gln 290 295 300 Lys Ser Asp Glu Leu Lys Ile Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Asp Cys Asn 305 310 315 320 Pro Val Thr Leu Lys Lys Ile Ile Lys Glu Phe Thr Glu Asp Thr Ile 325 330 335 Lys Asn Lys Ser His Ile Met Pro Leu Pro Gly Trp Phe Val Phe Thr 340 345 350 Lys Tyr Lys Trp Leu Leu Thr Leu Leu Thr Ile Ile Phe Gln Met Leu 355 360 365 Pro Met Tyr Leu Ala Asp Val Tyr Arg Val Leu Thr Gly Lys Ile Pro 370 375 380 Arg Tyr Met Lys Leu His His Leu Val Ile Gln Thr Arg Leu Gly Ile 385 390 395 400 Asp Phe Phe Thr Ser His Ser Trp Val Met Lys Thr Asp Arg Val Arg 405 410 415 Glu Leu Phe Gly Ser Leu Ser Leu Ala Glu Lys His Met Phe Pro Cys 420 425 430 Asp Pro Ser Ser Ile Asp Trp Thr Asp Tyr Leu Gln Ser Tyr Cys Tyr 435 440 445 Gly Val Arg Arg Phe Leu Glu Lys Lys Lys 450 455 <210> 11 <211> 1368 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H. armigera fatty acyl reductase (ATJ44471) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1368) <223> H. armigera fatty acyl reductase (ATJ44471) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <400> 11 atggtggtcc tgacctctaa ggagactaag ccctccgtgg ccgagttcta cgctggcaag 60 tctgtcttca tcaccggcgg aaccggtttc ctgggcaagg tcttcattga gaagctgctg 120 tactcctgtc ccgacatcgg caacatctac atgctgatcc gagagaagaa gggactgtct 180 gtgtccgagc gaattaagca cttcctggac gaccccctgt tcacccgact gaaggagaag 240 cgacccgccg acctggagaa gatcgtgctg attcccggag acatcaccgc tcccgacctg 300 ggtattacct ctgagaacga gaagatgctg atcgagaagg tgtctgtcat cattcactcc 360 gccgctaccg tcaagttcaa cgagcccctg cccaccgcct ggaagatcaa cgtggaggga 420 acccgaatga tgctggctct gtctcgacga atgaagcgaa ttgaggtctt catccacatt 480 tccaccgcct acaccaacac caaccgagag gtggtggacg agatcctgta ccctgctcct 540 gctgacattg accaggtgca ccgatacgtc aaggacggta tctctgagga agagactgag 600 aagattctga acggccgacc caacacctac accttcacca aggccctgac cgagcacctg 660 gtggctgaga accaggctta cgtgcccacc atcattgtcc gaccctccgt ggtcgccgct 720 atcaaggacg agcccattaa gggatggctg ggtaactggt acggagctac cggactgacc 780 gtgttcaccg ctaagggtct gaaccgagtc atctacggcc actcttccaa catcgtggac 840 ctgattcccg tggactacgt cgccaacctg gtcattgccg ctggcgctaa gtcttccaag 900 tccaccgagc tgaaggtgta caactgttgc tcttccgcct gcaaccccat caccattgga 960 aagctgatgt ctatgttcgc cgaggacgct atcaagcaga agtcctacgc tatgcccctg 1020 cccggttggt acatcttcac caagtacaag tggctggtcc tgctgctgac cattctgttc 1080 caggtcatcc ccgcctacat taccgacctg taccgacacc tgatcggcaa gaacccccga 1140 tacattaagc tgcagtctct ggtcaaccag acccgatctt ccattgactt cttcacctct 1200 cactcctggg tcatgaaggc tgaccgagtc cgagagctgt tcgcctctct gtcccccgct 1260 gacaagtacc tgttcccctg tgaccccacc gacatcaact ggacccacta cattcaggac 1320 tactgctggg gagtgcgaca cttcctggag aagaagtcct acgagtag 1368 <210> 12 <211> 456 <212> PRT <213> Helicoverpa armigera <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(456) <223> H. armigera fatty acyl reductase (ATJ44471) <400> 12 Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly 20 25 30 Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Gly Asn 35 40 45 Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg 50 55 60 Ile Lys Gln Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Glu Lys 65 70 75 80 Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr 85 90 95 Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Glu Asn Glu Lys Ile Leu Ile Glu 100 105 110 Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met 130 135 140 Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile 145 150 155 160 Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu 165 170 175 Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val His Gln Tyr Val Lys Asp 180 185 190 Gly Ile Ser Glu Glu Glu Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn 195 200 205 Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val Ala Glu Asn 210 215 220 Gln Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Val Arg Pro Ser Val Val Ala Ala 225 230 235 240 Ile Lys Asp Glu Pro Ile Lys Gly Trp Leu Gly Asn Trp Tyr Gly Ala 245 250 255 Thr Gly Leu Thr Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg Val Ile Tyr 260 265 270 Gly His Ser Ser Asn Ile Val Asp Leu Ile Pro Val Asp Tyr Val Ala 275 280 285 Asn Leu Val Ile Ala Ala Gly Ala Lys Ser Ser Lys Ser Thr Asp Leu 290 295 300 Lys Val Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Ala Cys Asn Pro Ile Thr Ile Gly 305 310 315 320 Lys Leu Met Ser Met Phe Ala Glu Asp Ala Ile Lys Gln Lys Ser Tyr 325 330 335 Ala Met Pro Leu Pro Gly Trp Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Lys Trp Leu 340 345 350 Val Leu Leu Leu Thr Ile Leu Phe Gln Val Ile Pro Ala Tyr Ile Thr 355 360 365 Asp Leu Tyr Arg His Leu Ile Gly Lys Asn Pro Arg Tyr Ile Lys Leu 370 375 380 Gln Ser Leu Val Asn Gln Thr Arg Ser Ser Ile Asp Phe Phe Thr Ser 385 390 395 400 His Ser Trp Val Met Lys Ala Asp Arg Val Arg Glu Leu Phe Ala Ser 405 410 415 Leu Ser Pro Ala Asp Lys Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Pro Thr Asp Ile 420 425 430 Asn Trp Thr His Tyr Ile Gln Asp Tyr Cys Trp Gly Val Arg His Phe 435 440 445 Leu Glu Lys Lys Thr Thr Asn Lys 450 455 <210> 13 <211> 915 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> misc_feature <222> (1)..(915) <223> Y. lipolytica fatty acid elongase 1 (YALI0_F06754g) <400> 13 atgctctcgt caatctcgcc cgacctatac tcgtccttct cgttcaaaaa ctcgctcgcc 60 gaggccatgc cctccgtgcc acacgaactc atcaactcaa aaacactctc atggatgtac 120 aatgcctctc tggacattcg ggttcctctg actatcggaa ccatctacgc cgtctccgtg 180 cacctgacca actcatctga acgaatcaag aaacgccagc ccattgcctt tgccaagacc 240 gcactcttca agtggctctg tgtcctccac aatgcaggtc tgtgtctcta ctcagcatgg 300 acctttgtcg gtatcctcaa cgccgtcaaa cacgcctacc aaatcacagg agacagctcc 360 gcccccttct ccttcaacac cctctgggga tcgttttgtt cacgtgactc cctctgggtc 420 accggcctca actactacgg atactggttc tatctgtcca aattctacga agtggtggac 480 accatgatca tcctcgcaaa gggaaaaccg tcctcaatgc tccagacata ccaccacacc 540 ggcgccatgt tctccatgtg ggccggcatc cgattcgcct ctccccccat ctggatcttt 600 gtggttttca actccctcat ccacacaatc atgtactttt actacaccct caccaccctc 660 aagatcaagg ttcccaagat cctcaaggca tctctgacca ccgcccagat cacccagatt 720 gtcggaggtg gcatcctggc tgcctcccac gcctttattt attacaagga ccaccagact 780 gagaccgtct gttcttgtct cactacccag ggtcagtttt tcgctctcgc cgtcaatgtc 840 atctatctga gtcctctggc ctatctcttt attgccttct ggattcgatc ttacttgaag 900 gccaagtcca actag 915 <210> 14 <211> 304 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(304) <223> Y. lipolytica fatty acid elongase 1 (XP_505094) <400> 14 Met Leu Ser Ser Ile Ser Pro Asp Leu Tyr Ser Ser Phe Ser Phe Lys 1 5 10 15 Asn Ser Leu Ala Glu Ala Met Pro Ser Val Pro His Glu Leu Ile Asn 20 25 30 Ser Lys Thr Leu Ser Trp Met Tyr Asn Ala Ser Leu Asp Ile Arg Val 35 40 45 Pro Leu Thr Ile Gly Thr Ile Tyr Ala Val Ser Val His Leu Thr Asn 50 55 60 Ser Ser Glu Arg Ile Lys Lys Arg Gln Pro Ile Ala Phe Ala Lys Thr 65 70 75 80 Ala Leu Phe Lys Trp Leu Cys Val Leu His Asn Ala Gly Leu Cys Leu 85 90 95 Tyr Ser Ala Trp Thr Phe Val Gly Ile Leu Asn Ala Val Lys His Ala 100 105 110 Tyr Gln Ile Thr Gly Asp Ser Ser Ala Pro Phe Ser Phe Asn Thr Leu 115 120 125 Trp Gly Ser Phe Cys Ser Arg Asp Ser Leu Trp Val Thr Gly Leu Asn 130 135 140 Tyr Tyr Gly Tyr Trp Phe Tyr Leu Ser Lys Phe Tyr Glu Val Val Asp 145 150 155 160 Thr Met Ile Ile Leu Ala Lys Gly Lys Pro Ser Ser Met Leu Gln Thr 165 170 175 Tyr His His Thr Gly Ala Met Phe Ser Met Trp Ala Gly Ile Arg Phe 180 185 190 Ala Ser Pro Pro Ile Trp Ile Phe Val Val Phe Asn Ser Leu Ile His 195 200 205 Thr Ile Met Tyr Phe Tyr Tyr Thr Leu Thr Thr Leu Lys Ile Lys Val 210 215 220 Pro Lys Ile Leu Lys Ala Ser Leu Thr Thr Ala Gln Ile Thr Gln Ile 225 230 235 240 Val Gly Gly Gly Ile Leu Ala Ala Ser His Ala Phe Ile Tyr Tyr Lys 245 250 255 Asp His Gln Thr Glu Thr Val Cys Ser Cys Leu Thr Thr Gln Gly Gln 260 265 270 Phe Phe Ala Leu Ala Val Asn Val Ile Tyr Leu Ser Pro Leu Ala Tyr 275 280 285 Leu Phe Ile Ala Phe Trp Ile Arg Ser Tyr Leu Lys Ala Lys Ser Asn 290 295 300 <210> 15 <211> 6337 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6337) <223> Y. lipolytica fatty acid synthase 1 (YALI0_B15059g) <400> 15 atggtgagta tcgaccgaag caggatgatc tctacatgag atatgcaacg cgtacgtgat 60 tcaattgatc ctaacacagt accctaccac aggtgtcaac accccccaga gcgccgcctc 120 attaagacca ctggtgctat cgcacggcca aactgagcac tcgctgctgg tgcccacctc 180 tctgtacatc aactgcacca cgctccgaga ccagttctac gcctctctac ctccagccac 240 tgaagacaag gccgacgatg atgagccctc ctcctccaca gagcttctag ctgccttcct 300 gggatttact gccaagaccg tcgaggaaga gcccggacca tacgacgacg ttctctctct 360 cgtgcttaac gagtttgaga cccggtactt gcgaggtaac gacatccacg ctgtggcctc 420 ctccttgtta caagacgagg acgtgcctac caccgttggt aagatcaaga gggtgattcg 480 agcctactac gccgcacgaa ttgcctgcaa ccggcccatc aaggcccact cgtcggctct 540 gttccgagcc gcatctgaag actcggacaa cgtctctctg tacgccatct tcggtggcca 600 gggaaacacc gaggactact ttgaggaact gcgggagatt tacgacatct accaggggct 660 ggtcggcgac ttcattcggg aatgtggagc ccagcttctg gcgctgtctc gagatcacat 720 tgctgctgag aaaatttata ccaagggctt tgatatcgtc aagtggctgg aacaccccga 780 gaccatcccc gactttgagt acctaatttc tgctcccatc tctgtaccca tcatcggtgt 840 tatccagctg gcacactacg ctgtcacctg tcgagttttg ggtcttaatc ctggccaggt 900 ccgagacaac ctcaagggtg ccactggcca ttctcagggt ctgatcaccg caattgccat 960 ctctgcctcc gactcgtggg acgagttcta taactctgcc tctcgaattc tcaagatctt 1020 cttcttcatc ggtgtccgtg tccaacaggc ttacccctcc actttcctgc ctccctccac 1080 tctggaagac agtgtcaagc agggtgaggg caagcccact cccatgctgt ccatccgaga 1140 cctgtctctc aaccaggttc aggagttcgt cgatgccacc aacttgcatt tgcccgaaga 1200 taagcagatc gtcgtgtctc tgatcaatgg tcctcgaaac gttgtcgtta ctggcccccc 1260 ccagtctctg tatggtctgt gtcttgtgct tcgaaaacag aaggccgaga ccggtctgga 1320 ccaaagccga gtgccccaca gtcagcgaaa gctcaaattc acacatcgtt tcctgcccat 1380 cacctctcct ttccactcgt acctgctgga gaagagcacg gatctgatca tcaacgacct 1440 ggagtcttcc ggtgtggagt ttgtgtcctc cgagctcaag gtgcctgttt acgacacctt 1500 tgatggctcc gtgctgtctc agctacccaa gggtatcgtc agccgtctgg tcaacctcat 1560 cactcatctg cccgtcaagt gggagaaggc cactcagttt caggcctccc acattgtgga 1620 ctttggtccc ggtggcgctt ctggtcttgg tctgttgacc cacaagaaca aggatggaac 1680 tggagtgcga actattcttg ctggtgtcat tgaccagccc ctcgagttcg gcttcaagca 1740 ggagctgttt gaccgacagg agtcgtccat tgtttttgct caaaactggg ccaaggagtt 1800 ttctcccaag ctcgtcaaga tctcctccac caacgaggtc tatgtcgaca ccaaattctc 1860 tcgtctgact ggccgagccc ccatcatggt cgctggtatg acccctacca ctgtcaaccc 1920 caaatttgtg gctgccacta tgaactccgg ctaccacatc gagcttggtg gtggaggcta 1980 ctttgccccc ggtatgatga ccaaggccct tgaacacatt gagaagaaca ctcctcccgg 2040 atccggtatc accatcaacc tgatctacgt caaccctcga ctgattcaat ggggtattcc 2100 tctgattcag gagcttcgac agaagggttt ccccattgaa ggtctcacca ttggtgccgg 2160 tgtgccctct ctggaggttg ctaacgagtg gattcaggat ctgggcgtca agcacatcgc 2220 cttcaagcct ggatccatcg aggccatctc ctcggtgatt cgaatcgcca aggccaaccc 2280 agactttcct atcatccttc agtggaccgg aggtcgagga ggaggacatc attcgtttga 2340 ggacttccac gctcccattc tgcagatgta ctccaagatc cgacgatgca gcaacattgt 2400 gctgattgcc ggatctggtt tcggtgcttc taccgactcc tacccatacc tcaccggttc 2460 atggtcccga gactttgact accctcccat gccctttgac ggtatcctgg ttggttctcg 2520 agtcatggtt gccaaggagg ctttcacttc tctgggagcc aagcagctca ttgttgactc 2580 tccgggtgtt gaggattctg agtgggagaa aacctacgac aagcccactg gtggcgtcat 2640 caccgttctc tccgagatgg gtgagcctat ccacaagctc gccactcgag gtgtgctctt 2700 ctggcacgag atggacaaga ccgtgttctc cctgcccaag aagaagcgtc tggaagtgct 2760 caagtccaag cgagcctaca tcatcaagcg tctcaacgac gacttccaga agacttggtt 2820 tgccaagaac gcccagggac aggtgtgtga tctcgaagac ctcacctacg cggaggtcat 2880 ccagcgactt gttgacctca tgtacgtgaa gaaggaaagc cgatggatcg atgtcactct 2940 ccgaaatctt gccggcactt tcattcgacg agttgaggag cgattctcca ccgagacagg 3000 tgcctcttct gtgttgcaga gcttttccga gctggattcc gagcccgaga aggttgtcga 3060 gcgggtgttt gagctcttcc ctgcctctac tacccagatc atcaacgctc aagacaagga 3120 ccacttcctc atgctgtgtc tcaaccccat gcagaagccc gtgcccttca tccctgttct 3180 ggatgacaac tttgagttct tcttcaagaa ggactctctg tggcagtgcg aggacctcgc 3240 agctgttgtg gacgaagacg ttggacgaat ctgtattctt cagggtcccg ttgctgtcaa 3300 gcactccaag attgtcaacg agcccgtcaa ggagattctc gactccatgc acgaaggtca 3360 catcaagcag ctgcttgagg atggcgagta cgctggcaac atggccaaca tcccccaggt 3420 cgaatgcttt ggtggaaagc ctgctcagaa cttcggtgac gttgctctcg actctgtcat 3480 ggttcttgat gacctcaaca agaccgtgtt caagattgag accggcacct ctgctctgcc 3540 ttctgctgca gattggttct ctctgctggc cggtgacaag aactcttggc gacaggtctt 3600 cctgtccact gacaccattg tgcagaccac caagatgatc tccaaccctc tgcatcgact 3660 tctggagccc atcgcaggtt tgcaggttga gattgagcac cctgatgagc ccgagaacac 3720 cgtcatctct gctttcgagc ccatcaacgg caaggtcacc aaggtgctgg agctgcgaaa 3780 gggtgccgga gacgtcattt cgctgcagct gatcgaagcg cgtggcgttg accgagtccc 3840 cgttgctctt cctctggaat tcaagtacca gccccagatt ggctacgctc ccattgttga 3900 ggttatgacc gacaggaaca cccgaatcaa ggagttctac tggaagctgt ggtttggcca 3960 ggactccaag tttgagattg acaccgacat caccgaggaa atcattggcg atgacgttac 4020 catctctggc aaggccattg ccgactttgt ccacgctgtt ggcaacaagg gcgaggcctt 4080 tgttggtcga tctacctctg ctggtactgt cttcgctccc atggactttg ccattgtttt 4140 gggctggaag gccattatca aggcaatctt tccccgagca attgatgctg acattctgcg 4200 tctggtacat ctgtccaacg gcttcaagat gatgcctggc gccgaccctc tgcagatggg 4260 tgatgttgtt tccgccactg ccaagatcga cactgtcaag aactccgcta ccggcaagac 4320 tgttgctgtt cgaggtcttc tcacccgaga cggcaagcct gtcatggagg ttgtttccga 4380 attcttctac cgaggcgaat tctccgactt ccagaacact tttgagcgac gagaggaggt 4440 acccatgcaa ctgaccctca aggacgccaa ggccgtggcc attctctgct ccaaggagtg 4500 gtttgagtac aatggcgacg ataccaagga cctcgagggc aagaccattg tgttccgaaa 4560 ctcgtcattc atcaagtaca agaatgagac cgtcttctct tctgtgcaca ccaccggtaa 4620 ggtattgatg gagctgccct ccaaggaggt cattgagatt gccactgtta actaccaggc 4680 tggcgagtct catggcaatc ccgtcattga ttacctggag cgaaatggaa ccaccattga 4740 gcagcctgtt gagtttgaga agcccatccc tctgtccaag gcagatgatc ttctctcctt 4800 caaggctcct tcttccaacg agccctacgc tggtgtgtcc ggtgactaca atcccatcca 4860 cgtgtctcga gcctttgctt cctatgcatc ccttcctgga accatcaccc acggtatgta 4920 ctcttctgct gctgttcgat ctctgattga ggtctgggct gccgagaaca atgtgtctcg 4980 agttcgagcc ttctcctgtc agttccaggg catggttttg cccaacgacg agattgtgac 5040 tcgactggag cacgttggca tgatcaacgg tcgaaagatc atcaaggtta cctccaccaa 5100 ccgggagacc gaggctgttg ttctgtctgg cgaggctgag gtcgagcagc ccatctccac 5160 ctttgtcttt actggccagg gctctcagga gcagggcatg ggtatggacc tgtacgcctc 5220 ttccgaggtg gccaagaagg tctgggacaa ggctgacgag cacttcttgc agaactacgg 5280 tttctccatc atcaagatcg ttgtggagaa ccccaaggag ctggatattc attttggagg 5340 ccccaagggt aagaagatcc gagacaacta tatctctatg atgttcgaga ccattgatga 5400 gaagaccggc aacctcattt ccgagaagat cttcaaggag attgacgaga ccaccgactc 5460 tttcaccttc aagtccccca ccggtctgct ttctgctacc cagttcactc agcccgctct 5520 gaccctcatg gagaaggcgt cctttgagga catgaaggct aagggtcttg tccccgtgga 5580 tgcaaccttt gctggtcact cccttggtga gtactccgct cttgcttctc ttggtgatgt 5640 catgcccatc gagtctcttg ttgatgtcgt cttctaccga ggtatgacta tgcaggttgc 5700 tgttccccga gatgcccagg gtcggtccaa ttacggtatg tgcgctgtca acccctctcg 5760 aatctctacc accttcaacg acgctgctct tcggtttgtc gttgaccaca tctccgagca 5820 gaccaagtgg ctgcttgaga ttgtcaacta caacgttgag aactctcagt acgtgactgc 5880 cggtgacctg cgagctctcg acaccctcac caatgtgctc aacgtgctca aactcgagaa 5940 gatcaacatt gacaagctgc tcgagtctct gcctctggag aaggtcaagg agcacctttc 6000 tgagatcgtc accgaggtgg ccaagaagtc cgttgctaag cctcagccca ttgagctgga 6060 acgaggcttt gccgtgatcc ctctcaaggg catctctgtg cctttccact cttcgtacct 6120 gcgaaatggt gtcaagccct tccaaaactt cctggtgaag aaggtgccca agaacgctgt 6180 caaacctgcc aacctcattg gcaagtacat ccccaacctc actgccaagc cctttgagat 6240 caccaaggag tactttgaag aggtttacaa gctcaccggt tccgagaagg tcaagagcat 6300 catcaacaac tgggagtctt atgagtccaa gcagtaa 6337 <210> 16 <211> 2086 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2086) <223> Y. lipolytica fatty acid synthase 1 (XP_500912) <400> 16 Met Tyr Pro Thr Thr Gly Val Asn Thr Pro Gln Ser Ala Ala Ser Leu 1 5 10 15 Arg Pro Leu Val Leu Ser His Gly Gln Thr Glu His Ser Leu Leu Val 20 25 30 Pro Thr Ser Leu Tyr Ile Asn Cys Thr Thr Leu Arg Asp Gln Phe Tyr 35 40 45 Ala Ser Leu Pro Pro Ala Thr Glu Asp Lys Ala Asp Asp Asp Glu Pro 50 55 60 Ser Ser Ser Thr Glu Leu Leu Ala Ala Phe Leu Gly Phe Thr Ala Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Glu Glu Pro Gly Pro Tyr Asp Asp Val Leu Ser Leu Val 85 90 95 Leu Asn Glu Phe Glu Thr Arg Tyr Leu Arg Gly Asn Asp Ile His Ala 100 105 110 Val Ala Ser Ser Leu Leu Gln Asp Glu Asp Val Pro Thr Thr Val Gly 115 120 125 Lys Ile Lys Arg Val Ile Arg Ala Tyr Tyr Ala Ala Arg Ile Ala Cys 130 135 140 Asn Arg Pro Ile Lys Ala His Ser Ser Ala Leu Phe Arg Ala Ala Ser 145 150 155 160 Glu Asp Ser Asp Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Phe Gly Gly Gln Gly 165 170 175 Asn Thr Glu Asp Tyr Phe Glu Glu Leu Arg Glu Ile Tyr Asp Ile Tyr 180 185 190 Gln Gly Leu Val Gly Asp Phe Ile Arg Glu Cys Gly Ala Gln Leu Leu 195 200 205 Ala Leu Ser Arg Asp His Ile Ala Ala Glu Lys Ile Tyr Thr Lys Gly 210 215 220 Phe Asp Ile Val Lys Trp Leu Glu His Pro Glu Thr Ile Pro Asp Phe 225 230 235 240 Glu Tyr Leu Ile Ser Ala Pro Ile Ser Val Pro Ile Ile Gly Val Ile 245 250 255 Gln Leu Ala His Tyr Ala Val Thr Cys Arg Val Leu Gly Leu Asn Pro 260 265 270 Gly Gln Val Arg Asp Asn Leu Lys Gly Ala Thr Gly His Ser Gln Gly 275 280 285 Leu Ile Thr Ala Ile Ala Ile Ser Ala Ser Asp Ser Trp Asp Glu Phe 290 295 300 Tyr Asn Ser Ala Ser Arg Ile Leu Lys Ile Phe Phe Phe Ile Gly Val 305 310 315 320 Arg Val Gln Gln Ala Tyr Pro Ser Thr Phe Leu Pro Pro Ser Thr Leu 325 330 335 Glu Asp Ser Val Lys Gln Gly Glu Gly Lys Pro Thr Pro Met Leu Ser 340 345 350 Ile Arg Asp Leu Ser Leu Asn Gln Val Gln Glu Phe Val Asp Ala Thr 355 360 365 Asn Leu His Leu Pro Glu Asp Lys Gln Ile Val Val Ser Leu Ile Asn 370 375 380 Gly Pro Arg Asn Val Val Val Thr Gly Pro Pro Gln Ser Leu Tyr Gly 385 390 395 400 Leu Cys Leu Val Leu Arg Lys Gln Lys Ala Glu Thr Gly Leu Asp Gln 405 410 415 Ser Arg Val Pro His Ser Gln Arg Lys Leu Lys Phe Thr His Arg Phe 420 425 430 Leu Pro Ile Thr Ser Pro Phe His Ser Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Thr 435 440 445 Asp Leu Ile Ile Asn Asp Leu Glu Ser Ser Gly Val Glu Phe Val Ser 450 455 460 Ser Glu Leu Lys Val Pro Val Tyr Asp Thr Phe Asp Gly Ser Val Leu 465 470 475 480 Ser Gln Leu Pro Lys Gly Ile Val Ser Arg Leu Val Asn Leu Ile Thr 485 490 495 His Leu Pro Val Lys Trp Glu Lys Ala Thr Gln Phe Gln Ala Ser His 500 505 510 Ile Val Asp Phe Gly Pro Gly Gly Ala Ser Gly Leu Gly Leu Leu Thr 515 520 525 His Lys Asn Lys Asp Gly Thr Gly Val Arg Thr Ile Leu Ala Gly Val 530 535 540 Ile Asp Gln Pro Leu Glu Phe Gly Phe Lys Gln Glu Leu Phe Asp Arg 545 550 555 560 Gln Glu Ser Ser Ile Val Phe Ala Gln Asn Trp Ala Lys Glu Phe Ser 565 570 575 Pro Lys Leu Val Lys Ile Ser Ser Thr Asn Glu Val Tyr Val Asp Thr 580 585 590 Lys Phe Ser Arg Leu Thr Gly Arg Ala Pro Ile Met Val Ala Gly Met 595 600 605 Thr Pro Thr Thr Val Asn Pro Lys Phe Val Ala Ala Thr Met Asn Ser 610 615 620 Gly Tyr His Ile Glu Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Phe Ala Pro Gly Met 625 630 635 640 Met Thr Lys Ala Leu Glu His Ile Glu Lys Asn Thr Pro Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Ile Thr Ile Asn Leu Ile Tyr Val Asn Pro Arg Leu Ile Gln Trp 660 665 670 Gly Ile Pro Leu Ile Gln Glu Leu Arg Gln Lys Gly Phe Pro Ile Glu 675 680 685 Gly Leu Thr Ile Gly Ala Gly Val Pro Ser Leu Glu Val Ala Asn Glu 690 695 700 Trp Ile Gln Asp Leu Gly Val Lys His Ile Ala Phe Lys Pro Gly Ser 705 710 715 720 Ile Glu Ala Ile Ser Ser Val Ile Arg Ile Ala Lys Ala Asn Pro Asp 725 730 735 Phe Pro Ile Ile Leu Gln Trp Thr Gly Gly Arg Gly Gly Gly His His 740 745 750 Ser Phe Glu Asp Phe His Ala Pro Ile Leu Gln Met Tyr Ser Lys Ile 755 760 765 Arg Arg Cys Ser Asn Ile Val Leu Ile Ala Gly Ser Gly Phe Gly Ala 770 775 780 Ser Thr Asp Ser Tyr Pro Tyr Leu Thr Gly Ser Trp Ser Arg Asp Phe 785 790 795 800 Asp Tyr Pro Pro Met Pro Phe Asp Gly Ile Leu Val Gly Ser Arg Val 805 810 815 Met Val Ala Lys Glu Ala Phe Thr Ser Leu Gly Ala Lys Gln Leu Ile 820 825 830 Val Asp Ser Pro Gly Val Glu Asp Ser Glu Trp Glu Lys Thr Tyr Asp 835 840 845 Lys Pro Thr Gly Gly Val Ile Thr Val Leu Ser Glu Met Gly Glu Pro 850 855 860 Ile His Lys Leu Ala Thr Arg Gly Val Leu Phe Trp His Glu Met Asp 865 870 875 880 Lys Thr Val Phe Ser Leu Pro Lys Lys Lys Arg Leu Glu Val Leu Lys 885 890 895 Ser Lys Arg Ala Tyr Ile Ile Lys Arg Leu Asn Asp Asp Phe Gln Lys 900 905 910 Thr Trp Phe Ala Lys Asn Ala Gln Gly Gln Val Cys Asp Leu Glu Asp 915 920 925 Leu Thr Tyr Ala Glu Val Ile Gln Arg Leu Val Asp Leu Met Tyr Val 930 935 940 Lys Lys Glu Ser Arg Trp Ile Asp Val Thr Leu Arg Asn Leu Ala Gly 945 950 955 960 Thr Phe Ile Arg Arg Val Glu Glu Arg Phe Ser Thr Glu Thr Gly Ala 965 970 975 Ser Ser Val Leu Gln Ser Phe Ser Glu Leu Asp Ser Glu Pro Glu Lys 980 985 990 Val Val Glu Arg Val Phe Glu Leu Phe Pro Ala Ser Thr Thr Gln Ile 995 1000 1005 Ile Asn Ala Gln Asp Lys Asp His Phe Leu Met Leu Cys Leu Asn 1010 1015 1020 Pro Met Gln Lys Pro Val Pro Phe Ile Pro Val Leu Asp Asp Asn 1025 1030 1035 Phe Glu Phe Phe Phe Lys Lys Asp Ser Leu Trp Gln Cys Glu Asp 1040 1045 1050 Leu Ala Ala Val Val Asp Glu Asp Val Gly Arg Ile Cys Ile Leu 1055 1060 1065 Gln Gly Pro Val Ala Val Lys His Ser Lys Ile Val Asn Glu Pro 1070 1075 1080 Val Lys Glu Ile Leu Asp Ser Met His Glu Gly His Ile Lys Gln 1085 1090 1095 Leu Leu Glu Asp Gly Glu Tyr Ala Gly Asn Met Ala Asn Ile Pro 1100 1105 1110 Gln Val Glu Cys Phe Gly Gly Lys Pro Ala Gln Asn Phe Gly Asp 1115 1120 1125 Val Ala Leu Asp Ser Val Met Val Leu Asp Asp Leu Asn Lys Thr 1130 1135 1140 Val Phe Lys Ile Glu Thr Gly Thr Ser Ala Leu Pro Ser Ala Ala 1145 1150 1155 Asp Trp Phe Ser Leu Leu Ala Gly Asp Lys Asn Ser Trp Arg Gln 1160 1165 1170 Val Phe Leu Ser Thr Asp Thr Ile Val Gln Thr Thr Lys Met Ile 1175 1180 1185 Ser Asn Pro Leu His Arg Leu Leu Glu Pro Ile Ala Gly Leu Gln 1190 1195 1200 Val Glu Ile Glu His Pro Asp Glu Pro Glu Asn Thr Val Ile Ser 1205 1210 1215 Ala Phe Glu Pro Ile Asn Gly Lys Val Thr Lys Val Leu Glu Leu 1220 1225 1230 Arg Lys Gly Ala Gly Asp Val Ile Ser Leu Gln Leu Ile Glu Ala 1235 1240 1245 Arg Gly Val Asp Arg Val Pro Val Ala Leu Pro Leu Glu Phe Lys 1250 1255 1260 Tyr Gln Pro Gln Ile Gly Tyr Ala Pro Ile Val Glu Val Met Thr 1265 1270 1275 Asp Arg Asn Thr Arg Ile Lys Glu Phe Tyr Trp Lys Leu Trp Phe 1280 1285 1290 Gly Gln Asp Ser Lys Phe Glu Ile Asp Thr Asp Ile Thr Glu Glu 1295 1300 1305 Ile Ile Gly Asp Asp Val Thr Ile Ser Gly Lys Ala Ile Ala Asp 1310 1315 1320 Phe Val His Ala Val Gly Asn Lys Gly Glu Ala Phe Val Gly Arg 1325 1330 1335 Ser Thr Ser Ala Gly Thr Val Phe Ala Pro Met Asp Phe Ala Ile 1340 1345 1350 Val Leu Gly Trp Lys Ala Ile Ile Lys Ala Ile Phe Pro Arg Ala 1355 1360 1365 Ile Asp Ala Asp Ile Leu Arg Leu Val His Leu Ser Asn Gly Phe 1370 1375 1380 Lys Met Met Pro Gly Ala Asp Pro Leu Gln Met Gly Asp Val Val 1385 1390 1395 Ser Ala Thr Ala Lys Ile Asp Thr Val Lys Asn Ser Ala Thr Gly 1400 1405 1410 Lys Thr Val Ala Val Arg Gly Leu Leu Thr Arg Asp Gly Lys Pro 1415 1420 1425 Val Met Glu Val Val Ser Glu Phe Phe Tyr Arg Gly Glu Phe Ser 1430 1435 1440 Asp Phe Gln Asn Thr Phe Glu Arg Arg Glu Glu Val Pro Met Gln 1445 1450 1455 Leu Thr Leu Lys Asp Ala Lys Ala Val Ala Ile Leu Cys Ser Lys 1460 1465 1470 Glu Trp Phe Glu Tyr Asn Gly Asp Asp Thr Lys Asp Leu Glu Gly 1475 1480 1485 Lys Thr Ile Val Phe Arg Asn Ser Ser Phe Ile Lys Tyr Lys Asn 1490 1495 1500 Glu Thr Val Phe Ser Ser Val His Thr Thr Gly Lys Val Leu Met 1505 1510 1515 Glu Leu Pro Ser Lys Glu Val Ile Glu Ile Ala Thr Val Asn Tyr 1520 1525 1530 Gln Ala Gly Glu Ser His Gly Asn Pro Val Ile Asp Tyr Leu Glu 1535 1540 1545 Arg Asn Gly Thr Thr Ile Glu Gln Pro Val Glu Phe Glu Lys Pro 1550 1555 1560 Ile Pro Leu Ser Lys Ala Asp Asp Leu Leu Ser Phe Lys Ala Pro 1565 1570 1575 Ser Ser Asn Glu Pro Tyr Ala Gly Val Ser Gly Asp Tyr Asn Pro 1580 1585 1590 Ile His Val Ser Arg Ala Phe Ala Ser Tyr Ala Ser Leu Pro Gly 1595 1600 1605 Thr Ile Thr His Gly Met Tyr Ser Ser Ala Ala Val Arg Ser Leu 1610 1615 1620 Ile Glu Val Trp Ala Ala Glu Asn Asn Val Ser Arg Val Arg Ala 1625 1630 1635 Phe Ser Cys Gln Phe Gln Gly Met Val Leu Pro Asn Asp Glu Ile 1640 1645 1650 Val Thr Arg Leu Glu His Val Gly Met Ile Asn Gly Arg Lys Ile 1655 1660 1665 Ile Lys Val Thr Ser Thr Asn Arg Glu Thr Glu Ala Val Val Leu 1670 1675 1680 Ser Gly Glu Ala Glu Val Glu Gln Pro Ile Ser Thr Phe Val Phe 1685 1690 1695 Thr Gly Gln Gly Ser Gln Glu Gln Gly Met Gly Met Asp Leu Tyr 1700 1705 1710 Ala Ser Ser Glu Val Ala Lys Lys Val Trp Asp Lys Ala Asp Glu 1715 1720 1725 His Phe Leu Gln Asn Tyr Gly Phe Ser Ile Ile Lys Ile Val Val 1730 1735 1740 Glu Asn Pro Lys Glu Leu Asp Ile His Phe Gly Gly Pro Lys Gly 1745 1750 1755 Lys Lys Ile Arg Asp Asn Tyr Ile Ser Met Met Phe Glu Thr Ile 1760 1765 1770 Asp Glu Lys Thr Gly Asn Leu Ile Ser Glu Lys Ile Phe Lys Glu 1775 1780 1785 Ile Asp Glu Thr Thr Asp Ser Phe Thr Phe Lys Ser Pro Thr Gly 1790 1795 1800 Leu Leu Ser Ala Thr Gln Phe Thr Gln Pro Ala Leu Thr Leu Met 1805 1810 1815 Glu Lys Ala Ser Phe Glu Asp Met Lys Ala Lys Gly Leu Val Pro 1820 1825 1830 Val Asp Ala Thr Phe Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Tyr Ser Ala 1835 1840 1845 Leu Ala Ser Leu Gly Asp Val Met Pro Ile Glu Ser Leu Val Asp 1850 1855 1860 Val Val Phe Tyr Arg Gly Met Thr Met Gln Val Ala Val Pro Arg 1865 1870 1875 Asp Ala Gln Gly Arg Ser Asn Tyr Gly Met Cys Ala Val Asn Pro 1880 1885 1890 Ser Arg Ile Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ala Ala Leu Arg Phe Val 1895 1900 1905 Val Asp His Ile Ser Glu Gln Thr Lys Trp Leu Leu Glu Ile Val 1910 1915 1920 Asn Tyr Asn Val Glu Asn Ser Gln Tyr Val Thr Ala Gly Asp Leu 1925 1930 1935 Arg Ala Leu Asp Thr Leu Thr Asn Val Leu Asn Val Leu Lys Leu 1940 1945 1950 Glu Lys Ile Asn Ile Asp Lys Leu Leu Glu Ser Leu Pro Leu Glu 1955 1960 1965 Lys Val Lys Glu His Leu Ser Glu Ile Val Thr Glu Val Ala Lys 1970 1975 1980 Lys Ser Val Ala Lys Pro Gln Pro Ile Glu Leu Glu Arg Gly Phe 1985 1990 1995 Ala Val Ile Pro Leu Lys Gly Ile Ser Val Pro Phe His Ser Ser 2000 2005 2010 Tyr Leu Arg Asn Gly Val Lys Pro Phe Gln Asn Phe Leu Val Lys 2015 2020 2025 Lys Val Pro Lys Asn Ala Val Lys Pro Ala Asn Leu Ile Gly Lys 2030 2035 2040 Tyr Ile Pro Asn Leu Thr Ala Lys Pro Phe Glu Ile Thr Lys Glu 2045 2050 2055 Tyr Phe Glu Glu Val Tyr Lys Leu Thr Gly Ser Glu Lys Val Lys 2060 2065 2070 Ser Ile Ile Asn Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Ser Lys Gln 2075 2080 2085 <210> 17 <211> 5947 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5947) <223> Y. lipolytica fatty acid synthase 2 (YALI0_B19382g) <400> 17 agtgagtctt gaaatatggg atatgaggag gggtttgaag aggttgcaat cgataactca 60 cgacacggac gaaaaagaat aaggaccaac acgatctcca gacaaccaca gatcagcagt 120 cgaacccccc tcaacagcag acaaatgatg ttgtggaatt gcagtagatg atttcttctg 180 cgacgctagt attggctgtc ggcgacacta ttctctgaca gtgcccaatg gtctttttat 240 tgtgcaccaa ccgctgattt gtggctcagg ttttgtgacg gcgagagtca ttctcgtgat 300 gcatgggatg attggtctct ttgaagccga cagatcgaca tatttccaca cacagcaacg 360 acaatgttat cttatccatt gccattctaa cccagtgcac cccgaagtcg aacaagaact 420 cgcccacgtg ctcctgacgg agctgctggc ctaccaattt gcctcgcccg tgcgatggat 480 cgagacccag gacgtgctgt tcaagcagtt caatgtcgag cgagtcgtcg aagtcggccc 540 atccccaact ctcgccggca tggcccagcg aacccttaag tccaagtacg agtcatacga 600 cgctgctctg tctctgcagc gagagatcct gtgttactcc aaggaccaga aggacatcta 660 ctaccttgcc gatgaggccg atgaagcccc tgcccccgct gctggtggtg atgcccccgc 720 tgctcctgcc gctgccgctc ctgccgccgc tgccgctcct gctgccgctg ccgccccctc 780 tggccccgtt gccaaggttg aggacgcccc cgtcaaggcc caggagattc tccacgccct 840 ggtcgcccat aagctcaaga agacccccga gcaggtgccc ctgtccaagg ccatcaaaga 900 ccttgttggt ggtaagtcta ccatccagaa cgagattctc ggtgatctcg gaaaggaatt 960 tggtgccacc cctgagaagc ccgaggatac tccccttggc gagctggctg agtccttcca 1020 ggcctccttt gacggcaagc tcggtaagca gtcttcttct ctcattgccc gactcatgtc 1080 ctccaagatg cccggagggt tctctctcac ctctgctcga tcctacctcg acagcagatg 1140 gggcctggct gctggccgac aggactccgt tctgcttgtt gctctgatga acgaacccaa 1200 gaaccgactt ggctctgaag ccgaggccaa ggcctacctc gacgagcaga cccagaagta 1260 tgctgcttct gccggtctta acctgtctgc ccccgctggt ggtgccgagg gtggcaatgg 1320 cggtggcgcc gtcattgact ccgctgcctt tgacgctctc accaaggacc agcgatacct 1380 ggtccagcag caactcgagt tgtttgccaa ctacctgaag caggatctgc gacagggctc 1440 caaggtggct gctgcccaga aggaggccat ggatattctg caagctgaac tggatctttg 1500 gaactccgag cacggcgagg tctacgctga gggcatcaag cccgccttct ctgccctgaa 1560 ggcccgtgtc tacgactcgt actggaactg ggctcgacag gactcgctct ccatgtactt 1620 tgacattgtt ttcggtcgtc tctccaccgt tgaccgagag attatggcta agtgtatcca 1680 cctgatgaac cgaaccaacc acaacctgat cgactacatg cagtaccaca tggaccacgt 1740 ccccgttcac aagggagcca cctacgagct tgccaagcag ctcggtctgc agctcctcga 1800 gaactgtaag gagactctca ccgaggcccc cgtctacaag gatgtctctt accccactgg 1860 accccagacc accattgatg tcaagggtaa cattgtttac aacgaggtgc cccgacccaa 1920 tgtccgaaag ctcgagcagt atgtccacga gatggcctgt ggtggtgagc tgaccaagga 1980 cccctctttt gttggagaag gtgtccaggg cgagctcaag aagctgtact ctcagatctc 2040 tgctcttgcc aagacccaga ccggctctac cctcgacatc gaggctctgt actccgacct 2100 ggtcgctaag atctcccagg ccgaggacgc gtccaagcct gtcgttgaga acaaggctgt 2160 ttctgcctcc atcactcccg gcactctccc ttttctccac atcaagaaga agaccgaact 2220 tggtgcctgg aattacgaca gcgagaccac cgccacctac ctcgatggtc ttgaggttgc 2280 tgcccgtgat ggtctcactt tccagggcaa gactgctctg atcaccggtg ctggtgctgg 2340 ctccattggt gcctcaatcc tccagggtct catttccgga ggctgcaaag tcattgtcac 2400 aacctctcga tactcccgaa aggtgaccga gtactaccag tccctctaca ccaagttcgg 2460 tgctaagggt tccactctga ttgttgtccc cttcaaccaa ggctccaaga aggacgtgga 2520 cgagctggtg tcgttcatct acaacgaccc caagaacggc ggtcttggct gggatctgga 2580 ctttgttgtt ccctttgctg ctctgcccga gaacggtatt gagctggagc acattgactc 2640 aaagtccgag cttgcccatc gaatcatgct caccaacctc ctgcgtctgc ttggtaacgt 2700 caagaagcag aaagtggccc attcctacga gactcgaccc gcccaggtca tgctgcccct 2760 gtcgcccaac catggcaact tcggctccga tggtctgtac tccgagtcca agatctctct 2820 cgagactctg ttcaaccggt ggcacaccga gtcctggggc tcttatctca ccattgttgg 2880 tgtggtgatt ggctggaccc gaggtaccgg tctgatgagc gccaacaaca tcaccgccga 2940 gggtctggag cagctcggcg tccgaacctt ctcccagact gagatggcct tttccatcat 3000 gggtctcatg accaaggaca ttgtgcgact ggcccagaac tcccccgtgt gggccgatct 3060 caacggtggc ttccagtaca ttcccgacct caagggagtt gttggaaaga tccgacgaga 3120 cattgtggag acctccgaga tccgacgggc tgtggctcag gagactgcca ttgaacagaa 3180 ggtggtcaac ggcccccacg ccgatcttcc ttaccagaag gtcgaggtca agccccgagc 3240 caacctcaag tttgacttcc ccaccctcaa atcctacgcc gaggtcaagg agctgtctcc 3300 tgctggtgat gctctggagg gtcttctgga tctctcttcc gtcattgttg tcactggttt 3360 cgccgaggtc ggtccttggg gtaacgcccg aacccgatgg gacatggagg ccaacggtgt 3420 cttctccctt gagggtgcca ttgagatggc ctggatcatg ggtctgatca agcaccacaa 3480 tggtcccctg cccggcatgc ctcagtactc tggctggatc gataccaaga ccaagcagcc 3540 cgtcgatgac cgagatatca agaccaagta cgaggactac ctgcttgagc acgccggtat 3600 ccgactcatt gagcctgagc tgttccacgg ctacaacccc aagaagaaga ccttcctcca 3660 ggaggttatt gtggagcacg atctcgagcc ctttgaggcc tccaaggagt ctgctgagca 3720 atttgctctc gagcagggcg cgaacgttga gatcttcgcc gtccccgagt ccgaccagtg 3780 gactgtgcga cttctcaagg gcgccaagct cctcattccc aaggccctca agtttgaccg 3840 acttgtggcc ggccagattc ccactggatg ggatgcccga cgatacggta ttcccgagga 3900 catttgtgac caggttgacc ccatcactct gtacgctctt gtctccactg ttgaggctct 3960 gttggcctcc ggtattaccg acccctacga gttctacaag tacgtccacg tgtccgaggt 4020 cggtaactgt tccggttccg gtatgggtgg tatcaccgcc ctgcgaggca tgttcaagga 4080 ccggttcatg gacaagcctg ttcagaacga tattctccag gagtccttca tcaacaccat 4140 gtctgcctgg gtcaacatgt tgctgctctc ctcttccggt cccatcaaga cccccgttgg 4200 agcttgtgcc actgctgtcg agtctgtgga cattggttgc gaaaccattc tgtccggcaa 4260 ggccagaatc tgtctggtcg gtggttacga tgatttccag gaggagtctt ctcaggagtt 4320 tgcaaacatg aacgcaacat ccaacgctga gaccgagatc actcacggcc gaactccggc 4380 cgagatgtct cgacccatca cttccacacg agccggtttc atggaggctc agggtgctgg 4440 aacccaggtg ctgatggccg ccgacctcgc catcgccatg ggtgtgccca tctactgtat 4500 cgttggttac gtcaacactg ccaccgacaa gattggccga tctgtgcctg ctcccggtaa 4560 gggtatcctg accactgctc gagagcacca gactctcaaa cacgccaacc ctctcctcaa 4620 catcaagtac cgaaagcgac agctcgattc tcgactccga gacattaagc gatgggctga 4680 gggcgaaatg gaggctattg acattgagct tgacgacgtg tctgacgccg acaaggagtc 4740 cttcatccag gagcgatctg cccacatcca gtctcagtcc gatcgaatga tccgagaggc 4800 taagaactct tggggtaacg cctttttcaa gcaggacgcc cgaatctccc ccatccgagg 4860 agcgctggca acctacggtc tcaccattga tgacatctcc gtcgcttctt tccatggtac 4920 atccaccaag gccaacgaga agaacgagac caccaccgtc aacgccatgc tggagcatct 4980 cggcagaacc cggggtaacc ctgtctacgg tatcttccag aagtacctta ctggtcaccc 5040 caagggagct gctggtgcct ggatgctcaa cggagccatc caatgcctca actctggtat 5100 catccctggt aaccgaaacg ccgataacgt ggatgcctac tttgagcagt gccagcacgt 5160 ggtgttcccc tcgcgatctc tgcagaccga tggcctcaag gctgcttccg tgacctcctt 5220 tggtttcggt cagaagggtg cccaggccat tgtcatccac cccgactacc tgtacgctgc 5280 cctgacaccc tccgagtact ccgagtacac cacccgagtc gcccagcgat acaagaaggc 5340 ttaccgatac taccacaacg ccattgccga ggagtccatg ttccaggcca aggacaaggc 5400 tccctactct gctgagctgg agcaggaggt ctacctggat cctcttgtgc gagtccacca 5460 gaacgaggac accgagcagt actccttcaa cgccaaggac ctcgctgcct ccgcctttgt 5520 caagaactcc cacaaggaca ccgccaaggt gcttgccaac ctcacctccc aggtgtccgg 5580 ttctggtaag aacgttggtg tcgacgttga ggccatctcc gccatcaaca ttgataacga 5640 caccttcctt gaccgaaact tcaccgccaa cgagcaggcc tactgcttca aggccccctc 5700 cccccagtct tctttcgctg gcacttggtc tgccaaggag gctgttttca agtctctggg 5760 cgtcaagtcc cagggcggag gagctgagct caagtccatt gagatcactc gagatggcaa 5820 cggagctccc gtcgtggttc ttcacggagc tgccaaggac gctgctgctt ctaagggtat 5880 ctccaccgtc aaggtgtcca tttcccatga cgactctcag gccgtggctg ttgctgttgc 5940 cgagtag 5947 <210> 18 <211> 1850 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1850) <223> Y. lipolytica fatty acid synthase 2 (XP_501096) <400> 18 Met His Pro Glu Val Glu Gln Glu Leu Ala His Val Leu Leu Thr Glu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Tyr Gln Phe Ala Ser Pro Val Arg Trp Ile Glu Thr Gln 20 25 30 Asp Val Leu Phe Lys Gln Phe Asn Val Glu Arg Val Val Glu Val Gly 35 40 45 Pro Ser Pro Thr Leu Ala Gly Met Ala Gln Arg Thr Leu Lys Ser Lys 50 55 60 Tyr Glu Ser Tyr Asp Ala Ala Leu Ser Leu Gln Arg Glu Ile Leu Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Lys Asp Gln Lys Asp Ile Tyr Tyr Leu Ala Asp Glu Ala Asp 85 90 95 Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ala Gly Gly Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala 100 105 110 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro 115 120 125 Ser Gly Pro Val Ala Lys Val Glu Asp Ala Pro Val Lys Ala Gln Glu 130 135 140 Ile Leu His Ala Leu Val Ala His Lys Leu Lys Lys Thr Pro Glu Gln 145 150 155 160 Val Pro Leu Ser Lys Ala Ile Lys Asp Leu Val Gly Gly Lys Ser Thr 165 170 175 Ile Gln Asn Glu Ile Leu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Phe Gly Ala Thr 180 185 190 Pro Glu Lys Pro Glu Asp Thr Pro Leu Gly Glu Leu Ala Glu Ser Phe 195 200 205 Gln Ala Ser Phe Asp Gly Lys Leu Gly Lys Gln Ser Ser Ser Leu Ile 210 215 220 Ala Arg Leu Met Ser Ser Lys Met Pro Gly Gly Phe Ser Leu Thr Ser 225 230 235 240 Ala Arg Ser Tyr Leu Asp Ser Arg Trp Gly Leu Ala Ala Gly Arg Gln 245 250 255 Asp Ser Val Leu Leu Val Ala Leu Met Asn Glu Pro Lys Asn Arg Leu 260 265 270 Gly Ser Glu Ala Glu Ala Lys Ala Tyr Leu Asp Glu Gln Thr Gln Lys 275 280 285 Tyr Ala Ala Ser Ala Gly Leu Asn Leu Ser Ala Pro Ala Gly Gly Ala 290 295 300 Glu Gly Gly Asn Gly Gly Gly Ala Val Ile Asp Ser Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Leu Thr Lys Asp Gln Arg Tyr Leu Val Gln Gln Gln Leu Glu Leu 325 330 335 Phe Ala Asn Tyr Leu Lys Gln Asp Leu Arg Gln Gly Ser Lys Val Ala 340 345 350 Ala Ala Gln 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Ala Leu Tyr Ser Asp Leu Val Ala Lys Ile Ser Gln Ala 565 570 575 Glu Asp Ala Ser Lys Pro Val Val Glu Asn Lys Ala Val Ser Ala Ser 580 585 590 Ile Thr Pro Gly Thr Leu Pro Phe Leu His Ile Lys Lys Lys Thr Glu 595 600 605 Leu Gly Ala Trp Asn Tyr Asp Ser Glu Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Asp 610 615 620 Gly Leu Glu Val Ala Ala Arg Asp Gly Leu Thr Phe Gln Gly Lys Thr 625 630 635 640 Ala Leu Ile Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ser Ile Gly Ala Ser Ile Leu 645 650 655 Gln Gly Leu Ile Ser Gly Gly Cys Lys Val Ile Val Thr Thr Ser Arg 660 665 670 Tyr Ser Arg Lys Val Thr Glu Tyr Tyr Gln Ser Leu Tyr Thr Lys Phe 675 680 685 Gly Ala Lys Gly Ser Thr Leu Ile Val Val Pro Phe Asn Gln Gly Ser 690 695 700 Lys Lys Asp Val Asp Glu Leu Val Ser Phe Ile Tyr Asn Asp Pro Lys 705 710 715 720 Asn Gly Gly Leu Gly Trp Asp Leu Asp Phe Val Val Pro Phe Ala Ala 725 730 735 Leu Pro Glu Asn Gly Ile Glu Leu Glu His Ile Asp Ser Lys Ser Glu 740 745 750 Leu Ala His Arg Ile Met Leu Thr Asn Leu Leu Arg Leu Leu Gly Asn 755 760 765 Val Lys Lys Gln Lys Val Ala His Ser Tyr Glu Thr Arg Pro Ala Gln 770 775 780 Val Met Leu Pro Leu Ser Pro Asn His Gly Asn Phe Gly Ser Asp Gly 785 790 795 800 Leu Tyr Ser Glu Ser Lys Ile Ser Leu Glu Thr Leu Phe Asn Arg Trp 805 810 815 His Thr Glu Ser Trp Gly Ser Tyr Leu Thr Ile Val Gly Val Val Ile 820 825 830 Gly Trp Thr Arg Gly Thr Gly Leu Met Ser Ala Asn Asn Ile Thr Ala 835 840 845 Glu Gly Leu Glu Gln Leu Gly Val Arg Thr Phe Ser Gln Thr Glu Met 850 855 860 Ala Phe Ser Ile Met Gly Leu Met Thr Lys Asp Ile Val Arg Leu Ala 865 870 875 880 Gln Asn Ser Pro Val Trp Ala Asp Leu Asn Gly Gly Phe Gln Tyr Ile 885 890 895 Pro Asp Leu Lys Gly Val Val Gly Lys Ile Arg Arg Asp Ile Val Glu 900 905 910 Thr Ser Glu Ile Arg Arg Ala Val Ala Gln Glu Thr Ala Ile Glu Gln 915 920 925 Lys Val Val Asn Gly Pro His Ala Asp Leu Pro Tyr Gln Lys Val Glu 930 935 940 Val Lys Pro Arg Ala Asn Leu Lys Phe Asp Phe Pro Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Tyr Ala Glu Val Lys Glu Leu Ser Pro Ala Gly Asp Ala Leu Glu Gly 965 970 975 Leu Leu Asp Leu Ser Ser Val Ile Val Val Thr Gly Phe Ala Glu Val 980 985 990 Gly Pro Trp Gly Asn Ala Arg Thr Arg Trp Asp Met Glu Ala Asn Gly 995 1000 1005 Val Phe Ser Leu Glu Gly Ala Ile Glu Met Ala Trp Ile Met Gly 1010 1015 1020 Leu Ile Lys His His Asn Gly Pro Leu Pro Gly Met Pro Gln Tyr 1025 1030 1035 Ser Gly Trp Ile Asp Thr Lys Thr Lys Gln Pro Val Asp Asp Arg 1040 1045 1050 Asp Ile Lys Thr Lys Tyr Glu Asp Tyr Leu Leu Glu His Ala Gly 1055 1060 1065 Ile Arg Leu Ile Glu Pro Glu Leu Phe His Gly Tyr Asn Pro Lys 1070 1075 1080 Lys Lys Thr Phe Leu Gln Glu Val Ile Val Glu His Asp Leu Glu 1085 1090 1095 Pro Phe Glu Ala Ser Lys Glu Ser Ala Glu Gln Phe Ala Leu Glu 1100 1105 1110 Gln Gly Ala Asn Val Glu Ile Phe Ala Val Pro Glu Ser Asp Gln 1115 1120 1125 Trp Thr Val Arg Leu Leu Lys Gly Ala Lys Leu Leu Ile Pro Lys 1130 1135 1140 Ala Leu Lys Phe Asp Arg Leu Val Ala Gly Gln Ile Pro Thr Gly 1145 1150 1155 Trp Asp Ala Arg Arg Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Cys Asp Gln 1160 1165 1170 Val Asp Pro Ile Thr Leu Tyr Ala Leu 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1370 1375 1380 Val Pro Ala Pro Gly Lys Gly Ile Leu Thr Thr Ala Arg Glu His 1385 1390 1395 Gln Thr Leu Lys His Ala Asn Pro Leu Leu Asn Ile Lys Tyr Arg 1400 1405 1410 Lys Arg Gln Leu Asp Ser Arg Leu Arg Asp Ile Lys Arg Trp Ala 1415 1420 1425 Glu Gly Glu Met Glu Ala Ile Asp Ile Glu Leu Asp Asp Val Ser 1430 1435 1440 Asp Ala Asp Lys Glu Ser Phe Ile Gln Glu Arg Ser Ala His Ile 1445 1450 1455 Gln Ser Gln Ser Asp Arg Met Ile Arg Glu Ala Lys Asn Ser Trp 1460 1465 1470 Gly Asn Ala Phe Phe Lys Gln Asp Ala Arg Ile Ser Pro Ile Arg 1475 1480 1485 Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Gly Leu Thr Ile Asp Asp Ile Ser Val 1490 1495 1500 Ala Ser Phe His Gly Thr Ser Thr Lys Ala Asn Glu Lys Asn Glu 1505 1510 1515 Thr Thr Thr Val Asn Ala Met Leu Glu His Leu Gly Arg Thr Arg 1520 1525 1530 Gly Asn Pro Val Tyr Gly Ile Phe Gln Lys Tyr Leu Thr Gly His 1535 1540 1545 Pro Lys Gly Ala Ala Gly Ala Trp Met Leu Asn Gly Ala Ile Gln 1550 1555 1560 Cys Leu Asn Ser Gly Ile Ile Pro Gly Asn Arg Asn Ala Asp Asn 1565 1570 1575 Val Asp 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ttcctgctcc cgagaattgc gtctcctcgc tggaggtgtc caagtacctc 480 aacaagcagg gcgtgatcag tgacgatatt ctcaagaaga tggtggatcg atcagttgag 540 gatcccattg aaattagact agtgaccggt cttctgaaca aggacgatgg tctgcttcct 600 catgaacgaa gaatcaagtt ctgggttcga tgcaaacctg ttattgagcg agacgacgtt 660 cagtcggtcg gtattgctta cctcagtgac tctttcctgc tgggaacagc tatccgagtc 720 cagcccctca atcccggtgc tgcctctatg gttgtttccc tggaccacac aatctacttt 780 catggcaagt tccgagctga tgaatggctg ctgcacgtga ttgattccaa ctggagtgga 840 aacgagcggg cactggtccg aggacgactc tacaaccaac agggagtctt ggtcgccaca 900 gtgttccagg agggtgtcat tcgattgaag gagaaataca aaggcaaggc tgtagagacc 960 acagatgact atcttagcag cggaacgaga actgatgctg agaaggagga gtctaagaag 1020 aagggagcca tggctgctaa gagtattgac agtaagctgt aa 1062 <210> 20 <211> 353 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(353) <223> Y. lipolytica XP_505426 <400> 20 Met Ser Leu Leu Glu Arg Glu Leu Gln Ile Glu Glu Ile Asp Ile Asn 1 5 10 15 Leu Tyr Arg Ser Ala Lys Glu Leu Trp Arg Pro Ile 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accaaggtcg tggacggagt ggagaagaag gtgcccaagg aatggaagta ctttgagatg 300 ggcccttaca agtggctctc atacaaggag gcccttaagc tggtccatga ttatggagct 360 ggtcttcgac acctcggaat caagcccaag gagaagatgc acatttacgc ccagacctcc 420 caccgatgga tgctctctgg cctggcttct ctgtctcagg gtattcccat tgtcactgcc 480 tacgacactc ttggagagga gggtctcact cgatctctcc aggagaccaa ctcggtcatc 540 atgtttaccg acaaggctct gctgagctct ctcaaggtct ctctcaagaa gggcaccgat 600 ctgcgaatca tcatctacgg aggtgatctg acccccgacg acaagaaggc cggaaacacg 660 gagattgacg ccatcaagga gattgttcca gatatgaaga tctacaccat ggacgaggtt 720 gtcgctctcg gccgagaaca cccccacccc gtggaggagg tcgactatga ggacctggcc 780 ttcatcatgt acacctctgg ttctaccggt gtccccaagg gtgtggttct gcagcacaag 840 cagatcctcg cctctgtggc cggtgtcacc aagatcattg accgatctat catcggcaac 900 acagaccggc ttctcaactt cctgcccctc gcacacattt tcgagtttgt gttcgagatg 960 gtcaccttct ggtggggtgc ttctctgggt tacggaaccg tcaagaccat ttccgatctg 1020 tccatgaaga actgtaaggg agacattcga gagctcaagc ccaccatcat ggtcggcgtt 1080 cccgctgtct gggaacctat gcgaaagggt attcttggca agatcaagga gctgtctcct 1140 ctgatgcagc gggtcttctg ggcctcattt gccgccaagc agcgtctcga cgagaacgga 1200 ctccctggtg gatctatcct cgactcgctc attttcaaga aggtcaagga cgccactgga 1260 ggctgtctcc gatacgtgtg taacggaggt gctccagtat ctgtcgacac ccagaagttc 1320 atcaccactc tcatctgtcc catgctgatt ggatgcggtc tgaccgagac tacagccaac 1380 accaccatca tgtcgcctaa atcgtacgcc tttggcacca ttggtgagcc caccgccgcc 1440 gtgaccctca agctcattga cgtgcctgaa gccggctact tcgccgagaa caaccaggga 1500 gagctgtgca tcaagggcaa cgtcgtgatg aaggagtact acaagaacga ggaggagacc 1560 aagaaggcgt tctccgacga tggctatttc ctcaccggtg atattgccga gtggaccgcc 1620 aatggccagc tcagaatcat tgaccgacga aagaacctcg tcaagaccca gaacggagag 1680 tacattgctc tggagaagct cgagacacag taccgatcgt cgtcgtacgt ggccaacctg 1740 tgtgtgtacg ccgaccagaa ccgagtcaag cccattgctc tggtcattcc taacgagggc 1800 cccaccaaga agcttgccca gagcttgggc gtcgattctg acgactggga cgccgtctgt 1860 tccaacaaaa aggtggtcaa ggctgtgctc aaggacatgc tcgataccgg ccgatctctg 1920 ggtctgtccg gcattgagct gctgcaaggc attgtgttgc tgcctggcga gtggactcct 1980 cagaacagct acctgactgc tgcccagaag ctcaaccgaa agaagattgt ggatgataac 2040 aagaaggaaa ttgatgagtg ctacgagcag tcttag 2076 <210> 22 <211> 691 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(691) <223> Y. lipolytica fatty acyl-CoA synthase (XP_502959) <400> 22 Met Val Gly Tyr Thr Ile Ser Ser Lys Pro Val Ser Val Glu Val Gly 1 5 10 15 Pro Ala Lys Pro Gly Glu Thr Ala Pro Arg Arg Asn Val Ile Ala Lys 20 25 30 Asp Ala Pro Val Val Phe Pro Asp Asn Asp Ser Ser Leu Thr Thr Val 35 40 45 Tyr Lys Leu Phe Lys Lys Tyr Ala Glu Ile Asn Ser Glu Arg Lys Ala 50 55 60 Met Gly Trp Arg Asp Thr Ile Asp Ile His Val Glu Thr Lys Gln Val 65 70 75 80 Thr Lys Val Val Asp Gly Val Glu Lys Lys Val Pro Lys Glu Trp Lys 85 90 95 Tyr Phe Glu Met Gly Pro Tyr Lys Trp Leu Ser Tyr Lys Glu Ala Leu 100 105 110 Lys Leu Val His Asp Tyr Gly Ala Gly Leu Arg His Leu Gly Ile Lys 115 120 125 Pro Lys Glu Lys Met His Ile Tyr Ala Gln Thr Ser His Arg Trp Met 130 135 140 Leu Ser Gly Leu Ala Ser Leu Ser Gln Gly Ile Pro Ile Val Thr Ala 145 150 155 160 Tyr Asp Thr Leu Gly Glu Glu Gly Leu Thr Arg Ser Leu Gln Glu Thr 165 170 175 Asn Ser Val Ile Met Phe Thr Asp Lys Ala Leu Leu Ser Ser Leu Lys 180 185 190 Val Ser Leu Lys Lys Gly Thr Asp Leu Arg Ile Ile Ile Tyr Gly Gly 195 200 205 Asp Leu Thr Pro Asp Asp Lys Lys Ala Gly Asn Thr Glu Ile Asp Ala 210 215 220 Ile Lys Glu Ile Val Pro Asp Met Lys Ile Tyr Thr Met Asp Glu Val 225 230 235 240 Val Ala Leu Gly Arg Glu His Pro His Pro Val Glu Glu Val Asp Tyr 245 250 255 Glu Asp Leu Ala Phe Ile Met Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Val Pro 260 265 270 Lys Gly Val Val Leu Gln His Lys Gln Ile Leu Ala Ser Val Ala Gly 275 280 285 Val Thr Lys Ile Ile Asp Arg Ser Ile Ile Gly Asn Thr Asp Arg Leu 290 295 300 Leu Asn Phe Leu Pro Leu Ala His Ile Phe Glu Phe Val Phe Glu Met 305 310 315 320 Val Thr Phe Trp Trp Gly Ala Ser Leu Gly Tyr Gly Thr Val Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Asp Leu Ser Met Lys Asn Cys Lys Gly Asp Ile Arg Glu Leu 340 345 350 Lys Pro Thr Ile Met Val Gly Val Pro Ala Val Trp Glu Pro Met Arg 355 360 365 Lys Gly Ile Leu Gly Lys Ile Lys Glu Leu Ser Pro Leu Met Gln Arg 370 375 380 Val Phe Trp Ala Ser Phe Ala Ala Lys Gln Arg Leu Asp Glu Asn Gly 385 390 395 400 Leu Pro Gly Gly Ser Ile Leu Asp Ser Leu Ile Phe Lys Lys Val Lys 405 410 415 Asp Ala Thr Gly Gly Cys Leu Arg Tyr Val Cys Asn Gly Gly Ala Pro 420 425 430 Val Ser Val Asp Thr Gln Lys Phe Ile Thr Thr Leu Ile Cys Pro Met 435 440 445 Leu Ile Gly Cys Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ala Asn Thr Thr Ile Met 450 455 460 Ser Pro Lys Ser Tyr Ala Phe Gly Thr Ile Gly Glu Pro Thr Ala Ala 465 470 475 480 Val Thr Leu Lys Leu Ile Asp Val Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Glu 485 490 495 Asn Asn Gln Gly Glu Leu Cys Ile Lys Gly Asn Val Val Met Lys Glu 500 505 510 Tyr Tyr Lys Asn Glu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Phe Ser Asp Asp Gly 515 520 525 Tyr Phe Leu Thr Gly Asp Ile Ala Glu Trp Thr Ala Asn Gly Gln Leu 530 535 540 Arg Ile Ile Asp Arg Arg Lys Asn Leu Val Lys Thr Gln Asn Gly Glu 545 550 555 560 Tyr Ile Ala Leu Glu Lys Leu Glu Thr Gln Tyr Arg Ser Ser Ser Tyr 565 570 575 Val Ala Asn Leu Cys Val Tyr Ala Asp Gln Asn Arg Val Lys Pro Ile 580 585 590 Ala Leu Val Ile Pro Asn Glu Gly Pro Thr Lys Lys Leu Ala Gln Ser 595 600 605 Leu Gly Val Asp Ser Asp Asp Trp Asp Ala Val Cys Ser Asn Lys Lys 610 615 620 Val Val Lys Ala Val Leu Lys Asp Met Leu Asp Thr Gly Arg Ser Leu 625 630 635 640 Gly Leu Ser Gly Ile Glu Leu Leu Gln Gly Ile Val Leu Leu Pro Gly 645 650 655 Glu Trp Thr Pro Gln Asn Ser Tyr Leu Thr Ala Ala Gln Lys Leu Asn 660 665 670 Arg Lys Lys Ile Val Asp Asp Asn Lys Lys Glu Ile Asp Glu Cys Tyr 675 680 685 Glu Gln Ser 690 <210> 23 <211> 968 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H. armigera cytochrome b5 reductase (XP_021183830) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(968) <223> H. armigera cytochrome b5 reductase (XP_021183830) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <400> 23 tgtctaacgt cgaggtggcc gtggacgacg ccttcggcat cctgaccgtg ctgcccatcg 60 tggtgggcgt gtctgccgcc gtggtgctgg tgtctgtgat cgccaactgc ttctggggca 120 agaaggacaa gaaggctgct cccaagaagt cctctcagct gatcaccctg gtggacccca 180 acgtgaagta cgctctgccc ctgatcgagc gagaggaaat ctctcacgac acccgacgat 240 tccgattcgg actgccctct tcggagcacg tcctgggact gcccattggc cagcacatcc 300 acctgtctgc caagatcgac gacgacctgg tgatccgatc ttacacccct gtgtcctctg 360 acgaagagaa gggctacgtc gagctggtga tcaaggtgta cttcaagaac gtgcacccta 420 agttccccga cggcggcaag atgtctcagc acctgaactc cctgaagatc aacgacacca 480 tcgacgtgcg aggcccctct ggccgactgc agtacgccgg caacggcctg ttcctgatca 540 agaagatgcg aaaggaccct cctgtcgagc tgcgagccaa gaagctgaac atgattgccg 600 gcggaaccgg aatcgctccc atgctgcagc tgatccgaca catctgcaag gacgcctctg 660 atcccaccga gatgcgactg ctgttcgcca accagaccga agaggacatc ctgctgcgaa 720 acgagctgga aaagtaccag gctgagcacc ccgagcagtt caagctgtgg tacaccctgg 780 accgacctaa cgaaggctgg aagtactctg tgggcttcat caacgacgag atgatcaagg 840 aacacctgtt cgctcccgcc gacgacgtgc tggtgctgat gtgcggccct cctcctatga 900 tcaacttcgc ttgcaacccc gctctcgaga agctgggcta ccccgagtct cagcgattcg 960 cctactaa 968 <210> 24 <211> 322 <212> PRT <213> Helicoverpa armigera <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(322) <223> H. armigera cytochrome b5 reductase (XP_021183830) <400> 24 Met Ser Asn Val Glu Val Ala Val Asp Asp Ala Phe Gly Ile Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Pro Ile Val Val Gly Val Ser Ala Ala Val Val Leu Val Ser 20 25 30 Val Ile Ala Asn Cys Phe Trp Gly Lys Lys Asp Lys Lys Ala Ala Pro 35 40 45 Lys Lys Ser Ser Gln Leu Ile Thr Leu Val Asp Pro Asn Val Lys Tyr 50 55 60 Ala Leu Pro Leu Ile Glu Arg Glu Glu Ile Ser His Asp Thr Arg Arg 65 70 75 80 Phe Arg Phe Gly Leu Pro Ser Ser Glu His Val Leu Gly Leu Pro Ile 85 90 95 Gly Gln His Ile His Leu Ser Ala Lys Ile Asp Asp Asp Leu Val Ile 100 105 110 Arg Ser Tyr Thr Pro Val Ser Ser Asp Glu Glu Lys Gly Tyr Val Glu 115 120 125 Leu Val Ile Lys Val Tyr Phe Lys Asn Val His Pro Lys Phe Pro Asp 130 135 140 Gly Gly Lys Met Ser Gln His Leu Asn Ser Leu Lys Ile Asn Asp Thr 145 150 155 160 Ile Asp Val Arg Gly Pro Ser Gly Arg Leu Gln Tyr Ala Gly Asn Gly 165 170 175 Leu Phe Leu Ile Lys Lys Met Arg Lys Asp Pro Pro Val Glu Leu Arg 180 185 190 Ala Lys Lys Leu Asn Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly Ile Ala Pro Met 195 200 205 Leu Gln Leu Ile Arg His Ile Cys Lys Asp Ala Ser Asp Pro Thr Glu 210 215 220 Met Arg Leu Leu Phe Ala Asn Gln Thr Glu Glu Asp Ile Leu Leu Arg 225 230 235 240 Asn Glu Leu Glu Lys Tyr Gln Ala Glu His Pro Glu Gln Phe Lys Leu 245 250 255 Trp Tyr Thr Leu Asp Arg Pro Asn Glu Gly Trp Lys Tyr Ser Val Gly 260 265 270 Phe Ile Asn Asp Glu Met Ile Lys Glu His Leu Phe Ala Pro Ala Asp 275 280 285 Asp Val Leu Val Leu Met Cys Gly Pro Pro Pro Met Ile Asn Phe Ala 290 295 300 Cys Asn Pro Ala Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Pro Glu Ser Gln Arg Phe 305 310 315 320 Ala Tyr <210> 25 <211> 627 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> E. coli thioesterase (AAB40248) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(627) <223> E. coli thioesterase (AAB40248) codon optimized for Y. lipolytica; mRNA-coding sequence <400> 25 atgatgaact tcaacaacgt gttccgatgg catctgccct ttctgtttct ggtgctgctg 60 accttccgag ccgccgctgc tgacaccctg ctgatcctgg gcgactctct gtctgccggc 120 taccgaatgt ctgcctctgc cgcttggccc gctctgctga acgacaagtg gcagtctaag 180 acctctgtgg tgaacgcctc tatctctggc gacacctctc agcagggcct cgctcgactg 240 cctgctctgc tcaagcagca tcagccccga tgggtgctcg tcgagcttgg cggcaacgac 300 ggcctgcgag gcttccagcc tcagcagacc gagcagaccc tgcgacagat tctgcaggac 360 gtgaaggccg ccaacgctga gcctctgctg atgcagattc gactgcccgc caactacggc 420 cgacgataca acgaggcctt ctctgctatc taccccaagc tggccaagga attcgacgtg 480 cccctgctgc cattcttcat ggaagaggtg tacctgaagc ctcagtggat gcaggacgac 540 ggcattcacc ccaaccgaga tgctcagccc ttcattgccg actggatggc caagcagctg 600 cagcctctgg tgaaccacga ctcttaa 627 <210> 26 <211> 218 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(218) <223> E. coli thioesterase (AAB40248) <400> 26 Met Leu Pro Leu Thr Asp Gly Leu Leu Lys Met Met Asn Phe Asn Asn 1 5 10 15 Val Phe Arg Trp His Leu Pro Phe Leu Phe Leu Val Leu Leu Thr Phe 20 25 30 Arg Ala Ala Ala Ala Asp Thr Leu Leu Ile Leu Gly Asp Ser Leu Ser 35 40 45 Ala Gly Tyr Arg Met Ser Ala Ser Ala Ala Trp Pro Ala Leu Leu Asn 50 55 60 Asp Lys Trp Gln Ser Lys Thr Ser Val Val Asn Ala Ser Ile Ser Gly 65 70 75 80 Asp Thr Ser Gln Gln Gly Leu Ala Arg Leu Pro Ala Leu Leu Lys Gln 85 90 95 His Gln Pro Arg Trp Val Leu Val Glu Leu Gly Gly Asn Asp Gly Leu 100 105 110 Arg Gly Phe Gln Pro Gln Gln Thr Glu Gln Thr Leu Arg Gln Ile Leu 115 120 125 Gln Asp Val Lys Ala Ala Asn Ala Glu Pro Leu Leu Met Gln Ile Arg 130 135 140 Leu Pro Ala Asn Tyr Gly Arg Arg Tyr Asn Glu Ala Phe Ser Ala Ile 145 150 155 160 Tyr Pro Lys Leu Ala Lys Glu Phe Asp Val Pro Leu Leu Pro Phe Phe 165 170 175 Met Glu Glu Val Tyr Leu Lys Pro Gln Trp Met Gln Asp Asp Gly Ile 180 185 190 His Pro Asn Arg Asp Ala Gln Pro Phe Ile Ala Asp Trp Met Ala Lys 195 200 205 Gln Leu Gln Pro Leu Val Asn His Asp Ser 210 215 <210> 27 <211> 531 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> misc_feature <222> (1)..(531) <223> Y. lipolytica TEFintron promoter <400> 27 agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60 cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120 aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180 cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240 gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300 aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360 cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaatgg tgagtttcag 420 aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480 acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt actaaccgca g 531 <210> 28 <211> 1002 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1002) <223> Y. lipolytica EXP promoter <400> 28 aaggagtttg gcgcccgttt tttcgagccc cacacgtttc ggtgagtatg agcggcggca 60 gattcgagcg tttccggttt ccgcggctgg acgagagccc atgatggggg ctcccaccac 120 cagcaatcag ggccctgatt acacacccac ctgtaatgtc atgctgttca tcgtggttaa 180 tgctgctgtg tgctgtgtgt gtgtgttgtt tggcgctcat tgttgcgtta tgcagcgtac 240 accacaatat tggaagctta ttagcctttc tattttttcg tttgcaaggc ttaacaacat 300 tgctgtggag agggatgggg atatggaggc cgctggaggg agtcggagag gcgttttgga 360 gcggcttggc ctggcgccca gctcgcgaaa cgcacctagg accctttggc acgccgaaat 420 gtgccacttt tcagtctagt aacgccttac ctacgtcatt ccatgcatgc atgtttgcgc 480 cttttttccc ttgcccttga tcgccacaca gtacagtgca ctgtacagtg gaggttttgg 540 gggggtctta gatgggagct aaaagcggcc tagcggtaca ctagtgggat tgtatggagt 600 ggcatggagc ctaggtggag cctgacagga cgcacgaccg gctagcccgt gacagacgat 660 gggtggctcc tgttgtccac cgcgtacaaa tgtttgggcc aaagtcttgt cagccttgct 720 tgcgaaccta attcccaatt ttgtcacttc gcacccccat tgatcgagcc ctaacccctg 780 cccatcaggc aatccaatta agctcgcatt gtctgccttg tttagtttgg ctcctgcccg 840 tttcggcgtc cacttgcaca aacacaaaca agcattatat ataaggctcg tctctccctc 900 ccaaccacac tcactttttt gcccgtcttc ccttgctaac acaaaagtca agaacacaaa 960 caaccacccc aaccccctta cacacaagac atatctacag ca 1002 <210> 29 <211> 1029 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1029) <223> Y. lipolytica YEF3 promoter <400> 29 gatagctgag ggatatggtg tagataaggg gtgtccgagg gccgtgttag cactccagag 60 agagtgcaca tggagctcgg gctggggtct cgaagcgttg tccggcagct tttttgccac 120 ccccaaaact gaacatcacc ctttgaccct gtcccacaat cagccgtata cttgggttca 180 gcaactctgg atactacagg aaaactatgc agagatccaa ccacacacgg ccaatgtcct 240 ctatggagct gcgtgggaga tattgggtaa gtcctaagtg gctggaaaag ggggattgag 300 cccgcgtcct aggccatggt ccatcccgtt gctctcaatg ccggcctata gaacgggttc 360 caacactaca cacacccact aatgcacccc tccccctcgt gttagccgag gagagatggt 420 atgagtgagt agacaagaag agatggtgat gaccgagaac gccgatagta tcagcgagat 480 acacgccaac aaccaaacaa cttggttgcc ctcaaatcaa gcccctcttc gccattcggt 540 tccttccaga ccattccaga tcaatccacc tcttcttatc tcaggtgggt gtgctgacat 600 cagaccccgt agcccttctc ccagtggcga acagcaggca taaaacaggg ccattgagca 660 gagcaaacaa ggtcggtgaa atcgtcgaaa aagtcggaaa acggttgcaa gaaattggag 720 cgtcacctgc caccctccag gctctatata aagcattgcc ccaattgcta acgcttcata 780 tttacacctt tggcacccca gtccatccct ccaataaaat gtactacatg ggacacaaca 840 agagaggatg cgcgcccaaa ccctaaccta gcacatgcac gatgattctc tttgtctgtg 900 aaaaaatttt tccaccaaaa tttccccatt gggatgaaac cctaaccgca accaaaagtt 960 tttaactatc atcttgtacg tcacggtttc cgattcttct cttctctttc atcatcatca 1020 cttgtgacc 1029 <210> 30 <211> 2247 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 30 atgacgagac gtactactat taatcccgat tcggtggttc tgaatcctca aaaatttatc 60 cagaaagaaa gggcggattc gaaaatcaaa gttgaccaag ttaacacatt tttagagtca 120 tccccggaga ggagaactct gacgcacgcc ttaatagacc aaatagtgaa tgatcctata 180 ttgaaaactg atacggacta ttacgatgct aaaaaaatgc aagagagaga aattactgcc 240 aaaaaaatag ctaggcttgc tagttatatg gagcacgata tcaaaacagt gcgcaaacac 300 tttcgcgaca ctgacctgat gaaagagttg caagcaaatg atccagacaa agcttcgcct 360 ttaacaaaca aagacctttt tatattcgat aagagattgt cacttgtagc aaatattgat 420 cctcaattgg gtacgcgcgt gggtgtacac ttggggctat ttggtaattg tatcaagggc 480 aatggtactg atgagcaaat ccggtattgg ttgcaggaga gaggtgccac tttgatgaaa 540 ggtatatatg gctgttttgc aatgactgag ttaggacatg gttccaatgt tgcccagctg 600 cagactaggg ctgtgtacga taagcaaaat gatacttttg taattgatac acctgatcta 660 actgccacca aatggtggat tggtggggct gcccattctg ccacgcacgc tgccgtgtac 720 gccagattga tcgttgaagg taaagactac ggtgtaaaaa cattcgttgt tcctctgaga 780 gacccttcga ctttccaact gttagctggt gtttccatag gggatattgg agcgaagatg 840 ggtcgtgacg gtattgataa tggctggatc cagttcagaa acgtagttat ccctagagaa 900 tttatgctaa gtagatttac caaagttgtc cgttctccag atggttcagt caccgtcaaa 960 actgagccac aattggatca aatttctggt tatagtgcat tgttaagtgg tagagttaac 1020 atggtcatgg attcatttag gtttggctcc aaatttgcta ctattgctgt acgttacgcg 1080 gttggtcgtc agcaattcgc acctagaaag ggattgtctg aaacacaatt aatcgactat 1140 ccccttcacc aatatcgtgt tttaccacaa ttgtgtgttc catatttggt gtcacctgta 1200 gcttttaagt taatggacaa ctattattcc actttggacg agttatacaa cgcttcctca 1260 tctgcataca aagctgctct ggttaccgtg agtaaaaagt tgaagaattt atttattgat 1320 agcgccagct tgaaagccac caatacttgg ttaattgcta cactgattga tgagttgaga 1380 cagacttgcg gaggacatgg gtattcacag tataacggat ttggtaaagg ctatgacgac 1440 tgggtggttc agtgcacatg ggagggtgat aataatgttt tatctttaac ttcagcaaaa 1500 tcaatattga aaaaatttat cgattcagcc acaaagggta gatttgacaa cacactggat 1560 gtggactcat tctcttactt aaaacctcag tacataggat ctgtggtttc tggagaaata 1620 aagagtggtt taaaggagtt gggtgattat actgaaattt ggtctatcac cttaatcaaa 1680 ttactggcac atattggtac tttagttgaa aaatcaagaa gtattgatag cgtttctaag 1740 cttttagtct tagtatccaa atttcatgcc ttgcgctgca tgttgaaaac ctattacgac 1800 aagttaaact ctcgtgattc acatatttcc gatgaaatta caaaggaatc tatgtggaat 1860 gtttataagt tattttcctt gtattttatt gacaagcatt ccggagaatt ccaacaattc 1920 aagatcttca ctcctgatca gatctctaaa gttgtgcagc cacaactatt ggctcttttg 1980 ccaattgtga ggaaagactg tataggtctg acagactcct ttgaattacc tgacgcgatg 2040 ttaaattctc ctataggtta ctttgatggc gatatctatc acaattactt caatgaagtt 2100 tgccgcaata atccagtgga ggcagatggg gcagggaagc cttcttatca tgcgctgttg 2160 agcagcatgc tcggtagagg tttcgaattt gaccaaaagt taggtggtgc agctaatgcg 2220 gaaattttat cgaaaataaa caagtga 2247 <210> 31 <211> 748 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 31 Met Thr Arg Arg Thr Thr Ile Asn Pro Asp Ser Val Val Leu Asn Pro 1 5 10 15 Gln Lys Phe Ile Gln Lys Glu Arg Ala Asp Ser Lys Ile Lys Val Asp 20 25 30 Gln Val Asn Thr Phe Leu Glu Ser Ser Pro Glu Arg Arg Thr Leu Thr 35 40 45 His Ala Leu Ile Asp Gln Ile Val Asn Asp Pro Ile Leu Lys Thr Asp 50 55 60 Thr Asp Tyr Tyr Asp Ala Lys Lys Met Gln Glu Arg Glu Ile Thr Ala 65 70 75 80 Lys Lys Ile Ala Arg Leu Ala Ser Tyr Met Glu His Asp Ile Lys Thr 85 90 95 Val Arg Lys His Phe Arg Asp Thr Asp Leu Met Lys Glu Leu Gln Ala 100 105 110 Asn Asp Pro Asp Lys Ala Ser Pro Leu Thr Asn Lys Asp Leu Phe Ile 115 120 125 Phe Asp Lys Arg Leu Ser Leu Val Ala Asn Ile Asp Pro Gln Leu Gly 130 135 140 Thr Arg Val Gly Val His Leu Gly Leu Phe Gly Asn Cys Ile Lys Gly 145 150 155 160 Asn Gly Thr Asp Glu Gln Ile Arg Tyr Trp Leu Gln Glu Arg Gly Ala 165 170 175 Thr Leu Met Lys Gly Ile Tyr Gly Cys Phe Ala Met Thr Glu Leu Gly 180 185 190 His Gly Ser Asn Val Ala Gln Leu Gln Thr Arg Ala Val Tyr Asp Lys 195 200 205 Gln Asn Asp Thr Phe Val Ile Asp Thr Pro Asp Leu Thr Ala Thr Lys 210 215 220 Trp Trp Ile Gly Gly Ala Ala His Ser Ala Thr His Ala Ala Val Tyr 225 230 235 240 Ala Arg Leu Ile Val Glu Gly Lys Asp Tyr Gly Val Lys Thr Phe Val 245 250 255 Val Pro Leu Arg Asp Pro Ser Thr Phe Gln Leu Leu Ala Gly Val Ser 260 265 270 Ile Gly Asp Ile Gly Ala Lys Met Gly Arg Asp Gly Ile Asp Asn Gly 275 280 285 Trp Ile Gln Phe Arg Asn Val Val Ile Pro Arg Glu Phe Met Leu Ser 290 295 300 Arg Phe Thr Lys Val Val Arg Ser Pro Asp Gly Ser Val Thr Val Lys 305 310 315 320 Thr Glu Pro Gln Leu Asp Gln Ile Ser Gly Tyr Ser Ala Leu Leu Ser 325 330 335 Gly Arg Val Asn Met Val Met Asp Ser Phe Arg Phe Gly Ser Lys Phe 340 345 350 Ala Thr Ile Ala Val Arg Tyr Ala Val Gly Arg Gln Gln Phe Ala Pro 355 360 365 Arg Lys Gly Leu Ser Glu Thr Gln Leu Ile Asp Tyr Pro Leu His Gln 370 375 380 Tyr Arg Val Leu Pro Gln Leu Cys Val Pro Tyr Leu Val Ser Pro Val 385 390 395 400 Ala Phe Lys Leu Met Asp Asn Tyr Tyr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Tyr 405 410 415 Asn Ala Ser Ser Ser Ala Tyr Lys Ala Ala Leu Val Thr Val Ser Lys 420 425 430 Lys Leu Lys Asn Leu Phe Ile Asp Ser Ala Ser Leu Lys Ala Thr Asn 435 440 445 Thr Trp Leu Ile Ala Thr Leu Ile Asp Glu Leu Arg Gln Thr Cys Gly 450 455 460 Gly His Gly Tyr Ser Gln Tyr Asn Gly Phe Gly Lys Gly Tyr Asp Asp 465 470 475 480 Trp Val Val Gln Cys Thr Trp Glu Gly Asp Asn Asn Val Leu Ser Leu 485 490 495 Thr Ser Ala Lys Ser Ile Leu Lys Lys Phe Ile Asp Ser Ala Thr Lys 500 505 510 Gly Arg Phe Asp Asn Thr Leu Asp Val Asp Ser Phe Ser Tyr Leu Lys 515 520 525 Pro Gln Tyr Ile Gly Ser Val Val Ser Gly Glu Ile Lys Ser Gly Leu 530 535 540 Lys Glu Leu Gly Asp Tyr Thr Glu Ile Trp Ser Ile Thr Leu Ile Lys 545 550 555 560 Leu Leu Ala His Ile Gly Thr Leu Val Glu Lys Ser Arg Ser Ile Asp 565 570 575 Ser Val Ser Lys Leu Leu Val Leu Val Ser Lys Phe His Ala Leu Arg 580 585 590 Cys Met Leu Lys Thr Tyr Tyr Asp Lys Leu Asn Ser Arg Asp Ser His 595 600 605 Ile Ser Asp Glu Ile Thr Lys Glu Ser Met Trp Asn Val Tyr Lys Leu 610 615 620 Phe Ser Leu Tyr Phe Ile Asp Lys His Ser Gly Glu Phe Gln Gln Phe 625 630 635 640 Lys Ile Phe Thr Pro Asp Gln Ile Ser Lys Val Val Gln Pro Gln Leu 645 650 655 Leu Ala Leu Leu Pro Ile Val Arg Lys Asp Cys Ile Gly Leu Thr Asp 660 665 670 Ser Phe Glu Leu Pro Asp Ala Met Leu Asn Ser Pro Ile Gly Tyr Phe 675 680 685 Asp Gly Asp Ile Tyr His Asn Tyr Phe Asn Glu Val Cys Arg Asn Asn 690 695 700 Pro Val Glu Ala Asp Gly Ala Gly Lys Pro Ser Tyr His Ala Leu Leu 705 710 715 720 Ser Ser Met Leu Gly Arg Gly Phe Glu Phe Asp Gln Lys Leu Gly Gly 725 730 735 Ala Ala Asn Ala Glu Ile Leu Ser Lys Ile Asn Lys 740 745 <210> 32 <211> 1236 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1236) <223> Y.lipolytica codon-optimized nucleotide sequence of thioesterase from Cuphea palustris CpFATB2 <400> 32 atggtggccg ctgccgcctc cgccgccttc ttctctgtgg ccacccctcg aactaacatc 60 tctccctcgt ctctgtctgt gcccttcaag cccaagtcta accacaacgg cggcttccag 120 gtgaaggcca acgcctctgc ccaccccaag gccaacggat ctgccgtgtc tctgaagtct 180 ggctctctcg agactcagga ggacaagacc tcttcttcgt cgcctcctcc ccgaaccttc 240 atcaaccagc tgcccgtgtg gtctatgctg ctgtctgccg tgaccaccgt gttcggcgtg 300 gccgagaagc agtggcccat gctggaccga aagtctaagc gacccgacat gctggtcgag 360 cccctgggcg tggaccgaat cgtgtacgac ggcgtgtctt tccgacagtc tttctctatc 420 cgatcttacg agatcggcgc tgaccgaacc gcctctatcg agactctgat gaacatgttc 480 caggagactt ctctgaacca ctgcaagatc atcggcctgc tgaacgacgg cttcggccga 540 acccctgaga tgtgcaagcg agatctgatt tgggtggtga ccaagatgca gatcgaggtg 600 aaccgatacc ccacctgggg cgacaccatt gaggtgaaca cctgggtgtc tgcctctggc 660 aagcacggca tgggccgaga ctggctgatc tctgactgcc acaccggcga gatcctgatc 720 cgagccacct ctgtgtgggc catgatgaac cagaagaccc gacgactgtc taagatcccc 780 tacgaggtgc gacaggagat cgagccccag ttcgtggact ctgctcccgt gatcgtggac 840 gaccgaaagt tccacaagct ggacctcaag accggcgact ctatctgcaa cggcctgacc 900 cctcgatgga ccgacctgga cgtgaaccag cacgtgaaca acgtgaagta catcggctgg 960 atcctgcagt ctgtgcccac cgaggtgttt gagactcagg agctgtgcgg cctgaccctc 1020 gagtaccgac gagagtgcgg ccgagactct gtgctcgagt ctgtgaccgc catggacccc 1080 tctaaggagg gcgaccgatc tctgtaccag cacctcctgc gactcgagga cggcgccgac 1140 atcgtgaagg gccgaaccga gtggcgaccc aagaacgctg gcgccaaggg cgccatcctg 1200 accggcaaga cctctaacgg caactctatc tcttaa 1236 <210> 33 <211> 411 <212> PRT <213> Cuphea palustris <400> 33 Met Val Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Phe Phe Ser Val Ala Thr Pro 1 5 10 15 Arg Thr Asn Ile Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Pro Phe Lys Pro Lys 20 25 30 Ser Asn His Asn Gly Gly Phe Gln Val Lys Ala Asn Ala Ser Ala His 35 40 45 Pro Lys Ala Asn Gly Ser Ala Val Ser Leu Lys Ser Gly Ser Leu Glu 50 55 60 Thr Gln Glu Asp Lys Thr Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Arg Thr Phe 65 70 75 80 Ile Asn Gln Leu Pro Val Trp Ser Met Leu Leu Ser Ala 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180 cccgactggt ctatgctgtt cgccgtgatc accaccatct tctctgccgc cgagaagcag 240 tggaccaacc tcgagtggaa gcccaagcct aaccctcctc agctgctgga cgaccacttc 300 ggaccccacg gcctggtgtt ccgacgaacc ttcgccatcc gatcttacga ggtgggcccc 360 gaccgatcta cctctatcgt ggccgtcatg aaccacctcc aagaggccgc tctgaaccac 420 gccaagtctg tgggcatcct cggcgacggc ttcggcacca ctctcgagat gtctaagcga 480 gatctgattt gggtcgtgaa gcgaacccac gtcgccgtcg agcgataccc cgcctggggc 540 gacaccgtcg aggtcgagtg ctgggtgggc gcctctggca acaacggccg acgacacgac 600 tttctggtgc gagactgcaa gaccggcgag attctgaccc gatgtacctc tctgtctgtg 660 atgatgaaca cccgaactcg acgactgtct aagatccccg aggaagtgcg aggcgagatc 720 ggacccgcct tcatcgacaa cgtggccgtg aaggacgagg aaatcaagaa gccccagaag 780 ctgaacgact ctaccgccga ctacatccaa ggcggactga cccctcgatg gaacgacctg 840 gacatcaacc agcacgtgaa caacatcaag tacgtggact ggatcctcga gactgtgccc 900 gactctatct tcgagtctca ccacatctct tcgttcacca tcgagtaccg acgagagtgc 960 accatggact ctgtgctgca gtctctgacc accgtgtctg gcggctcctc tgaggccgga 1020 ctggtgtgcg agcacctcct gcagctcgaa ggcggctctg aggtcctgcg agccaagacc 1080 gagtggcgac ccaagctgac tgactctttc cgaggcatct ctgtgatccc cgccgagtcc 1140 tctgtgtaa 1149 <210> 35 <211> 382 <212> PRT <213> Cinnamomum camphora <400> 35 Met Ala Thr Thr Ser Leu Ala Ser Ala Phe Cys Ser Met Lys Ala Val 1 5 10 15 Met Leu Ala Arg Asp Gly Arg Gly Met Lys Pro Arg Ser Ser Asp Leu 20 25 30 Gln Leu Arg Ala Gly Asn Ala Gln Thr Ser Leu Lys Met Ile Asn Gly 35 40 45 Thr Lys Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Lys Lys Leu Pro Asp Trp Ser 50 55 60 Met Leu Phe Ala Val Ile Thr Thr Ile Phe Ser Ala Ala Glu Lys Gln 65 70 75 80 Trp Thr Asn Leu Glu Trp Lys Pro Lys Pro Asn Pro Pro Gln Leu Leu 85 90 95 Asp Asp His Phe Gly Pro His Gly Leu Val Phe Arg Arg Thr Phe Ala 100 105 110 Ile Arg Ser Tyr Glu Val Gly Pro Asp Arg Ser Thr Ser Ile Val Ala 115 120 125 Val Met Asn His Leu Gln Glu Ala Ala Leu Asn His Ala Lys Ser Val 130 135 140 Gly Ile Leu Gly Asp Gly Phe Gly Thr Thr Leu Glu Met Ser Lys Arg 145 150 155 160 Asp Leu Ile Trp Val Val Lys Arg Thr His Val Ala Val Glu Arg Tyr 165 170 175 Pro Ala Trp Gly Asp Thr Val Glu Val Glu Cys Trp Val Gly Ala Ser 180 185 190 Gly Asn Asn Gly Arg Arg His Asp Phe Leu Val Arg Asp Cys Lys Thr 195 200 205 Gly Glu Ile Leu Thr Arg Cys Thr Ser Leu Ser Val Met Met Asn Thr 210 215 220 Arg Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pro Glu Glu Val Arg Gly Glu Ile 225 230 235 240 Gly Pro Ala Phe Ile Asp Asn Val Ala Val Lys Asp Glu Glu Ile Lys 245 250 255 Lys Pro Gln Lys Leu Asn Asp Ser Thr Ala Asp Tyr Ile Gln Gly Gly 260 265 270 Leu Thr Pro Arg Trp Asn Asp Leu Asp Ile Asn Gln His Val Asn Asn 275 280 285 Ile Lys Tyr Val Asp Trp Ile Leu Glu Thr Val Pro Asp Ser Ile Phe 290 295 300 Glu Ser His His Ile Ser Ser Phe Thr Ile Glu Tyr Arg Arg Glu Cys 305 310 315 320 Thr Met Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Thr Val Ser Gly Gly Ser 325 330 335 Ser Glu Ala Gly Leu Val Cys Glu His Leu Leu Gln Leu Glu Gly Gly 340 345 350 Ser Glu Val Leu Arg Ala Lys Thr Glu Trp Arg Pro Lys Leu Thr Asp 355 360 365 Ser Phe Arg Gly Ile Ser Val Ile Pro Ala Glu 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acgacctgcg agatgagctg aacaacatca agacccctcc aaagaagctg 660 gactacattt tcaagtacga agaggactac cagctgctgc gaaagctgcc cgagcctatc 720 gagaaggtga tcgacttccg acctccttac ctgttcatcc ccaagtctct gctgtctgga 780 ttcatctaca accacctccg attctcttcg aagggcgtgt gcatgcgaat ggacgacgtg 840 gaaaagaccg acgacgttgt gaccgagatc atcaacatct ctcccaccga gttccaggcc 900 atcaaggcca acattaagtc taacatccag ggcaagtgta ccatcactcc ctttctgcac 960 gtgtgctggt tcgtgtctct gcacaagtgg ggcaagttct ttaagcccct gaacttcgag 1020 tggctgaccg acatcttcat ccccgccgac tgccgatctc agctgcctga cgacgacgag 1080 atgcgacaga tgtaccgata cggcgccaac gtgggcttca tcgacttcac cccttggatc 1140 tctgagttcg acatgaacga caacaaggaa aacttctggc ccctgatcga gcactaccac 1200 gaggtgattt ctgaggccct gcgaaacaag aagcacctcc acggcctggg cttcaacatt 1260 cagggcttcg tccagaagta cgtcaacatt gacaaggtga tgtgcgaccg agccatcggc 1320 aagcgacgag gcggcaccct gctgtctaac gtgggcctgt tcaaccagct cgaggaaccc 1380 gacgccaagt actctatctg cgacctggcc ttcggccagt tccaaggctc ttggcaccag 1440 gctttctccc tgggcgtgtg ttctaccaac gtgaagggca tgaacatcgt ggtggcctct 1500 accaagaacg tggtgggctc tcaagagtct ctggaagaac tgtgctctat ctacaaggcc 1560 ctgctgctgg gcccctaa 1578 <210> 37 <211> 525 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 37 Met Asn Glu Ile Asp Glu Lys Asn Gln Ala Pro Val Gln Gln Glu Cys 1 5 10 15 Leu Lys Glu Met Ile Gln Asn Gly His Ala Arg Arg Met Gly Ser Val 20 25 30 Glu Asp Leu Tyr Val Ala Leu Asn Arg Gln Asn Leu Tyr Arg Asn Phe 35 40 45 Cys Thr Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Tyr Cys Thr Arg Asp Gln Leu Thr 50 55 60 Leu Ala Leu Arg Glu Ile Cys Leu Lys Asn Pro Thr Leu Leu His Ile 65 70 75 80 Val Leu Pro Thr Arg Trp Pro Asn His Glu Asn Tyr Tyr Arg Ser Ser 85 90 95 Glu Tyr Tyr Ser Arg Pro His Pro Val His Asp Tyr Ile Ser Val Leu 100 105 110 Gln Glu Leu Lys Leu Ser Gly Val Val Leu Asn Glu Gln Pro Glu Tyr 115 120 125 Ser Ala Val Met Lys Gln Ile Leu Glu Glu Phe Lys Asn Ser Lys Gly 130 135 140 Ser Tyr Thr Ala Lys Ile Phe Lys Leu Thr Thr Thr Leu Thr Ile Pro 145 150 155 160 Tyr Phe Gly Pro Thr Gly Pro Ser Trp Arg Leu Ile Cys Leu Pro Glu 165 170 175 Glu His Thr Glu Lys Trp Lys Lys Phe Ile Phe Val Ser Asn His Cys 180 185 190 Met Ser Asp Gly Arg Ser Ser Ile His Phe Phe His Asp Leu Arg Asp 195 200 205 Glu Leu Asn Asn Ile Lys Thr Pro Pro Lys Lys Leu Asp Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Tyr Glu Glu Asp Tyr Gln Leu Leu Arg Lys Leu Pro Glu Pro Ile 225 230 235 240 Glu Lys Val Ile Asp Phe Arg Pro Pro Tyr Leu Phe Ile Pro Lys Ser 245 250 255 Leu Leu Ser Gly Phe Ile Tyr Asn His Leu Arg Phe Ser Ser Lys Gly 260 265 270 Val Cys Met Arg Met Asp Asp Val Glu Lys Thr Asp Asp Val Val Thr 275 280 285 Glu Ile Ile Asn Ile Ser Pro Thr Glu Phe Gln Ala Ile Lys Ala Asn 290 295 300 Ile Lys Ser Asn Ile Gln Gly Lys Cys Thr Ile Thr Pro Phe Leu His 305 310 315 320 Val Cys Trp Phe Val Ser Leu His Lys Trp Gly Lys Phe Phe Lys Pro 325 330 335 Leu Asn Phe Glu Trp Leu Thr Asp Ile Phe Ile Pro Ala Asp Cys Arg 340 345 350 Ser Gln Leu Pro Asp Asp Asp Glu Met Arg Gln Met Tyr Arg Tyr Gly 355 360 365 Ala Asn Val Gly Phe Ile Asp Phe Thr Pro Trp Ile Ser Glu Phe Asp 370 375 380 Met Asn Asp Asn Lys Glu Asn Phe Trp Pro Leu Ile Glu His Tyr His 385 390 395 400 Glu Val Ile Ser Glu Ala Leu Arg Asn Lys Lys His Leu His Gly Leu 405 410 415 Gly Phe Asn Ile Gln Gly Phe Val Gln Lys Tyr Val Asn Ile Asp Lys 420 425 430 Val Met Cys Asp Arg Ala Ile Gly Lys Arg Arg Gly Gly Thr Leu Leu 435 440 445 Ser Asn Val Gly Leu Phe Asn Gln Leu Glu Glu Pro Asp Ala Lys Tyr 450 455 460 Ser Ile Cys Asp Leu Ala Phe Gly Gln Phe Gln Gly Ser Trp His Gln 465 470 475 480 Ala Phe Ser Leu Gly Val Cys Ser Thr Asn Val Lys Gly Met Asn Ile 485 490 495 Val Val Ala Ser Thr Lys Asn Val Val Gly Ser Gln Glu Ser Leu Glu 500 505 510 Glu Leu Cys Ser Ile Tyr Lys Ala Leu Leu Leu Gly Pro 515 520 525 <210> 38 <211> 2088 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> codon-optimized nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2088) <223> DNA Codon-optimised sequence of peroxisomal oxidase <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2088) <223> DNA Codon-optimised sequence of peroxisomal oxidase, Agrotis segetum <400> 38 atgcccattt tcatctgtat catcacctcg caagccatca tccgatcgaa cgtggaacga 60 gtggcagtca ttcttaacat caacatgggt aaggtgaacg aggacctggt tcgagagcgt 120 gcaaagtgta ccttcaacat tgaggagctc acctactttc ttgacggagg aaaagataaa 180 accttggaaa gaaaggagac cgaacgagct atgttgacca agcgagaaga gctctttgga 240 ggcgttcccg acgaatacct gtcacacaag gagaagtacg agaactccat gcgaaaggct 300 gttattctct tcggaatcct tagaaagatc caaaaggata acaacaccga cctcaccaac 360 taccggaatc tgctgagcgg agtgctgtcc gtgtccatct cccaggatgg ctctcctttc 420 ggcctccact acatcatgtt catgcctgtg ctgctgtctc aggctgatga aaaacaacaa 480 gagaagtggc tgaagcgagc catgaactgt gaaatcatcg gctcttacgc ccagaccgag 540 ctgggccacg gcactttcat ccgaggcctt gagactactg ccacttacga tcccgccacc 600 caggagttcg tgctgcactc tcctgctctt tcgtcctaca agtggtggcc tggaggcctc 660 ggaaacactg tcaattactg catcgttatt gcccagctgt actctaaggg cgtctgtcac 720 ggcattcatt ccttcatcgt gcaggtgcga gacgaggaca ctcacatgcc gttgcccggc 780 atcaaggtcg gagagatcgg tgtgaagatg ggtctgaact ctgtcaacaa cggattcctg 840 ggattcgaga acgtccgaat cccccgagtg aacatgctta tgaagcacgc caagatcctg 900 gaggatggaa cttacgttaa gtcgaagaac aacaagctca tctacggagc aatggtgttc 960 gtccgagtgg tgatcgtgtt cgactctgtg aactacctgg ccaaggccat caccattggc 1020 gcacgatact ccctggtgcg gcgacagtcg caattaaaag ctggagaacc tgagcgacag 1080 atcctcgact atgtcaccca gcagcacaag attctgcccg ctatcgctgg atgctacgcc 1140 atgaagatga acgcttggag gttgtgggac accttcaacc tgatcaacgg acaactgcat 1200 cagggcaaca tggaacggct gggcgagctg catgccctcg cgtgctgcct caaggctatc 1260 tctaccaccg acgcggctat gttcacctct ctgtgtcgac tcggatgcgg aggtcacggt 1320 tacatgactt cttccaacct ccctcccaca tacgctttga cttctgcctc gtgcacttac 1380 gagggagaca acaccgttct gctgctgcag accgctcgat ttcttctcaa gacctggcga 1440 cagattgaca cccaccctct gactagaacc gtggcctacc tgaagaccgt gtctgcccct 1500 ggattctctg acagatggga gtcttccgtg gagggcatca ttcgaggctt ccagaccgtc 1560 gctatgaaaa agatttcttc ctgtctggac atcatgactt ctaaggtgat gtctggaatg 1620 tcccaggagg atgcatggaa cgctatttct atccagctgg tttcggccgc tgaatcccat 1680 tctcgaggca ccgtgatctc tacgttttac gaagacatgt ctaaggccat gcgatccatg 1740 actgctccct tggcgaaggt gatgggtcag ctggttgagc tgtacgcggt ttattggact 1800 ctagagcgac tgggagacat gttgcagtac accagtattt ctcacaccga cgttgttgac 1860 ctccgatcct ggtacgaaga gctcctccga aagatccgac ctaacactat cggactggtg 1920 gacgcgtttg atattattga tgaactgctc cagtccaccc tgggtgctta tgacggtcgt 1980 gtttacgaac gactgatgga agaagctttg aagtctcccc tgaacgctga gcccgtgaac 2040 cagtccttcc acaagtacct caagcccttt atgcagtcta agctgtaa 2088 <210> 39 <211> 695 <212> PRT <213> Agrotis segetum <400> 39 Met Pro Ile Phe Ile Cys Ile Ile Thr Ser Gln Ala Ile Ile Arg Ser 1 5 10 15 Asn Val Glu Arg Val Ala Val Ile Leu Asn Ile Asn Met Gly Lys Val 20 25 30 Asn Glu Asp Leu Val Arg Glu Arg Ala Lys Cys Thr Phe Asn Ile Glu 35 40 45 Glu Leu Thr Tyr Phe Leu Asp Gly Gly Lys Asp Lys Thr Leu Glu Arg 50 55 60 Lys Glu Thr Glu Arg Ala Met Leu Thr Lys Arg Glu Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Glu Tyr Leu Ser His Lys Glu Lys 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Cucurbita maxima <400> 47 Met Ala Ala Gly Lys Ala Lys Ala Lys Ile Glu Val Asp Met Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ser Leu Tyr Met Arg Gly Lys His Arg Glu Ile Gln Glu Arg Val 20 25 30 Phe Glu Tyr Phe Asn Ser Arg Pro Glu Leu Gln Thr Pro Val Gly Ile 35 40 45 Ser Met Ala Asp His Arg Glu Leu Cys Met Lys Gln Leu Val Gly Leu 50 55 60 Val Arg Glu Ala Gly Ile Arg Pro Phe Arg Phe Val Asn Glu Asp Pro 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Phe Ala Ile Met Glu Ala Val Gly Ser Val Asp Val Ser 85 90 95 Leu Ala Ile Lys Met Gly Val Gln Phe Ser Leu Trp Gly Gly Ser Val 100 105 110 Ile Asn Leu Gly Thr Lys Lys His Arg Asp Arg Phe Phe Asp Gly Ile 115 120 125 Asp Asn Val Asp Tyr Pro Gly Cys Phe Ala Met Thr Glu Leu His His 130 135 140 Gly Ser Asn Val Gln Gly Leu Gln Thr Thr Ala Thr Phe Asp Pro Ile 145 150 155 160 Thr Asp Glu Phe Ile Ile Asn Thr Pro Asn Asp Gly Ala Ile Lys Trp 165 170 175 Trp Ile Gly Asn Ala Ala Val His Gly Lys Phe Ala Thr Val Phe Ala 180 185 190 Lys Leu Val Leu Pro Thr His Asp Ser Arg Lys Thr Ala Asp Met Gly 195 200 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Val Ala Val Glu Pro Arg Val 20 25 30 Asp Val Ala Ala Leu Gly Glu Gln Leu Leu Gly Arg Trp Ala Asp Ile 35 40 45 Arg Leu His Ala Arg Asp Leu Ala Gly Arg Glu Val Val Gln Lys Val 50 55 60 Glu Gly Leu Thr His Thr Glu His Arg Ser Arg Val Phe Gly Gln Leu 65 70 75 80 Lys Tyr Leu Val Asp Asn Asn Ala Val His Arg Ala Phe Pro Ser Arg 85 90 95 Leu Gly Gly Ser Asp Asp His Gly Gly Asn Ile Ala Gly Phe Glu Glu 100 105 110 Leu Val Thr Ala Asp Pro Ser Leu Gln Ile Lys Ala Gly Val Gln Trp 115 120 125 Gly Leu Phe Gly Ser Ala Val Met His Leu Gly Thr Arg Glu His His 130 135 140 Asp Lys Trp Leu Pro Gly Ile Met Ser Leu Glu Ile Pro Gly Cys Phe 145 150 155 160 Ala Met Thr Glu Thr Gly His Gly Ser Asp Val Ala Ser Ile Ala Thr 165 170 175 Thr Ala Thr Tyr Asp Glu Glu Thr Gln Glu Phe Val Ile Asp Thr Pro 180 185 190 Phe Arg Ala Ala Trp Lys Asp Tyr Ile Gly Asn Ala Ala Asn Asp Gly 195 200 205 Leu Ala Ala Val Val Phe Ala Gln Leu Ile Thr Arg Lys Val Asn His 210 215 220 Gly Val His Ala Phe Tyr Val Asp Leu Arg Asp Pro Ala Thr 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gcacctacgc tcagaccgag 420 atgggccacg gcacccacct ccgaggactc gagactaccg ccacttacga ccccaagact 480 caagagttca tcctgaactc tcccaccgtg acctctatca agtggtggcc cggtggcctg 540 ggcaagacct ctaaccacgc catcgtgctg gcccagctga ttacccaggg cgagtgctac 600 ggcctgcacg ccttcgtggt gcccatccga gagatcggaa cccacaagcc actgcctggc 660 atcaccgtgg gcgacatcgg ccccaagttc ggctacgagg aaatggacaa cggctacctg 720 aagatggaca actaccgaat tcctcgagag aacatgctga tgaagtacgc ccaggtgaag 780 cccgacggaa cctacgtgaa gcccctgtct aacaagctga cctacggaac catggtgttc 840 gtgcgatctt tcctggtggg caacgccgct cagtctctgt ctaaggcctg caccattgcc 900 atccgatact ctgccgtgcg acgacagtct gagatcaagc agtctgagcc cgagcctcag 960 atcctggact ttcagaccca gcagtacaag ctgttccctc tgctggccac cgcctacgcc 1020 ttccacttcg tgggccgata tatgaaggaa acctacctgc gaatcaacga gtctatcggc 1080 cagggcgacc tgtctgagct gcccgagctg cacgccctga ccgccggact gaaggctttc 1140 accacctgga ccgccaacgc cggcatcgag gaatgccgaa tggcctgtgg cggccacggc 1200 tactctcact cctctggcat ccccaacatc tacgtgacct tcactcccgc ctgcaccttc 1260 gagggtgaga acaccgtgat gatgctgcag accgctcgat tcctgatgaa gatctacgac 1320 caggtgcgat ctggcaagct ggtcggcggc atggtgtctt acctgaacga tctgccctct 1380 cagcgaattc agcctcagca ggttgccgtg tggcccacta tggtggacat caactcgctc 1440 gagggcctga ccgaggccta caagctgcga gccgctcgac tggtcgagat cgccgccaag 1500 aacctgcaga cccacgtgtc tcaccgaaag tctaaggaag tggcttggaa cctgacctct 1560 gtggacctgg tgcgagcttc tgaggcccac tgccactacg tggtggtgaa ggtgttctct 1620 gacaagctgc ccaagatcca ggacaaggct gtccaggccg tgctgcgaaa cctgtgcctg 1680 ctgtactctc tgtacggaat ctctcagaag ggcggcgact tcctcgaggg ctctatcatc 1740 accggcgctc agctgtctca ggtcaacgct cgaatcctcg agctgctgac cctgattcga 1800 cccaacgccg tggctctggt ggacgctttc gacttcaagg acatgaccct gggctctgtg 1860 ctgggacgat acgacggcaa cgtgtacgag aacctcttcg agtgggccaa gaagtctccc 1920 ctgaacaaga ccgaggtgca cgagtcttac cacaagcacc tgaagcctct gcagtctaag 1980 ctggaccaga ttacctccgt gggatcttct tcgaagctgt ag 2022 <210> 53 <211> 673 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 53 Met Asn Pro Asp Leu Arg Lys Glu Arg Ala Ser Ala Thr Phe Asn Pro 1 5 10 15 Glu Leu Ile Thr His Ile Leu Asp Gly Ser Pro Glu Asn Thr Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Glu Ile Glu Asn Leu Ile Leu Asn Asp Pro Asp Phe Gln His 35 40 45 Glu Asp Tyr Asn Phe Leu Thr Arg Ser Gln Arg Tyr Glu Val Ala Val 50 55 60 Lys Lys Ser Ala Thr Met Val Lys Lys Met Arg Glu Tyr Gly Ile Ser 65 70 75 80 Asp Pro Glu Glu Ile Met Trp Phe Lys Asn Ser Val His Arg Gly His 85 90 95 Pro Glu Pro Leu Asp Leu His Leu Gly Met Phe Leu Pro Thr Leu Leu 100 105 110 His Gln Ala Thr Ala Glu Gln Gln Glu Arg Phe Phe Met Pro Ala Trp 115 120 125 Asn Leu Glu Ile Thr Gly Thr Tyr Ala Gln Thr Glu Met Gly His Gly 130 135 140 Thr His Leu Arg Gly Leu Glu Thr Thr Ala Thr Tyr Asp Pro Lys Thr 145 150 155 160 Gln Glu Phe Ile Leu Asn Ser Pro Thr Val Thr Ser Ile Lys Trp Trp 165 170 175 Pro Gly Gly Leu Gly Lys Thr Ser Asn His Ala Ile Val Leu Ala Gln 180 185 190 Leu Ile Thr Gln Gly Glu Cys Tyr Gly Leu His Ala Phe Val Val Pro 195 200 205 Ile Arg Glu Ile Gly Thr His Lys Pro Leu Pro Gly Ile Thr Val Gly 210 215 220 Asp Ile Gly Pro Lys Phe Gly Tyr Glu Glu Met Asp Asn Gly Tyr Leu 225 230 235 240 Lys Met Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Arg Glu Asn Met Leu Met Lys Tyr 245 250 255 Ala Gln Val Lys Pro Asp Gly Thr Tyr Val Lys Pro Leu Ser Asn Lys 260 265 270 Leu Thr Tyr Gly Thr Met Val Phe Val Arg Ser Phe Leu Val Gly Asn 275 280 285 Ala Ala Gln Ser Leu Ser Lys Ala Cys Thr Ile Ala Ile Arg Tyr Ser 290 295 300 Ala Val Arg Arg Gln Ser Glu Ile Lys Gln Ser Glu Pro Glu Pro Gln 305 310 315 320 Ile Leu Asp Phe Gln Thr Gln Gln Tyr Lys Leu Phe Pro Leu Leu Ala 325 330 335 Thr Ala Tyr Ala Phe His Phe Val Gly Arg Tyr Met Lys Glu Thr Tyr 340 345 350 Leu Arg Ile Asn Glu Ser Ile Gly Gln Gly Asp Leu Ser Glu Leu Pro 355 360 365 Glu Leu His Ala Leu Thr Ala Gly Leu Lys Ala Phe Thr Thr Trp Thr 370 375 380 Ala Asn Ala Gly Ile Glu Glu Cys Arg Met Ala Cys Gly Gly His Gly 385 390 395 400 Tyr Ser His Ser Ser Gly Ile Pro Asn Ile Tyr Val Thr Phe Thr Pro 405 410 415 Ala Cys Thr Phe Glu Gly Glu Asn Thr 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aaggtggaca tggacaaggt gcttcctgca 660 gtcaacaagg gcaaggacgt ggccgagaga cgtcagctgt actttttccg agtgccctac 720 aagctgcctg acgacatgaa ctaccatgtg gcagccatgc tctatctgtc agatcgaaac 780 tcgctcttca cctgtatgaa cctgagagac aaggtgccca ctttggcgcg cctggcatcg 840 ctggaccatc agtttactat gcatgacatg cactctcgtg tggacgaggg ctggatgcct 900 atggagacct ggactgactg ggctggagac tgtcgaggac agtaccaggg ccgactattt 960 acagatgaag gcaagcttgt atgcacattt atgcaagacg gtctgattcg aaccgttgag 1020 gaggaccacg atgacgacga cgacaagaag gaggatgaca aggctgataa caccacccga 1080 caggttcctc gaagaagaaa gaagaagact cctgctcaga atttgtttct caagttcaaa 1140 gctgtgcttt aa 1152 <210> 55 <211> 630 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 55 atgtttcgtc acgcgatcag atcaattggc ctcgtgactc ctgtcagagt cattaccccc 60 actctacgtg cttctctggt tctcggggca gttcgttctc agagttcgca cgccaaaccc 120 caagcacccg attggatcca gaatctgctc gatgagcacg agggcaaagg atacttgctt 180 gccgacgctg ggctgccgtc tcagggcgtc tcttggggag aaattgactc cttccagcat 240 gttaacaaca aggtgtatct ggcttggttc gagaccgccc gtgttaacat gtttctcaag 300 tggggcacgg actttcagcg gttcatgagt ggccagtcgg tggcaccggt catgcggtcg 360 gtcaatctag cttggcgata ccccatcaaa ttccccgacc aggtgacggt cgtccacaaa 420 attgaccaga ttctcgatga ccggttcatt ctcaagggcg tcgtgatagg ccacaagtcc 480 aagaaggtgt gtgcacgaat tgaagaggtg attgtcgctg tcgattacac taagggtgcc 540 accaagtgtt ctattccgga cgatatgaga gagtttctgg agcagaaaaa gagagagcaa 600 ggcgcggggg agtatgatgc gcagatttag 630 <210> 56 <211> 1185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1185) <223> Y. lipolytica codon-optimised nucleotide sequence of thioesterase from Cuphea hookeriana ChFatB3 <400> 56 atggtggccg ctgccgcctc ttctgccttc ttctcggtgc ccactcctgg catctctccc 60 aagcctggca agttcggcaa cggcggcttc caggtgaagg ccaacgccaa cgctcacccc 120 tcgctgaagt ctggctctct cgagactgag gacgacacct cttcctcttc tccaccacct 180 cgaaccttca tcaaccagct gcctgactgg tctatgctgc tgtctgccat caccaccatc 240 ttcggagccg ccgagaagca gtggatgatg ctggaccgaa agtctaagcg acccgacatg 300 ctgatggaac ccttcggcgt ggactctatc gtgcaggacg gcgtgttctt ccgacagtct 360 ttctctatcc gatcttacga gattggcgcc gaccgaacca cctctatcga gactctgatg 420 aacatgtttc aagagacttc tctgaaccac tgcaagtcta acggcctgct gaacgacggc 480 ttcggacgaa cccctgagat gtgcaagaag ggcctgatct gggtcgtgac caagatgcag 540 gtcgaggtga acagataccc catctggggc gactctattg aggtcaacac ctgggtgtct 600 gagtctggca agaacggcat gggccgagac tggctgatct ctgactgctc taccggcgag 660 atcctggtgc gagccacctc tgtgtgggcc atgatgaacc agaagacccg acgactgtct 720 aagttcccat tcgaggtgcg acaagagatc gctcccaact tcgtcgactc tgtccccgtg 780 atcgaggacg accgaaagct gcacaagctg gacgtcaaga ccggcgactc catccacaac 840 ggactgaccc ctcgatggaa cgacctggac gtgaaccagc acgtgaacaa cgtgaagtac 900 atcggctgga tcctgaagtc ggtgcccacc gacgtgttcg aggcccaaga gctgtgcggc 960 gtgaccctcg agtaccgacg agagtgcgga cgagactccg tgatggaatc tgtgaccgct 1020 atggacccct ctaaagaagg cgaccgatct gtctaccagc acctcctgcg actcgaggac 1080 ggcgccgaca ttgccatcgg ccgaaccgag tggcgaccca agaacgctgg cgccaacggc 1140 gccatctcta ccggaaagac ctctaaccga aactctgtgt cttaa 1185 <210> 57 <211> 394 <212> PRT <213> Cuphea hookeriana <400> 57 Met Val Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ala Phe Phe Ser Val Pro Thr Pro 1 5 10 15 Gly Ile Ser Pro Lys Pro Gly Lys Phe Gly Asn Gly Gly Phe Gln Val 20 25 30 Lys Ala Asn Ala Asn Ala His Pro Ser Leu Lys Ser Gly Ser Leu Glu 35 40 45 Thr Glu Asp Asp Thr Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Arg Thr Phe Ile 50 55 60 Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu Ser Ala Ile Thr Thr Ile 65 70 75 80 Phe Gly Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met Leu Asp Arg Lys Ser Lys 85 90 95 Arg Pro Asp Met Leu Met Glu Pro Phe Gly Val Asp Ser Ile Val Gln 100 105 110 Asp Gly Val Phe Phe Arg Gln Ser Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile 115 120 125 Gly Ala Asp Arg Thr Thr Ser Ile Glu Thr Leu Met Asn Met Phe Gln 130 135 140 Glu Thr Ser Leu Asn His Cys Lys Ser Asn Gly Leu Leu Asn Asp Gly 145 150 155 160 Phe Gly Arg Thr Pro Glu Met Cys Lys Lys Gly Leu Ile Trp Val Val 165 170 175 Thr Lys Met Gln Val Glu Val Asn Arg Tyr Pro Ile Trp Gly Asp Ser 180 185 190 Ile Glu Val Asn Thr Trp Val Ser Glu Ser Gly Lys Asn Gly Met Gly 195 200 205 Arg Asp Trp Leu Ile Ser Asp Cys Ser Thr Gly Glu Ile Leu Val Arg 210 215 220 Ala Thr Ser Val Trp Ala Met Met Asn Gln Lys Thr Arg Arg Leu Ser 225 230 235 240 Lys Phe Pro Phe Glu Val Arg Gln Glu Ile Ala Pro Asn Phe Val Asp 245 250 255 Ser Val Pro Val Ile Glu Asp Asp Arg Lys Leu His Lys Leu Asp Val 260 265 270 Lys Thr Gly Asp Ser Ile His Asn Gly Leu Thr Pro Arg Trp Asn Asp 275 280 285 Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile 290 295 300 Leu Lys Ser Val Pro Thr Asp Val Phe Glu Ala Gln Glu Leu Cys Gly 305 310 315 320 Val Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Met Glu 325 330 335 Ser Val Thr Ala Met Asp Pro Ser Lys Glu Gly Asp Arg Ser Val Tyr 340 345 350 Gln His Leu Leu Arg Leu Glu Asp Gly Ala Asp Ile Ala Ile Gly Arg 355 360 365 Thr Glu Trp Arg Pro Lys Asn Ala Gly Ala Asn Gly Ala Ile Ser Thr 370 375 380 Gly Lys Thr Ser Asn Arg Asn Ser Val Ser 385 390 <210> 58 <211> 5449 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5549) <223> Fusion of a truncated version of FAS1 from Y. lipolytica and a truncated version of the thioesterase TesA from E. coli <400> 58 gtgagtatcg accgaagcag gatgatctct acatgagata tgcaacgcgt acgtgattca 60 attgatccta acacagtacc ctaccacagg tgtcaacacc ccccagagcg ccgcctcatt 120 aagaccactg gtgctatcgc acggccaaac tgagcactcg ctgctggtgc ccacctctct 180 gtacatcaac tgcaccacgc tccgagacca gttctacgcc tctctacctc cagccactga 240 agacaaggcc gacgatgatg agccctcctc ctccacagag cttctagctg ccttcctggg 300 atttactgcc aagaccgtcg aggaagagcc cggaccatac gacgacgttc tctctctcgt 360 gcttaacgag tttgagaccc ggtacttgcg aggtaacgac atccacgctg tggcctcctc 420 cttgttacaa gacgaggacg tgcctaccac cgttggtaag atcaagaggg tgattcgagc 480 ctactacgcc gcacgaattg cctgcaaccg gcccatcaag gcccactcgt cggctctgtt 540 ccgagccgca tctgaagact cggacaacgt ctctctgtac gccatcttcg gtggccaggg 600 aaacaccgag gactactttg aggaactgcg ggagatttac gacatctacc aggggctggt 660 cggcgacttc attcgggaat gtggagccca gcttctggcg ctgtctcgag atcacattgc 720 tgctgagaaa atttatacca agggctttga tatcgtcaag tggctggaac accccgagac 780 catccccgac tttgagtacc taatttctgc tcccatctct gtacccatca tcggtgttat 840 ccagctggca cactacgctg tcacctgtcg agttttgggt cttaatcctg gccaggtccg 900 agacaacctc aagggtgcca ctggccattc tcagggtctg atcaccgcaa ttgccatctc 960 tgcctccgac tcgtgggacg agttctataa ctctgcctct cgaattctca agatcttctt 1020 cttcatcggt gtccgtgtcc aacaggctta cccctccact ttcctgcctc cctccactct 1080 ggaagacagt gtcaagcagg gtgagggcaa gcccactccc atgctgtcca tccgagacct 1140 gtctctcaac caggttcagg agttcgtcga tgccaccaac ttgcatttgc ccgaagataa 1200 gcagatcgtc gtgtctctga tcaatggtcc tcgaaacgtt gtcgttactg gcccccccca 1260 gtctctgtat ggtctgtgtc ttgtgcttcg aaaacagaag gccgagaccg gtctggacca 1320 aagccgagtg ccccacagtc agcgaaagct caaattcaca catcgtttcc tgcccatcac 1380 ctctcctttc cactcgtacc tgctggagaa gagcacggat ctgatcatca acgacctgga 1440 gtcttccggt gtggagtttg tgtcctccga gctcaaggtg cctgtttacg acacctttga 1500 tggctccgtg ctgtctcagc tacccaaggg tatcgtcagc cgtctggtca acctcatcac 1560 tcatctgccc gtcaagtggg agaaggccac tcagtttcag gcctcccaca ttgtggactt 1620 tggtcccggt ggcgcttctg gtcttggtct gttgacccac aagaacaagg atggaactgg 1680 agtgcgaact attcttgctg gtgtcattga ccagcccctc gagttcggct tcaagcagga 1740 gctgtttgac cgacaggagt cgtccattgt ttttgctcaa aactgggcca aggagttttc 1800 tcccaagctc gtcaagatct cctccaccaa cgaggtctat gtcgacacca aattctctcg 1860 tctgactggc cgagccccca tcatggtcgc tggtatgacc cctaccactg tcaaccccaa 1920 atttgtggct gccactatga actccggcta ccacatcgag cttggtggtg gaggctactt 1980 tgcccccggt atgatgacca aggcccttga acacattgag aagaacactc ctcccggatc 2040 cggtatcacc atcaacctga tctacgtcaa ccctcgactg attcaatggg gtattcctct 2100 gattcaggag cttcgacaga agggtttccc cattgaaggt ctcaccattg gtgccggtgt 2160 gccctctctg gaggttgcta acgagtggat tcaggatctg ggcgtcaagc acatcgcctt 2220 caagcctgga tccatcgagg ccatctcctc ggtgattcga atcgccaagg ccaacccaga 2280 ctttcctatc atccttcagt ggaccggagg tcgaggagga ggacatcatt cgtttgagga 2340 cttccacgct cccattctgc agatgtactc caagatccga cgatgcagca acattgtgct 2400 gattgccgga tctggtttcg gtgcttctac cgactcctac ccatacctca ccggttcatg 2460 gtcccgagac tttgactacc ctcccatgcc ctttgacggt atcctggttg gttctcgagt 2520 catggttgcc aaggaggctt tcacttctct gggagccaag cagctcattg ttgactctcc 2580 gggtgttgag gattctgagt gggagaaaac ctacgacaag cccactggtg gcgtcatcac 2640 cgttctctcc gagatgggtg agcctatcca caagctcgcc actcgaggtg tgctcttctg 2700 gcacgagatg gacaagaccg tgttctccct gcccaagaag aagcgtctgg aagtgctcaa 2760 gtccaagcga gcctacatca tcaagcgtct caacgacgac ttccagaaga cttggtttgc 2820 caagaacgcc cagggacagg tgtgtgatct cgaagacctc acctacgcgg aggtcatcca 2880 gcgacttgtt gacctcatgt acgtgaagaa ggaaagccga tggatcgatg tcactctccg 2940 aaatcttgcc ggcactttca ttcgacgagt tgaggagcga ttctccaccg agacaggtgc 3000 ctcttctgtg ttgcagagct tttccgagct ggattccgag cccgagaagg ttgtcgagcg 3060 ggtgtttgag ctcttccctg cctctactac ccagatcatc aacgctcaag acaaggacca 3120 cttcctcatg ctgtgtctca accccatgca gaagcccgtg cccttcatcc ctgttctgga 3180 tgacaacttt gagttcttct tcaagaagga ctctctgtgg cagtgcgagg acctcgcagc 3240 tgttgtggac gaagacgttg gacgaatctg tattcttcag ggtcccgttg ctgtcaagca 3300 ctccaagatt gtcaacgagc ccgtcaagga gattctcgac tccatgcacg aaggtcacat 3360 caagcagctg cttgaggatg gcgagtacgc tggcaacatg gccaacatcc cccaggtcga 3420 atgctttggt ggaaagcctg ctcagaactt cggtgacgtt gctctcgact ctgtcatggt 3480 tcttgatgac ctcaacaaga ccgtgttcaa gattgagacc ggcacctctg ctctgccttc 3540 tgctgcagat tggttctctc tgctggccgg tgacaagaac tcttggcgac aggtcttcct 3600 gtccactgac accattgtgc agaccaccaa gatgatctcc aaccctctgc atcgacttct 3660 ggagcccatc gcaggtttgc aggttgagat tgagcaccct gatgagcccg agaacaccgt 3720 catctctgct ttcgagccca tcaacggcaa ggtcaccaag gtgctggagc tgcgaaaggg 3780 tgccggagac gtcatttcgc tgcagctgat cgaagcgcgt ggcgttgacc gagtccccgt 3840 tgctcttcct ctggaattca agtaccagcc ccagattggc tacgctccca ttgttgaggt 3900 tatgaccgac aggaacaccc gaatcaagga gttctactgg aagctgtggt ttggccagga 3960 ctccaagttt gagattgaca ccgacatcac cgaggaaatc attggcgatg acgttaccat 4020 ctctggcaag gccattgccg actttgtcca cgctgttggc aacaagggcg aggcctttgt 4080 tggtcgatct acctctgctg gtactgtctt cgctcccatg gactttgcca ttgttttggg 4140 ctggaaggcc attatcaagg caatctttcc ccgagcaatt gatgctgaca ttctgcgtct 4200 ggtacatctg tccaacggct tcaagatgat gcctggcgcc gaccctctgc agatgggtga 4260 tgttgtttcc gccactgcca agatcgacac tgtcaagaac tccgctaccg gcaagactgt 4320 tgctgttcga ggtcttctca cccgagacgg caagcctgtc atggaggttg tttccgaatt 4380 cttctaccga ggcgaattct ccgacttcca gaacactttt gagcgacgag aggaggtacc 4440 catgcaactg accctcaagg acgccaaggc cgtggccatt ctctgctcca aggagtggtt 4500 tgagtacaat ggcgacgata ccaaggacct cgagggcaag accattgtgt tccgaaactc 4560 gtcattcatc aagtacaaga atgagaccgt cttctcttct gtgcacacca ccggtaaggt 4620 attgatggag ctgccctcca aggaggtcat tgagattgcc actgttaact accaggctgg 4680 cgagtctcat ggcaatcccg tcattgatta cctggagcga aatggaacca ccattgagca 4740 gcctgttgag tttgagaagc ccatccctct gtccaaggca gatgatcttc tctccttcaa 4800 ggctccttct tccaacgagc cctacgctgg tgtgtccggt gactacaatc ccatccacgt 4860 gtctcgagcc tttgcttcct atgcatccct tcctggagca gcggacacgt tattgattct 4920 gggtgatagc ctgagcgccg ggtatcgaat gtctgccagc gcggcctggc ctgccttgtt 4980 gaatgataag tggcagagta aaacgtcggt agttaatgcc agcatcagcg gcgacacctc 5040 gcaacaagga ctggcgcgcc ttccggctct gctgaaacag catcagccgc gttgggtgct 5100 ggttgaactg ggcggcaatg acggtttgcg tggttttcag ccacagcaaa ccgagcaaac 5160 gctgcgccag attttgcagg atgtcaaagc cgccaacgct gaaccattgt taatgcaaat 5220 acgtctgcct gcaaactatg gtcgccgtta taatgaagcc tttagcgcca tttaccccaa 5280 actcgccaaa gagtttgatg ttccgctgct gccctttttt atggaagagg tctacctcaa 5340 gccacaatgg atgcaggatg acggtattca tcccaaccgc gacgcccagc cgtttattgc 5400 cgactggatg gcgaagcagt tgcagccttt agtaaatcat gactcataa 5449 <210> 59 <211> 2268 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2268) <223> Fusion of a truncated version of FAS1 from Y. lipolytica and a truncated version of the thioesterase TesA from E. coli <400> 59 Tyr Pro Thr Thr Gly Val Asn Thr Pro Gln Ser Ala Ala Ser Leu Arg 1 5 10 15 Pro Leu Val Leu Ser His Gly Gln Thr Glu His Ser Leu Leu Val Pro 20 25 30 Thr Ser Leu Tyr Ile Asn Cys Thr Thr Leu Arg Asp Gln Phe Tyr Ala 35 40 45 Ser Leu Pro Pro Ala Thr Glu Asp Lys Ala Asp Asp Asp Glu Pro Ser 50 55 60 Ser Ser Thr Glu Leu Leu Ala Ala Phe Leu Gly Phe Thr Ala Lys Thr 65 70 75 80 Val Glu Glu Glu Pro Gly Pro Tyr Asp Asp Val Leu Ser Leu Val Leu 85 90 95 Asn Glu Phe Glu Thr Arg Tyr Leu Arg Gly Asn Asp Ile His Ala Val 100 105 110 Ala Ser Ser Leu Leu Gln Asp Glu Asp Val Pro Thr Thr Val Gly Lys 115 120 125 Ile Lys Arg Val Ile Arg Ala Tyr Tyr Ala Ala Arg Ile Ala Cys Asn 130 135 140 Arg Pro Ile Lys Ala His Ser Ser Ala Leu Phe Arg Ala Ala Ser Glu 145 150 155 160 Asp Ser Asp Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Phe Gly Gly Gln Gly Asn 165 170 175 Thr Glu Asp Tyr Phe Glu Glu Leu Arg Glu Ile Tyr Asp Ile Tyr Gln 180 185 190 Gly Leu Val Gly Asp Phe Ile Arg Glu Cys Gly Ala Gln Leu Leu Ala 195 200 205 Leu Ser 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agcaccaggt gcacgtgccc accgtgatta 720 ttcgaccctc tatcgtgggc tctatcaagg acgagcccat ccgaggctgg ctgtgcaact 780 ggttcggcgc caccggcatc tctgtgttca ccgccaaggg cctgaaccga gtgctgctcg 840 gaaaggcctc taacatcgtg gacgtgatcc ccgtggacta cgtggccaac ctggtgatcg 900 tggctggcgc caagaacggc ggcgagaagt ctgaggaact gaagatctat aactgctgtt 960 cttctgactg caaccccgtg accgtgaaga agatcctgaa ggaattcatc gacgacacca 1020 ttaagaacaa gtctcacatc atgcctctgc ctggctggtt cgtgttcacc aagtacaagt 1080 ggctgatgac cctgctgacc atcatcttcc agatgatccc catgtacctg gccgacgtgt 1140 accgagtcct gatgggcaag aaccctcggt acatgaagct gcaccacctg gtcattcaga 1200 cccgactggt gatcaacttc ttcaccttcc actcttgggt gatgaagacc gatcgagccc 1260 gagagctgtt cggctctctg tctcccgttg agaagcacat gttcccttgg gacccctctg 1320 gcatcgactg gaccgagtac ctgcagtctt actgctacgg cgtgcgacac ttcctcgaga 1380 agcgaaagta gaatataaat tt 1402 <210> 61 <211> 458 <212> PRT <213> Agrotis ipsilon <400> 61 Met Ala Val Ile Ile Ser Arg Glu Glu Glu Lys Leu Ser Val Pro Glu 1 5 10 15 Phe Tyr Ala Gly Lys Ser Ile Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu 20 25 30 Gly Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Asp 35 40 45 Lys Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Asn Leu Ser Ile Asp Glu 50 55 60 Arg Met Thr Met Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Ser Arg Leu Lys Glu 65 70 75 80 Lys Arg Pro Gly Asp Val Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile 85 90 95 Ser Ser Pro Asn Leu Gly Leu Ser Ala Glu Asn Glu Arg Ile Leu Ile 100 105 110 Glu Asn Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Ile Lys Phe Asn 115 120 125 Glu Pro Leu Pro Ile Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met 130 135 140 Leu Met Asp Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Lys Val Phe Ile His 145 150 155 160 Ile Ser Thr Ala Tyr Ser Asn Ala Asn Ser Glu Arg Ala Ala Val Glu 165 170 175 Glu Ile Leu Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Met Asp Gln Val Tyr Gln Leu 180 185 190 Val Lys Asp Gly Val Thr Glu Glu Glu Thr Glu Ile Leu Leu Asn Gly 195 200 205 Leu Pro Asn Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Ala Glu His Leu Ala 210 215 220 Ala Glu His Gln Val His Val Pro Thr Val 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aagaacattc tgcccgccga gaacaagatg accttcattg cctgcctggg cgagaacttc 780 cacaactacc accacgtgtt cccttgggac taccgagcct ctgagctggg caacatcgga 840 atgaactgga ccgccaagtt catcgacttt ttcgcctgga tcggctgggc ctacgacctc 900 aagaccgcct ctgacgagaa catcaagtct cgaatgaagc gaaccggcga cggcaccgac 960 gtgtctggac agaagtactc ttgcgagtcc tctgaggtgc tgcagtaa 1008 <210> 63 <211> 335 <212> PRT <213> Choristoneura rosaceana <400> 63 Met Ala Pro Asn Val Glu Asp Met Glu Ser Asp Leu Pro Glu Ser Glu 1 5 10 15 Glu Lys Leu Glu Lys Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Pro Arg Lys Tyr 20 25 30 Gln Ile Ile Tyr Thr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Trp His Ile Ala 35 40 45 Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr 50 55 60 Ile Ile Leu Ala Leu Ile Leu Asn Glu Met Ala Ile Leu Gly Ile Thr 65 70 75 80 Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Ser Tyr Lys Ala Thr Val 85 90 95 Pro Leu Gln Ile Ile Leu Ile Ile Phe Asn Ser Leu Ser Phe Gln Asn 100 105 110 Ser Ala Ile His Trp Ile Arg Asp His Arg Met His His Lys Tyr Ser 115 120 125 Asp Thr Asp Gly Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser 130 135 140 His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Lys Arg 145 150 155 160 Ala Lys Thr Ile Asp Met Ser Asp Ile Tyr Ser Asn Pro Ile Leu Arg 165 170 175 Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Met Ile Cys Phe Val 180 185 190 Leu Pro Thr Ile Ile Pro Met Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Leu Ser Asn 195 200 205 Ala Trp His Ile Thr Met Leu Arg Tyr Val Phe Ser Leu Asn Ser Ile 210 215 220 Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Tyr Gly Tyr Arg Pro Tyr Asp 225 230 235 240 Lys Asn Ile Leu Pro Ala Glu Asn Lys Met Thr Phe Ile Ala Cys Leu 245 250 255 Gly Glu Asn Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg 260 265 270 Ala Ser Glu Leu Gly Asn Ile Gly Met Asn Trp Thr Ala Lys Phe Ile 275 280 285 Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Ala Ser 290 295 300 Asp Glu Asn Ile Lys Ser Arg Met Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp 305 310 315 320 Val Ser Gly Gln Lys Tyr Ser Cys Glu Ser Ser Glu Val Leu Gln 325 330 335 <210> 64 <211> 1005 <212> DNA <213> Choristoneura parallela <400> 64 atggctccca acgtcgagga catggaatct gacatgcccg agtctgagaa gtgggagaag 60 ctggtggctc cccaggctgc tccccgaaag tacgagatca tctacaccaa cctgctgacc 120 ttcggctacg gccacattgc cggcctgtac ggactgtacc tgtgcttcac ctctgccaag 180 tggcagaccg tgatcctggc catcatcctg aacgagatgg ccattctggg catcaccgct 240 ggcgcccacc gactgtggtc ccaccgatct tacaaggccg ctgtgcccct gcagatcatt 300 ctgatgatct tcaactctct ggccttccag aactctgcca tcaactgggt gcgagatcac 360 cgaatgcacc acaagtactc tgacaccgac ggcgaccctc acaacgcctc tcgaggcttc 420 ttctactctc acgtcggctg gctgctggtg aagaagcacc ccgaggtcaa aaagcgaggc 480 aagatgatcg acatgagcga catctactct aaccccgtgc tgcgattcca gaagaagtac 540 gctatcccct tcatcggcat gatctgcttc gtgctgccca ctattatccc tatgtacttc 600 tggggcgaga ctctgtctaa cgcctggcac atcaccatgc tgcgatacgt gttctctctg 660 aactctatct tcctggtgaa ctccgccgct cacctgtacg gctaccgacc ttacgacaag 720 aacattctgc ccgccgagaa caagatcgcc ctgatcgcct gcctgggcga ctctttccac 780 aactaccacc acgtgttccc ttgggactac cgagcctctg agctgggcaa catcggaatg 840 aactggaccg ctcagttcat cgactttttc gcctggatcg gctgggccta cgacctcaag 900 accgcctctg acgagaacat caactctcga atgaagcgaa ccggcgacgg caccgacatc 960 tctggacaga agtactcttg cgagtcctct gaggtgctgc agtaa 1005 <210> 65 <211> 334 <212> PRT <213> Choristoneura parallela <400> 65 Met Ala Pro Asn Val Glu Asp Met Glu Ser Asp Met Pro Glu Ser Glu 1 5 10 15 Lys Trp Glu Lys Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Pro Arg Lys Tyr Glu 20 25 30 Ile Ile Tyr Thr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Gly His Ile Ala Gly 35 40 45 Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr Val 50 55 60 Ile Leu Ala Ile Ile Leu Asn Glu Met Ala Ile Leu Gly Ile Thr Ala 65 70 75 80 Gly Ala His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Lys Ala Ala Val Pro 85 90 95 Leu Gln Ile Ile Leu Met Ile Phe Asn Ser Leu Ala Phe Gln Asn Ser 100 105 110 Ala Ile Asn Trp Val Arg Asp His Arg Met His His Lys Tyr Ser Asp 115 120 125 Thr Asp Gly Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His 130 135 140 Val Gly Trp Leu Leu 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misc_feature <222> (1)..(1050) <223> Cpo_NPVE, codon-optimised for Y. lipolytica <400> 66 atgccccctc agggacagcc tcccgcctgg gtcctggacg agtccgatgc agtgaccgag 60 gacaaggacg tggccacccc cgctcccgaa gccgagaagc gaaagctgca gatcgtttgg 120 agaaacgtga ccctgttcgt gtttctgcac atcggagctc tgtacggagg atacctgttc 180 tttaccaagg ccatgtggac tacccgaatt ttcactgtgc tgctgtacat tatgtctggg 240 ctgggtatca ccgccggcgc ccatcgactc tgggctcaca agtcttacaa ggcccgactg 300 cccctgcgac tgctgctgac cctcttcaac accatcgcct ttcaggactc cgttctggat 360 tgggcccgag atcaccgaat gcaccataag tactctgaaa ccgacgcaga tccccacaat 420 gctacccgag gcttcttctt ctctcacgtg ggctggctgc tggtgcgaaa gcacccccag 480 atcaaggcca agggacatac tatcgacatg tctgacctgc tggccgatcc cgtgctgcga 540 ttccagaaga agtactacct gacactgatg cccttgtgct gcttcatcct gccctcttac 600 attcccaccc tctggggaga gtctctgtgg aacgcttact ttgtgtgcgc catcttccga 660 tactgttacg ttctgaacgt gacttggctg gtgaactccg ctgcccacaa atggggtgac 720 cgaccttacg acaagaacat caaccctgtg gagactaagc ctgtgtctct ggtggttttc 780 ggagagggat tccacaacta ccaccacacc ttcccctggg attacaagac cgccgagctg 840 ggcggatact ctctgaacct ttccaaactg ttcatcgata ctatgtccaa gattggatgg 900 gcctacgacc tgaagtccgt ttcccctgac atcgtggaga agcgagtgaa gcgcaccggc 960 gacggatctc accacgtgtg gggatgggac gatgctccct ctgagcaaaa ggtggctgcc 1020 accatcgtga accccgataa gaccgagtaa 1050 <210> 67 <211> 349 <212> PRT <213> Cydia pomonella <400> 67 Met Pro Pro Gln Gly Gln Pro Pro Ala Trp Val Leu Asp Glu Ser Asp 1 5 10 15 Ala Val Thr Glu Asp Lys Asp Val Ala Thr Pro Ala Pro Glu Ala Glu 20 25 30 Lys Arg Lys Leu Gln Ile Val Trp Arg Asn Val Thr Leu Phe Val Phe 35 40 45 Leu His Ile Gly Ala Leu Tyr Gly Gly Tyr Leu Phe Phe Thr Lys Ala 50 55 60 Met Trp Thr Thr Arg Ile Phe Thr Val Leu Leu Tyr Ile Met Ser Gly 65 70 75 80 Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Ser Tyr 85 90 95 Lys Ala Arg Leu Pro Leu Arg Leu Leu Leu Thr Leu Phe Asn Thr Ile 100 105 110 Ala Phe Gln Asp Ser Val Leu Asp Trp Ala Arg Asp His Arg Met His 115 120 125 His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly 130 135 140 Phe Phe Phe Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Gln 145 150 155 160 Ile Lys Ala Lys Gly His Thr Ile Asp Met Ser Asp Leu Leu Ala Asp 165 170 175 Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr Leu Thr Leu Met Pro Leu 180 185 190 Cys Cys Phe Ile Leu Pro Ser Tyr Ile Pro Thr Leu Trp Gly Glu Ser 195 200 205 Leu Trp Asn Ala Tyr Phe Val Cys Ala Ile Phe Arg Tyr Cys Tyr Val 210 215 220 Leu Asn Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Lys Trp Gly Asp 225 230 235 240 Arg Pro Tyr Asp Lys Asn Ile Asn Pro Val Glu Thr Lys Pro Val Ser 245 250 255 Leu Val Val Phe Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Thr Phe Pro 260 265 270 Trp Asp Tyr Lys Thr Ala Glu Leu Gly Gly Tyr Ser Leu Asn Leu Ser 275 280 285 Lys Leu Phe Ile Asp Thr Met Ser Lys Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu 290 295 300 Lys Ser Val Ser Pro Asp Ile Val Glu Lys Arg Val Lys Arg Thr Gly 305 310 315 320 Asp Gly Ser His His Val Trp Gly Trp Asp Asp Ala Pro Ser Glu Gln 325 330 335 Lys Val Ala Ala Thr Ile Val Asn Pro Asp Lys Thr Glu 340 345 <210> 68 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1005) <223> Cpo_SPTQ, codon-optimised for Y. lipolytica <400> 68 atggccccct actctgagga gtacgagatc ctgaaggaga atactaagcc cgtatctccc 60 caggccgccc ccagagagta caccgttgtg tactctgtgg tgcttatctt tgtttactgg 120 cacatcggag ccctgtacgg actgtacctg ggcttcacct ccgccaagtg ggccaccatc 180 atctttaact acctgatcta cgtgtctggc ggcttcgcca ttactgctgg atcccatcga 240 ctgtggtctc accgagcctt caaggctaag ctccccctgc agatcctgct catgcttctg 300 cagaccatgt cttgtcagaa gtctgtgctg aactgggtgc gagatcaccg actgcaccac 360 atgtactgtg ataccgatgc cgacccttac aactctactc gaggaatctt ctactctcac 420 atcggctggc tgatggtgaa gaagcatcct gaggtgatcc gaaagggccg aaccatcgac 480 atgtccgatc tggagaacaa ccctgtgctg aagttccaga agaagttcta ccccatcctc 540 gtgaccctga tggcctttat cctgcctgcc ctgatccccg ttattttctg gcaggagtct 600 ctgaacatcg ctcaccacgt ttctcttgtg cacctggtcg tgggctccca catgaccttt 660 gccattaact ctattgccca cgccttcgga tctaagcctt gcgacaagac catctctccc 720 actcagtcca tttccctgtc tctggtgacc ttcggcgaag gctaccataa ctaccaccac 780 gtgttcccct ttgattaccg agtggccgag ctgggcaaca actacctgaa cctgaccacc 840 aacttcatcg acttcttcgc ctggattggc tgggcctacg acctgaagta cgcctctccc 900 gatatggttg ctaagcgagc caagcgaacc ggcgacggaa ctgacctgtg gggacgagct 960 attgagcacg ccgatattca ggctaagcgg gtgcacccct cttaa 1005 <210> 69 <211> 334 <212> PRT <213> Cydia pomonella <400> 69 Met Ala Pro Tyr Ser Glu Glu Tyr Glu Ile Leu Lys Glu Asn Thr Lys 1 5 10 15 Pro Val Ser Pro Gln Ala Ala Pro Arg Glu Tyr Thr Val Val Tyr Ser 20 25 30 Val Val Leu Ile Phe Val Tyr Trp His Ile Gly Ala Leu Tyr Gly Leu 35 40 45 Tyr Leu Gly Phe Thr Ser Ala Lys Trp Ala Thr Ile Ile Phe Asn Tyr 50 55 60 Leu Ile Tyr Val Ser Gly Gly Phe Ala Ile Thr Ala Gly Ser His Arg 65 70 75 80 Leu Trp Ser His Arg Ala Phe Lys Ala Lys Leu Pro Leu Gln Ile Leu 85 90 95 Leu Met Leu Leu Gln Thr Met Ser Cys Gln Lys Ser Val Leu Asn Trp 100 105 110 Val Arg Asp His Arg Leu His His Met Tyr Cys Asp Thr Asp Ala Asp 115 120 125 Pro Tyr Asn Ser Thr Arg Gly Ile Phe Tyr Ser His Ile Gly Trp Leu 130 135 140 Met Val Lys Lys His Pro Glu Val Ile Arg Lys Gly Arg Thr Ile Asp 145 150 155 160 Met Ser Asp Leu Glu Asn Asn Pro Val Leu Lys Phe Gln Lys Lys Phe 165 170 175 Tyr Pro Ile Leu Val Thr Leu Met Ala Phe Ile Leu Pro Ala Leu Ile 180 185 190 Pro Val Ile Phe Trp Gln Glu Ser Leu Asn Ile Ala His His Val Ser 195 200 205 Leu Val His Leu Val Val Gly Ser His Met Thr Phe Ala Ile Asn Ser 210 215 220 Ile Ala His Ala Phe Gly Ser Lys Pro Cys Asp Lys Thr Ile Ser Pro 225 230 235 240 Thr Gln Ser Ile Ser Leu Ser Leu Val Thr Phe Gly Glu Gly Tyr His 245 250 255 Asn Tyr His His Val Phe Pro Phe Asp Tyr Arg Val Ala Glu Leu Gly 260 265 270 Asn Asn Tyr Leu Asn Leu Thr Thr Asn Phe Ile Asp Phe Phe Ala Trp 275 280 285 Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Tyr Ala Ser Pro Asp Met Val Ala 290 295 300 Lys Arg Ala Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp Leu Trp Gly Arg Ala 305 310 315 320 Ile Glu His Ala Asp Ile Gln Ala Lys Arg Val His Pro Ser 325 330 <210> 70 <211> 1362 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> codon-optimized nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1362) <223> S. cerevisiae-codon-optimized nucleotide sequence of H. subflexa fatty acyl reductase; mRNA-coding sequence. <400> 70 atggttgtct tgacctccaa agaaactaag ccatctgttg ctgaatttta cgctggtaag 60 tctgttttca ttactggtgg tactggtttc ttgggtaagg ttttcattga aaagttgttg 120 tactcctgcc cagatatcgg taatatctac atgttgatca gagaaaagaa gggtttgtcc 180 gtttccgaaa gaatcaagca ctttttggat gatcctttgt tcaccagatt gaaagaaaaa 240 agaccagccg acttggaaaa gatcgttttg attccaggtg atattactgc tccagatttg 300 ggtattacct ccgaaaacga aaagatgttg atcgaaaagg tcagtgtcat tattcattct 360 gctgctaccg ttaagttcaa cgaaccattg ccaactgctt ggaagattaa cgttgaaggt 420 actagaatga tgttggcctt gtctagaaga atgaagagaa tcgaagtttt catccatatc 480 tctaccgctt acactaacac caacagagaa gttgttgacg aaatcttgta tccagctcca 540 gctgatattg atcaagttca ccaatatgtt aaggacggta tctctgaaga agaaactgaa 600 aaaatcttga acggtagacc aaacacttac actttcacta aggctttgac cgaacatttg 660 gttgctgaaa atcaagctta cgttccaacc attatcgtta gaccatcagt tgttgctgcc 720 attaaggatg aacctattaa gggttggttg ggtaattggt atggtgctac aggtttgact 780 gtttttactg ctaagggttt gaacagagtt atctacggtc actcttctaa catcgttgat 840 ttgatcccag ttgattacgt tgccaacttg gttattgctg ctggtgctaa atcttctaag 900 tctactgaat tgaaggtcta caactgctgt tcttctgctt gtaacccaat tactatcggt 960 aagttgatgt ccatgtttgc tgaagatgct atcaagcaaa agtcttacgc tatgccattg 1020 ccaggttggt acatttttac taagtacaag tggttggtct tgttgttgac cattttgttc 1080 caagttattc cagcctacat taccgacttg tacagacatt tgattggtaa gaacccaaga 1140 tatatcaagt tgcaatcctt ggtcaatcaa accagatcct ccattgattt cttcaccaac 1200 cattcttggg ttatgaaggc tgatagagtc agagaattat tcgcttcttt gtctccagca 1260 gataagtact tgtttccatg tgatccagtc aacatcaatt ggagacaata tatccaagat 1320 tactgctggg gtgttagaca tttcttggaa aaaaagactt aa 1362 <210> 71 <211> 453 <212> PRT <213> Heliothis subflexa <400> 71 Met Val Val 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caacagagaa gttgttgacg aaatcttgta tccagctcca 540 gctgatattg atcaagttca ccaatatgtt aaggacggta tctctgaaga agaaactgaa 600 aaaatcttga acggtagacc aaacacttac actttcacta aggctttgac cgaacatttg 660 gttgctgaaa atcaagctta cgttccaacc attatcgtta gaccatcagt tgttgctgcc 720 attaaggatg aacctattaa gggttggttg ggtaattggt atggtgctac aggtttgact 780 gtttttactg ctaagggttt gaacagagtt atctacggtc attcctctta catcgttgat 840 ttgatcccag ttgattacgt tgccaacttg gttattgctg ctggtgctaa atcttctaag 900 tctactgaat tgaaggtcta caactgctgt tcttctgctt gtaacccaat tactatcggt 960 aagttgatgt ccatgtttgc tgaagatgct atcaagcaaa agtcttacgc tatgccattg 1020 ccaggttggt atgtttttac aaagtacaag tggttggtct tgttgttgac cattttgttc 1080 caagttattc cagcctacat taccgacttg tacagacatt tgattggtaa gaacccaaga 1140 tatatcaagt tgcaatcctt ggtcaatcaa accagatcct ccattgattt cttcacctct 1200 cattcttggg ttatgaaggc tgatagagtc agagaattat tcgcttcttt gtctccagca 1260 gataagtact tgtttccatg tgatccaacc gatattaact ggacccatta cattcaagat 1320 tactgctggg gtgttagaca cttcttggaa aaaaagacta ccaacaagta a 1371 <210> 73 <211> 456 <212> PRT <213> Helicoverpa assulta <400> 73 Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly 20 25 30 Lys Ile Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Gly Asn 35 40 45 Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg 50 55 60 Ile Lys Gln Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Glu Lys 65 70 75 80 Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr 85 90 95 Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Glu Asn Glu Lys Met Leu Ile Glu 100 105 110 Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met 130 135 140 Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile 145 150 155 160 Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu 165 170 175 Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val His Gln Tyr Val Lys Asp 180 185 190 Gly 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Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly 20 25 30 Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Val Asn 35 40 45 Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg 50 55 60 Ile Lys Gln Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Asp Lys 65 70 75 80 Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr 85 90 95 Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ala Ala Asn Glu Lys Met Leu Ile Glu 100 105 110 Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met 130 135 140 Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile 145 150 155 160 Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu 165 170 175 Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val Tyr Gln Tyr Val Lys Glu 180 185 190 Gly Ile Ser Glu Glu Asp Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn 195 200 205 Thr Tyr Thr Phe Thr 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agatataaat atcctttggt cggatttctc 540 tgttacggtc tacctacgtt tatacccatg tatttttggg gagagacttt ggtaacagct 600 tggcatgtga atattctgcg ttacttttta agtatgaatg ccgtttttct ggtcaacagc 660 ttggcgcatt tgtacggaaa taagccttat gacatatcaa tttgtccgcg acaaagtcct 720 tttgtgtcac ttttgaccat aggcgaggga ttccacaatt atcaccatac gtttccttgg 780 gactataggg cggcagaact aggcaataac tatctgaatg ttggaaaatg ggtcatagac 840 ttcttcgcta tgatcggctg ggcgtatgac ctcaaaacag ttccagatga aacgataaag 900 agaagaatga aaaggactgg agatggcacc aactgctggg gatgggggga caaggacatg 960 actagggagg acagagatat cgctaaaatc atctatcctg agtcgatatc gaaagaagaa 1020 agagatataa ttgcgatgga 1040 <210> 79 <211> 1041 <212> DNA <213> Grapholita molesta <400> 79 atgcctccgg agtccaaaaa cgttcctatc cagcaaaatt ttaggaaacc actagaattt 60 ctcccgagga aatatgatgt ggtgtacgag aatgtatttc ttcacatcgc tggacatata 120 tctgcagctt acggcttata tctctgcttc actgtggcta aatggcagac tatcgccctt 180 gcattcgtct ggtaccacct gggcaagatt ggtataatct gtggcgccca ccggctttgg 240 tctcatcgct gctacaaagc caagatgcct ctgcatatta ttcttatgat atgtaattgt 300 ataggtttcg aaaacacagc cattaattgg gtaaggaatc atagaatgca ccacaagcac 360 agcgacacgg acggtgatcc ccacaactcg aatagaggag ctttcttttc ccacatcggt 420 tggctgtgtg tcaggaaaca tccggagact agaaactgta aagtcgacat gagtgatata 480 tacagcaatc ctgtattggt gtttcagaag agatataaat atcctttggt cggatttctc 540 tgttacggtc tacctacgtt tatacccatg tatttttggg gagagacttt ggtaacagct 600 tggcatgtga atattctgcg ttacttttta agtatgaatg ccgtttttct ggtcaacagc 660 ttggcgcatt tgtacggaaa taagccttat gacatatcaa tttgtccgcg acaaagtcct 720 tttgtgtcac ttttgaccat aggcgaggga ttccacaatt atcaccatac gtttccttgg 780 gactataggg cggcagaact aggcaataac tatctgaatg ttggaaaatg ggtcatagac 840 ttcttcgcta tgatcggctg ggcgtatgac ctcaaaacag ttccagatga aacgataaag 900 agaagaatga aaaggactgg agatggcacc aactgctggg gatgggggga caaggacatg 960 actagggagg acagagatat cgctaaaatc atctatcctg agtcgatatc gaaagaagaa 1020 agagatataa ttgcgatgtg a 1041 <210> 80 <211> 1524 <212> DNA <213> Cydia pomonella <400> 80 atggacatga tcgacgaggc cgaggctcga ggcgagtctc agatccagaa gttcctgtct 60 ggctctacca tcctgctgac cggcggaacc ggcttcctgg gcaagctgct ggtcgagaag 120 ctgctgcgaa cctgtcctga catcaagaag atctacctgc tggctcgacc caagaagaac 180 aaggaaatcc agaagcgact gcaagagcag ttcgaggacc ctctgtacga gcgactccga 240 aagcaggtcc ccgacttcat gtctaagatc ggcgtggtcg agggcgacgt gggaaagctc 300 ggcctgggca tctctgagtc tgaccgacag accgtggtgg acgaggtgga cgtgatcttc 360 cacggcgctg ctaccctgcg attcaacgag cccctgcgag atgccgtgtt catcaacgtg 420 cgaggcaccc gagagatgat gctgctggcc cgagcctgca ccaagctgaa ggccatggtg 480 cacatctcta ccgcctactc taactgcacc ctgtctgaga ttgacgaggt gttctacgag 540 tctcccattc ctggcgacaa gctgatcgac ctggccgagt ctctggacga aaagaccatc 600 aactctatca cccctggcct gatcggcgac ttccccaaca cctacgccta caccaagggc 660 gtcgccgagg acgtgctgca gaagtactct cagggactgc ccgtggccgt ggtgcgaccc 720 tctatcgtga tcggcaccgc taaggacccc gtcgccggct ggatcgacaa cgtgtacggt 780 cccaccggtg tgattgtggg tgctgagctg ggcctgctgc acgtgctcca cgctgctccc 840 aacgcctctg cctctctggt gcccggtgac gctgtggctg ctgcttgcgt ggctgctgct 900 tggtctgtgt ctcgagccga gaaccatcag gctcccgctc gagatgcccc tcctctgtac 960 cactgcgtgt gctctgagaa ggctcccatc acctggtcgc agttcatgtc tctggccgag 1020 actcacggcc tggtggtgcc tccaatgcag gccatgtggt actacatgct gaccctgacc 1080 aactctaagg ccatgtacac cctgctcgcc ctgctgatgc actggatccc cgcctacatc 1140 atcgacggcg tgtgcatggt gctgggcaag aagccccagc tgcgaaaggc ttacaccaag 1200 atcgagcagt ttgccgccgt gatcgagttc ttcgctctgc gagagtggcg attccacaac 1260 aacaacatga cccgactgta caacgagctg tgcgacgccg acaagcacat ctacgacttc 1320 gacacctctg ccatcgactg gaacgagttc tttgccaact acatgaaggg catccgagtg 1380 tacctgctga aggaccctgt gtctactatc cctgagtctc tgaagcgaca caagcgactg 1440 aagtggctgc actacgccct gctcaccgtg ctgtctctgc tggtgctgcg actgctgtgg 1500 ttcttcgtgt ctttcctgtt ttag 1524

Claims (25)

  1. E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 효모 세포로서, 상기 효모 세포는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된(desaturated) 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제(heterologous desaturase)를 발현하고, 여기서 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)이고,
    여기서,
    a) 적어도 하나의 데사투라제는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 80%의 동일성(identity), 예컨대, 서열 번호: 2와 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체(functional variant) 이거나; 또는
    b) 적어도 하나의 데사투라제는 적어도 2개의 데사투라제이고, 여기서 상기 2개의 데사투라제 중 적어도 하나는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 서열 번호: 2와 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이고, 다른 데사투라제는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 데사투라제, 예컨대, Z9-12 데사투라제인 효모 세포.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 데사투라제가 적어도 2개의 데사투라제이고, 여기서 다른 데사투라제가 Cpo_NPVE (서열 번호: 67), Cpo_SPTQ (서열 번호: 69), 및 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 서열 번호: 67 또는 서열 번호: 69와 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체로부터 선택되는 효모 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 효모 세포가 블라케슬레아(Blakeslea), 칸디다(Candida), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 쿤닝하멜라(Cunninghamella), 리포마이세스(Lipomyces), 모르티에렐라(Mortierella), 무코르(Mucor), 피코마이세스(Phycomyces), 피시움(Pythium), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 로도토룰라(Rhodotorula), 트리코스포론(Trichosporon), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 야로위아(Yarrowia)로부터 선택되는 속(genus)에 속하고, 임의로, 여기서 효모 세포가 블라케슬레아 트리스포라(Blakeslea trispora), 칸디다 풀케리마(Candida pulcherrima), C. 레브카우피(C. revkaufi), C. 트로피칼리스(C. tropicalis), 크립토코쿠스 쿠르바투스(Cryptococcus curvatus), 쿤닝하멜라 에키눌라타(Cunninghamella echinulata), C. 엘레간스(C. elegans), C. 자포니카(C. japonica), 리포마이세스 스타키(Lipomyces starkeyi), L. 리포페루스(L. lipoferus), 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina), M. 이사벨리나(M. isabellina), M. 라만니아나(M. ramanniana), M. 비나세아(M. vinacea), 무코르 키르키넬로이데스(Mucor circinelloides), 피코마이세스 블라케스레아누스(Phycomyces blakesleanus), 피시움 이레굴라레(Pythium irregulare), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), R. 그라실리스(R. gracilis), R. 그라미니스(R. graminis), R. 무실라기노사(R. mucilaginosa), R. 피니콜라(R. pinicola), 트리코스포론 풀란스(Trichosporon pullans), T. 쿠타네움(T. cutaneum), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 선택되는 종(species)에 속하고, 바람직하게, 효모 세포가 야로위아 리폴리티카 세포 또는 사카로마이세스 세레비지아에 세포인 효모 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 세포가 E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있고, 상기 효모 세포는 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)로서, 여기서 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 추가로 발현하는 효모 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 데사투라제가 85번 위치에 돌연변이, 예컨대, S85A 돌연변이를 갖는 Cpo_CPRQ의 돌연변이체(mutant)이고/거나, 여기서 적어도 하나의 이종성 데사투라제가 적어도 2개의 상이한 이종성 데사투라제, 예컨대, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 Cpo_CPRQ, 및 85번 위치에 돌연변이, 예컨대, S85A 돌연변이를 갖는 Cpo_CPRQ의 돌연변이체인 효모 세포.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 지방 아실-CoA 리덕타제가 Ase_FAR (서열 번호: 10), Aip_FAR (서열 번호: 61), Hs_FAR (서열 번호: 71), Has_FAR (서열 번호: 73), Hv_FAR (서열 번호: 75), Har_FAR (서열 번호: 12), Cpo_FAR (서열 번호: 76), 및 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 이와 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체로 구성된 군으로부터 선택되고, 임의로, 여기서 지방 아실-CoA 리덕타제가 Ase_FAR의 돌연변이체, 예컨대, 198번 또는 413번 위치에 돌연변이, 바람직하게, T198A 돌연변이 또는 S413A 돌연변이를 갖는 돌연변이체인 효모 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기:
    - 이종성 시토크롬 b5, 예컨대, 레피도프테라 종으로부터의 시토크롬 b5, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5, 바람직하게, 서열 번호: 4에 기재된 시토크롬 b5 HarCyb5, 또는 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 이와 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현하는 것;
    - 이종성 시토크롬 b5 리덕타제 (EC 1.6.2.2), 예컨대, 레피도프테라 종, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5 리덕타제를 발현하고, 바람직하게, 시토크롬 b5 리덕타제는 서열 번호: 24에 기재된, 헬리코베르파 아르미게라로부터의 시토크롬 b5 리덕타제, 또는 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 이와 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체인 것,
    - 헤모글로빈, 예컨대, 비트레오스킬라 스테르코라리아로부터의 헤모글로빈, 바람직하게, 서열 번호: 6에 기재된, 비트레오스킬라 스테르코라리아로부터의 헤모글로빈, 또는 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 이와 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 발현하는 것,
    - 엘롱가제(elongase)를 인코딩(encoding)하고, 엘롱가제 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 예컨대, Elo1 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 ELO1 유전자 (서열 번호: 13)의 돌연변이를 포함하고, 바람직하게, 여기서 상기 돌연변이는 결실인 것,
    - 티오에스테라제를 코딩하고, 티오에스테라제 활성의 부분적 또는 전체적인 손실을 초래하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 예컨대, YAL10 _ F14729g 유전자 (서열 번호: 19)의 돌연변이, YALI0 _ E18876g 유전자 (서열 번호: 54)의 돌연변이, 또는 YALI0 _ D03597g (서열 번호: 55)의 돌연변이를 포함하고, 바람직하게, 여기서 상기 돌연변이는 결실인 것,
    - Hfd1, Hfd2, Hfd3, Hfd4, Fao1, GPAT 및 Pex10 중 적어도 하나의 활성 감소를 초래하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하거나, 또는 적어도 하나의 단백질의 활성 감소를 초래하고, 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 이와 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는 돌연변이를 갖는 것,
    - 변형된 케톤 신타제 도메인을 갖는 지방 아실 신타제 변이체를 발현하고, 여기서 상기 지방 아실 신타제 변이체는 Fas1 (서열 번호: 16), 또는 Fas2 (서열 번호: 18)의 변이체, 예컨대, 123번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Fas1, 바람직하게, L123V 돌연변이, 또는 1220번 위치에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Fas2, 바람직하게, I1220F 또는 I1220W 돌연변이인 것,
    - 티오에스테라제, 예컨대, 이종성 티오에스테라제를 발현하고, 임의로, 여기서, 티오에스테라제는 높은 수준으로 발현되고, 예컨대, 티오에스테라제는 서열 번호: 33에 기재된, 쿠페아 팔루스트리스로부터의 티오에스테라제, 서열 번호: 57에 기재된, 쿠페아 후케리아나로부터의 티오에스테라제, 서열 번호: 35에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터의 티오에스테라제, 또는 서열 번호: 26에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터의 티오에스테라제와 적어도 80%의 동일성을 갖고, 바람직하게, 티오에스테라제는 서열 번호: 35에 기재된, 신나모멈 캠포라로부터의 티오에스테라제, 또는 서열 번호: 26에 기재된, 에스케리키아 콜라이로부터의 티오에스테라제와 적어도 80%의 동일성을 갖는 것,
    - 말단절단된 지방 아실 신타제 및 말단절단된 티오에스테라제의 융합 단백질, 예컨대, 서열 번호: 59에 기재된 융합 단백질, 또는 이와 적어도 80%의 동일성을 갖는, 이의 동족체(homologue)를 발현하는 것 중 하나 이상의 것을 추가로 갖는 효모 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Hfd1, Hfd2, Hfd3, Hfd4, Fao1, GPAT 및 Pex10 중 적어도 하나의 활성 감소를 초래하는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하거나, 또는 적어도 하나의 단백질의 활성 감소를 초래하고, 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 이와 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 효모 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 세포가 적어도 0.5 mg/L, 예컨대, 적어도 0.6 mg/L, 예컨대, 적어도 0.7 mg/L, 예컨대, 적어도 0.8 mg/L, 예컨대, 적어도 0.9 mg/L, 예컨대, 적어도 1 mg/L, 예컨대, 적어도 1.5 mg/L, 예컨대, 적어도 2.5 mg/L, 예컨대, 적어도 5.0 mg/L, 예컨대, 적어도 10 mg/L, 예컨대, 적어도 15 mg/L, 예컨대, 적어도 20 mg/L, 예컨대, 25 mg/L, 예컨대, 적어도 50 mg/L, 예컨대, 적어도 100 mg/L, 예컨대, 적어도 250 mg/L, 예컨대, 적어도 500 mg/L, 예컨대, 적어도 750 mg/L, 예컨대, 적어도 1 g/L, 예컨대, 적어도 2 g/L, 예컨대, 적어도 3 g/L, 예컨대, 적어도 4 g/L, 예컨대, 적어도 5 g/L, 예컨대, 적어도 6 g/L, 예컨대, 적어도 7 g/L, 예컨대, 적어도 8 g/L, 예컨대, 적어도 9 g/L, 예컨대, 적어도 10 g/L 이상의 역가로 E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산할 수 있는 효모 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 세포가 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환시킬 수 있는 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.84)를 추가로 발현하고, 이로써, 효모 세포는 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 생산할 수 있고, 바람직하게, 여기서 아세틸트랜스퍼라제가 상기 효모 세포로부터 발현된 이종성 아세틸트랜스퍼라제 (AcT), 또는 상기 효모 세포로부터 과다발현된 천연 아세틸트랜스퍼라제이고, 바람직하게, 여기서 아세틸트랜스퍼라제가 Sc_Atf1 (서열 번호: 37), 또는 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, Sc_Atf1 (서열 번호: 37)과 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체인 효모 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 세포가 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시킬 수 있는 알데히드 형성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.50), 알콜 데히드로게나제 (EC 1.1.1.2) 및/또는 지방 알콜 옥시다제 (EC 1.1.3.20)를 추가로 발현하는 효모 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 세포가 추가로
    i) 하나 이상의 천연 아실-CoA 옥시다제의 활성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖고;
    ii) 지방 아실-CoA를 산화시킬 수 있는 적어도 하나의 아실-CoA 옥시다제를 포함하는 효소의 적어도 하나의 군을 발현하고, 여기서 효소의 군은 제1 탄소 쇄 길이가 X인 지방 아실-CoA를 제2 탄소 쇄 길이 X'인 단축된 지방 아실-CoA로 단축시킬 수 있고, 여기서 X' ≤ X-2이고, 바람직하게, X'=12인 효모 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 탄소 쇄 길이가 X인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 데사투라제, 예컨대, CroZ11 데사투라제 (서열 번호: 63), 또는 CpaE11 데사투라제 (서열 번호: 65), 또는 서열 번호: 63, 또는 서열 번호: 65와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체를 추가로 발현하는 효모 세포.
  14. 효모 세포를 제공하는 단계, 및 배지 중에서 상기 효모 세포를 인큐베이션(incubation)시키는 단계를 포함하여, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10- 도데카디엔-1-올을 생산하는 방법으로서 여기서 효모 세포는:
    i) 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 하나 이상의 이중 결합을 도입하여 상기 지방 아실-CoA를 탈포화된 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 데사투라제로서, 여기서 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부는 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)이고; 여기서,
    a) 적어도 하나의 데사투라제는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 서열 번호: 2와 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이거나; 또는
    b) 적어도 하나의 데사투라제는 적어도 2개의 데사투라제이고, 여기서 상기 2개의 데사투라제 중 적어도 하나는 Cpo_CPRQ (서열 번호: 2), 또는 이와 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 서열 번호: 2와 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는, 이의 기능성 변이체이고, 다른 데사투라제는 탄소 쇄 길이가 12인 지방 아실-CoA에 적어도 하나의 이중 결합을 도입할 수 있는 데사투라제, 예컨대, Z9-12 데사투라제인 적어도 하나의 이종성 데사투라제; 및
    ii) 임의로, 상기 탈포화된 지방 아실-CoA의 적어도 일부를 탈포화된 지방 알콜로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)로서, 여기서, 지방 아실-CoA 리덕타제는 상기 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A (E8,E10-C12:CoA)의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시킬 수 있는 것인 적어도 하나의 이종성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.84)를 발현하는,
    효모 세포에서 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A 및 임의로, E8,E10-도데카디엔-1-올을 생산하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 방법이 E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A를 지질, 예컨대, 트리아실글리세리드로, 또는 유리 지방산으로 전환시키는 단계, 상기 지질 또는 유리 지방산을 회수하는 단계, 및 상기 지질 또는 유리 지방산을 E8,E10-도데카디엔-1-올로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 방법이 상기 E8,E10-도데카디엔-1-올을 회수하는 단계를 추가로 포함하고,
    바람직하게, 여기서 효모 세포가 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 아세틸트랜스퍼라제의 발현에 의해, 또는 화학적 전환에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 전환시킴으로써, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 추가로 생산하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 상기 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시킬 수 있는 알데히드 형성 지방 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.50), 알콜 데히드로게나제 (EC 1.1.1.2) 및/또는 지방 알콜 옥시다제 (EC 1.1.3.20)의 발현에 의해, 또는 화학적 전환에 의해 E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 전환시킴으로써, E8,E10-도데카디에날을 추가로 생산하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로, 상기 E8,E10-도데카디에날을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 배양 온도에서 예컨대, 배양 배지와 같은 수용액 중에서 이의 클라우드 농도(cloud concentration) 이상인 양으로 추출제(extrant)를 포함하고, 여기서 추출제는 비이온성 에톡실화된 계면활성제, 예컨대, 소포제(antifoaming agent), 바람직하게, 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 폴레에테르 분산액의 혼합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트를 포함하는 소포제, 예컨대, 시메티콘, 지방 알콜 알콕실레이트, 폴리에톡실화된 계면활성제 및 에톡실화 및 프로폭실화된 C16-C18 알콜계 소포제 및 이의 조합으로부터 선택되는 폴리에톡실화된 계면활성제인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 배양 배지가 이의 클라우드 농도보다 적어도 50%, 예컨대, 적어도 100%, 예컨대, 적어도 150%, 예컨대, 적어도 200%, 예컨대, 적어도 250%, 예컨대, 적어도 300%, 예컨대, 적어도 350%, 예컨대, 적어도 400%, 예컨대, 적어도 500%, 예컨대, 적어도 750%, 예컨대, 적어도 1000% 이상 만큼 더 큰 양으로 추출제를 포함하고/거나, 여기서 배양 배지가 이의 클라우드 농도의 적어도 2배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 3배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 4배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 5배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 6배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 7배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 8배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 9배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 10배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 12.5배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 15배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 17.5배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 20배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 25배, 예컨대, 이의 클라우드 농도의 적어도 30배인 양으로 추출제를 포함하고, 여기서, 클라우드 농도는 배지 중에서, 바람직하게, 배양 온도에서 측정되는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, E8,E10-도데카디에닐 코엔자임 A를 지질, 또는 유리 지방산으로 전환시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 효모 세포에 의해 생산된 상기 지질 또는 유리 지방산, 상기 E8,E10-도데카디엔-1-올, 및 임의로, 상기 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 상기 E8,E10-도데카디에날이 발효 브로쓰(fermentation broth) 중 에멀젼으로 존재하고, 본 방법은 상기 에멀젼을 파괴시켜 추출제 및 지질 또는 유리 지방산, E8,E10-도데카디엔-1-올, 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 포함하는 생성물 상(product phase)을 포함하는 조성물을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 에멀젼을 파괴시키는 단계가 발효 브로쓰의 상 분리 단계, 예컨대, 원심분리 단계를 거쳐 3개 상: 수상, 세포 및 세포 파편(cell debris)을 포함하는 상, 및 추출제 및 지질 또는 유리 지방산, E8,E10-도데카디엔-1-올, 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 포함하는 생성물 상으로 구성된 조성물을 수득하는 단계를 포함하거나, 또는 이로 구성되는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 생성물 상이 처음 발효 브로쓰에 존재하는 지질 또는 유리 지방산, E8,E10-도데카디엔-1-올, 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날의 적어도 50%, 예컨대, 적어도 55%, 예컨대, 적어도 60%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95% 이상을 포함하는 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 바람직하게, 증류 단계, 예컨대, 감압하에서의 증류 단계에 의해, 또는 칼럼 정제에 의해 지질 또는 유리 지방산, E8,E10-도데카디엔-1-올, 및 임의로, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 회수하는 단계,
    - E8,E10-도데카디엔-1-올의 적어도 일부를 E8,E10-도데카디에날로 및/또는 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트로 화학적으로 전환시키는 단계,
    - 임의로, 상기 E8,E10-도데카디에날 및/또는 E8,E10-도데카디에닐 아세테이트를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 E8,E10-도데카디엔-1-올, E8,E10-도데카디에닐 아세테이트 및/또는 E8,E10-도데카디에날을 페로몬 조성물로 제제화(formulating)하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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