ES2243075T3

ES2243075T3 - Genes de la monooxigenasa del citocromo p450 y de la oxidoreductasa nadph del citocromo p450 y proteinas relacionadaqs con el complejo de la omega hidroxilasa de candida tropicalis y metodos relacionados con los mismos.

Info

Publication number: ES2243075T3
Application number: ES99946862T
Authority: ES
Inventors: C. Ron Wilson; David L. Craft; L. Dudley Eirich; Mark Eshoo; Krishna M. Madduri; Cathy A. Cornett; Alfred A. Brenner; Maria Tang; John C. Loper; Martin Gleeson
Original assignee: Cognis IP Management GmbH
Current assignee: Cognis IP Management GmbH
Priority date: 1998-10-05
Filing date: 1999-09-10
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2019-09-10
Also published as: DE69924873D1; EP1148135A2; EP1162268A3; DE69941603D1; EP1148134A3; AU5917799A; EP1148132A3; EP1148131A2; EP1162268A2; EP1148133A2; EP1148138A2; EP1148130A2; CA2653985A1; WO2000020566A9; EP1148136A2; EP1148136A3; EP1148137A3; EP1148143A2; EP1148143A3; EP1148131A3

Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína CPRA que tiene la secuencia de aminoácido que se expone en la SEQ. ID. No. 83.

Description

Genes de la monooxigenasa del citocromo P450 y de la oxidoreductasa NADPH del citocromo P450 y proteínas relacionadas con el complejo de la \omega-hidroxilasa de Candida tropicalis y métodos relacionados con los mismos.

Antecedentes 1. Campo de la invención

La presente invención se relaciona con los genes que codifican enzimas del complejo de la \omega-hidroxilasa en las cepas de la levadura Candida tropicalis. En particular, la invención se relaciona con los genes que codifican al citocromo P450 y a las enzimas de la reductasa NADPH del complejo de la \omega-hidroxilasa en la levadura Candida tropicalis y con un método para cuantificar la expresión de los genes.

2. Descripción del estado de la técnica relacionado

Los ácidos alifáticos dióicos son versátiles intermediarios químicos, útiles como materia prima para la preparación de perfumes, polímeros, adhesivos y antibióticos macrólidos. Mientras que se dispone de diferentes rutas químicas para la síntesis de ácidos alfa, \omega-dicarboxílicos de cadena larga, la síntesis no es fácil y la mayoría de los métodos dan como resultado mezclas que contienen cadenas de longitud más corta. Como resultado, se requieren prolongadas etapas de purificación. Mientras que se sabe que los ácidos dióicos de cadena larga pueden producirse también por transformación microbial de alcanos, ácidos grasos o ésteres de los mismos, la síntesis química a permanecido como la vía comercialmente más viable, debido a las limitaciones con las propuestas biológicas actuales.

Se sabe que varias cepas de levaduras excretan ácidos alfa, \omega-dicarboxílicos como subproductos cuando se las cultiva sobre alcanos o ácidos grasos como fuente de carbono. En particular, se sabe que las levaduras pertenecen al Género Cándida, tal como la C. albican, C. cloacae, C. guillermondii, C. intermedia, C. lipolílica, C. maltosa, C. parapsilosis y C. zeylenoides producen tales ácidos dicarboxílicos (Agr. Biol. Chem. 35: 2033-2042 (1971)). También, se sabe que varias cepas de C. tropicalis producen ácidos dicarboxílicos dentro del rango de longitudes de cadena desde C_{11} hasta C_{18} (Okino y colaboradores, BM Lawrence, BD Mookherjee y BJ Willis (eds), en Flavours and Fragances: A World Perspective. Proceedings of the 10^{th} International Conference of Essencial Oils, Flavours and Fragances, Elsevier Science Publishers BV Amsterdam (1988)), y son la base de diferentes patentes como lo reseñan Bühler y Schindler, en Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnolog, H.J. Rehm y G. Reed (eds), Vol. 169, Verlag Chemie, Weinheim (1984).

Los estudios de los procesos bioquímicos por medio de los cuales las levaduras metabolizan alcanos y ácidos grasos han revelado tres tipos de reacciones de oxidación: \alpha-oxidación de alcanos hasta alcoholes, \omega-oxidación de ácidos grasos hasta ácidos alfa, \omega-dicarboxílicos y la \beta-oxidación degradativa de ácidos grasos hasta CO_{2} y agua. Los primeros dos tipos de oxidaciones son catalizadas por enzimas microsomales, mientras que el último tipo tienen lugar en los peroxisomas. En C. tropicalis, la primera etapa en la ruta de la \omega-oxidación se cataliza por un complejo de enzima enlazada a la membrana (complejo \omega-hidroxilasa) incluye una monooxigenasa del citocromo P450 y una reductasa del citocromo NADPH. Este complejo hidroxilasa es responsable por la oxidación primaria del grupo metilo terminal en alcanos y ácidos grasos (Gilewicz y colaboradores, Can. J. Microbiol. 25: 201 (1979)). Los genes que codifican a los componentes del complejo citocromo P450 y reductasa NADPH, han sido previamente identificados como P450ALK y P450RED respectivamente, y han sido clonados y secuenciados también (Sanglard y colaboradores, Gene 76: 121-136 (1989)). El P450ALK también ha sido designado como P450ALK1. Más recientemente, los genes ALK han sido designados por el símbolo CYP, y los genes RED han sido designados por el símbolo CPR. Ver, por ejemplo, Nelson, Pharmacogenetics 6(1): 1-42 (1996). Ver también Ohkuma y colaboradores, DNA and Cell Biology 14: 163-173 (1995), Seghezzi y colaboradores, DNA and Cell Biology, 11: 767-780 (1992) y Kargel y colaboradores, Yeast 12: 333-348 (1996). Por ejemplo, P450ALK también se lo designa como CYP52 de acuerdo con la nomenclatura de Nelson, supra. Los ácidos grasos finalmente se forman a partir de alcanos después de dos etapas de oxidación adicionales, catalizadas por oxidasa de alcohol (Kemp y colaboradores, Appl. Microbiol. and Biotechnol. 28: 370-374 (1988)) y aldehído deshidrogenesa. Los ácidos grasos pueden ser oxidados además a través de la misma ruta o de una ruta similar a la correspondiente al ácido dicarboxílico. La \omega-oxidación de ácidos grasos procede a través del \omega-hidroxi ácido graso y su derivado aldehído, hasta el correspondiente ácido dicarboxílico sin requerir de la activación CoA. Sin embargo, tanto los ácidos grasos como los ácidos dicarbixílicos pueden degradarse, después de la activación del correspondiente éster acil-CoA a través de la ruta de la \beta-oxidación en los peroxisomas, conduciendo al acortamiento de la cadena. En los sistemas de los mamíferos tanto los productos de la \omega-oxidación del ácido graso como del ácido dicarboxílico se activan hasta sus ésteres CoA a las misma velocidades, y son sustratos tanto para la \beta-oxidación mitocondrial como peroxisomal (J. Biochem., 102: 225-234 (1987)). En las levaduras, la \beta-oxidación tiene lugar solamente en los peroxisomas (Agr. Biol. Chem. 49: 1821-1828 (1985)).

La producción de ácidos dicarboxílicos por fermentación de ácidos monocarboxólicos insaturados C_{14}-C_{16} usando una cepa de la especie C. tropicalis se describe en US-A-4.474.882. Los ácidos dicarboxílicos insaturados corresponden a los materiales de partida en el número y posición de los dobles enlaces. Procesos similares en los cuales se usan otros microorganismos especiales, se describen en US-A-3.975.234 y 4.339.536, en las Especificaciones de la Patente Británica GB-A-1.405.026 y en las Publicaciones de las Patentes Alemanas DE-A-21 64 626, 28 53 847, 29 37 292, 29 51 177 y 21 40 133.

Los citocromos P450 (P450s) son monooxidasas terminales de un sistema multicomponente de enzima como se describió antes. Ellos incluyen una superfamilia de proteínas ampliamente extendidas en la naturaleza que han sido aisladas de una variedad de organismos como se describe por ejemplo, en Nelson, supra. Estos organismos incluyen a varios mamíferos, peces, invertebrados, plantas, moluscos, crustáceos, eucariotas inferiores y bacterias (Nelson, supra). Descubiertas primero en los microsomas de hígado de roedor como un pigmento enlazado a un monóxido de carbono, como se describe por ejemplo en, Garfinkel, Arch. Biochem. Biophys. 77: 493-509 (1958), P450s fueron nombrados después con base en su absorción a 450 nm en un espectro de diferencia acoplada a CO reducido, como se describe por ejemplo, en Omura y colaboradores, J. Biol. Chem. 239: 2370-2378 (1964).

P450s catalizan el metabolismo de una variedad de compuestos endógenos y exógenos (Nelson, supra). Los compuestos endógenos incluyen esteroides, protanoídes, eicosanoides, vitaminas solubles en grasa, ácidos grasos, alcaloides de mamíferos, leucotrinas, aminas biogénicas y fitolexinas (Nelson, supra). El metabolismo de P450 involucra reacciones tales como epoxidación, hidroxilación, desalquilación, N-hidroxilación, sulfoxidación, desulfuración y deshalogenación reductiva. Estas reacciones generalmente hacen al compuesto más soluble en agua, que es conducente para excreción, y más electrofílico. Estos productos electrofílicos pueden tener efectos perjudiciales si reaccionan con ADN u otros constituyentes celulares. Sin embargo ellos pueden reaccionar a través de conjugación con sustancias hidrofílicas de bajo peso molecular, dando como resultado una glucorinidación, sulfatación, acetilación, conjugación de aminoácidos o conjugación de glutationa, lo que típicamente conduce a inactivación y eliminación como se describe, por ejemplo en, Klaassen y colaboradores, Toxicology 3^{era} edición, McMillan, New York, 1986.

Las P450 son proteínas heme tioladas que constan de una fracción heme enlazada a una cadena poplipéptidica individual de 45.000 hasta 55.000 Da. El hierro del grupo prostético heme se localiza en el centro de un anillo de protoporfirina. Los cuatro ligandos del hierro heme pueden atribuirse al anillo de porfirina. El quinto ligando en un anión tiolato de un residuo cisteinilo del polipéptido. El sexto ligando es probablemente un grupo hidroxilo de un residuo aminoácido, o una fracción con una fuerza de campo similar tal como una molécula de agua, como se describe por ejemplo en Goeptar y colaboradores, Critical Reviews en Toxicology 25(1): 25-65 (1995).

Las reacciones de monooxigenación catalizadas por citocromos P450 en un sistema enlazado a una membrana eucariótica, requieren la transferencia de electrones desde NADPH hasta P450 por medio de la NADPH-citocromo P450 reductasa (CPR) como se describe por ejemplo, en Taniguchi y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys. 232: 585 (1984). CPR es una flavoproteína de aproximadamente 78.000 Da que contiene 1 mol de flavín adenina dinucleótida (FAD) y 1 mol de flavín mononucleótido (FMN) por mol de enzima como se describe, por ejemplo, en Potter y colaboradores, J. Biol. Chem. 258: 6906 (1983), incorporada aquí como referencia. La fracción FAD de CPR es el sitio de la entrada del electrón dentro de la enzima, mientras que FMN es el sitio de donación del electrón al P450 como se describe, por ejemplo, en Vermilion y colaboradores, J. Biol. Chem. 253: 8812 (1978). La reacción completa es como sigue:

H^{+}+ RH + NADPH + O_{2} \rightarrow ROH + NADP^{+} + H_{2}O

El enlazamiento de un sustrato al sitio catalítico de P450 aparentemente da como resultado un cambio conformacional que da inicio a la transferencia electrónica desde CPR hasta P450. Después de la transferencia del primer electrón, O_{2} se enlaza al complejo del sustrato P450- Fe_{2}^{+} para formar el complejo del sustrato P450-Fe_{3}^{+}. Este complejo se reduce entonces por medio de un segundo electrón del CPR, o, en algunos casos, de NADH por medio del citocromo b5 y NADH-citocromo b5 reductasa como se describe, por ejemplo, en Guengerich y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys. 205: 365 (1980). Un átomo de este oxígeno reactivo se introduce dentro de sustrato, mientras que el otro se reduce hasta agua. El sustrato oxigenado se disocia entonces, regenerando la forma oxidada del citocromo P450 como se describe, por ejemplo, en Klassen, Amdur y Doull, Casarett and Doull's Toxicology, McMillan, New York (1986).

El ciclo de la reacción del P450 puede acortarse de tal manera que el O_{2} se reduce hasta O_{2}^{-} y/o H_{2}O_{2} en vez de ser utilizado para la oxigenación del sustrato. A menudo se hace referencia a esta reacción como el "desacoplamiento" del citocromo P450 como se describe, por ejemplo, en Kuthen y colaboradores, Eur. J. Biochem. 126: 583 (1982) y en Poulos y colaboradores, FASEB J. 6: 674 (1992). La formación de estos radicales de oxígeno puede conducir a daño oxidativo de la célula como se describe, por ejemplo, en Mukhopadhyay, J. Biol. Chem. 269(18): 13390-13397 (1994) y en Ross y colaboradores, Biochem. Pharm. 49(7): 979-989 (1995). Se ha propuesto que el efecto del citocromo b5 sobre el enlazamiento de P450 al CPR da como resultado un complejo más estable que es menos parecido al convertido en "desacoplado" como se describe, por ejemplo, en Yamazaki y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys. 325(2): 174-182 (1996).

Las familias de P450 se asignan con base en las comparaciones de secuencia de la proteína. A pesar de cierta cantidad de heterogeneidad, puede obtenerse una clasificación práctica de P450s en familias, con base en la similitud deducida de la secuencia de aminoácidos. La similitud en la secuencia de aminoácidos con P450s entre alrededor de 40-80%, se considera que son de la misma familia, con secuencias alrededor de > 55% que pertenecen a la misma subfamilia. Aquellos con una similitud de secuencia alrededor de < 40% se enlistan generalmente como miembros de diferentes familias del gen P450 (Nelson, supra). Un valor alrededor de > 97% se toma como indicativo de variantes alélicas del mismo gen, a menos que se pruebe otra cosa con base en la actividad catalítica, la divergencia de secuencia en regiones no trasladadas de la secuencia del gen o mapeo cromosómico.

La región más altamente conservada es el consenso HR2 que contiene al residuo invariante de cisteína cerca del carboxilo terminal que se requiere para el enlazamiento de heme como se describe, por ejemplo, en Gotoh y colaboradores, J. Biochem. 93: 807-817 (1983) y en Motohashi y colaboradores. J. Biochem. 101: 879-997 (1987). También han sido identificadas regiones adicionales de consenso, que incluyen la región central de la hélice I y la región transmembrana, como se describe, por ejemplo, en Goeptar y colaboradores, supra y en Kalb y colaboradores, PNAS. 85: 7221-7225 (1988), aunque la cisteína HR2 es el único aminoácido invariante entre P450s.

Los ácidos dicarboxílicos alifáticos (diácidos) de cadena corta (\leq C12) son importantes intermediarios industriales en la fabricación de diésteres y polímeros, y encuentran aplicación como termoplásticos, agentes plastificantes, lubricantes, fluidos hidráulicos, agroquímicos, productos farmacéuticos, tintas, tensoactivos, y adhesivos. El alto precio y la limitada disponibilidad de los diácidos de cadena corta se deben a las restricciones impuestas por la síntesis química existente.

Los diácidos de cadena larga (ácidos alifáticos \alpha, \omega-dicarboxílicos con un número de carbonos de 12 o superior, mencionados aquí también como diácidos) (HOOC-(CH_{2})_{n}-COOH) son una versátil familia de químicos con utilidad demostrada y potencial, en una variedad de productos químicos que incluyen plásticos, adhesivos y fragancias. Infortunadamente, no se ha llevado a cabo el mercadeo potencial total de los diácidos, debido a que los procesos químicos producen solamente un rango limitado de estos materiales y a un costo relativamente alto. Además, los procesos químicos para la producción de los diácidos tienen varias limitaciones y desventajas. Todos los procesos químicos se restringen a la producción de diácidos de longitudes de cadena carbonada específicas. Por ejemplo, el proceso del ácido dodecanóico comienza con butadieno. Los productos diácidos resultantes se limitan a múltiplos de longitud de cuatro carbonos y, en la práctica solamente se produce ácido dodecanóico. El proceso del ácido dodecanóico se basa en el suministro de existencias petroquímicas no renovables. El proceso de conversión multireacción produce subproductos no deseados, que conducen a la perdida en rendimiento, polución por NO_{x} y desperdicios de metales pesados.

Los diácidos de cadena larga ofrecen ventajas potenciales sobre los diácidos de cadena más corta, pero sus altos precios de venta y disponibilidad comercial limitada evitan un extenso crecimiento en muchas de estas aplicaciones. La biocatálisis ofrece una forma innovadora de superar estas limitaciones con un proceso que produce una gran variedad de productos diácido a partir de existencias renovables. Sin embargo no existen bioprocesos comercialmente viables para producir diácidos de cadena larga a partir de recursos renovables.

Resumen de la invención

Se provee un ácido nucleico aislado que codifica a una proteína CPRA que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ. ID. No. 83. Se provee también un ácido nucleico aislado que incluye una región de codificación definida por los nucleótidos 1006-3042 como se expone en la SEQ. ID. No. 81. Se provee una proteína aislada que incluye una secuencia de aminoácidos como se expone en el SEQ. ID. No. 83. Se provee un vector que incluye una secuencia de nucleótidos que codifican a la proteína CPRA que incluye una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83. Se provee una célula huésped que se transfecta o que se transforma con el ácido nucleico que codifica a la proteína CPRA que tiene una secuencia de aminoácido como se expone en la SEQ. ID. No. 83. También se provee un método para producir una proteína CPRA que incluye una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83, el cual incluye a) transforma a una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN que codifica a la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ. ID. No. 83; y b) cultivar la célula bajo condiciones que favorezcan la expresión de la proteína.

Se provee un ácido nucleico aislado que codifica a una proteína CPRB que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ. ID. No. 84. Se provee un ácido nucleico aislado que incluye una región de codificación definida por los nucleótidos 1033-3069 como se expone en la SEQ. ID. No. 82. Se provee una proteína aislada que incluye una secuencia de aminoácidos como se expone en el SEQ. ID. No. 84. Se provee un vector que incluye una secuencia de nucleótidos que codifican a la proteína CPRB que incluye una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84. Se provee una célula huésped que se transfecta o que se transforma con el ácido nucleico que codifica a la proteína CPRB que tiene una secuencia de aminoácido como se expone en la SEQ. ID. No. 84. También se provee un método para producir una proteína CPRB que incluye una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84, el cual incluye a) transformar a una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN que codifica a la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ. ID. No. 84; y b) cultivar la célula bajo condiciones que favorezcan la expresión de la proteína.

Se provee un método para discriminar a los miembros de una familia de genes por medio de la cuantificación de la cantidad de ARNm objetivo en una muestra, el cual incluye a) proveer un organismo que contiene un gen objetivo; b) cultivar el organismo con el sustrato orgánico que causa la sobre regulación en la actividad del gen objetivo; c) obtener una muestra del ARN total del organismo, en un primer momento en el tiempo; d) combinar por lo menos una porción de la muestra del ARN total, con una cantidad conocida del ARN competidor para formar una mezcla de ARN, en donde el ARN competidor es sustancialmente similar al ARNm objetivo, pero que tiene un menor número de nucleótidos comparado con el ARNm objetivo; e) añadir transcriptasa inversa a la mezcla de ARN en una cantidad suficiente para formar correspondiente ADN objetivo y al ADN competidor; f) conducir una reacción en cadena de la polimerasa en presencia de al menos un iniciador específico para al menos una región sustancialmente no homóloga del ADN objetivo dentro de la familia del gen, siendo el iniciador también específico para el ADN competidor; g) repetir las etapas (c-f) utilizando cantidades crecientes del ARN competidor mientras que se mantiene en forma sustancialmente constante la cantidad de ARN objetivo; h) determinar el punto en el cual, la cantidad de ADN objetivo es sustancialmente igual a la cantidad de ADN competidor; i) cuantificar los resultados por medio de la comparación de la relación de la concentración del objetivo desconocido con la concentración conocida del competidor; y j) obtener una muestra del ARN total del organismo en otro momento en el tiempo, y repetir la etapas (d-i).

Se provee un método para incrementar la producción de un ácido dicarboxílico, el cual incluye a) proveer una célula huésped que tiene una ocurrencia natural en el número de genes CPRA; b) incrementar, en la célula huésped, el número de genes CPRA que codifican una proteína CPRA que tienen la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83; c) cultivar la célula huésped en un medio que contiene un sustrato orgánico que sobre regula al gen CPRA, para efectuar el incremento en la producción del ácido dicarboxílico.

Se provee un método para incrementar la producción de una proteína CPRA que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83, el cual incluye a) transforma a una célula huésped que tiene una cantidad de proteína CPRA de ocurrencia natural con un número mayor de copias de un gen CPRA que codifica a la proteína CPRA que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83; y b) cultivar la célula para de ese modo incrementar la expresión de la proteína comparado con la célula huésped que contiene un número de copias de ocurrencia natural del gen CPRA.

Se provee un método para incrementar la producción de un ácido dicarboxílico, el cual incluye a) proveer una célula huésped que tiene un número de genes CPRB de ocurrencia natural; b) incrementar, en la célula huésped, el número de genes CPRB que codifican una proteína CPRB que tienen la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84; c) cultivar la célula huésped en un medio que contiene un sustrato orgánico que sobre regula al gen CPRB, para efectuar el incremento en la producción del ácido dicarboxílico.

Se provee un método para incrementar la producción de una proteína CPRB que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84, el cual incluye a) transformar a una célula huésped que tiene una cantidad de proteína CPRB de ocurrencia natural con un número mayor de copias de un gen CPRB que codifica a la proteína CPRB que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84; y b) cultivar la célula para de ese modo incrementar la expresión de la proteína comparado con la célula huésped que contiene un número de copias de ocurrencia natural del gen CPRB.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 en una representación esquemática del vector de clonación pTripIEx de Clontech^{TM} Laboratories, Inc. Se muestran los sitios de restricción seleccionados dentro del sitio de clonación múltiple.

La Figura 2A es un mapa del vector ZAP Express^{TM}.

La Figura 2B es una representación esquemática de un vector fagémido de clonación pBK-CMV.

La Figura 3A es una secuencia bicatenaria de ADN de una porción de la región de codificación del iniciador 5 del gen CYP52A5A (SEQ. ID. No. 36).

La Figura 4 es una representación diagramática de las regiones altamente conservadas de las secuencias de las proteínas de los genes CYP y CPR. La hélice I representa el sitio de enlazamiento del sustrato putativo y HR2 representa la región de enlazamiento heme. Las regiones de enlazamiento FMN, FAD y NADPH se indican debajo del gen CPR.

La Figura 5 es una representación diagramática del plásmido pHKM1 que contiene el gen CPRA truncado presente en el vector pTripIEx. Se muestra en la parte de arriba, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 6 es una representación diagramática del plásmido pHKM4 que contiene al gen CPRA truncado presente en el vector pTripIEx. Se muestra en la parte de arriba, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 7 es una representación diagramática del plásmido pHKM9 que contiene al gen CPRB (SEQ. ID. No. 82) presente en el vector pBK-CMV. Se muestra en la parte de arriba, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 8 es una representación diagramática del plásmido pHKM11 que contiene al gen CYP52A1A (SEQ. ID. No. 85) presente en el vector pBK-CMV. Se muestra en la parte de arriba, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 9 es una representación diagramática del plásmido pHKM12 que contiene al gen CYP52A8A (SEQ. ID. No. 92) presente en el vector pBK-CMV. Se muestra en la parte de arriba, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 10 es una representación diagramática del plásmido pHKM13 que contiene al gen CYP52D4A (SEQ. ID. No. 94) presente en el vector pBK-CMV. Se muestra en la parte de arriba, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 11 es una representación diagramática del plásmido pHKM14 que contiene al gen CYP52A2B (SEQ. ID. No. 87) presente en el vector pBK-CMV. Se muestra en la parte de arriba, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 12 es una representación diagramática del plásmido pHKM15 que contiene al gen CYP52A8B (SEQ. ID. No. 93) presente en el vector pBK-CMV. Se muestra en la parte de arriba, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

Las Figuras 13A-13D muestran las secuencias completas de ADN que incluyen las regiones reguladora y de codificación para el gen CPRA (SEQ. ID. No. 81) y el gen CPRB (SEQ. ID. No. 82) de C. tropicalis ATCC 20336. Las Figuras 13A-13D muestran la alineación de la región reguladora y de codificación de estas secuencias. Los asteriscos indican a los nucleótidos conservados. La negrilla indica a los nucleótidos que codifican a la proteína; los codones de inicio y de detención están subrayados.

La Figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos de las proteínas CPRA (SEQ. ID. No. 83) y CPRB (SEQ. ID. No. 84) de C. tropicalis ATCC 20366 y la alineación de estas secuencias de aminoácidos. Los asteriscos indican los residuos que no están conservados.

Las Figuras 15A-15M muestran las secuencias completas de ADN que incluyen las regiones reguladora y de codificación para los siguientes genes de C. tropicalis ATCC 20366: CYP52A1A (SEQ. ID. No. 85), CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86), CYP52A2B (SEQ. ID. No. 87), CYP52A3A (SEQ. ID. No. 88), CYP52A3B (SEQ. ID. No. 89), CYP52A5A (SEQ. ID. No. 90), CYP52A5B (SEQ. ID. No. 91), CYP52A8A (SEQ. ID. No. 92), CYP52A8B (SEQ. ID. No. 93), y CYP52D4A (SEQ. ID. No. 94). Las Figuras 15A-15M muestran la alineación región reguladora y de codificación de estas secuencias. Los asteriscos indican a los nucleótidos conservados. La negrilla indica a los nucleótidos que codifican a la proteína; los codones de inicio y de detención están subrayados.

Las Figuras 16A-16C muestran las secuencias de aminoácidos que codificación a las proteínas CYP52A1A (SEQ. ID. No. 95), CYP52A2A (SEQ. ID. No. 96), CYP52A2B (SEQ. ID. No. 97), CYP52A3A (SEQ. ID. No. 98),
CYP52A3B (SEQ. ID. No. 99), CYP52A5A (SEQ. ID. No. 100), CYP52A5B (SEQ. ID. No. 101), CYP52A8A (SEQ. ID. No. 102), CYP52A8B (SEQ. ID. No. 103), y CYP52D4A (SEQ. ID. No. 104) de C. tropicalis ATCC 20336. Los asteriscos indican a los residuos idénticos, y los puntos indican a los residuos conservados.

La Figura 17 es una representación esquemática del vector de clonación del producto PCR pTAg (comercialmente disponible de R&D Systems, Mineapolis, MN).

La Figura 18 es una gráfica de la relación logarítmica (U/C) del producto desconocido del ADN objetivo con respecto al producto del ADN competidor versus la concentración del ARNm competidor. Se utiliza la gráfica para calcular la concentración del ARN mensajero objetivo en una transcripción inversa competitiva cuantitativa por reacción en cadena de la polimerasa (QC-RT-PCR).

La Figura 19 es una gráfica que muestra la inducción relativa de C. tropicalis ATCC 20962 CYP52A5A (SEQ. ID. No 90) por medio de la adición del sustrato del ácido graso Emersol® 267 al medio de crecimiento.

La Figura 20 es una gráfica que muestra la inducción de los genes CYP52 y CPR de C. tropicalis ATCC 20962 por medio de Emersol® 267. Los genes de P450, CYP52A3A (SEQ. ID. No 88), CYP52A3B (SEQ. ID. No 89), y CYP52D4A (SEQ. ID. No 94) se expresan a niveles por debajo del nivel de detección del ensayo QC-RT-PCR.

La Figura 21 es un esquema para integrar a los genes seleccionados dentro del genoma de las cepas de Candida tropicalis y la recuperación del marcador seleccionable URA3A.

La Figura 22 es una representación esquemática de la transformación de C. tropicalis H5343 ura3^{-} con los genes CYP y/o CPR. Solamente un locus URA3 necesita ser funcional. Hay un total de 6 posibles objetivos ura3 (rompimientos 5ura3A loci-2 pox4, rompimientos 2 pox 5, locus 1 ura3A; y locus 1 ura3B).

La Figura 23 es la secuencia completa de ADN (SEQ. ID. No. 105) que codifica a URA3A de C. tropicalis ATCC 20336 y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada (SEQ. ID. No. 106).

La Figura 24 es una representación esquemática del plásmido pURAin, el vector base para a integración de los genes seleccionados dentro del genoma de C. tropicalis. La construcción detallada de pURAin se describe en el texto.

La Figura 25 es una representación esquemática del vector de clonación del plásmido pNEB193 (disponible comercialmente con New England Biolabs, Beverly, MA).

La Figura 26 es una representación diagramática del plásmido pPA 15 que contiene al gen truncado CYP52A2A presente en el vector pTripIEx. Se muestra en la parte superior, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 27 es una representación esquemática de pURA2in, el vector base se construye en pNEB193 que contiene las secuencias de reconocimiento 8 bp para Asc I, Pac I, y Pme I. URA3A (SEQ. ID. No. 105) y CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86) no contienen esos sitios de reconocimiento 8 bp. URA3A se invierte de modo que el fragmento de transformación intentará recircular antes de la integración. Se utilizó un fragmento Asc IIPme para transformar a H5343 ura^{-}.

La Figura 28 muestra un esquema para detectar la integración del gen CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86) dentro del genoma de H5343 ura^{-}. En todos los casos, la intensidad de la banda de hibridación podría reflejar el número de integraciones.

La Figura 29 es una representación diagramática del plásmido pPA57 que contiene al gen truncado CYP52A3A presente en el vector pTripIEx. Se muestra en la parte superior, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 30 es una representación diagramática del plásmido pPA62 que contiene al gen truncado CYP52A3B presente en el vector pTripIEx. Se muestra en la parte superior, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 31 es una representación diagramática del plásmido pPAL3 que contiene al gen truncado CYP52A5A presente en el vector pTripIEx. Se muestra en la parte superior, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 32 es una representación diagramática del plásmido pPA5 que contiene al gen truncado CYP52A5A presente en el vector pTripIEx. Se muestra en la parte superior, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 33 es una representación diagramática del plásmido pPA18 que contiene al gen truncado CYP52D4A presente en el vector pTripIEx. Se muestra en la parte superior, un mapa detallado de restricción solamente de la región secuenciada. La barra indica la estructura de lectura abierta. La dirección de la transcripción se indica por una flecha bajo la estructura de lectura abierta.

La Figura 34 es una gráfica que muestra la expresión de los genes CYP52A1 (SEQ. ID. No.85), CYP52A2 (SEQ. ID. No. 86) y CYP52A5 (SEQ. ID. Nos. 90 y 91) de C. tropicalis 20962 en una corrida en un fermentador por la adición de cantidades del sustrato ácido oleico o tridecano en un experimento complicado.

La Figura 35 describe un esquema utilizado para la extracción y el análisis de diácidos y monoácidos a partir de caldos de fermentación.

La Figura 36 es una gráfica que muestra la inducción de expresión de CYP52A1A, CYP52A2A y CYP52A5A en una corrida de fermentador por la adición del sustrato octadecano. No se observó inducción de CYP52A3A o CYP52A3B bajo estas condiciones.

Descripción de las modalidades preferidas

La productividad del diácido se mejora de acuerdo con la presente invención, incrementando en forma selectiva las enzimas que se sabe que son importantes para la oxidación de los sustratos orgánicos tales como los ácidos grasos que componen la alimentación deseada. De acuerdo con la presente invención, se han identificado y caracterizado diez genes CYP y dos genes CPR de C. tropicalis que se relacionan con la participación en el complejo \omega-hidroxilasa catalizando la primer etapa en la ruta de la \omega-oxidación. Además, se utiliza un ensayo novedoso de la transcripción inversa competitiva cuantitativa por reacción en cadena de la polimerasa (QC-RT-PCR), para medir la expresión del gen en el fermentador bajo condiciones de inducción por uno o más de los sustratos orgánicos como se definen aquí. Con base en los resultados de la QC-RT-PCR, se han identificado tres de los genes CYP, CYP52A1, CYP52A2 y CYP52A5 como de la mayor importancia para la \omega-oxidación de los ácidos grasos de cadena larga. La amplificación de un número de copias del gen CPR mejora la productividad. El ensayo QC-RT-PCR indica que tanto el gen CYP como el gen CPR parecen estar bajo un estrecho control regulatorio.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para discriminar a los miembros de una familia de genes por medio de la cuantificación de la cantidad de ARNm objetivo en una muestra, el cual incluye a) proveer un organismo que contiene un gen objetivo; b) cultivar el organismo con el sustrato orgánico que causa la sobre regulación en la actividad del gen objetivo; c) obtener una muestra del ARN total del organismo, en un primer momento en el tiempo; d) combinar por lo menos una porción de la muestra del ARN total, con una cantidad conocida del ARN competidor para formar una mezcla de ARN, en donde el ARN competidor es sustancialmente similar al ARNm objetivo, pero que tiene un menor número de nucleótidos comparado con el ARNm objetivo; e) añadir transcriptasa inversa a la mezcla de ARN en una cantidad suficiente para formar correspondiente ADN objetivo y al ADN competidor; f) conducir una reacción en cadena de la polimerasa en presencia de al menos un iniciador específico para al menos una región sustancialmente no homóloga del ADN objetivo dentro de la familia del gen, siendo el iniciador también específico para el ADN competidor; g) repetir las etapas (c-f) utilizando cantidades crecientes del ARN competidor mientras que se mantiene en forma sustancialmente constante la cantidad de ARN objetivo; h) determinar el punto en el cual, la cantidad de ADN objetivo es sustancialmente igual a la cantidad de ADN competidor; i) cuantificar los resultados por medio de la comparación de la relación de la concentración del objetivo desconocido con la concentración conocida del competidor; y j) obtener una muestra del ARN total del organismo en otro momento en el tiempo, y repetir la etapas (d-i).

Además, la modificación de los promotores existentes y/o el aislamiento de los promotores alternativos permiten una mayor expresión de los genes CYP y CPR. Los promotores más fuertes se obtienen al menos de cuatro fuentes: de las modificaciones aleatorias o específicas del promotor CYP52A2, del promotor CYP52A5, del promotor CYP52A1, la selección de un promotor fuerte a partir de los genes disponibles de \beta-oxidación de Candida tales como POX4 y POX5 o investigando para seleccionar otro promotor adecuado de Candida.

La fuerza del promotor puede medirse directamente utilizando QT-RT-PCR para medir la expresión de los genes CYP y CPR en células de Candida aisladas de los fermentadores. Los ensayos enzimáticos y los anticuerpos específicos para las proteínas CYP y CPR, son utilizados para verificar que la mayor fuerza del promotor se refleja por un incremento en la síntesis de las enzimas correspondientes. Una vez que se identifica un promotor adecuado, se lo fusiona a los genes seleccionados CYP y CPR y se introducen dentro de Candida por medio de la construcción de una nueva cepa de producción mejorada. Se contempla que la región de codificación de los genes CYP y CPR puede ser fusionada a promotores adecuados o a otras secuencias reguladoras que son bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica.

De acuerdo con la presente invención los estudios sobre C. tropicalis ATCC 20336 han identificado seis genes únicos CYP y cuatro alelos potenciales. Los análisis QC-RT-PCR de células aisladas durante el curso de las bioconversiones por fermentación, indican que al menos tres de los genes CYP son inducidos por los ácidos grasos, y al menos dos de los genes CYP son inducidos por alcanos. Ver la Figura 34. Dos de los genes CYP son altamente inducidos indicando su participación en el complejo \omega-hidroxilasa que catalizan la etapa limitante de velocidad en la oxidación de los ácidos grasos a los correspondientes diácidos.

Las caracterizaciones bioquímicas de cada enzima del P450 son utilizadas aquí para adaptar al huésped C. tropicalis para la productividad óptima del diácido y para seleccionar a las enzimas del P450 que se amplifican con base en el contenido de ácido graso de la corriente de alimentación. El(los) gen(es) CYP que codifican a las enzimas de P450 que tiene un actividad específica baja por el sustrato de ácido graso o de alcano de escogencia, son objetivos para inactivación, reduciendo por lo tanto la carga fisiológica sobre la célula.

Ya que se ha demostrado que CPR puede limitarse en los sistemas de la levadura, la remoción de P450s no esenciales del sistema pueden liberar electrones que son utilizados por P450s no esenciales y hacerlos disponibles para P450s importantes para la productividad del diácido. Además la remoción de P450s no esenciales puede apropiados a otros componentes potencialmente limitantes pero necesarios del sistema de P450 (esto es, el espacio apropiado de membrana, heme y/o NADPH).

La productividad del diácido se mejora por lo tanto por la integración, amplificación y la sobre expresión selectiva de los genes CYP y CPR en la producción del huésped C. tropicalis.

Debe entenderse que las células huésped dentro de la cuales se han introducido una o más copias de los genes deseados CYP y/o CPR, puede hacerse que incluyan a tales genes por una técnica cualquiera de las conocidas por aquellos entrenados en la técnica. Por ejemplo, las células huésped apropiadas incluyen a procariotas tales como Bacillus sp.,Pseudomous sp., Actinomicetes sp., Eschericia sp., Micobacterium sp., y eucariotas tales como levaduras, algas, células de insecto, células de planta y hongos filamentosos. Las células apropiadas del huésped son preferiblemente células de levaduras tales como Yarrowia, Bebaromices, Sacaromices, Schizosacaromices, y Pichia y más preferiblemente aquellas del género Candida. Las especies preferidas de Candida son la tropicalis, maltosa, apícola, paratropicalis, albicans, cloacae, guillermondii, intermedia, lipolítica, parapsilosis y zeylenoides. Ciertas cepas conocidas de Candida tropicalis se enlistan en US-A-5.254.466.

Pueden utilizarse vectores tales como plásmidos, fagémidos, fagos o cósmidos para transformar o transfectar a las células huésped adecuadas. Las células huésped pueden también ser transformadas introduciendo dentro de una célula un vector(es) de ADN lineal que contienen la secuencia del gen deseado. Tal ADN lineal puede ser ventajoso cuando se desea evitar la introducción de un ADN no nativo (foráneo) dentro de la célula. Por ejemplo, el ADN que consiste de un gen(es) objetivo(s) deseado(s) flanqueado(s) por secuencias de ADN que son nativas de la célula, puede introducirse dentro de la célula por electroporación, transformación con acetato de litio, esferoplastia y similares. Las secuencias de ADN que flanquean, pueden incluir marcadores seleccionables y/o otras herramientas para ingeniería genética.

Aquí, un sustrato orgánico adecuado puede ser cualquier compuesto orgánico que sea biooxidable hasta el ácido mono o policarboxílico. Tal compuesto puede ser cualquier compuesto alifático saturado o insaturado o cualquier compuesto carboxíclico o heterocíclico, que tenga al menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal que sea oxidable hasta un grupo carboxilo por biooxidación. Un grupo funcional terminal que sea un derivado de un grupo carboxilo, puede estar presente en la molécula del sustrato, y puede convertirse a un grupo carboxilo por reacción diferente a la biooxidación. Por ejemplo, si el grupo terminal es un éster que no es ni del tipo C. tropicalis silvestre, ni las modificaciones genéticas descritas aquí, permitirá la hidrólisis de la función éster hasta un grupo carboxilo, por lo tanto puede añadirse una lipasa durante la etapa de fermentación para liberar los ácidos grasos libres. Los sustratos orgánicos adecuados libres incluyen, pero no se limitan a, ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, alcanos, alquenos, alquinos y combinaciones de los mismos.

Los alcanos son un tipo de sustrato orgánico saturado que es útil aquí. Los alcanos pueden ser lineales o cíclicos, ramificados o de cadena recta sustituidos o no sustituidos. Los alcanos particularmente preferidos son aquellos que tienen desde alrededor de 4 hasta alrededor de 25 átomos de carbono, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, butano, hexano, octano, nonano, dodecano, tridecano, tetradecano, octadecano y similares.

Ejemplos de sustratos orgánicos insaturados que pueden ser utilizados aquí, incluyen, pero no se limitan a, olefinas internas tales como 2-penteno, 2-hexeno, 3-hexeno, 9-octadeceno y similares; los ácidos carboxílicos insaturados tales como el ácido 2-hexenóico y los ésteres del mismo, el ácido oleico y los ésteres del mismo incluyen ésteres triglicerilo que tienen un contenido de ácido oleico relativamente alto, ácido erúcico y ésteres del mismo incluyen éster triglicerilo que tienen un contenido relativamente alto de ácido erúcico, ácido ricinoléico y ésteres del mismo, incluidos los ésteres triglicerilo que tienen un contenido relativamente alto de ácido ricinoleico, ácido linoléico, y ésteres de los mismos que incluyen a los ésteres triglicerilo que tienen un contenido relativamente alto de ácido linoléico; alcoholes insaturados tales como 3-hexen-1-ol, 9-octadecen-1-ol y similares; los aldehídos insaturados tales como 3-hexen-1-al, 9-octadecen-1-al y similares. Además de lo anterior, un sustrato orgánico que puede ser utilizado aquí, incluye compuestos alicíclicos que tienen al menos un doble enlace interno carbono-carbono, y al menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal que sea oxidable hasta un grupo carboxilo por biooxidación. Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a, 3,6-dimetilo, 1,4-ciclohexadieno; 3-metilciclohexeno; 3-metil-1, 4-ciclohexadieno y similares.

Ejemplos de los compuestos aromáticos que pueden ser utilizados aquí incluyen, pero no se limitan a, arenos tales como o, m, p-xileno; ácido o, m, p-metilbenzóico; dimetil piridina, y similares. El sustrato orgánico puede contener también otros grupos funcionales que sean biooxidables hasta grupos carboxilo tales como un grupo aldehído o un grupo alcohol. El sustrato orgánico puede contener también otros grupos funcionales que no son biooxidables hasta grupos carboxilo y que no interfieren con la biooxidación tales como halógenos, éteres, y similares.

Ejemplos de ácidos grasos saturados que pueden ser aplicados a las células que incorporan a los presentes genes CYP y CPR incluyen a los ácidos capróico, enántico, caprílico, pelargónico, cáprico, undecílico, láurico, mirístico, pentadecanóico, palmítico, margárico, esteárico, arquídico, behénico, y combinaciones de los mismos. Ejemplos de ácidos grasos insaturados que pueden ser aplicados a las células que incorporan a los presentes genes CPY y CPR incluyen, a los ácidos palmitoléico, oleico, erúcico, linoléico, linolénico y combinaciones de los mismos. Los alcanos y las fracciones de alcanos que pueden aplicarse incluyen enlaces de cadena desde C12 hasta C24 en cualquier combinación. Un ejemplo de mezclas preferidas de ácido graso son Emersol® 267 y Tallow, ambos comercialmente disponibles de Henkel Chemicals Group, Cincinati, OH. La composición típica de ácido graso de Emersol® 267 y de Tallow es como sigue:

	TALLOW	E267
C14:0	3,5%	2,4%
C14:1	1,0%	0,7%
C15:0	0,5%	- - - - - - -
C16:0	25,5%	4,6%
C16:1	4,0%	5,7%
C17:0	2,5%	- - - - - - -
C17:1	- - - - - - -	5,7%

(Continuación)

	TALLOW	E267
C18:0	19,5%	1,0%
C18:1	41,0%	69,9%
C18:2	2,5%	8,8%
C18:3	- - - - - - -	0,3%
C20:0	0,5%	- - - - - - -
C20:1	- - - - - - -	0,9%

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar, pero no son limitantes para la invención. Todas las cepas microbiales y los plásmidos relevantes, se describen en la Tabla 1 y en la Tabla 2, respectivamente.

TABLA 1

1

2

3

TABLA 2

4

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5

6

En lo que sigue, aquellos Ejemplos que no caen bajo el alcance de las reivindicaciones son Ejemplos de Referencia.

Ejemplo 1 Purificación de ADN Genómico de Candida tropicalis ATCC 20336 A. Construcción de Bibliotecas Genómicas

Se inocularon 50 ml de caldo YEPD (ver la Carta) con una colonia individual de C. tropicalis 20336 de una placa con agar YEPD y se desarrolló durante la noche a 30ºC. Se inocularon 5 ml del cultivo que se desarrolló durante la noche en 100 ml de caldo YEPD fresco y se incubó a 30ºC durante 4 a 5 horas con agitación. Las células fueron cosechadas por centrifugación, lavadas dos veces con agua destilada estéril y se resuspendieron en 4 ml de solución amortiguadora de esferoplastia (Sorbitol 1 M, EDTA 50 mM, mercaptoetanol 14 mM) y se incubaron durante 30 min a 37ºC con agitación suave. Se añadieron 0,5 ml de zimolasa de 2 mg/ml (ICN Pharmaceuticals Inc., Irvine, CA) y se incubaron a 37ºC con agitación suave durante 30 a 60 min. La formación de esferoplastos fue seguida por lisis de SDS. Los esferoplastos fueron cosechados por medio de centrifugación breve (4.000 rpm, 3 min) y fueron lavados una vez con la solución amortiguadora de esferoplastos sin mercaptoetanol. Los esferoplastos cosechados fueron suspendidos entonces en 4 ml de solución amortiguadora para lisis (Tris 0,2 M / pH 8,0, EDTA 50 mM, SDS al 1%) que contenían 100 \mug/ml de RNasa (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) y se incubaron a 37ºC durante 30 a 60 min.

Las proteínas fueron desnaturalizadas y extraídas dos veces con un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) mezclando suavemente las dos fases por inversión de las manos. Las dos fases fueron separadas por centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min, y se recuperó al ADN de alto peso molecular contenido en la fase acuosa. Se añadió NaCl a la capa acuosa hasta una concentración final de 0,2 M, y se precipitó al ADN por medio de la adición de 2 volúmenes de etanol. El ADN precipitado fue enrollado con una varilla de vidrio limpia y resuspendido en solución amortiguadora TE (Tris 10 mM / pH 8,0, EDTA 1 mM) y se le permitió disolverse durante la noche a 4ºC. Al ADN disuelto se le añadió RNasa libre de cualquier actividad de DNasa (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) hasta una concentración final de 50 \mug/ml y se incubó a 37ºC durante 30 min. Luego se añadió proteasa (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) hasta una concentración final de 100 \mug/ml y se incubó entre 55 a 60ºC durante 30 min. Se extrajo la solución una vez con un volumen igual de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (25:24:1), y una vez con un volumen igual de cloroformo / alcohol isoamílico (24:1). Se añadieron a la fase acuosa, 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol enfriado con hielo (prueba 200), y el ADN de alto peso molecular fue enrollado en una varilla de vidrio, y disuelto en 1 a 2 ml de solución amortiguadora TE.

B. Preparación de ADN Genómico para la Amplificación por PCR de los Genes CYP y CPR

5 ml de medio YDP fueron inoculados con una colonia individual que se desarrolló durante la noche a 30ºC. El cultivo fue centrifugado durante 5 min a 1.200 x g. El sobrenadante fue removido por aspiración y se le añadieron 0,5 ml de solución de sorbitol (sorbitol 0,9 M, Tris-Cl 0,1 M, pH 8,0, EDTA 0,1 M) al sedimento. Ésta fue resuspendida por medio de agitación en vórtice y se añadieron un \mul de 2-mercaptoetanol y 50 \mul de una solución de zimolasa de 10 \mug/ml a la mezcla. El tubo fue incubado a 37ºC durante 1 hora sobre un agitador rotatorio (200 rpm). El tubo fue luego centrifugado durante 5 min a 1200 x g, y el sobrenadante fue removido por aspiración. El sedimento de protoplasto fue resuspendida en 0,5 ml 1x TE (Tris-Cl 10 mM pH 8,0, EDTA 1mM) y transferida a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Los protoplastos fueron lisados por medio de la adición de 50 \mul de SDS al 10% seguido por incubación a 65ºC durante 20 min. Después se añadieron 200 \mul de acetato de potasio 5 M y después de la mezcla, el tubo fue incubado sobre hielo al menos durante 30 min. Los restos celulares fueron removidos por centrifugación a 13.000 x g durante 5 min. El sobrenadante fue cuidadosamente removido y transferido a un nuevo tubo de microcentrífuga. El ADN fue precipitado por medio de la adición de 1 ml de etanol al 100% (prueba 200) seguido por centrifugación durante 5 min a 13.000 x g. Los sedimentos de ADN fueron lavados con 1 ml de etanol al 70% seguido por centrifugación durante 5 min a 13.000 x g. Después de secar parcialmente al ADN al vacío, fue resuspendido en 200 \mul 1x TE. La concentración de ADN se determinó por medio de la reacción de la absorbancia a 260 nm / 280 nm (A_{260/280}).

Ejemplo 2 Construcción de Bibliotecas Genómicas de Candida tropicalis 20336

Se construyeron tres bibliotecas genómicas de C. tropicalis, dos en Clontech Laboratories, Inc., (Palo Alto, CA) y una en Henkel Corporation (Cincinati, OH).

A. Bibliotecas Clontech

La primera biblioteca Clontech fue elaborada como sigue: se preparó el ADN genómico a partir de C. tropicalis 20336 como se describió antes, parcialmente digerido con EcoRI y su tamaño fue fraccionado por electroforesis en gel para eliminar los fragmentos menores a 0,6 kb. Después del fraccionamiento de tamaño, fueron empacadas varias ligaciones de los fragmentos de ADN genómico de EcoRI y los brazos del vector lambda (\lambda) TripIEx^{TM} (Figura 1) con los extremos pegajosos de EcoRI dentro de las cabezas del fago \lambda bajo condiciones diseñadas para obtener un millón de clones independientes. La segundo biblioteca genómica fue construida como sigue: el ADN genómico fue parcialmente digerido con Sau3A1 y su tamaño fue fraccionado por medio de electroforesis en gel. Los fragmentos de ADN fueron despuntados en sus extremos utilizando protocolos estándar como se describe, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 ed., Cold Spring Harbor Press, USA (1989), incorporado aquí como referencia. La estrategia fue la de rellenar las salientes de Sau3A1 con la polimerasa Klenow (Life Technologies, Grand Island, NY) seguido por la digestión con nucleasa S1 (Life Technologies, Grand Island, NY). Después de la digestión con nucleasa S1, los fragmentos fueron rellenado en los extremoss una vez más con polimerasa Klenow para obtener los fragmentos finales de ADN despuntados en sus extremos. Los enlazadores EcoRI fueron ligados a estos fragmentos de ADN despuntados en sus extremos seguido por ligación dentro del vector \lambda TripIEx^{TM}. La biblioteca resultante contenía aproximadamente 2 x 10^{6} clones independientes con un tamaño promedio de inserto de 4,5 kb.

B. Biblioteca Henkel

La tercera biblioteca genómica fue construida en Henkel Corporation utilizando al vector \lambdaZAP Express^{TM} (Stratagene, La Jolla, CA) (Figura 2). El ADN genómico fue parcialmente digerido con Sau3A1 y los fragmentos en el rango de 6 a 12 kb fueron purificados a partir de un gel de agarosa después de electroforesis del ADN digerido. Estos fragmentos de ADN fueron ligados entonces a los brazos del vector \lambdaZAP Express^{TM} digerido con BamHI, de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Se establecieron tres ligaciones para obtener aproximadamente 9,8 x 10^{5} clones independientes. Las tres bibliotecas fueron reunidas y amplificadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante para tener un patrón de título alto (> 10^{9} unidades formadora de plaqueta / ml) para almacenamiento a largo plazo. Se determinó el título de la biblioteca empacada del fago después de la infección de las células E. coliXL1Blue-MRF'. E. coliXL1Blue-MRF' crecieron durante la noche tanto en medio LB como en NZCYM (Carta) que contenían MgSO_{4} 10 mM y maltosa al 0,2% a 37ºC o a 30ºC, respectivamente con agitación. Las células fueron entonces centrifugadas y resuspendidas en 0,5 a 1 volumen de MgSO_{4}10 mM se mezclaron 200 \mul de este cultivo de E. coli con varias diluciones de la biblioteca empacada del fago y se incubaron a 37ºC durante 15 min. A esta mezcla se le añadieron 2,5 ml de agarosa de superficie LB o agarosa de superficie NZCYM (mantenidas a 60ºC) (ver Carta) y se sembró sobre agar LB o agar NCZYM (ver Carta) presente en cajas petri de 82 mm. A los fagos se les permitió propagarse durante la noche a 37ºC para obtener placas discretas, y se determinó el título del fago.

Ejemplo 3 Muestreo de las Bibliotecas Genómicas

Tanto los vectores \lambdaTripIEx^{TM} como \lambdaZAP Express^{TM} son vectores fagémidos que pueden propagarse ya sea como ADN de fago o de plásmido (después de la conversión de fago a plásmido) por lo tanto, las bibliotecas genómicas construidas en estos vectores pueden ser depuradas tanto por hibridación de placa (muestreo de la forma lambda de biblioteca) o por hibridación de colonias (forma de muestreo del plásmido de biblioteca después de la conversión de fago a plásmido). Ambos vectores son capaces de expresar a los genes clonados, y la diferencia principal es el mecanismo de excisión del plásmido a partir del ADN del fago. El sitio de clonación en \lambdaTripIEx^{TM} se localiza dentro de un plásmido que está presente en el fago y está flanqueado por el sitio loxP (Figura 1). Cuando \lambdaTripIEx^{TM} se introduce dentro de la cepa BM25.8 de E. coli (suministrada por Clontech), la recombinasa Cree presente en BM25.8 promueve la excisión y circularización del plásmido pTripIEx del fago \lambdaTripIEx^{TM} en los sitios loxP. El mecanismo de excisión del plásmido pBK-CMV del fago \lambdaZAP Express^{TM} es diferente. Requiere la asistencia de un fago auxiliar tal como ExAssist^{TM} (Stratagene) y de una cepa de E. coli tal como XLOR (Stratagene). Tanto pTripIEx como pBK-CMV pueden replicarse autónomamente en E. coli.

A. Bibliotecas Genómicas de Muestreo 1) Levantamiento de Colonias

Una colonia individual de E. coli BM25.8 fue inoculada dentro de 5 ml de LB que contenían 50 \mug/ml de kanamicina, MgSO_{4} 10 mM y maltosa al 0,1%, y se desarrolló durante la noche a 31ºC, 250 rpm. A 200 \mul de este cultivo que se desarrolló durante la noche (\sim4 X 10^{8} células), se le añadieron 1 \mul de biblioteca de fago (2-5 X 10^{6} unidades formadoras de placa) y 150 \mul de caldo LB, y se incubó a 31ºC durante 30 min después de los cuales se añadieron 400 \mul de caldo LB y se incubó a 31ºC, 225 rpm durante 1 hora. Este cultivo bacterial fue diluido y sembrado sobre agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) y Kanamicina (Sigma Chemical Company) para obtener 500 a 600 colonias/placa. Las placas fueron incubadas a 37ºC durante 6 a 7 horas hasta que las colonias se hicieron visibles. Las placas fueron almacenadas entonces a 4ºC durante 1,5 horas antes de colocar un disco de Hybridization Transfer Membrane, Colony/Plaque Screen^{TM} (DuPont NEN Research Products, Boston, MA) sobre la placa en contacto con las colonias bacteriales. Se permitió que procediera la transferencia de las colonias a la membrana durante 3 a 5 minutos. La membrana fue luego levantada y colocada sobre placas de agar LB fresco (ver la Carta) que contenían 200 \mug/ml de cloramfenicol con el lado expuesto a las colonias de bacterias dando cara hacia arriba. Las placas que contenían las membranas fueron incubadas entonces a 37ºC durante la noche con miras a permitir el desarrollo completo de las colonias bacteriales. Las placas de agar LB a partir de la cuales se levantaron inicialmente las colonias, fueron incubadas a 37ºC durante la noche y almacenadas a 4ºC para su uso posterior. A la mañana siguiente, las membranas que contenían las colonias bacteriales, fueron levantadas y colocadas sobre dos hojas de papel Whatman 3M (Whatman, Hillsboro, OR) saturadas con NaOH 0,5 N y dejadas a temperatura ambiente (RT) durante 3 a 6 min para lisar las células. El tratamiento adicional de las membranas fue como se describe en el protocolo proporcionado por NEN Research Products.

2) Hibridaciones de ADN

Las membranas fueron secadas durante la noche antes de hibridár a las sondas de oligonucleótido preparadas usando un oligo marcador 3' no radioactivo ECL^{TM} y un sistema de detección de Amersham. Life Sciences (Arlington, Heights, IL) La marcación de AND, la prehibridación y las hibridaciones fueron efectuadas de acuerdo con los protocolos del fabricante. Después de la hibridación, las membranas fueron lavadas dos veces a temperatura ambiente en 5 X SSC, SDS al 0,1% (en un volumen equivalente a 2 ml/cm^{2} de membrana) durante 5 min cada vez, seguido por dos lavadas a 50ºC en 1 X SSC, SDS al 0,1% (en un volumen equivalente a 2 ml/cm^{2} de membrana) durante 15 min cada vez. Se generó entonces la señal de hibridación y se la detecto con Hyperfilm ECL^{TM} (Amersham) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las membranas fueron alineadas a las placas que contenían las colonias bacteriales a partir de las cuales se realizó el levantamiento de las colonias, y las colonias correspondientes a las señales positivas con rayos X, fueron entonces aisladas y propagadas en caldo LB. El ADN del plásmido fue aislado de esos cultivos y analizado por medio de las digestiones con la enzima de restricción, y por secuenciación del ADN.

B. Muestreo de las Bibliotecas Genómicas (Forma de Placa) 1) Recubrimiento de Biblioteca \lambda

Las células E. coliXL1Blue-MRF' crecieron durante la noche en medio LB (25 ml) que contenía MgSO_{4} 10 mM y maltosa al 0,2% a 37ºC, 250 rpm. Las células fueron entonces centrifugadas (2200 x g durante 10 min) y resuspendidas en 0,5 volúmenes de MgSO_{4} 10 mM. 500 \mul de este cultivo de E. coli fueron mezclados con una suspensión de fagos que contenía 25.000 partículas de fagos \lambda amplificadas e incubadas a 37ºC durante 15 min. A esta mezcla se le añadieron 6,5 ml de agarosa de superficie NZCYM (mantenida a 60ºC) (ver Carta) y se sembró sobre 80-100 ml de agar NCZYM (véase Carta) presente en un caja de petri de 150 mm. Se le permitió a los fagos propagarse durante la noche a 37ºC para obtener placas discretas. Después del crecimiento durante la noche, las placas fueron almacenadas en un refrigerador durante 1-2 horas antes de realizar el levantamiento de las placas.

2) Levantamiento de Placa e Hibridaciones de ADN

Las membranas de nylon Magna Lift^{TM} (Micron Separations, Inc., Westborough, MA) fueron colocadas sobre la superficie de agar en contacto completo con las placas \lambda y se permitió que procediera la transferencia de las placas a las membranas de nylon durante 5 min a RT. Después de la transferencia de la placa, la membrana fue colocada sobre 2 hojas de papel filtro Whatman 3M^{TM} (Whatman, Hillsboro, OR) saturado con NaOH 0,5 N, solución de NaCl 1,0 M y dejada durante 10 min a RT para desnaturalizar el ADN. El exceso de solución desnaturalizadora fue removida por secado rápido sobre papel Whatman 3M seco. Las membranas fueron entonces transferidas a 2 hojas de papel filtro Whatman 3M^{TM} saturado con Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), NaCl 1,5 M y dejado durante 5 min hasta neutralización. Las membranas fueron entonces lavadas brevemente en 200-500 ml de 2 X SSC, secadas al aire y calentadas durante 30-40 min a 80ºC. Las membranas fueron entonces sondeadas con ADN marcado.

Las membranas fueron prelavadas con 200-500 ml de una solución de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1 mM (pH 8,0) durante 1-2 horas a 42ºC con agitación (60 rpm) para deshacerse de los restos bacteriales de las membranas. Las membranas fuero prehibridadas durante 1-2 horas a 42ºC con solución amortiguadora ECL Gold^{TM} (Amersham) (en un volumen equivalente a 0,125-0,25 ml/cm^{2} de membrana) que contenía NaCl 0,5 M y reactivo de bloqueo al 5%. Los fragmentos de ADN que fueron utilizados como sondas, fueron purificados a partir de gel de agarosa utilizando un juego de extracción en gel QIAEX II^{TM} (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes, y marcados utilizando un juego de marcación directa de ácido nucleico Amersham ECL^{TM} (Amersham). El ADN marcado (5-10 ng/ml de solución de hibridación) fue añadido a las membranas prehibridadas, y se permitió a la hibridación, proceder durante la noche. Al día siguiente, las membranas fueron lavadas con agitación (60 rpm) dos veces a 42ºC durante 20 min cada vez en una solución amortiguadora (en un volumen equivalente a 2 ml/cm^{2} de membrana) que contenía ya sea 0,1 (condiciones restrictivas altas) ó 0,5 (condiciones restrictivas bajas) X SSC, SDS al 0,4% y 360 g/l de urea. Esto fue seguido por dos lavados de 5 min a temperatura ambiente 2 X SSC (en un volumen equivalente a 2 ml/cm^{2} de membrana). Las señales de hibridación fueron generadas utilizando el reactivo de detección da ácido nucleico ECL^{TM} y detectadas utilizando Hyperfilm ECL^{TM} (Amersham).

Los tapones de agar que contenían las placas correspondientes a señales positivas sobre la película de rayos X, fueron tomados de las placas maestras utilizando la pipeta Pasteur de extremo ancho. Las placas fueron seleccionadas alineándolas con la película de rayos X. En esta etapa, generalmente fueron tomadas múltiples placas. Las partículas de fagos fueron eluidas de los tapones de agar por remojo en 1 ml de solución amortiguadora SM (Sambrook y colaboradores, supra) durante la noche. La elución de fagos fue diluida y sembrada con células E. coliXL1Blue-MRF' de crecimiento reciente para obtener 100-500 placas por placa de agar NCZYM de 85 mm. Las placas fueron transferidas a las membranas de nylon Magna Lift como antes, y sondeadas de nuevo utilizando la misma sonda. Las placas individuales bien aisladas correspondientes a las señales sobre la película de rayos X fueron recogidas removiendo los tapones de agar y eluyendo los fagos por remojo durante la noche en 0,5 ml de solución amortiguadora ECM.

C. Conversión de los Clones \lambda a la Forma de Plásmido

Los clones lambda aislados fueron convertidos a la forma de plásmido para análisis adicionales. La conversión de la forma de placa a la forma de plásmido fue acompañada por la infección de las placas dentro de la cepa BM25.8 de E. coli. La cepa de E. coli se desarrolló durante la noche a 31ºC, 250 rpm en caldo LB que contenía MgSO_{4} 10 mM y maltosa al 0,2% hasta que OD_{600} alcanzó el valor 1,1-1,4. Diez ml del cultivo que se desarrolló durante la noche fueron removidos y mezclados con 100 \mul de MgCl_{2} 1 M. Se removió un volumen de células de 200 \mul, y se mezcló con 150 \mul de suspensión de elusión de fago eluidos y se incubo a 31ºC durante 30 min. Se añadió caldo LB (400 \mul) al tubo, y se continuó la incubación a 31ºC durante 1 hora con agitación, 250 rpm. 1-10 \mul de la suspensión de células infectadas fueron sembrados sobre agar LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina a 37ºC, 250 rpm. El ADN del plásmido fue aislado de estos cultivos y analizado. Para convertir el vector \lambdaZAP Express^{TM} a la forma de plásmido, se utilizaron las cepas de E. coli XL1Blue-MRF' y XLOR. La conversión se realizó de acuerdo con los protocolos del fabricante (Stratagene) para la excisión individual de las placas.

Ejemplo 4 Transformación de C. tropicalis H5343 ura^{-} A. Transformación de C. tropicalis H5343 ura^{-} por Electroporación

5 ml de YEPD fueron inoculados con C. tropicalis H5343 ura^{-} de un patrón congelado e incubado durante la noche sobre un agitador New Brunswick a 30ºC y 170 rpm. Al siguiente día, 10 \mul del cultivo incubado durante la noche fueron inoculados dentro de 100 ml de YEPD y el desarrollo continuó a 30ºC, 170 rpm. Al día siguiente, las células fueron cosechadas a un OD_{600} de 1,0 y el sedimento de células fue lavado una vez con agua estéril enfriada con hielo. Las células fueron resuspendidas en polietilén glicol al 35%, estéril y enfriado con hielo (4.000 PM) a una densidad de 5 x 10^{8} células/ml. Se utilizó un volumen de células de 0,1 ml para cada electroporación. El protocolo de electroporación seguido fue el siguiente: se añadió 1 \mug de ADN transformante a 0,1 ml de células, junto con 5 \mug de ADN de timo de ternera, partido y desnaturalizado, y se le permitió a la mezcla incubarse sobre hielo durante 15 min. La solución de células fue transferida entonces a una cubeta de electroporación de 0,2 cm enfriada sobre hielo, manipulada para asegurarse de que la solución estuviera en el fondo de la cubeta y fuera electroporada. Las células fueron electroporadas utilizando un electroporador Invitrogen (Carlsbad, CA) a 450 Voltios, 200 Ohms y 250 \muF. Después de la electroporación, se añadieron 0,9 ml de medio SOS (Sorbitol 1M, YEPD al 30%, CaCl_{2} 10 mM) a la suspensión. El cultivo resultante se desarrolló durante 1 hora a 30ºC, 170 rpm. Después de la incubación, las células fueron sedimentadas por centrifugación a 1500 x g durante 5 min. Las células electroporadas fueron resuspendidas en 0,2 ml de sorbitol 1 M y sembradas sobre medio completo sintético menos uracilo (SC - uracilo) (Nelson, supra). En algunos casos las células electroporadas fueron sembradas directamente sobre SC - uracilo. El crecimiento de transformantes fue seguido durante 5 días. Después de tres días, varios transformantes fueron recogidos y trasferidos a placas de SC - uracilo para la preparación y muestreo genómico del ADN.

B. Transformación de C. tropicalis Utilizando Acetato de Litio

El siguiente protocolo fue utilizado para transformar C. tropicalis de acuerdo con los procedimientos descritos en Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 5, 13.7.1 (1989), incorporado aquí como referencia.

5 ml de YEPD fueron inoculados con C. tropicalis H5343 ura^{-} de un patrón congelado e incubado durante la noche sobre un agitador New Brunswick a 30ºC y 170 rpm. Al siguiente día, 10 \mul del cultivo incubado durante la noche fueron inoculados dentro de 50 ml de YEPD y el desarrolló continuó a 30ºC, 170 rpm. Al día siguiente, las células fueron cosechadas a un OD_{600} de 1,0. El cultivo fue transferido a un tubo de polipropileno de 50 ml y centrifugado 1000 x g durante 10 min. El sedimento de células fue resuspendido en 10 ml de TE estéril (Tris-Cl 10 mM y EDTA 1 mM, pH 8,0). Las células fueron centrifugadas nuevamente a 1000 x g durante 10 min y el sedimento de resuspendido en 10 ml de solución estéril de acetato de litio [LiAc (acetato de litio 0,1 M, Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM)]. Después de la centrifugación a 1000 x g durante 10 min, el sedimento fue resuspendido en 0,5 ml de LiAc. Esta solución fue incubada durante una hora a 30ºC mientras se la agitaba suavemente a 50 rpm. Una alícuota de 0,1 ml de esta suspensión fue incubada con 5 \mug de ADN transformante a 30ºC sin agitación durante 30 min. Una solución de 0,7 ml de PEG (polietilén glicol 3340 al 40% p/v, acetato de litio 0,1 M, Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1mM) fue añadida e incubada a 30ºC durante 45 min. Los tubos fueron entonces colocados a 42ºC durante 5 min. Una alícuota de 0,2 ml fue sembrada sobre medio completo sintético menos uracilo (SC - uracilo) (Kaiser y colaboradores. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1994). El crecimiento de transformantes fue seguido durante 5 días. Después de tres días, varios transformantes fueron recogidos y trasferidos a placas de SC - uracilo para la preparación y muestreo genómico del ADN.

Ejemplo 5 Aislamiento del ADN del Plásmido

El ADN del plásmido fue aislado de los cultivos de E. coli utilizando el juego de aislamiento Qiagen de plásmido (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 6 Análisis y Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN fue realizada en Sequetech Corporation (Mountain View, CA) utilizando un secuenciador automatizado de Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, CA). Las secuencias de ADN fueron analizadas con los paquetes de software MacVector y GeneWorks (Oxford Molecular Group, Campbell, CA).

Ejemplo 7 Protocolos PCR

La amplificación PCR fue llevada a cabo en un Perkin Elmer Thermocycler utilizando el juego de la enzima AmpliTaqGold (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Después de una amplificación exitosa, en algunos casos, los productos fueron digeridos con las enzimas apropiadas y purificados con gel utilizando QiaexII (Qiagen, Chatsworth, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En casos específicos fueron utilizadas la Ultma Taq polimerasa (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) o la Expand Hi-Fi Taq polimerasa (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante o como se define en la Tabla 3.

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La tabla abajo contiene una lista de iniciadores (SEQ. ID. Nos. 1-35) usada para amplificación PCR para construir a los vectores de integración génica o para generar sondas para detección y aislamiento de genes.

TABLA 4 Tabla de iniciadores para amplificación PCR para construir a los vectores de integración génica, para generar sondas para detección y aislamiento de genes y para obtener la secuencia de ADN de los constructores. (A-desoxiadenosina trifosfato [dATP], G-desoxiguanosina trifosfato [dGTP], C-desoxicitosina trifosfato [dCTP], T- desoxitimina trifosfato [dTTP], Y-dCTP o dTTP, R-dATP o dGTP, W-dATP o dTTP, M-dATP o dCTP, N-dATP o dCTP o dGTP o dTTP)

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Ejemplo 8 Procedimiento PCR de Colonia de Lavadura para la Confirmación de la Integración del Gen dentro del Genoma de C. tropicalis

Las colonias individuales de levaduras fueron removidas de la superficie de las placas de transformación, suspendidas en 50 \mul de solución amortiguadora de esferoplastia (KCl 50 mM, Tris-Cl 10 mM, pH 8,3, Zimolasa 1,0 mg/ml, glicerol al 5%) e incubadas a 37ºC durante 30 min. Después de la incubación, la solución fue calentada durante 10 min a 95ºC para lisar las células. Cinco \mul de esta solución fueron utilizados como molde PCR. Se utilizó la Expand Hi-Fi Taq polimerasa (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) en PCR acoplada con un iniciador específico del gen (gen que va a ser integrado) y un iniciador URA3. Si ocurrió la interacción, la amplificación daría un producto PCR del tamaño predicho, confirmando la presencia de un gen integrado.

Ejemplo 9 Método de Fermentación para los Estudios de Inducción Génica

Un fermentador fue cargado con medio de cultivo semisintético compuesto de 75 g/l de glucosa (anhídrida), 6,7 g/l de Yeast Nitrogen Base (Difco Laboratories), 3 g/l de extracto de levadura, 3 g/l de sulfato de amonio, 2 g/l de fosfato monopotásico, 0,5 g/l de cloruro de sodio. Los componentes fueron preparados como soluciones concentradas para ser autoclavadas y luego añadidas al fermentador donde se enfrían: el pH final fue aproximadamente de 5,2. esta carga fue inoculada con 5-10% del cultivo desarrollado durante la noche de C. tropicalis ATCC 20962 preparado em medio YM (Difco Laboratories) como se describe en los métodos de los Ejemplos 17 y 20 de la patente US 5.254.466, que se incorpora aquí como referencia. C. tropicalis ATCC 20962 es un C. tropicalis ATCC 20336 alterado en POX4 y POX5. Se suministró aire y agitación para mantener el oxígeno disuelto en un nivel tan alto como alrededor del 40% de saturación versus aire. El pH fue mantenido alrededor de 5,0 a 8,5 por medio de la adición de soda cáustica 5 N para su control. Tanto la corriente de alimentación de ácido graso (ácido oleico comercial en este ejemplo) con una composición típica de: 2,4% C_{14}; 0,7% C_{14:1}, 4,6% C_{16}; 5,7% C_{16:1}; 5,7 C_{17:1}; 1,0% C_{18}; 69,9% C_{18:1}; 8,8% C_{18:2}; 0,30% C_{18:3}; 0,90% C_{20:1}, como la alimentación del cosustrato glucosa, fueron añadidos en forma de tandas de alimentación, comenzando cerca del final del crecimiento exponencial. El cáustico fue añadido para el control del pH durante la bioconversión de ácidos grasos a diácidos y mantener el pH en el rango deseado. Típicamente, las muestras para el estudio de la inducción génica fueron recogidas justo antes de comenzar la alimentación de ácido graso y durante las 10 primeras horas de la bioconversión. La determinación del contenido de ácido graso y de diácido se hizo por medio de un protocolo estándar de éster metílico, utilizando cromatografía líquido gas (GCL). La inducción génica fue medida utilizando el protocolo QC-RT-PCR descrito en esta solicitud.

Ejemplo 10 Preparación de ARN

La primera etapa de este protocolo implica el aislamiento del ARN celular total de los cultivos de C. tropicalis El ARN celular fue aislado utilizando el juego Qiagen RNeasy Mini (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) como sigue: se recogieron muestras de cultivo de C. tropicalis de 2 ml del fermentador en tubos estándar estilo Eppendorf con tapa rosca de 2 ml en diferentes momentos, antes y después de la adición del sustrato de ácido graso o alcano. Las muestras de células fueron congeladas inmediatamente en nitrógeno líquido o en un baño de hielo seco/alcohol, después de que fueron cosechadas del fermentador. Para aislar el ARN total de las muestras, se permitió a los tubos descongelarse sobre hielo, y a las células que sedimentaran por centrifugación en una microcentrífuga durante 5 minutos (min) a 4ºC y el sobrenadante fue descartado mientras se mantenía al sedimento frío con hielo. Los tubos de microcentrífuga fueron llenados hasta las 2/3 partes con cuentas de Zirconio / Sílice enfriadas con hielo (0,5 mm de diámetro, Biospec Products, Bartlesville, OK), y hasta arriba con solución amortiguadora para lisis RLT* enfriada con hielo (* solución amortiguadora incluida con el juego Qiagen RNeasy Mini). La ruptura de las células se logró, colocando las muestras en una batidora de cuentas mini (Biospec Products, Bartlesville, OK) e inmediatamente se homogenizó a velocidad máxima durante 2,5 min. Se les permitió a las muestras enfriarse en un baño de agua hielo durante 1 minuto y el proceso de homogenización/enfriamiento fue repetido dos veces más para un tiempo total de homogenización de 7,5 min en la batidora de cuentas. Las muestras de células homogenizadas fueron microcentrifugadas a velocidad máxima durante 10, y se removieron y transfirieron 700 \mul de ARN contenidos en el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf. Se añadieron 700 \mul de etanol al 70% a cada muestra seguido por una mezcla por inversión. Esta y todas las etapas posteriores fueron efectuadas a temperatura ambiente. Setecientos microlitros de cada muestra tratada con etanol fueron transferidos a la columna de rotación Qiagen RNeasy, seguido por centrifugación a 8.000 x g durante 15 seg. El fluido se descartó y la columna se recargó con la muestra restante (700 \mul) y se centrífugó nuevamente a 8.000 x g durante 15 seg. La columna fue lavada una vez con 700 \mul de solución amortiguadora RW1* y centrifugada a 8.000 x g durante 15 seg., y el fluido se descartó. La columna fue colocada en un nuevo tubo de recolección de 2 ml, y lavada con 500 \mul de solución amortiguadora RPE* y se descartó el fluido. Se repitió el lavado con RPE* junto con centrifugación a 8.000 x g durante 2 min y se descartó el fluido. La columna de rotación fue transferida a un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml y se añadieron 100 \mul de agua libre de RNasa a la columna, seguido por centrifugación a 8.000 x g durante 15 seg. Se añadieron 75 \mul adicionales de agua libre de RNasa a la columna, seguido por centrifugación a 8.000 x g durante
2 min. El ARN eluido en el agua que fluyó a través de la columna fue recolectado para una purificación adicional.

El eluato de ARN fue tratado luego para remover el ADN contaminante. Se añadieron veinte microlitros de solución amortiguadora 10 X DNasa I (tris 0,5 M (pH 7,5), CaCl_{2} 50 mM, MgCl_{2} 100 mM), 10 \mul de DNasa I libre de RNasa (2 Unidades/\mul, Ambion Inc., Austin, Tejas) y 40 unidades de Rnasin (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) a la muestra de ARN. La mezcla fue incubada entonces a 37ºC durante 15 a 30 min. Las muestras fueron colocadas sobre hielo y se añadieron 250 \mul de solución amortiguadora RLT* Lysis, y 250 \mul de etanol (prueba 200). Las mezclas fueron mezcladas entonces por inversión. Las muestras fueron transferidas a las columnas de rotación Qiagen RNeasy y centrifugadas a 8.000 x g durante 15 seg y el fluido descartado. Las columnas fueron colocadas en nuevos tubos de recolección de 2 ml y lavadas dos veces con 500 \mul de solución amortiguadora de lavado de RPE* y el fluido descartado. Las columnas fueron transferidas a nuevos tubos eppendorf de 1,5 ml y el ARN fue eluido por medio de la adición de 100 \mul de agua tratada con DEPC, seguido por centrifugación a 8.000 x g durante 15 seg. El ARN residual fue recolectado, añadiendo 50 \mul adicionales de agua libre de RNasa a la columna de rotación, seguido por centrifugación a la velocidad máxima durante 2 min. Se removieron 10 \mul de la preparación de ARN y se cuantificaron por medio del método (A_{260/280}). El ARN fue almacenado a -70ºC. Se encontró que el rendimiento total de ARN fue de 30-100 \mug por cada caldo de fermentación de 2,0 ml.

Ejemplo 11 Protocolo de la Reacción en Cadena de la Polimerasa de la Transcripción Inversa Competitiva Cuantitativa (QC-RT-PCR)

QC-RT-PCR es una técnica utilizada para cuantificar la cantidad de un ARN específico en una muestra de ARN. Esta técnica emplea la síntesis de una molécula específica de ADN que es complementaria de una molécula de ARN en la muestra original, por medio de transcripción inversa y su posterior amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa. Por medio de la adición de diferentes cantidades de una molécula de ARN competidora a la muestra, uno puede determinar la concentración de la molécula de ARN de interés (en este caso los transcritos de ARNm de los genes CYP y CPR). Los niveles de los transcritos específicos de ARNm fueron ensayados todo /el tiempo en respuesta a la adición de los sustratos de ácido graso y/o de alcano al medio de crecimiento de los cultivos en desarrollo de C. tropicalis para la identificación y caracterización de los genes involucrados en la oxidación de esos sustratos. Esta aproximación puede ser utilizada para identificar as los genes CYP y CPR involucrados en la oxidación de cualquier sustrato dado con base en su regulación transcripcional.

A. Diseño del Iniciador

El primer requerimiento para QC-RT-PCR es el diseño de los pares iniciadores que son utilizados en la transcripción inversa y en las reacciones PCR posteriores. Estos iniciadores necesitan ser únicos y específicos para el gen de interés. Ya que existe una familia de genes CYP genéticamente similares presentes en C. tropicales, debe tenerse cuidado para diseñar los pares iniciadores que serían discriminados y solamente amplificar al gen de interés, en este ejemplo el gen CYP52A5. De esta forma, se construyen los iniciadores únicos dirigidos a las regiones sustancialmente no homólogas (variable aka) dentro de los miembros objetivo de una familia de genes. Que constituye regiones sustancialmente no homólogas, se determina en cada caso. Tales iniciadores únicos deben ser suficientemente específicos para aparear la región no homóloga del gen objetivo sin el apareamiento a otros miembros no objetivo de la familia de genes. Comparando las secuencias conocidas de los miembros de una familia de genes, se identifican las regiones no homólogas, y se construyen los iniciadores únicos que se aparearan con esas regiones. Está contemplado que las regiones no homólogas en ésta, típicamente exhibirían una homología menor que alrededor del 85%, pero pueden ser más homólogas dependiendo de las posiciones que se conserven y de las condiciones restrictivas de la reacción. Después de llevar a cabo la PCR, puede ser útil revisar el producto de la reacción para asegurar que representa al producto único del gen objetivo. Si no, las condiciones de reacción pueden alterarse en términos de las condiciones restrictivas para enfocar la reacción al objetivo deseado. Alternativamente, puede escogerse un nuevo iniciador o una nueva región no homóloga. Debido a los altos niveles de homología entre los genes de la familia CYP52A, la región más variable del iniciador 5 de la secuencia de codificación CYP52A5 fue el objetivo para el diseño de los pares iniciadores. En la Figura 3, se muestra una porción de la región de codificación del iniciador 5 para el alelo CYP52A5A (SEQ. ID. No. 36) de C. tropicalis 20336. Las secuencias encajonadas en la Figura 3son las secuencias de los iniciadores hacia delante y hacia atrás (SEQ. ID. Nos. 47 y 48) utilizadas para cuantificar la expresión de ambos alelos de este gen. El iniciador inverso real (SEQ. ID. No. 48) contiene una adenina menos que la mostrada en la Figura 3. Los iniciadores utilizados para medir la expresión de los genes específicos de C. tropicalis 20336 que utilizan el protocolo QC-RT-PCR se enlistan en la Tabla 5 (SEQ. ID. Nos. 37-58).

TABLA 5 Iniciador utilizado para medir la expresión del gen de C. tropicalis en las reacciones QC-RT-PCR

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B. Diseño y Síntesis del Molde del ADN Competidor

El ARN competidor se sintetiza in vitro a partir de un molde de ADN competidor que tiene al promotor de polimerasa T7, y preferiblemente transporta una pequeña supresión de por ejemplo, alrededor de 10 a 25 nucleótidos relativos a la secuencia nativa de ARN objetivo. El molde de ADN para la síntesis in vitro del ARN competidor se sintetiza utilizando iniciadores PCR que se encuentra entre 46 y 60 nucleótidos de longitud. En este ejemplo, los pares iniciadores para la síntesis del ADN competidor de CYP52A5 se muestran en las Tablas 6 y 7 (SEQ ID Nos. 59 y 60).

TABLA 6 Iniciadores hacia adelante y hacia atrás utilizados para sintetizar el molde del ARN competidor para la medición QC-RT-PCR de la expresión del gen CYP52A5A

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TABLA 7 Iniciadores para la síntesis de los moldes de ARN competidor QC-RT-PCR

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El iniciador hacia delante (SEQ. ID. No. 59) contiene la secuencia consenso del promotor T7 "GGATCCTAATACGA CTCACTATAGGG AGG" fusionada a la secuencia 7581-97-F del iniciador (SEQ. ID. No. 47). El Iniciador Inverso (SEQ. ID. No. 60) contiene la secuencia del iniciador 7581-97M (SEQ. ID. No. 48) seguida por las 20 bases secuencia arriba con una supresión par de 18 bases entre los dos bloques de las secuencia de CYP52A5. El iniciador hacia delante fue utilizado con el correspondiente iniciador inverso para sintetizar el molde del ADN competidor. Los pares iniciadores fueron combinados en una reacción PCR Tag Gold polimerasa estándar de acuerdo a las condiciones recomendadas por el fabricante (Perkin Elmer / Applied Biosystems, Foster City, CA). La mezcla de reacción PCR contenía una concentración final de 250 nM de cada iniciador y 10 ng de ADN cromosómico de C. tropicalis para el molde. La mezcla de reacción fue colocada en un termociclador por 25 a 35 ciclos utilizando la temperatura de apareamiento más alta posible durante las reacciones PCR para asegurar un producto PCR homogéneo (en este caso 62ºC). Los productos PCR fueron purificados ya sea por gel o filtrados para remover nucleótidos e iniciadores no incorporados. El ADN del molde competidor fue cuantificado entonces utilizando el método (A_{260/280}). Los iniciadores utilizados en los experimentos QC-RT-PCR para la síntesis de los diferentes moldes de ADN competitivo se enlistan en la Tabla 7 (SEQ. ID. Nos. 61-80).

C. Síntesis del ARN Competidor

El ADN del molde competidor se transcribió in vitro para elaborar el ARN competidor utilizando el juego Megascript T7 de Ambion Biosciences (Ambion Inc., Austin, Tejas). 250 nanogramos (ng) del molde de ADN competidor y los reactivos de transcripción in vitro, se mezclan de acuerdo con las instrucciones suministradas por el fabricante. La mezcla de reacción fue incubada durante 4 horas a 37ºC. Las preparaciones del ARN resultante fueron entonces revisadas por electroforesis sobre gel para establecer las mejores condiciones para obtener el mayor rendimiento y calidad del ARN competidor. Esto requiere a menudo de la optimización de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El molde de ADN fue removido entonces utilizando DNasa I como se describió en el juego Ambion. El competidor ARN fue cuantificado entonces por medio del método (A_{260/280}). Las diluciones seriales del ARN (1 ng/\mul a 1 femtogramo (fg)/\mul) se hicieron para utilizadas en las reacciones QC-RT-PCR y los patrones originales se almacenaron a -70ºC.

D. Reacciones QC-RT-PCR

Las reacciones QC-RT-PCR se realizaron utilizando rTth polimerasa de Perkin Elmer (Perkin Elmer / Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante. La reacción de transcripción inversa fue realizada en un volumen de 10 \mul con una concentración final de 200 \muM para cada dNTP, 1,25 unidades de rTth polimerasa, MnCl_{2} 1,0 mM, 1X de la solución amortiguadora 10X suministrada con la Enzima del fabricante, 100 ng del ARN total aislado de un cultivo de C. tropicalis desarrollado en el fermentador y 1,25 \muM del iniciador inverso apropiado. Para cuantificar la expresión de CYP52A5 en C. tropicalis, un iniciador inverso apropiado fue 7581-97M (SEQ. ID. No 48). Diferentes mezclas de reacción se prepararon para cada muestra de ARN caracterizada. Para cuantificar la expresión de CYP52A5 se tomaron una serie de 8 a 12 alícuotas de las mezclas de reacción QC-RT-PCR previamente descritas en diferentes tubos de reacción. A cada tubo se le añadió 1 \mul de una dilución serial que contenía desde 100 pg hasta 100 fg de ARN competidor de CYP52A5 por \mul, trayendo a las mezclas de reacción final hasta el volumen final de 10 \mul. Las mezclas de reacción QC-RT-PCR fueron mezcladas e incubadas a 70ºC durante 15 min de acuerdo con los tiempos recomendados por el fabricante para que ocurra la transcripción inversa. Al final de los 15 min de incubación, la temperatura de la muestra se redujo hasta 4ºC para detener la reacción y se añadieron 40 \mul de la mezcla de reacción PCR a la reacción para llevar el volumen total hasta 50 \mul. La mezcla de reacción PCR consiste de una solución acuosa que contiene 0, 3125 \muM del iniciador hacía adelante 7581-97F (SEQ. ID. No. 47), MgCl_{2} 3,125 mM y 1X de solución amortiguadora de quelación suministrada con la enzima de Perkin Elmer. Las mezclas de reacción fueron colocadas en un termociclador (Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400, Perkin Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA) y el siguiente ciclo PCR realizado: 94ºC durante 1 min, seguido por 94ºC durante 10 segundos seguido por 58ºC durante 40 segundos por 17 a 22 ciclos. La reacción PCR fue completada con una incubación final a 58ºC durante 2 min seguido por 4ºC. En algunas reacciones donde se produjeron productos PCR no detectables, las muestras fueron regresadas al termociclador para ciclos adicionales. Este proceso fue repetido hasta que se produjeron suficientes productos PCR para cuantificación utilizando HPLC. El número de ciclos necesarios para producir suficiente producto PCR es una función de la cantidad del ARNm objetivo en los 100 ng de ARN celular total. En los cultivos donde el gen CYP52A5 se expresa grandemente, hay suficiente mensaje presente de ARNm de CYP52A5 y se requieren menos ciclos PCR (\leq 17) para producir una cantidad cuantificable de producto PCR. Entre menores sean las concentraciones del ARNm objetivo presentes, más ciclos PCR se requieren para producir una cantidad detectable de producto. Estos procedimientos QC-RT-PCR fueron aplicados a todos los genes objetivo enlistados en la Tabla 5, utilizando los iniciadores respectivos indicados allí.

E. Cuantificación por HPLC

Después de completadas las reacciones QC-RT-PCR, las muestras fueron analizadas y cuantificadas por HPLC. Entre cinco y quince microlitros de la mezcla de reacción fueron inyectados en un HPLC 625 Bio-Compatible de Waters que tiene acoplado un detector sintonizable Waters 484. El detector fue programado para medir una longitud de onda de 254 nm. El HPLC contenía una columna marca Sarasep DNASep^{TM} (Sarasep, Inc., San José, CA) que fue colocada dentro del horno con una temperatura programada de 52ºC. la columna fue instalada de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, con 30 cm de tubería PEEK calentada, instalada entre el inyector y la columna. El sistema fue configurado con un guarda columna marca Sarasep ubicado antes del inyector. Además, había un filtro de disco de 0,22 \mum justo antes de la columna, dentro del horno. Se utilizaron dos soluciones amortiguadoras para crear un gradiente de elusión para resolver y cuantificar los productos PCR de las reacciones QC-RT-PCR. La solución amortiguadora A consta de acetato de trietilamonio (TEAA) 0,1 M y 5% de acetonitrilo (volumen a volumen). La solución amortiguadora B consta de TEAA 0,1 M y 25% de acetonitrilo (volumen a volumen). Las muestras QC-RT-PCR fueron inyectadas dentro del HPLC y se corrió el gradiente lineal de 75% de solución amortiguadora A / 25% de solución amortiguadora B hasta 45% de solución amortiguadora A / 55% de solución amortiguadora B durante 6 min a una velocidad de flujo de 0,85 ml por minuto. El producto QC-RT-PCR del ARN competidor 18 pares de base más pequeño, eluyó de la columna de HPLC antes que el producto QC-RT-PCR del ARNm de CYP52A5 (U). La cantidad de los productos QC-RT-PCR se grafica y se cuantifica con un módulo de datos acoplado 745 de Waters Corporation. La relación logarítmica de la cantidad de producto QC-RT-PCR ARNm de CYP52A5 (U) con respecto a la cantidad de producto QC-RT-PCR del competidor (C), medida por medio de las áreas de los picos, se graficó, y se determinó la cantidad de ARN competidor requerida para igualar a la cantidad de producto ARNm de CYP52A5. En el caso de cada uno de los genes objetivo enlistados en la Tabla 5, el ARN competidor contenía menos pares de bases en comparación con el ARNm objetivo nativo y eluyó antes del ARNm nativo en forma similar a aquella demostrada por CYP52A5. la cuantificación de los genes por HPLC se realizó como se indicó arriba.

Ejemplo 12 Evaluación de Nuevas Cepas en Frascos de Agitación

Las cepas amplificadas de CYP y CPR tales como las cepas HDC10, HDC15, HDC20 y HDC23 (Tabla1) y H5343, fueron evaluadas para la producción de diácido en frascos de agitación. Una colonia individual de cada cepa fue transferida desde una placa de agar YDP a 5 ml de un caldo YDP y se desarrollo durante la noche a 30ºC, 250 rpm. Un inóculo fue transferido entonces dentro de 50 ml de medio DCA2 (Carta) y se desarrollo durante 24 horas a 30ºC, 300 rpm. Las células fueron centrifugadas a 5000 rpm durante 5 min y resuspendidas en 50 ml de medio DCA3 (Carta) y se desarrollaron durante 24 horas a 30ºC, 300 rpm. Se añadió 3% de ácido oleico p/v después de 24 horas de desarrollo en medio DCA3, y a los cultivos se les permitió bioconvertir ácido oleico durante 48 horas. Las muestras fueron cosechadas y fueron analizadas las concentraciones de diácido y de monoácido como en el esquema dado en la Figura 35. Cada cepa fue analizada por duplicado, y los resultados mostrados en la Tabla 8 representan el valor promedio de los dos frascos.

TABLA 8

Bioconversión de ácido oleico por diferentes cepas recombinantes de Candida tropicalis
Cepa	Conversión de diácido Oleico (%)	Conversión Específica (g diácido/g biomasa)
H5343	41,9	0,53
HDC 10-2	50,5	0,85
HDC 15	54,4	0,85
HDC 20-1	45,1	0,72
HDC 20-2	45,3	0,58
HDC 23-2	55,2	0,84
HDC 23-3	58,8	0,89

Ejemplo 13 Clonación y Caracterización de los Genes de la Monooxigenasa del Citocromo P450 de C. tropicalis 20336 (CYP) y de la NADPH Oxidoreductasa del Citocromo P450 (CPR)

Para clonar a los genes CYP y CPR se emplearon varias estrategias diferentes. Se alinealon las secuencias disponibles de los aminoácidos de CYP y se observaron las regiones de similitud (Figura 4). Esas regiones corresponden a las regiones conservadas descritas vistas en otras familias de citocromo P450 (Goeptar y colaboradores, supra y Kalb y colaboradores, supra). Las proteínas de ocho familias de citocromos P450 de eucariotas, comparten una región segmentada con similitud de frecuencia. Una región correspondió al dominio HR2 que contiene al residuo de cisteína invariante cerca del carboxilo terminal que se requiere para la unión del heme, mientras que la otra región correspondió a la región central de la hélice I se pensó que estaba involucrada en el reconocimiento del sustrato (Figura 4). Se diseñaron iniciadores oligonucleótidos degenerados correspondientes a aquellas regiones altamente conservadas de la familia del gen CYP52 presente en Candida maltosa y en Candida tropicalis ATCC 750, y se utilizaron para amplificar los fragmentos de ADN de los genes CYP del ADN genómico de C. tropicalis 20336. Estos fragmentos PCR discretos fueron utilizados entonces como sondas para aislar los genes CYP en toda su longitud a partir de las bibliotecas genómicas de C. tropicalis 20336. En pocos casos, los iniciadores oligonucleótidos correspondientes a regiones altamente conservadas, fueron directamente utilizados como sondas para aislar las bibliotecas genómicas de genes CYP de longitud completa. En el caso de CPR, se utilizó una sonda heteróloga basada en la secuencia conocida de ADN para el gen CPR de C. tropicalis 750, para aislar al gen CPR de C. tropicalis 20336.

A. Clonación del Gen CPR de C. tropicalis 20336 1) Clonación del Alelo CPRA

Aproximadamente, 25.000 partículas de fago de la primera biblioteca genómica de C. tropicalis 20336 fueron muestreadas con un fragmento BamHI-Ndel de 1,9 kb del plásmido pCU3RED (Ver Picattagio y colaboradores, Bio/Technology 10:894-898 (1992), incorporado aquí como referencia) que contiene la mayoría del gen CPR de C. tropicalis 750. Cinco clones que hibridaron a la sonda fueron aislados, y el ADN del plásmido de estos clones lambda, fue rescatado y caracterizado por análisis de la enzima de restricción. El análisis de la enzima de restricción sugirió que todos los cinco clones eran idénticos, pero no fue claro que un gen CPR completo estuviera presente.

El análisis PCR fue utilizado para determinar si un gen completo CPR estaba presente en cualquiera de los cinco clones. Se prepararon iniciadores degenerados para regiones altamente conservadas de genes CPR conocidos (Ver Sutter y colaboradores, J. Biol. Chem. 265:16428-16436 (1990), (Figura 4). Dos iniciadores fueron sintetizados para la región de unión FMN (FMN1, SEQ. ID. No. 16 y FMN2, SEQ. ID. No 17). Un iniciador fue sintetizado para la región de unión FAD (FAD, SEQ. ID. No 18), y un iniciador para la región de unión NADPH (NADPH, SEQ. ID. No 19) (Tabla 4). Estos cuatro iniciadores fueron utilizados en experimentos de amplificación PCR utilizando como molde un plásmido aislado de ADN de cuatro de los cinco clones descritos arriba. Los iniciadores FMN (SEQ. ID. Nos. 16 y 17) y FAD (SEQ. ID. No. 18) sirvieron como iniciadores hacia delante y el iniciador NADPH (SEQ. ID. No. 19) como el iniciador inverso en las reacciones PCR. Cuando se utilizaron diferentes combinaciones de iniciadores hacia adelante e inversos, no se obtuvieron productos PCR de ninguno de los plásmidos. Sin embargo, todas las combinaciones de iniciadores de los productos amplificados del tamaño esperado con un plásmido, contenían al gen CPR de C. tropicalis 750 (control positivo). La razón más probable para la falla de los pares iniciadores para amplificar un producto fue que todos los cuatro clones contenían un gen CPR truncado. Uno de los cuatro clones (pHKM1) fue secuenciado utilizando a los iniciadores Triplex 5' (SEQ ID NO. 30) y Triplex 3' (SEQ. ID. No 31) (Tabal 4) que flanquean al inserto y al sitio de clonación múltiple sobre el vector de clonación, y con el iniciador degenerado basado en el sitio de unión NADPH descrito arriba. El iniciador NADPH (SEQ ID NO. 19) fallo en producir datos de secuencia, y esto es consistente con el análisis PCR. Las secuencias obtenidas con los iniciadores Triplex fueron comparadas con la secuencia CPR de C. tropicalis 750 utilizando el programa MacVector^{TM} (Oxford Molecular Group, Campbell, CA). La secuencia obtenida con el iniciador Triplex 3' (SEQ ID NO. 31) mostró similitud con una secuencia interna del gen CPR de C. tropicalis 750, confirmando que pHKM1 contenía la versión truncada del gen CPR 20336. pHKM1 tenía un inserto de 3,8 kb que incluía una región de codificación de 1,2 kb del gen CPR, acompañada por un ADN secuencia arriba de 2,5 kb (Figura 5). Aproximadamente 0,85 kb del gen CPR 20336 que codifican la porción C-terminal de la proteína CPR está perdida de este clon.

Ya que la primera biblioteca Clontech solamente produjo un gen CPR truncado, se muestreó la segunda biblioteca preparada por Clontech para aislar un gen CPR de longitud completa. Se obtuvieron tres clones CPR putativos. Los tres clones, con insertos en el rango de 5-7 kb, fueron denominados pHKM2, pHKM3 y pHKM4. Los tres fueron caracterizados por CPR utilizando los iniciadores degenerados descritos arriba. Tanto pHKM2 como pHKM4 dieron productos PCR con dos juegos de iniciadores internos. pHKM3 dio un producto PCR solamente con los iniciadores FAD (SEQ. ID. No 18) y NADPH (SEQ. ID. No 19) sugiriendo que este clon probablemente contenía un gen CPR truncado. Los tres plásmidos fueron parcialmente secuenciados utilizando los dos iniciadores Triplex y un tercer iniciador cuya secuencia se seleccionó de la secuencia ADN cercana al extremo truncado del gen CPR presente en pHKM1. Este análisis confirmó que tanto pHKM2 como pHKM4 tienen secuencias que se sobreponen a pHKM1 y que ambos contenían la región 3' del gen CPR que esta perdido de pHKM1. Se secuenciaron las porciones de inserto de pHKM1 y pHKM4, y se identificó al gen CPR de longitud completa. Con base en la secuencia de ADN y al análisis PCR, se concluyó que pHKM1 contenía la región promotora putativa y que 1,2 kb de secuencia codifican una porción (extremo 5') de un gen CPR. PHKM4 tenía 1,1 kb de ADN que se sobreponía a pHKM1 y contenía al resto (extremo 3') de un gen CPR junto con una región no traducida secuencia abajo (Figura 6). Simultáneamente, estos dos plásmidos contenían un gen CPRA completo con una región promotora secuencia arriba. CPRA tiene 4206 nucleótidos de longitud (SEQ. ID. No 81) e incluye una región reguladora y una región de codificación de proteína (definida por los nucleótidos 1006-3042) que corresponde a 2037 pares de bases de longitud y codifica a una proteína putativa de 679 aminoácidos (SEQ. ID. No 83) (Figuras 13 y 14). En la Figura 13, los asteriscos denotan nucleótidos conservados entre CPRA y CPRB, la negrilla denota nucleótidos que codifican proteína y los codones de inicio y detención se encuentran subrayados. Cuando se analizó a la proteína CPRA por medio del programa de alineación de proteínas del paquete de software GeneWorks^{TM} (Oxford Molecular Group, Campbell, CA) mostró una homología extensiva con las proteínas CPR de C. tropicalis 750 y C. maltosa.

2) Clonación del Alelo CPRB

Para clonar el segundo alelo CPRB, la tercera biblioteca genómica, preparada por Henkel, fue muestreada usando fragmentos de ADN de las sondas pHKM1 y pHKM4. Se obtuvieron cinco clones y estos fueron secuenciados con los tres iniciadores internos utilizados para secuenciar CPRA. Estos iniciadores fueron designados como PRK1.F3 (SEQ. ID. No. 20), PRK1.F5 (SEQ. ID. No. 21) y PRK4.R20 (SEQ. ID. No. 22) (Tabla 4) y los dos iniciadores externos (M13-20 y T3 [Stratagene]) para la región del poliligador presente en el vector de clonación pBK-CMV. El análisis de la secuencia sugirió que cuatro de estos clones, designados como pHKM5 hasta 8, contenían insertos que eran idénticos a los del alelo CPRA aislado antes. Todos los cuatro parecieron contener un gen CPR de longitud completa. El quinto clon era muy similar al alelo CPRA, especialmente en la región de estructura de lectura abierta, donde la identidad era muy alta. Sin embargo, habían diferencias significativas en las regiones no traducidas 5' y 3'. Esto sugirió que el quinto clon era el alelo de CPRA. El plásmido fue designado como pHKM9 (Figura 7) y una región de 4,14 kb de este plásmido fue secuenciada, y el análisis de esta secuencia confirmó la presencia del alelo CPRB (SEQ. ID. No. 82) el cual incluye una región reguladora y una región de codificación de proteína (definida por los nucleótidos 1033-3069) (Figura 13). La secuencia de aminoácidos de la proteína CPRB se expone en la SEQ. ID. No. 84 (Figura
14).

B. Clonación de los Genes (CYP) de C. tropicalis 20336 1) Clonación de CYP52A2A, CYP52A3A & 3B y CYP52A5A & 5B

Los clones que portan a los genes CYP52A2A, A3A, A3B, A5A y A5B fueron aislados de la primera y segunda bibliotecas genómicas de Clontech utilizando una sonda oligonucleotídica (HemeB1, SEQ. ID. No. 27) cuya secuencia se basaba en la secuencia de aminoácidos para la región de unión heme altamente conservada presente en toda la familia CYP52. La primera y segunda bibliotecas fueron convertida a la forma plásmido y muestreada por hibridaciones de colonia utilizando la sonda HemeB1 (SEQ. ID. No. 27) (Tabla 4). Varios clones potenciales fueron aislados y se aisló el ADN del plásmido de estos clones y se secuenció utilizando al oligonucleótido HemeB1 (SEQ. ID. No. 27) como iniciador. Esta aproximación fue exitosa para la identificación de los cinco genes CYP52. Tres de los genes CYP parecieron únicos, mientras que los dos restantes se clasificaron como alelos. Con base en una escogencia arbitraria de homología de los genes CYP52 de Candida maltosa, estos cinco genes y los plásmidos correspondientes fueron designados como CYP52A2A (pPA15 [Figura 26 ]), CYP52A3A (pPA57 [Figura 29 ]), CYP52A3B (pPA62 [Figura 30 ]), CYP52A5A (pPAl3 [Figura 31 ]), y CYP52A5B (pPA5 [Figura 32 ]). Se obtuvo la secuencia completa de ADN incluidas las regiones de codificación, reguladora y de proteína de esos cinco genes, y confirmo que todos los cinco eran genes CYP52 (Figura 15). En la Figura 15, los asteriscos denotan a los nucleótidos conservados entre los genes CYP. La negrilla indica a los nucleótidos que codifican proteína de los genes CYP, y los codones de inicio y de detención están subrayados. El gen CYP52A2A representado por la SEQ. ID. No 86 tiene una región de codificación de proteína definida por los nucleótidos 1199-2767, y la proteína codificada tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ. ID. No 96. El gen CYP52A3A representado por la SEQ. ID. No 88 tiene una región de codificación de proteína definida por los nucleótidos 1126-2748, y la proteína codificada tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ. ID. No 98. El gen CYP52A3B representado por la SEQ. ID. No 89 tiene una codificación de proteína definida por los nucleótidos 913-2535, y la proteína codificada tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ. ID. No 99. El gen CYP52A5A representado por la SEQ. ID. No 90 tiene una región de codificación de proteína definida por los nucleótidos 1103-2656, y la proteína codificada tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ. ID. No 100. El gen CYP52A5B representado por la SEQ. ID. No 91 tiene una región de codificación de proteína definida por los nucleótidos 1142-2695, y la proteína codificada tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ. ID. No
101.

2) Clonación de CYP52A1A y CYP52A8A

Los genes CYP52A1A y CYP52A8A fueron aislados de la tercera biblioteca genómica utilizando los fragmentos PCR como sondas. La sonda del fragmento PCR para CYP52A1 se generó después de la amplificación por PCR del ADN genómico de 20336 con iniciadores oligonucleótidos que fueron diseñados para amplificar una región desde la región Helix I hasta la región HR2 utilizando todos los genes CYP52 disponibles en la National Center for Biotechnology Information. Los iniciadores degenerados hacia delante UCup1 (SEQ. ID. No 23) y UCup2 (SEQ. ID. No 24) fueron diseñados con base en una secuencia de aminoácidos (-RDTTAG-) de la región Helix I (Tabla 4). Los iniciadores degenerados UCdown1 (SEQ. ID. No 25) y UCdown2 (SEQ. ID. No 26) fueron diseñados con base en la secuencia de aminoácidos (-GQQFAL-) de la región HR2 (Tabla 4). Para los iniciadores inversos, la secuencia de ADN representa al complemento inverso de la correspondiente secuencia de aminoácidos. Estos iniciadores fueron utilizados en combinaciones relacionadas con los pares en una reacción PCR con Stoffel Taq ADN polimerasa (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante. Se obtuvo un producto PCR de aproximadamente 450 bp. Este producto fue purificado a partir de gel de agorosa utilizando Gene-clean^{TM} (Bio 101, La Jolla, CA) y ligado al vector pTAG^{TM} (Figura 17) (R&D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. No fue necesario un tratamiento para clonar dentro de pTAG ya que se acostumbra el uso de la técnica de clonación TA. Se aislaron los plásmidos de diferentes transformantes y se caracterizaron sus insertos. Un plásmido contenía al clon PCR intacto. La secuencia de ADN del fragmento PCR (designada como 44CYP3, SEQ. ID. No 107) compartió homología con las secuencias de ADN para el gen CYP 52A1 de C. maltosa y el gen CYP52A3 de C. tropicalis 750. Este fragmento fue utilizado como sonda en el aislamiento del homologo de CYP52A1 de C. tropicalis 20336. La tercera biblioteca genómica fue muestreada utilizando la sonda PCR 44CYP3 (SEQ. ID. No 107) y se obtuvo un clon (pHKM11) que contenía un gen CYP52 de longitud completa (Figura 8). El clon contenía un gen con regiones de codificación, reguladora y de proteína. Una estructura de lectura abierta de 1572 nucleótidos codificó una proteína CYP52 de 523 aminoácidos (Figuras 15 y 16). Este gen CYP52 fue designado como CYP52A1A (SEQ. ID. No 85) ya que su secuencia putativa de aminoácidos (SEQ. ID. No 95) era la más similar a la proteína CYP52A1 de C. maltosa. La región de codificación de proteína del gen CYP52A1A se define por los nucleótidos 1177-2748 de la SEQ. ID. No 85.

Se procedió en forma similar para clonar a CYP52A8A. Se generó una sonda del fragmento de PCR para CYP52A8 utilizando iniciadores para las secuencias altamente conservadas de los genes CYP52A3, CYP52A2 y CYP52A5 de C. tropicalis 750. El iniciador inverso (iniciador 2, 3, 5, M) (SEQ. ID. No 29) fue diseñado con base en la región de unión heme altamente conservada (Tabla 4). El diseño del iniciador hacia adelante (iniciador 2, 3, 5, P) (SEQ. ID. No 28) se basó en una secuencia conservada cercana al N-terminal de los genes CYP52A3, CYP52A2 y CYP52A5 e C. tropicalis 750 (Tabla 4). La amplificación del ADN genómico de 20336 con estos dos iniciadores produjo un producto PCR mezclado. Un fragmento PCR amplificado fue de 1006 bp de longitud (designado como DCA 1002). Se determinó la secuencia de ADN para este fragmento y se encontró que tiene un 85% de identidad con la secuencia de ADN para el gen CYP52D4 de C. tropicalis 750. Cuando este producto PCR fue utilizado para muestrear la tercera biblioteca genómica, se identifico un clon (pHKM12 que contenía un gen CYP52 de longitud completa junto con secuencias flanqueantes 5' y 3' (Figura 9). El gen CYP52 incluyó regiones de codificación, reguladora y de proteína con una estructura de lectura abierta de 1539 nucleótidos de longitud que codificó a una proteína putativa CYP52 de 512 aminoácidos (Figuras 15 y 16). Este gen fue designado como CYP52A8A (SEQ. ID. No 92) ya que su secuencia de aminoácidos (SEQ. ID. No 102) era la más similar a la proteína CYP52A8 de C. maltosa. La región de codificación de la proteína del gen CYP52A8A se define por los nucleótidos 464-2002 de la SEQ. ID. No 92. La secuencia de aminoácidos de la proteína CYP52A8A se expone en la SEQ. ID. No 102.

3) Clonación de CYP52D4A

El muestreo de la segunda biblioteca genómica con el iniciador HemeB1 (SEQ. ID. No 27) (Tabla 4) produjo un clon que porta un plásmido (pPA18) que contenía un gen truncado que tiene homología con el gen CYP52D4 de C. maltosa (Figura 33). Se aisló un fragmento de 1,3 a 1,5 kb de EcoRI-SstI de pPA18 que contenía parte del gen CYP truncado y se lo utilizó como una sonda para hacer un muestreo de la tercera biblioteca genómica para un gen CYP52 de longitud completa. Se aisló un clon (pHKM13) y se encontró que contenía un gen CYP de longitud completa con secuencias flanqueantes extensivas 5' y 3' (Figura 10). Este gen ha sido designado como CYP52D4A (SEQ. ID. No 94) y el ADN completo que incluye las regiones de codificación, reguladora y de proteína (región de codificación definida por los nucleótidos 767-2266) y la secuencia putativa de aminoácidos (SEQ. ID. No 104) de este gen se muestra en las Figuras 15 y 16. CYP52D4A (SEQ. ID. No 94) comparte la homología más grande con el gen CYP52D4 de C. Maltosa.

4) Clonación de CYP52A2B y CYP52A8B

Se utilizó una sonda mezclada que contenía los genes CYP52A1A, A2A, A3A, D4A, A5A y A8A para hacer muestreo de la tercera biblioteca genómica y se identificaron diferentes clones putativos positivos. Siete de estos que se secuenciaron con los iniciadores degenerados Cyp52a (SEQ. ID. No 32), Cyp52b (SEQ. ID. No 33), Cyp52c (SEQ. ID. No 34) y Cyp52d (SEQ. ID. No 35) se muestran en la Tabla 4. Estos iniciadores fueron diseñados a partir de las regiones altamente conservadas de las cuatro subfamilias de CYP52, principalmente CYP52A, B, C & D. Las secuencias de dos de los clones, pHKM14 y pHKM15 (Figuras 11 y 12), compartieron una homología considerable con la secuencia de ADN de los genes C. tropicalis 20336 CYP52A2 y CYP52A8, respectivamente. El ADN completo (SEQ. ID. No 87) que incluye regiones de codificación, reguladora y de proteína (región de codificación definida por los nucleótidos 1072-2640) y la secuencia putativa de aminoácidos (SEQ. ID. No 97) del gen CYP52 presente en pHKM14 sugirió que se trata de CYP52A2B (Figuras 15 y 16). El ADN completo (SEQ. ID. No 83) que incluye regiones de codificación, reguladora y de proteína (región de codificación definida por los nucleótidos 1017-2555) y la secuencia putativa de aminoácidos (SEQ. ID. No 103) del gen CYP52 presente en pHKM15 sugirió que se trata de CYP52A8B (Figuras 15 y 16).

Ejemplo 14 Identificación de los Genes CYP y CPR Inducidos por Sustratos Seleccionados de Ácido Graso y Alcano

Los genes cuya transcripción se activó por la presencia de sustratos seleccionados de ácidos grasos o alcanos, han sido identificados utilizando el análisis QC-RT-PCR. Este ensayo fue utilizado para medir la expresión génica (CYP) y (CPR) en los cultivo en desarrollo dentro del fermentador, de C. tropicalis ATCC 20962. Este método incluye el aislamiento de ARN celular total de cultivos de C. tropicalis y la cuantificación de un ARNm específico dentro de esa muestra, a través del diseño y el uso de la secuencia específica de los iniciadores QC-RT-PCR y de un competidor ARN. La cuantificación se logra por medio del uso de concentraciones conocidas del ARN competidor altamente homologo en las reacciones QC-RT-PCR. Los ADNc amplificados QC-RT-PCR resultantes se separan y cuantifican por medio del uso de HPLC en fase reversa de apareamiento iónico. Este ensayo fue utilizado para caracterizar la expresión de los genes CYP52 de C. tropicalis ATCC 20962 en respuesta a varios sustratos de ácido graso y alcano. Los iones que fueron inducidos, fueron identificados por medio del calculo de su concentración de ARNm a diferentes tiempos, antes y después de la inducción. La Figura 18 provee un ejemplo de cómo puede calcularse la concentración de ARNm para CYP52A5 utilizando el ensayo QC-RT-PCR. Se grafica la relación logarítmica del (U) desconocido con respeto al producto competidor (C) versus la concentración del ARN competidor presente en las reacciones QC-RT-PCR. La concentración de competidor que resulta en una relación logarítmica de U/C de cero, representa el punto en donde la concentración desconocida de ARNm es igual a la concentración del competidor. La Figura 18 permite el cálculo de la cantidad de mensaje CYP52A5 presente en 100 ng de ARN total aislado de las muestras de células tomadas 0, 1 y 2 horas después de la adición de Emersol® 267 en una corrida del fermentador. A partir de este análisis, es posible determinar la concentración del ARNm de CYP52A5 presente en 100 ng de ARN celular total. En la gráfica contenida en la Figura 18, se toman 0,46 pg de competidor para igualar el número de ARNm de CYP52A5 en 100 ng de ARN aislado de células, justo antes (tiempo 0) de la adición del sustrato, Emersol® 267. En muestras de células tomadas una y dos horas después de la adición de Emersol® 267, se toman 5,5 y 8,5 pg de ARN competidor, respectivamente. Este resultado demuestra que CYP52A5 (SEQ. ID Nos. 90 y 91) se induce más de 18 veces dentro de las dos horas posteriores a la adición de Emersol® 267. Este tipo de análisis fue utilizado para demostrar que CYP52A5 (SEQ. ID Nos. 90 y 91) es inducido por Emersol® 267. La Figura 19 muestra que las cantidades relativas de expresión de CYP52A5 (SEQ. ID. Nos. 90 y 91) en la corrida de un fermentador, con o sin Emersol® 267 como sustrato. Las diferencias en los patrones de expresión de CYR52A5 (SEQ. ID. Nos. 90 y 91) son debidas a la adición de Emersol® 267 al medio de fermen-
tación.

Este análisis demuestra claramente que la expresión de CYR52A5 (SEQ. ID. Nos. 90 y 91) en C. tropicalis 20962 puede inducirse por medio de la adición de Emersol® 267 al medio de crecimiento. Este análisis fue realizado para caracterizar la expresión de CYR52A2A (SEQ. ID. No. 86), CYR52A3AB (SEQ. ID. Nos. 88 y 89), CYR52A8A (SEQ. ID. No. 92), CYR52A1A (SEQ. ID. No. 85), CYR52D4A (SEQ. ID. No. 94) y CPRB (SEQ. ID. No. 82) en respuesta a la presencia de Emersol® 267 en el medio de fermentación (Figura 20). Los resultados de estos análisis indican que así como el gen CYP52A5 (SEQ. ID. Nos. 90 y 91) de C. tropicalis 20962, el gen CYR52A2A (SEQ. ID. Nos. 86) puede ser inducido por medio de Emersol® 267: SE observa una pequeña inducción por CYR52A1A (SEQ. ID. No. 85) y para CYR52A8A (SEQ. ID. No. 92). En contraste, cualquier inducción para CYR52D4A (SEQ. ID. No. 94), CYR52A3A (SEQ. ID. No. 88), CYR52A3B (SEQ. ID. No. 89) esta por debajo del nivel de detección del ensayo. CPRB (SEQ. ID. No. 82) es moderadamente inducido por Emersol® 267, cuatro a cinco veces. Los resultados de estos análisis se resumen en la Figura 20. La Figura 34 provee un ejemplo de inducción selectiva de los genes CYP52A. Cuando ácidos grasos o alcanos puros son metidos dentro de un fermentador que contiene C. tropicalis 20962 o un derivado del mismo se detecta la activación transcripcional de los genes CYP52A, utilizando el ensayo QC-RT-PCR. La Figura 34 muestra que el ácido oleico puro (C 18:1) induce fuertemente al CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86), mientras que induce al CYP52A5 (SEQ. ID. Nos. 90 y 91). En el mismo fermentador, la adición de alcano puro (tridecano) muestra una fuerte inducción tanto de CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86) como de al CYP52A1A (SEQ. ID. No. 85). Sin embargo, el tridecano no indujo al CYR52A5 (SEQ. ID. Nos. 90 y 91). En una fermentación separada utilizando ATCC 20962, que contiene octadecano puro como sustrato, se detecta la inducción de CYR52A2A, CYR52A5A y CYR52A1A (ver Figura 36). Lo anterior demuestra la inducción selectiva de los genes particulares CYP por medio de sustratos específicos, proveyendo así técnicas para la ingeniería metabólica selectiva de cepas de células. Por ejemplo, si se desea la modificación del tridecano, los organismos modificados por ingeniería genética para altos niveles de actividad CYR52A2A (SEQ. ID. No. 86) y de CYR52A1A (SEQ. ID. No. 85) son los indicados. Si se desea la modificación del ácido oleico, el organismo modificado por ingeniería genética para altos niveles de actividad CYR52A2A (SEQ. ID. No. 86) es el indicado.

Ejemplo 15 Integración de los Genes Seleccionados CYP y CPR dentro del Genoma de Candida tropicalis

Con miras a integrar los genes seleccionados dentro del cromosoma de C. tropicalis 20336 o sus descendientes, debe haber una secuencia ADN objetivo, que puede o no ser un gen intacto, dentro del cual se pueden insertar los genes. Puede haber también un método para seleccionar el evento de integración. En algunos casos, la secuencia de ADN objetivo y el marcador seleccionable son el mismo y, si es así, debe haber entonces también un método para recuperar el uso del gen objetivo como un marcador seleccionable después del evento de integración. En C. tropicalis y sus descendientes, un gen que reúne estos criterios es URA3A, que codifica a la ortotidina-5'fosfato descarboxilasa. Utilizando éste como un objetivo para integración, las variantes ura^{-} de C. tropicalis pueden ser transformadas de tal forma que regeneren un genotipo URA^{+} por medio de recombinación homologa (Figura 21). Dependiendo del diseño del vector de integración, puede integrarse uno o más genes dentro del genoma al mismo tiempo. Utilizando un gen discontinuo URA3A orientado como se muestra en la Figura 22, una integración homologa produciría al menos una copia del(los) gen(es) de interés que están insertados entre las porciones discontinuas del gen URA3A. Además, debido a la gran similitud de secuencia entre los genes URA3A y URA3B la integración de la construcción puede ocurrir tanto para los loci URA3A como URA3B. Posteriormente, un oligonucleótido diseñado con una supresión en una porción del gen URA basado en la secuencia idéntica a través, tanto del gen URA3A como del gen URA3B, puede ser utilizado para producir transformantes de C. tropicalis que son una vez más ura^{-} pero que aún portan uno o más genes de escogencia recientemente integrados (Figura 21). Las variantes ura^{-} de C. tropicalis pueden aislarse también por medio de otros métodos tales como mutagénesis clásica o por medio de mutación espontánea. Utilizando protocolos bien establecidos, la selección de cepas ura^{-} puede facilitarse por medio del uso de ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) como se describe, por ejemplo, en Boeke y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 197:345-346, (1984) incorporado aquí como referencia. La utilidad de esta aproximación para la manipulación de C. tropicalis ha sido bien documentada como se describe, por ejemplo, en Picataggio y colaboradores, Mol.and Cell. Biol. 11:4333-4339 (1991); Rohrer y colaboradores, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:650-654 (1992); Picataggio y colaboradores, Biol. Technology 10:894-898 (1992); Patente US No. 5.648.247; Patente US No. 5.620.878; Patente US No. 5.204.252; Patente US No. 5.254.466, las cuales se incorporan aquí como refe-
rencia.

A. Construcción de un Vector de Integración URA, pURAin

Los iniciadores fueron diseñados y sintetizados con base en la secuencia de 1712 bp del gen URA3A de C. tropicalis 20336 (ver Figura 23). La secuencia nucleótida del gen URA3A de C. tropicalis 20336 se expone en la SEQ. ID. No. 105 y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada se expone en la SEQ. ID. No. 106. Se utilizó un iniciador URA3A Juego # 1a (SEQ. ID. No. 9) y # 1b (SEQ. ID. No. 10) (Tabla 4) en PCR con el ADN genómico de C. tropicalis 20336 para amplificar las secuencias de URA3A entre los nucleótidos 733 y 1688 como se muestra en la Figura 23. Los iniciadores se diseñan para introducir sitios de restricción únicos 5' AscI y 3' PacI dentro del fragmento URA3A amplificado. Los sitios AscI y PacI fueron escogidos ya que éstos no están presentes dentro de los genes CYP o CPR identificados hasta la fecha. Se utilizó un iniciador URA3A Juego # 2 en PCR con el ADN genómico de C. tropicalis 20336 como molde, para amplificar las secuencias de URA3A entre el nucleótido 9 y 758 como se muestra en la Figura 23. Se diseñó un iniciador URA3A Juego # 2a (SEQ. ID. No.11) y # 2b (SEQ. ID. No. 12) (Tabla 4) para introducir sitios de restricción únicos 5' PacI y 3' PmeI dentro del fragmento URA3A amplificado resultante. El sitio PmeI no está presente tampoco dentro de los genes CYP y CPR identificados hasta la fecha. Los fragmentos PCR del gen URA3A se purificaron, restringidos con las enzimas de restricción AscI, PacI y PmeI y ligados a un gel purificado, QiaexII limpiado AscI-PmeI digestión del plásmido pNEB193 (Figura 25) enviados desde New England Biolabs (Beverly, MA). La ligación se realizó con un número equimolar de terminales de ADN a 16ºC durante 16 horas, utilizando T4 ADN ligasa (New England Biolabs). Las ligaciones se transformaron dentro de las células E. coliXLl-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las colonias blancas se aislaron, se desarrollaron aisladas del ADN del plásmido y se digirieron con AscI-PmeI para confirmar la inserción del URA3A modificado dentro de pNEB193. El vector de integración base resultante fue llamado pURAin (Figura 24).

B. Amplificación de CYP52A2A, CYP52A3A, CYP52A5A y CPRB del ADN Genómico de C. tropicalis 20336

Se amplificaron los genes que codifican CYP52A2A, (SEQ. ID. No. 86) y CYP52A3A (SEQ. ID. No. 88) de C. tropicalis 20336 a partir de los clones genómicos (pPA15 y pPA57, respectivamente) (Figuras 26 y 29) por medio de PCR utilizando iniciadores (Iniciador CYP 2A#1, SEQ. ID. No. 1 e Iniciador CYP 2A#2, SEQ. ID. No. 2 para CYP52A2A) (Iniciador CYP 3A#1, SEQ. ID. No. 3 e Iniciador CYP 3A#2, SEQ. ID. No. 4 para CYP52A3A) para introducir sitios de clonación PacI. Estos iniciadores PCR fueron diseñados con base en la secuencia de ADN determinada para CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86) (Figura 15). El juego AmpliTaq Gold PCR (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) fue utilizado de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. El producto de amplificación PCR CYP52A2A era de 2230 pares de bases de longitud produciendo 496 bp de ADN secuencia arriba del codón de inicio de CYP52A2A y 168 bp secuencia abajo del codón de detención para el CYP52A2A ORF. El producto de amplificación PCR CYP52A3A era de 2154 pares de bases de longitud produciendo 437 bp de ADN secuencia arriba del codón de inicio de CYP52A3A y 97 bp secuencia abajo del codón de detención para el CYP52A3A ORF. El producto de amplificación PCR CYP52A3A era de 2154 pares de bases de longitud produciendo 437 bp de ADN secuencia arriba del codón de inicio de CYP52A3A y 97 bp secuencia abajo del codón de detención para el CYP52A3A
ORF.

El gen que codifica CYP52A5A (SEQ. ID. No. 90) de C. tropicalis 20336 fue amplificado a partir de ADN genómico por medio de iniciadores utilizando PCR (Iniciador CYP 5A#1, SEQ. ID. No. 5 e Iniciador CYP 5A#2, SEQ. ID. No. 6) para introducir sitios de clonación PacI. Estos iniciadores PCR fueron diseñados con base en la secuencia de ADN determinada para CYP52A5A (SEQ. ID. No. 90). El juego Expand Hi-Fi Taq PCR (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) fue utilizado de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. El producto de amplificación PCR CYP52A5A era de 3298 pares de bases de longitud.

El gen que codifica CPRB (SEQ. ID. No. 82) de C. tropicalis 20336 fue amplificado a partir de ADN genómico por medio de iniciadores utilizando PCR (CPRB #1, SEQ. ID. No. 7 y CPRB #2, SEQ. ID. No. 8) con base en la secuencia de ADN determinada para CPRB (SEQ. ID. No. 82) (Figura 13). Estos iniciadores fueron diseñados para introducir sitios de clonación únicos PacI. El juego Expand Hi-Fi Taq PCR (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) fue utilizado de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. El producto PCR CPRB era de 3266 bp de longitud produciendo 747 bp pf ADN secuencia arriba del codón de inicio CPRB y 493 bp secuencia abajo del codón de detención para el CPRB ORF. Los productos PCR resultantes fueron aislados por medio de electroforesis en gel de agarosa, purificados utilizando QiaexII y digeridos con PacI. Los fragmentos PCR fueron purificaron, desalinisados y concentrados utilizando un Microcon 100 (Amicon, Beverly, MA).

Los procedimientos de amplificación descritos antes son aplicables a los otros genes enlistados en la Tabla 5 utilizando los iniciadores indicados respectivamente.

C. Clonación de los Genes CYP y CPR dentro de pURAin

El siguiente paso fue clonar a los genes seleccionados CYP y CPR dentro del vector de integración pURAin. En un aspecto preferido de la presente invención ningún ADN foráneo diferente de aquel específicamente suministrado por las secuencias de los sitios de restricción sintéticos se incorpora dentro del ADN que fue clonado dentro del genoma de C. tropicalis, esto es, con la excepción del ADN del sitio de restricción, solamente las secuencias de ADN de C. tropicalis nativo se incorporan dentro del genoma. pURAin fue digerido con PacI, limpiado con QiaexII, y desfosforilado con Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (United States Biochemical, Cleveland, OH) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Aproximadamente 500 ng de PacI linealizado pURAin fue desfosforilado durante 1 hora a 37ºC usando SAP a una concentración de 0,2 Unidades de enzima por 1 pmol de terminales ADN. La reacción fue detenida por inactivación con calor a 65ºC durante 20 min.

El fragmento PacI de CYP52A2A derivado utilizando el iniciador mostrado en la Tabla 4, fue ligado al plásmido pURAin que había sido también digerido con PacI. pURAin digerido con PacI fue desfosforilado, y ligado al producto PCR ULTMA CYP52A2A como se describió previamente. La mezcla de ligación fue transformada dentro de E. coli XL 1 Blue MRF' (Stratagene) y 2 colonias resistentes fueron seleccionadas y muestreadas para corregir construcciones que deberían contener la secuencia del vector, el gen URA3A invertido, y el gen CYP52A2A amplificado (SEQ. ID. No. 86) de 20336. La digestión AscI-PmeI identificó una de las dos construcciones, el plásmido pURA2in, como el correcto (Figura 27). Este plásmido fue secuenciado y comparado con CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86) para confirmar que PCR no introdujo cambios en la base de ADN que resultarían en un cambio de aminoácidos.

Antes de su uso el fragmento PacI de CPRB derivado utilizando los iniciadores mostrados en la Tabla 4, fue secuenciado y comparado con CPRB (SEQ. ID. No. 82) para confirmar que PCR no introdujo cambios en los pares de bases de ADN que resultarían en un cambio de aminoácidos. Después de la confirmación, CPRB (SEQ. ID. No. 82) se ligó al plásmido pURAin que había sido también digerido con PacI. pURAin digerido con PacI fue desfosforilado, y ligado al producto PCR CPR Expand Hi-Fi como se describió previamente. La mezcla de ligación fue transformada dentro de E. coli XL 1 Blue MRF' (Stratagene) y varias colonias resistentes fueron seleccionadas y muestreadas para corregir construcciones que deberían contener la secuencia del vector, el gen URA3A invertido, y el gen CPRB amplificado (SEQ. ID. No. 82) de 20336. La digestión AscI-PmeI confirmó una construcción exitosa,
pURAREDBin.

En forma similar a la anterior cada uno de los otros genes CYP y CPR descritos aquí se clonan dentro de pURAin. Los fragmentos PacI de estos genes, cuyas secuencias se dan en las Figuras 13 y 15, son derivables por métodos conocidos por aquellos entrenados en la técnica.

1) Construcción de Vectores Utilizados para Generar HDC 20 y HDC 23

Un vector de integración previamente construido que contiene CPRB (SEQ. ID. No. 82), pURAREDBin, se escogió como el vector de iniciación. Este vector fue parcialmente digerido con PacI y el fragmento linealizado fue aislado con gel. El PacI activo fue destruido por tratamiento con T4 ADN polimerasa y el vector fue ligado nuevamente. El aislamiento posterior y la digestión completa de este nuevo plásmido produjeron un vector que ahora contiene solamente un sitio PacI activo. Este fragmento fue aislado con gel, desfosforilado y ligado l fragmento PacI de CYP52A2A. Se generaron los vectores que contienen a los genes CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86) y CPRB (SEQ. ID. No. 82) orientados en la misma dirección, pURAin CPR 2A S, así como en direcciones opuestas (conectados a los extremos 5'), pURAin CPR 2A O.

D. Confirmación de la Integración de CYP (Figura 21 para el Esquema de Integración) Dentro del Genoma de C. tropicalis

Con base en la construcción, pURA2in, usada para transformar H5343 ura^{-}, se ideó un esquema para detectar la integración. El ADN genómico de los transformantes se digirió con Dra III y Spe I que son enzimas que cortan dentro de los genes URA3A y URA3B, pero no dentro del gen CYP52A2A integrado. La digestión del ADN genómico, donde había ocurrido una integración en los loci URA3A o URA3B, se esperaría que resultara en un fragmento de 3,5 kb o uno de 3,3 kb, respectivamente (Figura 28). Además la digestión del mismo ADN genómico con PacI produciría un fragmento de 2,2 kb característico para el gen CYP52A2A integrado (Figura 28). Las hibridaciones Southern de estas digestiones con fragmentos del gen CYP52A2A fueron utilizadas para muestrear estos eventos de integración. La intensidad de la señal de la banda de Southern utilizando la digestión PacI, se utilizó como una medida del número de eventos de integración, ((esto es, entre más copias del gen CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86) estén presentes, más fuerte la señal de hibridación)).

Los prototrofos URA transformados de C. tropicalis H5343 se desarrollaron a 30ºC, 170 rpm en 10 ml de medio SC-uracilo para la preparación de ADN genómico. El ADN genómico se aisló por medio del método descrito anteriormente. El ADN genómico se digirió con SpeI y DraIII. Se utilizó gel de agarosa al 0,95% para preparar transferencia de hibridación Southern. El ADN del gel fue transferido a un filtro de membrana de nylon MagnaCharge (MSI Technologies, Westboro, MA) de acuerdo con el método de transferencia alcalina de Sambrook y colaboradores, supra. Para la hibridación Southern, se utilizó un fragmento de ADN de CYP52A2A de 2,2 kb como sonda de hibridación. Se marcaron 300 ng de ADN de CYP52A2A utilizando un sistema de marcación y detección ECL Direct (Amersham) y la Southern fue procesada de acuerdo con las especificaciones del juego de ECL. La transferencia se procesó en un volumen de 30 ml de fluido de hibridación correspondiente a 0,125 ml/cm^{2}. Después de una prehibridación a 42ºC durante 1 hora, se añadieron 300 ng de la sonda CYP52A2A y la hibridación continuó durante 16 horas a 42ºC. Después de la hibridación las transferencias se lavaron dos veces durante 20 min cada vez a 42ºC en un lavado primario que contenía urea. Se efectuaron dos lavados secundarios de 5 min a RT, seguido por detección de acuerdo con las instrucciones. Las transferencias se expusieron durante 16 horas (hr) como se recomendó. Se confirmó la integración por medio de la detección de un fragmento de SpeI-DraIII de 3,5 kb del ADN genómico de los transformantes, pero no con el control de C. tropicalis 20336. Posteriormente, una digestión PacI del ADN genómico de los transformantes positivos, seguida por una hibridación Southern utilizando una sonda del gen CYP52A2A, confirmó la integración por medio de la detección de un fragmento de 2,2 kb. La cepa integrada CYP52A2A resultante fue llamada HDC1 (ver Tabla 1).

En forma similar a lo anterior, se confirmó la integración dentro del genoma de C. tropicalis de cada uno de los genes contenidos en los fragmentos PacI que se describen en la Sección 3c anterior.

Se analizó por medio de hibridación Southern, la integración tanto de los genes en tándem CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86) como CPRB (SEQ. ID. No. 82) de los transformantes generados por transformación con los vectores, pURAin CPR 2A S o pURAin CPR 2A O. Se generaron tres cepas en las cuales los genes integrados CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86) y CPRB (SEQ. ID. No. 82) están en orientación opuesta (HDC 20-1, HDC 20-2 y HDC 20-3), y se generaron tres en las cuales los genes integrados CYP52A2A (SEQ. ID. No. 86) y CPRB (SEQ. ID. No. 82) están en la misma orientación (HDC 23-1, HDC 23-2 y HDC 23-3), Tabla 1.

E. Confirmación de la Integración de CPRB Dentro de H5343 ura^{-}

Se muestrearon siete transformantes por colonia PCR utilizando iniciador CPRB #2 (SEQ. ID. No. 8) y un iniciador específico de URA3A. En cinco de los transformantes, se detectó integración exitosa por medio de la presencia de un producto PCR de 3899 bp. Este producto PCR de 3899 bp representa al gen CPRB adyacente al gen URA3A en el genoma de H5343 confirmando así la integración. Las cepas integradas CPRB resultantes fueron llamadas HDC 10-1 y HDC 10-2 (ver Tabla 1).

F. Evaluación de la Cepa

Como se determinó por PCR cuantitativo, cuando se comparó al H5343 padre, HDC 10-1 contenía 3 copias adicionales del gen de la reductasa y HCD 10-2 contenía cuatro copias adicionales del gen de la reductasa. Las evaluaciones de HDC 20-1, HDC 20-2 y HDC 20-3 con base en los datos de hibridación Southern, indican que HDC 20-1 contenía múltiples integraciones, esto es, 2 a 3 veces lo que contenían HDC 20-2 o HDC 20-3. Las evaluaciones de HDC 23-1, HDC 23-2 y HDC 23-3 con base en los datos de hibridación Southern, indican que HDC 23-3 contenía múltiples integraciones, esto es, 2 a 3 veces lo que contenían HDC 23-1 o HDC 23-2. Los datos en la Tabla 8 indican que la integración de componentes del complejo \omega-hidroxilasa tiene un efecto positivo en la mejora de Candida tropicalis ATCC 20962 como biocatalizador. Los resultados indican que CYP52A5A (SEQ. ID. No. 90) es un gen importante para la conversión de ácido oleico a diácido. Sorprendentemente las integraciones en tándem de los genes CYP y CPR orientados en la dirección opuesta (cepas HDC 20) parecen ser menos productivas que las integraciones en tándem orientadas en la misma dirección (cepas HDC 23), Tablas 1 y 8.

CARTA

Composición del Medio		Sulfato de Magnesio	0,98 g
Caldo LB		(anhidro)
Bacto Triptona	10 g	Agar	15 g
Extracto de Bacto Levadura	5 g	Agua Destilada	1000 ml
Cloruro de Sodio	10 g	Agarosa de Superficie NZCYM
Agua Destilada	1000 ml	Digestión de Bacto Caseína	10 g
Agar LB		Ácidos Bacto Casamino	1 g
Bacto Triptona	10 g	Extracto de Bacto Levadura	5 g
Extracto de Bacto Levadura	5 g	Cloruro de Sodio	5 g
Cloruro de Sodio	10 g	Sulfato de Magnesio	0,98 g
Agar	15 g	(anhidro)
Agua Destilada	1000 ml	Agarosa	7 g
Agarosa de Superficie LB		Agua Destilada	1000 ml
Bacto Triptona	10 g	Caldo YEPD
Extracto de Bacto Levadura	5 g	Extracto de Bacto Levadura	10 g
Cloruro de Sodio	10 g	Bacto Peptona	20 g
Agarosa	7 g	Glucosa	20 g
Agua Destilada	1000 ml	Agua Destilada	1000 ml
Caldo NZCYM		Agar YDP*
Digestión de Bacto Caseína	10 g	Extracto de Bacto Levadura	10 g
Ácidos Bacto Casamino	1 g	Bacto Peptona	20 g
Extracto de Bacto Levadura	5 g	Glucosa	20 g
Cloruro de Sodio	5 g	Agar	20 g
Sulfato de Magnesio	0,98 g	Agua Destilada	1000 ml
(anhidro)		SC - uracilo*
Agua Destilada	1000 ml	Bacto Levadura con base en nitrógeno
Agar NZCYM		sin aminoácidos	6,7 g
Digestión de Bacto Caseína	10 g	Glucosa	20 g
Ácidos Bacto Casamino	1 g	Bacto agar	20 g
Extracto de Bacto Levadura	5 g	Mezcla para derramarse	2 g
Cloruro de Sodio	5 g	Agua Destilada	1000 ml

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Medio DCA2	g/l

Peptona	3,0
Extracto de Levadura	6,0
Acetato de Sodio	3,0
Levadura Nitrogenada (Difco)	6,7
Glucosa (anhidra)	50,0
Fosfato de Potasio (dibásico, trihidrato)	7,2
Fosfato de Potasio (monobásico, anhidro)	9,3

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Medio DCA3	g/l

Solución amortiguadora con fosfato 0,3 M, pH	7,5
Glicerol	50
Levadura Nitrogenada (Difco)	6,7

Mezcla para derramar

Adenina	0,5 g
Arginina	2 g
Ácido Aspártico	2 g
Glutamina	2 g
Glicina	2 g
Inositol	2 g
Leucina	10 g
Metionina	2 g
Fenilalanina	2 g
Serina	2 g
Ttriptófano	2 g
Valina	2 g
Alanina	2 g
Asparagina	2 g
Cisteína	2 g
Ácido Glutámico	2 g
Histidina	2 g
Isoleucina	2 g
Lisina	2 g
Ácido p-aminobenzóico	0,2 g
Prolina	2 g
Treonina	2 g
Tirosina	2 g

*Ver Kaiser y colaboradores, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1994), incorporado aquí como referencia.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Wilson, C. Ron

\hskip3,9cm

Craft, David L.

\hskip3,9cm

Eirich, Dudley

\hskip3,9cm

Eshoo, Mark

\hskip3,9cm

Madduri, Krishna M.

\hskip3,9cm

Cornett, Cathy A.

\hskip3,9cm

Brenner, Alfred A.

\hskip3,9cm

Tang, Maria

\hskip3,9cm

Loper, John C.

\hskip3,9cm

Gleeson, Martin

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENES DE LA MONOOXIGENASA DEL CITOCROMO P450 Y DE LA OXIDOREDUCTASA NADPH DEL CITOCROMO P450 Y PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL COMPLEJO DE LA OMEGA HIDROXILASA DE CANDIDA TROPICALIS Y MÉTODOS RELACIONADOS CON LOS MISMOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 107

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: HENKEL COPROTARION

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 2500 Renaissance Boulevard, Suite 200

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Gulph Mills

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: PA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 19406

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): COMPUTADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL APODERADO / AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Drach, John E.

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAATTAA ATGCACGAAG CGGAGATAAA AG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAATTAA GCATAAGCTT GCTCGAGTCT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAATTAA ACGCAATGGG AACATGGAGT G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAATTAA TCGCACTACG GTTATTGGTA TCAG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAATTAA TCAAAGTACG TTCAGGCGG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTATTAA GGCAGACAAC AACTTGGCAA AGTC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAATTAA GAGGTCGTTG GTTGAGTTTT C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAATTAA TTGATAATGA CGTTGCGGG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCGCGCCG GAGTCCAAAA AGACCAACCT CTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAATTAA TACGTGGATA CCTTCAAGCA AGTG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAATTAA GCTCACGAGT TTTGGGATTT TCGAG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTTTAAAC CGCAGAGGTT GGTCTTTTTG GACTC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTTTAAAC

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCGCGCC

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAATTAA

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3..4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9..10

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "w=dATP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 15..16

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "w=dATP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 18..19

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "w=dATP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCYCAAACWG GTACWGCWGA A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 12..13

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 15..16

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "w=dATP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTTTGGGTA AYTCWACTTA T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTTATTATC ATTTCTTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3..4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "m=dATP o dCTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9..10

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "r=dATP o dGTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCMACACCRGTA CCTGGACC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCCCAATCG TAATCAGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTGTCTTC GTTTAGCA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTACGTCTGT GGTGATGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3..4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "n=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 6..7

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9..10

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "n=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 12..13

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "n=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 15..16

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "n=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGNGAYACNAC NGCNGG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3..4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "r=dATP o dGTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 6..7

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9..10

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "n=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 12..13

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "n=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 15..16

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "n=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGRGAYACNA CNGCNGG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3..4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "r=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 6..7

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "r=dATP o dGTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9..10

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 12..13

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 15..16

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "n=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGNGCRAAYT GYTGNCC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..2

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 4..5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "n=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 7..8

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "r=dATP o dGTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 10..11

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 13..14

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 16..17

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "n=dATP o dCTP o dGTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

YAANGCRAAY TGYTGNCC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTCAACGGT GGTCCAAGAA TCTGTTTGG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCTATGTT GAGACCACAG TTTGC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCAGTTAA AGCAAATTGT TTGGCC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGGGAAGC GCGCCATTGT GTTCC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATACGACT CACTATAGGG CGAATTGGC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3..4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "r=dATP o dGTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 4..5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 16..17

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGRYTCAAAC CATCTYTCTG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACCGGCGT TAAAGGG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(D): UBICACIÓN: 9..10

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "w=dATP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NOMBRE / CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(D): UBICACIÓN: 12..13

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "y=dCTP o dTTP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATAGTCGWA TYATGCTTAG ACC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACCACCAT TGAATGG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 540 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGATGAAGT TTTCGACGAG TACCC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGCTTTAA CGTGTCCAAT CTGGTC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTATCGCCA CATACTTCAC CAAATGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGATCGTG GATACGCTGG AGTG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCACTCGGT AACTTTGTCA GGGAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTGAACTG AGTAGCCAAA ACAGCC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTACGTTTG GTATCGCTAC TCCGTTG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCCAGCCA GCACCGTCCA AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGAGCCGA TCTATGTTGC GTCC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATTGAATG CTTCCAGGAA CCTCG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGAGGGCAG GGCTCAAGAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCATGTGAA GATCCCATCA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGAAGGCC GTGTTGAACG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGATTTGT CTGAGTTGCC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATTGCCTT GAGATACGCC ATTGGTAG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCTTGGTG TCGTTCTTTT CAACGG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGGTTTGT TTGTTTCCTG TGTCCG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTTGACCT TCAATCTGGC GTAGACG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTGCTGAA TACGCTGAAG GTGATG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGCTGAA CAACTCTCTC GTCTCGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCCTCAACA CGGACAGCGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTCAACCAG GTGTGGAACT CGTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGA AGAGGGCAGG GCTCAAGAG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCATGTGAA GATCCCATCA CGAGTGTGCC TCTTGCCCAA AG

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGC CGATGAAGTT TTCGACGAGT ACCC

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGCTTTAA CGTGTCCAAT CTGGTCAACA TAGCTCTGGA GTGCTTCCAA CC

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 56 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGA TTATCGCCAC ATACTTCACC AAATGG

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGATCGTG GATACGCTGG AGTGCGTCGC TCTTCTTCTT CAACAATTCA AG

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTGAACTG AGTAGCCAAA ACAGCCCATG GTTTCAATCA ATGGGAGGC

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGG CCACTCGGTA ACTTTGTCAG GGAC

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 56 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGC CTACGTTTGG TATCGCTACT CCGTTG

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCCAGCCA GCACCGTCCA AGCAACAAGG AGTACAAGAA ATCGTGTC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGG CAGAGCCGAT CTATGTTGCG TCC

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATTGAATG CTTCCAGGAA CCTCGCCACA TCCATCGAGA ACCGG

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGC TTGAAGGCCG TGTTGAACG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGATTTGT CTGAGTTGCC GCCTGATCAA GATAGGATCC TTGCCG

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 56 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGG GTTTGCTGAA TACGCTGAAG GTGATG

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGCTGAA CAACTCTCTC GTCTCGGGTG GTCGAATGGA CCCTTGGTCA AG

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGT TCCTCAACAC GGACAGCGG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTCAACCAG GTGTGGAACT CGTCGGTGGC AACAATGAAA AACACCAAG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGC CATTGCCTTG AGATACGCCA TTGGTAG

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCTTGGTTG TCGTTCTTTT CAACGGAAGG TGGTCTCGAT GGTGTGTTCA ACC

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGGT TGGGTTTGTT TGTTTCCTGT GTCCG

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTTGACCT TCAATCTGGC GTAGACGCAG CACCACCGAT CCACCACTTG

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4206 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4145 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 679 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 679 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4115 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3948 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3755 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 87:

34

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3900 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3668 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 89:

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3826 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3910 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 91:

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3150 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 92:

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3579 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 93:

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3348 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 94:

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 523 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 95:

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 522 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 96:

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 522 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 97:

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 540 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 98:

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 540 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 99:

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 517 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 100:

61

62

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 517 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 101:

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 512 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 102:

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 512 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 103:

67

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 499 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 104:

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1712 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 105:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 267 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 106:

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 473 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 107:

73

Claims

1. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína CPRA que tiene la secuencia de aminoácido que se expone en la SEQ. ID. No. 83.

2. Un ácido nucleico aislado que comprende una región de codificación definida por los nucleótidos 1006-3042 como se expone en la SEQ. ID. No. 81

3. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 2 que comprende la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ. ID. No. 81.

4. Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83.

5. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína CPRA que incluye una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83.

6. Un vector de acuerdo con la reivindicación 5 en donde la secuencia de nucleótidos se expone en los nucleótidos 1006-3042 de la SEQ. ID. No. 81.

7. Un vector de acuerdo con la reivindicación 5 en donde el vector se selecciona del grupo que consiste de un plásmido, un fagémido, un fago y un cósmido.

8. Una célula huésped transfectada o transformada con el ácido nucleico de la reivindicación 1.

9. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 en donde la célula huésped es una célula de levadura.

10. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9 en donde la célula de levadura es una Candida sp.

11. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10 en donde la Candida sp es Candida tropicalis.

12. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 en donde la Candida tropicalis es Candida tropicalis 20336.

13. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 12 en donde la Candida tropicalis es H5343 ura^{-}.

14. Un método para producir una proteína CPRA que incluye una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83, que comprende:

a): transformar una célula huésped apropiada con una secuencia de ADN que codifica a la proteína que tiene la secuencia del aminoácido como se expone en la SEQ. ID. No. 83; y

b): cultivar la célula bajo condiciones que favorezcan la expresión de la proteína.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14 en donde la etapa de cultivar la célula comprende la adición de un sustrato orgánico al medio que contiene la célula.

16. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína CPRB que tiene la secuencia de aminoácido que se expone en la SEQ. ID. No. 84.

17. Un ácido nucleico aislado que comprende una región de codificación definida por los nucleótidos 1033-3069 como se expone en la SEQ. ID. No. 82.

18. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 17 que comprende la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ. ID. No. 82.

19. Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84.

20. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína CPRB que incluye una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84.

21. Un vector de acuerdo con la reivindicación 20 en donde la secuencia de nucleótidos se expone en los nucleótidos 1033-3069 de la SEQ. ID. No. 82.

22. Un vector de acuerdo con la reivindicación 20 en donde el vector se selecciona del grupo que consiste de un plásmido, un fagémido, un fago y un cósmido.

23. Una célula huésped transfectada o transformada con el ácido nucleico de la reivindicación 16.

24. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 23 en donde la célula huésped es una célula de levadura.

25. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 24 en donde la célula de levadura es una Candida sp.

26. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 25 en donde la Candida sp es Candida tropicalis.

27. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 26 en donde la Candida tropicalis es Candida tropicalis 20336.

28. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 27 en donde la Candida tropicalis es H5343 ura^{-}.

29. Un método para producir una proteína CPRB que incluye una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84, que comprende:

a): transformar una célula huésped apropiada con una secuencia de ADN que codifica a la proteína que tiene la secuencia del aminoácido como se expone en la SEQ. ID. No. 84; y

30. El método de acuerdo con la reivindicación 29 en donde la etapa de cultivar la célula comprende la adición de un sustrato orgánico al medio que contiene la célula.

31. Un método para incrementar la producción de un ácido dicarboxílico que comprende:

a): proveer una célula huésped que tiene un número de ocurrencia natural de genes CPRA;

b): incrementar, en la célula huésped, el número de genes CPRA que codifican una proteína CPRA que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83;

c): Cultivar la célula huésped en un medio que contiene un sustrato orgánico que sobrerregula al gen CPRA, para efectuar una mayor producción de ácido dicarboxílico.

32. Un método para incrementar la producción de una proteína CPRA que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83, que comprende:

a): transformar una célula huésped que tiene una cantidad de ocurrencia natural de proteína CPRA con un mayor número de copias de un gen CPRA que codifica a la proteína CPRA que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 83; y

b): cultivar la célula y de ese modo incrementar la expresión de la proteína, comparada con aquella de una célula huésped que contiene un número de copias de ocurrencia natural del gen CPRA.

33. Un método para incrementar la producción de un ácido dicarboxílico que comprende:

a): proveer una célula huésped que tiene un número de ocurrencia natural de genes CPRB;

b): incrementar, en la célula huésped, el número de genes CPRB que codifican una proteína CPRB que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84;

c): Cultivar la célula huésped en un medio que contiene un sustrato orgánico que sobrerregula al gen CPRB, para efectuar una mayor producción de ácido dicarboxílico.

34. Un método para incrementar la producción de una proteína CPRB que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84, que comprende:

a): transformar una célula huésped que tiene una cantidad de ocurrencia natural de proteína CPRB con un mayor número de copias de un gen CPRB que codifica a la proteína CPRB que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ. ID. No. 84; y

b): cultivar la célula y de ese modo incrementar la expresión de la proteína, comparada con aquella de una célula huésped que contiene un número de copias de ocurrencia natural del gen CPRB.