DE60115757T2

DE60115757T2 - Verfahren zur Herstellung von Astaxanthin

Info

Publication number: DE60115757T2
Application number: DE60115757T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Kamakura-shi Hoshino; Kazuyuki Fujisawa-shi Ojima; Yutaka Fujisawa-shi Setoguchi
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-18
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2021-05-19
Also published as: EP1158051A1; EP1158051B1; CA2346620C; NO20012552L; JP4861569B2; US6696293B2; BR0102104A; JP2002253266A; MXPA01005121A; TWI248466B; CA2346620A1; AU4604301A; AU784237B2; DE60115757D1; US20030049720A1; ES2254285T3; ATE312928T1; ID30360A; KR20010107680A; CN100376674C

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Molekularbiologie zur Herstellung von Carotinoiden und biologischen Materialen, die dafür nützlich sind.
Hintergrund der Erfindung
Astaxanthin ist bekanntermaßen in einer breiten Vielzahl an Organismen, wie Tiere (beispielsweise Vögel, wie Flamingos und scharlachrote Ibisse, und Fische, wie Regenbogenforellen und Lachs), Algen und Mikroorganismen verbreitet. Es ist ebenso anerkannt, daß Astaxanthin eine starke Antioxidationseigenschaft gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies aufweist, von der erwartet wird, daß sie zur pharmazeutischen Verwendung genutzt wird, um lebende Zellen gegen einige Krankheiten wie Krebs zu schützen. Außerdem erhöht sich aus Sicht der industriellen Anwendung der Bedarf an Astaxanthin als ein Färbereagens speziell in der Fischzuchtindustrie wie Lachs, da Astaxanthin den Tieren eine kennzeichnende orange-rote Färbung verleiht und zur Wirkung auf den Verbraucher beim Kauf beiträgt.
Phaffia rhodozyma ist als ein carotinogener Hefestamm bekannt, der speziell Astaxanthin erzeugt. Anders als andere carotinogene Hefe, Rhodotorula-Spezies, kann Phaffia rhodozyma (P. rhodozyma) einige Zucker wie D-Glukose fermentieren. Dies ist ein wichtiges Merkmal aus Sicht der industriellen Anwendung. In einer jüngsten taxonomischen Studie wurde ein Sexualzyklus von P. rhodozyma offenbart und sein telemorpher Zustand wurde unter dem Namen Xanthophyllomyces dendrorhous angegeben (W. I. Golubev; Yeast 11, 101–110, 1995). Einige Stammverbesserungsstudien zur Erhaltung von Hyperproduzenten von Astaxanthin aus P. rhodozyma sind durchgeführt worden, aber diese Versuche sind auf den Einsatz des Verfahrens der konventionellen Mutagenese und Protoplastenfusion in dieser Dekade beschränkt worden. Kürzlich entwickelten Wery et al. NS/15.05.2001 ein Wirtsvektorsystem unter Verwendung von P. rhodozyma, worin ein nicht-replizierbares Plasmid zur Integration auf dem Genom von P. rhodozyma an dem Genort von ribosomaler DNA mit hoher Kopienzahl verwendet wurde (Wery et al., Gene, 184, 89–97, 1997). Verdoes et al. berichteten von stärker verbesserten Vektoren zur Erhaltung einer Transformante von P. rhodozyma sowie ihren drei carotinogenen Genen, die die Enzyme kodieren, welche die Reaktionen von Geranylgeranylpyrophosphat zu beta-Carotin katalysieren (Internationale Patentveröffentlichung WO97/23633). Die Wichtigkeit des Gentechnikverfahrens auf die Stammverbesserungsstudie von P. rhodozyma wird sich in naher Zukunft erhöhen, um die erreichte Produktivität durch die konventionellen Verfahren zu durchbrechen.
Viele Forscher haben vermutet, daß Astaxanthin als Antioxidationsmittel in Phaffia rhodozyma eine Rolle spielen könnte, da seine Produktion in einer Respirationsphase des Wachstums eher als in der Fermentationsphase stimuliert wird. Im allgemeinen wird die reaktive Sauerstoffspezies gewöhnlich in der Respirationsphase infolge des Elektronenüberschusses in der Atmungskette erzeugt, die durch das Ungleichgewicht der Elektronenübertragung zwischen Reduktionsgeschwindigkeit vom Ubichinonpool und Elektronenübertragung in dem Abwärtsstrom der Atmungskette verursacht wird. Bei einer solchen Vermutung kann Astaxanthin solche reaktiven Sauerstoffspezies quenchen, wie es die Superoxiddismutase in lebenden Organismen tut.
Schroeder et al. berichteten, daß die Atmungskette von Phaffia rhodozyma von der KCN-empfindlichen Respiration zu der KCN-resistenten in der letzten Wachstumsphase verschoben wird, wenn die Astaxanthinproduktion sti muliert wurde (J. Biol. Chem., 270, 18374–18379, 1995). Die KCN-empfindliche Atmungskette ist die bekannte Elektronenübertragungskette, in der das Elektron innerhalb des Ubichinonpools zu dem Komplex IV über den Komplex III, der in einer breiten Vielzahl von Organismen verbreitet ist, übertragen wird. Es ist bekannt, daß diese Atmungskette durch KCN oder Antimycin A inhibiert wird. Andererseits wird die KCN-resistente Atmungskette in Pflanzen und Fungi verteilt. Bei dieser Atmungskette spielt das Mitochondrienmembranprotein, das als alternative Oxidase (AOX) bezeichnet wird, eine wesentliche Rolle bei der Übertragung des Elektrons innerhalb des Ubichinonpools zu dem H₂O-Molekül unter Verwendung eines Sauerstoffmoleküls als ein Rezeptor. Die AOX-Aktivität wird bekanntermaßen durch n-Propylgallat (n-PG) oder Salicylhydroxamsäure (SHAM) inhibiert.
In ihrer Charakterisierungsstudie für Antimycin-empfindliche Hyperproduzenten von Astaxanthin, abgeleitet von Phaffia rhodozyma, hatten An et al. die Vermutung, daß die Mutanten zum Quenchen der reaktiven Sauerstoffspezies, die durch das Elektron hergestellt werden kann, das aus der Elektronenübertragungskette überlief, viel mehr Astaxanthin erzeugen (Appl. Env. Microbiol, 55, 116–124, 1989).
„Neurospora crassa alternative oxidase ...", Q Liet et al., Genetics, Bd. 142, Nr. 1, 129–140, 1996 beschreiben das Klonen und die Analyse des alternative Oxidase-Gens von Neurospora crassa. Mitochondrien von Neurospora crassa enthalten eine Cyanid-resistente alternative Atmungsleitungsbahn zusätzlich zu der Zytochromleitungsbahn. Die alternative Oxidase liegt nur vor, wenn der Elektronenfluß durch die Zytochromkette eingeschränkt ist. Beide genomischen anc-cDNA-Kopien für das alternative Oxidase-Gen sind isoliert und analysiert worden. Diese Veröffentlichung offenbart ebenso die Nukleinsäuresequenz des Neurospora crassa-alternative Oxidase-Gens (ALTOX-Gen) bzw. die entsprechende Aminosäure-kodierende Sequenz.
WO 91 02060 beschreibt die Produktion eines Hefepilzes mit einem verbesserten Astaxanthingehalt, die das Unterziehen des Hefepilzes dem Wachstum in Gegenwart eines metabolischen Leitungsbahninhibitors unter einem Einfluß, der eine sekundäre Atmungsleitungsbahn (oxidativ) auslöst, oder das Unterziehen eines Phaffia-Hefepilzes, wie oben erhalten, dem Wachstum in Gegenwart eines Hauptatmungsleitungsbahninhibitors und in Gegenwart eines Mittels oder unter Einfluß von Umweltbedingungen, die eine sekundäre Atmungsleitungsbahn (oxidativ) verursachen, umfaßt.
WO 90 01552 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Hefepilzes mit einem verbesserten Astaxanthingehalt (AX-Gehalt), umfassend (a) morphologische Selektion durch Kultivieren eines Hefepilzes der Gattung Phaffia in einem Nährmedium, enthaltend einen antibiotischen Zytochrom-B-Inhibitor oder einen Terpenoid-Syntheseweginhibitor, und (b) vor und/oder nach der morphologischen Selektion Unterziehen des Hefepilzes insgesamt 2 oder mehreren Schritten der Mutagenese.
WO 91 02060 bzw. WO 90 01552 unterscheiden sich in dem Gegenstand, daß ihnen das technische Merkmal zur Herstellung von Carotinoiden oder Erreichen und Auswählen eines Mutantenstammes, der Carotinoide in einem erhöhten Niveau unter den Bedingungen zur Reduktion einer alternativen Oxidaseaktivität produzieren kann, fehlt.
Diese Erfindung wird basierend auf der Vermutung erreicht, daß die Biosynthese von Astaxanthin unter der Bedingung, daß die Elektronenübertragungskette in dem reduzierten Zustand sein würde, hochreguliert wird. Ein solcher reduzierter Zustand kann durch Zugabe eines speziellen Inhibitors wie Antimycin A, KCN, n-PG oder SHAM induziert werden. Ein solcher Zustand kann ebenso durch einige Mutationen induziert werden, was zu einem Ungleichgewicht der Elektronenübertragung führen würde.
Gemäß dieser Erfindung wurden Mutanten, auf die die Resistenz gegen SHAM übertragen wurde, erhalten. Diese Mutanten erreichten 50% höhere Produktivität von Astaxanthin als ihr Elternstamm.
Diese Erfindung umfaßt das Klonen eines Gens, das die alternative Oxidase von Phaffia rhodozyma kodiert. Diese Erfindung umfaßt ebenso die enzymatische Charakterisierung infolge der Exprimierung eines solchen Gens in geeigneten Wirtsorganismen, wie E. coli oder Saccharomyces cerevisiae. Das so geklonte Gen kann zur Reduktion der AOX-Aktivität unter Verwendung der ortsgerichteten Mutagenese der Promotorsequenz oder Antisense-Verfahren in einem geeigneten Wirt, wie P. rhodozyma, verwendet werden. Ihre Wirkungen auf die Carotinogenese können durch die Kultivierung einer solchen Transformante in einem geeigneten Medium unter entsprechenden Kultivierungsbedingungen bestätigt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden bereit, umfassend das Kultivieren eines Organismus, der durch Behandeln eines Elternorganismus, der Carotinoide unter der Bedingung, eine Reduktion einer alternativen Oxidaseaktivität zu induzieren, erhältlich ist, und Auswählen eines Organismus, dessen Produktivität von Carotinoiden erhöht ist. Der Organismus, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren genutzt wird, kann ein mutanter Stamm sein, dessen Produktivität von Carotinoiden mit Hilfe der Alteration der Resistenz gegenüber einem alternative Oxidase-Inhibitor erhöht ist. Dieser Organismus kann eine Mutante sein, die gegen einen alternative Oxidase-Inhibitor resistent ist. Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung eines Organismus praktiziert werden, der zu dem Reich der Protista oder Fungi, stärker bevorzugt zu der Gattung Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea oder Phycomyces gehört, wobei der am stärksten bevorzugte Organismus ein Stamm von Phaffia rhodozyma und Xanthophyllomyces dendrorhous sein kann.
Der alternative Oxidase-Inhibitor, der für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, kann aus der Gruppe, bestehend aus n-Propylgallat und Salicylhydroxamsäure, ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines Mutantenstammes, der Carotinoide in einem erhöhten Niveau in bezug auf den Elternorganismus produzieren kann, bereit, umfassend das Kultivieren eines Organismus, der Carotinoide produzieren kann, unter der Bedingung zur Reduktion einer alternativen Oxidaseaktivität und Auswählen eines Organismus, der Carotinoide in einem höheren Niveau als der Elternorganismus produzieren kann. Diese Bedingung zur Reduktion einer alternativen Oxidaseaktivität kann die Gegenwart eines alternative Oxidase-Inhibitors umfassen. Der alternative Oxidase-Inhibitor für diesen Zweck kann aus der Gruppe, bestehend aus n-Propylgallat und Salicylhydroxamsäure, ausgewählt werden. Der Organismus für einen Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung kann zu dem Reich der Protista oder Fungi, stärker bevorzugt zu der Gattung Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea oder Phycomyces gehören, wobei der am stärksten bevorzugte Organismus ein Stamm von Phaffia rhodozyma und Xanthophyllomyces dendrorhous sein kann.
In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung ebenso auf einen Mutantenstamm eines Organismus, der Carotinoide in einem erhöhten Niveau in bezug auf den Elternstamm, der durch das oben beschrieben Verfahren erhältlich ist, produzieren kann. Die Mutanten können spezieller dahingehend charakterisiert werden, daß sie selbst in dem Medium, das 0,3 bis 0,45 mg/ml SHAM enthält, bei einer ähnlichen Wachstumsgeschwindigkeit in dem Medium, das kein SHAM enthält, wachsen können.
Als eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden SHAM-resistente Mutanten bereitgestellt, die aus Phaffia rhodozyma ATCC96594 abgeleitet wurden. Diese SHAM-resistenten Mutanten wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung der Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland) unter DSM 13429, DSM 13430 bzw. DSM 13431 am 3. April 2000 hinterlegt.
Der Organismus, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann ein rekombinanter Organismus sein, dessen Genexpression der alternativen Oxidase verändert wird, um die Wirksamkeit im Vergleich zu einem Elternorganismus zu verringern. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen rekombinanten Organismus bereit, der Carotinoide in einem erhöhten Niveau in bezug auf den Wirtsorganismus produzieren kann, der dadurch gekennzeichnet ist, daß dessen Genexpression der alternativen Oxidase verändert wird, um die Wirksamkeit im Vergleich zu dem Wirtsorganismus zu verringern. Bei einem solchen Organismus kann es sein, daß die Genexpression der alternativen Oxidase mit Hilfe der Technik, ausgewählt aus Antisense-Technologie, ortsgerichteter Mutagenese, chemischer Mutagenese usw., verändert wird. Der Organismus für diesen Zweck kann zu dem Reich der Protista oder Fungi, stärker bevorzugt zu der Gattung Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea oder Phycomyces gehören, wobei der am stärksten bevorzugte Organismus ein Stamm von Phaffia rhodozyma und Xanthophyllomyces dendrorhous sein kann – speziell die obengenannten Hinterlegungen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine rekombinante DNA-Sequenz bereit, die für eine alternative Oxidase kodiert, die aus einem Organismus stammt, der Carotinoide produzieren kann. Die rekombinante DNA kann aus einem Organismus erhalten werden, der zu dem Reich von Protista oder Fungi, stärker bevorzugt zu der Gattung Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea oder Phycomyces gehört, wobei der am stärksten bevorzugte Organismus ein Stamm von Phaffia rhodozyma und Xanthophyllomyces dendrorhous sein kann – speziell die obengenannten Hinterlegungen. Die rekombinante DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kann die sein, die durch die SEQ ID Nr: 2 gekennzeichnet ist, oder die mit einer Identität mit SEQ ID Nr: 2 von höher als 55%, stärker bevorzugt höher als 75%, am stärksten bevorzugt höher als 95%.
Diese rekombinante DNA-Sequenz kann spezieller dadurch gekennzeichnet sein, daß sie (a) für das Enzym mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr: 1 beschrieben ist, kodiert, oder (b) für eine Variante des Enzyms kodiert, ausgewählt aus (i) einer Allelvariante und (ii) einem Enzym, das eine oder mehrere Aminosäureadditionen, -insertionen, -deletionen und/oder -substitutionen und die genannte Enzymaktivität aufweist. Die besonders spezifizierte isolierte DNA-Sequenz, die oben erwähnt wird, kann die sein, die aus einem Gen von Phaffia rhodozyma stammen kann und ausgewählt ist aus (i) einer DNA-Sequenz, dargestellt in SEQ ID Nr: 2, (ii) einer isokodierenden oder einer Allelvariante für die DNA-Sequenz, dargestellt in SEQ ID Nr: 2, und (iii) einem Derivat einer DNA-Sequenz, dargestellt in SEQ ID Nr: 2 mit Addition, Insertion, Deletion und/oder Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden und das für ein Polypeptid mit der Enzymaktivität kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso die Verwendung der rekombinanten DNA zur Umwandlung eines Wirtsorganismus bereit. Eine günstige Form der rekombinanten DNA kann ein Vektor sein. Der rekombinante Organismus, der durch die Verwendung der rekombinanten DNA erhalten wird, kann die Enzymaktivität für die alternative Oxidase verringern. Der Wirtsorganismus, der mit der rekombinanten DNA umgewandelt wird, kann bei der Verbesserung des Produktionsverfahrens von Carotinoiden, insbesondere Astaxanthin, nützlich sein. Daher stellt die vorliegende Erfindung ebenso einen rekombinanten Organismus bereit.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur biologischen Produktion von Carotinoiden bereit, welches das Einführen einer rekombinanten DNA, die oben beschrieben ist, in einen geeigneten Wirtsorganismus und das Kultivieren des so erhaltenen rekombinanten Organismus umfaßt. Daher ist das Verfahren zur Produktion eines Carotinoids, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein oben beschriebener rekombinanter Organismus unter Bedingungen, die zur Produktion des Carotinoids notwendig sind, kultiviert wird, einer der Aspekte der vorliegenden Erfindung. Dieses Verfahren kann auf die biologische Produktion von Astaxanthin angewendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist ein Arbeitsmodell für die Atmungskette von P. rhodozyma.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie oben beschrieben, vermuteten viele Forscher, daß Astaxanthin als ein Antioxidationsmittel in Phaffia rhodozyma eine Rolle spielen kann, da seine Produktion in einer Respirationsphase des Wachstums eher als in der Fermentationsphase stimuliert wird. Im allgemeinen wird die reaktive Sauerstoffspezies gewöhnlich in der Respirationsphase infolge des Elektronenüberschusses in der Atmungskette erzeugt, die durch das Ungleichgewicht der Elektronenübertragung zwischen Reduktionsgeschwindigkeit vom Ubichinonpool und Elektronenübertragung in dem Abwärtsstrom der Atmungskette verursacht wird (1). Bei einer solchen Vermutung kann Astaxanthin solche reaktiven Sauerstoffspezies quenchen, wie es die Superoxiddismutase tut.
Basierend auf dieser Vermutung könnte die Überproduktion von Astaxanthin durch die Inhibierung der Atmungskette in Phaffia rhodozyma realisiert werden. Tatsächlich isolierten An et al. Mutanten, deren KCN-empfindliche Respiration blockiert wurde, und die viel mehr Astaxanthin aus Phaffia rhodozyma produzierten (Appl. Env. Microbiol, 55, 116–124, 1989).
Andererseits wurde, wie Schroeder et al. berichteten, die Atmungskette von Phaffia rhodozyma von der KCN-empfindlichen Respiration zu der KCN-resistenten in der letzten Wachstumsphase verschoben, wenn die Astaxanthinproduktion stimuliert wurde (J. Biol. Chem., 270, 18374–18379, 1995). In diesem Zusammenhang würde die KCN-empfindliche Respiration, die durch die alternative Oxidase vermittelt wird, mehr Wirkung auf die Respiration in der Produktionsphase von Astaxanthin ausüben. Die Inhibierung der alternativen Oxidase kann zu der Überproduktion von Astaxanthin führen.
Um die Wirkung der speziellen Inhibierung der Respirationsaktivität auf die Produktion von Astaxanthin in Phaffia rhodozyma zu untersuchen, wurde SHAM, das dafür bekannt ist, die alternative Oxidase zu inhibieren, zu dem wachsenden Agarmedium bei serienverdünnter Konzentration zugegeben. Im Verlauf dieser Studie erschienen mehrere spontane Mutanten, die ähnliche Wachstumsaktivität selbst in Gegenwart von 0,3 bis 0,45 mg/ml SHAM zu der in dem Medium, das kein SHAM umfaßt, zeigten. Überraschenderweise wurde herausgefunden, daß diese Mutanten 50% mehr Astaxanthin als ihre Eltern produzierten. Dies zeigt, daß einige Mutationen, die zur Überproduktion von Astaxanthin führen, die Wachstumsinhibierung durch den reduzierten Zustand der Atmungskette, die durch eine Verringerung der alternativen Oxidaseaktivität verursacht werden würde, ergänzen könnten.
Die vorliegende Erfindung stellt die so isolieren Mutanten bereit, die gegenüber 0,3 bis 0,45 mg/ml des speziellen Inhibitors für die alternative Oxidase, SHAM, resistent sind. Ebenso wie oben, ist es für den Fachmann ohne weiteres selbstverständlich, daß Mutantenstämme, die zum Produzieren von Astaxanthin in höherer Produktivität fähig sind, durch Kultivieren eines entsprechenden Organismus in Gegenwart von irgendeinem oder mehreren der Inhibitoren für die alternative Oxidase und durch Screenen der Organismen, die die Wachstumsaktivität in Gegenwart der Inhibitoren und höhere Produktivität von Astaxanthin als Elternorganismen zeigen, hergestellt werden können. Die Produkti vität von Astaxanthin kann durch Extrahieren von Carotinoiden aus den Zellen von P. rhodozyma und Messen des Astaxanthinniveaus, wie in Beispiel 2 veranschaulicht, bestimmt werden. Eine Erhöhung der Produktivität um etwa 10% wird ein mögliches Kriterium sein, um einen Mutantenstamm auszuwählen, der Astaxanthin in einem höheren Niveau als ein Elternstamm produzieren kann. Die Rekultivierung und das Screenen des so erhaltenen Mutantenstammes unter dem Druck des alternative Oxidase-Inhibitors können eingesetzt werden, um die Produktivität zu verbessern. Der so erhaltene Mutantenstamm kann auf die Astaxanthinproduktion in einem geeigneten Medium angewendet werden.
Um die Aktivität für die alternative Oxidase zu verringern, weist ein Ansatz, der durch die Gentechnologie eingesetzt wird, mehrere Vorteile gegenüber einem Ansatz durch die Zugabe eines speziellen Inhibitors, wie SHAM, zu dem Kulturmedium auf. Einer dieser Vorteile ist ein wirtschaftlicher Grund. Die Zugabe eines solchen Inhibitors würde die Produktionskosten erhöhen. Und die Zugabe eines solchen Inhibitors zu dem Kulturmedium weist den anderen Nachteil des Reinigungsschrittes zur Entfernung der zugegebenen Inhibitoren aus dem Endprodukt auf.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte rekombinante DNA-Sequenz bereit, die für die alternative Oxidase aus Phaffia rhodozyma kodiert.
Die erfindungsgemäße DNA kann eine cDNA bedeuten, die nur ein offenes Leseraster, das zwischen den kurzen Fragmenten in ihrer 5'- und 3'-untranslatierten Region flankiert ist, enthält, und ebenso eine genomische DNA, die ihre Introns und Regulationssequenzen, wie ihren Promotor und Terminator, die in der Expression des Gens von Interesse involviert sind, enthält.
Zunächst klonten wir ein partielles Genfragment, das einen Teil des AOX-Gens enthielt, unter Verwendung des degenerierten PCR-Verfahrens. Die degenerierte PCR ist ein Verfahren zum Klonen eines Gens von Interesse, das eine hohe Homologie der Aminosäuresequenz zu dem bekannten Enzym aus anderen Spezies aufweist, die dieselbe oder ähnliche Funktion aufweisen. Ein degenerierter Primer, der als ein Primer bei der degenertierten PCR verwendet wird, wurde durch Umkehrtranslation der Aminosäuresequenz zu den entsprechenden Nukleotiden konstruiert („degeneriert"). Bei einem solchen degenerierten Primer wurde im allgemeinen ein gemischter Primer, der aus A, C, G oder T besteht, oder ein Primer, der Inosin bei einem Ambiguitätskode enthält, verwendet. In dieser Erfindung wurden die gemischten Primer für degenerierte Primer zum Klonen des obigen Gens verwendet. Die verwendete PCR-Bedingung wird in Abhängigkeit der Primer und des zu klonenden Gens variiert, wie nachstehend beschrieben.
Ein vollständiges Gen, das seine Kodierungsregion mit seinem Intron sowie seine Regulationsregion, wie einen Promotor oder Terminator, enthält, kann aus einem Chromosom durch Screenen der Genbibliothek, die in einem Phagenvektor oder Plasmidvektor in einem geeigneten Wirt konstruiert ist, unter Verwendung eines partiellen DNA-Fragments, erhalten durch degenerierte PCR, wie oben beschrieben, als eine Probe, nachdem sie markiert wurde, geklont werden. Im allgemeinen wird E. coli als ein Wirtsstamm und E. coli-Vektor, ein Phagenvektor, wie Lambdaphagenvektor, oder ein Plasmidvektor, wie pUC-Vektor, oftmals bei der Konstruktion der Bibliothek und eine nachfolgende Genmanipulation, wie eine Sequenzierung, eine Restriktionsdigestion, eine Ligation und dergleichen verwendet. In dieser Erfindung wurde eine EcoRI-Genbibliothek von P. rhodozyma in den Derivaten des Lambdavektors, Lambda-gt11, konstruiert. Eine Insertgröße, wobei die Länge des Inserts geklont werden muß, wurde durch die Southern-Blot-Hybridisierung vor der Konstruktion einer Bibliothek bestimmt. In dieser Erfindung wurde eine DNA, die für eine Probe verwendet wurde, mit Digoxigenin (DIG), einem Steroidhapten anstelle der konventionellen ³²P-Markierung, markiert, gefolgt von dem Protokoll, das durch den Lieferanten vorbereitet wurde (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Deutschland). Eine Genbibliothek, die aus dem Chromosom von P. rhodozyma konstruiert wurde, wurde unter Ver wendung eines DIG-markierten DNA-Fragments, das einen Teil eine Gens von Interesse als eine Probe aufweist, gescreent. Hybridisierte Plaques wurden aufgenommen und für weitere Studien verwendet. Nach der Isolierung des positiven Plaque wurde das Insertfragment in den entsprechenden Plasmidvektor subkloniert, der günstigerweise zum Sequenzieren verwendet werden kann. In dieser Erfindung wurde das Insertfragment in dem positiven Phagenvektor in den pOCUS-2-Vektor subkloniert, der zur Konstruktion von Transposon-insertierten Sequenzierungsderivaten verwendet wird (Locus Pocus System, Novagene, Madison, USA).
In dieser Erfindung wurde der automatisierte Fluoreszenz-DNA-Sequenzer, AL Fred System (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit einem Autozyklussequenzierungsprotokoll verwendet, in dem die Taq-DNA-Polymerase in den meisten Fällen des Sequenzierens eingesetzt wird.
Nach der Bestimmung der genomischen Sequenz wurde eine Sequenz einer Kodierungsregion zum Klonen von cDNA des entsprechenden Gens verwendet. Das PCR-Verfahren wurde ebenso zum Klonen des cDNA-Fragments genutzt. Die PCR-Primer, deren Sequenzen zu der Sequenz an dem 5'- und 3'-Ende des offenen Leserasters (ORF) identisch waren, wurden unter Zufügen einer geeigneten Restriktionsstelle synthetisiert, und die PCR wurde unter Verwendung dieser PCR-Primer durchgeführt. In dieser Erfindung wurde ein cDNA-Pool als eine Matrize bei diesem PCR-Klonen der cDNA verwendet. Dieser cDNA-Pool besteht aus verschiedenen cDNA-Spezies, die durch die Virusumkehrtranskriptase und Taq-Polymerase (CapFinder Kit, hergestellt von Clontech, Palo Alto, USA) unter Verwendung der mRNA, erhalten aus P. rhodozyma, als eine Matrize in vitro synthetisiert wurden. Die so erhaltene cDNA von Interesse kann in ihrer Sequenz bestätigt werden. Außerdem kann die so erhaltene cDNA zur Bestätigung ihrer Enzymaktivität nach dem Klonen des cDNA-Fragments zu einem Expressionsvektor, der in E. coli oder S. cerevisiae unter dem entsprechenden Promotor fungiert, verwendet werden.
Um ein Gen, das aus Eukaryote stammt, zu exprimieren, wird oftmals eine Verfahrensweise, bei der cDNA zu einem Expressionsvektor in E. coli oder S. cerevisiae geklont wird, verwendet. Dies wird durch die Tatsache verursacht, daß eine Spezifizität der Intronstruktur unter den Organismen variiert, und einer Unfähigkeit, die Intronsequenz von anderen Spezies zu unterscheiden. Tatsächlich weist die Prokaryote keine Intronstruktur in ihrem genetischen Hintergrund auf. Selbst bei dem Hefepilz unterscheidet sich der genetische Hintergrund zwischen Ascomycetes, zu denen Saccharomyces cerevisiae gehört, und Basidiomycetes, zu denen P. rhodozyma gehört. Wery et al. zeigten, daß die Intronstruktur des Aktingens aus P. rhodozyma weder erkannt noch durch die Ascomyceten-Hefe, Saccharomyces cerevisiae, gespleißt wird (Yeast, 12, 641–651, 1996).
Einige andere Forscher berichteten, daß die Intronstrukturen von einigen Arten der Gene die Regulation ihrer Genexpressionen umfassen (Dabeva, M. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 5854, 1986). Es kann wichtig sein, ein Genfragment zu verwenden, das seine Introns in dem Fall des Selbstklonens des Gens von Interesse, dessen Intronstruktur diese Regulation seiner eigenen Genexpression umfaßt, aufweist.
Um ein Gentechnologieverfahren für eine Stammverbesserungsstudie anzuwenden, ist es notwendig, seinen Genmechanismus in dem Fall wie Transkription und Translation zu untersuchen. Es ist wichtig, eine Gensequenz für seine Upstream-Aktivator-Sequenz (UAS), Promotor, Intronstruktur und Terminator, nicht nur für sein Exon zu bestimmen, um den Genmechanismus zu untersuchen.
Gemäß dieser Erfindung wurde das Gen, das für die alternative Oxidase kodiert, aus der genomischen DNA von P. rhodozyma kloniert, und ihre genomische Sequenz, die das alternative Oxidase-Gen (AOX-Gen), einschließlich seinen 5'- und 3'-nachbarständigen Regionen sowie seine Intronstrukturen enthält, bestimmt.
Nach der Bestätigung der Enzymaktivität kann die Genmodifikationsstudie, um die alternative Oxidaseaktivität zu verringern, eingesetzt werden.
In der vorliegenden Erfindung umfaßt die Polypeptidsequenz SEQ ID Nr: 2 und Fragmente davon mit AOX-Aktivität und Polypeptidsequenzen, die zu SEQ ID Nr: 2 unter stringenten Bedingungen, welche ausreichend sind, um spezielle Bindungen an SEQ ID Nr: 2 zu identifizieren, hybridisieren, und die Hybride ein Polypeptid kodieren, das die Funktion einer alternativen Oxidase aufweist. Beispielsweise kann irgendeine Kombination der folgenden Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden, um die erforderliche spezifische Bindung zu erreichen:
Hybridisierung unter stark stringenten Bedingungen:

6 × SSC
0,5% SDS
100 μg/ml denaturierte Lachsspermium-DNA
50% Formamid
Inkubieren über Nacht unter vorsichtigem Schütteln bei 42°C.

Waschung unter stark stringenten Bedingungen:
1 Wasc hung in 2 × SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur für 15 Minuten, gefolgt von einer weiteren Waschung in 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen:

6 × SSC
0,5% SDS
100 μg/ml denaturierte Lachsspermium-DNA
50% Formamid
Inkubieren über Nacht unter vorsichtigem Schütteln bei 37°C.

Waschung unter weniger stringenten Bedingungen:

1 Waschung 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur für 15 Minuten.

Mäßig stringente Bedingungen können durch Variieren der Temperatur, bei der die Hybridisierungsreaktion stattfindet, und/oder den Waschbedingungen, wie oben dargestellt, erhalten werden. In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, die Hybridisierung und Waschung unter stark stringenten Bedingungen zu verwenden.
Um eine Genexpression mit Genverfahren zu verringern, können einige Verfahren genutzt werden. Eines dieser Verfahren ist das Antisense-Verfahren. Das Antisense-Verfahren ist ein Verfahren zur Verringerung der Expression eines Gens von Interesse durch Einführen eines künstlichen Genfragments, dessen Sequenz zu der des Gens von Interesse komplementär ist. Ein solches Antisense-Fragment würde einen Komplex mit einem reifen mRNA-Fragment des jeweiligen Gens in vivo bilden und eine wirksame Translation aus mRNA als Folge inhibieren. Zur Konstruktion von Antisense-RNA für ein AOX-Gen kann ein PCR-Verfahren zum Klonen des komplementären cDNA-Stranges für das AOX-Gen eingesetzt werden.
Das andere Verfahren ist eine Mutation der Promotorregion. Im allgemeinen besteht das Gen aus mehreren Teilen, die unterschiedliche Funktionen voneinander aufweisen. In Eukaryoten werden die Gene, die die entsprechenden Proteine kodieren, zur Früh-Messenger-RNA (pre-mRNA) transkribiert, die sich von den Genen für ribosomale RNA (rRNA), kleine Kern-RNA (snRNA) und Transfer-RNA (tRNA) unterscheidet. Obwohl die RNA-Polymerase II (PolII) eine zentrale Rolle in diesem Transkriptionsvorgang spielt, kann PolII alleine die Transkription ohne cis-Element, das eine Upstream-Region, enthaltend einen Promotor und ein UAS und einen trans-acting Proteinfaktor, abdeckt, nicht starten. Zunächst erkennt ein Transkriptionsinitiationskomplex, der aus mehreren Grundproteinkomponenten besteht, die Promotorsequenz in der 5'-nachbarständigen Region des Gens, das exprimiert werden soll. In diesem Fall sind einige zusätzliche Teilnehmer bei dem Gen erforderlich, das unter einer speziellen Regulation exprimiert wird, wie eine Hitzeschockantwort oder Adaptation auf Ernährungsmangel und so weiter. In einem solchen Fall ist ein UAS erforderlich, das in der 5'-untranslatieren Upstream-Region um die Promotorsequenz existieren soll, und einige positive oder negative Regulatorproteine erkennen und binden an UAS. Die Bindungsfestigkeit des Transkriptionsinitiationskomplexes an die Promotorsequenz wird durch die Bindung des trans-acting Faktors um den Promotor beeinflußt, und dies ermöglicht die Regulation der Transkriptionsaktivität.
Nach der Aktivierung eines Transkriptionsinitiationskomplexes durch die Phosphorylierung initiiert ein Transkriptionsinitiationskomplex die Transkription aus der Transkriptionsstartstelle. Einige Teile des Transkriptionsinitiationskomplexes werden als ein Elongationskomplex von der Promotorregion zu der 3'-Richtung des Gens abgelöst (dieser Schritt wird als Promotor-Clearance-Vorgang bezeichnet) und ein Elongationskomplex setzt die Transkription fort, bis er eine Endsequenz erreicht, die in der 3'-nachbarständigen Downstream-Region des Gens lokalisiert ist.
Um die Expression des Gens von Interesse zu verringern, wurde die Mutation durch konventionelle chemische Mutagenese oder genetische ortsgerichtete Mutagenese in der Promotorregion des jeweiligen Gens, das die oben beschriebene UAS-Sequenz enthält, oftmals verwendet. In diesem Ansatz wird eine Genkassette, enthaltend ein Reportergen, das an eine Promotorregion, die aus einem Gen von Interesse stammt, an ihrem 5'-Ende und eine Terminatorregion aus einem Gen von Interesse an ihrem 3'-Ende kondensiert, mutagenisiert und dann in P. rhodozyma eingeführt. Durch Nachweisen des Unterschieds der Aktivität des Reportergens würde eine wirksame Mutation gescreent werden. Der Mutantenstamm, in dem sich die Expression des Enzyms von Interesse verringern kann, kann durch Umwandeln des Wirtsstammes mit einer rekombinanten DNA mit einer solchen mutierten Promotorregion erhalten werden.
Diese Konstrukte als ein Vektor, enthaltend Antisense-AOX-Gen oder mutierten Promotor für das AOX-Gen, können zu dem entsprechenden Wirtsstamm übertragen werden. Bei der Verwendung von Phaffia rhodozyma als Wirtsstamm wird dies durch Klonen dieser Konstrukte zu einem geeigneten Vektor realisiert, auf dem ein selektierbarer Marker, der in P. rhodozyma fungiert, untergebracht ist. Ein Arzneimittel-resistentes Gen, das das Enzym kodiert, welches das Überleben des Wirts in Gegenwart eine toxischen Antibiotikums ermöglicht, wird oftmals für den selektierbaren Marker verwendet. G418-Resistenzgen, untergebracht in pGB-Ph9 (Wery et al., Gene, 184, 89–97, 1997), ist ein Beispiel eines Arzneimittelresistenzgens. Ein solches Plasmid kann auf dem Chromosom von Phaffia rhodozyma durch die homologe Rekombination zwischen dem Chromosom und dem Plasmid integriert werden.
Als ein Transformationsverfahren wurden das LiAc-Verfahren und Elektroporationsverfahren (Wery et al., Gene, 184, 89–97, 1997) angewendet, um P. rhodozyma umzuwandeln.
Ein so genetisch verändertes P. rhodozyma wird in einem geeigneten Medium kultiviert und hinsichtlich seiner Produktivität von Astaxanthin bewertet.
Die vorliegende Erfindung wird mit den nachstehend beschriebenen Beispielen in bezug auf die anhängende Zeichnung weiter dargestellt.
Beispiele
Die folgenden Materialien und Verfahren wurden in den nachstehend beschriebenen Beispielen eingesetzt:
Stämme
P. rhodozyma ATCC96594 (erneut hinterlegt unter der Zugangs-Nr. ATCC74438 am 8. April 1998 gemäß dem Budapester Abkommen)

E. coli Y1090r^–: araD139, hsdR (r_K ^–, m_K ⁺), mcrB⁺, rpsL, supF, trpC12::Tn10, ΔlacU169, Δlon, F^–, λ^–, (pMC9) (Clontech)
E. coli DH5alpha: F^–, ϕ80d, lacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, hsd (r_K ^–, m_K ⁺), recA1, endA1, deoR, thi-1, gyrA96, relA1 (Toyobo, Osaka, Japan)
E. coli gamma delta Spender: Δ(gpt-proA)62, leu, 44, ara14, galK2, lacY1, Δ(mcrC-mrr), (r_B ^–, m_B ^–), xyl-5, mt1-1, recA13, [F⁺::Tn1000 (tet^s)] (Novagene)
E. coli gamma delta Empfänger: F^–, araD139, Δ(ara-leu)7696, galE15, galK16, Δ(lac)X74, (Str^r), hsdR2 (r_K12 ^–, mK₁₂ ⁺), mcrA, mcrB1::Tn5 (kan^r) (Novagene)
E. coli TOP10: F^–, mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), ϕ80, M15, ΔlacX74, recA1, deoR, araD139, (ara-leu)7697, galU, galK, rpsL (Str^r), endA1, nupG (Invitrogen, NV Leek, Niederlande)

Vektoren

lambda gt11 (Clontech)
pCR2.1-TOPO (Invitrogen)
pOCUS-2
pBluescript I1 SK-(Stratagene)
pGBPh9 (Wery et al., Yeast, 12, 641–651, 1996)

Medien
Der P. rhodozyma-Stamm wird routinemäßig in YPD-Medium gehalten (DIFCO, Detroit, USA). Der E. coli-Stamm wird in LB-Medium gehalten (10 g Bacto-trypton (DIFCO), 5 g Hefeextrakt (DIFCO) und 5 g NaCl pro Liter). NZY-Medium (5 g NaCl, 2 g MgSO₄-7H₂O, 5 g Hefeextrakt (DIFCO), 10 g NZ-Amin-Typ A (WAKO, Osaka, Japan) pro Liter) wird für Lambda-Phagen-Propagierung in weichem Agar (0,7% Agar; WAKO) verwendet. Wenn ein Agarmedium hergestellt wurde, wurden 1,5% Agar (WAKO) supplementiert. Salicylhydroxamsäure (SHAM) wurde von Aldrich (Milwaukee, USA) bezogen.
Verfahren
Ein allgemeines Verfahren für die Techniken der Molekulargenetik war gemäß einem Verfahren in der molekularen Klonierung: a Laboratory Manual, 2. Auflage (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase wurden von Takara Shuzo (Ohtsu, Japan) bezogen.
Die Isolierung einer chromosomalen DNA aus P. rhodozyma wurde unter Verwendung von QIAGEN Genomic Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) durchgeführt, gefolgt von dem Protokoll, geliefert vom Hersteller. Die Mini-Präparation der Plasmid-DNA aus umgewandelten E. coli wurde mit dem automatischen DNA-Isolationssystem durchgeführt (PI-50, Kurabo, Co. Ltd., Osaka, Japan). Die Midi-Präparation der Plasmid-DNA aus einer E. coli-Transformante wurde unter Verwendung der QIAGEN-Säule durchgeführt (QIAGEN). Ein DNA-Fragment wurde isoliert und aus Agarose unter Verwendung von QIAquick oder QIAEX II (QIAGEN) gereinigt.
Die Isolierung der gesamten RNA aus P. rhodozyma wurde mit einem Phenolverfahren unter Verwendung von Isogen durchgeführt (Nippon Gene, Toyama, Japan). mRNA wurde aus der so erhaltenen gesamten RNA unter Verwendung von mRNA-Separationskit (Clontech) gereinigt. cDNA wurde unter Verwendung von CapFinder-cDNA-Konstruktionskit (Clontech) synthetisiert.
Das in-vitro-Verpacken wurde unter Verwendung von Gigapack III Goldverpackungsextrakt durchgeführt (Stratagene, La Jolla, USA). Die Isolierung von Lambda-DNA wurde durch Wizard Lambda-Präparation-DNA-Reinigungssystem (Promega, Madison, USA) durchgeführt, gefolgt von dem Protokoll, vorbereitet durch den Hersteller.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde mit dem Thermal-Cycler vom Perkin Elmer Model 2400 durchgeführt. Jede PCR-Bedingung ist in den Beispielen beschrieben. Die PCR-Primer wurden von einem kommerziellen Lieferanten bezogen. Die DNA-Sequenzierung wurde mit dem automatisierten Fluoreszenz-DNA-Sequenzer durchgeführt (ALFred, Pharmacia).
Die kompetenten Zellen von DH5alpha wurden von Toyobo bezogen. Alle Chemikalien wurden von WAKO bezogen, wenn nicht anderes angegeben.
Beispiel 1 Isolation von SHAM-resistenten Mutanten, SHAM1, SHAM2 und SHAM3 aus P. rhodozyma ATCC96594
Um die Wirkung der Inhibierung für die KCN-resistente Respiration, die durch die alternative Oxidase vermittelt wurde, auf das Wachstum von P. rhodozyma zu untersuchen, wurde die Zugabe von SHAM zur Kultivierung von P. rhodozyma auf YPD-Agarmedium durchgeführt. SHAM wurde in Ethanol gelöst und zu dem YPD-Agarmedium durch 0,05, 0,15, 0,30, 0,45 bzw. 0,90 mg/ml bei Endkonzentration zugegeben. Auf dieses Medium wurden 2 × 10⁷ Zellen/ml P. rhodozyma ATCC96594 nach der Verdünnung verteilt. Nach der Kultivierung von 3 Tagen bei 20°C wurden die erhaltenen Kolonien gezählt. Schließlich war die Zahl an Kolonien, die auf dem SHAM-enthaltenen YPD-Agar wuchsen, beinahe dieselbe wie die auf dem Kontrollmedium, das kein SHAM enthielt. Aber die Größe der Kolonien, die auf einem SHAM-enthaltenden Medium wuchsen, war kleiner als die Kontrollkultur. Tabelle 1 zeigt den relativen Koloniedurchmesser gegenüber der Kontrollkolonie.
Tabelle 1 Relative Größe der Kolonie, die auf SHAM-enthaltendem YPD-Agar wuchs
Interessanterweise zeigten unter den Kolonien, die auf dem Medium wuchsen, das 0,3 und 0,45 mg/ml SHAM enthielt, einige Kolonien dieselbe Größe wie die Kontrollkolonie. Diese Kolonien zeigten ebenso eine tiefere Pigmentierung als die Kontrollkolonie. Vier Kolonien, die ähnliche Koloniegröße wie die Kontrollkolonie zeigten, wurden aufgenommen und über YPD-Agarmedium gestreift. Alle Kolonien zeigten eine tiefere Pigmentierung als die Kontrollkolonie sogar auf YPD-Agarmedium, das kein SHAM enthielt. Aus diesem Ergebnis wurde geschlußfolgert, daß diese Stämme spontane Mutanten sein könnten, und wurden SHAM1, SHAM2, SHAM3 und SHAM4 genannt.
Beispiel 2 Kolbenfermentation von resistenten Mutanten, SHAM1, SHAM2 und SHAM3
Um die Produktivität von Astaxanthin durch SHAM-resistente Mutanten, SHAM1, SHAM2 und SHAM3 zu bewerten, wurde die Fermentation in Schüttelgefäßen durchgeführt. Diese Mutanten und ihr Elternstamm ATCC96594 wurden aus frisch hergestellter Agar-Kultur zu 50 ml YPD-Medium in einem Prallgefäß mit einer Größe von 500 ml bei einer End-OD bei 660 nm von 0,05 inokuliert. Die Fermentation wurde bei 20°C bei 200 U/min durchgeführt. Bei einem geeigneten Intervall wurden 3 ml der Brühe abgezogen und hinsichtlich der Zellausbeute und des Astaxanthingehalts analysiert.
Die Zellausbeute wurde als OD bei 660 nm gemessen. Wie das Trockenzellgewicht wurde sie durch Abwiegen der Zellen, die aus 1,0 ml der Brühe stammten, nach dem Erhitzen bei 120°C über Nacht in 1,5 ml Mikrozentrifugationsröhrchen gemessen. Der Astaxanthingehalt von P. rhodozyma wurde mit dem HPLC-Verfahren nach der Extraktion von Carotinoiden aus den Zellen von P. rhodozyma durch Unterbrechung mit Glaskugeln folgendermaßen gemessen. Die Zellen, die aus 1 ml Brühe nach der Zentrifugation erhalten wurden, wurden zweifach mit destilliertem Wasser konzentriert und 10,0 g Glaskugeln wurden zu der Zellsuspension (0,5 ml) in ein bräunliches Teströhrchen (13,5 mm, 11 cm) zugegeben. Als nächstes wurden 1,5 ml Aceton/butyliertes Hydroxytoluol (BHT)/Wasser (45 mg BHT in 450 ml Aceton und 50 ml Wasser) zugegeben und dann wurde das Teströhrchen mit einer Horizontal-Tischschüttelmaschine für eine Stunde geschüttelt. Nach der Extraktion wurden 5 ml Aceton/BHT/Wasser, enthaltend eine geeignete Konzentration an Bixin (nacalai tesque, Kyoto, Japan), als interner Standard zugegeben. Der Überstand wurde hinsichtlich des Astaxanthingehalts mit dem folgenden HPLC-System analysiert (Hardware für HPLC-System wurde von Tosoh (Tokyo, Japan) bezogen).
HPLC-Säule; YMC-Pak ODS-A (6 mm, 150 mm (YMC, Inc., Milford, USA).
Temperatur; Raumtemperatur
Elutionsmittel; Acetonitril/Methanol/Isopropanol (85/10/5)
Injektionsvolumen; 10 Mikroliter
Fließgeschwindigkeit; 2,0 ml/Minute
Detektion; UV bei 471 nm
Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 zusammengefaßt. Alle Mutanten zeigten 50% höhere Produktivität von Astaxanthin als der Elternstamm ATCC96594. Aus diesem Ergebnis können einige Mutationen in diesen Mutanten auftreten, um die Inhibierung der alternativen Oxidaseaktivität durch Erhöhung der Astaxanthinproduktion zu kompensieren.
Tabelle 2 Produktivität von Astaxanthin durch SHAM-resistente Mutanten Astaxanthinproduktivität
Beispiel 3 Isolation von mRNA aus P. rhodozyma und Konstruktion der cDNA-Bibliothek
Um die cDNA-Bibliothek von P. rhodozyma zu konstruieren, wurde die gesamte RNA durch das Phenolextraktionsverfahren direkt nach der Zerstörung der Zellen isoliert und die mRNA aus dem P. rhodozyma-ATCC96594-Stamm wurde unter Verwendung von mRNA-Separationskit (Clontech) gereinigt.
Zunächst wurden die Zellen des ATCC96594-Stammes aus 10 ml der Zweitagekultur in YPD-Medium durch Zentrifugation (1500 × g für 10 min) geerntet und einmal mit Extraktionspuffer (10 mM Na-Zitrat/HCl (pH 6,2), enthaltend 0,7 M KCl) gewaschen. Nach dem Suspendieren in 2,5 ml Extraktionspuffer wurden die Zellen durch einen French-Presshomogenisator (Ohtake Works Corp., Tokyo, Japan) bei 1500 kgf/cm² zerstört und direkt mit dem Zweifachen des Volumens an Isogen (Nippon gene) gemäß des durch den Hersteller spezifizierten Verfahrens gemischt. In diesem Schritt wurden 400 μg der gesamten RNA wiedergewonnen.
Dann wurde diese gesamte RNA unter Verwendung des mRNA-Separationskits (Clontech) gemäß dem durch den Hersteller spezifizierten Verfahren gereinigt. Schließlich wurden 16 g der mRNA aus dem P. rhodozyma-ATCC96594-Stamm erhalten.
Um die cDNA-Bibliothek zu konstruieren, wurde CapFinder-PCR-cDNA-Konstruktionskit (Clontech) gemäß dem durch den Hersteller spezifizierten Verfahren verwendet. Ein Mikrogramm der gereinigten mRNA wurde für eine erste Strangsynthese, gefolgt von PCR-Amplifikation angewendet. Nach dieser Amplifikation durch PCR wurde 1 mg cDNA-Pool erhalten.
Beispiel 4 Klonen des partiellen AOX-Gens (alternative Oxidase-Gens) aus P. rhodozyma

Um ein partielles AOX-Gen aus P. rhodozyma zu klonen, wurde ein degeneriertes PCR-Verfahren genutzt. Die Spezies und Zugangszahl zur Datenbank, dessen Sequenz für die alternative Oxidase zur Mehrfachausrichtungsanalyse verwendet wurde (ClustalW, Thompson J. D., et al., Nucleic Acids Research, 22, 4673–4680, 1994), sind folgendermaßen.

Aspergillus niger	AB016540 (DDBJ/GenBank/EMBL)
Candida albicans	AF031229 (DDBJ/GenBank/EMBL)
Chlamydomonas reinhardtii	AF047832 (DDBJ/GenBank/EMBL)
Magnaporthe grisea	AB005144 (DDBJ/GenBank/EMBL)
Neurospora crassa	Q01355 (Swissprot)
Oryza sativa	AB004813 (DDBJ/GenBank/EMBL)

Pichia anomala	Q00912 (Swissprot)
Trypanosoma brucei brucei	Q26710 (Swissprot)

Zwei gemischte Primer, deren Nukleotidsequenzen konstruiert und synthetisiert wurden, wie in Tabelle 3 gezeigt, basierten auf der bekannten Sequenz der bekannten alternativen Oxidasegene aus anderen Sepzies. Tabelle 3 Sequenzprimer, verwendet beim Klonen des AOX-Gens

(N = A, C, G oder T; R = A oder G, Y = C oder T, M = A oder C)

Nach der PCR-Reaktion von 25 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 15 Sekunden unter Verwendung von ExTaq (Takara Shuzo) als DNA-Polymerase und cDNA-Pool, erhalten in Beispiel 1, als Matrize wurde das Reaktionsgemisch auf die Agarosegelelektrophorese aufgebracht. Ein PCR-Band, das eine gewünschte Länge aufweist, wurde wiedergewonnen und durch QIAquick (QIAGEN) gemäß dem durch den Hersteller spezifizierten Verfahren gereinigt und dann zu pCR2.1-TOPO (Invitrogen) ligiert. Nach der Umwandlung des kompetenten E. coli TOP10 wurden 6 weiße Kolonien ausgewählt und Plasmide wurden mit dem automatischen DNA-Isolationssystem isoliert. Infolge des Sequenzierens wurde herausgefunden, daß 3 Klone eine Sequenz aufwiesen, deren abgeleitete Aminosäuresequenz ähnlich den bekannten alternative Oxidase-Genen war. Dieser isolierte cDNA-Klon wurde als pAOX514 bezeichnet und für weitere Studien verwendet.
Beispiel 5 Isolation genomischer DNA aus P. rhodozyma
Um genomische DNA aus P. rhodozyma zu isolieren, wurde QIAGEN-genomischer Kit gemäß dem durch den Hersteller spezifizierten Verfahren verwendet.
Zunächst wurden die Zellen des P. rhodozyma-ATCC96594-Stammes aus 100 ml Übernachtkultur in YPD-Medium durch Zentrifugation (1500 × g für 10 min) geerntet und einmal mit TE-Puffer (10 mM Tris/HCl (pH 8,0), enthaltend 1 mM EDTA) gewaschen. Nach dem Suspendieren in 8 ml Y1-Puffer des QIAGEN-genomischen Kits wurde Lyticase (SIGMA, St. Louis, USA) bei der Konzentration von 2 mg/ml zugegeben, um die Zellen durch enzymatischen Abbau zu zerstören, und das Reaktionsgemisch wurde für 90 Minuten bei 30°C inkubiert und dann zu dem nächsten Extraktionsschritt übergeben. Schließlich wurden 20 μg genomische DNA erhalten.
Beispiel 6 Southern-Blot-Hybridisierung unter Verwendung von pAOX514 als Probe
Southern-Blot-Hybridisierung wurde durchgeführt, um ein genomisches Fragment, das das AOX-Gen aus P. rhodozyma enthält, zu klonen. Zwei Mikrogramm der genomischen DNA wurden durch EcoRI digeriert und der Agarosegelelektrophorese unterzogen, gefolgt von der Säure- und Basenbehandlung. Die denaturierte DNA wurde auf eine Nylonmembran (Hybond N⁺, Amersham, Buckinghamshire, UK) unter Verwendung von Transblot (Joto Rika, Tokyo, Japan) für eine Stunde übertragen. Die DNA, die auf die Nylonmenbran übertragen wurde, wurde durch eine Wärmebehandlung (80°C, 90 Minuten) fixiert. Eine Probe wurde durch Markieren einer Matrizen-DNA (EcoRI-digeriertes pAOX514) mit DIG-Multipriming-Verfahren (Boehringer Mannheim) hergestellt. Die Hybridisierung wurde mit dem durch den Hersteller spezifizierten Verfahren durchgeführt. Infolgedessen wurde ein hybridisiertes Band in dem Bereich von 5,5 bis 7,0 Kilobasen (kb) visualisiert.
Beispiel 7 Klonen eines genomischen Fragments, enthaltend AOX-Gen
Vier Mikrogramm der genomischen DNA wurden durch EcoRI digeriert und der Agarosegelelektrophorese unterzogen. Dann wurden DNAs, deren Längen in dem Bereich von 5,0 bis 7,0 kb liegen, durch QIAEX II-Gelextraktionskit (QIAGEN) gemäß dem durch den Hersteller spezifizierten Verfahren wiedergewonnen. Die gereinigte DNA wurde zu 0,5 μg EcoRI-digeriertem und CIAP-(Kalbsdarm-Alkaliphosphatase)-behandelten lambda-gt11 (Clontech) bei 16°C über Nacht ligiert, und durch Gigapack III Goldverpackungsextrakt (Stratagene) verpackt. Das verpackte Extrakt wurde dem E. coli-Y 1090-Stamm infiziert und mit NZY-Medium, das auf LB-Agarmedium gegossen wurde, überzogen. Etwa 6000 Plaques wurden unter Verwendung von EcoRI-digeriertem pAOX514 als Probe gescreent. Ein Plaque wurde zu der markierten Probe hybridisiert.
Dieses lambda-gt11-Derivat, enthaltend das vermeintliche AOX-Gen aus P. rhodozyma, wurde unter Verwendung des Wizard-lambda-Präparations-DNA-Reinigungssystems (Promega) hergestellt. Als Folge der Digestion durch EcoRI wurde offenbart, daß dieses lambda-gt11-Derivat 6 kb EcoRI-Insert enthielt. Als nächstes wurde PCR unter Verwendung dieses lambda-gt11-Derivats als Matrize und zwei Primern, aox3 und aox5 als Primer, durchgeführt. Infolge von PCR unter denselben PCR-Bedingungen, wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde erwartungsgemäß ein 0,3-kb-Band erhalten. Es wurde daraus geschlossen, daß dieses lambda-gt11-Derivat vermeintliches AOX-Gen aus P. rhodozyma enthalten kann. 6,0 kb Insert-EcoRI-Fragment in diesem lambda-gr11-Derivat wurden unter Verwendung von QIAquick (QIAGEN) gereinigt und dem Subklonen in pOCUS-2-Vektor (Novagen) unter Verwendung von DH5alpha als Wirtsstamm unterzogen, und ergab pOCUSAOX607.
Beispiel 8 Sequenzieren eines genomischen Fragments, enthaltend AOX-Gen
pOCUSAOX607 wurde zu den kompetenten gamma-delta-Donorzellen übertragen und zur Herstellung von Sequenzierungsderivaten, die für das Locus-Pocus-System (Novagen) verwendet wurden, verwendet. Dem Verfahren zur Herstellung von Sequenzierungsderivaten folgte das Protokoll, geliefert vom Hersteller. Als Sequenzierungsprimer wurden Cy5-markierte Primer, deren Sequenzen in Tabelle 4 aufgelistet sind, synthetisiert und zum Sequenzieren unter Verwendung von AutoCycle-Sequenzierungskit (Pharmacia) verwendet.
Tabelle 4 Sequenz von Primern, verwendet beim Sequenzieren von AOX-Gen
Infolge des Sequenzierens wurde die Nukleotidsequenz, umfassend 2561 Basenpaare des genomischen Fragments, enthaltend AOX-Gen aus P. rhodozyma, bestimmt.
Die Kodierungsregion war in 1206 Basenpaaren, die aus 10 Exons und 9 Introns bestanden. Die Introns wurden alle durch die Kodierungsregion ohne 5'- oder 3'-Neigung dispergiert. Unter Verwendung von genetischer Analysesoftware, GENETYX-SV/RC (Software Development Co., Ltd., Tokyo, Japan) Version 4.0.1 wurde herausgefunden, daß das offene Leseraster aus 402 Aminosäuren (SEQ ID Nr: 1) besteht, deren Sequenz zu der bekannten Aminosäuresequenz der alternativen Oxidase von anderen Spezies stark ähnlich ist (51,5% Identität zur alternativen Oxidase aus Aspergillus niger). Eine Dehnung der hydrophoben Aminosäurereste am Aminoende, von dem erwartet wird, das es eine Alpha-Helixstruktur bildet, zeigt, daß die Aminoendregion eine membrandurchdringende Domäne oder Transitpeptid für Mitochondrien sein kann. Das PSORTII-Programm (http://psort.nibb.ac.jp:8800/) sagt voraus, daß dieses Protein ein Mitochondrienprotein mit einem Vorhersagewert von 82,6% sein kann.
Beispiel 9 Klonen der Upstream-Region vom AOX-Gen
Das Klonen der 5'-nachbarständigen Region des AOX-Gens wurde unter Verwendung des Genome-Walker-Kits (Clontech) durchgeführt, da es scheint, daß pAOX514 keine ausreichende Länge aufweisen kann, um den Promotor für das AOX-Gen zu enthalten. Zunächst wurden die PCR-Primer, deren Sequenzen in Tabelle 5 gezeigt wurden, synthetisiert.
Tabelle 5 Sequenz von Primern, verwendet beim Klonen von 5'-nachbarständiger Region vom AOX-Gen
Protokolle für die Bibliothekskonstruktion und die PCR-Bedingungen waren dieselben wie die, die durch den Hersteller spezifiziert wurden. Die Herstellung der genomischen DNA, erhalten in Beispiel 5, wurde als PVR-Matrize verwendet. Die PCR-Fragmente, die eine ScaI-Stelle an dem 5'-Ende (1,2 kb) aufwiesen, und die eine DraI-Stelle an dem 5'-Ende (3,0 kb) aufwiesen, wurden wiedergewonnen und zu pCR2.1-TOPO unter Verwendung von E. coli TOP10 als Wirtsstamm geklont. Infolge der Sequenzierung von jedem der 2 unabhängigen Klone aus beiden Konstrukten wurde bestätigt, daß die 5'-nachbarständige Region des AOX-Gens geklont wurde. Der Klon, der durch das SacI-Konstrukt in dem obigen Experiment erhalten wurde, wurde als pAOXSc702 bezeichnet und für weitere Studien verwendet. Basierend auf der Sequenz des Insertfragments in pAOXSc702 wurden die 4 PCR-Primer, deren Sequenzen in Tabelle 6 aufgelistet sind, synthetisiert.
Tabelle 6 Sequenz von Primern, verwendet zum Klonen von AOX-Promotorregion
Die PCR-Bedingung war dieselbe, wie in Beispiel 4 gezeigt, außer daß die HF-Polymerase (Clontech) als DNA-Polymerase verwendet wurde. Bei der Kombination von aox15 und aox16 wurde das Fragment, das 0,7 kb in seiner Länge aufwies, amplifiziert. Bei der Kombination von aox17 und aox18 wurde das Fragment, das 0,5 kb in seiner Länge aufwies, amplifiziert. Diese Fragmente wurden zu pCR2.1-TOPO und transformierten E. coli TOP10 geklont. Die Plasmide wurden aus 6 unabhängigen weißen Kolonien hergestellt und dem Sequenzieren unterzogen. Infolgedessen wurden die erwarteten Klone, deren Sequenzen des Insertfragments identisch miteinander waren, erhalten. Bei der Kombination von aox15 und aox16 wurde der erhaltene Klon als pAOX714#1516 bezeichnet. Bei der Kombination von aox17 und aox18 wurde der erhaltene Klon als pAOX714#1718 bezeichnet. Infolge der Seqenzierung wurden die Sequenzen von pAOX714#1516 und pAOX714#1718, die die Promotorregion für das AOX-Gen aus P. rhodozyma enthielten, bestimmt. Die bestimmte Sequenz, die den AOX-Promotor enthielt, war 1406 Basenpaare lang.
Durch Kombinieren der Sequenz, die in Beispiel 8 und 9 erhalten wurde, wurde bestimmt, daß die Nukleotidsequenz (3,7 kb) das AOX-Gen und seinen Promotor und Terminator (SEQ ID Nr: 2) enthielt.
Beispiel 10 Konstruktion von Antisense-Plasmid für das AOX-Gen
Ein Antisense-Genfragment, welches das gesamte Strukturgen für das AOX-Gen abdeckt, wurde durch das PCR-Verfahren amplifiziert und dann zu dem Integrationsvektor geklont, in dem das Antisense-AOX-Gen durch AST-Promotor in P. rhodozyma transkribiert wurde.
Tabelle 7 Sequenz von Primern, verwendet als Antisensekonstruktion für AOX-Gen
Beide Primer, aox101 und 102, wiesen eine asymmetrische Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym, SfiI (GGCCNNNNNGGCC) auf, aber ihre asymmetrische Hang-Over-Sequenz war anders. Dies kann ein gerichtetes Klonen zum Expressionsvektor, der dieselbe asymmetrische Sequenz bei ihrer Ligationsequenz aufweist, ermöglichen.
PCR wurde unter Verwendung der HF-Polymerasse (Clontech) als Taq-Polymerase und der cDNAs, hergestellt in Beispiel 3, als Matrize unter folgenden Bedingungen: 30 Zyklen von 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden durchgeführt. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde gereinigt und zu dem pCR2.1-TOPO-Vektor geklont. Infolge der Sequenzierung wurde offenbart, daß ein Klon das korrekte Fragment aufwies, und dieser Klon wurde als pAOX1007#0102 bezeichnet. Die Sequenz des Antisense-Fragments für das AOX-Gen wird in SEQ ID Nr: 15 aufgelistet.
Für das Promotor- und Terminatorfragment, das die Transkription des Antisense-AOX-Gens antreibt, wurden der AST-Promotor und -Terminator aus dem Chromosom, hergestellt in Beispiel 5, geklont.
Tabelle 8 Sequenz von Primern, verwendet zum Klonen von AST-Promotor und -Terminator
Die PCR-Bedingung war folgendermaßen: 25 Zyklen von 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 90 Sekunden. Bei der Kombination von ast49 und ast50 wurde das Fragment, das 1,25 kb in seiner Länge aufwies, amplifiziert. Bei der Kombination von ast36 und ast37 wurde das Fragment, das 0,3 kb in seiner Länge aufwies, amplifiziert. Diese Fragmente wurden zu pCR2.1-TOPO und transformierten E. coli TOP10 geklont. Die Plasmide wurden aus 6 unabhängigen weißen Kolonien hergestellt und der Sequenzierung unterzogen. Infolgedessen wurden die Klone, die eine korrekte Sequenz vom AST-Promotor und -Terminator ( EP 1 035 206 A1 ) aufwiesen, für weitere Studien ausgewählt (pUAST407 für AST-Promotor und pAST526#3637 für AST-Terminator).
Als nächstes wurde die AST-Terminatorsequenz zu der G418-resistenten Kassette durch Ligieren von NotI-plus KpnI-digeriertem pAST526#3637 und KpnI- plus SacI-digeriertem pG418Sa330 ( EP 1 035 206 A1 ) zu NotI- und SacI-digeriertem pBluescriptII SK- (Stratagene) kondensiert. Das Ligationsgemisch wurde zu den kompetenten KB822-Zellen umgewandelt. Infolge der Restriktionsanalyse wurde ein Klon (pUAST418), der die korrekte Struktur aufwies, für weitere Studien ausgewählt.
Dann wurden 3,1 kb des SacI-Fragments, enthaltend ribosomalen DNA-Lokus (rDNA) (Wery et al., Gene, 184, 89–97, 1997) in den Abwärtsstrom der G418-Kassette von pUAST418 eingeführt. Das rDNA-Fragment existiert in Mehrfachkopien an dem Chromosom der Eukaryote. Der Integrationsvorgang über das rDNA-Fragment führt zur mehrfachkopierten Integration an dem Chromosom des verwendeten Wirts, und dies ermöglicht die Überexprimierung der fremden Gene, die in dem Expressionsvektor untergebracht sind. Für diesen Zweck wurde das SacI-Fragment aus pGBPh9-enthaltendem rDNA-Gen zu SacI-digeriertem und Bakterien-Alkaliphosphatase-behandeltem pUAST418 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zu den kompetenten KB822-Zellen umgewandelt. Infolge der Restriktionsanalyse wurden zwei Klone, worin das rDNA-Fragment in unterschiedliche Richtung voneinander eingeführt wurde, für weitere Studien ausgewählt (pURDNA421 und pURDNAR421).
Anschließend wurde der AST-Promotor in den Aufwärtsstrom des AST-Terminators eingeführt, um den Expressionsvektor zu konstruieren, der in P. rhodozyma fungiert. 1,0 kb NotI- und BglII-Fragment von pUAST407 und 0,25 kb Fragment von BglII- und PstI-Fragment von pUAST407 wurden zu NotI- und Sse83871-digeriertem pURD-NA421 oder pURDNAR421 ligiert. Die kompetenten KB822-Zellen wurden durch das Ligationsgemisch umgewandelt, und jeweils 6 resultierende Kolonien wurden der Restriktionsanalyse unterzogen. Die Klone, die die korrekte Insertion des AST-Promotors aufwiesen, wurden für weitere Studien miteinander ausgewählt (pF718 und pR718, die die entgegengesetzte Richtung des rDNA-Fragments aufwiesen).
Schließlich wurde das Antisense-AOX-Konstrukt durch Einführen der 1,2 kb des SfiI-Fragments von pAOX1007#0102 in das SfiI-digerierte pF718 oder pR718 vervollständigt. Die resultierenden Plasmide wurden als pFAOX828 und pRAOX828 bezeichnet.
Beispiel 11 Transformation von P. rhodozyma mit AOX-Antisense-Vektor
Die AOX-Antisense-Vektoren, pFAOX828 und pRAOX828, wurden zu P. rhodozyma-Wildtyp-Stamm, ATCC96594, umgewandelt. Die biolistische Transformation wurde gemäß dem Verfahren, das in Methods in Molecular Biology (Johnson et al., 53, 147–153, 1996) beschrieben wird, durchgeführt. Der P. rhodozyma-Stamm, ATCC96594, wurde in YPD-Medium zur stationären Phase kultiviert. Nach der Zentrifugation der Brühe wurden die Zellen 10fach mit sterilisiertem Wasser konzentriert, und 200 μl der Zellsuspension wurden auf dem YPD-Medium, enthaltend 100 μg/ml Geneticin und 0,75 M D-Mannitol und D-Sorbitol, verteilt. Fünf Mikrogramm Plasmide wurden auf 1,5 mg der 0,9 μm Goldteilchen aufgeschichtet und als Donor-DNAs für die biolistische Transformation verwendet. Eine Geneticin-resistente Kolonie, die mit pFAOX828 umgewandelt wurde und verbesserte Pigmentierung zeigte, wurde zur weiteren Charakterisierung im Hinblick auf ihre Produktivität von Astaxanthin und ihrer verringerten Aktivität der alternativen Oxidase, die durch das AOX-Gen kodiert wurde, ausgewählt.
Beispiel 12 Charakterisierung des pFAOX828-Integranten, abgeleitet von P. rhodozyma, ATCC96594
Die P. rhodozyma-Transformante, ATCC96594::pFAOX828, zusammen mit seinem Elternstamm ATCC96594 wurde in 50 ml YPD-Medium in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben bei 20°C für 3 Tage unter Verwendung seiner Samenkultur, die in 10 ml YPD-Medium in Teströhrchen (21 mm im Durchmesser) bei 20°C für 3 Tage wuchs, kultiviert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten, beispielsweise bei 24, 43 und 65 Stunden nach der Inokulierung, wurde ein geeignetes Volumen der Kulturbrühe abgezogen und zur Analyse ihres Wachstums, der Produktivität von Astaxanthin und ihrer Sauerstoffaufnahmeaktivität unter Gegenwart oder Abwesenheit von KCN verwendet. Der 24-, 43- und 65-Stunden-Zeitpunkt entspricht der Wachstumsphase der späten log-Phase, mittelstationär bzw. spätstationär.
Zur Analyse des Wachstums wurde die optische Dichte bei 660 nm unter Verwendung des UV-1200-Photometers (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) zusätzlich zur Bestimmung der getrockneten Zellmasse durch Trocknen der Zellen, die aus 1 ml Brühe nach der Mikrozentrifugation bei 100°C für einen Tag stammen, gemessen.
Zur Analyse des Gehalts von Astaxanthin und der gesamten Carotinoide wurden die Zellen aus 1,0 ml der Brühe nach der Mikrozentrifugation geerntet und für die Extraktion der Carotinoide aus Zellen von P. rhodozyma durch Zerstörung mit Glaskugeln verwendet. Nach der Extraktion wurden die zerstörten Zellen dann durch Zentrifugation entfernt und das Resultierende wurde hinsichtlich des Carotinoidgehalts mit HPLC analysiert. Die verwendeten HPLC-Bedingungen waren folgendermaßen;
HPLC-Säule; Chrompack Lichrosorb si-60 (4,6 mm, 250 mm)
Temperatur; Raumtemperatur
Elutionsmittel; Aceton/Hexan (18/82), unter Hinzufügung von 1 ml/l Wasser zu dem Elutionsmittel
Injektionsvolumen; 10 μl
Fließgeschwindigkeit; 2,0 ml/Minute
Detektion; UV bei 450 nm
Eine Referenzprobe von Astaxanthin wurde von F. Hoffmann-La Roche AG (Basel, Schweiz) erhalten.
Zur Bestimmung der Respirationsaktivität zur Messung der Sauerstoffaufnahmeaktivität in Gegenwart oder Abwesenheit von KCN wurden das DO-Metermodel, B-505 und die DO-Probe, GU-BM, hergestellt von Iijima Electronics Corporation (Aichi, Japan), verwendet. Die geernteten Zellen wurden mit 0,5 M KPB (pH 7,4) resuspendiert. Dann wurden 200 μl dieser Zellsuspension mit 2,3 ml Wasser in der Kammer der DO-Analyse verdünnt. Die Messung wurde durch die Addition von 0,2 ml 1 M Glukose in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,48 mM KCN initiiert.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 9 zusammengefaßt. Tabelle 9
(Aktivität der Respiration wird durch nmol O₂-Aufnahme/min × mg getrocknete Zellen ausgedrückt.)
Wie in Tabelle 9 gezeigt, zeigte die Antisense-AOX-Transformante ATCC96594::pFAOX828 ähnliche Zellausbeute wie der Elternstamm, ATCC96594 bei 43 Stunden Kultur, obwohl er langsameres Wachstum bei 24 Stun den zeigte. Der Astaxanthin- und Carotinoidgehalt der Transformante erhöhte sich um 15%. Im Hinblick auf die Respirationsaktivität wies die Transformante ähnliche Aktivität der KCN-empfindlichen Respiration zu seinem Wirtsstamm auf (95%), aber die KCN-resistente Respiration, die durch die alternative Oxidase vermittelt wurde, wurde auf 20-%-Niveaus seines Wirtsstammes bei 24 Stunden Kultur verringert und völlig bei 43 Stunden Kultur beeinträchtigt.
Aus diesem Ergebnis wurde gezeigt, daß die Verringerung der alternativen Oxidaseaktivität, die die KCN-resistente Respiration vermittelt, zu der Überproduktion von Astaxanthin und Carotinoiden in P. rhodozyma führen kann.
Sequenzauflistung

Claims

Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden, umfassend die Behandlung eines Elternorganismus, der Carotinoide produzieren kann, um eine Reduktion einer alternativen Oxidaseaktivität zu induzieren, und Auswählen eines Organismus, dessen Produktion von Carotinoiden erhöht ist, und Kultivieren des ausgewählten Organismus.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der ausgewählte Organismus ein Mutantenstamm ist, dessen Carotinoidproduktivität mit Hilfe der Alteration der Resistenz gegenüber einem alternative Oxidase-Inhibitor gesteigert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der ausgewählte Organismus eine Mutante ist, die gegen einen alternative Oxidase-Inhibitor resistent ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Organismus zu dem Reich der Protista oder Fungi, stärker bevorzugt zu der Gattung Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea oder Phycomyces gehört.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der Organismus ein Stamm von Phaffia rhodozyma ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei der Organismus ein Stamm ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DSM, 13429, 13430 und 13431.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei der alternative Oxidase-Inhibitor aus der Gruppe, bestehend aus n-Propylgallat und Salicylhydroxamsäure, ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Mutantenstammes, der Carotinoide in einem erhöhtem Niveau in bezug auf den Elternorganismus produzieren kann, umfassend das Kultivieren eines Elternorganismus, der Carotinoide produzieren kann, unter der Bedingung zur Reduktion einer alternativen Oxidaseaktivität und Auswählen eines Organismus, der Carotinoide in einem höheren Niveau als der Elternorganismus produzieren kann.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Bedingung zur Reduktion einer alternativen Oxidaseaktivität die Gegenwart eines alternative Oxidase-Inhibitors umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der alternative Oxidase-Inhibitor aus der Gruppe, bestehend aus n-Propylgallat und Salicylhydroxamsäure, ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der Organismus zu dem Reich der Protista oder Fungi, stärker bevorzugt zu der Gattung Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea oder Phycomyces gehört.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei der Organismus ein Stamm von Phaffia rhodozyma ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei der ausgewählte Organismus ein Stamm aus der Gruppe, bestehend aus DSM, 13429, 13430 und 13431, ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der ausgewählte Organismus ein rekombinanter Organismus ist, und wobei die Genexpression der alternativen Oxidase verändert wird, um die Wirksamkeit im Vergleich zu dem Wirtsorganismus zu verringern.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Genexpression der alternativen Oxidase mit Hilfe der Technik, ausgewählt aus Antisense-Technologie, ortsgerichteter Mutagenese, chemischer Mutagenese usw., verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Organismus zu dem Reich der Protista oder Fungi, stärker bevorzugt zu der Gattung Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea oder Phycomyces gehört.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei der Organismus ein Stamm von Phaffia rhodozyma ist.
Rekombinanter Organismus, der Carotinoide in einem erhöhtem Niveau in bezug auf seinen Elternorganismus produzieren kann, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Genexpression der alternativen Oxidase verändert ist, um die Wirksamkeit im Vergleich zu dem Elternorganismus zu verringern, wobei der Organismus zu der Gattung Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea oder Phycomyces gehört.
Rekombinanter Organismus nach Anspruch 18, wobei die Genexpression der alternativen Oxidase mit Hilfe der Technik, ausgewählt aus Antisense-Technologie, ortsgerichteter Mutagenese, chemischer Mutagenese usw., verändert wird.
Rekombinanter Organismus nach einem der Ansprüche 18 bis 19, wobei der Organismus ein Stamm von Phaffia rhodozyma ist.
Rekombinante DNA-Sequenz, die für eine alternative Oxidase kodiert, die aus einem Organismus stammt, der Carotinoide produzieren kann, wobei der Organismus ein Stamm von Phaffia rhodozyma ist und die Sequenz SEQ ID Nr: 2 ist, oder eine Identität mit SEQ ID Nr: 2 von höher als 55% aufweist.
Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 21, deren abgeleitete Aminosäuresequenz SEQ ID Nr: 1 ist oder eine Identität mit SEQ ID Nr: 1 von höher als 51,5% aufweist.