DE60005871T2

DE60005871T2 - Astaxanthin Synthetase

Info

Publication number: DE60005871T2
Application number: DE60005871T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Kamakura-shi Hoshino; Kazuyuki Fujisawa-shi Ojima; Yutaka Fujisawa-shi Setoguchi
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2020-03-04
Also published as: ES2206095T3; JP2000262294A; US7074587B2; US6365386B1; DK1035206T3; JP4469053B2; CA2298869A1; CA2298869C; KR20010020655A; ATE252155T1; CN1266101A; CN1170935C; EP1035206B1; US20030077691A1; DE60005871D1; EP1035206A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die rekombinante Herstellung von Carotinoiden und biologischen Materialien, die dafür nützlich sind.
Phaffia rhodozyma (P. rhodozyma) ist ein carotinogener Hefestamm, der Astaxanthin erzeugt. Astaxanthin ist in einer großen Vielzahl von Organismen verbreitet, wie Tieren (Vögeln, wie Flamingo und Scharlachibis, und Fischen, wie Regenbogenforelle und Lachs), Algen und Mikroorganismen. Es ist auch anerkannt, dass Astaxanthin eine starke Antioxidationseigenschaft gegenüber dem Sauerstoffradikal hat, wovon erwartet wird, dass es für die pharmazeutische Verwendung zutrifft, um lebende Zellen gegen einige Krankheiten, wie Krebs, zu schützen. Außerdem nimmt der industrielle Bedarf für Astaxanthin als färbendes Reagenz zu, insbesondere in der Industrie für Zuchtfisch, wie Lachs, da Astaxanthin den Tieren eine unterscheidbare orangerote Färbung vermittelt und die Verbrauchererwartung auf dem Markt erfüllt.
P. rhodozyma ist als carotinogener Hefestamm bekannt, der Astaxanthin erzeugt. Anders als die andere carotinogene Hefe, Rhodotorula, kann P. rhodozyma einige Zucker, wie D-Glucose fermentieren. Dies ist ein wichtiges Merkmal vom Standpunkt der industriellen Anwendung aus gesehen. In einer kürzlich veröffentlichten taxonomischen Untersuchung wurde ein sexueller Zyklus bei P. rhodozyma festgestellt und sein telemorphes Stadium wurde unter dem Namen Xanthophyllomyces dendrorhous angegeben (W. I. Golubev; Yeast 11, 101–110, 1995). Einige Untersuchungen zur Stammverbesserung, um Überproduzierer von Astaxanthin aus P. rhodozyma zu erhalten, wurden durchgeführt, aber diese Bemühungen waren darauf beschränkt, die Methode der üblichen Mutagenese und Protoplastenfusion in diesem Jahrzehnt anzuwenden. Kürzlich entwickelten Wery et al. ein Wirtsvektorsystem unter Verwendung von P. rhodozyma, bei dem ein nicht replizierbares Plasmid verwendet wurde, um in Mehrfachkopien in das Genom der ribosomalen DNA von P. rhodo zyma integriert zu werden (Wert' et a1., Gene, 184, 89–97, 1997). Verdoes et al. berichteten über mehrere verbesserte Vektoren, um einen Transformanten von P. rhodozyma zu erhalten ebenso wie dessen drei carotinogene Gene, die Enzyme codieren, die die Reaktionen von Geranylgeranylpyrophosphat zu β-Carotin katalysieren (WO 97/23633).
Ein spezifischer biosynthetischer Weg für Carotinogenese zweigt von dem allgemeinen Isoprenoidweg ab an dem Punkt eines wichtigen Zwischenprodukts, Farnesylpyrophosphat (FPP) (1). FPP und IPP werden von Geranylgeranylpyrophosphat(GGPP)-Synthase kondensiert, die von crtE in P. rhodozyma codiert wird, um GGPP zu erzeugen. GGPP wird dann in β-Carotin umgewandelt durch aufeinander folgende Reaktion eines Enzyms, das doppelt als Phytoensynthase und Lycopencyclase wirkt, die von crtBY codiert wird, und Phytoendesaturase, die von crtI codiert wird.
Bei Bakterien wurden Enzyme und Gene, die an der Xanthophyllbildung beteiligt sind, isoliert und im Detail charakterisiert. β-Carotinhydroxylase, die von crtZ codiert wird, ist an den beiden Stufen der Hydroxylierung für den β-Iononring von β-Carotin an beiden Enden beteiligt. Das crtZ-Gen wurde aus einer Vielzahl von Organismen kloniert, unter anderem Erwinia uredovora (Misawa et a1., J. Bacteriol., 172, 6704– 6712, 1990), Flavobacter-Arten (L. Pasamontes et a1., 185 (1), 35–41, 1997) und Agrobacterium aurantiacum (Misawa et al., J. Bacteriol., 177 (22), 6575–6584, 1995). β-Carotin-Ketolase, die von crtW codiert wird, katalysiert die beiden Stufen der Einführung der Oxogruppe in den β-Iononring von β-Carotin an beiden Enden. Kajiwara et al. klonierten und sequenzierten das bkt-Gen entsprechend crtW in Eubacterien von Haematococcus bluvialis (Kajiwara et a1., P. Mol. Biol., 29, 343–352, 1995). Harker et al. klonierten und sequenzierten auch das crtO-Gen, entsprechend crtW in Eubacterien aus Synechococcus PCC7942 (Harker et al., FEBS Letters, 404, 129–134, 1997). Beide Enzyme, die Hydroxylase und die Ketolase, haben eine breite Substratspezifizität und dies stellt die Bildung einer Vielzahl von Xantophyllen sicher in dem Fall, dass beide Enzyme gleichzeitig abhängig von den Reaktionsbedingungen reagieren (1).
Wie oben beschrieben, wurden alle Gene, die an der Bildung von β-Carotin aus FPP beteiligt sind, isoliert, aber die Enzyme und Gene, die an der letzten Stufe der Xantophyllbildung aus β-Carotin beteiligt wären, wurden nicht auf Protein- und DNA-Ebene in P. rhodozyma identifiziert. Obwohl Johnson et al. (Crit. Rev. Biotechnol., 11 (4), 297–326, 191) die Existenz von zwei unabhängigen Stoffwechselwegen der Astaxanthinbildung vorschlugen in der Annahme, dass einige der Xantophyllverbindungen, die von ihnen isoliert wurden, Zwischenprodukte der Astaxanthinbiosynthese wären, konnten zwei verschiedene Wege nicht bewiesen werden, da Enzyme und Gene, die an solchen Stoffwechselwegen beteiligt sind, nicht isoliert werden konnten. Weiterhin kann nicht ausgeschlossen werden, dass diese Xantophyllverbindungen durch ein Versuchsartefakt in der Isolierungsstufe dieser Verbindungen entstanden. Da eine Mutante aus P. rhodozyma, die Zwischenprodukte auf dem biosynthetischen Weg von β-Carotin zu Astaxanthin ansammelt, nicht isoliert werden konnte, war es schwierig, den Biosyntheseweg von β-Carotin zu Astaxanthin aufzuklären.
Die Erfindung betrifft ein Gen und Enzym, das an der letzten Stufe der Astaxanthinbiosynthese von β-Carotin zu Astaxanthin beteiligt ist.
Die vorliegende Erfindung liefert isolierte DNA, insbesondere cDNA, die eine Nucleotidsequenz enthält, die Astaxanthinsynthase codiert, die an der Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin in P. rhodozyma beteiligt ist, wie das AST-Gen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das klonierte DNA-Fragment dadurch gekennzeichnet werden, dass

(a) die Nucleotidsequenz das Enzym mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 beschrieben, codiert oder
(b) die Nucleotidsequenz eine Variante des Enzyms codiert, die ausgewählt ist aus (i) einer allelischen Variante oder (ii) einem Enzym mit einer oder mehreren Aminosäure-Additionen, -Insertionen, -Deletionen und/ oder -Substitutionen und mit der angegebenen Enzymaktivität.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das isolierte cDNA-Fragment von einem Gen von Phaffia rhodozyma abgeleitet sein und ist ausgewählt aus:

(i) einer cDNA-Sequenz, wie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt;
(ii) einer isocodierenden oder allelischen Variante der cDNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist und
(iii) einem Derivat einer cDNA, die in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist mit Addition, Insertion, Deletion und/oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide, die ein Polypeptid mit der Enzymaktivität codiert.

In einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf die oben beschriebene isolierte cDNA gerichtet, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Nucleotidsequenz:

(i) eine in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Nucleotidsequenz;
(ii) eine Nucleotidsequenz, die aufgrund der Degeneriertheit oder Degeneration des genetischen Codes eine Astaxanthinsynthase mit der gleichen Aminosäuresequenz codiert, die von Nucleotidsequenz (i) codiert wird und
(iii) eine Nucleotidsequenz ist, die mit dem Komplement der Nucleotidsequenz von i) oder ii) unter Standardhybridiserungsbedingungen hybridisiert.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das isolierte genomische DNA-Fragment von einem Gen von Phaffia rhodozyma abgeleitet sein und ist ausgewählt aus:

(i) einer genomischen DNA-Sequenz, wie in SEQ ID Nr. 3 dargestellt;
(ii) einer isocodierenden oder allelischen Variante der genomischen DNA-Sequenz, die durch SEQ ID Nr. 3 dargestellt wird und
(iii) einem Derivat einer genomischen DNA-Sequenz, die durch SEQ ID Nr. 3 dargestellt wird mit Addition, Insertion, Deletion und/oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide, die ein Polypeptid mit der Enzymaktivität codiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf die oben beschriebene isolierte genomische DNA gerichtet, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Nucleotidsequenz:

(i) eine in SEQ ID Nr. 3 dargestellte Nucleotidsequenz;
(ii) eine Nucleotidsequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes eine Astaxanthinsynthase mit der gleichen Aminosäuresequenz codiert, wie die von der Nucleotidsequenz in (i) codierte und
(iii) eine Nucleotidsequenz, die mit dem Komplement der Nucleotidsequenz von i) oder ii) unter Standardhybridisierungsbedingungen hybridisiert, ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert ein rekombinantes Polypeptid mit einer Astaxanthinsynthaseaktivität, das an der Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin in P. rhodozyma beteiligt ist, das erhältlich ist durch Expression des oben angegebenen klonierten DNA-Fragments.
Eine bevorzugte Ausführungsform des rekombinanten Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass

(a) das Polypeptid eine Aminosäuresequenz hat, wie in SEQ ID Nr. 1 beschrieben, oder
(b) das Polypeptid eine Variante des in (a) definierten Peptids ist, die ausgewählt ist aus (i) einer allelischen Variante oder (ii) einem Enzym mit Addition, Insertion, Deletion und/oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren und mit der angegebenen Enzymaktivität.

Die vorliegende Erfindung ist daher auch auf Varianten der Polypeptide des vorliegenden Falls gerichtet. Solche Varianten werden auf Basis der Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung definiert durch Addition, Insertion, Deletion und/ oder Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste solcher Sequenzen, wobei solche Derivate immer noch die gleiche Art von enzymatischer Aktivität haben, wie die entsprechenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder das Ergebnis des wohl bekannten Phänomens der allelischen Variation sind. Solche Aktivitäten können mit jedem im Stand der Technik bekannten Test oder mit hier spezifisch beschriebenen Tests gemessen werden. Solche Varianten können entweder durch im Stand der Technik bekannte chemische Peptidsynthese oder mit rekombinanten Mitteln auf Basis der hier offenbarten DNA-Sequenzen mit im Stand der Technik bekannten Methoden, z. B. denen von Sambrook et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2. Ausg. 1989) offenbarten hergestellt werden. Aminosäureaustausche in Proteinen und Peptiden, die die Aktivität solcher Moleküle nicht allgemein ändern, sind im Stand der Technik bekannt und werden z. B. von H. Neurath und R. L. Hill in "The Proteins" (Academix Press, New York, 1979, siehe insbesondere 6, S. 14) beschrieben. Die am häufigsten auftretenden Austausche sind: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Art, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly ebenso wie umgekehrt.
Weiterhin ist die vorliegende Erfindung nicht nur auf die DNA-Sequenzen, die z. B. in dem Sequenzprotokoll offenbart sind, sowie deren komplementäre Stränge gerichtet, sondern auch auf solche, die diese Sequenzen enthalten, DNA-Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit solchen Sequenzen oder Fragmenten davon hybridisieren und DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unter Standardbedingungen nicht mit solchen Sequenzen hybridisieren, aber für Polypeptide codieren mit exakt der gleichen Aminosäuresequenz.
"Standardbedingungen" zur Hybridisierung bedeutet in diesem Zusammenhang die Bedingungen, die allgemein von einem Fachmann auf diesem Gebiet verwendet werden, um spezifische Hybridisierungssignale nachzuweisen und die z. B. von Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben werden oder bevorzugt so genannte stringente Hybridisierung und nicht stringente Waschbedingungen oder bevorzugter so genannte stringente Hybridisierungs- und stringente Waschbedingungen, mit denen der Fachmann auf diesem Gebiet vertraut ist und die z. B. bei Sambrook et al. beschrieben werden (siehe oben) oder bevorzugter so genannte mittelstringente Bedingungen, z. B. unter Verwendung des DIG-(Digoxigenin)-Markierungskits und des Lumineszenznachweiskits von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland) gemäß dem vom Hersteller angegebenen Protokoll unter Verwendung folgender Hybridisierungslösung:
Formamid (WAKO, Osaka, Japan) 50% (V/V)
5 × SSC
Blockierungsreagenz (Boehringer) 2% (G/V)
N-Lauroylsarcosin 0,1% (G/V)
SDS 0,3% (G/V)
bei einer Temperatur von 42°C über Nacht und anschließendes Waschen und Nachweis, wie vom Hersteller angegeben.
DNA-Sequenzen, die von den DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind entweder, weil sie mit solchen DNA- Sequenzen hybridisieren (siehe oben) oder durch Polymerasekettenreaktion konstruiert werden können unter Verwendung von Primern, die auf Basis solcher DNA-Sequenzen entwickelt werden, können hergestellt werden entweder wie angegeben, nämlich durch PCR-Reaktion, oder durch ortsgerichtete Mutagenese [siehe z. B. Smith, Ann. Rev. Genet. 19, 423 (1985)] oder synthetisch wie beschrieben, z. B. in EP 747 483 oder durch übliche Methoden von Molecular Cloning, wie z. B. in Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf einen Vektor oder ein Plasmid mit einer DNA, wie oben beschrieben, und eine Wirtszelle, die mit einer DNA, wie oben beschrieben, oder einem Vektor oder Plasmid, wie oben angegeben, transformiert oder transfiziert ist, gerichtet.
Die vorliegende Erfindung liefert auch einen rekombinanten Organismus, der durch Transformation eines Wirts erhältlich ist unter Verwendung einer rekombinanten DNA, die die oben erwähnte DNA trägt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines enzymatischen Polypeptids, das die Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin katalysieren kann, das umfasst, dass ein rekombinanter Organismus, wie oben beschrieben, unter Bedingungen, die zur Erzeugung des enzymatischen Polypeptids führen, gezüchtet wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Astaxanthin, das umfasst, dass ein oder mehrere der oben beschriebenen DNAs in einen geeigneten Wirtsorganismus eingeführt werden und der transformierte Organismus unter Bedingungen, die zur Erzeugung von Astaxanthin führen, gezüchtet wird.
Das enzymatische Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist auch geeignet für ein Verfahren zur Herstellung von Astaxanthin, wobei das Verfahren umfasst, dass man β-Carotin mit dem rekombinanten Polypeptid mit einer Astaxanthinsynthaseaktivität in Kontakt bringt, die an der Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin beteiligt ist, wie oben ausgeführt, in Gegenwart eines geeigneten Elektronendonators in einer geeigneten Reaktionsmischung, die eine geeignete rekonstituierte Membran enthält. Bei dieser Methode kann das rekombinante Polypeptid in der Form einer rekonstituierten Membran vorhanden sein, die aus biologischen Membranen erzeugt wird, wie Mikrosomen oder mitochondrialen Membranen. Das rekombinante Polypeptid kann auch in Form einer rekonstituierten künstlichen Membran vorhanden sein, wie Liposomen. Der Elektronendonator, wie Cytochrom-P450-Reduktase ist ein geeigneter Elektronendonator, der ein Reaktionszentrum des Enzyms der vorliegenden Erfindung reduzieren kann.
Die folgenden Zeichnungen sind enthalten, um die vorliegende Erfindung zusammen mit der unten angegebenen detaillierten Beschreibung weiter zu erläutern.
1 zeigt den Biosyntheseweg von Acetyl-CoA zu Astaxanthin in P. rhodozyma.
2 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pRl6, das ein teilgenomisches AST-Gen beinhaltet.
Allgemein gibt es eine Anzahl von Methoden, um ein Gen, das biosynthetische Enzyme codiert, zu klonieren. Z. B. kann degenerierte PCR verwendet werden. Degenerierte PCR ist eine Methode, um ein interessierendes Gen zu klonieren, das eine starke Homologie seiner codierten Aminosäuresequenz mit der eines bekannten Enzyms einer anderen Art hat, das die gleiche oder eine ähnliche Funktion hat. Ein degenerierter Primer, der als Satz von Primern bei der degenerierten PCR verwendet wird, wurde entwickelt durch reverse Translation der Aminosäuresequenz in die entsprechenden Nucleotide ("degeneriert"). Bei einem solchen degenerierten Primer wird ein gemischter Primer, der aus A, C, G oder T besteht, oder ein Primer, der Inosin an unklaren Stellen enthält, verwendet. Nach Klonieren eines Teilfragments des interessierenden Gens kann das genetische Fragment, das das gesamte Gen enthält, gescreent werden, indem das klonierte und markierte Teil-DNA-Fragment als Sonde verwendet wird.
Im Fall einer Klonierung eines Gens, das ein Enzym codiert, dessen Aktivität durch einen enzymatischen Assay gemessen werden kann, ist die Reinigung eines solchen Enzyms durch Überwachung der Enzymaktivität und Bestimmung der Aminosäuresequenz des Enzyms eine gute Methode. Eine so erhaltene Aminosäuresequenz wird leicht in die entsprechende Nucleotidsequenz/die entsprechenden Nucleotidsequenzen rückübersetzt. Ein DNA-Fragment, das die entsprechende Nucleotidsequenz hat, kann in vitro mit einem DNA-Syntheseautomaten synthetisiert werden und für direkte Verwendung als Hybridisierungssonde markiert werden. Ein alternativer Weg, um eine Hybridisierungssonde zu erhalten, ist die degenerierte PCR-Methode unter Verwendung der Information der Aminosäuresequenz.
Um ein Gen zu klonieren, dessen Funktion nicht enzymatisch charakterisiert werden kann, wurde eine Methode, die als "Shot-gun-Screening" bezeichnet wird, als übliche Klonierungsmethode angewendet. Diese Methode umfasst die Isolierung eines Mutantenstamms, dem das spezifische Gen, das für irgendeines der interessierenden biosynthetischen Enzyme codiert, fehlt [und die Transformation des Mutantenstamms durch DNA, die aus dem Organismus hergestellt wurde, der ein intaktes Gen aufweist, das dem Gen, das so mutiert wurde, entspricht]. Zur Isolierung einer solchen Mutante wird häufig eine übliche Mutagenese verwendet. Die Bestätigung des erworbenen Phänotyps, der der gleiche wie der des Elternstamms ist, kann durch Untersuchung der Auxotrophie und dgl. durchgeführt werden. In dem Fall, in dem die Donor-DNA das Gen enthält, das dem mutierten Gen in dem Mutantenstamm entspricht, erwarb der Transformant durch ein solches Gen den gleichen Phänotyp, wie der Elternstamm als Ergebnis einer genetischen Komplementierung.
Als Vektor kann jede Form von Vektoren, unabhängig davon, ob sie im Klonierungswirt replizieren oder nicht, für eine Shotgun-Klonierung verwendet werden. Zur Verwendung eines replikativen Vektors ist die Fähigkeit der Komplementierung eine Notwendigkeit und es ist nicht notwendig, dass ein solcher Vektor eine zu dem Genom des Rezipienten homologe Sequenz enthält. Wenn ein nicht replikativer Vektor verwendet wird, ist es notwendig, dass ein solcher Vektor eine zu dem Genom des Wirts homologe Sequenz enthält, damit eine Rekombination zwischen Donor- und Rezipienten-DNA erfolgt.
Für die Klonierung der DNAs der vorliegenden Erfindung kann die als "Farbkomplementierung" bezeichnete Methode angewendet werden. Nicht carotinogene Organismen, wie Escherichia coli, können die carotinogene Fähigkeit erwerben als Ergebnis der Transformation mit carotinogenen Genen, die aus carotinogenen Organismen, wie Erwinia uredovora, Erwinia herbicola und dgl. kloniert werden könnten. E. coli, die crtE, crtB, crtI und crtY beherbergen, können β-Carotin erzeugen und färben die Zellen gelb. Unter Ausnutzung einer solchen Eigenschaft wurde eine Anzahl von carotinogenen Genen aus verschiedenen carotinogenen Organismen, wie Bakterien und Pflanzen, kloniert. Um z. B. das crtY-Gen, das Lycopenzyklase codiert, zu klonieren, wird E. coli, der crtE, crtB und crtI auf einem mit pUC kompatiblen Vektor beherbergt, als Transformationswirt erzeugt. Ein solcher Wirt färbt sich rot, was eine Ansammlung von Lycopen zeigt. Als nächstes kann eine cDNA- oder genomische Bibliothek aus carotinogenen Organismen konstruiert werden unter Verwendung des pUC-Vektors. Wenn das crtY in dem caro tinogenen Donororganismus entsprechende Gen in dem transformierten Plasmid vorhanden ist, würde die genetische Komplementierung auftreten und E. coli würde gelb werden, was den Erwerb der Fähigkeit, β-Carotin zu erzeugen, zeigen würde. Tatsächlich wurden das crtE-, crtBY- und crtI-Gen aus P. rhodozyma mit dieser Methode kloniert (Verdoes et al., WO 97/23633).
Bezüglich der Klonierung des Gens, das an der Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin beteiligt ist, erzeugten Kajiwara et al. eine cDNA-Expressionsbibliothek aus P. rhodozyma in dem Wirts-E. coli, der crtE, crtB, crtI und crtY-Gene aus E. uredovora beherbergt (Kajiwara et a1., WO 96/28545, 1996). In einem solchen Klonierungssystem könnte ein Gen, das an der Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin beteiligt ist, theoretisch aus P. rhodozyma kloniert werden, indem die rote Pigmentierung beurteilt wird, die die Ansammlung von Canthaxanthin oder Astaxanthin zeigt. Über ein solches Gen wurde bisher jedoch nicht berichtet. Viele Forscher spekulieren über die Möglichkeit, dass membrangebundene carotinogene Enzyme einen Enzymkomplex bilden würden. In einem solchen Modell wäre die Affinität unter carotinogenen Enzymen notwendig für eine effiziente Carotinogenese. Basierend auf einer solchen Annahme ist die Farbkomplementierungsmethode nicht geeignet, um das Enzym, das an der letzten Stufe der Astaxanthinbiosynthese beteiligt ist, zu klonieren, nämlich der von β-Carotin zu Astaxanthin, da exogene Enzyme möglicherweise keine Affinität zu dem carotinogenen Enzym von Phaffia in der aufeinander folgenden Reaktion der Carotinogenese haben.
Bei dieser Erfindung wurde P. rhodozyma ATCC96815, der gemäß Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer 74486 am 18. Februar 1999 erneut hinterlegt wurde und der für die Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin blockiert wurde, als Transformationswirt verwendet (W. A. Schroeder und E. A. Johnson, J. Ind.
Microbiol. 14, 502–507, 1995). Die Transformation dieser Mutante durch die genomische Bibliothek, die aus dem Chromosom eines Wildtypstamms von P. rhodozyma ATCC96594 hergestellt wurde, der auch gemäß Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer 74438 am B. April 1998 hinterlegt wurde, wurde verwendet, um einen Klon zu isolieren, der Astaxanthin erzeugt. Bei der vorliegenden Erfindung wurde ein solches genetisches Fragment, das die Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin in P. rhodozyma vervollständigt, isoliert und seine Nucleotidseguenz bestimmt.
Ein solches Gen/eine solche DNA der vorliegenden Erfindung kann für die Überproduktion von Astaxanthin verwendet werden durch eine Gendosierungswirkung unter Verwendung von Genamplifikation oder Promotormodifikation statt Komplementierung der blockierten Mutation.
Erfindungsgemäß wurde die Punktmutation des P.-rhodozyma-ATCC-96815-Stamms, die dem P. rhodozyma-Wildtypstamm die β-Carotinproduktion vermittelte, bestimmt. Aus dem Sequenzierungsergebnis wurde vorgeschlagen, dass die Basenänderung an der Spleßsequenz des achten Introns des AST-Gens einen solchen Phänotyp mit spezifischer β-Carotinansammlunng verursacht durch unrichtiges Spleißen der mRNA. Die RT-PCR-Analyse wies das unrichtig gespleißte Produkt für das AST-Gen nach und (stützte die Identifizierung des Mutationspunktes stark.
Die Erfindung liefert auch das rekombinante AST-Gen., das in verschiedenen Wirtsorganismen, wie E. coli., exprimiert werden kann. Bei. dieser Erfindung wurde ein solches rekombinantes AST-Gen in E.. coli exprimiert und es wurde bestätigt, dass die Größe des vom AST-Gen codierten Proteinprodukts dem abgeleiteten Molekulargeivicht entsprach. Die biologische Erzeugung von Astaxanthin kann realisiert werden durch Verwendung des neuen AST-Gens und solche rekombinanten DNA-Techniken.
Erfindungsgemäß wurde das das Enzym, das an der letzten Stufe der Astaxanthinbiosynthese beteiligt ist, codierende Gen aus einer cDNA-Bibliothek von P. rhodozyma kloniert und die Nucleotidsequenz bestimmt. Weiterhin wurde ein Teil der genomischen DNA einschließlich Promotor und Terminator kloniert und kann für eine Klonierung des gesamten Gens einschließlich Promotor- und Terminatorregion verwendet werden.
Es gibt verschiedene Strategien, um die gewünschte enzymatische Aktivität des interessierenden Proteins zu verstärken unter Verwendung der DNA-Sequenz.
Eine Strategie besteht darin, das Gen selbst in seiner nativen Form zu verwenden. Der einfachste Ansatz besteht darin, die genomische Sequenz einschließlich der regulatorischen Sequenzen, wie Promotor und Terminator, zu amplifizieren. Dies kann geschehen, indem das genomische Fragment, das das interessierende Enzym codiert, in einen geeigneten Vektor mit einem selektierbaren Marker, der in P. rhodozyma funktioniert, kloniert wird. Ein Arzneimittelresistenzgen, das ein Enzym codiert, das ermöglicht, dass der Wirt in Gegenwart eines toxischen Antibiotikums überlebt, wird häufig als selektierbarer Merker verwendet. Das G418-Resistenzgen, das in pGB-Ph9 enthalten ist (Wery et a1., Gene, 184, 89–97, 1997) ist ein Beispiel einer solchen Vektorkonstruktion. Als Vektor können allgemein zwei Arten von Vektoren verwendet werden. Eine dieser Arten ist ein Integrationsvektor, der keine autonom replizierende Sequenz aufweist. Das Plasmid pGB-Ph9 ist ein Beispiel für diese Art von Vektoren. Weil ein solcher Vektor keine autonom replizierende Sequenz hat, kann der obige Vektor nicht selbst replizieren und kann nur in einer auf dem Chromosom des Wirts integrierten Form vorhanden sein als Ergebnis einer Einzelkreuzungsrekombination unter Verwendung der homologen Sequenz zwischen einem Vektor und dem Chromosom. Durch Erhöhen der Konzentration des entsprechenden Arzneimittels in dem Selektionsmedium kann nur der Stamm überle ben, in dem das integrierte Gen auf dem Chromosom amplifiziert wird. Eine andere Art von Vektor ist ein replizierbarer Vektor, der eine autonom replizierende Sequenz aufweist. Ein solcher Vektor kann mit hoher Kopienzahl existieren. Bei dieser Art von Vektor kann ein Nährstoffkomplementierungsmarker ("Nutrition Complementation Maker") auch in dem Wirt verwendet werden, der einen geeigneten Auxotrophiemarker hat. Der P. rhodozyma-ATTC-24221-Stamm, der Cytidin für sein Wachstum erfordert, ist ein Beispiel eines solchen Auxotrophs. Durch Verwendung einer CTP-Synthetase als Donor-DNA für ATCC24221 kann ein Wirtsvektorsystem unter Verwendung einer Nahrungsergänzung bzw. Nährstoffkomplementierung etabliert werden.
Eine weitere Strategie, um ein interessierendes Enzym überzuexprimieren, ist die Anordnung des interessierenden Gens unter einen starken Promotor. Bei einer solchen Strategie muss das interessierende Gen nicht notwendigerweise in hoher Kopienzahl vorliegen. Weiterhin kann auch ein Promotor, dessen Promotoraktivität in einer geeigneten Wachstumsphase und zu einem geeigneten Kultivierungszeitpunkt induziert wird, verwendet werden. Die Erzeugung von Astaxanthin beschleunigt sich in der späten Phase des Wachstums, wie die Produktionsphase eines sekundären Metaboliten. Indem z. B. die carotinogenen Gene unter die Kontrolle eines vegetativen Promotors gebracht werden, könnte die Genexpression dieser Gene in der exponentiellen Wachstumsphase induziert werden und die Produktion von Astaxanthin könnte mit dem Wachstum des Produktionsstamms verbunden werden.
Bei dieser Erfindung wurden Promotor- und Terminatorfragment für Triosephosphatisomerase-(TPI)-Gen aus P. rhodozyma als ein Beispiel für einen solchen konstitutiven Promotor und Terminator kloniert. Außerdem wurde eine Wiederaufnahme der Astaxanthinproduktion bei den Transformanten bestätigt, bei denen das AST-Gen an einem anderen Ort (AMY-Ort, der das Amylasegen enthält) auf dem Chromosom des β-Carotin produzieren den P. rhodozyma ATCC96815 exprimiert wurde, gesteuert von dem konstitutiven Promotor und Terminator, die vom TPI-Gen stammen.
Eine weitere Strategie, um interessierende Enzyme zu überexprimieren, ist die Mutation in den regulatorischen Elementen. Für diesen Zweck wird eine Art von Reportergen, wie ein β-Galactosidasegen, Luciferasegen, ein Gen, das für ein grün fluoreszierendes Protein codiert und dgl., zwischen Promotor und Terminatorsequenz des interessierenden Gens eingesetzt, so dass alle Teile, einschließlich Promotor, Terminator und Reportergen, fusioniert sind und zusammen funktionieren. Ein transformierter P. rhodozyma, in den das Reportergen auf dem Chromosom oder auf dem Vektor eingeführt wurde, kann in vivo mutagenisiert werden, um eine Mutation zu induzieren innerhalb der Promotorregion des interessierenden Gens. Die Mutation kann überwacht werden, indem die Veränderung der Aktivität, die von dem Reportergen codiert wird, nachgewiesen wird. Wenn die Mutation in einem cis-Element des Gens auftritt, würde der Mutationspunkt bestimmt durch den Erhalt des mutagenisierten Gens und Sequenzierung. Diese Mutation kann dann in die Promotorregion auf dem Chromosom durch Rekombination zwischen der nativen und mutierten Promotorsequenz eingeführt werden. Auf gleiche Weise kann eine Mutation in dem Gen, das für einen trans-wirkenden Faktor codiert, erfolgen.
Eine Mutation kann auch durch eine in-vitro-Mutagenese eines cis-Elements in der Promotorregion induziert werden. Bei diesem Ansatz wird eine Gencassette, die ein Reportergen enthält, das mit einer Promotorregion, die von einem interessierenden Gen stammt, am 5'-Ende und einer Terminatorregion von einem interessierenden Gen am 3'-Ende fusioniert ist, mutagenisiert und dann in P. rhodozyma eingeführt. Indem der Unterschied der Aktivität des Reportergens nachgewiesen wird, würde eine wirksame Mutation gescreent. Eine solche Mutation kann in die Sequenz der nativen Promotorregion auf dem Chro mosom mit der gleichen Methode eingeführt werden, wie im Fall des Ansatzes einer in-vivo-Mutation.
Als Donor-DNA könnte ein Gen, das ein Enzym codiert, das die Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin katalysiert, eingeführt werden. Eine codierende Sequenz, die identisch ist mit der nativen Sequenz ebenso wie ihre allelische Variante, eine Sequenz, die eine oder mehrere Aminosäureadditionen, -Deletionen und/oder -Substitutionen aufweist, können verwendet werden, soweit das entsprechende Enzym die gleiche Art von Enzymaktivität hat. Ein solcher Vektor kann dann in P. rhodozyma durch Transformation eingeführt werden und die Transformanten können ausgewählt werden, indem die transformierten Zellen auf einem geeigneten Selektionsmedium, wie YPD-Agarmedium, das Geneticin enthält, im Fall von pGB-Ph9, oder einem Minimalagarmedium, bei dem Cytidin weggelassen wird, im Fall der Verwendung des Auxotrophs ATCC24221 als Rezipient, verteilt werden.
Ein solcher genetisch veränderter P. rhodozyma kann in einem geeigneten Medium kultiviert werden und bezüglich der Produktivität von Astaxanthin ausgewertet werden. Ein Hyperproduzierer von Astaxanthin, der so ausgewählt wurde, würde bestätigt im Hinblick auf den Zusammenhang zwischen der Produktivität und dem Grad an Gen- oder Proteinexpression, die durch ein solches gentechnisches Verfahren eingeführt wurde.
Beispiele
Die folgenden Materialien und Methoden wurden in den spezifischen Beispielen, die unten beschrieben werden, angewendet:
Stämme:

P. rhodozyma ATCC96594 (Dieser Stamm wurde am B. April 1998 gemäß Budapester Vertrag unter der Hinterlegungsnummer 74438 erneut hinterlegt)
P. rhodozyma ATCC96815 (Dieser Stamm wurde am 18. Februar 1999 gemäß Budapester Vertrag unter der Hinterlegungsnummer 74486 erneut hinterlegt)
E. coli DH5alpha F^-, phi80d, lacZdeltaMl5, delta(lacZYAargF)U169, hsd (r_K ^–, m_K ⁺), recAl, endAl, deoR, thi-1, supE44, gyrA96, relAl (Toyobo, Osaka, Japan)
E. coli XL1-Blue MRF': delta(mcrA)183, delta(mcrCB-hsdSMRmrr)173, endAl, supE44, thi-1, recAl, gyrA96, relAl, lac[F'proAB, lacI^gZdeltaMl5, Tn10 (tet^r)] (Stratagene, La Jolla, USA)
E. coli SOLR: e14^–(mcrA), delta(mcrCB-hsdSMR-mrr)171, sbcC, recB, recJ, umuC :: Tn5(kan^r), uvrC, lac, gyrA96, relAl, thi-1, endAl, lambda^R, [F'proAB, lacI^gZdeltaMl5]Su^– (nicht supprimierend) (Stratagene)
E. coli TOP10: F^–, mcrA, delta(mrr-hsdRMS-mcrBC), phi80, delta(lacZM15), delta(lacX74), recAl, deoR, araDl39, (araleu)7697, galU, galK, rpsL(Str^r), endAl, nupG (Invitrogen, NV Leek, Niederlande)
E. coli BL21 (DE3) (pLysS) : dcm^–, ompTr_H ^–m_B ^–, Ion^–lambda(DE3), pLysS (Stratagene)

Vektoren:

pUCl9 (Takara Shuzo, Otsu, Japan)
lambdaZAPII (Stratagene)
pCR2.1-TOPO (Invitrogen)
pET11c (Stratagene)

Medien:
Der P. rhodozyma-Stamm wird routinemäßig in YPD-Medium IFCO, Detroit, USA) gehalten. Der E. coli-Stamm wird in LB-Medium (10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt (DIFCO) und 5 g NaCl pro Liter) gehalten. Wenn ein Agarmedium hergestellt wurde, wurden 1,5% Agar (WAKO, Osaka, Japan) ergänzt.
Methoden:
Allgemeine molekularbiologische Methoden wurden durchgeführt wie in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben. Die Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase wurden von Takara Shuzo erhalten.
Die Isolierung von chromosomaler DNA aus P. rhodozyma wurde durchgeführt unter Verwendung von QIAGEN Genomic Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) gemäß dem vom Hersteller gelieferten Protokoll. Miniprep von Plasmid-DNA aus transformiertem E. coli wurde durchgeführt mit dem automatischen DNA-Isolierungssystem (PI-50, Kurabo, Co. Ltd., Osaka, Japan). Midiprep von Plasmid-DNA von einem E. coli-Transformanten wurde durchgeführt unter Verwendung einer QIAGEN-Säule (QIAGEN). Ein DNA-Fragment wurde von der Agarose isoliert und gereinigt unter Verwendung von QIAquick oder QIAEX II (QIAGEN).
Fluoreszierende DNA-Primer für die DNA-Sequenzierung wurden von Pharmacia erworben. Die DNA-Sequenzierung wurde mit dem automatisierten Fluoreszenz-DNA-Sequenzierautomaten durchgeführt (ALFred, Pharmacia, Uppsala, Schweden).
Kompetente Zellen von DH5alpha wurden von Toyobo erworben.
Die Vorrichtung und das Reagenz für die biolistische Transformation von P. rhodozyma wurden von Nippon Bio-Rad Laboratories (Tokio, Japan) erworben.
Beispiel 1
Isolierung von genomischer DNA von P. rhodozyma Um genomische DNA von P. rhodozyma, ATCC96594, zu isolieren, wurde das QIAGEN-Genomkit verwendet gemäß der vom Hersteller angegebenen Methode.
Zuerst wurden Zellen von P. rhodozyma ATCC96594 aus 100 ml über-Nacht-Kultur in YPD-Medium durch Zentrifugation (1500 × g 10 Min.) geerntet und einmal mit TE-Puffer (10 mM Tris/HCl (pH 8,0), der 1 mM EDTA enthielt) gewaschen. Nach Suspendieren in 8 ml Y1-Puffer des QIAGEN-Genomkits wurde Lyticase (SIGMA, St. Louis, USA) in einer Konzentration von 2 mg/ml zugegeben, um die Zellen durch enzymatischen Abbau aufzureißen und die Reaktionsmischung wurde 90 Minuten lang bei 30°C inkubiert und dann mit der nächsten Extraktionsstufe fortgefahren . Schließlich wurden 20 μg genomische DNA erhalten .
Beispiel 2
Konstruktion einer genomischen Bibliothek von P. rhodozyma ATCC96594
Wie in dem Abschnitt "Detaillierte Beschreibung der Erfindung" beschrieben, wurde ein Plasmid mit einer Cassette mit Arzneimittelresistenzmarker konstruiert, indem ein G418-Resistenzstrukturgen zwischen Promotor- und Terminatorregion des Gens der Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP) insertiert wurde und diese Cassette in mit KpnI- und HindIIIverdauten pUCl9 ligiert wurde. Dieses Plasmid wurde pUC-G418 genannt und weiter verwendet. Dann wurde ein ClaI-Linker in die einzige EcoRI-Stelle des pUC-G418-Vektors ligiert und das entstehende Plasmid pUC-G418C1512 wurde erhalten und als Vektorgerüst bei der Konstruktion der Phaffia-Genombibliothek verwendet.
Dann wurden 10 μg chromosomale DNA, die aus P. rhodozyma ATCC96594, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt worden war, teilweise bei 37°C 45 Minuten lang mit 1,6 Einheiten HpaII verdaut und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärben mit Ethidiumbromid wurde die teilweise verdaute DNA-Art von 4 bis 10 kb durch Elektroelution gewonnen unter Verwendung einer Dialysemembran. Nach Ausfällung der gewonnenen HpaII-Fragmente mit Ethanol, wurden 1,215 μg DNA erhalten.
Als nächstes wurden 3 μg pG418C1512 mit 10 Einheiten ClaI 1 Stunde bei 37°C verdaut und mit Ethanol ausgefällt. Mit ClaI verdauter pG418C1512 wurde dann dephosphoryliert unter Verwendung von alkalischer Kälberdarmphosphatase. Mit ClaI verdauter und dephosphorylierter pG418C1512-Vektor wurde dann einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und das DNA-Fragment wurde gewonnen unter Verwendung des QIAquick-Protokolls nach den Anleitungen des Herstellers. Schließlich wurden 2,62 μg mit ClaI verdauter und dephosphorylierter pG418C1512 erhalten.
2,62 μg ClaI-verdauter und dephosphorylierter pG418C1512 wurden in 1,22 μg mit HpaII teilweise verdauter Phaffia-Genom-DNA über Nacht bei 16°C ligiert und die entstehende Ligierungslösung wurde als Donor-DNA für die Transformation eines E. coli-DH5-alpha-Stamms verwendet. Die gesamte Ligierungsmischung (270 μl) wurde dann in 1 ml kompetente Zellen von DH5a (Toyobo) transferiert. Nach einer Hitzeschockbehandlung 45 Sekunden bei 42°C und anschließendem 30-minütigen Aufbewahren auf Eis wurden die transformierten Zellen 2 Minuten auf Eis gebracht und dann bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert unter Zugabe von 5 ml SOC-Medium:
0,5% Hefeextrakt (DIFCO)
2% Trypton (DIFCO)
10 mM NaCl
2 , 5 mM KCl
10 mM MgCl₂
20 mM MgSO₄
20 mM Glucose.
Die so inkubierten Zellen wurden in 100 ml LB-Medium überführt, das 100 gamma/ml Ampicillin enthielt. Die Kultivierung wurde über Nacht bei 37°C fortgesetzt und dann die Zellen für die Plasmidmidipräparation geerntet.
Eine Plasmidbibliothek wurde aus den geernteten Zellen erstellt unter Verwendung von QIAGEN Midiprepsäulen gemäß der vom Hersteller angegebenen Methode. Schließlich wurden 0,3 mg/ml Phaffia-Genombibliothek erhalten in einem Gesamtvolumen von 5 ml und als Genombibliothek in einer weiteren Untersuchung verwendet.
Beispiel 3
Transformation von P. rhodozyma ATCC96815 mit einer biolistischen Methode
Die Transformation erfolgte gemäß der in Methods in Molecular Biology (Johnston et a1., 53; 147–153, 1996) beschriebenen Methode. Als Wirtsstamm wurde P. rhodozyma ATCC96815 in YPD-Medium bis zur stationären Phase gezüchtet. Nach Zentrifugation der Brühe wurden Zellen 10-fach mit sterilisiertem Wasser eingeengt und 200 μl der Zellsuspension wurden auf YPD-Medium, das 100 gamma/ml Geneticin und 0,75 M Mannit und Sorbit enthielt, ausgebreitet. 5 μg einer Genombibliothek, die wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt worden war, wurden auf 1,5 mg 0,9 um Goldteilchen geschichtet und als Donor-DNA für die biolistische Transformation verwendet. Ungefähr 20.000 geneticinresistente Klone wurden geliefert (300 bis 500 Kolonien pro Platte) nach 1 Woche Inkubation bei 20°C. Obwohl die meisten Transformanten eine gelbe Farbe zeigten (wie der Wirtsstamm, ATCC96815), waren drei Kolonien rot pigmentiert und wurden weiterverwendet.
Beispiel 4
Analyse der aus rot pigmentierten Transformanten erhaltenen Carotinoide
Rot pigmentierte Transformanten, die aus P. rhodozyma ATCC96815 erhalten worden waren, wurden in 10 ml YPD-Medium bei 20°C in Teströhrchen gezüchtet. Dann wurden die Zellen aus 0,5 ml Brühe geerntet und für die Extraktion von Carotinoiden aus Zellen verwendet. Der Carotinoidgehalt von P. rhodozyma wurde mit HPLC gemessen nach Extraktion der Carotinoide aus Zellen von P. rhodozyma durch Aufreißen mit Glasperlen, wie beschrieben. Nach Extraktion wurden die aufgerissenen Zellen dann durch Zentrifugation gesammelt und der entstehende Überstand wurde auf den Carotinoidgehalt mit HPLC analysiert.

HPLC-Säule: Chrompack Lichrosorb si-60 (4,6 mm, 250 mm)
Temperatur: Raumtemperatur
Elutionsmittel: Aceton/Hexan (18/82) Zugabe von 1 ml/l Wasser zu dem Eluens Injektionsvolumen: 10 μl
Durchflussrate: 2,0 ml/min
Detektion: UV bei 450 nm
Eine Probe β-Carotin wurde von SIGMA erworben und Astaxanthin wurde von Hoffman La-Roche (Basel, Schweiz) erhalten.

Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurde bestätigt, dass alle drei roten Transformanten Astaxanthin erzeugten, obwohl der Wirtsstamm, ATCC96815, nur β-Carotin erzeugte.
Beispiel 5
Plasmidgewinnung aus dem Chromosom von roten Transformanten, die Astaxanthin erzeugten
Chromosomale DNA wurde aus allen Astaxanthin produzierenden Transformanten hergestellt. Für diesen Zweck wurde der QIAGEN-Genomkit verwendet nach der vom Hersteller angegebenen Methode, wie in Beispiel 1 beschrieben. 5 μg der so hergestellten chromosomalen DNA wurde mit HindIII verdaut und dann mit dem QIAquick-Protokoll gereinigt. E. coli-DH5alphakompetente Zellen wurden mit den ligierten DNA-Lösungen transformiert und dann auf LB-Agarmedium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen. Alle Transformanten hatten die gleichen Insertfragmente in ihren Plasmiden, was durch Sequenzanalyse der Plasmide beurteilt wurde. Dies deutet darauf hin, dass drei unabhängige rote Transformanten, abgeleitet von P. rhodozyma ATCC96815, erhalten wurden durch die gleiche Art von Rekombinationsereignis zwischen der Donor-DNA der genomischen Bibliothek und chromosomaler DNA. Eines der so gewonnenen Plasmide wurde als pR2-4 bezeichnet und weiterverwendet.
Beispiel 6
Screenen der ursprünglichen Genombibliothek unter Verwendung von pR2-4 als Hybridisierungssonde
Da das gewonnene Fragment in pR2-4 Mutationen haben könnte abhängig von der Richtung des Rekombinationsereignisses, das zu roten Transformanten von P. rhodozyma führte, erfolgte das Screenen der ursprünglichen Genombibliothek unter Verwendung von pR2-4 als Hybridisierungssonde.
Für diesen Zweck wurden 20.000 E. coli-Transformanten der ursprünglichen Genombibliothek, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf Nylonmembranfilter (Hybond-N+, Amersham, Buckinghamshire, GB) überführt und einer Koloniehybridisierung unterzogen. Drei Transformanten, die die gleiche Nucleotidsequenz in ihrem Insert beinhalteten, wie pR2-4, wurden isoliert. Die isolierten Plasmide aus diesen Transformanten wurden pR3, pR5.1 und pR16 genannt.
Als nächstes wurde P. rhodozyma ATCC96815 mit pR3, pR5.l und pR16 transformiert. Alle Transformanten färbten sich rot. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die isolierten Plasmide das Gen enthalten könnten, das ein Enzym codiert, das an der Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin in P. rhodozyma beteiligt ist. Dieses Gen wurde als AST-Gen bezeichnet. Von diesen Plasmiden wurde pRl6 weiterverwendet.
Beispiel 7
Isolierung der mRNA aus P. rhodozyma für die cDNA-Analyse
Um das Muster der Transkripts von P. rhodozyma zu analysieren, wurde die gesamte RNA aus P. rhodozyma ATCC96594 und ATCC96815 durch Phenolextraktion kombiniert mit einem Aufreißen der Zellen mit Glasperlen und gereinigte mRNA unter Verwendung eines mRNA-Trennungskits isoliert (Clontech, Palo Al to, USA).
Zuerst wurden Zellen aus den Stämmen ATCC96594 und ATCC96815 aus 10 ml einer 2-Tage-Kultur in YPD-Medium durch Zentrifugation (1500 × g 10 Minuten) geerntet und einmal mit Extraktionspuffer (100 mM Tris/HCl (pH 7, 5) , der 0, 1 M LiCl und 0, 1 mM EDTA enthielt) gewaschen. Nach Auffüllen auf 5,0 ml der Zellsuspension mit dem gleichen Extraktionspuffer in einem 50-ml-Wegwerfzentrifugenröhrchen (IWAKI Glass, Tokio, Japan) wurden 1,5 ml Isogen-LS (Nippon gehe, Toyama, Japan) und 10 g Glasperlen zugegeben. Zentrifugenröhrchen, die die Zellsuspension mit Isogen-LS und Glasperlen enthielten, wurden mit einem horizontalen Tischtopschüttler 1 Stunde lang geschüttelt. In dieser Stufe wurden 300 μg Gesamt-RNA gewonnen.
Dann wurde die mRNA gereinigt unter Verwendung eines mRNA-Trennungskits (Clontech). 8,0 μg mRNA aus P. rhodozyma ATCC96594- und ATCC96815-Stämmen wurden erhalten.
Um cDNR zu synthetisieren, wurde der SMART-cDNA-Konstruktionskit (Clontech) verwendet nach der vom Hersteller angegebenen Methode. 2 μg gereinigte mRNA wurden für die Synthese des ersten Strangs angewendet gefolgt von einer PCR-Amplifizierung und 1 mg cDNA wurde erhalten.
Beispiel 8
Subklonierung von pRl6 und funktionelle Analyse des Insertfragments
Die Restriktionskarte von pRl6 ist in 2 dargestellt. Jedes EcoRI-Fragment, dessen Länge 0,7 bzw. 2,7 kb war, wurde in pUC-G418 subkloniert und mit pRS913 bzw. pRLR913 bezeichnet.
Dann wurde der Astaxanthin produzierende P. rhodozyma ATCC96594-Stamm mit pRS913 transformiert. Als Ergebnis dieser Transformationsuntersuchung wurden gelbe Transformanten erhalten. Dies deutet darauf hin, dass das 0,7-kb-EcoRI-Fragment ein trunkiertes AST-Gen enthalten könnte und die Transformation über ein Einzelkreuzungsrekombinationsereignis zwischen einem 0,7-kb-EcoRI-Fragment und seiner homologen Sequenz auf dem Chromosom P. rhodozyma zu einer Genzerstörung des A5T-Gens auf dem Chromosom von P. rhodozyma führen würde.
Als nächstes wurde der β-Carotin produzierende ATCC96815-Stamm mit pRLR913 transformiert und rote Transformanten wurden erhalten. Dies deutet darauf hin, dass der Mutationspunkt von Stamm ATCC96815, der den Astaxanthin produzierenden Wildtypstamm dazu brachte, β-Carotin zu produzieren, in dem 2,7-kb-EcoRI-Fragment läge, das ursprünglich dem 0,7-kb-EcoRI-Fragment in pR16 benachbart war.
200 μg der in Beispiel 7 hergestellten cDNA wurden einer Agarosegelelektrophorese für eine virtuelle Northern Analyse unterzogen. Im Fall der aus ATCC96594 und 96815 erzeugten cDNAs wurden zwei Banden, nämlich mit 3,2 und 2,0 kb, in beiden Fällen hybridisiert unter Verwendung des 2,7-kb-EcoRI-Fragments von pRLR913 als Hybridisierungssonde. Dies deutet darauf hin, dass die ast-Mutation von ATCC96815 eine Punktmutation wäre, die sich nicht in der Veränderung der Länge der mRNA widerspiegelt, wie eine Fehlsinn-Mutation.
Im Fall der Verwendung des 0,7-kb-EcoRI-Fragments von pR5913 als Hybridisierungssonde hybridisierte eine Bande von 2,0 kb. Aus dieser Untersuchung scheint es, dass das AST-Gen ein 2,0-kb-Transkript in P. rhodozyma ergeben könnte.
Beispiel 9
Klonierung der cDNA des AST-Gens
Um cDNA für das AST-Gen aus P. rhodozyma zu klonieren, wurde eine cDNA-Bibliothek aus P. rhodozyma ATCC96594 konstruiert. Die Gesamt-RNA wurde isoliert durch Phenolextraktion kombiniert mit der Zellzerstörung mit Glasperlen, wie in Beispiel 7 beschrieben.
Zuerst wurden Zellen des ATCC96594-Stamms von 50 ml einer Zweitagekultur in YPD-Medium geerntet durch Zentrifugation (1500 × g 10 Minuten) und einmal mit Extraktionspuffer (100 mM Tris/HCl (pH 7,5), der 0,1 M LiCl und 0,1 mM EDTA enthielt) gewaschen. Nach Auffüllen der Zellsuspension mit 5,0 ml des gleichen Extraktionspuffers in 50-ml-Wegwerfzentri fugenröhrchen (IWAKI Glass) wurden 1,5 ml Isogen-LS (Nippon gene) und 10 g Glasperlen zugegeben. Die Zentrifugenröhrchen, die die Zellsuspension mit Isogen-LS und Glasperlen enthielten, wurden auf einem horizontalen Tischtopschüttler 1 Stunde lang geschüttelt. In dieser Stufe wurden 1,8 mg Gesamt-RNA gewonnen.
Dann wurde die mRNA gereinigt unter Verwendung eines Poly-ATtract-mRNA-Isolierungssystems (Promega corp., Madison, USA) gemäß der vom Hersteller angegebenen Methode. Schließlich wurden 8,0 μg mRNA aus dem P. rhodozyma ATCC96594-Stamm erhalten.
Um eine cDNA-Bibliothek zu konstruieren, wurden 8,0 μg der gereinigten mRNA in dem COPY-Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) mit dem vom Hersteller angegebenen Protokoll verwendet. Nach Ligierung eines EcoRI-Adapters (Stratagene) wurde synthetisierte cDNA einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Nach Ausschneiden des Agarosegelstücks, das die Länge der cDNAs von 1,9 bis 2,3 kb umfasste, wurde die gesammelte cDNA-Art gereinigt mit QIAEX II (QIAGEN). Diese der Größe nach fraktionierte cDNA wurde in mit EcoRI verdauten und dephosphorylierten lambdaZAPII (Stratagene) ligiert. Die über-Nacht-Ligierungsmischung wurde in vitro verpackt mit Ligapack III Goldextrakt (Stratagene) und zur Infektion von E. coli XLl-Blue MRF'-Stamm verwendet.
Ein übliches Plaque-Screening wurde durchgeführt für 6000 Plaques unter Verwendung der 2,7- und 0,7-kb-EcoRI-Fragmente, wie in Beispiel 8 beschrieben, als Hybridisierungssonden. Ein Plaque, der stark mit diesen Sonden hybridisierte, wurde mit einem sterilisierten Zahnstocher herausgepickt und das eluierte Phagenteilchen für in-vivo-Exzision verwendet mit gemäß der vom Hersteller angegebenen Methode. Schließlich wurden infizierte Transformanten von E. coli-SOLR-Zellen, die Resistenz gegenüber Ampicillin zeigten, isoliert. Nach Sequenzie rung der aus diesen Transformanten erhaltenen isolierten Plasmide stellte sich heraus, dass diese Plasmide das gleiche Fragment als Teil der Sequenz von pRl6 enthielten, das in Beispiel 6 beschrieben wurde.
Die gesamte Sequenz der cDNA des AST-Gens wurde bestimmt und ist als SEQ ID Nr. 2 gezeigt und die abgeleitete Aminosäuresequenz als SEQ ID Nr. 1.
Beispiel 10
In-vitro-Charakterisierung des AST-Genprodukts
Für die enzymatische Charakterisierung des AST-Genprodukts kann ein Standardtest, der für die Charakterisierung von P450-Enzymen verwendet wird, angewendet werden. Für diesen Zweck ist es notwendig, dass die Reaktionsmischung eine rekonstituierte Membran enthält. Als rekonstituierte Membran werden häufig natürliche Isolate wie Mitochondrienmembranen oder Mikrosomen und künstliche Membranen verwendet. In jedem Fall ist es notwendig, dass ein Elektronentransfer zwischen einem Elektronenakzeptor und einem Rezeptor auftreten kann. Als Elektronendonator wird häufig Cytochrom-P450-Reduktase zu der Reaktionsmischung zugegeben. Als Elektronenakzeptor sind Sauerstoffmoleküle beteiligt. In Gegenwart einer Elektronenquelle, wie reduziertem NADPH+, kann β-Carotin, das ein Substrat der Astaxanthinsynthase ist, in Astaxanthin umgewandelt werden. Erzeugtes Astaxanthin kann qualitativ und quantitativ mit HPLC-Analyse bestimmt werden.
Beispiel 11
Klonierung des genomischen Fragments, das AST-Gen enthält
Um die genomische Sequenz zu bestimmen, die das AST-Gen enthält, wurde ein Sequenzierungsversuch durchgeführt unter Ver wendung des Primer-Walking-Verfahrens. Die Sequenzanalyse von pRS913 zeigte, dass pRS913 nicht das 3'-Ende des AST-Gens enthielt. Um das 3'-benachbarte genomische Fragment des AST-Gens zu erhalten, wurde ein Genom-Walking-Versuch durchgeführt. Dazu wurde ein universelles Genom-Walker-Kit (Clontech) nach der vom Hersteller angegebenen Methode angewendet. Als PCR-Matrize wurde chromosomale DNA, die in Beispiel 1 hergestellt worden war, verwendet. Genspezifische Primer, astl5, dessen Sequenz wie in Tabelle 1 aufgeführt war, wurden synthetisiert und als PCR-Primer verwendet.
Tabelle 1
Sequenz des für das Genom-Walking des AST-Gens verwendeten Primers
astl5: TAGAGAGAAGGAGGGGTACCAGATGC (SEQ ID Nr. 9)
PCR-Fragmente, die eine geeignete Länge hatten (kleiner als 1 kb) wurden aus einer EcoRV- und StuI-Bibliothek gewonnen, gereinigt und in pCR2.1-TOPO (Invitrogen) kloniert. Als Ergebnis der Sequenzierung wurde gefunden, dass beide Fragmente das genomische Fragment enthielten, das das AST-Gen enthielt. Auf Basis der Sequenz, die 200 bp von der polyA-Stelle des AST-Gens angeordnet war, wurden PCR-Primer, wie in Tabelle 2 aufgeführt, entworfen.
Tabelle 2
Sequenz der Primer zur Klonierung des 3'-benachbarten Fragments von AST-Gen
astl8: CCCCGGATTGTGGAGAAACT (SEQ ID Nr. 10)
Unter Verwendung von astl5 und ast18 als PCR-Primer und von chromosomaler DNA, die in Beispiel 1 hergestellt worden war, als PCR-Matrize, wurde eine PCR durchgeführt. Proof-Reading-Polymerase (HF-Polymerase, Clontech) stellte die Amplifikation des PCR-Fragments sicher, das die exakte Sequenz hatte. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 25 Zyklen mit 15 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 30 Sekunden bei 72°C. Sechs unabhängige Klone, die 400-bp-Inserts hatten, zeigten die identische Sequenz.
Kombiniert mit den Sequenzen für pR5913 und pRL913 wurde die 3,9-kb-Sequenz, die das AST-Gen enthielt, das 474 by Promotorregion und 269 by Terminatorregion enthielt, bestimmt (SEQ ID Nr. 3). Als Ergebnis zeigte das AST-Gen eine intronreiche Struktur (17 Introns).
Beispiel 12
Bestimmung des Mutationspunktes des β-Carotin erzeugenden Stamms P. rhodozyma ATCC96815
Um die Tatsache zu bestätigen, dass die β-Carotinproduktion des Stamms P. rhodozyma ATCC96815 durch die Mutation innerhalb des AST-Gens verursacht wurde, wurde die genomische Sequenz, die das AST-Gen enthielt, die aus ATCC96815 erhalten wurde, und des Elternstamms P. rhodozyma RTCC24230 bestimmt. Hierzu wurden PCR-Primer, deren Sequenzen als Tabelle 3 aufgeführt sind, synthetisiert und für die PCR-Klonierung verwendet: Tabelle 3
PCR-Primer für die Klonierung des gesamten genomischen AST-Gens
ast21: ATGTTCATCTTGGTCTTGCT (Sense Primer) (SEQ ID Nr. 11)
ast4: ACGTAGAAGTCATAGCGCCT (Antisense Primer) (SEQ ID Nr. 12)
Unter Verwendung von HF-Polymerase (Clontech) als PCR-Polymerase und chromosomaler DNA, die aus den Stämmen ATCC96815 und ATCC24230 mit dem gleichen Protokoll, wie in Beispiel 1, hergestellt worden war, als PCR-Matrize wurde die PCR durchgeführt unter den folgenden Bedingungen: 25 Zyklen mit 15 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 4 Minuten bei 72°C. Die erhaltenen PCR-Fragmente, deren Länge ungefähr 3,5 kb war, wurden in pCR2.1-TOPO kloniert und die Gesamtsequenz durch Primer-Walking-Verfahren sequenziert. Zwischen der Sequenz von P. rhodozyma-Stamm ATCC96594 und dem Stamm ATCC24230 wurden 7 Basenveränderungen gefunden. 4 Basenveränderungen wurden in der Exonsequenz gefunden, aber diese ergaben keine Aminosäureveränderungen. 3 Basenveränderungen fanden sich in der Intronstruktur. Beim Vergleich zwischen dem β-Carotin erzeugenden Stamm ATCC96815 und dem Elternstamm ATCC24230 wurde eine Basenänderung an der 5'-Spleiß-Sequenz (GTAAGT > GTAAAT) innerhalb des achten Introns gefunden. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Mutation, die den Phänotyp der β-Carotinansammlung bei Astaxanthin produzierendem P. rhodozyma erzeugt, durch ein falsches Spleißen der mRNA für das AST-Gen verursacht wurde.
Um diese Annahme zu bestätigen, wurde eine RT-PCR durchgeführt unter Verwendung von cDNA, die aus P. rhodozyma ATCC96815 hergestellt worden war, als PCR-Matrize. mRNA wurde aus P. rhodozyma ATCC96815 mit dem gleichen Protokoll, wie in Beispiel 9, isoliert und für die Synthese von cDNA verwendet. Um cDNA aus dieser mRNA, die aus ATCC96815 mit der PCR-Methode hergestellt worden war, zu erhalten, wurde der SMART-PCR-cDNA-Bibliothek-Konstruktionskit (Clontech) nach der Methode, wie vom Hersteller angegeben, benutzt. Die folgenden Primer, deren Sequenz in Tabelle 4 aufgeführt ist, und die das achte Intron abdeckten, wurden synthetisiert und als PCR-Primer verwendet.
Tabelle 4
PCR-Primer für RT-PCR, um das falsche Spleiß-Produkt für AST-Gen nachzuweisen
ast7: TTTGACTCAAGGATTAGCAG (Sense Primer) (SEQ ID Nr. 13)
ast26: TGTCTTCTGAGAGTCGGTGA (Antisense Primer) (SEQ ID Nr. 14)
Die RT-PCR-Bedingungen waren wie folgt: 25 Zyklen mit 15 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 30 Sekunden bei 72°C. Als Ergebnis der PCR wurden 300 by PCR-Produkte amplifiziert und in pCR2.1-TOPO kloniert. Zwei unabhängige Klone, die 300-bp-Inserts aufwiesen, wurden sequenziert. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die unrichtigen Spleiß-Produkte für AST-Gen in dem P. rhodozyma-Stamm ATCC96815 synthetisiert wurden. Das unrichtige Spleißen des achten Introns des RST-Gens könnte die Erzeugung von kürzer trunkiertem AST-Protein verursachen, statt AST-Protein, das richtig gespleißt ist, da das Stoppcodon im achten Intron liegt. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der Mutationspunkt im AST-Gen liegt, das kein richtiges Spleißen ergab.
Beispiel 13
Kolbenfermentation durch Rekombinanten, bei denen das rekombinante AST-Gen in das Chromosom von β-Carotin erzeugendem P. rhodozyma integriert wurde

Die Produktivität von Astaxanthin wurde mit der Kolbenfermentation ausgewertet. Das Medium für die Kolbenfermentation hatte die folgende Formulierung: Tabelle 5 Saatmediumformulierung für Kolbenfermentation

Glucose	30,0 g/l
NH₄Cl	4,83 g/l
KH₂PO₄	1,0 g/l
MgSO₄·7 H₂O	0,88 g/l
NaCl	0,06 g/l
CaCl₂·2 H₂O	0,2 g/l
KH-Phthalat	20,0 g/l
FeSO₄·7 H₂O	28 mg/l
Citronensäure·1 H₂O	15,0 mg/l
ZnSO₄·7 H₂O	40,0 mg/l
CuSO₄·5 H₂O	0,75 mg/l
MnSO₄·4,5 H₂O	0,6 mg/l
H₃BO₃	0,6 m g/l
NaMo₂O₄·2 H₂O	0,6 mg/l
KI	0,15 mg/l
Myo-Inosit	60,0 mg/l
Nicotinsäure	3,0 mg/l
Ca-D-pantothenat	3,0 mg/l
Vitamin B1 (Thiamin-HCl)	3,0 mg/l
p-Aminobenzoesäure	1,8 mg/l
Vitamin B6 (Pyridoxin-HCl)	0,3 mg/l
Biotin	0,048 mg/l
7 ml/Teströhrchen (21 mm Durchmesser)

Tabelle 6 Formulierung des Mediums für Kolbenfermentation

MgSO₄·7 H₂O	2,1 g/l
CaCl₂·2 H₂O	0,865 g/l
(NH₄)₂SO₄	3,7 g/l
FeSO₄·7 H₂O	0,28 g/l
Glucose (getrennt sterilisiert)	22 g/l
KH₂PO₄ (getrennt sterilisiert)	14,25 g/l
Citronensäure·1 H₂O	0,21 g/l
ZnSO₄·7 H₂O	70,14 mg/l
CuSO₄·5 H₂O	10,5 mg/l
MnSO₄·4,5 H₂O	8,4 mg/l
H₃BO₃	8,4 mg/l
Na₂MoO₄·2 H₂O	8,4 mg/l
KI	2,1 mg/l
Myo-Inosit	0,374 g/l
Nicotinsäure	18,7 mg/l
Ca-D-pantothenat	28,05 mg/l
Vitamin B1 (Thiamin-HCl)	18,7 mg/l
p-Aminobenzoesäure	11,22 mg/l
Vitamin B6 (Pyridoxin-HCl)	1,87 mg/l
Biotin	1,122 mg/l
CaCO₃	10 g/l

1 Tropfen Actcol (Takeda Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) wurde zu jedem Kolben zugegeben.
50 ml (Endvolumen mit 5% Saatinokulum)/500-ml-Kolben mit Unterteilungen
Die Zellen wurden aus der fermentierten Brühe geerntet nach 7 Tagen Fermentation und auf die Ansammlung von Astaxanthin und β-Carotin mit HPLC analysiert, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
Tabelle 7 Wiederherstellung der Astaxanthinproduktion durch Rekombinanten, bei denen das AST-Gen integriert war (die Daten sind angegeben als relativer Titer von Astaxanthin und β-Carotin bezogen auf den Titer von β-Carotin, das von P. rhodozyma ATCC96815 akkumuliert wurde)
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte DNA enthaltend eine Nucleotidsequenz, die ein Enzym mit Astaxanthinsynthaseaktivität codiert, das die Reaktion von β-Carotin zu Astaxanthin katalysiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus den Nucleotidsequenzen, die in SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 3 dargestellt sind.
Isolierte DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz (a) eine Nucleotidsequenz ist, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes eine Astaxanthinsynthase codiert mit der gleichen Aminosäuresequenz wie die, die von den in SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nucleotidsequenzen codiert wird; (b) eine Nucleotidsequenz ist, die mit dem Komplement der Nucleotidsequenzen von SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 3, die eine Astaxanthinsynthase codieren, unter mäßig stringenten Hybridisierungsbedingungen mit 50% (V/V) Formamid, 5 × SSC, 2% (G/V) Blockierungsreagenz, 0,1% (G/V) N-Lauroylsarcosin und 0,3% (G/V) SDS bei einer Temperatur von 42°C über Nacht hybridisiert.
Vektor oder Plasmid enthaltend die isolierte DNA nach Anspruch 1 oder Anspruch 2.
Wirtszelle, die mit der isolierten DNA, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, oder einem Vektor oder Plasmid nach Anspruch 3 transformiert oder transfiziert ist.
Polypeptid, das von der isolierten DNA, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, codiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit einer Aktivität als Astaxanthinsynthase, das umfasst, dass eine transformierte Wirtszelle, wie in Anspruch 4 beansprucht, unter Bedingungen, die zur Erzeugung des Enzyms führen, gezüchtet wird.
Verfahren zur biologischen Produktion von Astaxanthin, das umfasst, dass eine oder mehrere isolierte DNAs nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 in einen geeigneten Wirtsorganismus eingebracht werden, der erhaltene Organismus unter Bedingungen, die zur Produktion von Astaxanthin führen, gezüchtet wird und Astaxanthin aus der Kultur gewonnen wird.
Verfahren zur Herstellung von Astaxanthin, wobei das Verfahren umfasst, dass β-Carotin mit einem Polypeptid in Kontakt gebracht wird, das von den Nucleotidsequenzen codiert wird, wie in SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 3 gezeigt, und das eine Aktivität als Astaxanthinsynthase aufweist in Gegenwart eines Elektronendonators, wie Cytochrom-P450-Reduktase, der das Reaktionszentrum des Polypeptids in einer Reaktionsmischung reduzieren kann, die das Polypeptid in Form einer rekonstituierten Membran enthält, die aus einer biologischen Membran, wie einer Mikrosomen- oder einer Mitochondrien-Membran, hergestellt wurde, oder worin das Polypeptid in Form einer rekonstituierten künstlichen Membran, wie einem Liposom, vorhanden ist.