DE69433969T2 - Dna - kette zur synthese von xanthophyll und prozess zur herstellung von xanthophyll - Google Patents

Dna - kette zur synthese von xanthophyll und prozess zur herstellung von xanthophyll Download PDF

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    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Stränge, die zur Synthese von Ketogruppen-haltigen Xanthophyllen (Ketocarotinoide), wie beispielsweise Astaxanthin, nützlich sind, die zum Verstärken der Farbe von Kulturfischen und Schalentieren, wie beispielsweise Seebrassen, Lachsen, Hummern und ähnlichen nützlich sind und für Nahrungsmittel als Farbstoff und als Antioxidationsmittel verwendet werden, auf ein Verfahren zum Herstellen von Ketogruppen-haltigen Xanthophyllen (Ketocarotinoide), wie beispielsweise Astaxanthin, unter Verwendung eines Mikroorganismus, in den die DNA-Stränge eingeschleust worden sind.
  • Stand der Technik
  • Der Begriff Xanthophylle bedeutet Carotinoidpigmente mit einer sauerstoffhaltigen Gruppe, wie beispielsweise einer Hydroxylgruppe, einer Ketogruppe oder einer Epoxygruppe. Carotinoide werden durch das Isoprenoidbiosynthese-Verfahren synthetisiert, welches in einem Zwischenstadium mit Steroiden und anderen Terpenoiden mit Mevalonsäure als Ausgangsmaterial verwendet wird. C15-Farnesylpyrophosphat (FPP), welches aus dem grundlegenden Isoprenbiosyntheseweg hervorgeht, wird mit C5-Isopentenylpyrophosphat (IPP) kondensiert, um C20-Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) zu ergeben. Zwei Moleküle von GGPP werden kondensiert, um ein farbloses Phytoen als Ausgangscarotinoid zu synthetisieren. Das Phytoen wird durch eine Serie von Entsättigungsreaktionen in Phytofluen, ζ-Carotin, Neurosporen und dann Lycopin umgewandelt, und Lycopin wird wiederum durch eine Cyclisierungsreaktion in β-Carotin umgewandelt. Es wird vermutet, dass eine Vielzahl von Xanthophyllen durch das Einschleusen einer Hydroxylgruppe oder einer Ketogruppe in das β-Carotin synthetisiert werden (siehe G. Britton, "Biosynthesis of Carotenoids"; Plant Pigments, T. W. Goodwin, Herausg. Academic Press, London, 1988, S. 133–182).
  • Die vorstelligen Erfinder haben es kürzlich möglich gemacht, einen Carotinoidbiosynthesegenkluster aus dem epiphytischen, nicht-fotosynthetischen Bakterium Erwinia uredovora in Escherichia coli zu klonieren, mit einem gelbfarbigen Index des Bakteriums, einer Vielzahl von Kombinationen an Genen, die in Mikroorganismen, wie beispielsweise Escherichia coli exprimiert werden, um Phytoen, Lycopin, β-Carotin und Zeaxanthin zu produzieren, welches ein Derivat des β-Carotin ist, in das Hydroxylgruppen eingeschleust wurden (siehe 10; N. Misawa, M. Nakagawa, K. Kobayashi, S. Yamano, Y. Izawa, K. Nakamura, K. Harashima, "Elucidation of the Erwinia uredovora Carotinoid biosynthetic Pathway by Functional Analysis of Gene Products Expressed in Escherichia coli", J. Bacteriol., 172, S. 6704–6712, 1990; N. Misawa, S. Yamano, H. Ikenaga, "Production of β-Carotine in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciencs by Introduction of the Biosynthesis Genes from Erwinia uredovora", Appl. environ. Microbiol., 57, S. 1847–1849, 1991; und japanische Patentanmeldung Nr. 58786/1991 (japanische Patentanmeldung Nr. 53255/1990): "DNA Strands useful for the Synthesis of Carotenoids").
  • Andererseits ist Astaxanthin, ein rotes Xanthophyll, ein typisches tierisches Carotinoid, das besonders in einer großen Vielzahl an marinen Tieren vorkommt, einschließlich roter Fische, wie beispielsweise der Seebrasse und dem Lachs, und in Krustazeen, wie beispielsweise Krabben und Hummern. Im Allgemeinen können die Tiere keine Carotinoide biosynthetisieren, so dass es für sie notwendig ist, Carotinoide aufzunehmen, die durch Mikroorganismen oder Pflanzen in ihrer Umgebung synthetisiert werden. Daher ist Astaxanthin bis dato verbreitet für die Verstärkung der Farbe von kultivierten Fischen und Schalentieren, wie beispielsweise der Seebrasse, Lachs, Hummer und ähnlichen, verwendet worden. Außerdem hat Astaxanthin nicht nur als Farbmittel in Nahrungsmitteln Aufmerksamkeit auf sich gezogen, sondern auch als Antioxidationsmittel zum Entfernen aktiven Sauerstoffs, der in den Körpern erzeugt wird, und welcher Karzinome auslöst (siehe Herausg. Takao Matsuno, "Physiological Functions and Bioactivities of Carotinoids in Animals", Kagaku to Seibutsu, 28, S. 219–227, 1990). Als Quellen für Astaxanthin sind Krustazeen, wie beispielsweise Krill im Antarktischen Ozean, kultivierte Produkte der Hefe Phaffia, kultivierte Produkte der Grünalge Haematococcus und Produkte bekannt gewiesen, die durch organische synthetische Verfahren erhalten werden. Wenn jedoch Krustazeen, wie beispielsweise Krill im Antarktischen Ozean oder ähnliche verwendet werden, benötigt es aufwendige Arbeit und hohe Ausgaben zur Isolierung von Astaxantin von Verunreinigungen, wie beispielsweise Lipiden während des Erntens und der Extraktion von Krill. Außerdem wird im Falle des kultivierten Produktes der Hefe Phaffia eine große Menge an Ausgaben zum Ernten und Extrahieren von Astaxanthin benötigt, da die Hefe feste Zellwände hat und Astaxanthin nur in einer geringen Ausbeute produziert. Auch im Fall des kultivierten Produkts der Grünalge Haematococcus ist nicht nur ein Ort zum Aufnehmen von Sonnenlicht oder eine Investition in einen Kulturapparatur zum Zurverfügungstellen von künstlichem Licht benötigt, um Licht zur Verfügung zu stellen, welches wesentlich zur Synthese von Astaxanthin ist, sondern es ist auch schwierig, Astaxanthin von Fettsäureestern als Nebenprodukten oder Chlorophyllen, die in den kultivierten Produkten vorhanden sind, abzutrennen. Aus diesen Gründen ist das Astaxanthin, das aus biologischen Quellen hergestellt wird, in der gegenwärtigen Situation dem, das durch organische synthetische Verfahren erhalten wird, auf Kostenbasis unterlegen. Die organischen synthetischen Verfahren haben jedoch das Problem der Nebenprodukte, die während der Umsetzungen erzeugt werden, hinsichtlich der Verwendung als Nahrungsmittel für Fische und Schalentiere und als Zusatzstoff für Nahrungsmittel, und die Produkte, die durch organische synthetische Verfahren erhalten werden, sind gegen die Vorliebe der Konsumenten für natürliche Produkte. So war es gewünscht, ein günstiges Astaxanthin bereitzustellen, das sicher ist, und das aus biologischen Quellen hergestellt werden kann und deswegen ein gutes Erscheinungsbild für Konsumenten hat, und ein Verfahren zu entwickeln, um Astaxanthin herzustellen.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Es würde als sehr nützlich erachtet werden, eine Gruppe an Genen zu finden, die eine Rolle bei der Biosynthese von Astaxanthin spielen, da es möglich ist, einem Mikroorganismus die Astaxanthinerzeugungsfähigkeit zu verleihen, indem ein Genkluster für die Astaxanthinbiosynthese in den Mikroorganismus eingeschleust wird, welcher optimal im Hinblick auf die Sicherheit als Nahrungsmittel und in der Leistungsstärke zum Herstellen von Astaxanthin ist, unabhängig von dem Vorhandensein von Astaxanthin-Produktionsfähigkeit. In diesem Fall wird kein Problem von Nebenprodukten als Verunreinigungen verursacht, so dass es als nicht so schwierig angesehen werden sollte, die Produktionsmenge an Astaxanthin mit einer kürzlich vorangeschrittenen Technik der Genmanipulierung auf ein Niveau zu steigern, das höher ist als das, welches durch organische Syntheseverfahren erreicht wird. Die Gruppen an Genen zum Synthetisieren von Zeaxanthin, einem der Xanthophylle, sind durch die vorstelligen Erfinder, wie oben beschrieben wurde, bereits erworben worden, während keine Gene, die Ketogruppen einschleusende Enzyme, welche für die Synthese von Astaxanthin benötigt werden, erfolgreich erhalten worden sind. Der Grund für das Scheitern des Erhaltens von Genen schließt ein, dass das Ketogruppen einschleusende Enzym ein Membranprotein ist und seine Wirkung verliert, wenn es aus der Membran isoliert wird, so dass es unmöglich war, das Enzym zu reinigen oder dessen Aktivität zu messen, und deswegen war keine Information über das Enzym zu erhalten. Deswegen war es bis dato unmöglich, Astaxanthin in Mikroorganismen mittels Genmanipulierung herzustellen.
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, DNA-Stränge bereitzustellen, die Gene enthalten, die zum Produzieren von Ketogruppen-haltigen Xanthophyllen (Ketocarotinoide) in Mikroorganismen benötigt werden, wie beispielsweise Astaxanthin, durch Erhalten solcher Gene, die für Enzyme kodieren, wie beispielsweise ein Ketogruppen einschleusendes Enzym, das zum Produzieren von Ketogruppen-haltigen Xanthophyllen (Ketocarotinoide), wie beispielsweise Astaxanthin, benötigt werden, und um ein Verfahren zum Herstellen Ketogruppen-haltiger Xanthophylle (Ketocarotinoide), wie beispielsweise Astaxanthin mit den Mikroorganismen bereitzustellen, die in die DNA-Stränge eingeschleust worden sind.
  • Ein Genklonierungsverfahren, welches häufig verwendet wird, umfasst für gewöhnlich das Reinigen des gewünschten Proteins, das teilweise Bestimmen der Aminosäuresequenz, und das Erhalten von Genen mit Hilfe einer synthetischen Probe, kann nicht verwendet werden, da die Reinigung des Astaxanthinsyntheseenzyms, wie oben beschrieben, unmöglich war. Deswegen haben die vorstelligen Erfinder auf die Tatsache Acht gegeben, dass das Kluster an Carotinoidsynthesegenen in dem nicht-fotosynthetischen Bakterium (Erwinia) in Escherichia coli funktioniert, wobei Lycopin und β-Carotin, von denen man ausgeht, dass sie Zwischenprodukte für die Biosynthese von Astaxanthin sind, ermöglicht werden, mit Kombinationen aus Genen aus dem Genkluster produziert zu werden, und haben Escherichia coli als Wirt zum Klonieren von Astaxanthinsynthesegenen verwendet. Die vorstelligen Erfinder haben auch darauf geachtet, dass einige marine Bakterien eine Astaxanthinproduktionsfähigkeit besitzen (A. Yokoyama, H. Izumida, W. Miki, "Marine bacteria produced astaxanthin", 10th International Symposium on Carotinoids, Abstract, CL11-3, 1993), dass eine Reihe verwandter Gene ein Kluster wie im Fall von Bakterien bilden würde, und dass der Genkluster funktional in Escherichia coli im Fall von Bakterien exprimiert werden würde. Die vorstelligen Erfinder haben deswegen Marinebakterien als Genquellen ausgewählt. Sie haben Recherchen mit einer Kombination aus diesen zwei Mitteln durchgeführt und erfolgreich die Gengruppe erhalten, die zur Synthese von Astaxanthin und den anderen Ketogruppen-haltigen Xanthophyllen in Marinebakterien benötigt wird. Sie haben dadurch die vorliegende Erfindung erfüllt. Zusätzlich ist in der vorliegenden Erfindung zuerst aufgeklärt worden, dass der Astaxanthinsynthesegenkluster in Marinebakterien ein Kluster bildet und seine Wirkung in Escherichia coli ausübt, und diese Genprodukte β-Carotin und Lycopin als Substrat verwenden können.
  • Die DNA-Stränge gemäß der vorliegenden Erfindung sind wie folgt aufgeführt.
    • (1) Ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit der Enzymaktivität zum Umwandeln der Methylengruppe an der 4-Position des β-Iononrings in eine Ketogruppe kodiert.
    • (2) Ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität zum Umwandeln der Methylengruppe an der 4-Position des β-Iononrings in eine Ketogruppe kodiert und eine Aminosäuresequenz besitzt, die im wesentlichen die Aminosäurenn Nrn. 1 bis 212 hat, welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
    • (3) Ein DNA-Strang, der mit dem DNA-Strang, der in (2) beschrieben ist, hybridisiert und eine Nukleotidsequenz hat, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität, die in (2) beschrieben ist, kodiert.
    • (4) Ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität zum Umwandeln der Methylengruppe an der 4-Position des β-Iononrings in eine Ketogruppe kodiert, und mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen aus den Aminosäuren Nrn. 1 bis 242 besteht, die in der SEQ ID NO: 9 gezeigt ist.
    • (5) Ein DNA-Strang, der mit dem DNA-Strang, der in (4) beschrieben ist, hybridisiert und mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, das eine Enzymaktivität hat, die in (4) beschrieben ist.
    • (6) Ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität zum Umwandeln von β-Carotin in Canthaxanthin über Echinenon und mit einer Aminosäuresequenz hybridisiert, die im wesentlichen die Aminosäuren Nrn. 1 bis 212 kodiert, die in der SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
    • (7) Ein DNA-Strang, der mit dem DNA-Strang, der in (6) beschrieben ist, hybridisiert, und mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität, die in (6) beschrieben ist, kodiert.
    • (8) Ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, das die Enzymaktivität zum Umwandeln von β-Carotin in Canthaxanthin über Echinenon besitzt und mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen die Aminosäuren Nrn. 1 bis 242 aufweist, die in SEQ ID NO: 9 gezeigt ist.
    • (9) Ein DNA-Strang, der mit dem DNA-Strang, der in (8) beschrieben ist, hybridisiert und mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität, die in (8) beschrieben ist, kodiert.
    • (10) Ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität zum Umwandeln der Methylengruppe an der 4-Position des 3-Hydroxy-β-iononrings in eine Ketogruppe kodiert.
    • (11) Ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität zum Umwandeln der Methylengruppe an der 4-Position des 3-Hydroxy-β-iononrings in eine Ketogruppe kodiert und mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen aus den Aminosäuren Nrn. 1 bis 212 besteht, welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
    • (12) Ein DNA-Strang, der mit dem DNA-Strang hybridisiert, der in (11) beschrieben ist, und mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität, die in (11) beschrieben ist, kodiert.
    • (13) Ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität zur Umwandeln der Methylengruppe an der 4-Position des 3-Hydroxy-β-iononrings in eine Ketogruppe und mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen aus den Aminosäuren Nrn. 1 bis 242 besteht, welche in SEQ ID NO: 9 gezeigt ist, kodiert.
    • (14) Ein DNA-Strang, der mit dem DNA-Strang, der in (13) beschrieben ist, hybridisiert und mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität kodiert, die in (13) beschrieben ist.
    • (15) Ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität zum Umwandeln von Zeaxanthin in Astaxanthin durch 4-Ketozeaxanthin kodiert, und mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen die Aminosäuren Nrn. 1 bis 212, welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, aufweist.
    • (16) Ein DNA-Strang, der mit dem DNA-Strang, der in (15) beschrieben ist, hybridisiert, und mit einer Nukleotidsequenz, welche ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität, die in (15) beschrieben ist, kodiert.
    • (17) Ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, welche ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität zum Umwandeln von Zeaxanthin in Astaxanthin mittels 4-Ketozeaxanthin kodiert, und mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen aus Aminosäuren Nrn. 1 bis 242 besteht, welche in SEQ ID NO: 9 gezeigt ist.
    • (18) Ein DNA-Strang, der mit dem DNA-Strang hybridisiert, der in (17) beschrieben ist und mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität, die in (17) beschrieben ist, kodiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen von Xanthophyllen.
  • Das heißt, dass das Verfahren zum Herstellen von Xanthophyllen gemäß der vorliegenden Erfindung unten ausgeführt wird.
    • (1) Ein Verfahren zum Herstellen eines Xanthophylls, umfassend das Einschleusen der DNA-Stränge, wie in einem der oben erwähnten DNA-Stränge (1) bis (9) beschrieben, in einen Mikroorganismus mit einer β-Carotinsynthesefähigkeit, Kultivieren des transformierten Mikroorganismus in einem Kulturmedium, und Erhalten von Canthaxanthin oder Echinenon aus den kultivierten Zellen.
    • (2) Ein Verfahren zum Herstellen eines Xanthophylls, umfassend das Einschleusen des in einem der oben erwähnten DNA-Stränge (10 bis 18) beschriebenen DNA-Strangs in einen Mikroorganismus mit Zeaxanthinsynthesefähigkeit, Kultivieren des transformierten Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Erhalten von Astaxanthin oder 4-Ketozeaxanthin aus den kultivierten Zellen.
    • (3) Ein Verfahren zum Herstellen eines Xanthophylls gemäß einem der oben erwähnten Verfahren (1) bis (2), wobei der Mikroorganismus ein Bakterium oder eine Hefe ist.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 stellt diagrammartig die Nukleotidsequenz des Ketogruppen-einschleusenden Enzymgens (crt W-Gen) des Marinebakteriums Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 und die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das hierdurch kodiert wird, dar.
  • 2 stellt diagrammartig die Nukleotidsequenz des Hydroxylgruppen-einschleusenden Enzymgens (crt Z-Gen) des Marine-Bakteriums Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 und die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das hierdurch kodiert wird, dar.
  • 3 stellt diagrammartig die Nukleotidsequenz des Lycopin-cyclisierenden Enzymgens (crt Y-Gen) des Marinebakteriums Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 und die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das hierdurch kodiert wird, dar.
  • 4 stellt diagrammartig die Abfolge der Sequenzen dar, die auf die in 3 dargestellten folgen.
  • 5 stellt diagrammartig die Nukleotidsequenz des Xanthophyllsynthesegenklusters des Marinebakteriums Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 dar.
  • Die Buchstaben A bis F in 5 entsprechen denen in 1 bis 4.
  • 6 stellt diagrammartig die Fortsetzung der Sequenz, die der in 5 dargestellten folgt, dar.
  • 7 stellt diagrammartig die Fortsetzung der Sequenz, die der in 6 darstellten folgt, dar.
  • 8 stellt diagrammartig die Fortsetzung der Sequenz, die der in 7 dargestellten folgt, dar.
  • 9 stellt diagrammartig die Fortsetzung der Sequenz, die der in 8 dargestellten folgt, dar.
  • 10 stellt diagrammartig den Carotinoidbiosyntheseweg des nicht-fotosynthetischen Bakteriums Erwinia uredovora und die Funktionen der Carotinoidsynthesegene dar.
  • 11 stellt diagrammartig die Hauptbiosynthesewege für Xanthophyll des Marinebakteriums Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 und Alcaligenes sp. PC-1 und die Funktionen der Xanthophyllsynthesegene dar.
  • Die Funktion des crtY-Gens ist jedoch nur in dem erstgenannten Bakterium bestätigt worden.
  • 12 stellt diagrammartig eine Vielzahl an Deletionsplasmiden dar, die die Xanthophyll-Synthesegene (Kluster) des Marine-Bakteriums Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 enthalten.
  • Der Buchstabe P stellt den Promotor von lac des Vektors pBluescript II SK dar. Die Positionen zum Schneiden mit Restriktionsenzymen werden durch die Abkürzungen wie folgt dargestellt: Sa, SacI; X, XbaI; B, BamHI; P, PstI; E, EcoRI; S, SalI; A, ApaI; K, KpnI; St, StuI; N, NruI; Bg, BglII; Nc, NcoI; Hc, HincII.
  • 13 stellt diagrammartig die Nukleotidsequenz des Ketogruppen-einschleusenden Enzymgens (crtW-Gens) des Marine-Bakteriums Alcaligenes sp. PC-1 und die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das hierdurch kodiert wird, dar.
  • 14 stellt diagrammartig die Fortsetzung der Sequenzen, die denen in 13 darstellten folgen, dar.
  • 15 stellt diagrammartig die Nukleotidsequenz des Hydroxylgruppen einschleusenden Enzymgens (crtZ-Gens) des Marinebakteriums Alcaligenes sp. PC-1 und die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das hierdurch kodiert wird, dar.
  • 16 stellt diagrammartig die Nukleotidsequenz des Xanthophyllsynthesegenklusters des Marinebakterieums Alcaligenes sp. PC-1 und die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das hierdurch kodiert wird, dar.
  • Die Buchstaben A bis D in 16 entsprechen denen in 13 bis 15.
  • 17 stellt diagrammartig die Fortsetzung der Sequenzen, die denen in 16 dargestellten folgen, dar.
  • 18 stellt diagrammartig die Fortsetzung der Sequenzen, die denen in 17 dargestellten folgen, dar.
  • 19 stellt diagrammartig eine Vielzahl an Deletionsplasmiden dar, die die Xanthophyllsynthesegene (Kluster) des Marinebakteriums Alcaligenes sp. PC-1 enthalten.
  • Der Buchstabe P stellt den Promotor lac des Vektors pBluescript II DSk+ dar.
  • 20 stellt diagrammartig die Xanthophyllbiosynthesewege dar, die in dem marinen Bakterium Agrobacterium aurantiacus sp. Nr. MK1 und Alcaligenes sp. PC-1 biosynthetische Nebenwege enthalten, und die Funktionen der Xanthophyllsynthesegene.
  • Biosynthetische Nebenwege werden durch gepunktete Pfeile dargestellt.
  • Beste Art der Durchführung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, DNA-Stränge bereitzustellen, die zum Synthetisieren von Ketogruppen-haltigen Xanthophyllen (Ketocarotinoide) nützlich sind, wie beispielsweise Astaxanthin, das aus dem marinen Bakterium Agrobacterium auranthiacus sp. nov. MK1 und Alcaligenes sp. PC-1 stammt, und ein Verfahren zum Herstellen Ketogruppen-haltiger Xanthophylle (Ketocarotinoide), d. h. Astaxanthin, Phoenicoxanthin, 4-Ketozeaxanthin, Canthaxanthin und Echinenon, unter Verwendung eines Mikroorganismus, in den die DNA-Stränge eingeschleust worden sind.
  • Die DNA-Stränge gemäß der vorliegenden Erfindung werden im Prinzip allgemein durch die oben erwähnten DNA-Stränge (1) und (10) dargestellt, unter dem Gesichtspunkt der genauen chemisch erzeugten Reaktion, und im Grunde durch die oben erwähnten DNA-Stränge (2), (4), (11) und (13) definiert. Die spezifischen Beispiele der DNA-Stränge (2) und (4) sind die oben erwähnten DNA-Stränge (6) und (8); die spezifischen Beispiele der DNA-Stränge (11) und (13) sind die oben erwähnten DNA-Stränge (15) und (17). In diesem Zusammenhang hybridisieren die DNA-Stränge (3), (5), (7), (9), (12), (14), (16), (18) mit den DNA-Strängen (2), (4), (6), (8), (11), (13), (15) bzw. (17) unter stringenten Bedingungen.
  • Die durch die DNA-Stränge gemäß der vorliegenden Erfindung kodierten Polypeptide haben Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen einen spezifischen Bereich wie oben in den SEQ ID NOS: 2 und 4 und 9 und 11 (1 bis 2 und 13 bis 15) beschrieben sind, z. B. eine Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nrn. 1 bis 212 in der SEQ ID NO: 2 (A bis B in 1). In der vorliegenden Erfindung können vier Polypeptide, die durch diese DNA-Stränge kodiert werden, d. h. vier Enzyme, die an der Xanthophyllproduktionssreaktion teilnehmen, durch Deletion, Substitution oder Addition von einigen der Aminosäuren modifiziert werden, vorausgesetzt dass die Polypeptide die Enzymaktivität haben, die oben beschrieben wird (siehe Beispiel 13). Dies entspricht der "Aminosäuresequenzen ... im wesentlichen ...". Zum Beispiel ist ein Enzym, von dem eine Aminosäure an der ersten Position (Met) deletiert worden ist, ebenfalls in die Polypeptide oder Enzyme, die durch die Modifizierung der Aminosäuresequenz erhalten werden, eingeschlossen. In diesem Zusammenhang ist es überflüssig zu sagen, dass die DNA-Stränge gemäß der vorliegenden Erfindung zum Kodieren der Polypeptide auch eine Addition zu denen mit den Nukleotidsequenzen in einem spezifischen Bereich, der in SEQ ID NOS: 2, 4, 9 und 11 gezeigt ist, einschließen (1 bis 2 und 13 bis 15), degenerierte Isomere, die die gleichen Polypeptide wie oben kodieren, außer dass sie degenierte Kodons haben.
  • Ketogruppen-einschleusendes Enzymgen (crtW)
  • Die DNA-Stränge (1) bis (18) sind Gene, die die Ketogruppen-einschleusenden Enzyme kodieren (nachfolgend als crtW bezeichnet). Typische Beispiele dieser Gene sind crtW-Gene, die aus dem marinen Bakterium Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 oder Alcaligenes sp. PC-1 kloniert wurden, welche die DNA-Stränge sind, die die Nukleotidsequenzen umfassen, die die Polypeptide kodieren, die die Aminosäuresequenzen A bis B in 1 haben (Aminosäuren Nrn. 1 bis 212 in SEQ ID NO: 2) oder A bis B in 13 bis 14 (Aminosäuren Nrn. 1 bis 242 in SEQ ID NO: 9). Das crtW-Genprodukt (auch nachfolgend als CrtW bezeichnet) hat die Enzymaktivität zum Umwandeln der 4-Methylengruppe des β-Iononrings in eine Ketogruppe und eines der spezifischen Beispiele hat die Enzymaktivität zum Synthetisieren von Canthaxanthin mit β-Carotin als Substrat über Echinenon (siehe 11). Zusätzlich hat das crtW-Genprodukt auch die Enzymaktivität des Umwandelns der 4-Methylengruppe des 3-Hydroxy-β-iononrings in eine Ketogruppe, und eines der spezifischen Beispiele hat eine Enzymaktivität zum Synthetisieren von Astaxanthin mit Zeaxanthin als Substrat über 4-Ketozeaxanthin (siehe 11). In diesem Zusammenhang sind Polypeptide mit solchen Enzymaktivitäten und die DNA-Stränge, die die Polypeptide kodieren, bis heute nicht beschrieben worden, und die Polypeptide oder die DNA-Stränge, die Polypeptide kodieren, haben keine Gesamthomologie mit Polypeptiden oder DNA-Strängen, die bis jetzt beschrieben worden sind. Außerdem ist keine Information darüber erhältlich gewesen, dass ein Enzym eine Aktivität hat, direkt nicht nur eine Methylengruppe des β-Iononrings und des 3-Hydroxy-β-iononrings, sondern auch die anderen Verbindungen in eine Ketogruppe umzuwandeln. Außerdem wurde eine Homologie von CrtW, die bis zu 83% identisch auf Aminosäuresequenzniveau ist, zwischen Agrobacterium und Alcaligenes gezeigt.
  • Andererseits ist es möglich, Mikroorganismen, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnlichen, zu ermöglichen, β-Carotin oder Zeaxanthin unter Verwendung der Carotinoidsynthesegene des nicht-fotosynthetischen Bakteriums Erwinia zu produzieren, d. h. dass die crtE-, crtB-, crtI- und crtY-Gene von Erwinia dem Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnlichen, die β-Carotinproduktionsfähigkeit verleihen und dass die crtE-, crtB-, crtI-, crtY- und crtZ-Gene von Erwinia dem Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnlichen, die Zeaxanthinproduktionsfähigkeit verleihen (siehe 10 und die Offenlegungsschrift von WO 91/13078). Das heißt, dass das Substrat für CrtW durch den crt-Genkluster von Erwinia geliefert wird, so dass, wenn ein zusätzliches crtW-Gen in den Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnliche, eingeschleust wird, welches den vorher erwähnten crt-Genkluster von Erwinia enthält, der β-Carotin-produzierende Mikroorganismus Canthaxanthin über Echinenon herstellen wird, und der Zeaxanthin herstellende Mikroorganismus wird Astaxanthin durch 4-Ketozeaxanthin herstellen.
  • Hydroxylgruppen-einschleusendes Enzymgen (crtZ)
  • Die DNA-Stränge, die durch SEQ ID NOS: 4 und 11 beispielhaft dargestellt werden, sind Gene, die ein Hydroxylgruppen-einschleusendes Enzym kodieren (nachfolgend bezeichnet als crtZ). Typische Beispiele der Gene sind crtZ-Gene, die aus dem marinen Bakterium Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 oder Alcaligenes sp. PC-1 kloniert werden, welche die DNA-Stränge sind, die Nukleotidsequenzen umfassen, die die Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen C bis D in 2 kodieren (Aminosäuren Nrn. 1 bis 162 in SEQ ID NO: 4) oder C bis D in 15 (Aminosäuren Nrn. 1 bis 162 in SEQ ID NO: 11). Das crtZ-Genprodukt (auch nachfolgend bezeichnet als CrtZ) hat die Enzymaktivität des Anfügens einer Hydroxylgruppe an das 3-Kohlenstoffatom des β-Iononrings, und eines der spezifischen Beispiele ist die Enzymaktivität des Synthetisierens von Zeaxanthin unter Verwendung von β-Carotin als Substrat über β-Cryptoxanthin (siehe 11). Zusätzlich hat das crtZ-Genprodukt auch die Enzymaktivität des Hinzufügens einer Hydroxylgruppe an das 3-Kohlenstoffatom des 4-Keto-β-iononrings, und eines der spezifischen Beispiele ist eine Enzymaktivität des Synthetisierens von Astaxanthin mit Canthaxanthin als Substrat über Phoenicoxanthin (siehe 11). In diesem Zusammenhang ist bis heute von keinem Polypeptid mit der letztgenannten Enzymaktivität und über einen DNA-Strang, der das Polypeptid kodiert, berichtet worden. Außerdem zeigen CrtZ von Agrobacterium und Alcaligenes eine hohe Homologie mit CrtZ von Erwinia uredovora (57 und 58% Identität) auf Aminosäureniveau. Auch eine hohe Homologie von 90% Identität auf Aminosäuresequenzniveau wurde zwischen CrtZ von Agrobacterium und Alcaligenes gezeigt.
  • Es ist oben beschrieben worden, dass es möglich ist, einem Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnlichen, zu ermöglichen, β-Carotin unter Verwendung der Carotinoidsynthesegene des nicht-fotosynthetischen Bakteriums Erwinia zu produzieren. Außerdem ist oben beschrieben worden, dass es möglich ist, einem Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnlichen, zu ermöglichen, Canthaxanthin durch Hinzugabe von crtW herstellen. Das bedeutet, dass das Substrat für CrtZ von Agrobacterium oder Alcaligenes durch die crtE-, crtB-, crtI- und crtY-Gene von Erwinia bereitgestellt wird (Herstellung von β-Carotin) und, dass das crtW-Gen von Agrobacterium oder Alcaligenes hinzugegeben wird, so dass, wenn das crtZ-Gen von Agrobacterium oder Alcaligenes in einen Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnliche, eingeschleust wird, die die crt-Gengruppe enthalten, der β-Carotin-produzierende Mikroorganismus Zeaxanthin über β-Cryptoxanthin produzieren wird, und dass der Canthaxanthin-produzierende Mikroorganismus Astaxanthin über Phoenicoxanthin produzieren wird.
  • Lycopin-cyclisierendes Enzymgen (crtY)
  • Der DNA-Strang, der die Aminosäuresequenz, die im wesentlichen von E bis F der 3 und 4 kodiert (Aminosäuren Nrn. 1 bis 386 in SEQ ID NO: 6) ist ein Gen, das ein Lycopin-cyclisierendes Enzym kodiert (nachfolgend bezeichnet als crtY). Ein typisches Beispiel des Gens ist das crtY-Gen, das aus dem Marinebakterium Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 kloniert wurde, wenn es der DNA-Strang ist, der die Nukleotidsequenz umfasst, die das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz E bis F in 3 und 4 kodiert. Das crtY-Genprodukt (auch nachfolgend als CrtY-Gen bezeichnet) hat die Enzymaktivität des Synthetisierens von β-Carotin mit Lycopin als Substrat (siehe 11). Es ist möglich, einem Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnlichen, zu ermöglichen, Lycopin unter Verwendung der Carotinoidbiosynthesegene eines nicht-fotosynthetischen Bakteriums Erwinia herzustellen, d. h. dass die crtE-, crtB- und crtI-Gene von Erwinia einem Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnlichen, die Lycopinbiosynthesefähigkeit verleihen (siehe 10, und die offengelegte Veröffentlichung von WO 91/13078). Das heißt, dass das Substrat von CrtY von Agrobacterium durch die crt-Gengruppe von Erwinia geliefert wird, so dass, wenn crtY von Agrobacterium in einen Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnliche, eingeschleust wird, die die crt-Gengruppe enthalten, es möglich wird, dem Mikroorganismus zu ermöglichen, β-Carotin herzustellen.
  • In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass das CrtY von Agrobacterium eine signifikante Homologie von 44,3% Identität mit CrtY von Erwinia uredovora auf Aminosäuresequenzniveau hat, und dass diese CrtY-Enzyme auch die gleiche enzymatische Funktion haben (siehe 10 und 11).
  • Bakteriologische Eigenschaften der marinen Bakterien
  • Das Marinebakterium Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 und Alcaligenes sp. PC-1 als Quelle der Xanthophyllsynthesegene zeigen die folgenden bakteriologischen Eigenschaften:
  • Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1
  • (1) Morphologie
    • Form und Größe des Bakteriums: Stäbchen, 0,9 μm × 1,2 μm;
    • Beweglichkeit: ja;
    • Flagellum: peripheres Flagellum;
    • Polymorphismus der Zelle: keine;
    • Sporogenese: keine;
    • Gram-Färbung: negativ.
  • (2) Wachstum im Kulturmedium
    • Nährstoffagar-Plattenkultur: nicht-diffundierende zirkuläre orange Kolonien mit Glanz werden gebildet.
    • Nährstoff-Schrägagar-Kultur: nicht-diffundierende orange Bande mit Glanz werden gebildet.
    • Nährstofflösung-Flüssigkultur: homogenes Wachstum im gesamten Kulturmedium mit oranger Farbe.
    • Nährstoff-Gelatine-Stichkultur: Wachstum über die Oberfläche um die Stichporen.
  • (3) Physiologische Eigenschaften
    • Reduktion von Nitrat: positiv:
    • Denitrifizierungsreaktion: negativ;
    • Indolbildung: negativ;
    • Verwendung von Citronensäure: negativ;
    • Bildung von Pigmenten: fettlösliche rötlich-oranges Pigment;
    • Ureasewirkung: negativ;
    • Oxidaseaktivität: positiv;
    • Catalaseaktivität: positiv;
    • β-Glucosidaseaktivität (Esculindegradierbarkeit): positiv;
    • β-Galactosidaseaktivität: positiv;
    • Wachstumsbereich: pH = 5 bis 9; Temperatur = 10 bis 40°C;
    • Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob;
    • Beständigkeit gegenüber Seewasser: positiv;
    • O-F Test: Oxidierung;
    • Anabolische Fähigkeit von Sacchariden: Positiv: D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, D-Fructose, Lactose, Maltose, Saccharose, Glycogen, N-Acetyl-D-glucosamin; Negativ: L-Arabinose, D-Mannit, Inositol, L-Rhamnose, D-Sorbit;
    • Anabolische Fähigkeit gegenüber organischen Säuren: Positiv: Lactat; Negativ: Citrat, Malat, Gluconat, Caprinat, Succinat, Adipat;
    • Anabolische Fähigkeit gegenüber anderen organischen Materialien: Positiv: Inosin, Uridin, Glucose-1-phosphat, Glucose-6-phosphat; Negativ: Gelatine, L-Arginin, DNA, Casein.
  • Alcaligenes sp. PC-1
  • (1) Morphologie
    • Farm und Größe des Bakteriums: kurzer Stab, 1,4 μm;
    • Motilität: ja;
    • Flagellum: peripheres Flagellum;
    • Polymorphismus der Zelle: keiner;
    • Sporogenese: keine;
    • Gram-Färbung: negativ.
  • (2) Wachstum im Kulturmedium
    • Nährstoff-Agar-Plattenkultur: nicht-diffundierende zirkuläre orange Kolonien mit Glanz werden gebildet
    • Nährstoff-Schrägagar-Kultur: nicht-diffundierende orange Bande mit Glanz werden gebildet.
    • Nährstoff-Flüssig-Kultur: homogenes Wachstum über das gesamte Kulturmedium mit einer orangen Farbe.
    • Nährstoff-Gelatine-Stichkultur: Wachstum über die Oberfläche um die Stichporen.
  • (3) Physiologische Eigenschaften
    • Bildung von Pigmenten: fettlösliche rötlich-oranges Pigment;
    • Oxidaseaktivität: positiv;
    • Catalaseaktivität: positiv;
    • Wachstumsbereich: pH = 5 bis 9; Temperatur = 10 bis 40°C;
    • Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob;
    • Beständigkeit gegenüber Seewasser: positiv;
    • O-F Test: Oxidierung;
    • Degradierbarkeit von Gelatine: negativ.
  • Xanthophyllsynthesegenkluster anderer Marinebakterien
  • Es ist bis dato berichtet worden, dass 16 Marinebakterien die Fähigkeit haben, Ketocarotinoide, wie beispielsweise Astaxanthin und ähnliche, zu synthetisieren (A. Yokoyama, H. Izumida, W. Miki, "Marine bacteria produced astaxanthin", 10th International Symposium on Carotenoids, Abstract, CL11-3, 1993). Wenn eines der crt-Gene der zuvor erwähnten Marinebakterien Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK-1 oder Alcaligenes sp. PC-1 als Sonde verwendet wird, sollte der Genkluster, der eine Rolle in der Biosynthese von Ketocarotinoiden, wie beispielsweise Astaxanthin und ähnlichen, spielt, aus anderen Astaxanthin-produzierenden Marinebakterien erhalten werden, indem die Homologie dieser Gene verwendet wird. Tatsächlich haben die vorstelligen Erfinder erfolgreich die crtW- und crtZ-Gene als stark hybridisierende DNA-Fragmente aus chromosomaler DNA von Alcaligenes PC-1 unter Verwendung eines DNA-Fragments erhalten, das mit crtW und crtZ von Ag. aurantiacus sp. nov. MK1 als Sonde hybridisiert (siehe Beispiele für die Details). Außerdem, wenn Alteromonas SD-402 aus den verbliebenen 14 Marinebakterien mit einer Astaxanthinsynthesefähigkeit ausgewählt wurde und eine chromosomale DNA hiermit hergestellt wurde und einem Southern Hybridisierungsexperiment mit einem DNA-Fragment, enthaltend crtW und crtZ von Ag. aurantiacus sp. nov. MK1, unterzogen wurde, die Probe mit den Banden hybridisierte, die aus der chromosomalen DNA von Marinebakterien stammen. Die DNA-Stränge gemäß der vorliegenden Erfindung schließen auch einen DNA-Strang, der mit DNA-Strängen (2), (4), (6), (8), (11), (13), (15) und (17) hybridisiert.
  • Erwerb von DNA-Strängen
  • Obwohl eines der Verfahren zum Erhalten des DNA-Stranges mit einer Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz jedes Enzyms, das oben beschrieben wurde, das chemische Synthetisieren mindestens eines Teils der Stranglänge gemäß dem Verfahren zum Synthetisieren einer Nukleinsäure ist, wird angenommen, dass es zu bevorzugen ist, gegenüber dem chemischen Syntheseverfahren den DNA-Strang unter Verwendung von Gesamt-DNA zu erhalten, die mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut worden ist, um eine Bibliothek in Escherichia coli herzustellen, wobei aus dieser Bibliothek der DNA-Strang durch Verfahren, die in konventioneller Weise auf dem Gebiet der Gentechnik verwendet werden, erhalten wird, wie beispielsweise einem Hybridisierungsverfahren mit einer geeigneten Sonde (siehe den Xanthophyllsynthesegenkluster der anderen Marinebakterien).
  • Transformation eines Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli und Genexpression
  • Eine Vielzahl von Xanthophyllen können durch das Einschleusen der vorliegenden DNA-Stränge, die oben beschrieben wurden, in geeignete Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, z. B. Escherichia coli, Zymomonas mobilis und Agrobacterium tumefaciens, und in Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerivisiae, hergestellt werden.
  • Die Anleitung zum Einschleusen eines Fremdgens in einen bevorzugten Mikroorganismus ist unten beschrieben.
  • Das Verfahren oder die Prozedur des Einschleusens und Exprimierens des Fremdgens in einen Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnliche, umfasst solche, die für gewöhnlich in dem Gebiet der Gentechnik verwendet werden, zusätzlich zu denen, die unten in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, und können gemäß Verfahren oder Prozeduren durchgeführt werden (siehe z. B. "Vectors for Cloning Genes", Methods in Enzymology, 216, S. 469–631, 1992, Academic Press, und "Other Bacerial Systems", Methods in Enzymology, 204, S. 305–636, 1991, Academic Press).
  • Escherichia coli
  • Das Verfahren zum Einschleusen fremder Gene in Escherichia coli schließt mehrere wirksame Verfahren, wie beispielsweise das Hanahan-Verfahren und das Rubidium-Verfahren, ein, und die fremden Gene können gemäß diesen Verfahren eingeschleust werden (siehe z. B. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989). Während Fremdgene in Escherichia coli gemäß konventionellen Verfahren exprimiert werden können (siehe z. B. "Molecular Cloning – A Laboratory Manual"), kann die Expression z. B. mit einem Vektor für Escherichia coli mit einem lac-Promotor in der pUC- oder pBluescript-Serie durchgeführt werden. Die vorstelligen Erfinder haben den Vektor pBluescript II SK oder KS für Escherichia coli mit einem lac-Promotor und ähnliche verwendet, und die crtW-, crtZ- und crtY-Gene von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 und die crtW- und crtZ-Gene von Alcaligenes sp. PC-1, und ermöglicht, dass die Gene in Escherichia coli exprimiert werden.
  • Hefe
  • Das Verfahren zum Einschleusen fremder Gene in Hefe Saccharomyces cerivisiae schließt Verfahren ein, die bereits etabliert wurden, wie beispielsweise das Lithiumverfahren und ähnliche, und die Einschleusung kann gemäß dieser Verfahren durchgeführt werden (siehe beispielsweise, Herausgeber Yuichi Akiyama, zusammengestellt durch die Bio-industry Association, "New Biotechnology of Yeast", veröffentlicht von Igaku Shuppan Center). Fremdgene können in Hefe unter Verwendung eines Promotors und eines Terminators, wie beispielsweise PGK und GPD exprimiert werden, um eine Expressionskassette zu konstruieren, in die das Fremdgen zwischen den Promotor und den Terminator inseriert wurde, so dass die Transkription durchgeführt wird, und indem die Expressionskassette in einen Vektor, wie beispielsweise das YRp-System inseriert wird, welches ein Multikopienvektor mit einer ARS-Sequenz des Hefechromosoms für Hefe als Replikationsursprung, das YEp-System, welches ein Multikopienvektor für Hefe ist mit einem Replikationsursprung, der 2 μm DNA von Hefe, und dem YIp-System, welches ein Vektor zum Integrieren eines Hefechromosoms ohne Replikationsursprung von Hefe ist (siehe "New Biotechnology of Yeast", veröffentlicht von Igaku Shuppan Center, a. a. O.; Nippon Nogei-Kagaku Kai ABC-Serien "Genetic Engineering for Producing Materials", veröffentlicht von Asakura Shoten; und S. Yamano, T. Ishii, M. Nakagawa, H. Ikenaga, N. Misawa, "Metabolic Engineering for Production of β-Carotine und Lycopine in Saccharomyces cerevisiae", Biosci. Biotech. Biochem., 58, S. 1112–1114, 1994).
  • Zymomonas mobilis
  • Fremde Gene können in ein Ethanol-herstellendes Bakterium Zymomonas mobilis durch das Konjugationstransferverfahren eingeschleust werden, welches Gram-negativen Bakterien inhärent ist, und die Fremdgene können unter Verwendung eines Vektors pZA22 für Zymomonas mobilis exprimiert werden (siehe Katsumi Nakamura, "Molecular Breeding of Zymomonas mobilis", Nippon Nogei-Kagaku Kaishi, 63, S. 1016–1018, 1989; und N. Misawa, S. Yamano, H. Ikanaga, "Production of β-Carotine in Zymomonas mobilis und Agrobacterium tumefaciens by Introduction of the Biosynthesis Genes from Erwinia uredovora", Appl. Environ. Micorbiol., 57, S. 1847–1849, 1991).
  • Agrobacterium tumefaciens
  • Fremdgene können in das pflanzenpathogene Bakterium Agrobacterium tumefaciens durch die Konjugationstransfermethode eingeschleust werden, die Gram-negativen Bakterien inhärent ist, und die fremden Gene können unter Verwendung eines Vektors pBI121 für ein Bakterium wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens exprimiert werden (siehe N. Misawa, S. Yamano, H. Ikenaga, "Production of β-Carotene in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by Introduction of the Biosynthesis Genes from Erwinia uredovora", Appl. Environ. Microbiol., 57, S. 1847–1849, 1991).
  • Produktion von Xanthophyllen durch Mikroorganismen
  • Der Genkluster für die Synthese von Ketocarotinoiden, wie beispielsweise Astaxanthin, das aus einem Marinebakterium stammt, kann durch das Verfahren oder die Methode, die oben für das Einschleusen und Exprimieren eines Fremdgens in einen Mikroorganismus beschrieben wurde, eingeschleust und exprimiert werden.
  • Farnesylpyrophosphat (FPP) ist ein Substrat, welches nicht nur Carotinoiden gemeinsam ist, sondern auch anderen Terpenoiden, wie beispielsweise Sesquiterpenen, Triperpenen, Sterolen, Hopanolen und ähnlichen. Im allgemeinen synthetisieren Mikroorganismen Terpenoide, wenn sie keine Carotinoide synthetisieren können, so dass alle Mikroorganismen im Grunde FPP als Zwischenmetabolit haben sollten. Außerdem hat der Carotinoidsynthesegenkluster eines nicht-fotosynthetischen Bakteriums Erwinia die Fähigkeit, die Substrate der crt-Genprodukte von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 oder Alcaligenes sp. PC-1 unter Verwendung von FPP als ein Substrat zu synthetisieren (siehe 10). Die vorstelligen Erfinder haben bereits bestätigt, dass, wenn die Gruppe der crt-Gene von Erwinia nicht nur in Escherichia coli eingeschleust wird, sondern auch in die zuvor erwähnten Mikroorganismen, d. h. in die Hefe Saccharomyces cerevisiae, das Ethanol-produzierende Bakterium Zymomonas mobilis, oder das pflanzenpathogene Bakterium Agrobacterium tumefaciens, Carotinoide, wie beispielsweise β-Carotin und ähnliche, hergestellt werden können, wie von diesen Mikroorganismen erwartet werden konnte (S. Yamano, T. Ishii, M. Nakagawa, H. Idenaga, N. Misawa, "Metabolic Engineering for Production of β-Carotine and Lycopine in Saccharomyces cerevisiae", Biosci. Biotech. Biochem., 58, S. 1112–1114, 1994; N. Misawa, S. Yamano, H. Ikenaga, "Production of β-Carotine in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by Introduction of the Biosynthetic Genes from Erwinia uredovora", Appl. Environ. Microbiol., 57, S. 1847–1849, 1991; und japanische Patentanmeldung Nr. 58786/1991 (japanische Patentanmeldung Nr. 53255/1990) der vorstelligen Erfinder: "DNA Strands useful for the Synthesis of Carotenoids").
  • Deswegen sollte es im Prinzip möglich sein, all diesen Mikroorganismen, in denen die Geneinschleusung und das Expressionssystem etabiliert worden ist, zu ermöglichen Ketocarotinoide, wie beispielsweise Astaxanthin und ähnliche, durch das Einschleusen der Kombination des Carotinoidsynthesegenklusters, der aus Erwinia stammt, und der DNA-Stränge gemäß der vorliegenden Erfindung (typischerweise der Carotinoidsynthesegenkluster, der aus Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 oder Alcaligenes sp. PC-1) stammt), zum gleichen Zeitpunkt im gleichen Mikroorganismus herzustellen. Das Verfahren zum Herstellen einer Vielzahl von Ketocarotinoiden in Mikroorganismen wird unten beschrieben.
  • Herstellung von Canthaxanthin und Echinenon
  • Es ist möglich, Canthaxanthin als Endprodukt und Echinenon als Zwischenmetabolit durch das Einschleusen und Exprimieren der crtE-, crtB-, crtI- und crtY-Gene von Erwinia uredovora in einen Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli, welche für die Synthese von β-Carotin, sowie in anderen der DNA-Stränge der vorliegenden Erfindung (1) bis (9), welche ein Ketogruppen-einschleusendes Enzymgen ist (typischerweise das crtW-Gen von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 oder Alcaligenes PC-1) zu produzieren. Die Ausbeute des Verhältnisses von Canthaxanthin und Echinenon können durch das Kontrollieren des Expressionsniveaus des DNA-Stranges (crtW-Gen) oder das Untersuchen der Kulturbedingungen eines Mikroorganismus mit dem DNA-Strang geändert werden. Zwei Ausführungsformen in Escherichia coli werden unten beschrieben, und weitere Details werden in den Beispielen dargestellt.
  • Das Plasmid pACCAR16ΔcrtX, welches ein Fragment ist, das die crtE-, crtB-, crtI- und crtY-Gene von Erwinia uredovora enthält, ist in den Escherichia coli-Vektor pACYC184 und in das Plasmid pAK916 eingeschleust worden, welches ein Fragment ist, welches das crtW-Gen von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 enthält, ist in den Escherichia coli-Vektor pBluescript II SK– in Escherichia coli JM101 eingeschleust werden und bis zur stationären Phase kultiviert worden, um die bakteriellen Zellen zu sammeln und die Carotinoidpigmente zu extrahieren. Die extrahierten Pigmente umfassten 94% Canthaxanthin und 6% Echinenon. Canthaxanthin wurde auch in einer Ausbeute von 3 mg, ausgehend von 2 Litern der Kulturlösung, erhalten.
  • Das Plasmid pACCAR16ΔcrtX, das ein Fragment ist, das die crtE-, crtB-, crtI- und crtY-Gene von Erwinia uredovora enthält, ist in den Escherichia coli-Vektor pACYC184 und ein Plasmid pPC17-3, das ein Fragment ist, welches das crtW-Gen von Alcaligenes PC-1 enthält, ist in den Escherichia coli-Vektor pBluecript II Sk+ eingeschleust worden, und wurden in Escherichia coli JM101 eingeschleust und bis zur stationären Phase kultiviert, um die bakteriellen Zellen zu sammeln, und die Carotinoidpigmente zu extrahieren. Die extrahierten Pigmente umfassen 40% Canthaxanthin und 50% Echinenon. Der Rest umfasste 10% nicht-umgesetztes β-Carotin.
  • Produktion von Astaxanthin und 4-Ketozeaxanthin
  • Es ist möglich, Astaxanthin als Endprodukt und 4-Ketozeaxanthin als Zwischenmetabolit durch das Einschleusen der crtE-, crtB-, crtI-, crtY- und crtZ-Gene in einen Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnliche, zu produzieren, und die crtE-, crtB-, crtI-, crtY- und crtZ-Gene von Erwinia uredovora, welche für die Synthese von Zeaxanthin benötigt werden, sowie einen der DNA-Stränge der vorliegenden Erfindung (10)–(18), welches ein Ketogruppen-einschleusendes Enzymgen ist (typischerweise das crtW-Gen von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 oder Alcaligenes PC-1). Die Ausbeuten oder das Verhältnis von Astaxanthin und 4-Ketozeoxanthin kann durch das Kontrollieren des Expressionsniveaus des DNA-Strangs (crtW-Gen) oder das Untersuchen der Kulturbedingungen eines Mikroorganismus mit dem DNA-Strang geändert werden.
  • Zwei Ausführungsformen in Escherichia coli werden unten beschrieben, und genaue Details werden in den Beispielen dargestellt.
  • Das Plasmid pACCAR25ΔcrtX, welches ein Fragment ist, das crtE-, crtB-, crtI-, crtY- und crtZ-Gene von Erinia uredovora enthält, ist in den Escherichia coli-Vektor pACYC184 eingeschleust worden, und das Plasmid pAK916, welches ein Fragment, das das crtW-Gen von Ag. aurantiacus sp. nov. MK1 enthält, ist in den Escherichia coli Vektor pBluescript II SK– eingeschleust worden, und diese wurden in Escherichia coli JM101 eingeschleust und bis zur stationären Phase kultiviert, um die Bakterienzellen zu sammeln und die Carotinoidpigmente zu extrahieren. Die Ausbeute der extrahierten Pigmente betrug 1,7 mg Astaxanthin und 1,5 mg 4-Ketozeaxanthin, bezogen auf 2 Liter der Kulturlösung.
  • Das Plasmid pACCAR25ΔcrtX, welches ein Fragment, das die crtE-, crtB-, crtI-, crtY- und crtZ-Gene von Erwinia uredovora enthielt, ist in den Escherichia coli-Vektor pACYC184 eingeschleust worden und das Plasmid pPC17-3, welches ein Fragment enthält, das das crtW-Gen aus Alcaligenes PC-1 enthält, ist in den Escherichia coli-Vektor pBluescript II SK+ inseriert worden, welche in Escherichia coli JM101 eingeschleust wurden und bis zur stationären Phase kultiviert wurden, um die bakteriellen Zellen zu sammeln und die Carotinoidpigmente zu extrahieren. Die Ausbeute der extrahierten Pigmente betrug ungefähr 1 mg Astaxanthin und 4-Ketozeaxanthin, bezogen auf 2 Liter der Kulturlösung.
  • Produktion von Astaxanthin und Phoenicoxanthin
  • Es ist möglich, Astaxanthin als Endprodukt und Phoenicoxanthin als Zwischenprodukt Metabolit durch das Einschleusen und durch das Exprimieren von den crtE-, crtB-, crtI- und crtY-Genen von Erwinia uredovora in einen Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli oder ähnliche, die für die Synthese von β-Carotin benötigt werden, und irgendeines der DNA-Stränge der vorliegenden Erfindung (1)–(9), welche ein Ketogruppen-einschleusendes Enzymgen ist (typischerweise das crtW-Gen von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 oder Alcaligenes PC-1) und irgendeinen der DNA-Stränge der vorliegenden Erfindung, die beispielhaft dargestellt werden durch die SEQ ID NOS: 4 und 11, welche ein Hydroxylgruppen-einschleusendes Enzymgen ist (typischerweise das crtZ-Gen von Ag. aurantiacus sp. nov. MK1 oder Alcaligenes PC-1) zu produzieren. Die Ausbeuten oder das Verhältnis von Astaxanthin und Phoenicoxanthin können durch das Kontrollieren der Expressionsniveaus der DNA-Stränge (crtW- und crtZ-Gene) oder durch das Untersuchen der Kulturbedingungen eines Mikroorganismus mit den DNA-Strängen geändert werden. Eine Ausführungsform in Escherichia coli wird unten beschrieben und weitere Details werden in den Beispielen ausgeführt.
  • Das Plasmid paCCAR16ΔcrtX, welches ein Fragment ist, das crtE-, crtB-, crtI- und crtY-Gene von Erwinia uredovora enthält, ist in den Escherichia coli-Vektor pACYC184 inseriert worden, und das Plasmid pAK96K, welches ein Fragment ist, das die crtW- und crtZ-Gene von Ag. aurantiacus sp. nov. MK1 enthält, ist in den Escherichia coli-Vektor pBluescript II SK– inseriert worden, welche in Escherichia coli JM101 eingeschleust wurden und bis zur stationären Phase kultiviert wurden, um die bakteriellen Zellen zu sammeln und die Carotinoidpigmente zu extrahieren. Die Ausbeute der extrahierten Pigmente umfasste 3 mg Astaxanthin und 2 mg Phoenicoxanthin, ausgehend von 4 Litern Kulturlösung.
  • Hinterlegung der Mikroorganismen
  • Die Mikroorganismen als Genquellen der DNA-Stränge der vorliegenden Erfindung und Escherichia coli, die die isolierten Gene trägt (die DNA-Stränge der vorliegenden Erfindung) sind am National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt worden.
    • (i) Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 Hinterlegungsnummer: FERM BP-4506 Zugesichertes Datum: 20. Dezember 1993
    • (ii) Escherichia coli JM101 (pAccrt-EIB, pAK92) Hinterlegungsnummer: FERM BP-4505 Zugesichertes Datum: 20. Dezember 1993
    • (iii) Alcaligense sp. PC-1 Hinterlegungsnummer: FERM BP-4760 Zugesichertes Datum: 27. Juli 1994
    • (iv) Escherichia coli β: pPC17 Hinterlegungsnummer: FERM BP-4761 Zugesichertes Datum: 27. Juli 1994
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter genauer unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, ohne die Erfindung zu begrenzen. Zusätzlich beruhen die gewünschten Experimente der Genmanipulierung, die hier verwendet werden, auf den Standardverfahren (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), solange sie nicht anders angegeben wurden.
  • Beispiel 1: Herstellung chromosomaler DNA
  • Chromosomale DNAs wurden aus drei marinen Bakterienstämmen, d. h. Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1, Alcaligenes sp. PC-1 und Alteromonas SD-402, hergestellt (A. Yokoyama, H. Izumida, W. Miki, "Marine bacteria produced astaxanthin", 10th International Symposium on Carotenoids, Abstract, CL11-3, 1993). Nachdem jedes dieser Marinebakterien in 200 ml eines Kulturmediums (ein Kulturmedium, das gemäß den Anweisungen aus "Marine Broth", hergestellt von DIFCO, hergestellt wurde) bei 25°C für 4 Tage bis zur stationären Phase gezüchtet wurde, wurden die bakteriellen Zellen eingesammelt, mit TES-Puffer gewaschen (20 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,1 M NaCl, pH 8), einer Wärmebehandlung bei 68°C für 15 min unterworfen, und in Lösung I (50 mM Glucose, 25 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8) suspendiert, welche 5 mg/ml Lysozym (hergestellt von Seikagaku Kogyo) und 100 μg/ml an RNase A (hergestellt von Sigma) enthält. Nach einer Inkubation der Suspension bei 37°C für 1 h wurde Proteinase K (hergestellt von Boehringer-Mannheim) hinzugegeben und das Gemisch wurde für 10 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde SARCOSIL (N-Lauroylsarcosin NA, hergestellt von Sigma) bis zu einer Endkonzentration von 1% hinzugegeben, und das Gemisch wurde ausreichend gemischt, wurde es bei 37°C für einige Stunden inkubiert. Das Gemisch wurde mehrere Male mit Phenol/Chloroform extrahiert und Ethanol in doppelter Menge wurde langsam hinzugegeben. Die so abgelagerte DNA wurde um einen Glasstab gewickelt, mit 70% Ethanol gespült und in 2 ml TE-Puffer gelöst (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8), um eine chromosomale DNA-Lösung herzustellen.
  • Beispiel 2: Herstellung von Wirten für eine Cosmid-Bibliothek
  • (1) Herstellung von Phytoen-produziertem Escherichia coli
  • Nach der Entfernung des BstEII(1235)-Eco521(4926)-Fragments aus Plasmid pCAR16 mit dem Carotinoidsynthesegenkluster, außer dem crtZ-Gen von Erwinia uredovora (N. Misawa, M. Nakagawa, K. Kobayashi, S. Yamano, Y. Izawa, K. Nakamura, K. Harashima, "Elucidation von the Erwinia uredovora Carotenoid Biosynthetic Pathway by Functional Analysis of Gene Products expressed in Escherichia coli", J. Bacteriol., 172, S. 6704–6712, 1990; und japanische Patentanmeldung Nr. 58786/1991 (japanische Patentanmeldung Nr. 53255/1990): "DNA Strands useful for the Synthesis of Carotenoids"), wurde ein 2,3 kb Asp718(KpnI)-EcoRI-Fragment, das die crtE- und crtB-Gene enthält, welche für die Herstellung von Phytoenen benötigt werden, ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde dann in die EcoRV-Schnittstelle des E. coli-Vektors pACYC184 inseriert, um ein gewünschtes Plasmid (pACCRT-EB) zu ergeben. Das Bakterium E. coli, das pACCRT-EB enthält, weist eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Chloramphenicol (Cmr) auf und stellt Phytoene her (H. Linden, N. Misawa, D. Chamovitz, I. Pecker, J. Hirschberg, G. Sandmann, "Functional Complementation in Escherichia coli of Different Phytoene Desaturase Genes and Analysis of Accumulated Carotenes", Z. Naturforsch., 46c, 1045–1051, 1991).
  • (2) Herstellung eines Lycopin-proudzierenden Escherichia coli
  • Nach der Entfernung von dem BstEII(1235)-SnaBI(3497)-Fragments aus dem Plasmid pCAR16 mit dem Carotinoidsynthesegenkluster, außer dem crtZ-Gen von Erwinia uredovora, wurde ein 3,75 kb Asp718(KpnI)-EcoRI-Fragment, das die crtE-, crtI- und crtB-Gene enthält, welche für die Produktion von Lycopin benötigt werden, ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde dann in die EcoRV-Schnittestelle des E. coli-Vektors pACYC184 inseriert, um das gewünschte Plasmid zu ergeben (pACCRT-EIB). Das Bakterium E. coli, das pACCRT-EIB enthält, weist Cmr auf und stellt Lycopin her (F. X. Cunningham Jr., D. Chamovitz, N. Misawa, E. Gatt, J. Hirschberg, "Cloning and Functional Expression in Escherichia coli of Cyanobacterial Gene for Lycopine Cyclase, the Enzyme that catalyzes the Biosynthesis of β-Carotines", FEBS Lett., 328, 130–138, 1993).
  • (3) Herstellung von β-Carotin-produzierenden Escherichia coli
  • Nachdem das crtX-Gen durch das Unterwerfen des Plasmids pCAR16 mit einem Carotinoidsynthesegenkluster außer dem crtZ-Gen von Erwinia uredovora gegenüber einem Verdau mit dem Restriktionsenzym BstEII, einer Klenow-Fragmentbehandlung und der Ligationsreaktion inaktiviert wurde, wurde ein 6,0 kb Asp718(KpnI)-EcoRI-Fragment, das die crtE-, crtY-, crtI- und crtB-Gene enthält, welche für die Herstellung von β-Carotin benötigt werden, ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde dann in die EcoRV-Schnittstelle des E. coli-Vektors pACYC184 inseriert, um das gewünschte Plasmid zu ergeben (nachfolgend als pACCAR16ΔcrtX bezeichnet). Das Bakterium E. coli, das pACCAR16ΔcrtX enthält, weist Cmr auf und stellt β-Carotin her. In diesem Zusammenhang wurden das Restriktionsenzym und die Enzyme, die für die genetische Manipulation verwendet wurden, von Takara Shuzo (K. K.) oder Boehringer-Mannheim bezogen.
  • Beispiel 3: Herstellung einer Cosmid-Bibliothek und Erwerb von Escherichia coli, welche eine orange Farbe aufweisen
  • Nachdem das Restriktionsenzym Sau3AI in einer Menge von einer Einheit zu 25 μg der chromosomalen DNA von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 hinzugegeben wurde, wurde das Gemisch für 15 min bei 37°C inkubiert und bei 68°C für 10 min hitzebehandelt, um das Restriktionsenzym zu inaktivieren. Unter dieser Bedingung wurden viele teilweise mit Sau3AI verdaute Fragmente von ungefähr 40 kb erhalten. Der Cosmidvektor pJBB (der gegenüber Ampicillin resistent ist (Apr)), welcher einem BamHI-Verdau und einer alkalischen Phosphatasebehandlung unterworfen wurde, und bei dem der rechte Arm (das kürzere Fragment) von pJBB mit SalI/BamHI verdaut worden ist, und dann aus dem Gel gewonnen wurde, wurde mit einem Teil der obigen Sau3AI-Teilfragmente gemischt und über Nacht bei 12°C ligiert. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass pJBB von Amersham bezogen wurde.
  • Phagenpartikel wurden in einer Menge erhalten, die ausreicht, um eine Cosmidbibliothek herzustellen, indem eine in vitro Verpackung mit Gigapack Gold (hergestellt von Stratagene; erhältlich von Funakoshi) unter Verwendung der DNA, die oben beschrieben wurde, ligiert.
  • Nachdem Escherichia coli DH1 (ATCC33849) und Escherichia coli DH1, von denen jedes eines der in Beispiel 2 hergestellten drei Plasmide aufweist, mit den Phagenpartikeln infiziert wurden, wurden diese Bakterien verdünnt, so dass 100 bis 300 Kolonien auf einer Platte gefunden wurden, wurden sie auf LB ausplattiert, das ein geeignetes Antibiotikum enthält (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl), und für eine Dauer über Nacht bis einige Tage bei 37°C oder Raumtemperatur kultiviert.
  • Als Ergebnis wurden in Cosmid-Bibliotheken mit den einfachen Escherichia coli (beige) oder den Phytoen-produzierenden Escherichia coli (beige) mit pACCRT-EB als Wirt keine Kolonien erhalten, die eine veränderte Farbe haben, obwohl 10.000 oder mehr der Kolonien der entsprechenden Bibliotheken gescreent wurden. Andererseits traten in Cosmid-Bibliotheken, die die Lycopin-herstellenden Escherichia coli (hellrot) mit pACCRT-EIB oder den β-Carotin-produzierenden Escherichia coli (gelb) mit pACCAR16ΔcrtX als Wirt, Kolonien, die Orange aufwiesen, in einem Anteil von einem Stamm auf mehreren Hundert Kolonien auf. Die meisten dieser transformierten Escherichia coli-Stämme, die orange Farbe aufwiesen, enthielten das Plasmid pJB8, in das ungefähr 40 kb teilweise verdauter Sau3AI-Fragmente kloniert waren. Es wird aus dieser Tatsache ebenfalls verständlich, dass keine Kolonien mit veränderter Farbe bei Cosmid-Bibliotheken mit den einfachen Escherichia coli oder den Phytoen-produzierenden Escherichia coli mit pACCRT-EB als Wirt auftraten, dass Escherichia coli mit der Fähigkeit zum Herstellen der Carotinoidsynthese-Zwischenprodukte der späteren Schritte von mindestens Phytoen als Wirt zum Zweck des Expressionsklonierens des Xanthophyllsynthesegenklusters aus der chromosomalen DNA von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 verwendet werden sollten.
  • Beispiel 4: Lokalisierung eines Fragments, das einen Orangepigment-Synthesegenkluster enthält
  • Wenn man einige zehn individuelle Kolonien aus den orangen Kolonien, die in den Cosmid-Bibliotheken mit den Lycopin-produzierenden Escherichia coli (hellrot) mit pACCRT-EIB oder den β-Carotin-produzierenden Escherichia coli (gelb) mit pACCAR16ΔcrtX als Wirt ausgewählt, um die Plasmide zu analysieren, waren 33 kb–47 kb Fragmente, die teilweise mit Sau3AI verdaut waren, in den Vektor pJB8 in allen der Kolonien bis auf einen Stamm inseriert. Ein verbliebener Stamm (Lycopin-produziertes Escherichia coli als Wirt) enthält ein Plasmid, war ein 3,9 kb Fragment, das teilweise mit Sau3AI verdaut war, in pJB8 inseriert (nachfolgend bezeichnet als Plasmid pAK9). Dieses wurde als dasjenige betrachtet, das sich gebildet hatte, wenn eine in vivo Deletion des inserierten Fragments nach der Infektion von Escherichia coli auftrat. Das gleiche Pigment (identifiziert als Astaxanthin in Beispiel 6), wie das in den orangen Kolonien, die aus den anderen Cosmid-Bibliotheken erhalten wurde, wurde erfolgreich mit den Lycopin-produzierenden Escherichia coli mit pAK9 synthetisiert, wobei pAK9 als ein Material in den folgenden Analysen verwendet wurde.
  • Beispiel 5: Bestimmung der Nukleotidsequenz in dem Pigmentsynthesegenkluster für Orange
  • Das inserierte 3,9 kb EcoRI-Fragment, das aus pAK9 hergestellt wurde, wurde in die EcoRI-Schnittstelle des Escherichia coli-Vektors pBluescript II SK+ inseriert, um zwei Plasmide (pAK91 und pAK92) mit unterschiedlichen Richtungen des Fragments im Vektor zu ergeben. Die Restriktionsenzymkarte von einem der Plasmide (pAK92) ist in 12 dargestellt. Wenn man pAK92 in die Lycopin-produzierenden Escherichia coli einschleuste, wurden orange Kolonien als Ergebnis der Synthese von Astaxanthin (Beispiel 6) erhalten. Es wurde jedoch keine Fähigkeit zum Synthetisieren neuer Pigmente verliehen, selbst wenn pAK91 in die Lycopin-produzierenden Escherichia coli eingeschleust wurde. Es wurde daher davon ausgegangen, dass der Pigmentsynthesegenkluster in dem Plasmid pAK92 die gleiche Richtung hat, wie die des lac-Promotor des Vektors. Als Nächstes wurde jedes der 2,7 kb PstI-Fragmente, die durch den PstI-Verdau von pAK92 erhalten wurden, ein 2,9 kb BamHI-Fragments, welches durch ein BamHI-Verdau von pAK92 erhalten wurde, und die 2,3 kb und 1,6 kb SalI-Fragmente, die durch den SalI-Verdau von pAK92 erhalten wurden, in den Vektor pBleuscript II SK– kloniert. Die Restriktionskarten der Plasmide, welche als pAK94, pAK96, pAK98, pAK910, pAK93 und pAK95 bezeichnet werden, werden in 12 dargestellt. Die Plasmide pAK94, pAK96, pAK98 und pAK910 haben den Pigmentsynthesegenkluster in der gleichen Richtung wie der lac-Promotor des Vektors, während die Plasmide pAK93 und pAK95 den Pigmentsynthesegenkluster in der entgegengesetzten Richtung zum Promotor haben.
  • Es wurde herausgefunden, dass, wenn das Plasmid pAK96 mit dem 2,9 kb BamHI-Fragment in die Lycopin-produzierten Escherichia coli eingeschleust wurde, die Transformante auch Astaxanthin synthetisierte, wie in dem Fall, dass das Plasmid pAK92 mit einem 3,9 kb EcoRI-Fragment eingeschleust wurde (Beispiel 6), so dass die DNA-Sequenz des 2,9 kb BamHI-Fragments bestimmt wurde.
  • Die DNA-Sequenz wurde durch das Herstellen von Deletionsmutanten des 2,9 kb BamHI-Fragments aus den normalen und entgegengesetzten Richtungen und das Bestimmen der Sequenz unter Verwendung von Klonen mit verschiedenen Längen von Deletionen bestimmt. Die Deletionsmutanten wurden aus den vier Plasmiden pAK96, pAK98, pAK93 und pAK95 gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt: Jedes der Plasmide, 10 μg, wurde mit SacI und XbaI verdaut und mit Phenol/Chloroform extrahiert, um die DNA mittels Ethanolpräzipitierung zu gewinnen. Jede der DNAs wurde in 100 μl ExoIII-Puffer gelöst (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM 2-Mercaptoethanol, pH 8,0), und 180 Einheiten von ExoIII-Nuklease wurde hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C aufbewahrt. Eine 10 μl-Portion wurde jede Minute als Probe entnommen, und zwei Proben wurden in ein Röhrchen transferiert, in dem 20 μl MB-Puffer (50 mM Natriumacetat, 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl2, 10% Glycerin, pH 4,5) enthalten ist, welches dann auf Eis gestellt wurde. Nach Vollendung des Probenziehens wurden fünf Röhrchen, die so erhalten wurden, bei 65°C für 10 min belassen, um das Enzym zu inaktivieren, es wurden fünf Einheiten Mungbohnennuklease hinzugegeben, und die Gemische wurden für 30 Minuten bei 37°C aufbewahrt. Nach der Reaktion wurden fünf DNA-Fragmente, die sich voneinander in den Graden der Deletion unterschieden, für jedes Plasmid mittels Agarosegelelektrophorese gewonnen. Die DNA-Fragmente, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden mit dem Klenow-Fragment geglättet, einer Ligationsreaktion bei 16°C über Nacht unterzogen, und Escherichia coli JM109 wurde transformiert. Eine einzelsträngige DNA wurde aus jedem der zahlreichen Klone, die auf diese Weise erhalten wurden, mit Hilfe eines Helferphagen M13K07 erhalten und die Sequenzierreaktion wurde einem Fluoreszenzprimer-Zyklussequenzier-Kit (fluorescent primer cycle-sequence kit) unterworfen, der von Applied Biosystem (K. K.) erhältlich ist, und die DNA-Sequenz wurde mit automatischen Sequenziergerät bestimmt.
  • Die so erhaltene DNA-Sequenz, die 2886 Basenpaare (bp) umfasst, ist in den 5 bis 9 dargestellt (SEQ ID NO: 7). Als Ergebnis der Untersuchung eines offenen Leserasters mit einer Ribosombindungsstelle vor dem Initiationskodon wurden drei offene Leseraster, die die entsprechenden Proteine (A bis B) (Nukleotidpositionen 229–864 der SEQ ID NO: 7), C bis D (Nukleotidpositionen 864–1349), E bis F (Nukleotidpositionen 1349–2506) in 5 bis 9) an den Positionen gefunden, an denen die drei Xanthophyllsynthesegene crtW, crtZ und crtY als vorhanden vermutet wurden. Für die zwei offene Leseraster von A–B und E–F ist der Initiationskodon GTG und für den verbleibenen offenen Leserahmen C–D ist er ATG.
  • Beispiel 6: Identifizierung des orangen Pigments
  • Das Lycopin-produzierende Escherichia coli JM101 mit pAK92 oder pAK96, das hierin eingeschleust wurde (Escherichia coli (pACCRT-EIB, paK92 oder pAK96); orange Farbe aufweisend) oder das β-Carotin-produzierende Escherichia coli JM101 mit pAK94 oder pAK96K (12), welche hierin einschleust wurden (Escherichia coli (pACCAR16ΔcrtX, paK94 oder pAK96K); orange Farbe aufweisend) wurde in 4 Litern 2YT-Kulturmedium kultiviert (1,6% Trypton, 1% Hefeextrakt, 0,5% NaCl), enthaltend 150 μg/ml Ampicillin (Ap, hergestellt von Meiji Seika) und 30 μg/ml Chloramphenicol (Cm, hergestellt von Sankyo) bei 37°C für 18 Stunden kultiviert. Die bakteriellen Zellen, welche aus der Kulturlösung gesammelt wurden, wurden mit 600 ml Aceton extrahiert, konzentriert, zwei Mal mit 400 ml Chloroform/Methanol (9/1) extrahiert und bis zur Trockenheit auf konzentriert. Dann wurde eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durch das Lösen des Restes in einer geringen Menge Chloroform/Methanol (9/1) und das Entwickeln auf einer Kieselgel-Platte für eine präparative TLC, welche von Merck hergestellt wird, mit Chloroform/Methanol (15/1) durchgeführt. Das ursprüngliche orange Pigment wurde in drei Punkten bei den Rf-Werten von 0,72, 0,82 und 0,91 durch die TLC aufgetrennt. Das Pigment mit dem dunkelsten Punkt bei Rf 0,72, entsprechend 50% der Gesamtmenge des orangen Pigments, und das Pigment des zweiten dunkleren Punktes bei Rf 0,82, wurden aus der TLC-Platte herausgekratzt, in einer geringen Menge Chloroform/Methanol (9/1) oder Methanol gelöst und auf einer Sephadex LH-20-Säule chromatographisch aufgetrennt (15 × 300 mm) mit einem Elutionsmittel aus Chloroform/Methanol (9/1) oder Methanol eluiert, um die gereinigten Materialien in einer Ausbeute von 3 mg (Rf 0,72) bzw. 2 mg (Rf 0,82) zu ergeben.
  • Es wurde aus den Ergebnissen der UV-sichtbaren, 1H-NMR- und FD-MS-(m/e 596)-Spektren aufgeklärt, dass das Pigment bei Rf 0,72 die gleiche planare Struktur hat wie das von Astaxanthin. Wenn das Pigment in Diethylether : 2-Propanol : Ethanol (5 : 5 : 2) gelöst wurde, um das CD-Spektrum zu messen, wurde bewiesen, dass es eine stereochemische Konfiguration von 3S, 3'S hat und dadurch als Astaxanthin identifiziert; siehe 11 für die Strukturformel). Auch das Pigment bei Rf 0,82 wurde als Phoenicoxanthin identifiziert (siehe 11 für die Strukturformel), aus den Ergebnissen der UV-sichtbaren, 1H-NMR- und FD-MS-(m/e 580)-Spektren. Zusätzlich war das Pigment bei 0,91 Canthaxanthin (Beispiel 7(2)).
  • Beispiel 7: Identifizierung von metabolischen Zwischenprodukten von Xanthophyll
  • (1) Identifizierung von 4-Ketozeaxanthin
  • Das Zeaxanthin-produzierende Escherichia coli wurde gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt. Das heißt, dass das Plasmid pCAR25 mit dem gesamten Carotinoidsynthesegenkluster aus Er. uredorora (N. Misawa, M. Nakagawa, K. Kobayashi, S. Yamano, Y. Izawa, K. Nakamura, K. Harashima, "Elucidation of the Erwinia uredovora Carotenoid Biosynthetic Pathway by Functional Analysis of Gene Products expressed in Escherichia coli", J. Bacteriol., 172, S. 6704–6712, 1990; und japanische Patentanmeldung Nr. 58786 (japanische Patentanmeldung Nr. 53255/1990): "DNA Strands useful for the Synthesis of Carotenoids") mit dem Restriktionsenzym BstEII verdaut wurde und einer Klenow-Fragment-Behandlung und einer Ligationsreaktion unterzogen wurde, um das crtX-Gen durch einen Wechsel des Leserasters zu inaktivieren, und dann wurde das 6,5 kb Asp718(KpnI)-EcoRI-Fragment, das die crtE-, crtY-, crtI-, crtB- und crtZ-Gene enthält, welche für das Herstellen von Zeaxanthin benötigt werden, ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde dann in die EcoRV-Schnittstelle des Escherichia coli-Vektors pACYC184 inseriert, um das gewünschte Plasmid zu ergeben (nachfolgend bezeichnet als pACCAR25ΔcrtX).
  • Das Zeaxanthin-produzierende Escherichia coli JM101 mit pAK910 oder pAK916 (12), das hierin eingeschleust wurde (Escherichia coli (pACCAR25ΔcrtX, pAK910 oder pAK916); orange aufweisend) wurde in 2 Litern 2YT-Kulturmedium, enthaltend 150 μg/ml Ap und 30 μg/ml Cm für 18 Stunden bei 37°C kultiviert. Die bakteriellen Zellen, die aus der Kulturlösung gesammelt wurden, wurden mit 300 ml Aceton extrahiert, konzentriert, ferner mit 200 ml Chloroform/Methanol (9/1) extrahiert, und bis zur Trockenheit auf konzentriert. Dann wurde eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durch das Lösen des Restes in einer geringen Menge an Chloroform/Methanol (9/1) durchgeführt, und es wurde auf einer Kieselgelplatte für eine präparative TLC unter Verwendung von Chloroform/Methanol (15/1) entwickelt, welche von Merck hergestellt wurde. Das ursprünglich orange Pigment wurde in drei Punkte bei Rf-Werten von 0,54 (46%), 0,72 (53%) und 0,91% (1%) mittels TLC aufgetrennt. Das Pigment bei Rf 0,54 wurde aus der TLC-Platte herausgekratzt, in einer geringen Menge Chloroform/Methanol (9/1) oder Methanol gelöst und mit dem Elutionsmittel Chloroform/Methanol (9/1) oder Methanol chromatographisch auf einer Sephadex LH-20-Säule (15 × 300 mm) aufgetrennt, um ein gereinigtes Material in einer Ausbeute von 1,5 mg zu ergeben.
  • Dieses Material wurde als 4-Ketozeaxanthin identifiziert (siehe 11 für die Strukturformel), da dessen UV-sichtbares Spektrum, FD-MS-Spektrum (m/e 582) und die Mobilität in Kieselgel-TLC (entwickelt mit Chloroform/Methanol (15/1)) perfekt mit dem der Standardprobe für 4-Ketozeaxanthin übereinstimmt (gereinigt aus Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1; japanische Patentanmeldung Nr. 70335/1993). Zusätzlich sind die Pigmente bei Rf 0,72 und 0,91 Astaxanthin (Beispiel 6) bzw. Canthaxanthin (Beispiel 7(2)).
  • (2) Identifizierung von Canthxanthin
  • Das β-Carotin-produzierende Escherichia coli JM101 mit pAK910 oder pAK916, welche hierin eingeschleust wurden (Escherichia coli (pACCAR16ΔcrtX, pAK910 oder pAK916); orange Farbe aufweisend) wurde in 2 Litern 2YT-Kulturmedium, enthaltend 150 μg/ml Ap und 30 μg/ml Cm bei 37°C für 18 Stunden kultiviert. Die bakteriellen Zellen, die aus der Kulturlösung gesammelt wurden, wurden mit 300 ml Aceton extrahiert, konzentriert, 2 Mal extrahiert mit Chloroform/Methanol (9/1) extrahiert und bis zur Trockenheit aufkonzentriert. Dann wurde eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durch das Lösen des Restes in einer geringen Menge Chloroform/Methanol (9/1) durchgeführt, und das Entwickeln unter Verwendung von Chloroform/Methanol (50/1) auf einer Kieselgelplatte für eine präparative TLC, welche durch Merck hergestellt wurde. Das Pigment des dunkelsten Punkts entsprach 94% der Gesamtmenge der orangen Pigmente und wurde aus der TLC-Platte ausgekratzt, in einer geringen Menge Chloroform/Methanol (9/1) oder Chloroform/Methanol (1/1) gelöst und chromatographisch auf einer Sephadex LH-20-Säule (15 × 300 ml) mit einem Elutionsmittel aus Chloroform/Methanol (9/1) oder Chloroform/Methanol (1/1) aufgetrennt, um ein gereinigtes Material in einer Ausbeute von 3 mg zu ergeben.
  • Dieses Material wurde als Canthaxanthin identifiziert (siehe 11 für die Strukturformel), da dessen UV-sichtbares Spektrum, 1H-NMR-, FD-MS-(m/e 564)-Spektren und die Mobilität in Kieselgel-TLC (Rf 0,53 bei Entwicklung mit Chloroform/Methanol (50/1)) perfekt mit dem der Standardprobe von Canthaxanthin (hergestellt von BASF) übereinstimmte. Zusätzlich entsprach das Pigment 6% der gesamten orangen Pigmente, die in dem ursprünglichen Extrakt gefunden wurden, wurden als Echinenon angesehen (siehe 11 für die Strukturformel) auf der Grundlage von seinem UV-sichtbaren Spektrum, der Mobilität auf Kieselgel-TLC (Rf 0,78 bei Entwicklung mit Chloroform/Methanol (50/1)), und die Mobilität in HPLC mit Nova Pack HR 6μ C18 (3,9 × 300 mm; hergestellt von Waters) (RT 16 Minuten durch Entwickelung bei einer Fließrate von 1,0 ml/min mit Acetonitril/Methanol/2-Propanol (90/6/4)).
  • (3) Identifizierung von Zeaxanthin
  • Das β-Carotin-produzierende Escherichia coli JM101 mit pAK96NK, welches hierin eingeschleust wurde (Escherichia coli (pACCAR16ΔcrtX, pAK96NK); gelbe Farbe aufweisend) wurde in 2 Litern 2YT-Kulturmedium, enthaltend 150 μg/ml Ap und 30 μg/ml an Cm für 18 Stunden bei 37°C kultiviert. Die Bakterienzellen wurden aus der Kulturlösung eingesammelt und wurden mit 300 ml Aceton extrahiert, konzentriert, 2 Mal mit 200 ml Chloroform/Methanol (9/1) extrahiert und bis zur Trockenheit auf konzentriert. Dann wurde eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durch das Lösen des Restes in einer geringen Menge an Chloroform/Methanol (9/1) durchgeführt und die Entwicklung auf einer Kieselgelplatte für eine präparative TLC, welche von Merck hergestellt wurde, mit Chloroform/Methanol (9/1) durchgeführt. Das Pigment des dunkelsten Flecks entsprach 87% der Gesamtmenge der gelben Pigmente, und wurde aus der TLC-Platte herausgekratzt, in einer geringen Menge Chloroform/Methanol oder in Methanol gelöst, und auf einer Sephadex LH-20-Säule chromatographisch (15 × 300 mm) mit einem Elutionsmittel aus Chloroform/Methanol (9/1) oder Methanol aufgetrennt, um ein gereinigtes Material in einer Ausbeute von 3 mg zu ergeben.
  • Es wurde aufgefunden, dass dieses Material die gleiche planare Struktur hat wie Zeaxanthin, da dessen UV-sichtbares Spektrum, 1H-NMR-, FD-MS-(m/e 568)-Spektren und die Mobilität in Kieselgel-TLC (Rf 0,59 nach Entwicklung mit Chloroform/Methanol (9/1)) perfekt mit der der Standardprobe von Zeaxanthin übereinstimmte (hergestellt von BASF). Wenn man das Pigment in Diethylesterh : 2-Propanol : Ethanol (5 : 5 : 2) löst, um das CD-Spektrum zu messen, wurde bewiesen, dass es eine stereochemische Konfiguration aus 3R, 3'R hat und dadurch als Zeaxanthin identifiziert (siehe 11 für die Strukturformel). Das Pigment, das 13% der gesamten gelben Pigmente, die in dem ursprünglichen Extrakt gefunden wurden, wurde als β-Cryptoxanthin angesehen (siehe 11 für die Strukturformel) auf der Grundlage von dessen UV-sichtbarem Spektrum, der Mobilität in Kieselgel-TLC (Rf 0,80 durch das beim Entwickeln mit Chloroform/Methanol (9/1)), und eine Mobilität in HPLC mit Nova Pack HR 6μ C18 (3,0 × 300 mm; hergestellt von Waters) (RT 19 Minuten beim Entwickeln mit einer Fließrate von 1,0 ml/min mit Acetonitril/Methanol/2-Propanol (90/6/4)).
  • (4) Identifizierung von β-Carotin
  • Das Lyopin-produzierende Escherichia coli JM101 mit pAK98, hierin eingeschleust (Escherichia coli (pACCRT-EIB, pAK98); gelbe Farbe aufweisend), wurde in 2 Litern eines 2YT-Kulturmediums, das 150 μg/ml Ap und 30 μg/ml Cm enthält, bei 37°C für 18 Stunden kultiviert. Die Bakterienzellen, die aus der Kulturlösung eingesammelt wurden, wurden mit 300 ml Aceton extrahiert, konzentriert und 2 Mal mit 200 ml Hexan extrahiert. Die Hexanschicht wurde auf konzentriert und auf einer Kieselgelsäule (15 × 300 mm) mit einem Elutionsmittel aus Hexan/Ethylacetat (50/1) chromatographisch aufgetrennt, um 3 mg eines gereinigten Materials zu ergeben.
  • Das Material wurde als β-Carotin identifiziert (siehe 11 für die Strukturformel), da alle Daten dessen UV-sichtbaren, FD-MS-Spektrum (m/e 536) und die Mobilität in HPLC mit Nova Pack HR 6μ C18 (3,9 × 300 mm; hergestellt von Waters), RT 62 Minuten beim Entwickeln bei einer Fließrate von 1,0 ml/min mit Acetonitril/Methanol/2-Propanol (90/6/4)) mit denen der Standardprobe von β-Carotin übereinstimmte (All-Trans-Typ, hergestellt von Sigma).
  • Beispiel 8: Identifizierung des Xanthophyllsynthese-Genklusters
  • (1) Identifizierung eines Ketogruppen-einschleusenden Enzymgens
  • Es ist aus den Ergebnissen des Beispiels 6 offensichtlich, dass in dem 3,9 kb-Fragment, das in pAK9 enthalten ist (Beispiel 4) oder pAK92, alle Gene, die für die Synthese von Astaxanthin aus Lycopin in dem 2,9 kb BamHI-Fragment auf der rechten Seite (pAK96, 12) enthalten ist. Das heißt, dass das 1,0 kp-Fragment auf der linken Seite nicht benötigt wird. Einzigartige NcoI- und KpnI-Schnittstellen sind in dem 2,9 kb BamHI-Fragment von pAK96 vorhanden. Es wird aus den Ergebnissen des Beispiels 7(3) herausgefunden, dass das 1,4 kb Fragment (pAK96NK) zwischen den NcoI- und KpnI-Schnittstellen eine Hydroxylgruppen-einschleusende Enzymaktivität hat, aber keine Ketogruppen-einschleusende Enzymaktivität aufweist. Canthaxanthin kann auch mit Hilfe des 2,9 kb BamHI-Fragments aus β-Carotin synthetisiert werden, von dem ein Fragment auf der rechten Seite von der einzigartigen SalI-Schnittstelle zwischen den NcoI- und KpnI-Schnittstellen entfernt worden ist (pAK910), oder mit dem 2,9 kb BamHI-Fragment synthetisiert werden kann, von dem ein Fragment auf der rechten Seite der HincII-Schnittstelle, welche auf der linken Seite der SalI-Schnittstelle entfernt worden ist (pAK916), aber die Aktivität zum Synthetisieren von Canthaxanthin aus β-Carotin verschwand in dem 2,9 kb BamHI-Fragment aus pAK96, von dem ein Fragment auf der rechten Seite der NcoI-Schnittstelle linke der HincII-Schnittstelle entfernt worden ist. Andererseits, wurde selbst wenn ein Fragment auf der linken Seite der einzigartigen BglII-Schnittstelle, welche auf der linken Seite innerhalb des 0,9 kb BamHI-HincII-Fragments in pAK916 entfernt worden ist, eine ähnliche Aktivität wie die im zuvor erwähnten BamHI-HincII-Fragment (pAK916) beobachtet. Es wird deswegen davon ausgegangen, dass ein Gen, das ein Ketogruppen- einschleusendes Enzym kodiert, mit einer Enzymaktivität zum Synthetisieren von Canthaxanthin aus β-Carotin aus Substrat innerhalb der 0,74 kb BglII-HincII-Fragmente von pAK916 vorhanden ist, und dass die zuvor erwähnte NcoI-Schnittstelle innerhalb dieses Gens vorhanden ist. Als Ergebnis der Bestimmung der Nukleotidsequenz wurde ein offenes Leseraster, das dem Gen entspricht und eine Ribosombindungsstelle genau vor dem Initiationskodon hat, erfolgreich nachgewiesen, und es wurde dann als crtW-Gen bezeichnet. Die Nukleotidsequenz des crtW-Gens und die dadurch kodierte Aminosäuresequenz werden in 1 dargestellt (SEQ ID NO: 1 und 2).
  • Das crtW-Genprodukt (CrtW) von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 hat die Enzymaktivität des Umwandelns einer Methylengruppe an der 4-Position eines β-Iononrings in eine Ketogruppe und eines der spezifischen Beispiele ist die Enzymaktivität zum Synthetisieren von Canthaxanthin aus β-Carotin über Echinenon als ein Substrat (Beispiel 7(2); siehe 11). Außerdem hat das crtW-Genprodukt auch die Enzymaktivität zum Umwandeln einer Methylengruppe an der 4-Position eines 3-Hydroxy-β-iononrings in der Ketogruppe, und eines der spezifischen Beispiele ist die Enzymaktivität zum Synthetisieren von Astaxanthin aus Zeaxanthin als ein Substrat über 4-Ketozeaxanthin (Beispiel 7(1); siehe 11). Zusätzlich sind Polypeptide mit solchen Enzymaktivitäten und DNA-Strängen, die diese Polypeptide kodieren, bis dato nicht bekannt gewesen, und die Polypeptide und die DNA-Stränge, die diese Polypeptide kodieren, haben keine Gesamthomologie mit irgendwelchen Polypeptiden oder DNA-Strängen, die bis dato bekannt waren. Es gab bis dato auch keine Informationen, dass eine Methylengruppe nicht nur eines β-Iononrings und eines 3-Hydroxy-β-iononringes, sondern auch der anderen Verbindungen direkt in eine Ketogruppe mit Hilfe eines Enzyms umgewandelt wird.
  • (2) Identifizierung eines Hydroxylgruppen-einschleusenden Enzymgens
  • Die einzigartige SalI-Schnittstelle ist innerhalb des 2,9 kb BamHI-Fragments von pAK96 vorhanden. Wenn das 2,9 kb BamHI-Fragment an der SalI-Schnittstelle in zwei Fragmente zerschnitten wird, haben diese zwei Fragmente (pAK910 und pAK98) keine Hydroxylgruppen-einschleusende Wirkung. Das bedeutet, dass das linke Fragment (pAK910) nur eine Ketogruppen-einschleusende Enzymaktivität (Beispiel 7(2)), hat und das rechte Fragment (pAK98) hat nur eine Lycopin-cyclisierende Enzymaktivität (Beispiel 7(4)). Andererseits wird, wenn ein 1,4 kb NcoI-KpnI-Fragement (pAK96NK), das die oben erwähnte SalI-Schnittstelle enthält, in eine β-Carotin-produzierendes Escherichia coli eingeschleust wird, Zeaxanthin in einem β-Carotin-produzierenden Escherichia coli über β-Cryptoxanthin synthetisiert (Beispiel 7(3)). Es wird daher davon ausgegangen, dass ein Gen, das ein Hydroxylgruppen-einschleusendes Enzym kodiert, das eine Enzymaktivität zum Synthetisieren von Zeaxanthin aus β-Carotin als Substrat hat, innerhalb des 1,4 kb NcoI-KpnI-Fragments von pAK96NK vorhanden ist, und dass die zuvor erwähnte SalI-Schnittstelle innerhalb dieses Gens vorhanden ist. Als Ergebnis der Bestimmung der Nukleotidsequenz wurde ein offenes Leseraster, das dem Gen entspricht, und eine Ribosomeintrittbindungsstelle genau vor dem Initiationskodon hat, erfolgreich detektiert, und dies wurde dann als crtZ-Gen bezeichnet. Die Nukleotidsequenz des crtZ-Gens und die kodierte Aminosäuresequenz wird in 2 dargestellt (SEQ ID NO: 3 und 4).
  • Das crtZ-Genprodukt (CrtZ) von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 hat die Enzymaktivität des Anfügens einer Hydroxylgruppe an den 3-Kohlenstoff eines β-Iononrings und eines der spezifischen Beispiele ist die Enzymaktivität zum Synthetisieren von Zeaxanthin aus β-Carotin als Substrat über β-Cryptoxanthin (Beispiel 7(3); siehe 11). Außerdem hat das crtZ-Genprodukt auch die Enzymaktivität des Hinzufügens einer Hydroxylgruppe an den 3-Kohlenstoff eines 4-Keto-β-iononrings, und eines der spezifischen Beispiele ist die Enzymaktivität des Synthetisierens von Astaxanthin aus Canthaxanthin als Substrat über Phoenicoxanthin (Beispiel 6; siehe 11). Zusätzlich sind Polypeptide mit der zuletzt genannten Enzymaktivität und DNA-Stränge, die diese Polypeptide kodieren, bis heute nicht bekannt gewesen. Auch das CrtZ von Agrobacterium zeigte signifikante Homologie mit dem CrtZ von Erwinia uredovora (Identität von 57%) auf dem Niveau der Aminosäuresequenz.
  • (3) Identifizierung eines Lycopincyclasegens
  • Astaxanthin kann aus β-Carotin mit dem 2,9 kb BamHI-Fragment synthetisiert werden, aus dem ein Fragment auf der rechten Seite der KpnI-Schnittstelle entfernt worden ist (pAK96K) oder mit dem 2,9 kb BamHI-Fragment, von dem ein Fragment rechts von der PstI-Schnittstelle, welche weiter rechts der KpnI-Schnittstelle erzielt ist, entfernt worden ist (pAK94) (Beispiel 6), aber Astaxanthin konnte nicht aus Lycopin synthetisiert werden. Andererseits wenn ein 1,6 kb SaliI-Fragment (pAK98), welches ein rechtes Fragment der einzigartigen SalI-Schnittstelle, welche weiter links als die zuvor erwähnte KpnI-Schnittstelle vorhanden ist, innerhalb des 2,9 kb BamHI-Fragments in ein Lycopin-produziertendes Escherichia coli eingeschleust wird, welche β-Carotin synthetisiert (Beispiel 7(4)). Es wird daher davon ausgegangen, dass ein Gen, das Lycopincyclase kodiert, welches eine Enzymaktivität des Synthetisierens von β-Carotin aus Lycopin als Substrat hat, innerhalb des 1,6 kb SalI-Fragments von pAK98 vorhanden ist, und dass dieses Gen über einen Bereich der kpnI-Schnittstelle und der PstI-Schnittstelle vorhanden ist. Als Ergebnis der Bestimmung der Nukleotidsequenz wurde ein offenes Leseraster, das dem Gen entspricht, und die Ribosombindungsstelle genau vor dem Initiationskodon enthält, erfolgreich nachgewiesen und dann als crtY-Gen bezeichnet. Die Nukleotidsequenz des crtY-Gens und die Aminosäuresequenz, die kodiert wird, werden in den 3 bis 4 dargestellt (SEQ ID NO: 3).
  • Das crtY-Genprodukt (CrtY) aus Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 hat signifikante Homologie mit CrtY von Erwinia uredovora (Identität von 44,3%) auf dem Niveau der Aminosäuresequenz, und die Funktionen beider Enzyme sind gleich.
  • Beispiel 9: Southern-Blotting-Analyse mit chromosomaler DNA der anderen Marinebakterien
  • Es wurde eine Untersuchung durchgeführt, ob eine Region, die eine Homologie mit den isolierten crtW und crtZ aufweist, aus chromosomalen DNAs anderer Marinemikroorganismen erhalten wird. Die chromosomalen DNAs von Alcaligenes sp. PC-1 und Alteromonas sp. SD-402, die in Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und PstI verdaut und mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Alle auf diese Weise aufgetrennten DNA-Fragmente wurden mit einer alkalischen Lösung von 0,5 N NaOH und 1,5 M NaCl denaturiert und auf ein Nylonmembranfilter für eine Dauer über Nacht transferiert. Der Nylonmembranfilter, auf dem DNAs adsorbiert worden sind, wurde in eine Hybridisierungslösung eingetaucht (6 × Denhardt, 5 × SSC, 100 μg/ml ssDNA) und eine Prähybridisierung wurde bei 60°C für 2 h durchgeführt. Als Nächstes wurde das 1,5 kb DNA-Fragment aus pAK96K mit BalI ausgeschnitten, welches crtW und crtY enthält, und mit einem Mega primeTM-Markierungssystem (labelling system) (Amersham) markiert und [α-32P]dCTP (~110 TBq/mmol) zu der oben erwähnten Prähybridisierungslösung hinzugegeben, und eine Hybridisierung bei 60°C für 16 h wurde durchgeführt.
  • Nach der Hybridisierung wurde der Filter wurde 2 × SSC, enthaltend 0,1% SDS, bei 60°C für 1 h gewaschen und einer Detektion von Signalen unterzogen, die Homologie aufweisen mit Hilfe Autoradiographie. Als Ergebnis wurden starke Signale bei ungefähr 13 kb in dem Produkt erhalten, welches mit BamHI verdaut wurde, und bei 2,35 kb in dem Produkt, das mit PstI verdaut wurde, für Alcaligenes sp. PC-1 und starke Signale wurden bei ungefähr 5,6 kb in dem Produkt, das mit BamHI verdaut wurde und bei 20 kb oder mehr in dem Produkt, was mit PstI in dem Falle von Alteromonas sp. SD-4 erhalten.
  • Beispiel 10: Erwerb des Xanthophyllsynthese-Genklusters aus einem anderen Marinebakterium
  • Da aus den Ergebnissen in Beispiel 9 ersichtlich wurde, dass der PstI-Verdau der chromosomalen DNA von Alcaligenes sp. PC-1 eine Region von ungefähr 2,35 kb hat, die mit einem DNA-Fragment hybridisiert, welches die crtW- und crtZ-Gene von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 enthält, wurde die chromosomale DNA von Alcaligenes mit PstI verdaut und dann wurden DNA-Fragmente von 2–3,5 kb Größe mittels Agarosegelelektrophorese gewonnen. Die DNA-Fragmente, die auf diese Weise gesammelt wurden, wurden in die PstI-Schnittstelle des Vektors pBluescript II Sk+ inseriert und in Escherichia coli DH5α eingeschleust, um eine Teilbibliothek von Alcaligenes herzustellen. Wenn man die Teilbibliothek einer Kolonien-Hybridisierung mit einem 1,5 kb DNA-Fragment unterzog, das die crtW- und crtZ-Gene von Agrobacterium als Sonde enthielt, wurde eine positive Kolonie aus ungefähr 5.000 Kolonien isoliert. In diesem Fall wurde eine Kolonienhybridisierung unter den gleichen Bedingungen wie in der Southern Blottinganalyse durchgeführt, die in Beispiel 9 gezeigt ist. Wenn man die Plasmid-DNA der so erhaltenen Kolonien isolierte und mit PstI verdaute, um die Größe der integrierten DNA-Fragmente zu untersuchen, wurde gefunden, dass das Plasmid drei verschiedene Fragmente enthielt. Daher wurde ein 2,35 kb-Fragment, das hybridisiert werden sollte, aus den drei verschiedenen DNA-Fragmenten mit Southern Blottinganalyse ausgewählt, welche in Beispiel 9 beschrieben wurde, wobei das 2,35 kb PstI-Fragment durch Agarosegelelektrophorese gewonnen wurde und wieder in die PstI-Schnittstelle von pBluescript II SK+ inseriert wurde, um die Plasmide pPC11 und pPC12 herzustellen. In pPC11 und pPC12 wurde das oben erwähnte 2,35 kb PstI-Fragment in die PstI-Schnittstelle des pBluescript II Sk+ in entgegengesetzter Richtung zueinander inseriert. Die Restriktionsenzymkarte von pPC11 ist in 11 dargestellt.
  • Beispiel 11: Bestimmung der Nucleotidsequenz des Xanthophyllsynthesegenklusters in Alcaligenes
  • Wenn sowohl pPC11 und pPC12 in die β-Carotin-produzierenden Escherichia coli eingeschleust wurden, wurden aufgrund der Synthese von Astaxanthin (Beispiel 12) orange Kolonien beim erstgenannten erhalten, aber in dem letztgenannten wurden keine anderen Pigmente neu synthetisiert. Es wurde daher davon ausgegangen, dass die Richtung des Astaxanthinsynthesegenklusters in dem Plasmid pPC11 die gleiche war wie die des lac-Promotors des Vektors. Es wurde auch gefunden, dass pPC11 keine Lycopin-cyclisierenden Enzymgene enthielt, da keine anderen Pigmente neu produziert wurden, selbst wenn pPC11 in Lycopin-produzierende Escherichia coli eingeschleust wurde.
  • Es wurde gefunden, dass, selbst wenn ein Plasmid mit einem 0,72 kb BstEII-EcoRV-Fragment, welches auf rechten Seite des PstI-Fragments positioniert war, entfernt worden war (bezeichnet als pPC17, 19), in das β-Carotin-produzierende Escherichia coli eingeschleust wurde, die Transformante der Escherichia coli Astaxanthin und ähnliche synthetisierte (Beispiel 12) wie auch im Falle von E. coli, in das pPC11 eingeschleust worden ist, so dass die Nukleotidsequenz des 1,63 kb PstI-BstEII-Fragments in pPC17 bestimmt wurde.
  • Es wurden Deletionsmutanten mit pPC17 und pPC12 gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt. Ein 10 μg-Teil sowohl des pPC17 und pPC12 wurde mit KpnI und HindIII oder KpnI und EcoRI verdaut, mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA wurde durch Präzipitierung mit Ethanol gewonnen. Jede der DNAs wurde in 100 μl ExoIII-Puffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM 2-Mercaptoethanol, pH 8,0) verdünnt und 180 Einheiten ExoIII-Nuklease wurde hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C belassen. Ein 10 μl-Teil wurde jede Minute gesammelt, und zwei Proben wurden in ein Röhrchen transferiert, in dem 20 μl des MB-Puffers waren (40 mM Natriumacetat, 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl2, 10% Glycerin, pH 4,5), welche dann auf Eis gestellt wird. Nach Beendigung der Probenentnahme wurden fünf Röhrchen, die auf diese Weise erhalten wurden, für 10 min bei 65°C gelassen, um das Enzym zu inaktivieren, wobei fünf Einheiten Mungbohnennuklease hinzugegeben wurden, und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 37°C gelassen. Nach der Reaktion wurden 10 DNA-Fragmente, die voneinander in den Graden der Deletion verschieden waren, für jedes Plasmid mittels Agarosegelelektrophorese gewonnen. Die DNA-Fragmente, die auf diese Weise gewonnen wurden, wurden mit dem Klenow-Fragment an den Enden geglättet, einer Ligationsreaktion bei 16°C über Nacht unterworfen, und Escherichia coli JM 109 wurde transformiert. Eine einzelsträngige DNA wurde aus jedem der zahlreichen Klone, die mit dem Helferphagen M13K07 erhalten wurden, hergestellt und einer Sequenzierreaktion mit einem Fluoreszenzprimer-Zyklus-Sequenzier-Kit, der von Applied Biosystem (K. K.) enthältlich ist, unterworfen, und die DNA-Sequenz wurde mit einem automatischen Sequenziergerät bestimmt.
  • Die DNA-Sequenz, die 1631 Basenpaare (bp) umfasst, welche auf diese Weise erhalten wurde, ist in 1 bis 18 (SEQ ID NO: 12) dargestellt. Als Ergebnis einer Untersuchung des offenen Leserasters mit einer Ribosomenbindungsstelle vor dem Initiationskodon wurden zwei offene Leseraster, die die entsprechenden Proteine (A bis B (Nukleotidpositionen 99–824 der SEQ ID NO: 12), C bis D (Nukleotidpositionen 824–1309) in 16 bis 18 kodieren, an den Positionen gefunden, wo die zwei Xanthophyllsynthesegene crtW und crtZ erwartetermaßen vorhanden waren.
  • Beispiel 12: Identifizierung von Pigmenten, die durch Escherichia coli mit einem Alcaligenes-Xanthophyllsynthesegenkluster hergestellt werden
  • (1) Identifizierung von Astaxanthin und 4-Ketozeaxanthin
  • Ein Deletionsplasmid (mit nur crtW) mit einer Deletion der rechten BstEII-Schnittstelle bis zur Nukleotidposition 1162 (17) (Nukleotidposition 1162 der SEQ ID NO: 12) aus den Deletionsplasmiden aus pPC17, welches in Beispiel 11 hergestellt wurde, wurde als pPC17-3 (19) bezeichnet.
  • Das Zeaxanthin-produzierende Escherichia coli JM101 (Beispiel 7(1)) mit darin eingeschleustem pPC17-3 (Escherichia coli (pACCAR25ΔcrtX, pPC17-3); orange Farbe aufweisend) wurde in 2 Litern 2YT-Kulturmedium, welches 150 μg/ml Ap und 30 μg/ml Cm enthält, bei 37°C für 18 h kultiviert. Die bakteriellen Zellen wurden aus der Kulturlösung gesammelt und mit 300 ml Aceton extrahiert, auf konzentriert, 2 Mal mit 200 ml Chloroform/Methanol (9/1) extrahiert und bis zur Trockenheit aufkonzentriert. Dann wurde eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durch das Lösen des Rests in einer geringen Menge Chloroform/Methanol (9/1) und das Entwickeln mit Chloroform/Methanol (15/1) auf einer Kieselgelplatte für eine präparative TLC durchgeführt, wobei die Platte von Merck hergestellt wurde. Das ursprünglich orange Pigment wurde in drei Punkte bei den Rf-Werten von 0,54 (ca. 25%), 0,72 (ca. 30%) und 0,91 (ca. 25%) aufgetrennt. Die Pigmente an den Rf-Werten 0,54 und 0,72 wurden aus der TLC-Platte ausgekratzt, in einer geringen Menge Chlroform/Methanol (9/1) oder Methanol gelöst und auf einer Sephadex LH-20-Säule (15 × 300 mm) mit dem Elutionsmittel Chloroform/Methanol (9/1) oder Methanol chromatographisch aufgetrennt, um die gereinigten Materialien in einer Ausbeute von ungefähr 1 mg zu ergeben.
  • Die Materialien wurden als 4-Ketozeaxanthin (Rf 0,54) und Astaxanthin (Rf 0,72) identifiziert, da alle Daten aus ihren UV-sichtbaren, FD-MS-Spektren und Mobilität in TLC (entwickelt mit Chloroform/Methanol (15/1)) mit denen der Standardproben von 4-Ketozeaxanthin und Astaxanthin übereinstimmten. Zusätzlich war das Pigment mit dem Rf-Wert von 0,91 Canthaxanthin (Beispiel 12(2)).
  • Es wurde durch ähnliche analytische Verfahren auch bestätigt, dass das β-Carotin-produzierende Escherichia coli JM101 mit pPC11 oder pPC17 hierin eingeschleust (Escherichia coli (pACCAR16ΔcrtX, pPC11 oder pPC17) (orange Farbe aufweisend) Astaxanthin, 4-Ketozeaxanthin und Canthaxanthin produziert. Außerdem wurde ebenfalls mit der authentischen Probe von Phoenicoxanthin bestätigt, welche in Beispiel 6 erhalten wurde, dass diese E. coli-Transformanten eine Spurenmenge an Phoenicoxanthin herstellen.
  • (2) Identifizierung von Canthaxanthin
  • Das β-Carotin-produzierende Escherichia coli JM101 mit pPC17-3, hierin eingeschleust (Escherichia coli (PACCAR16ΔcrtX, pPC17-3); aufweisend orange Farbe) wurde in 2 Litern 2YT-Kulturmedium, enthaltend 150 μg/ml Ap und 30 μg/ml an Cm, für 18 h bei 37°C kultiviert. Die bakteriellen Zellen wurden aus der Kulturlösung gesammelt und mit 300 ml Aceton extrahiert, konzentriert, 2 Mal mit 200 ml Chloroform/Methanol (9/1) extrahiert und bis zur Trockenheit auf konzentriert. Dann wurde eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durch Lösen des Restes in einer geringen Menge an Chloroform/Methanol (9/1) durchgeführt, und auf einer von Merck hergestellten Kieselgelplatte für präparative TLC mit Chloroform/Methanol (50/1) entwickelt. Das dunkelste Pigment, das 40% der Gesamtmenge der orangen Pigmente entsprach, wurde auf der TCL-Platte herausgekratzt, in einer geringen Menge Chloroform/Methanol (9/1) oder Chloroform/Methanol (1/1) gelöst und auf einer Sephadex LH-20-Säule (15 × 300 mm) mit einem Elutionsmittel aus Chloroform/Methanol (9/1) oder Chloroform/Methanol (1/1) chromatographisch aufgetrennt, um einen Bereich des Materials in einer Ausbeute von 2 mg zu ergeben.
  • Das Material wurde als Canthaxanthin identifiziert, da alle Daten des UV-sichtbarten, FD-MS(m/e 564)-Spektrums und die Mobilität in TLC (entwickelt mit Chloroform/Methanol (50/1)) mit der Standardprobe von Canthaxanthin (hergestellt von BASF) übereinstimmten. Zusätzlich wurde das Pigment, dessen Menge 50% der Gesamtmenge der orangen Pigmente, die in dem Ausgangsextrakt beobachtet wurden, aufgrund seines UV-sichtbaren Spektrums, der Mobilität in Kieselgel-TLC (entwickelt mit Chloroform/Methanol (50/1)), und der Mobilität in HPLC mit Nova Pack HR 6μ C18 (3,9 × 300 mm; hergestellt von Waters) (entwickelt mit Acetonitril/Methanol/2-Propanol (90/6/4)) (Beispiel 7(2)) als Echinenon angesehen. Zusätzlich war der Rest der extrahierten Pigmente 10% nicht-umgesetztes β-Carotin.
  • (3) Identifizierung von Zeaxanthin
  • Ein Plasmid mit einem 1,15 kb SalI-Fragment in pPC11, welches in die gleiche Richtung wie das Plasmid pPC11 in die SalI-Schnittstelle in pBluescript II Sk+ inseriert war, wurde hergestellt (als pPC13 bezeichnet, siehe 19).
  • Das β-Carotin-produzierende Escherichia coli JM101 mit pPC13 hierin eingeschleust (Escherichia coli (pACCAR16ΔcrtX, pPC13); aufweisend gelbe Farbe) wurde in 2 Litern 2YT-Kulturmedium, enthaltend 150 μg/ml Ap und 30 μg/ml Cm bei 37°C für 18 h kultiviert. Die bakteriellen Zellen, die aus der Kulturlösung gesammelt wurden, wurden mit 300 ml Aceton extrahiert, konzentriert, 2 Mal mit 200 ml Chloroform/Methanol (9/1) extrahiert und bis zur Trockenheit auf konzentriert. Dann wurde eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durch das Lösen des Restes in einer geringen Menge Chloroform/Methanol (9/1) durchgeführt, und auf einer Kieselgelplatte für eine präparative TLC, welche von Merck hergestellt wurde, mit Chloroform/Methanol (9/1) entwickelt. Das dunkelste Pigment, das 90% der Gesamtmenge der orangen Pigmente entsprach, wurde von der TLC-Platte heruntergekratzt, in einer geringen Menge Chloroform/Methanol (9/1) oder Methanol gelöst und auf einer Sephadex LH-20-Säule (15 × 300 mm) mit einem Elutionsmittel aus Chloroform/Methanol (9/1) oder Methanol chromatographisch aufgetrennt, um ein gereinigtes Material in einer Ausbeute von 3 mg zu ergeben.
  • Das Material wurde als Zeaxanthin identifiziert, da alle Daten des UV-sichtbaren, FD-MS(m/e 568)-Spektrums und die Mobilität in TLC (entwickelt mit Chloroform/Methanol (9/1)) mit denen der Standardprobe von Zeaxanthin (Beispiel 7(3)) übereinstimmten. Zusätzlich wurde das Pigment, dessen Menge 10% der Gesamtmenge der orangen Pigmente entspricht, die in dem ursprünglichen Extrakt beobachtet wurden, als β-Cryptoxanthin aufgrund dessen UV-sichtbaren Spektrum, der Mobilität in Kieselgel-TLC (entwickelt mit Chloroform/Methanol (9/1)), und der Mobilität in HPLC mit Nova Pack HR 6μ C18 (3,9 × 300 mm; hergestellt von Waters) (entwickelt mit Acetonitril/Methanol/2-Propanol (90/6/4)) (Beispiel 7(3)) angesehen.
  • Beispiel 13: Identifizierung des Alcaligenes Xanthophyll-Synthesegenklusters
  • (1) Identifizierung des Ketogruppen-einschleusenden Enzymgens
  • Es ist aus den Ergebnissen der Beispiele 11 und 12(1) offensichtlich, dass alle Gene, die die Synthese von Astaxanthin aus β-Carotin in dem 2,35 kb PstI-Fragment, welches in pPC11 enthalten ist, in dem 1,63 kb PstI-BstEII-Fragment enthalten ist (pPC17, 19) auf der linken Seite. Das heißt, dass das 0,72 kb BstEII-PstI-Fragment auf der rechten Seite nicht benötigt wird. Die einzigartigen SmaI- und SalI-Schnittstellen sind innerhalb des 1,63 kb PstI-BstEII-Fragments in pPC17 vorhanden (19). Es wird durch die Pigmentanalyse mit einem β-Carotin-produzierenden Escherichia coli mit den hierin eingeschleusten Deletionsplasmiden bestätigt, dass die Ketogruppen-einschleusende Enzymaktivität verloren ging, wenn die 0,65 kb und 0,69 kb-Fragmente auf der linken Seite von SmaI- und SalI-Schnittstellen entfernt wurden. Es wurde durch die Pigmentanalyse mit einem β-Carotin-produzierenden Escherichia coli mit dem hierin eingeschlossenen Plasmid auch bestätigt, dass das Plasmid mit einem 0,69 kb PstI-SalI-Fragment, welches an der linken Seite des 1,63 kb PstI-BstEII-Fragment hierin positioniert, welches in die PstI-SalI-Schnittstelle des pBluescript SK+ inseriert wurde, eine Ketogruppen-einschleusende Enzymaktivität aufweist. Andererseits hat das Deletionsplasmid pPC17-3 (19), in dem eine Deletion vom BstEII-Ende am rechten Ende des Nukleotids Nr. 1162 (Nukleotidposition 1162 in SEQ ID NO: 12) auftrat, eine Ketogruppen-einschleusende Enzymaktivität (Beispiel 12(1), (2)), so dass es als ein Gen angesehen wird, das ein Ketogruppen-einschleusendes Enzym kodiert, das eine Enzymaktivität des Synthetisierens von Canthaxanthin oder Astaxanthin mit einem Substrat aus β-Carotin oder Zeaxanthin hat, in dem 1162 bp-Fragment in pPC17-3 vorhanden ist, und dass die zuvor erwähnten SmaI- und SalI-Schnittstellen innerhalb dieses Gens vorhanden sind. Als Ergebnis der Bestimmung der Nukleotidsequenz wurde erfolgreich ein offenes Leseraster, das dem Gen entspricht und eine Ribosombindungsstelle genau vor dem Initiationskodon hat, nachgewiesen, so dass es als crtW-Gen bezeichnet wurde. Die Nukleotidsequenz des crtW-Gens und der kodierten Aminosäuresequenz wird in den 13 bis 14 (SEQ ID NO: 8 und 9) dargestellt.
  • Das crtW-Genprodukt (CrtW) von Alcaligenes sp. PC-1 hat die Enzymaktivität des Umwandelns einer Methylengruppe an der 4-Position eines β-Iononrings in eine Ketogruppe, und eines der spezifischen Beispiele hierfür ist eine Enzymaktivität zum Synthetisieren von Canthaxanthin als β-Carotin als Substrat über Echinenon (Beispiel 12(2); siehe 11). Außerdem hat das crtW-Genprodukt auch die Enzymaktivität des Umwandelns einer Methylengruppe an der 4-Position eines 3-Hydroxy-β-iononrings in eine Ketogruppe und eines der spezifischen Beispiele ist die Enzymaktivität des Synthetisierens von Astaxanthin aus Zeaxanthin als Substrat über 4-Ketozeaxanthin (Beispiel 12(1); siehe 11). Zusätzlich sind Polypeptide mit solchen Enzymaktivitäten und DNA-Stränge, die diese Polypeptide kodieren, bis dato noch nicht bekannt gewesen, und die Polypeptide und die DNA-Stränge, die diese Polypeptide kodieren, haben keine Homologie mit irgendwelchenn Polypeptiden oder DNA-Strängen, die bis dato bekannt waren. Die crtW-Genprodukte (CrtW) von aGrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 und Alcaligenes sp. PC-1 teilen auch eine sehr hohe Homologie (Identität von 83%) auf dem Niveau der Aminosäuresequenz, und die Funktionen von beiden Enzymen sind die gleichen. Die Aminosäuresequenz in der Region von 17% ohne eine Identität unter diesen Aminosäuresequenzen wird als nicht so signifikant für die Funktionen dieses Enzyms angesehen. Es wird daher davon ausgegangen, dass besonders in dieser Region eine geringe Menge an Substitutionen durch andere Aminosäuren, die Deletion oder Addition von anderen Aminosäuren nicht die Enzymaktivität beeinflussen wird.
  • Es kann behauptet werden, dass das Ketogruppen-einschleusende Enzymgen crtW des Marinebakteriums, die β-Ionon- oder 3-Hydroxy-β-iononringketolase kodiert, welche direkt die Methylengruppe an der 4-Position in eine Ketogruppe umwandelt, ungeachtet der Tatsache, ob eine Hydroxylgruppe an die 3-Position angefügt ist oder nicht. Zusätzlich waren solche Informationen bis dato nicht erhältlich, dass eine Methylengruppe nicht nur einen β-Iononring und 3-Hydroxy-β-iononring, sondern auch die anderen Verbindungen direkt in eine Ketogruppe mit einem Enzym umgewandelt.
  • (2) Identifizierung eines Hydroxylgruppen-einschleusenden Enzymgens
  • Alle Gene, die für die Synthese von Astaxanthin aus β-Carotin benötigt werden, sind in dem 1,63 kb PstI-BstEII-Frgment (19) in pPC17 vorhanden. Eine SalI-Schnittstelle ist innerhalb des 1,63 kb PstI-BstEII-Fragments von pPC17 vorhanden. Es ist aus Ergebnissen des Beispiels 12(3) offensichtlich, dass eine Hydroxylgruppe-einschleusende Enzymaktivität in einem Fragment auf der rechten Seite der salI-Schnittstelle vorhanden ist. Es wird daher verständlich, dass die Hydroxylgruppen-einschleusende Enzymaktivität in dem 0,94 kb SalI-BstEII-Fragment vorhanden ist, welches das rechte Fragment in dem 1,63 kb PstI-BstEII-Fragment ist. Als Ergebnis der Bestimmung der Nukleotidsequenz wurde ein offenes Leseraster, das dem Gen entspricht und eine Ribosombindungsstelle genau vor dem Initiationskodon hat, erfolgreich nachgewiesen, und es wurde als crtZ-Gen bezeichnet. Die Nukleotidsequenz des crtZ-Gens und die kodierte Aminosäuresequenz werden in der 15 (SEQ ID NO: 10 und 11) dargestellt.
  • Das crtZ-Genprodukt (CrtZ) von Alcaligenes sp. PC-1 hat die Enzymaktivität des Hinzufügens einer Hydroxylgruppe an den 3-Kohlenstoff des β-Iononrings, und eines der spezifischen Beispiele ist die Enzymaktivität des Synthetisierens von Zeaxanthin aus β-Carotin als Substrat über β-Cryptoxanthin (Beispiel 12(3); siehe 11). Außerdem hat das crtZ-Genprodukt auch die Enzymaktivität des Hinzufügens einer Hydroxylgruppe an den 3-Kohlenstoff eines 4-Keto-β-iononrings, und eines der spezifischen Beispiele ist die enzymatische Aktivität des Synthetisierens von Astaxanthin aus Canthaxanthin als Substrat über Phoenicoxanthin (Beispiel 12(1); siehe 11). Zusätzlich sind Polypeptide mit der letztgenannten Enzymaktivität und DNA-Stränge, die diese Polypeptide kodieren, bis dato nicht bekannt gewesen. Das CrtZ von Alcaligenes sp. PC-1 zeigte auch eine signifikante Homologie mit dem CrtZ von Erwinia uredovora (Identität von 58%) auf dem Niveau der Aminosäuresequenz. Zusätzlich haben die CrtZ-Genprodukte (CrtZ) von Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 und Alcaligenes sp. PC-1 eine hohe Homologie (Identität von 90%) auf dem Niveau der Aminosäuresequenz, und die Funktionen der beiden Enzyme sind die gleichen. Die Aminosäuresequenz in der Region von 10% ohne Identität zwischen diesen Aminosäuresequenzen wird als nicht so signifikant für die Funktionen des Enzyms betrachtet. Es wird daher davon ausgegangen, dass insbesondere in dieser Region eine geringe Menge an Substitution durch andere Aminosäuren, eine Deletion oder Addition anderer Aminosäuren keine Auswirkung auf die Enzymaktivität haben.
  • (3) Betrachtung der geringfügigeren biosynthetischen Wege der Xanthophylle
  • Durch unsere Studien ist aufgeklärt worden, dass mit den Carotinoidsynthesegenen des epiphytischen Bakteriums Erwinia oder des fotosynthetischen Bakteriums Rhodobacter Carotinoidbiosyntheseenzyme im allgemeinen wirken, indem die Hälfte an Carotinoidmolekül als Substrat erkennen. Beispielsweise erkennt das Lycopincyclasegen von Erwinia, crtY, die Hälften des Lycopinmoleküls, um es zu cyclisieren. Wenn das Phytoendesaturasegen crtI von Rhodobacter für die Synthese von Neurosporen anstelle von Lycopin in Escherichia coli verwendet wurde und crtY von Erwinia ermöglicht wurde hierauf einzuwirken, erkennt das crtY-Genprodukt die Hälfte der molekularen Struktur, die Lycopin gemeinsam ist, um ein halb-cyclisiertes β-Zeacarotin herzustellen (H. Linden, N. Misawa, D. Chamovits, I. Pecher, J. Hirschberg, G. Sandmann, "Functional Complementation in Escherichia coli of Different Phytoene Desaturase Genes and Analysis of Accumulated Carotenes", Z. Naturforsch., 46c, S. 1045–1051, 1991). Auch in der vorliegenden Erfindung ist, wenn CrtW ermöglicht wird, auf β-Carotin oder Zeaxanthin, Echinenon oder 4-Ketozeaxanthin einzuwirken, in die eine Ketogruppe eingeschleust wird, zuerst synthetisiert und dann CrtZ ermöglicht wird, auf β-Carotin oder Canthaxanthin, β-Cryptoxanthin oder Phoenicoxanthin einzuwirken, in die eine Hydroxylgruppe eingeschleust worden ist, wird zuerst synthetisiert. Es kann davon ausgegangen werden, dass diese Enzyme daher die Hälfte des Moleküls als Substrats erkennen. Das heißt, während Escherichia coli mit dem crtE-, crtB-, crtI- und crtY-Genen von Erwinia und dem crtZ-Gen eines Marinebakteriums Zeaxanthin wie oben beschrieben herstellt, kann β-Cryptoxanthin, welches ein β-Carotin ist mit einer Hydroxylgruppe, die hierin eingeschleust wurde, als ein Zwischenmetabolit nachgewiesen werden. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass, wenn CrtW vorhanden ist, 3'-Hydroxyechinenon oder 3-Hydroxyechinenon aus β-Cryptoxanthin als Substrat synthetisiert werden kann, und dass Phoenicoxanthin weiter durch die Einwirkung von CrtW auf diese Intermediate synthetisiert werden kann. Die vorstelligen Erfinder haben diese KetoCarotinoide in der Kulturlösung nicht identifiziert, und der Grund hierfür scheint zu sein, dass nur eine Spurenmenge dieser Verbindungen unter den Bedingungen vorhanden ist, die in den vorliegenden Experimenten durchgeführt wurden. In der Tat wurde beschrieben, dass 3-Hydroxyechinenon oder 3'-Hydroxyechinenon als geringfügiges intermediäres Metabolit von Astaxanthin in einem marinen Bakterium Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 als Genquelle nachgewiesen wurde (Akihiro Yokoyama, Herausgeber, "For the biosynthesis of astaxanthin in marine bacteria", Nippon Suisan Gakkai, Spring Symposium, 1994, Abstract, S. 252, 1994). Aus den obigen Beschreibungen kann davon ausgegangen werden, dass geringfügigere Stoffwechselwege, die in 20 gezeigt werden, ebenfalls zusätzlich zu den Hauptstoffwechselwegen von Astaxanthin, die in 11 gezeigt werden, vorhanden sind.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Genkluster, die für die Biosynthese der Ketogruppen-haltigen Xanthophylle, wie beispielsweise Astaxanthin, Phoenicxanthin, 4-Ketozeaxanthin, Canthaxanthin und Echinenon erfolgreich aus Marinebakterien erhalten wurden, und ihre Strukturen, Nukleotidsequenzen und Funktionen sind aufgeklärt worden. Die DNA-Stränge gemäß der vorliegenden Erfindung sind als Gene nützlich, die in der Lage sind, die Fähigkeit der Biosynthese der Ketogruppen-haltigen Xanthophylle, wie beispielsweise Astaxanthin, in Mikroorganismen, wie beispielsweise Escherichia coli und ähnliche, zu erlauben.
  • SEQUENZLISTE
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Claims (16)

  1. DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, das Enzymaktivität aufweist, um eine Methylengruppe an der 4-Position eines β-Iononrings in eine Ketogruppe umzuwandeln, und/oder Enzymaktivität aufweist, um die Methylengruppe an der 4-Position des 3-Hydroxy-β-iononrings in eine Ketogruppe umzuwandeln, und Aminosäuresequenzen mit den Aminosäuren Nrn. 1 bis 212, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt sind, und/oder den Aminosäuren Nrn. 1 bis 242, die in SEQ ID NO: 9 gezeigt sind, aufweist, wobei das Polypeptid durch Deletion, Substitution oder Addition in einer oder einigen Aminosäuren der Aminosäuresequenz modifiziert sein kann, vorausgesetzt daß die Enzymaktivität beibehalten wird, die durch das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nrn. 1 bis 212, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt sind, oder der Aminosäuren Nrn. 1 bis 242, die in SEQ ID NO: 9 gezeigt sind, hervorgebracht wird.
  2. DNA-Strang nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid Enzymaktivität aufweist, um die Methylengruppe an der 4-Position des β-Iononrings in eine Ketogruppe umzuwandeln, und eine Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nrn. 1 bis 212, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt sind, oder der Aminosäuren Nrn. 1 bis 242, die in SEQ ID NO: 9 gezeigt sind, aufweist.
  3. DNA-Strang gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid in Agrobacterium oder Alcaligenes aufgefunden wird.
  4. DNA-Strang, der mit dem DNA-Strang gemäß Anspruch 2 unter den folgenden Bedingungen hybridisiert: Hybridisieren in einer Lösung enthaltend 6 × Denhart, 5 × SSC bei 60°C 16 Stunden, gefolgt vom Waschen mit 2 × SSC, 0,1% × SDS bei 60°C 1 Stunde, und eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Polypeptid mit Enzymaktivität gemäß Anspruch 1 kodiert.
  5. DNA-Strang gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit Enzymaktivität kodiert, β-Carotin in Canthaxanthin durch Echinenon umzuwandeln.
  6. DNA-Strang gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit Enzymaktivität kodiert, Zeaxanthin in Astaxanthin durch 4-Ketozeoxanthin umzuwandeln.
  7. Verfahren zur Herstellung eines Xanthophylls umfassend das Einführen des DNA-Strangs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in einen Mikroorganismus, der β-Carotin synthetisieren kann, Kultivieren des transformierten Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Erhalten eines Xanthophylls aus der Kultur.
  8. Verfahren zur Herstellung eines Xanthophylls gemäß Anspruch 7, wobei außerdem ein DNA-Strang mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, das Enzymaktivität aufweist, um eine Hydroxygruppe an die Position 3-Kohlenstoff des 4-Keto-β-iononrings und/oder an die 3-Kohlenstoff des β-Iononrings hinzuzufügen, wobei eine Aminosäuresequenz des Polypeptids ein Mitglied ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Aminosäuresequenz mit den Aminosäuren Nrn. 1 bis 162, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist, b) einer Aminosäuresequenz mit den Aminosäuren Nrn. 1 bis 162, die in SEQ ID NO: 11 gezeigt ist und c) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 90% identisch zu der von (a) oder (b) ist, in einen Mikroorganismus eingeführt wird, der β-Carotin synthetisieren kann, der transformierte Mikroorganismus in einem Kulturmedium kultiviert und ein Xanthophyll aus der Kultur erhalten wird.
  9. Verfahren zur Herstellung eines Xanthophylls gemäß Anspruch 7, umfassend das Einführen des DNA-Strangs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 in einen Mikroorganismus, der β-Carotin synthetisieren kann, Kultivieren des transformierten Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Erhalten von Canthaxanthin oder Echinenon aus den kultivierten Zellen.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Xanthophylls gemäß Anspruch 7, umfassend das Einführen des DNA-Strangs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6 in einen Mikroorganismus, der Zeaxanthin synthetisieren kann, Kultivieren des transformierten Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Erhalten von Astaxanthin oder 4-Ketozeaxanthin aus den kultivierten Zellen.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Xanthophylls gemäß Anspruch 8, umfassend das Kultivieren des transformierten Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Erhalten von Astaxanthin oder Phoenicoxanthin aus den kultivierten Zellen.
  12. Verfahren zur Herstellung eines Xanthophylls gemäß Ansprüchen 7 bis 10, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium oder Hefe ist.
  13. Rekombinanter Mikroorganismus, der ein Xanthophyll herstellen kann, wobei der Mikroorganismus einen DNA-Strang gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt.
  14. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 13, wobei der Mikroorganismus FERM BP-4505 ist, der beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan hinterlegt ist.
  15. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 13, wobei der Mikroorganismus FERM BP-4761 ist, der beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan hinterlegt ist.
  16. Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zur Herstellung von Xanthophyll.
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