JPH05168465A - ファフィア・ロドチーマの突然変異株およびその培養によるカロチノイド類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 β−カロチンもしくはエキネノンまたはこれ
らの類縁カロチノイドを高選択性で効率よく生産する微
生物を提供する。 【構成】 アスタキサンチンの生合成前駆体に相当する
カロチノイド類、特に、主として、β−カロチンおよび
エキネノンからなる群より選ばれるカロチノイド類の高
い生産性を有するファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆ
ｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の突然変異株を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ファフィア・ロドチー
マ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）に属するカ
ロチノイド類の生産能を有する菌株およびその培養によ
るカロチノイド類の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ファフィア・ロドチーマはそれ自体赤色
に変化するアスタキサンチン生産菌として周知である。
一方、多種多様な用途が考えられる天然色素である他の
カロチノイド類も最近注目を集めるようになってきた。
例えば、β−カロチンは天然黄色色素として食品などに
有用であるばかりでなく、栄養素としての認識も深まり
ビタミンと同様に扱われている。また、β−カロチンに
は抗酸化作用、発癌抑制作用および紫外線などの有害作
用の予防効果なども認められており、食品、医薬品およ
び化粧品分野など産業上広汎な利用が期待できる生理活
性物質である。さらに、β−カロチンの４位ケト体であ
るエキネノンもβ−カロチンと同様な分野への用途が期
待されている。

【０００３】これらのカロチノイド類は動植物源をはじ
めとし、天然界に広く分布していることが知られてお
り、それらから単離抽出することが可能である。しかし
ながら、例えば、β−カロチンは甲殻類や赤色魚類にそ
の存在が知られている（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３
２，６９〜７９ページ，１９７０）が、その存在量は極
めて少なく、またカロチノイド類の種類も多様であるた
め、これらから経済的にβ−カロチンを採取することは
極めて困難である。また、エキネノンもウニやナマコな
どのキョクヒ動物に存在することが知られているが、β
−カロチンと同様にそれらからの経済的な採取は困難で
ある。

【０００４】さらに、これらのカロチノイド類を生産す
る微生物も知られており、例えば、エキネノンを生産す
る微生物としては、ミクロコッカス・ロゼウス（Ｍｉｃ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１０４，２７２〜２７４ページ，１９７
０）、ブレビバクテリウム・エスピー（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，２５０５〜２５１０
ページ，１９８９）、ファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａ
ｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．，１１５，１７３〜１８３ページ，１９
７９）などが、そしてβ−カロチンを生産する微生物と
してはドナリエラ（Ｄｕｎａｒｉｅｌｌａ）（特公昭６
４−４３１６７号公報）、コアネフォラ・トリスポラ
（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）（特公
昭４８−３５０８７号公報）などが挙げられる。

【０００５】しかしながら、いずれも目的のカロチノイ
ドを工業的規模で得るには生育性が劣るか、蓄積量が低
いか、または特定のカロチノイドの蓄積に対する選択性
が低いなどの理由により、満足できるものでない。より
具体的にβ−カロチンの生産について概観してみると、
ドナリエラは緑藻類に属する微生物で、これを用いるこ
とでかなり高収率でβ−カロチンを製造できるが、その
生育に際して光を必要とするなど、一般的な発酵槽で培
養できないため、現在培養池を掘って生産しているが、
至適培養条件の管理が煩雑であり、その生産性は低い。
また、糸状菌に属するコアネフォラは、その形態的特徴
より菌体がペレット（小塊）を形成したり、菌糸が長く
延びてパルプ状になり菌体への酸素供給が律速になる場
合が多く、ファフィア等の酵母と比較して一般に培養が
困難である。一方、エキネノンの生産について概観して
みると、上記微生物が生産するカロチノイド類は、主と
してカンタキサンチンやアスタキサンチンであり、全カ
ロチノイド類中のエキネノン含量は一般に低い。例え
ば、ミクロコッカス・ロゼウスでは５％（２９μｇ／ｇ
−乾燥菌体）であり、ブレビバクテリウム・エスピーＫ
Ｙ−４３１３株では２０〜３５％（４５０μｇ／ｇ−乾
燥菌体）であり、そしてファフィア・ロドチーマでは２
〜４％（６５．９μｇ／ｇ−乾燥菌体）である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述するように、β−
カロチンまたはエキネノンを単離採取する観点に立て
ば、従来の動植物源はもとより、微生物源も満足できる
ものとはいえない。そこで本発明の目的は、β−カロチ
ンまたはエキネノン、さらにその他のアスタキサンチン
前駆体のいずれかのカロチノイドの製造に適する微生物
を提供すると共に、それらを培養して目的とするカロチ
ノイド類の製造方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、工業的に
安価で効率のよいカロチノイド類を生産する微生物を探
索してきたところ、アスタキサンチンを生産するファフ
ィア・ロドチーマを、突然変異せしめることによりエキ
ネノンまたはβ−カロチンばかりでなく、その他のアス
タキサンチン生合成前駆体のいずれかの生産性およびそ
の選択性を個別に高める変異菌株を見い出して本発明を
完成した。

【０００８】従って、本発明によれば、上記課題は、フ
ァフィア・ロドチーマの突然変異株であって、アスタキ
サンチンに至るまでの生合成経路のいずれかが遮断され
ているかまたは障害を受けていて、アスタキサンチン生
合成前駆体いずれかのカロチノイド類を主として生産す
る突然変異株の提供、好ましくは、主としてβ−カロチ
ンおよびエキネノン（４−ケト−β−カロチン）からな
る群より選ばれるカロチノイド類を生産する突然変異株
を提供することによって解決される。

【０００９】かかる変異株は、ファフィア・ロドチーマ
の栄養培地として既知のいずれかの培地を用い、適当な
培養条件下で培養することによりβ−カロチンまたはエ
キネノンを選択性よく、かつ効率よく製造することがで
きる。以下、本発明をより具体的に説明する。本発明に
いう突然変異株は、適当な変異誘発源、例えば、エチル
メタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（以下「ＮＴＧ」と略称する）、ブ
ロモウラシルなどの化学的処理剤を用いるか、あるいは
ＵＶ照射などの物理的手段を用いて誘導されるもの、さ
らに、得られた変異株を同様の変異手段に供するか、ま
たは細胞融合もしくは形質転換して得られるものも包含
する意味で用いられている。こうして誘導され、アスタ
キサンチンに至るまでの生合成経路のいずれかが遮断さ
れているかまたは障害を受けているとは、アスタキサン
チンに至る生合成前駆体のいずれかを主として生産する
ようになっていれば、その変異状態如何を問わず、特定
のカロチノイドを選択性よく生産するような変異状態を
意味する。限定されるものでないが、上記生合成経路の
主要生産物を例示して概述すると、次のものが挙げられ
る。

【００１０】ＨＭＧ−ＣｏＡ→メバロン酸→…→フィト
エン→フィトフルエン→ ノイロスポレン→リコペン→…→β−カロチン→エキネ
ノン→ ３−ヒドロキシエキネノン→フェニコキサンチン→アス
タキサンチン （Andrewesら、Phytochemistry, 1976, 第15巻、1003〜
1007ページ参照）。 従って、本発明の変異株は、上記アスタキサンチンの生
合成前駆体、例えば、リコペン、β−カロチン、エキネ
ノン、３−ヒロドキシエキネノンおよびフェニコキサン
チンのいずれかを選択性よく生産するが、好ましい変異
株としては、主としてβ−カロチンおよびエキネノンか
らなる群より選ばれるカロチノイドを生産する株を挙げ
ることができる。かかる、突然変異株であって、主とし
てアスタキサンチン生合成前駆体、特にβ−カロチンお
よびエキネノンからなる群より選ばれるカロチノイド類
を生産するとは、これらの変異株が生産する総カロチノ
イド類の主たる成分がβ−カロチンまたはエキネノンで
あることを意味する。以下、生合成前駆体のうち、β−
カロチンおよびエキネノンを例にとり、本発明を説明す
るが、本発明はこれに限定されるものでない。

【００１１】主たる成分がβ−カロチンまたはエキネノ
ンであるとは、それらの総カロチノイド類に占める含有
量がそれらを効率よく採取できるものであればよく、ま
た効率よく採取できる範囲は一緒に生産される他のカロ
チノイド類の種類および組成によって変化するので限定
的でないが、一般に、β−カロチンにあっては、総カロ
チノイド類当り６０重量％以上、好ましくは９０重量％
以上であり、そしてエキネノンにあっては総カロチノイ
ド類当り５０重量％以上、好ましくは８０重量％以上で
あることをいう。

【００１２】変異誘発に使用することができるファフィ
ア・ロドチーマは、カロチノイド類の生産能を有する微
生物であれば樹液および土壌を初めとする天然界から得
られたものであるか、既存のタイプカルチャーより入手
できるものであってもよい。後者の具体例としては、ア
メリカン・タイプカルチャー・コレクションより、ＡＴ
ＣＣ２４２０１，ＡＴＣＣ２４２０２，ＡＴＣＣ２４２
０３，ＡＴＣＣ２４２２８，ＡＴＣＣ２４２２９，ＡＴ
ＣＣ２４２３０およびＡＴＣＣ２４２６１として入手で
きる菌株を挙げることができる。好ましくは、これらの
菌株から何らかの変異誘発手段または形質導入や細胞融
合などによってカロチノイド類、特にアスタキサンチン
の生産性が高まった菌株を用いるのがよい。

【００１３】このことは、上述のようにβ−カロチンお
よびエキネノンがそれぞれアスタキサンチン生合成系に
おけるある種の前駆体であることが窺えるので、変異処
理によって、これらの前駆体からアスタキサンチンへの
生合成経路を遮断またはその経路に障害をもたらすこと
によって、必然的にそれらの前駆体の生産量を高めるこ
とができるからである。

【００１４】かかる、アスタキサンチンの生産性が高ま
った菌株の具体的なものとしては、同時係属中の特願平
３−７７９４９号明細書に記載する、ＦＥＲＭ Ｐ−１
２１１８、ＦＥＲＭ Ｐ−１２１１７、ＦＥＲＭ Ｐ−
１２１１９を挙げることができる。なお、本明細書で使
用する「ＦＥＲＭ Ｐ」の番号は、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託
された番号を意味する。

【００１５】したがって、本発明の菌株はこれらの微生
物から上記変異源を用いる変異誘発手段によって誘導さ
れ、総カロチノイド類の生産性を低減することなく、β
−カロチンまたはエキネノン生産性の選択性が高まった
菌株が好ましい。これらの具体的なものとしては、平成
３年１２月１８日付で上記寄託センターに寄託され、寄
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６６２およびＦＥＲＭ Ｐ−
１２６６１が、それぞれ付されたファフィア・ロドチー
マ１３−Ｙ１３１株（β−カロチン生産株）および同１
３−Ｅ１１６株（エキネノン生産株）を挙げることがで
きる。

【００１６】本発明の突然変異株の作出は、上記変異源
を用いる常法によって行うことができる。例えば、上記
のようなアスタキサンチンの高い生産能を有する菌株を
用い、上述のようにＮＴＧまたはＵＶ照射などにより変
異処理を施した菌体を適当に希釈し、ＹＭ寒天培地に接
種し、生育したコロニーの色調を肉眼で観察し、黄色色
調の強い株を選択し、次いでそれらを培養生育した後、
生産する色素を確認することによって、それぞれ個別に
β−カロチンおよびエキネノン生産性変異株をうること
ができる。

【００１７】こうして得られる変異菌株は、ファフィア
・ロドチーマの培養に通常用いられる培地に培養して、
β−カロチンまたはエキネノンの生産に供することがで
きる。この培養に用いる炭素源としては例えばグルコー
ス、サッカロース、ガラクトース、セロビオース、キシ
ロース、デンプンおよび糖蜜などが挙げられ、窒素源と
しては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、水酸化アンモニウム、コーンスティープリカー、酵
母エキス、ペプトン、麦芽エキスおよび尿素などが挙げ
られる。また、培養に用いる無機塩としては、例えば、
リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜
鉛、塩化第二鉄、硫酸銅およびモリブデン酸ナトリウム
が挙げられ、その他微量栄養素として、例えばビオチ
ン、イノシトール、チアミン、パントテン酸カルシウ
ム、ピリドキシンなどを添加することができる。

【００１８】さらに、カロチノイドの生合成代謝に影響
を及ぼす代謝中間体やその類似化合物、例えば、β−イ
オノン、シトラールやゲラニオールなどを添加すること
により、所期のカロチノイドの生産性を高めることがで
きる。また、培地のpHは３〜７．５に調整するのが望ま
しい。培養は、好気的条件下、１５〜２７℃、好ましく
は２０〜２２℃の範囲の温度において培養することによ
り目的のカロチノイドを多量に含有する菌体が得られ
る。培養終了後遠心分離などの処理により菌体を取得
し、常法に従い溶媒抽出し、カラムクロマトグラフィ
ー、分取薄層クロマトグラフィーなどにより処理して、
培養物からβ−カロチンまたはエキネノンを単離精製す
ることができる。なお、これらのカロチノイドの培養時
間は、用いる菌株や培地組成、培養温度によって異なる
が、振盪培養、タンク培養ともに２〜１０日間でそれら
の蓄積量を最高にすることができる。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲をこれらに限定することを意
図するものでない。例１ β−カロチン生産性１３−Ｙ１３１株の取得 ファフィア・ロドチーマＡＴＣＣ２４２０１株を、ＹＭ
培地（ＹＭ Ｂｒｏｔｈ，Ｄｉｆｃｏ社製、２１ｇ／
ｌ）で２０℃、４８時間培養し集菌後、減菌水で２回洗
浄したのちリン酸緩衝液（０．０２Ｍ，pH６．０）５ml
に懸濁させた。この懸濁液に変異誘発剤としてＮ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）
を５μｇ／mlとなるように添加し、懸濁液を２０℃で１
時間振盪した。ついで集菌後、減菌水で２回菌体を洗浄
した。変異処理後、懸濁液を減菌水で１０００倍程度に
希釈し、希釈懸濁液０．１mlをＹＭ寒天培地（ＹＭ Ａ
ｇｑｒ，Ｄｉｆｃｏ社製、４１ｇ／ｌ）に塗抹して２０
℃で７２時間培養しコロニーを得た。

【００２０】こうして得られた約１０⁷ 個のコロニーの
中から肉眼で色調の赤くなった株を選択し、このうち特
に色調の赤い株、１３−Ｌｅｕ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
１１８）を得た。本菌は野生株と比較してアスタキサン
チン生産能が約５倍に上昇した菌株である。さらに、１
３−Ｌｅｕ株を親株とし、上記の方法で変異処理を繰り
返した。こうして得られた約１０⁶ 個のコロニーの中か
ら肉眼で色調の黄色くなった株を選択し、このうち特に
色調の黄色い株、１３−Ｙ１３１株を選抜した。β−カロチンの生産 酵母エキス３ｇ／ｌ、麦芽エキス３ｇ／ｌ、ペプトン５
ｇ／ｌおよびグルコース１０ｇ／ｌ（pH６．２）からな
る培地（ＹＭ培地）を試験管に５ml加え、ファフィア・
ロドチーマ１３−Ｙ１３１株を一白金耳接種し、２０℃
にて２４時間振盪し前培養を行った。ついで、酵母エキ
ス３ｇ／１、麦芽エキス３ｇ／１、ペプトン５ｇ／ｌ、
グルコース１０ｇ／ｌ（pH６．２）からなる培地（ＹＭ
培地）を、５００ml容坂口フラスコに５０ml加え、先の
前培養液１mlを接種し２０℃にて１２０時間振盪培養を
行った。培養終了後遠心分離により菌体を集め、β−カ
ロチンの分離を行った。菌体よりβ−カロチンの抽出 培養終了後、遠心分離により集めた菌体にガラスビーズ
とアセトンを加え、ホモジナイザー（日本精機製作所
ＤＸ−１型）を用い５分間粉砕した。ワットマンＧＦ／
Ｄ濾紙を用いて吸引濾過後、濾液（アセトン粗抽出液）
をアセトン粗抽出液：生理食塩水：ジエチルエーテル＝
１００：８０：６０の割合で混合し反復抽出を行った。
この抽出液をＮｏ．２濾紙（東洋濾紙）を用いて濾過
し、その濾液を４０℃で減圧乾固した後ｎ−ヘキサン１
０ml、またはシクロヘキサン１０mlに溶かし、ｎ−ヘキ
サン定溶溶液、シクロヘキサン定溶溶液としてβ−カロ
チンの分析に供した。β−カロチンの可視部吸収スペクトルの測定 上記の方法で抽出した、ｎ−ヘキサン定溶溶液、シクロ
ヘキサン定溶溶液を用いて可視部吸収スペクトルを測定
した。測定には島津自記分光光度計ＵＶ−２２００を用
いた。得られた可視部吸収スペクトルはｎ−ヘキサン
中、及びシクロヘキサン中とも、標準β−カロチン（化
学合成品）のスペクトルと一致した。β−カロチンのＴＬＣ分析 上記の方法で抽出したｎ−ヘキサン定溶溶液を用いて、
β−カロチンのＴＬＣ分析を行った。薄層クロマトプレ
ートはメルク社製、シリカゲル６０−Ｆ₂₅₄ シラナイズ
ドを使用した。また溶媒にはｎ−ヘキサンを用いて室温
にて展開した。これより得られた菌体抽出液のＲｆ値は
０．８８で、標準β−カロチン（化学合成品）のＲｆ値
と一致した。β−カロチンのＨＰＬＣ分析 上記の方法で抽出した、ｎ−ヘキサン定溶溶液を用いて
β−カロチンのＨＰＬＣ分析を行った。以下に分析条件
及び使用機器を記す。分析条件及び使用機器 溶媒 ： アセトニトリル／メタノール／テト
ラヒドロフラン＝５８／３８／７ 流速 ： １．０ml／min カラム圧 ： ７５kgf ／cm² 温度 ： ２５℃ サンプル量 ： ２０μｌ 検出 ： ４５０nm カラム ： ＣＡＰＣＥＬＬ Ｃ−１８ ＣＧ１
２０−３（センシュー科学社製）４．６mm×１５０mm ポンプ ： ＨＩＴＡＣＨＩ Ｌ−６０００ 検出器 ： 島津 ＳＰＤ−６ＡＶ 上記条件で菌体抽出液をＨＰＬＣ分析した結果、菌体抽
出液ピークのリテンションタイムは１３．６min で標準
β−カロチン（化学合成品）ピークのリテンションタイ
ムと一致した。

【００２１】以上、可視部吸収スペクトルの測定、ＴＬ
Ｃ分析、ＨＰＬＣ分析によって本菌の菌体抽出液の主成
分はβ−カロチンであると同定した。β−カロチンの定量 上記の方法で抽出したｎ−ヘキサン定溶溶液を用いてβ
−カロチンの定量を行ない、４５０nmにおける吸光係数
（Ｅ^1% _1cm ）を２５９５としてｎ−ヘキサン中でのβ−
カロチン量を算出した。上記の方法で菌体中のβ−カロ
チン量を測定したところ、１．８mg／ｇ−乾燥菌体であ
った。例２ β−カロチン生産性２４２０１−Ｙ３株の取得 ファフィア・ロドチーマＡＴＣＣ２４２０１株を、ＹＭ
培地（前述）で２０℃、４８時間培養し集菌後、減菌水
で２回洗浄したのちリン酸緩衝液（０．０２ＭpH６．
０）５mlに懸濁させた。この懸濁液に変異誘発剤として
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）を５μｇ／mlとなるように添加し、懸濁液を
２０℃で１時間振盪した。ついで集菌後減菌水で２回菌
体を洗浄した。

【００２２】変異処理後、懸濁液を減菌水で１０００倍
程度に希釈し、希釈懸濁液０．１mlをＹＭ寒天培地（前
述）に塗抹して２０℃で７２時間培養しコロニーを得
た。こうして得られた約１０⁵ 個のコロニーの中から肉
眼で色調の黄色くなった株を選択し、このうち特に色調
の黄色い株、２４２０１−Ｙ３株を得た。β−カロチンの生産 酵母エキス３ｇ／ｌ、麦芽エキス３ｇ／ｌ、ペプトン５
ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ（pH６．２）からなる培
地（ＹＭ培地）を試験管に５ml加え、ファフィア・ロド
チーマ２４２０１−Ｙ３株を一白金耳接種し２０℃にて
２４時間振盪し前培養を行った。ついで、酵母エキス３
ｇ／ｌ、麦芽エキス３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、グル
コース１０ｇ／ｌ（pH６．２）からなる培地（ＹＭ培
地）を、５００ml容坂口フラスコに５０ml加え、先の前
培養液１mlを接種し２０℃にて１２０時間振盪培養を行
った。β−カロチンの抽出、分析、及び定量 培養終了後、実施例−１に説明した方法でβ−カロチン
の抽出、分析、定量を行った。分析の結果本菌の菌体抽
出液の主成分はβ−カロチンであると同定した。また定
量の結果β−カロチン含量は０．７mg／ｇ−乾燥菌体で
あった。例３ エキネノン生産性１３−Ｅ１１６株の取得 ファフィア・ロドチーマＡＴＣＣ２４２０１株にＮＴＧ
による変異処理を施して、乾燥菌体当りのアスタキサン
チン含量が５倍程度に増大したファフィア・ロドチーマ
１３−Ｌｅｕ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１１８）を、減菌
したＹＭ培地５０mlの入った５００ml容坂口フラスコに
１白金耳植菌し、２０℃で４８時間振盪培養した。集菌
後、蒸留水で２回洗浄したのち、０．０２Ｍリン酸緩衝
液（pH６．０）５mlに懸濁した。この懸濁液に変異誘発
剤としてＮＴＧ溶液を１５μｇ／mlになるように添加
し、２０℃で１時間振盪した。ついで遠心分離により集
菌し、同様のリン酸緩衝液で３回菌体を洗浄した。この
菌体懸濁液を減菌水で１０００倍程度希釈したのち、Ｙ
Ｍ寒天培地に０．１mlずつ塗末して２０℃で５日間培養
しコロニーを得た。こうして得られた赤いコロニーの中
にわずかに混在するオレンジ色のコロニーをＹＭ寒天培
地に分離した。

【００２３】単一コロニー１つを減菌したＹＭ液体培地
５０mlの入った坂口フラスコに１白金耳植菌し、これを
２０℃で５日間振盪培養した。培養液を遠心分離にかけ
て集菌し、アセトンを添加して冷却下ホモジナイザーで
破砕後吸引濾過した。アセトン抽出を２回繰り返して得
られた抽出液に対し生理食塩水、エチルエーテルをそれ
ぞれ８０％、６０％になるように添加し、分液ロートで
分離した。エーテル層を分取し、さらに生理食塩水２０
mlを加えて同様にエーテル層を分取した。濾過した後に
減圧濃縮して得られたエーテル抽出物をｎ−ヘキサンに
溶解し、分光光度スキャニングにかけ得られた吸収スペ
クトルの結果、吸収スペクトルの形及び最大吸収波長が
４５８nmのみであることから、このカロチノイドはエキ
ネノンと同定された。そしてさらに薄層クロマトグラフ
ィー分析とＨＰＬＣ分析でも確認した。

【００２４】こうして得られたエキネノン生産変異株フ
ァフィア・ロドチーマ１３−Ｅ１１６株を取得した。本菌株のエキネノン含量の算出 アセトン溶媒中での４５８nmにおける吸光度の値と分子
吸光係数２１５８から計算すると２．３２mg／ｌ、菌体
量４．５２ｇ／ｌよりエキネノン含量は０．５１mg／ｇ
−乾燥菌体となる。参考までに、従来技術と本発明のエ
キネノン含量をまとめると以下のようになる。 ─────────────────────────────── 菌 株 名 エキネノン含量 ─────────────────────────────── ミクロコッカス・ロゼウス (Micrococcus roseus)ATCC 516 29 μg/g-乾燥菌体 ─────────────────────────────── ブレビバクテリウム・エスピー (Brevibacterium sp.)KY 4313 450 μg/g-乾燥菌体 ─────────────────────────────── ファフィア・ロドチーマ (Phaffia rhodozyma )UDC 67-210 65.9 μg/g-乾燥菌体 ─────────────────────────────── 13-E116 510 μg/g-乾燥菌体 ───────────────────────────────例４ １３−Ｙ１３１株によるβ−カロチンの生産 例−２で取得した１３−Ｙ１３１株を用い、さらにβ−
カロチン生産能を高めるべく種々、培養条件の検討を行
った。その結果、以下に記した培養法を用いることによ
り菌体中のβ−カロチン含量は３．６mg／ｇ−乾燥菌体
にまで増加した。なお、β−カロチンの抽出及び分析法
は例−１の方法に従った。

【００２５】酵母エキス３ｇ／ｌ、麦芽エキス３ｇ／
ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ（pH６．
２）からなる培地（ＹＭ培地）を試験管に５ml加え、フ
ァフィア・ロドチーマ１３−Ｙ１３１株を一白金耳接種
し２０℃にて２４時間振盪し前培養を行った。ついで、
酵母エキス３ｇ／ｌ、麦芽エキス３ｇ／ｌ、ペプトン５
ｇ／ｌおよびグルコース５０ｇ／ｌ（pH６．２）からな
る培地を、５００ml容坂口フラスコに５０ml加え、先の
前培養液１mlを接種し２０℃にて１２０時間振盪培養を
行った。培養終了後遠心分離により菌体を集め、β−カ
ロチンの分離を行った。このように培地中のグルコース
濃度を５倍にすることにより菌体中のβ−カロチン含量
は約２倍に増加した。例５ １３−Ｅ１１６株によるエキネノンの生産 グルコース５０ｇ／ｌ、酵母エキス６ｇ／ｌ、麦芽エキ
ス６ｇ／ｌおよびポリペプトン１０ｇ／ｌ（pH６．２）
の組成からなる培地５０mlずつを、５００ml容坂口フラ
スコ２本に入れ減菌した後、ファフィア・ロドチーマ１
３−Ｅ１１６株を１白金耳植菌し、２０℃で７日間培養
した。培養液から集菌し、例２と同様にアセトンとエー
テルを用いて抽出を行った。抽出液を集め、減圧濃縮
し、薄層クロマトグラフィーにより分取、精製すると、
１．２mgのエキネノンが得られた。また、この時のエキ
ネノン含量は０．９６mg／ｇ−乾燥菌体であった。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、β−カロチンまたはエ
キネノンを高い選択性で効率よく生産するファフィア・
ロドチーマの突然変異株が提供される。したがって、か
かる変異株の培養により前記カロチノイド類の工業的生
産が可能になる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉ
   ａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の突然変異株であって、アス
   タキサンチンに至るまでの生合成経路のいずれかが遮断
   されているかまたは障害を受けていて、アスタキサンチ
   ンの生合成前駆体いずれかのカロチノイド類を主として
   生産する突然変異株。
2. 【請求項２】 アスタキサンチンの生合成前駆体がβ−
   カロチンおよびエキネノンからなる群より選ばれるカロ
   チノイド類である請求項１記載の突然変異株。