JP4290559B2

JP4290559B2 - ブラケスレアトリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株及び（−）株を使用する混合培養物の発酵によるβ−カロテンの生産方法

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Publication number: JP4290559B2
Application number: JP2003564264A
Authority: JP
Inventors: ペレス、ハヴィエルコスタ; ロドリゲス、アナ、テレサマルコス; ラフエンテモレノ、ファン、ルイスデ; セイズ、マルタロドリゲス; ガルシア、ブルーノディエス; セゾン、エンリケペイロ; カブリ、ウォルター; フエンテ、ホセ、ルイスバレード
Original assignee: ビタテネ、ソシエダッドアノニマ
Priority date: 2002-01-29
Filing date: 2003-01-29
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2023-01-29
Also published as: ES2327911T3; ATE434052T1; EP1367131A1; DE60327967D1; US20040152154A1; JP2005515786A; WO2003064673A1; EP1367131B1; DK1367131T3; ES2195766A1; ES2195766B1; US7252965B2

Description

本発明は、β−カロテンを過剰に産生するブラケスレアトリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株及び（−）株を選択する方法、並びに食品分野及び製薬分野において直接的に適用されるβ−カロテンの安定した製造を可能にする当該菌株の新しい発酵方法を記載する。

カロテノイドは、ある種の細菌、菌類及び光合成生物によって合成されるイソプレノイド起源の色素である。カロテノイドは下記の２つのタイプに分けることができる：
（ｉ）カロテンと呼ばれる純粋な炭化水素（これには、β−カロテン、α−カロテン、γ−カロテン又はリコペンなどの化合物が含まれる）、及び
（ｉｉ）キサントフィルと呼ばれる、酸素を様々な形態（ヒドロキシル基、エポキシ基など）で含有する分子（これには、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カプサンチン、カンタキサンチン、ルテインなどが含まれる）。
これらの化合物はすべて、ヒトの食事において、抗酸化物質（ガン及び他の疾患の防止）や、ビタミンＡの前駆体として、重要な役割を果たしている。健康に対するそれらの有益な効果及びそれらの魅力的な色のために、カロテノイドは、着色剤及び食品添加物として商業的に非常に重要視されている［ＮｉｎｅｔＬ．及びＲｅｎａｕｔＪ．（１９７９）、微生物技術（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（編者：ＰｅｐｐｌｅｒＨＪ、ＰｅｒｌｍａｎＤ、第２版）、第１巻、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮＹ、５２９頁〜５４４頁］。

β−カロテンは、その化学合成が１９５６年以来知られているカロテノイドである。β−カロテンは、５３６．９の分子量を有し、１１個の共役二重結合を有する分子（Ｃ_４０Ｈ_５６）である。その色は、結晶状態では赤みがかった紫色であり、油性溶液では黄色がかったオレンジ色であり、水性分散物ではオレンジ色である。合成されたβ−カロテンは、オールトランス異性体の立体配置を有しており、その一方、様々な天然源から得られたβ−カロテンは、様々な形態（オールトランス、モノシス、ジシス及びポリシス）を有している。

微生物の生合成によるカロテノイドの生産は、化学的プロセスと生物学的プロセスとの間で競合する古くからの一例である。生物工学的プロセスの長所としては、とりわけ、天然にしか存在しない立体配座異性体が得られるだけでなく、より複雑な構造のカロテノイドを簡便な方法で得られることがある。β−カロテンを生産するための工業的な生物工学的プロセスは、化学合成と競合しているが、藻類のズナリエラサリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ）及び菌類のブラケスレアトリスポラ（Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ）の使用に基づいている。ブラケスレアトリスポラ（Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ）を用いた生産プロセスには、β−カロテンの最大収量を達成するために、その（＋）株及び（−）株の混合発酵を必要とする。混合培養物におけるカロテノイドの収量増大は、β因子又はトリスポリック酸と呼ばれる一群の酸化合物の産生に関連する［国際特許出願公開ＷＯ００／７７２３４；ＣａｇｌｉｏｔｉＬ．他（１９６６）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、増刊７：１７５頁〜１８７頁］。β−カロテンは、（＋）株及び（−）株の両方によって産生されるが、両者はβ−カロテンをレチナールに代謝し、続いて４−ジヒドロトリスポロールに代謝する。（＋）株は、ジヒドロトリスポリック酸及びそのメチルエステル（４−ジヒドロトリスポリック酸メチル）を形成させるための基質として４−ジヒドロトリスポロールを利用する。（−）株に関する限り、（−）株は、４−ジヒドロトリスポロールをトリスポロールに代謝する。最後に、４−ジヒドロトリスポリック酸メチルは（−）株によってトリスポリック酸に変換され、そしてトリスポロールは（＋）株によってトリスポリック酸に変換される。トリスポリック酸の生合成に関するこの記載は、このプロセスで、多くの共代謝物が生成し、共代謝物の一部は（＋）株及び（−）株の両方に共通しているが、他の共代謝物はそれらの一方に特異的であることから、単純化して記載されている。これらの共代謝物の相対的な量は、菌株に依存して変化する。

β−カロテンの生合成経路（スキーム１）が、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａに系統学的に関連する菌類（フィコミセスブラケスリーアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ）及びムコールシルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）など）において記載されている［ＡｒｒａｃｈＮ．他（２００１）、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ、９８：１６８７頁〜１６９２頁；ＶｅｌａｙｏｓＡ．他（２０００）、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６７：５５０９頁〜５５１９頁］。少なくとも３つの酵素が、この生合成には必要である：
（ｉ）フィトエンシンターゼ（これは、２分子のゲラニルゲラニルピロリン酸を結合して、フィトエンを形成する）、
（ｉｉ）フィトエンデヒドロゲナーゼ（これは、４つの二重結合をフィトエン分子に導入して、リコペンを合成する）、及び
（ｉｉｉ）リコペンシクラーゼ（これは、リコペンを基質として使用して、β−カロテン分子の両端に存在する環を形成する）。
この菌類におけるβ−カロテンの生合成経路は、Ｐ．ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓについて記載された生合成経路と類似することが、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの変異体の分析に基づいて結論された［ＭｅｔｈａＢ．Ｊ．及びＣｅｒｄａ−ＯｌｍｅｄｏＥ．（１９９５）、ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４２：８３６頁〜８３８頁］。フィコミセスブラケスリーアヌス（Ｐ．ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ）の場合、その菌糸の黄色の色を変異によって変化させることができ、そのような変異により、赤色、白色又は様々な色調の黄色に着色されている菌糸体を持つ菌株を生じる。赤色の変異体は、リコペンを蓄積し、一方、白色の変異体は、カロテノイドの産生性を欠くか、フィトエンを蓄積している。

菌株を選択するために工業微生物学において使用されているシステムの１つは、フローサイトメトリーに基づいている。この技術により、不均一な集団から変異体の亜集団を選択することが可能となる。これを達成するために、蛍光の測定及び光散乱の測定などの非破壊的な方法が使用される。変異体の単離は、細胞の選別及び分離を可能にするサイトメーター（「Ｓｏｒｔ」）に接続された付帯装置によって行われる。亜集団の選択は、収量に直接的又は間接的に関連する特定のパラメーターを測定することに基づいている。フローサイトメトリーは、目的とするその生成物が自己蛍光性である生物学的サンプルには特に有用である。β−カロテンは実際には蛍光性分子ではないが、４８８ｎｍの波長のアルゴンレーザーで励起されたときには、励起状態からその基底状態に戻るとき、エネルギーの喪失により、６００ｎｍを超える波長で検出される放射遷移のプロセスが生じる。この性質により、目的とする変異体を直接選択することが可能になる。

Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの発酵によるβ−カロテンの生産が様々な特許に記載されている（米国特許第３５２２１４６号、ソ連邦１５９２３２７、ロシア２０５３３０１、及び米国特許第５４２２２４７号）。米国特許第５４２２２４７号には、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの選択された菌株を特定の発酵条件において使用する３．５ｇ／ｌ〜７ｇ／ｌのβ−カロテンの生産が特許請求されている。

本特許では、９ｇ／ｌのβ−カロテンを生産することを可能にする菌株の新しい選択方法及び改善された発酵条件が記載される。

本発明は、菌類のＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａを用いて高収量のβ−カロテンを得るための一連の方法を記載する。本発明は、（ｉ）β−カロテンの過剰産生体であるＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの変異体を作製及び選択するための方法の設計、並びに（ｉｉ）改善された発酵条件の開発からなる。
Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａは、β−カロテンの生物工学的生産にとって工業的に非常に重要な菌類である。実際、本発明の方法は、現在工業的に使用されている合成方法と競合し得ることを証明する。

β−カロテンの過剰産生体である菌株を得ることを目指して、最初に、変異誘発法を、変異誘発剤のエチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）及びＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いてＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）株及び（−）株について開発した。変異処理される胞子の懸濁物を、ＹｐＳｓ培地を用いて斜面培養物から得た。胞子を、それぞれの斜面培養物に０．１％トリトンＸ−１００溶液１０ｍｌを加えることによって再懸濁した。菌糸残留物を、細孔サイズ２０μｍのナイロンフィルターによるろ過で除いた。懸濁物における胞子の濃度は、約１０^６胞子／ｍｌであった。ＥＭＳを用いた変異方法は、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）における３％ＥＭＳ溶液中の１０^６胞子／ｍｌの胞子を、室温で６０分間インキュベーションし、約９９％の死亡率を達成することからなった。変異処理された胞子を、０．１％トリトンＸ−１００で３回洗浄し、１５℃で２分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。ＮＴＧを用いた変異方法は、２５０μｇ／ｍｌのＮＴＧ及び０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を含有する溶液中の１０^６胞子／ｍｌの胞子を、室温で３０分間インキュベーションし、約９５％の死亡率を達成することからなった。変異処理された胞子を、０．１％トリトンＸ−１００で３回洗浄し、１５℃で２分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。０．１％トリトンＸ−１００が補充されたＳｕｔｔｅｒＩＶ固体培地を含有するペトリ皿に、変異処理された胞子を播種し、２５℃で４日間インキュベーションして、単離されたコロニーを得た。

β−カロテンの過剰産生体であるＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（−）株を選択するために用いられた方法論は下記の通りであった：
（ｉ）蛍光に基づく細胞選択技術（ＦＡＣＳ、蛍光活性化細胞選別）の使用、
（ｉｉ）γ−カロテン及び他のカロテノイドのより低い収量、並びに
（ｉｉｉ）コロニーの色強度。
ＦＡＣＳを使用してβ−カロテン産生変異体を選択するために、変異処理された胞子をＰＤＡ培地において増殖させ、０．１％トリトンＸ−１００で洗浄し、細胞選別器及び分離器と連結させたフローサイトメーターで分析した（「ＦＡＣＳｏｒｔ」、蛍光活性化細胞選別）。この技術を使用すると、最高レベルの自己蛍光を有する変異体の亜集団を選択することが可能である。β−カロテンは実際には蛍光性分子ではないが、４８８ｎｍのアルゴンレーザーで励起された場合、６００ｎｍを超える波長で検出される蛍光放射を発する。この方法では、検出される自己蛍光は胞子中のβ−カロテンの含有量に比例する。

選択された胞子をＰＤＡ培地（Ｄｉｆｃｏ）に播種して、２５℃でインキュベーションし、β−カロテンの過剰産生体である変異体が濃いオレンジ色になることを観察した。β−カロテン産生変異体の選択を、γ−カロテン及び他のカロテノイドにおける当該変異体のより低い収量を指標として、下記のように行われた。
即ち、ＦＡＣＳｏｒｔによって単離された、より高レベルの自己蛍光を有する変異体の亜集団を、混合培養におけるβ−カロテンの収量を測定する目的で、液体培地において発酵させた。発酵終了後直ちに、β−カロテン及び他のカロテノイドをＨＰＬＣによって定量した。このようにして、（ｉ）β−カロテンのより高い収量、及び（ｉｉ）γ−カロテン及び他のカロテノイドのより低い収量を示す、様々な変異体が選択された。ＶＫＰＭＦ−７４４の（−）株について両方の方法を適用して、本発明者らは、ＣＭＡ１（−）株、ＣＭＡ２（−）株、ＣＭＡ３（−）株及びＣＭＡ４（−）株を選択した（スキーム２）。

スキーム２は、変異方法及び選択方法を使用してＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａＶＫＰＭＦ−２０８（−）株から得られた様々なＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）株の発生系統を示す。ＵＶは紫外線、ＳＮは自然選択、ＮＴＧはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ＥＭＳはエチルメタンスルホナート、ＦＡＣＳは蛍光活性化細胞選別を表す。

下記の記号体系が、選択された菌株を示すために使用された：
ＣＭ＝カロテンマイナス（−）、ＣＰ＝カロテンプラス（＋）。
親の世代間の関係は、アルファベット順に従う（ＡはＢの親で、ＢはＣの親である。以降同様）。文字の後に付けられた数字は変異体の番号に対応する。例えば、ＣＭＡ１（−）の名称は、これがカロテン産生株（Ｃ）で、マイナス（Ｍ）で、ＣＭＢの親で、変異体番号１であることを意味する。同じように、ＣＭＡ１（−）、ＣＭＡ２（−）、ＣＭＡ３（−）及びＣＭＡ４（−）は、１つの世代、すなわち、同じ世代の変異体１、変異体２、変異体３及び変異体４に対応する。

β−カロテン産生変異体の選択が、コロニーの色強度を関数として、下記のように行われた。即ち、ＣＭＡ１（−）株の変異処理された胞子を、ＹＥＰＤＡ固体培地の培養皿に播種し、増殖したところで、ＣＭＡ１（−）親株よりも濃い黄色がかったオレンジ色を有するコロニーを選択した。このようにして、黄色がかった濃いオレンジ色を有する２つのコロニーを単離し、これらをＣＭＢ１（−）及びＣＭＢ２（−）と称した。

Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）のβ−カロテン過剰産生変異体の選択を、変異処理された胞子を、ＳｕｔｔｅｒＩＶ固体培地を含有するペトリ皿において増殖させることによって行った。次に、各コロニーの一部を、予めＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）が播種されているＰＤＡの培養皿に移した。固体培地でのβ−カロテンの収量を、（＋）株のコロニーと（−）株のコロニーとの交差域における色強度の指標として評価した。このようにして、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａＣＰＡ１（＋）株を選択した（スキーム３）。この菌株は、高収量のβ−カロテンを、一連の（−）株との混合固体培養においてもたらした。その後、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａＣＰＡ１（＋）株の収量を、液体培地での混合培養において分析した。

スキーム３は、変異方法及び選択方法を使用して、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａＶＫＰＭＦ−１１７（＋）から得られたＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）株の発生系統を示す。ＵＶは紫外線、ＳＮは自然選択、ＮＴＧはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ＥＭＳはエチルメタンスルホナートを表す。

固体培地で選択されたＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）株及び（−）株を、液体培地及び混合培養におけるβ−カロテンの収量を測定する目的で、フラスコにおいて発酵させた。このために、（＋）株及び（−）株の種菌を別々のフラスコで増殖させ、その後、２つの菌株の混合発酵をフラスコにおいて行った。発酵終了後直ちに（約６日）、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの菌糸を渦状撹拌によって溶解し、β−カロテンを有機溶媒（例えば、アセトン）で抽出し、その濃度及び純度をＨＰＬＣによって測定した。得られた収量は、６．０ｇ／ｌ〜７．０ｇ／ｌの間で変化した。

選択された菌株を、β−カロテンの収量を測定するためにパイロットプラント発酵装置において培養した。このために、選択された菌株を別々にフラスコで増殖させて、中間増殖用タンクに別々に移し、最後に一緒にして発酵させた。発酵は、１００時間〜１４０時間インキュベーションして行なった。一連の異なる発酵において得られたβ−カロテンの平均収量は、ＣＰＡ１（＋）株／ＣＭＡ３（−）株で７．２ｇ／ｌであり、ＣＰＡ１（＋）株／ＣＭＢ２（−）株で６．８ｇ／ｌであった。ＣＰＡ１（＋）株／ＣＭＡ３（−）株の発酵において、種菌の培養期間を４８時間から４６時間に減らしたとき、その収量が７．７ｇ／ｌに増大したことが見出された。同様に、ＣＰＡ１（＋）株／ＣＭＢ２（−）株の発酵において、種菌の培養期間を４８時間から４６時間に減らしたとき、その収量が７．１ｇ／ｌに増大したことが見出された。次に、本発明者らは、β−イオノンを添加する最適なプログラムを確立することによってＣＰＡ１（＋）株／ＣＭＡ３（−）株からのβ−カロテンの収量を増大させることに成功した。この方法では、８．７ｇ／ｌの範囲での収量が達成された。最後に、酸素注入を伴う発酵システムを開発し、これにより、（ｉ）ＣＰＡ１（＋）株／ＣＭＡ３（−）株の発酵において、β−カロテンの収量を少なくとも９ｇ／ｌにまで増大させること、並びに（ｉｉ）γ−カロテン及び他のカロテノイドの蓄積を低下させることが可能となった。

（ブダペスト条約に従った微生物の寄託）
ブラケスレアトリスポラのこれらの菌株は、ブダペスト条約の規定に従って、ロシア国立工業微生物コレクション（ＲｕｓｓｉａｎＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＶＫＰＭ）（ＧＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ，ＤｏｒｏｚｈｎｙＰｒｏｅｚｄ１、Ｍｏｓｃｏｗ１１３５４５、ロシア）に、下記の番号及び日付で寄託されている：
ＶＫＰＭＦ−１１７、１９７９年１２月２１日；
ＶＫＰＭＦ−２０８、１９７９年１２月２０日；
ＶＫＰＭＦ−５５１、１９９２年１１月１９日；
ＶＫＰＭＦ−６７４、１９９２年１１月１９日；
ＶＫＰＭＦ−７２６、１９９７年１月２１日；
ＶＫＰＭＦ−７２７、１９９７年１月２１日；
ＶＫＰＭＦ−７３６、１９９７年１０月７日；
ＶＫＰＭＦ−７４１、１９９８年１月２８日；
ＶＫＰＭＦ−７４４、１９９８年１月２８日；及び
ＶＫＰＭＦ−８１６、２０００年１２月１３日。

下記の実施例により、本発明を詳細に記載するが、これらは、本発明を限定するものではない。

Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）株及び（−）株の変異方法
最初に、変異誘発法をＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）株及び（−）株について開発し、そのために、下記のことを検討した：
（ｉ）様々なタイプの変異誘発剤、
（ｉｉ）変異原の濃度、
（ｉｉｉ）胞子の濃度、
（ｉｖ）インキュベーションｐＨ、及び
（ｖ）処理時間。
このようにして、エチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）及びＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を、変異誘発剤として選択した。

変異処理される胞子の懸濁物を、下記の組成を有するＹｐＳｓ培地を用いて斜面培養物から得た：
４ｇ／ｌの酵母抽出物、
１５ｇ／ｌの可溶性デンプン、
１ｇ／ｌのＫ_２ＨＰＯ_４、
０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ及び１５ｇ／ｌの寒天、
５．８の最終ｐＨ。
胞子を、それぞれの斜面培養物にトリトンＸ−１００の０．１％溶液１０ｍｌを加えることによって再懸濁した。菌糸残留物を、細孔サイズ２０μｍのナイロンフィルターでろ過して除いた。懸濁物中の胞子濃度は、約１０^６胞子／ｍｌであった。

ＥＭＳを用いた変異方法は、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の３％ＥＭＳ溶液中における１０^６胞子／ｍｌの胞子を、室温で６０分間インキュベーションし、約９９％の死亡率を達成することからなった。変異処理された胞子を０．１％トリトンＸ−１００で３回洗浄し、１５℃で２分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。

ＮＴＧを用いた変異方法は、２５０μｇ／ｍｌのＮＴＧ及び０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を含有する溶液中で、１０^６胞子／ｍｌの胞子を、室温で３０分間インキュベーションし、約９５％の死亡率を達成することからなった。変異処理された胞子を０．１％トリトンＸ−１００で３回洗浄し、１５℃で２分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。

変異処理された胞子を用いて、０．１％トリトンＸ−１００が補充されたＳｕｔｔｅｒＩＶ固体培地を含有するペトリ皿に播種した。ＳｕｔｔｅｒＩＶ培地の１リットルあたりの組成は下記の通りである：
４０ｇグルコース、４ｇＬ−アスパラギン、１０ｇＫＨ_２ＨＰＯ_４、４０ｍｌの５０ｘ微量成分溶液、及び３０ｇの寒天。
５０ｘ微量成分溶液は、２５ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１．８２ｇ／ｌのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのチアミン、０．１ｇ／ｌのクエン酸、０．０７５ｇ／ｌのＦｅ（ＮＯ_３）_３・９Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１７ｇ／ｌのＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、０．０２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、及び０．０２５ｇ／ｌのＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏから作製される。
播種された培養皿を、単離されたコロニーを得るために２５℃で４日間インキュベーションした。

β−カロテンの過剰産生体であるＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）の変異体を選択するための方法
本実施例では、（ｉ）蛍光に基づく細胞選択技術（ＦＡＣＳ、蛍光活性化細胞選別）の使用、（ｉｉ）γ−カロテン及び他のカロテノイドのより低い収量、並びに（ｉｉｉ）コロニーの色強度に基づく、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）のβ−カロテン過剰産生株を選択するための方法を記載する。本発明で使用されたＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）株の発生系統をスキーム２に示す。

ＦＡＣＳによるβ−カロテン産生変異体の選択を、実施例１に記載されるようにＥＭＳで変異処理された胞子から出発して行った。変異処理された胞子をＰＤＡ固体培地に播種して、２５℃で７日間インキュベーションした。インキュベーション終了時、胞子を遠心分離によって集め、トリトンＸ−１００の０．１％溶液で２回洗浄した。それぞれの培養皿の培養物を１ｍｌの最終容量で懸濁した。Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの変異胞子を、ＦＡＣＳｏｒｔ装置（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによって分析した。励起を４８８ｎｍのアルゴンレーザーで行い、下記のパラメーターについて評価した：
前方散乱（ＦＳＣ）、
側方散乱（ＳＳＣ）、及び
６００ｎｍから始まる蛍光放射（ＦＬ３検出器を使用した）。
β−カロテンの過剰産生体である変異体を、ＦＬ３検出器において最高レベルの自己蛍光を有する胞子亜集団を純化することによって選択した。このようにして単離された胞子を、単離されたコロニーを得る目的で、ＰＤＡ培地に播種した。コロニーのそれぞれの収量を、実施例４に記載されるようなＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａＣＰＡ１（＋）株との混合培養によるフラスコ発酵によって分析した。１０個の変異体コロニーを用いて得られた結果は以下の通りであった。
即ち、５個のコロニー（５０％）は、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａＶＫＰＭＦ−７４４（−）親株に対して、β−カロテン収量の有意な増加を示し、３０％のコロニーは、親株と類似した収量を示し、残る２０％は、親株よりも少ない量を産生した（図１）。β−カロテン収量が増大した５個の変異体（ＣＭＡ１（−）、ＣＭＡ２（−）、ＣＭＡ３（−）、ＣＭＡ４（−）及びＦ９（−））の中で、そのうちの１個だけ（Ｆ９（−））が、他より多量のγ−カロテン及び他のカロテノイドを有していた。そのため、これは破棄された。最大の純度及び収量のβ−カロテンを有する菌株は、ＣＭＡ１（−）であった。したがって、これを、次のサイクルの変異（スキーム２）の親株として選択した。

β−カロテンの過剰産生体である変異体の選択が、コロニーの色強度を関数として、以下のように行われた。
即ち、ＣＭＡ１（−）株を、実施例１に記載されるような変異誘発に付した。変異処理された胞子をＹＥＰＤＡ固体培地（２０ｇ／ｌのバクトペプトン、１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２０ｇ／ｌグルコース、２０ｇ／ｌ寒天、最終ｐＨ６．０）の培養皿に播種して、２５℃で２４時間インキュベーションし、その後、２０℃で４８時間〜７２時間インキュベーションした。最後に、ＣＭＡ１（−）親株よりも濃い黄色がかったオレンジ色を有するコロニーを選択した。このようにして、β−カロテンの過剰産生体であると考えられる、濃いオレンジ色を有する２つのコロニーが単離され、これらはＣＭＢ１（−）及びＣＭＢ２（−）と称された。その後、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＭＡ１（−）株、ＣＭＡ２（−）株、ＣＭＡ３（−）株、ＣＭＡ４（−）株、ＣＭＢ１（−）株及びＣＭＢ２（−）株の収量を、実施例４、実施例５、実施例６及び実施例７に記載されるように、液体培地でのＣＰＡ１（＋）株との混合培養において分析した。スキーム２には、本発明において使用されたＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）の菌株の発生系統を示す。

β−カロテンの過剰産生体であるＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）の変異体を選択するための方法
Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）のβ−カロテン過剰産生変異体の選択を、実施例１に記載されるような変異処理された胞子を使用して行った。これらの胞子を、ＳｕｔｔｅｒＩＶ固体培地を含有するペトリ皿に播種し、２５℃で７日間インキュベーションして、単離されたコロニーを得た。次に、各コロニーの一部を、予めＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）を播種しているＰＤＡ培地の培養皿に移した。（＋）株と（−）株との播種点間の距離は約２ｃｍでなければならない。固体培地におけるβ−カロテンの収量が、（＋）株のコロニーと（−）株のコロニーとの交差域における着色強度から推定される。このようにして、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＰＡ１（＋）株を選択したが。この株は、一連の（−）株との混合固体培養において、より高収量のβ−カロテンをもたらした。その後、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＰＡ１（＋）株の収量を、実施例４、実施例５、実施例６及び実施例７に記載されるように、液体培地での混合培養において分析した。スキーム３には、本発明において使用されたＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）の菌株の発生系統を示す。

Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）株と（−）株との混合培養によるフラスコにおけるβ−カロテンの生産方法
実施例１、実施例２及び実施例３に記載されるようにして選択されたＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）株及び（−）株を、液体培地及び混合培養におけるβ−カロテンの生産レベルを測定する目的で、フラスコにおいて発酵させた。
このために、種菌用培地を、１リットルあたり下記の組成で調製した：
２３ｇのダイズ粉、
４７ｇのトウモロコシ粉、
０．５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４及び
０．００２ｇのチアミン塩酸塩。
ｐＨを６．３に調節した。（＋）株を、６７ｍｌの培地を含有する５００ｍｌフラスコに、１０^３胞子／ｍｌの割合で播種した。（−）株を、１００ｍｌの培地を含有する５００ｍｌフラスコに、１０^４胞子／ｍｌの割合で播種した。両タイプの種菌を、２５℃及び２５０ｒｐｍで４４時間インキュベーションした。

発酵培地は、１リットルあたり下記の組成を有し、ｐＨを６．３に調節した：
４４ｇのダイズ粉、
１９ｇのトウモロコシ粉、
１０ｇのオレンジ粉、
０．５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、
０．２８ｇのイソニアジド、
０．００２ｇのチアミン塩酸塩、
１０ｇのレシチン及び
１００ｇの植物油。
培地を、フラスコあたり２０ｍｌの割合で２５０ｍｌの三角フラスコに分けた。発酵培地を含有するフラスコに、（＋）株と（−）株とを１／１０の比率で混合した１０％混合物を接種した。フラスコを２５℃及び２５０ｒｐｍでインキュベーションし、４８時間目に、β−イオノンを培養培地１リットル当たり１ｍｌの割合で添加した。発酵終了時（６日）、発酵培地及び塩化メチレン／メタノール（１／１）の混合物を調製した。溶媒との混合により、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの菌糸が溶解されて、細胞内のβ−カロテンが放出された。β−カロテンを有機相に抽出し、その後、アセトンで希釈した。β−カロテンの濃度及び純度を、逆相ＨＰＬＣを使用して測定した。

ＣＰＡ１（＋）株と、ＣＭＡ１（−）株、ＣＭＡ２（−）株、ＣＭＡ３（−）株、ＣＭＡ４（−）株、ＣＭＢ１（−）株及びＣＭＢ２（−）株との各混合発酵において得られた収量は６．０ｇ／ｌ〜７．０ｇ／ｌの間で変化した（図１）。

発酵装置におけるＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）株と（−）株との混合培養によるβ−カロテンの生産方法
実施例２、実施例３及び実施例４に記載されるようにして選択されたＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＭＡ１（−）株、ＣＭＡ２（−）株、ＣＭＡ３（−）株、ＣＭＢ１（−）株及びＣＭＢ２（−）株を、β−カロテンの収量を測定するために、ＣＰＡ１（＋）株と一緒にパイロット段階の発酵装置において培養した。このために、種菌用培地を、１リットルあたり下記の組成で調製した：
２３ｇのダイズ粉、
４７ｇのトウモロコシ粉、
０．５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、
０．００２ｇのチアミン塩酸塩。
ｐＨを６．３に調節した。（＋）株及び（−）株を、５００ｍｌの培地を含有する２０００ｍｌフラスコに別々に播種し、２５℃及び２５０ｒｐｍで４４時間〜４８時間インキュベーションした。

それぞれの菌株を、１リットルあたり下記の組成を有する培養培地を含有する栄養増殖用タンクに０．１％で移し、そのｐＨを６．０に調節した：
２９ｇのファルマメディア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）、
４７ｇのトウモロコシ粉、
０．５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、
０．００２ｇのチアミン塩酸塩及び
１ｇの消泡剤。
（＋）株を、０．６６ｖ／ｖ／ｍ（容量／容量／分）で通気しながら２５℃〜２７℃でインキュベーションし、（−）株を、１．５ｖ／ｖ／ｍで通気しながら２７℃〜２９℃でインキュベーションした。インキュベーション条件におけるこれらの違いは、これら２つの菌株の増殖の違いをもたらし、その結果、発酵装置における混合時において、その生理学的状態が、最大の収量を達成するために好適になる。

４６時間インキュベーションした後、（＋）株及び（−）株を１／１０の比率で混合し、１０％混合物を使用して１リットルあたり下記の組成を有する発酵培地に播種し、初期ｐＨを５．９に調節した：
５０ｇのダイズ粉、
２５ｇのトウモロコシ粉、
１５ｇのオレンジ粉、
０．５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、
０．２８ｇのイソニアジド、
０．００２ｇのチアミン塩酸塩、
１０ｇのダイズレシチン、
８０ｇの植物油及び
０．１７５ｇの消泡剤。
発酵液を、１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍの間で変化させて撹拌するとともに１ｖ／ｖ／ｍ〜１．５ｖ／ｖ／ｍで通気しながら、２５℃〜２８℃の温度で１２０時間〜１４０時間インキュベーションした。ｐＨをアンモニア又はリン酸で制御した。発酵の４０時間目〜５０時間目の間において、植物油におけるβ−イオノンの１０％溶液を、１リットルの発酵培地あたり１０ｇ加えた。
同様に、発酵の７０時間目〜８０時間目の間において、植物油におけるエトキシキンの１０％溶液を、１リットルの発酵培地あたり１０ｇ加えた。

発酵終了時、β−カロテンの濃度及び純度を、実施例４に記載されるように評価した。得られた結果を図２に示す。ＣＰＡ１（＋）株とＣＭＡ３（−）株との一連の異なる発酵において得られたβ−カロテンの平均収量は、４８時間インキュベーションされた種菌由来の発酵槽では、７．２ｇ／ｌであり、４６時間インキュベーションされた種菌の発酵槽では、７．７ｇ／ｌであった。ＣＰＡ１（＋）株とＣＭＢ２（−）株との収量は、４８時間インキュベーションされた種菌由来の発酵槽では、６．８ｇ／ｌであり、４６時間インキュベーションされた種菌の発行槽では、７．１ｇ／ｌであった。このことは、種菌のインキュベーション時間が２時間減少したことにより、β−カロテンの収量がおよそ５％〜７％増大したことを意味している。本実施例は、β−カロテンの収量が、（ｉ）インキュベーション時間、並びに（ｉｉ）２つの菌株のそれぞれに対して確立された増殖条件によって、どのように影響されるかを明瞭に明らかにしている。

β−イオノンの添加についての特定のプログラムを使用した発酵槽におけるＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＰＡ１（＋）株とＣＭＡ３（−）株との混合培養によるβ−カロテンの生産方法
実施例２、実施例３及び実施例４に記載されるようにして選択されたＣＰＡ１（＋）株及びＣＭＡ３（−）株を、β−カロテンの収量を測定する目的で、パイロット段階の発酵槽において培養した。発酵条件（種菌、栄養増殖用タンク及び発酵槽）は、異なるβ−イオノン添加プログラムを用いたことを除いて、実施例５に記載される通りであった。

実施例５で確立されたβ−イオノン添加プログラムは、発酵の４０時間目〜５０時間目の間において、植物油におけるβ−イオノンの１０％溶液を、１リットルの発酵培地あたりの１０ｇ供給することからなった。この実施例においては、新しい一連の添加プログラムを分析して、下記の改善された結果を得た。
即ち、発酵の４０時間目〜５０時間目の間に１リットルの発酵培地当たり植物油中のβ−イオノンの１０％溶液を１０ｇ、発酵の６０時間目〜７０時間目の間に１リットル当たりさらに１０ｇ、かつ発酵の１００時間目〜１０５時間目の間に１リットル当たりさらに５ｇ供給するというものである。

発酵終了時、β−カロテンの濃度及び純度を、実施例４に記載されるように評価した。ＣＰＡ１（＋）株とＣＭＡ３（−）株との一連の異なる発酵において得られたβ−カロテンの平均収量は、実施例５に記載されるβ−イオノン添加プログラムを使用したときには７．２ｇ／ｌであるが、本実施例に記載の改善されたプログラムを用いた場合には、８．７ｇ／ｌであった。これらの結果により、β−イオノンの添加プログラムとβ−カロテンの収量との間には密接な関連が存在することが確認される。

酸素を注入した発酵槽でＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）株と（−）株との混合培養を行なうβ−カロテンの生産方法
実施例２及び実施例３に記載されるようにして選択されたＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＰＡ１（＋）株及びＶＫＰＭＦ−７４４（−）株を、β−カロテンの収量を測定する目的で、パイロット段階の発酵槽において培養した。発酵条件（種菌、中間増殖用タンク及び発酵槽）は、酸素を注入して発酵培地の溶存酸素の量を増大させたこと以外は、実施例５に記載される通りであった。

対象発酵（酸素のさらなる添加を伴わない）を、１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍの間で変化させて撹拌するとともに１ｖ／ｖ／ｍ〜１．５ｖ／ｖ／ｍで通気しながら行った。酸素注入を伴う発酵の場合には、発酵槽に導入される空気を、純酸素ビンに接続して酸素富化したことを除いて、同じ条件を用いた。このようにして、空気の酸素含有量を２１％から２４．５％へと増大させた。酸素補充を発酵の４０時間目〜７０時間目の間において行った。酸素補充を伴う条件で、発酵培地の溶存酸素の平均濃度は４９％の値に達し、一方、酸素の添加を伴わない培地中では、溶存酸素の平均濃度は３４％であった。

発酵終了時、β−カロテンの濃度及び純度を、実施例４に記載されるように評価した。ＣＰＡ１（＋）株とＶＫＰＭＦ−７４４（−）株との一連の異なる発酵において得られたβ−カロテンの平均収量は、酸素添加を伴わない場合には６．７ｇ／ｌであるが、酸素を注入したときには７．１ｇ／ｌであった。このことは、発酵期間中に、発酵培地に溶解する酸素の濃度がその最小値にあるときには、さらなる酸素を供給することによってβ−カロテンの収量を増大させることが可能であることを明らかにしている。この技術を、ＣＰＡ１（＋）株及びＣＭＡ３（−）株について実施例６で確立された発酵条件に適用することにより、９ｇ／ｌを超える収量が得られた（図３）。

さらに、発酵装置に入る空気を酸素富化することにより、γ−カロテン及びβ−ゼアカロテンなどの他の望ましくないカロテノイドの収量の減少がもたらされた。前に記載された一連の実験におけるγ−カロテンの平均収量（β−カロテンに対する相対的な百分率として）は、酸素注入がない場合には１．８％であり、酸素注入がある場合には１．２％であった。さらに、β−ゼアカロテンの値は、酸素注入がない場合には１．０％であり、酸素が注入されたときには僅か０．５％であった。培養液への酸素注入量と（ｉ）β−カロテン収量の増大並びに（ｉｉ）γ−カロテン及びβ−ゼアカロテンの減量との間には密接な関連が存在することが、これらの結果に基づいて結論される。

Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＰＡ１（＋）株とＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの一連の（−）株との混合フラスコ培養によるβ−カロテンの生産を示す。縦軸：ｇ／ｌ；横軸：ＦＡＣＳｏｒｔシステムを用いて選択したＦ_１、Ｆ_２などの変異体であり、これらから、フラスコ発酵後、ＣＭＡ１、ＣＭＡ２、ＣＭＡ３及びＣＭＡ４を選んだ（実施例２）。Ｌ２５（−）は、ＶＫＰＭＦ−７４４（−）に対応する。発酵槽における、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＰＡ（＋）株と一連のＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（−）株との混合培養によるβ−カロテンの生産を示す。縦軸：Ｌ２５（−）の収量に対する相対％。Ｌ２５（−）は、ＶＫＰＭＦ−７４４（−）に対応する。酸素の直接的な注入を行わない場合（対象）、又は酸素の直接的な注入を使用した場合の発酵槽におけるＣＰＡ１（＋）株／Ｌ２５（−）株及びＣＰＡ１（＋）株／ＣＭＡ３（−）株の混合発酵によるβ−カロテンの生産を示す。縦軸：ｇ／ｌ。Ｌ２５（−）はＶＫＰＭＦ−７４４（−）に対応する。

Claims

ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株及び（−）株の混合培養物を用いた発酵によるβ−カロテンの生産方法であって、
該菌株の栄養成長段階(vegetative growth stages)の培養期間を、種菌培養(inoculum)及び一次培養(primary cultures)の両方で制御し、
β−イオノンを、発酵の４０時間目から１０５時間目までに自動プログラムに従って、少なくとも３周期の間に添加して、発酵が行なわれることを特徴とする方法。
β−イオノンが、４０時間目〜５０時間目の間、６０時間目〜７０時間目の間及び１００時間目〜１０５時間目の間に添加されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記の最初の２つの周期のそれぞれにおいて、発酵培地１リットルにつき、植物油におけるβ−イオノンの１０％溶液を、少なくとも１０ｇ添加し、かつ３番目の周期において、発酵培地１リットルにつき、該溶液を、少なくとも５ｇ添加することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
酸素を、発酵の開始から終了までに加えることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
酸素を、４０時間目〜７０時間目の間に加えることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
発酵培地中の溶存酸素の平均値が、初期酸素に対して３５％〜６０％の間に維持されることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
前記種菌培養(inoculum)として、播種前のインキュベーション時間が、４２時間〜５０時間である培養が用いられることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
前記一次成長培養(primary vegetatives)として、播種前のインキュベーション時間が、３５時間〜５５時間である培養が用いられることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株の種菌を、８００胞子／ｍｌ〜１０００胞子／ｍｌの範囲で播種し、
（ｂ）ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（−）株の種菌を、１００００胞子／ｍｌ〜６００００胞子／ｍｌの範囲で播種し、
（ｃ）ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株及び（−）株の種菌を、２５℃で４６時間培養し、
（ｄ）ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株の一次培養物に、０．１％（ｖ／ｖ）のその種菌を播種し、
（ｅ）ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（−）株の一次培養物に、０．１％（ｖ／ｖ）のその種菌を播種し、
（ｆ）ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株の一次培養物を、２６℃で４４時間〜４８時間培養し、
（ｇ）ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（−）株の一次培養物を、２８℃で４４時間〜４８時間培養し、
（ｈ）ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株及び（−）株の一次培養物を、１（＋）／１０（−）（ｖ／ｖ）の比率で混合し、
（ｉ）各発酵槽に、（ｈ）に記載したブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株と（−）株との１０％（ｖ／ｖ）混合物を播種し、
（ｊ）混合された培養物が２６℃で５日間〜６日間にわたってインキュベーションされることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。