CN1886519A - 生产包含类胡萝卜素的生物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含类胡萝卜素的生物质的生产方法。本发明的目的是提供包含类胡萝卜素的生物质的生产方法,其可以在大规模上以低水平的复杂性和不需使用抗生素来实现。为此目的,本发明提供将具有提高的β-胡萝卜素的合成和贮存能力的非基因改造的异宗配合真菌培养在浸沉培养物中,由此所述生物质以多阶段,只从孢子中按照(+)和(-)配型分别进行增殖。在所述生产发酵之前的最后的生物质增殖期完成后,将(+)配型的生物质或(+)配型的培养液或(+)配型的匀浆化生物质或,代替(+)配型的配素型的刺激物或内酯或三孢酸或三孢酸衍生物加入(-)配型的生物质,并且在熟化时期持续数小时后,将该浸沉混合物转移到产品发酵的营养液中。所述营养液以这样的方式组成从而使得在时间tw,生物质的生长期被磷限制所终止,另外β-胡萝卜素的合成通过产生短期应激环境而引发,并且通过在生长期中的磷限制使从得到的干生物质中无溶剂提取β-胡萝卜素成为可能。
Description
本发明涉及生产包含类胡萝卜素的生物质的方法。
类胡萝卜素是在植物生物体中形成的作为保护性或有色色素的天然染料和活性剂。
在动物生物体中,它们中的数个被转化成维生素A并作为这些种类的物质在主要的组成代谢和操作代谢(operating metabolism)中具有许多特殊作用。β-胡萝卜素是维生素A的前体并且在动物生物体中被转化成维生素。动物生物体在没有加入前体的情况下不能合成维生素A。β-胡萝卜素是脂溶性物质并且可以仅在与脂质和油有关的情况中被引入体内。在中国,维生素A的特别作用在2000年前就已经被了解,其中在眼疾或夜盲症的情形中,推荐食用新鲜有色水果和绿色蔬菜。
人和动物具有对β-胡萝卜素的高的天然需求,因为这种物质和在体内形成这种物质的多种物质使身体性能稳定并且抵御有害的环境影响。每日最小的需求规定为0.8-1mg维生素A=5mg-6mgβ-胡萝卜素(DGE2000)。按照Heseker等(VERA-Schriftenreihe,Bd.III,2.Auflage,Wiss.Fachverlag Dr.Fleck,Niederkleen,1994),在联邦德意志共和国中的β-胡萝卜素的每日实际食用量为1.5-2.0mg。按照流行病学研究,在低血浆水平的β-胡萝卜素和冠心病以及心肌梗塞的风险之间存在很高的关联性(Kardinal等,Euramic study,Lancet 342,1379-84,1993)。
然而,β-胡萝卜素不仅是在作为活性剂时是有意义的。事实上,在化妆品和药品中要满足美丽和健康生活方式的需要,由此利用了β-胡萝卜素的着色性质。
然而,β-胡萝卜素不仅在人类领域中非常重要。β-胡萝卜素还在动物营养中具有重要的作用。一般的饲料原料,诸如三叶草,紫花苜蓿包含β-胡萝卜素,但是植物中的这些部分由于工业化生产方法导致土壤降解,减少得越来越多。
在自然界,β-胡萝卜素只在植物生物体和一些微生物中合成。相当大含量的β-胡萝卜素被包含在胡萝卜(用于命名),辣椒,樱桃,一些藻类和另外地在棕榈油和绿茶中。在本文上下文中,“相当大”指一般指在干生物质中<0.1%。
工业规模的天然β-胡萝卜素生产者的提取是非常复杂的并且特别要求非常大的面积,并且生物质的下游处理总吨位高。因此,在上个世纪中期,已经开始探索化学合成并开发它们易于应用的可能性。
目前,工业上90%的β-胡萝卜素是通过化学合成产生的。然而,自天然来源提取β-胡萝卜素的方法正在越来越多地受到重视,因为发现尽管β-胡萝卜素在分布上只有<1%的低分布,β-胡萝卜素对人和动物的生理作用显著地被β-胡萝卜素的天然伴生物质所有利地影响,所述伴生物质也属于类胡萝卜素。
由于通过传统的农业生产未满足该领域对天然β-胡萝卜素已经出现并且越来越多的需要,对于工业生物技术β-胡萝卜素的合成的可能性已经研究了约20年,由此考虑关于β-胡萝卜素合成的生产力可以被增加到明显地>1%干生物质,并且特别地,发酵或藻类培养可供用于本文的生物技术方法。
通常,在广泛研究的过程中发现藻类(例如,杜氏盐藻(Dunaliellasalina),小球藻(Chlorella spec),Spirulina spec等),微型真菌,诸如三孢布拉霉(Blakeslea trispora),瓜笄霉(Choanephora cucurbitarum)和布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus),细菌,诸如黄杆菌(Flavobacterium),棒状杆菌(Corynebacterium),分枝杆菌(Mycobacterium)和短杆菌(Brevibacterium),和酵母(红酵母属(Rhodotorula))不仅合成β-胡萝卜素,还甚至能够在限定的发酵和细胞培养条件下产生过量的类胡萝卜素(Lampila等,Mycopatholigia 90,65,80,pp.65-80,1985)。
在类胡萝卜素中,β-胡萝卜素的形成尤其值得注意。在藻类Dunaliella的干生物质中可以积累多到20%的β-胡萝卜素(De Baets,Vandedrinck,Vandamme,Encylopedia of Microbiology,Vol.4,837-853,2000)。然而,其经济的细胞培养仅在盐水中热带条件下可能获得成功。公认地,在培养基中的海藻生物质浓度落后于真菌或细菌培养物中的生物质浓度约10的一次方,并且必须大面积培养从而获得工业上所需的β-胡萝卜素的产率。
因为这个原因,正在越来越多地集中于微生物的开发,其同时获得>20-30g/l的生物质浓度和β-胡萝卜素的高累积。因此,通常使用野生型菌株或确定的选择菌株进行诱变。将从它们中衍生并选择的高性能突变株进行培养并通过设定优化工艺条件用于发酵生物合成。
诱变的已知方法是用不同浓度的亚硝基胍,单独或例如与UV辐射组合进行处理(Cubero等,1993,Kuntschikova,2000)
按照Weide,Paca,Knorre(“Biotechnologie”,Gustav-FischerVerlag,1987),β-胡萝卜素的最高产率(3-4g/l)在三孢布拉霉(Blakeslea trispora)(+)和(-)菌株(高性能的突变株)的半菌株(halfstrain)的混合培养物的发酵过程中获得。(-)菌株的β-胡萝卜素形成由三孢酸所促进(Bu’Lock等,Arch.Microbiol.97,239-244,1974)。发酵在28℃进行并持续6-8天。
三孢布拉霉的不同性别的半菌株的组合细胞培养物起初由Hesseltine和Anderson(US-2 865 814,US-2 890 989)建立并且被一些公司进一步发展。
胡萝卜素的合成由维生素B1,异烟肼和β-芷香酮的添加而得以促进(Vandamme E.J.,Biotechnology of Vitamins,Pigments and GrowthFactors,31-33,Elsevier Science Publishers LTD,1989)。
三孢酸的重要性在于这种酸与遗传信息结合促进在(-)半菌株中的β-胡萝卜素的过量形成的事实(Caglioti L.等,Tetrahedron Suppl.,7,175-187,1966)。减少的β-胡萝卜素的形成由三孢酸通过化学品((Lampila))的定向还原而导致。支持作用通过添加脱落酸(如β-胡萝卜素的萜),β-芷香酮(萜)(特别见物质Feofilova,Arbuzov Mikrobiologija卷44,3,1975),α-芷香酮(萜),和维生素A(萜)(自1994年7月12日的US 005328845)而获得。这些物质的添加加速RNA的翻译并导致形成类胡萝卜素的酶的重新合成。另外被分析的添加剂是青霉素,视黄醇,煤油,芳香族化合物,诸如邻苯二甲酸二甲酯和藜芦醚,和含氮的杂环化合物,诸如异丙烟肼(除异烟肼之外,见上)。
产生氧应激的物质充当β-胡萝卜素合成的加速剂。可以通过加入表面活性物质来加速在水性介质中的氧传递,由此增加氧的利用度(例如,Span20:Seon-Won Kim等,Journal of Fermentation and Bioengineering,Vol.84,No.4,330-332,1997)。如果臭氧被加入或在发酵过程中直接产生,也可以产生氧应激。还描述了过氧化氢的添加导致了β-胡萝卜素形成的显著增加(Jae-Cheol Jeong等,Biotechnology letters 21,683-686,1999)。
通过改变营养液的成分来操纵β-胡萝卜素的合成也通过磷缺乏的方式而获得(Goncharova,O.,Konova,I.,Biruzova,V.,Biochemical andstructural features of Blakeslea trispora dependent on mediumcomposition,Microbiology 65,47,1996),其中改变了Blakesleatrispora BS01(+)和BS01(-)的细胞壁。
碳底物的选择也对β-胡萝卜素的合成施加影响。发现如果复合底物同时包含糖和有机氮化合物(豆,豆粉,豆提取捣碎的谷物)(Lampila),它们是最有利的。另外,添加脂肪和油增加β-胡萝卜素的合成(US 5 422 247A,EP 1 367 131 A1)。
通过添加大豆油,棉籽油或这些油的脂肪酸以及皂脚(作为油精炼的产物,沉淀的脂肪酸)增加的β-胡萝卜素的形成是参考样品的80倍。Pazola等,Acta Microbiologica Polonica Vol.17,1,pp.75-82,1968,报道一些脂质对混合配对的类胡萝卜素的形成的影响。脂质的组成对于贮存脂的形成是重要的,所述贮存脂是细胞中β-胡萝卜素的溶剂。发现脂肪酸的光谱对于内源性脂质库具有重要影响。
在摇瓶规模下进行关于在真菌中的β-胡萝卜素生产者的性别和类胡萝卜素生物合成的基础研究。几乎没有对在大规模工艺中的β-胡萝卜素应用生产的描述,但是已知一些公司发酵生产β-胡萝卜素。对于此,使用三孢布拉霉和布拉克须霉的突变株。
目前的应用方法基于Ninet和Renaut在1979年开发的在3201的规模的小规模发酵的发酵185小时的发酵方法,其中(+)和(-)半菌株彼此严格分开增殖并且在最后一个步骤混合在一起。对于该目的,将两种半菌株都加入发酵步骤的营养液中,在那里一起增殖,并且通过添加刺激物在限定的时间引发β-胡萝卜素的生物合成。该技术主要了解自抗生素和酶的生产。在那里,总是选择多阶段的无菌方法,其中将来自摇瓶的生物质培养在第一发酵罐中并且在第二发酵罐中进一步富集(大小等级1∶10)。通过首先产生生物质在第三个步骤中进行目标产物的实际合成并且通过改变发酵条件来使目标产物(初级代谢产物或次级代谢产物)的生产继续进行。所有的方法通常进行无菌操作。选择间断操作方式来保证无菌状态。在达到所述步骤的目的后,倒空发酵罐并进行灭菌以重复应用。将单一培养物用在上述的每种方法中。倾向于使用形态上均一的微生物,因为认识到维持必要的处理条件对于这种生物而言更容易。如果它们没有达到这些要求,通常需要补充化学和物理作用从而相应地影响微生物。
所有的已知类胡萝卜素方法都不具优势,因为它们仅在有限程度上适合于工业操作。
目前,已知生产β-胡萝卜素的单一技术方法,其中仅在51的发酵罐中分析搅拌强度和出气速率的影响,并通过Mantzouridou等在2001年建模的方式(Biochemical Engineering Journal 3561,1-13)测定重要的作用参数。
本发明的目的是详细说明产生包含类胡萝卜素的生物质的方法,其在大规模下实现,具有低水平的复杂性并且不含抗生素。
按照本发明,所述问题通过按照权利要求1的方法得以解决。该方案的有利实施方案公开在从属权利要求中。
本发明的本质存在于通过接合菌门(Zygomycota),毛霉目(Mucorales)菌株,例如三孢布拉霉(Blakeslea trispora)(高性能突变株)的异宗配合真菌的方式在浸沉培养法(submerged culture)中,工业生产包含类胡萝卜素的生物质,优选地包含β-胡萝卜素的生物质,其中补充三孢酸衍生物和三孢酸于包含培养液的发酵罐中,其中:
-按照本发明使用添加1%的表面活性剂的无离子水在限氮的复合培养基上出水培养10-12天后,从热带三孢布拉霉的(+)和(-)半菌株中获得纯的孢子混悬液,其中10ml的试样(eprouvette)培养物的孢子混悬液的孢子沉积物重悬在1ml的无离子水中并且随后用9ml的甘油填充,并且将这些包含没有膨胀的孢子囊孢子的孢子混悬液装入管中并保存于-80℃到-85℃,
-在(+)半菌株的生物质在前面的过程控制中被加入的时候,将三孢酸和/或三孢酸辅助物质(co-substance)加入多阶段增殖的(-)半菌株而不是(+)半菌株,并且所述混合物随后在引发重新开始的生物质生产之前经历熟化期,
-仅(-)半菌株进行常见的多阶段生物质增殖并且用于合成β-胡萝卜素,而(+)半菌株在实验室规模上培养在持续的,循环或间断的培养物中,其中取决于过程控制,将生物质,培养液,生物质匀浆或配素类型的刺激物或三孢酸在该生物质的指数生长期结束后从该培养物中加入(-)半菌株,生物质匀浆和培养液以1∶100的比率,而配素类型的刺激物和三孢酸作为生物合成刺激添加剂以1∶1000到1500的比率加入。
按照本发明,进一步的是:
-使用支持β-胡萝卜素的生物合成的刺激物是有利的。刺激物可以是维生素和其它根据化学组成具有与β-胡萝卜素相关的结构的物质。
-在生产发酵罐中的营养液以这样的方式组成从而在诱导时期结束的时候,其导致通过限制磷浓度来限制总培养物中的生物质生长并且引发β-胡萝卜素的合成。还可以通过氧休克和/或温度减少约至少4℃,组合以磷限制的时间来启动合成。
-营养液以这样的方式来组成,从而使得在孢子萌发和生物质增殖的过程中细胞壁中的几丁质合成(building-up)都被限制,由此获得从真菌细胞中不用溶剂提取β-胡萝卜素的更好的能力(诸如对于实施例1中所给出的情形而言)。
-以使最佳混合和气体交换条件出现的方式来补充酶或酶混合物以设定营养液的粘度,由此尽技术工艺的可能来进行经济的发酵操作是有利的。
-另外,可以使用保护β-胡萝卜素的生物合成的激活剂。它们可以是具有根据化学组成与β-胡萝卜素相关的结构的物质。
-生物质生产的过程和β-胡萝卜素合成的过程通过磷的限制而彼此分开从而使它们顺序进行,由此成功地将发酵时间明确限制在<90-100小时,获得>25g/kg干生物质的高β-胡萝卜素产率。
以已知方式通过无溶剂提取法来进行从真菌生物质中的β-胡萝卜素提取。
本发明的描述了这样的一种方法,所述方法可以通过使用能够从接合菌门(Zygomycota),毛霉目(Mucorales)菌株形成β-胡萝卜素的异宗配合真菌,以最佳的经济和技术条件进行包含β-类胡萝卜素的真菌生物质的工业化生产。
这里,生物质单独地按照(+)和(-)配型(pair type)以多阶段只从孢子中进行增殖。
在发酵生产之前的最后的生物质增殖期结束后,将(+)配型的生物质或(+)配型的培养液或(+)配型的匀浆化生物质或配素型的刺激物或内酯或三孢酸或三孢酸衍生物加入(-)配型的生物质,其中在接种物发酵罐中在1到数小时的熟化时间后使用该浸沉混合物来起始生产发酵。营养液以这样的方式组成从而使生物质的生长期通过磷限制在时间tw上终止。
在本发明范围内,可以另外通过产生短期应激环境来引发β-胡萝卜素的合成。另外,通过以磷比率(速率)(rate)限制生长以及在生长期中的磷限制来使通过植物油从得到的三孢布拉霉BS01(-)的干生物质中无溶剂提取β-胡萝卜素成为可能。
用在本发明的方法中的(+)配型仅是诱导菌株并且它们的生物质被培养在持续的或循环的培养物中。与此相反,用在本发明的方法中的(-)半菌株仅是类胡萝卜素的生产菌株。
将(+)配型的生物质培养在循环培养物中。与此相反,将(-)配型以多阶段持续进行增殖。在交配过程中,各个(+)配型的生物质与各个(-)配型的生物质的比率是1∶10到1∶200,优选地1∶45到1∶75。(-)半菌株的交配阶段,即非再引发(repriming)阶段通过(+)半菌株的培养液,匀浆或合成产物的方式来进行菌株特异性地测定,并且所述时间是1-180分钟,优选30-90分钟。
营养液由聚合物养分组成,具有磷限制,其中聚合物碳底物(carbonsubstrate)在凝集作用后,在对培养基进行灭菌的过程中进行酶导致的液化作用,其中液化作用大大减少了溶液的粘度,但是阻止了单体碳底物的形成。
营养液以这样的方式组成并且制备从而使生物质生长持续而快速进行并且培养物中的几丁质生物合成减少,并且在由于磷限制导致的生长终止后,仅底物可供用于产物形成,由此使在通过生产真菌的另外的酶促消化后重新开始的二次生物质发展(development)成为不可能。
按照本发明,将具有β-胡萝卜素合成>2.0%干重的潜力的异宗配合真菌用作β-胡萝卜素生产者,具体地是三孢布拉霉及其通过诱变衍生的菌株,其中不同的配型也可以起源自不同的系谱系。
将保藏于德意志微生物保藏中心(Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSMZ)的三孢布拉霉的高性能突变株BS01(+)和BS01(-)用作本发明方法中的基本材料。
对于本发明重要的是生产和支持培养物严格地只从孢子中进行培养。两种半菌株等同地在分开的培养物中处理,反应器大小可达1201。随后,将BS01(+)半菌株在反应器中作为持续的或循环培养继续培养。将BS01(-)半菌株进一步增殖到生物质体积为5m3。到BS01(-)半菌株的生长期结束时,当营养底物浓度在此时在反应器中减少时,将三孢酸衍生物和/或三孢酸以1∶1000-5000的比率加入BS01(-)生物质中。所述三孢酸衍生物和/或三孢酸获自BS01(+)半菌株培养物中。它们可以作为BS01(+)生物质或匀浆(在该情形中,以比率1∶10到1∶100),培养液或单独的刺激物混合物进行添加。在发酵条件下在30-180分钟的关键接触时间后,将用于β-胡萝卜素合成的营养液与该诱导的菌丝体混合物一起接种在生产发酵罐中。该营养液以这样的方式组成从而使被磷比率限制的生物质的增加在24小时后被磷限制所终止,并且β-胡萝卜素的合成开始。这种合成另外被氧应激诱导至少3小时并且一般在78-94小时后,被立即的固体/液体分离和随后的干燥所终止。
与本发明有关,突变原(mutagene)-处理的三孢布拉霉的纯合子配型BS01(+)和BS01(-)的菌株维持和培养是重要的从而保证遗传稳定性。对于BS01(+),通过用500mg/ml浓度的亚硝基胍处理0.02-0.1%的孢子混悬液进行诱变来获得菌株,而对于BS01(-),以孢子存活率为5-7%的UV辐射和相同浓度的亚硝基胍进行诱变来获得菌株。BS01(-)的特征在于细胞壁的几丁质含量减少。两种半菌株将油裂解为甘油和脂肪酸,但是不能利用裂解产物。另外,它们的特征在于它们菌丝(hyphae)的高分枝程度。对于半菌株,孢子囊孢子的无性生殖在限氮培养基上进行从而获得足够高的孢子形成。12天生长后在孢子囊孢子的形态分化后,使用添加了1%表面活性剂的无离子水,将同质的孢子菌苔洗下,再次用无离子水将孢子沉积物洗下并用甘油重悬。将该混悬液装入安瓿中并存于-80℃到-85℃。不依赖于它们的体积大小,由于离子游离的结果导致的水结合被阻止的这些未膨胀孢子的原种保存物是用于发酵一年的基本材料。
描述在本说明书中的所有特征,后附的实施例和权利要求可以单独地和彼此组合在一起都是对于本发明所必需的。
随后,本发明的方法通过两个实施例的方式来详细进行解释,所述实施例关于三孢布拉霉BS01(+)和BS01(-)的培养,但本发明并不局限于该真菌因为毛霉目的其它真菌可以用在本发明的方法中。
1.实施例
在用20mg淀粉酶(BAN 800MG,Novo Nordisk)/2l培养基进行淀粉酶处理后将具有20g/l大豆蛋白胨,30g/l玉米淀粉,0.5g/l KH2PO4,6.5ml/l向日葵油,0.002g/l维生素B1,0.001g/l维生素B2的组成的0.3l培养基装入具有锥形肩状部的21烧瓶中,并于125℃高压灭菌30分钟到45分钟后用具有2.0×106到4.0×106/ml孢子混悬液的孢子浓度的1ml孢子混悬液接种培养基。通过利用11ml无离子水洗去12天龄的试样培养物而获得用0.1ml原种保存物接种的这种孢子混悬液。
于27℃+/-1℃以10cm的振幅于180rpm在2l摇瓶中对两种半菌株等同地进行第一个增殖步骤24小时。30l接种物发酵罐的培养基制品由20g/l大豆粉,20g/l玉米淀粉,0.5g/l KH2PO4,1.5g/l向日葵油,0.002g/l维生素B1组成。在发酵罐中将称重过的10l自来水中的大豆粉和玉米淀粉样品加热到100℃。在冷却至60℃后加入磷酸二氢钾和预先高压灭菌的向日葵油并将体积填充至22l。在将pH调节至pH=6.5-7.0后于121℃进行灭菌45分钟。用0.6l BS01(-)半菌株的振荡培养物进行接种物发酵罐的接种。在开始同时在2l摇瓶中以所述的方式培养BS01(+)半菌株。24小时的培养后通过向发酵罐中加入0.36lBS01(+)培养物进行BS01(-)菌株中生物合成的诱导,持续60-180分钟。在27.5℃于300rpm上持续搅拌和0.5vvm的通风下进行通过添加BS01(+)半菌株诱导生物合成的BS01(-)菌株的培养。
500l生产发酵罐的培养基由25g/l大豆粉,10g/l玉米粉,40g/l玉米淀粉,含有2g/l生育酚的油成分组成。将22.5kg的培养基制品在1501自来水中与2.25g淀粉酶(BAN 800MG,Novo Nordisk)一起搅拌,在将pH调节至pH=6.8-7.0后加热到73℃,并在10分钟后将温度控制到100℃。在冷却到60℃后加入含有生育酚的成分并将体积调节至3001。于121℃进行这种制备的培养基的高压灭菌45分钟。设定起始条件,250rpm,0.4vvm的通风和27.5℃后,通过压力叠加的方式将发酵的诱导培养物转移入生产发酵罐中。只允许起始自100%的pO2通过通风速率(高达1.0vvm)以及不超过300rpm的搅拌器速率的方式减少到10%-20%。在72小时中起始自此值的pO2值提高到40%-60%。通过分别利用20%的碱或20%的酸的两步控制实现了pH值控制在pH=7.2-7.4。以酸化阶段进行利用蛋白质的生长直到第24小时磷限制,随后代之以碱化阶段,显示中度的NH4-N-释放。24小时后通过磷限制以30g生物质/升完成初级生长。同时,作为在接种物发酵罐中已经进行过的BS01(-)半菌株中β-胡萝卜素生物合成的诱导的结果,于早期在生产发酵罐中从发酵的第20小时诱导β-胡萝卜素形成。β-胡萝卜素含量根据培养基组成和制备到第84小时为止高达4%生物干重。深红色的真菌菌丝体是同质的并且易于在中止时期轻轻倒出。
2.实施例
按照实施例1中对第一个增殖步骤给出的方式进行三孢布拉霉的两种突变半菌株的培养。培养基以及用BS01(-)半菌株接种30l接种物发酵罐也与实施例1中的细节相同。在持续的和/或循环的条件下于具有净体积4l培养基的5l生物反应器中进行BS01(+)半菌株的培养。无颗粒的培养基包含5g/l植物明胶,10g/l玉米溶胀水(swelling water)(100%),5g/l葡萄糖和0.5g/l Rhodigel(Rhodia Food)。通过贮存液的方式将Rhodigel加入到培养基中,由此调节粘性以便维持真菌的同质生长。通过Ultraturrax的方式在脱水器中缓慢搅拌5g Rhodigel/升,由此产生这种贮存液。在将pH值调节到pH 7.0后,将培养基于125℃高压灭菌35分钟。利用BS01(+)半菌株的0.3l振荡培养基进行培养基的接种。在5小时间断的培养控制之后改变为D=0.1h-1的持续的培养控制。培养物的生产力总计0.5g/lxh.将0.36BS01(+)培养物加到22l(-)培养物中以在具有8-10g/l生物质浓度的30l接种物反应器中诱导生物合成(交配)。因而,BS01(+)半菌株的持续培养被一个循环所中断。诱导的条件相应于实施例1中的那些条件。类似地,生产的条件是相同的。不依赖于伴随诱导培养的生产发酵的循环过程,BS01(+)半菌株的生物质可供用于活性生物质,均质化生物质和配素-类型和非再引发物质的提取。
Claims (18)
1.产生包含β-类胡萝卜素的生物质的方法,该方法基于借助异宗配合的真菌在浸沉培养物中的微生物合成来进行,所述异宗配合的真菌通过诱变进行改造并且具有提高的合成和贮藏β-胡萝卜素的能力,所述方法的特征在于,
-在多阶段中,所述生物质只从孢子中按照(+)和(-)配型分别进行增殖,
-在用无离子水洗涤后,将(+)和(-)配型的孢子在-80℃到-85℃甘油保护的条件下贮存在密封管中,
-在所述生产发酵之前的最后的生物质增殖期结束后,将(+)配型的生物质或(+)配型的培养液或(+)配型的匀浆化生物质或配素型的刺激物或内酯或三孢酸或三孢酸衍生物加入(-)配型的生物质,
-在1-5小时的时间依赖型交配或诱导时间后,将该浸沉混合物转移到生产发酵的营养液中,其中所述营养液以这样的方式组成,即使得被磷比率所限制的生物质的生长期在时间tw被完全终止,
-另外通过产生温度和氧应激环境3-7小时来引发在产物培养物中的β-胡萝卜素的合成,
-其中依靠只是在被磷比率限制的生长期后,不再将无机磷化合物加入所述培养基中来对所述菌株进行磷限制而使从获得的干生物质中无溶剂提取β-胡萝卜素成为可能。
2.按照权利要求1的方法,其特征在于所述(+)配型仅是诱导菌株并且它们的生物质培养在持续的和循环的培养物中。
3.按照权利要求1的方法,其特征在于所述(-)半菌株仅是类胡萝卜素的生产菌株。
4.按照权利要求1的方法,其特征在于所述(+)配型的生物质培养在循环的培养物中并且只有所述(-)配型在多阶段中持续地进行增殖。
5.按照权利要求1的方法,其特征在于在交配过程中各个(+)配型的生物质与各个(-)配型的生物质的比率是1∶10到1∶200,优选1∶45到1∶75。
6.按照权利要求1的方法,其特征在于如果应用培养液,匀浆或合成产物,所述交配时间或所述熟化时间分别由所用的微生物决定,并且所述时间是1-180分钟,优选30-180分钟。
7.按照权利要求1的方法,其特征在于所述营养液由聚合物底物组成,具有磷限制,并且在所述聚合物碳底物的凝集作用后的准备过程中,经历酶导致的液化作用,其中所述液化作用大大减少了所述溶液的粘度,但是阻止了单体碳底物的形成。
8.按照权利要求1的方法,其特征在于所述营养液以这样的方式组成和制备,即使得所述生物质生长持续而快速进行并且所述培养物中几丁质的生物合成减少,并且在由于磷限制导致生长终止后,仅营养底物可供用于所述产物形成,由此使在通过所述生产真菌的另外的酶促消化后重新开始的二次生物质发展成为不可能。
9.按照权利要求1的方法,其特征在于在所述发酵过程中使用应激因子。
10.按照权利要求9的方法,其特征在于所述应激因子是氧过剩和/或抗氧化剂。
11.按照权利要求1的方法,其特征在于使用刺激物。
12.按照权利要求11的方法,其特征在于所述刺激物是维生素和/或维生素的前体和/或根据化学组成与所述β-胡萝卜素有关的结构。
13.权利要求12的方法,其特征在于根据化学组成与所述β-胡萝卜素有关的结构是β-芷香酮,三孢酸,类胡萝卜素,类胡萝卜素的片段和/或内酯。
14.按照权利要求1的方法,其特征在于将具有β-胡萝卜素合成>2.0%干重的潜力的异宗配合真菌用作β-胡萝卜素生产者。
15.按照权利要求1-14的方法,其特征在于所述异宗配合的真菌是三孢布拉霉(Blakeslea trispora)及其通过诱变衍生的菌株。
16.按照权利要求15的方法,其特征在于所述异宗配合的真菌是三孢布拉霉BS01(+)和BS01(-)。
17.按照权利要求14的方法,其特征在于所述不同配型的异宗配合的真菌起源自一种系谱系。
18.按照权利要求14的方法,其特征在于所述不同配型的异宗配合真菌起源自不同的不同系谱系。
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