WO2005030976A2 - Verfahren zur herstellung carotinoidhaltiger biomasse - Google Patents

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WO2005030976A2
WO2005030976A2 PCT/DE2004/002162 DE2004002162W WO2005030976A2 WO 2005030976 A2 WO2005030976 A2 WO 2005030976A2 DE 2004002162 W DE2004002162 W DE 2004002162W WO 2005030976 A2 WO2005030976 A2 WO 2005030976A2
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carotene
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mating
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Arnulf Christner
Klaus-Dieter Menzel
Michael Cyrulies
Original Assignee
Biosynergy Gmbh
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing carotenoid-containing biomass.
  • Carotenoids are natural coloring and active substances that are formed in the plant organism as protective or colored pigments.
  • ß-carotene is a precursor of vitamin A and is converted into the vitamin in the animal organism.
  • the animal organism is unable to synthesize vitamin A without the added precursors.
  • ß-Carotene is a fat-soluble substance and can therefore only get into the body in combination with fats and oils.
  • the special effects of vitamin A were already known 2000 years ago in China, where e.g. In the case of eye problems or night blindness, the consumption of fresh colored fruit and green vegetables has been recommended.
  • ß-carotene is not only important as an active substance, rather the desire for beauty and ⁇ 4 is expressed in cosmetic and pharmaceutical products corresponded to a healthy lifestyle and therefore also used the color properties of the ß-carotene.
  • ß-carotene is not only important in the human field. Ss-Carotene also plays an important role in animal nutrition. Common feed such as clover and alfalfa contain ß-carotene, but the proportion in the plants decreases due to the degradation of the soil due to the industrial production methods.
  • ß-carotene is synthesized exclusively by plant organisms and by some microorganisms.
  • Substantial ß-carotenes are contained in carrots (namesake), peppers, cherries, various algae, but also in palm oil and green tea.
  • essential generally means ⁇ 0.1% in dry biomass.
  • ß-carotene is produced on an industrial scale by 90% by chemical synthesis.
  • processes in which ß-carotene is obtained from natural sources are becoming increasingly important because it has been established that the human and animal physiological effects of ß-carotene, despite their low proportion of ß-carotene, in part of ⁇ 1%, are essentially due to the natural ones
  • Accompanying substances of ß-carotene, which are also carotenoids, is positively influenced.
  • algae e.g. Dunaliella salina, Chlorella spec, Spirulina spec. Etc.
  • micro-fungi such as Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum and Phycomyces blakesleeanus
  • bacteria such as Flavobacterium, Corynebacterium, Mycobacterium and Brevibacterotor and yeast are not only synthesize ⁇ -carotene, but can even produce an excess of carotenoids under certain fermentation and cultivation conditions (Lampila et al., Mycopatholigia 90, 65, 80, pp. 65-80, 1985).
  • ß-carotene (De Baets, Vandedrinck, Vandamme, Encyclopedia of Mikrobiology, Vol. 4, 837 - 853, 2000) can be accumulated in the dry biomass in the algae Dunaliella.
  • their economic breeding is only possible successfully under tropical conditions in creamy waters.
  • the algae biomass concentration in the medium is approximately ten times lower than that of fungal or bacterial cultures and large areas have to be cultivated in order to obtain industrially interesting ß-carotene yields.
  • the highest yield of ß-carotene (3 - 4 g / 1) is obtained according to Weide, Paca, Knorre ("Biotechnology", Gustav-Fischer Verlag, 1987) in the fermentation of a mixed culture of the half-strains of Blakeslea trispora (+) - and (-) - Strains (high-performance mutants)
  • the ⁇ -carotene formation of the (-) strain is promoted by trisporic acid (Bu'Lock et al., Arch. Microbiol. 97, 239-244, 1974).
  • the fermentation is running 28 ° C and lasts 6 - 8 days.
  • trisporic acid lies in the fact that, together with the genetic information, this acid requires the formation of an excess of ß-carotene in the (-) - semi-strain (Caglioti L., et al, Tetrahedron Suppl., 7, 175 - 187, 1966).
  • a targeted reduction of trisporic acid by chemicals leads to reduced ß-carotene formation (Lampila).
  • abscissic acid such as ß-carotene to a terpene
  • ß-ionone terpene
  • Substances that generate oxygen stress act as accelerators of ß-carotene synthesis.
  • surface-active substances e.g. Span 20: Seon-Won Kim et.al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 84, No. 4 330 -332, 1997) the oxygen transfer into the aqueous medium can be accelerated and thus the Oxygen availability can be increased.
  • Oxygen stress can also be generated if ozone is added or generated directly in the fermentation.
  • the addition of hydrogen peroxide is also described, which causes a substantial increase in ß-carotene formation (Jae-Cheol Jeong et. Al., Biotechnology letters 21, 683-686, 1999).
  • a multi-stage, aseptic process is always selected, in which biomass is grown from the shake flask in a first fermentor, which is further enriched in a second fermenter (size levels 1:10).
  • the actual synthesis of the target product takes place in the third stage, in that biomass is first generated there and the target product (primary metabolite or secondary metabolite) is produced by changing the fermentation conditions.
  • common to all procedures is that they are aseptic. To ensure sterility, choose the discontinuous mode of operation. After reaching the At the end of the stage, the fermentor is emptied and sterilized for repeated use. Individual cultures are used in each method described above.
  • microorganisms used are morphologically homogeneous, since it is easier to achieve the required process conditions with such organisms. If they do not meet these requirements, chemical and physical measures are generally taken to influence the microorganisms accordingly.
  • the object of the present invention is to provide a process for the production of carotenoid-containing biomass which can be carried out on a large industrial scale without antibiotics.
  • the essence of the invention is that carotenoid-containing, in particular ß-carotene-containing biomass in submerged culture by heterothallic fungi from the Zygomycota strain, order Mucorales, for example Blakeslea trispora (high-performance mutants) is produced on an industrial scale with the addition of trisporic acid derivatives and trisporic acid in ferrous solution-containing cultures , by doing: • Pure spore suspensions are obtained from the (+) - and (-) - half-strains of tropical Blakeslea trispora according to the invention after ten to twelve days of emersed growth on a nitrogen-limited complex medium using ion-free water with a 1% surfactant additive, the spore sediments of 10 ml spore suspension of a test tube culture is resuspended with 1 ml ion-free water and then filled up with 9 ml glycerol and these spore suspensions, which contain non-swollen sporangiospores, are
  • Stimulators can be vitamins and other substances that have structures related to ß-carotene from the chemical structure.
  • the nutrient solution in the product fermentor is composed in such a way that, at the end of the induction period, the phosphorus concentration is limited by limitation to limit the biomass growth in the entire culture and the synthesis of ⁇ -carotene is triggered. This can also be initiated in connection with the time of the phosphorus limitation by an oxygen shock and / or a temperature reduction of at least 4 ° C.
  • the nutrient solution is composed in such a way that both the germination of the spores and the increase in biomass restrict the build-up of chitin in the cell walls and thus achieve better solvent-free extractability of the ß-carotene from the fungal cells (as given, for example, in Example 1).
  • the viscosity of the nutrient solution is advantageously adjusted by adding enzymes or enzyme mixtures in such a way that optimal mixing and gas exchange conditions are created, thereby enabling economical operation of the fermentation as a technical process.
  • Activators can also be used to protect the biosynthesis of ⁇ -carotene.
  • These can be substances which have structures related to ß-carotene from the chemical structure. • The processes of biomass production and ß-carotene synthesis are separated from each other by the phosphorus limitation, so that they take place one after the other and thereby significantly limit the fermentation time to ⁇ 90 to 100 hours with a high ß-carotene yield of> 25 g / kg dry biomass is achieved.
  • the ⁇ -carotene is obtained from the fungal biomass by solvent-free extraction with vegetable oil in a manner known per se.
  • the present invention describes a process which, using heterothallic mushrooms from the Zygomycota strain, order Mucorales, which are capable of producing ⁇ -carotene, permits the industrial production of mushroom biomass containing ⁇ -carotene under optimal economic and technical conditions.
  • the biomass is multiplied exclusively from spores according to the (+) - and (-) - pairing type in several stages.
  • Biomass of the (-) - pairing type only becomes biomass of the (+) - pairing type or culture fluid of the (+) - pairing type or homogenized biomass of the (+) - pairing type or gamon-like stimulators or lactones or trisporic acid or only after completion of the last biomass propagation phase before the product fermentation
  • Trisporic acid derivatives are added, the product fermentation being started with this submerged mixture after a one to several hour ripening period in the inoculum fermenter.
  • the nutrient solution is composed in such a way that the growth phase of the biomass is completed by P-limitation at time t w .
  • the synthesis of ⁇ -carotene can additionally be triggered by generating a short-term stress situation.
  • a phosphor-rate-limited growth and a phosphorus limitation during the growth phase enable the solvent-free extraction of the ß-carotene by means of vegetable oil from the resulting dry biomass of Blakeslea trispora BSOl (-).
  • the (+) mating types used in the process according to the invention are only induction strains and their biomass is grown in continuous or cyclic culture.
  • the (-) - half strains used in the process according to the invention are only production strains for carotenoids.
  • the biomass of the (+) - mating types are grown in cyclical culture.
  • the (-) pairing types are constantly being increased in several stages.
  • the ratio of biomass of the respective (+) - pairing type to that of the respective (-) - pairing type when mating is 1:10 to 1: 200, preferably 1:45 to 1:75.
  • the phase of derepression of the (-) half-strain is determined by the use of culture fluid, homogenates or synthesis products of the (+) - half-strain in a strain-specific manner and is 1 to 180 minutes, preferably 30 to 90 minutes.
  • the nutrient solution consists of polymeric nutrients, has a phosphorus limitation, whereby the polymeric carbon substrate is subjected to an enzyme-related liquefaction in the course of the medium sterilization after gelatinization, which greatly reduces the viscosity of the solution, but does not result in the formation of monomeric carbon substrates.
  • the nutrient solution is composed and prepared in such a way that the biomass growth in the culture proceeds evenly and quickly with reduced chitin biosynthesis and after growth is complete, only substrates for product formation are available due to the phosphorus limitation, so that after further enzymatic digestion by the producing fungus, a second secondary biomass formation is not possible.
  • heterothallic fungi with a ß-carotene synthesis potential> 2.0% of the dry weight are used as ß-carotene formers, in particular Blakeslea trispora and strains derived from it by mutagenesis, the different mating types also being able to come from different stem lines.
  • the high-performance mutants BS01 (+) and BSOl (-) from Blakeslea trispora, which are deposited in the collection of microorganisms and cell cultures GmbH (DSZM), are used as the starting material for the process according to the invention.
  • the production and auxiliary cultures are basically only drawn from spores.
  • both half-strains are treated equally in separate cultivation.
  • the BS01 (+) half-stem is continued in the reactor as a continuous or cyclic culture, the BS01 (-) - half-stem is further increased up to a biomass volume of 5 m 3 .
  • trisporic acid derivatives and / or trisporic acid are added to the BS01 (-) biomass in a ratio of 1: 1000 - 1500.
  • the trisporic acid derivatives and / or trisporic acid are obtained from the BS01 (+) semi-stem culture. They can be added as BS01 (+) biomass or homogenate (then in a ratio of 1:10 to 1: 100), culture solution or a separate stimulator mixture. After a decisive contact time of 30-180 minutes under fermentative conditions, the nutrient solution for the ⁇ -carotene synthesis in the product fermentor is inoculated with this induced mycelium mixture.
  • the nutrient solution is composed in such a way that after 24 hours the phosphorus rate-limited biomass increase is ended by the phosphorus limitation and the ß-carotene synthesis begins. This is additionally induced by at least three hours of oxygen stress and is predominantly ended after 78-94 hours by immediate solid-liquid separation and subsequent drying.
  • the lineage and the cultivation of the homozygous mating types BS01 (+) and BSOl (-) of the mutagenically treated Blakeslea trispora are important in order to improve the genetic stability guarantee.
  • the strain was determined by mutagenesis with nitrosoguanidine in a concentration of 500 mg / ml, a spore suspension of 0.02-0.1% for BS01 (+) and in combination with UV radiation with a survivability of the spores of 5-7%. and nitrosoguanidine in the same concentration for BSOl (-).
  • BSOl (-) is characterized by a reduced chitin content in the cell wall, both half-strains split oils into glycerol and fatty acids, but cannot utilize the cleavage products. They are also characterized by a high degree of branching of their hyphae. The asexual reproduction of the sporangiospores takes place separately for the half-strains on a nitrogen-limited medium in order to achieve a sufficiently high sporulation.
  • the first stage of propagation takes place in a 2-1 shake flask at 180 rpm. with an amplitude of 10 cm at 27 ° C +/- 1 ° C for 24 h the same for both half-strains.
  • the medium batch for a 30-1 inoculation fermentor consists of soy flour 20 g / 1, corn starch 20 g / 1, KH 2 P0 4 0.5 g / 1, sunflower oil 1.5 g / 1, vitamin Bl 0.002 g / 1.
  • the soy flour and maize starch in 10 1 tap water is heated in the fermenter to 100 ° C, after cooling to 60 ° C, the potassium dihydrogen phosphate and pre-autoclaved sunflower oil are added and the volume is increased to 22 1.
  • the inoculation of the vaccine fermenter is carried out with 0.6 1 shake culture of the BS01 (-) half-strain. Parallel to the start, the BS01 (+) half-stem is cultivated in 2-1 shake flasks in the manner described. After the 24-hour growth, the biosynthesis is induced in the BS01 (-) strain by adding 0.36 l of BS01 (+) culture in the fermenter for 60 to 180 minutes. The cultivation of the BS01 (-) strain biosynthesis-induced by the added BS01 (+) semi-strain proceeds with a constant stirring of 300 rpm. and a ventilation of 0.5 wm at 27.5 ° C.
  • the medium of the 500-1 product fermenter consists of soy flour 25 g / 1, corn flour 10 g / 1, corn starch 40 g / 1, tocopherol-containing oil fraction 2 g / 1.
  • the medium thus prepared is autoclaved for 45 minutes. at 121 ° C.
  • the fermented induction culture is transferred to the product fermenter by pressure overlay.
  • the ventilation rate up to 1.0 wm
  • the stirrer speed the 300 U / min. does not exceed, the p0 2 drop starting from 100% is only allowed to 10% to 20%. From this value, the p0 2 value increases to 40% to 60% in 72 hours.
  • the growth with the utilization of proteins up to the phosphorus limitation at the 24th hour takes place with an acidification phase, which is then replaced by an alkalization phase with a moderate release of NH 4 -N.
  • the primary growth is completed after 24 hours with 30 g biomass / 1 by a phosphorus limitation.
  • the ß-carotene formation is induced early in the product fermentor from the 20th fermentation hour.
  • the ß-carotene content develops up to 4% of the dry biomass depending on the medium composition and preparation up to the 84th hour.
  • the deep red mushroom mycelium is homogeneous and easy to decant.
  • the two mutant half-strains of Blakeslea trispora are grown in the manner described in Example 1 for the first stage of propagation.
  • the medium and the inoculation of the 30-1 inoculatory fermenter with the BS01 (-) half-strain are also identical to the information given in Example 1.
  • the cultivation of the BS01 (+) semi-strain takes place under continuous and / or cyclic conditions in a 5-1 bioreactor with a net volume of 4 1 culture.
  • the particle-free medium contains vegetable gelatin 5 g / 1, corn steep liquor (100%) 10 g / 1, glucose 5 g / 1 and Rhodigel (Rhodia Food) 0.5 g / 1.
  • Rhodigel feed to the medium for the purpose of adjusting a viscosity in order to maintain homogeneous fungal growth takes place with a stock solution.
  • 5 g Rhodigel / 1 are slowly stirred into a water reservoir with an Ultraturrax.
  • the productivity of the culture is 0.5 g / 1 x h.
  • microorganism referred to under I was received by this international depository on (date of first deposit) and an application for conversion of this deposit into a deposit under the Budapest Treaty was received on (date of receipt of the application for conversion)
  • This international depository accepts the microorganism designated under I, which it received on 2004-09-23 (date of first deposit) 1 .
  • microorganism referred to in 1 has been received by this International Depository on (date of ice deposit) and an application for the conversion of this initial deposit into a deposit under the Budapest Treaty has been received on (date of receipt of the application for conversion).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung carotinoidhaltiger Biomasse. Die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung carotinoidhaltiger Biomasse anzugeben, dass aufwandtgering im großtechnischen Umfang antibiotikafrei realisierbar ist, wird dadurch gelöst, dass nicht gentechnisch veränderte heterothallische Pilze mit erhöhter Synthese und Speicherkapazität von ß-Carotin in submersen Kulturen kultiviert werden, wobei die Biomasse ausschließlich aus Sporen getrennt nach (+)- und (-)-Paarungstyp mehrstufig vermehrt wird, zur Biomasse des (-)-Paarungstypes nach Abschluss der letzten Biomassevermehrungsphase vor der Produktfermentation Biomasse des (+)-Paarungstypes oder Kulturflüssigkeit des (+)-Paarungstypes oder homogenisierte Biomasse des (+)-Paarungstypes oder anstelle des (+)-Paarungstyps gamonartige Stimulatoren oder Laktone oder Trisporsäure oder Trisporsäurederivate zugesetzt werden und jeweils dieses submerse Gemisch nach einer mehrstündigen Reifezeit in die Nährlösung der Produktfermentation überführt wird, wobei die Nährlösung so zusammengesetzt ist, dass zum Zeitpunkt tw die Wachstumsphase der Biomasse durch Phosphor-Limitation abgeschlossen, die Synthese von ß-Carotin zusätzlich durch Erzeugung einer kurzfristigen Stress-Situation ausgelöst wird und durch eine Phosphorlimitierung während der Wachstumsphase die lösemittelfreie Extraktion des ß-Carotins aus der resultierenden Trockenbiomasse ermöglicht wird.

Description

Verfahren zur Herstellung carotinoidhaltiger Biomasse
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung carotinoidhaltiger Biomasse.
Carotinoide sind natürliche Färb- und Wirkstoffe, die im pflanzlichen Organismus als Schutz- oder Farbpigmente gebildet werden.
Im tierischen Organismus werden einige von ihnen in Vitamin A umgewandelt und haben als solche zahlreiche speziellen Wirkungen im zentralen Bau- und Betriebsstoffwechsel. So ist ß-Carotin eine Vorstufe von Vitamin A und wird im tierischen Organismus in das Vitamin umgewandelt. Der tierische Organismus ist nicht in der Lage, Vitamin A ohne die zugeführten Vorstufen zu synthetisieren. ß-Carotin ist eine fettlösliche Substanz und kann deshalb nur in Verbindung mit Fetten und Ölen in den Körper gelangen. Die speziellen Wirkungen von Vitamin A sind bereits vor 2000 Jahren in China bekannt gewesen, wo z.B. .bei Augenbeschwerden oder Nachtblindheit der Verzehr von frischem farbigen Obst und grünen Gemüsen empfohlen wurde.
Mensch und Tier haben einen hohen natürlichen Bedarf von ß-Carotin, da diese Substanz bzw. daraus im Körper gebildete Substanzen die körperliche Leistungsfähigkeit stabilisieren und schädliche Umwelteinwirkungen abwehren. Der tägliche Mindestbedarf wird mit 0,8 mg - 1 mg Vitamin A = 5 mg - 6 mg ß-Carotin angegeben (DGE 2000). Nach Heseker et al. (VERA-Schriftenreihe, Bd.III, 2. Aufl., Wiss. Fachverlag Dr. Fleck, Niederkleen, 1994) liegt die tatsächliche tägliche ß-Carotinaufnahme in der Bundesrepublik Deutschland bei 1,5 mg - 2,0 mg. Nach epidemiologischen Studien besteht eine hohe Korrelation zwischen niedrigen ß-Carotin-Plasmaspiegeln und dem Risiko koronarer Herzkrankheiten und Myocardinfarkt (Kardinaal et al., Euramic study, Lancet 342, 1379 - 84, 1993).
Aber nicht nur als Wirksubstanz ist ß-Carotin bedeutsam, vielmehr wird in kosmetischen und pharmazeutischen Produkten dem Wunsch nach Schönheit und ι4 gesunder Lebensweise entsprochen und deshalb auch die Farbeigenschaften des ß-Carotins genutzt.
ß-Carotin ist jedoch nicht nur direkt im Humanbereich bedeutsam. Auch in der Tierernährung spielt ß-Carotin eine wichtige Rolle. Übliche Futtermittel wie Klee, Luzerne enthalten zwar ß-Carotin, jedoch nimmt der Anteil in den Pflanzen durch Degradation der Böden infolge der industriellen Produktionsmethoden immer mehr ab.
ß-Carotin wird in der Natur ausschließlich von pflanzlichen Organismen und von einigen Mikroorganismen synthetisiert. Wesentliche ß-Carotingehalte sind in Karotten (Namensgeber), Paprika, Kirschen, verschiedenen Algen, aber auch in Palmöl und in grünem Tee enthalten. Wesentlich bedeutet in diesem Zusammenhang im Allgemeinen < 0,1 % in der Trockenbiomasse.
Die Gewinnung von natürlichen ß-Carotinproduzenten in technischem Maßstab ist sehr aufwendig und erfordert vor allem sehr große Anbauflächen und die Aufarbeitung großtonnagiger Biomassemengen. Aus diesem Grunde wurde in der Mitte des vorigen Jahrhunderts begonnen, Möglichkeiten einer chemischen Synthese zu suchen und zur Anwendungsreife zu entwickeln.
ß-Carotin wird heute großtechnisch zu 90 % durch chemische Synthese erzeugt. Zunehmend gewinnen jedoch Verfahren an Bedeutung, in denen aus natürlichen Quellen ß-Carotin gewonnen wird, weil festgestellt wurde, dass die human- und tierphysiologische Wirkung des ß-Carotin trotz deren geringen Anteils am ß-Carotin von teilweise < 1 % wesentlich durch die natürlichen Begleitstoffe des ß-Carotin, die ebenfalls zu den Carotinoiden zählen, positiv beeinflusst wird.
Da der in diesem Bereich entstandene und zunehmende Bedarf an natürlichem ß-Carotin aus der klassischen landwirtschaftlichen Produktion heraus nicht zu decken ist, wird nunmehr seit ca. 20 Jahren an der Möglichkeit der industriellen biotechnologischen Synthese von ß-Carotin gearbeitet, wobei dafür Organismen in Frage kommen, deren Leistungsfähigkeit bezüglich der ß-Carotinsynthese auf deutlich > 1 % der Trockenbiomasse gesteigert werden kann und für die biotechnischen Verfahren hier insbesondere die Fermentation oder die Algenkultivierung zugänglich sind.
Allgemein wurde durch umfangreiche Forschungsarbeiten festgestellt, dass Algen ( z.B. Dunaliella salina, Chlorella spec, Spirulina spec. etc.), Mikropilze wie Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum und Phycomyces blakesleeanus, Bakterien wie Flavobacterium, Corynebacterium, Mycobacterium und Brevibacterium und Hefen {Rhodotorula) nicht nur ß-Carotin synthetisieren, sondern sogar einen Überschuss an Carotinoiden unter bestimmten Fermentations- und Anzuchtbedingungen erzeugen können (Lampila et al., Mycopatholigia 90, 65, 80, pp. 65 - 80, 1985).
Von den Carotinoiden wurde besonders der Bildung von ß-Carotin Aufmerksamkeit geschenkt. In der Alge Dunaliella kann bis zu 20 % ß-Carotin (De Baets, Vandedrinck, Vandamme, Encyclopedia of Mikrobiology, Vol. 4, 837 - 853, 2000) in der Trockenbiomasse angereichert werden. Ihre wirtschaftliche Zucht ist jedoch nur unter tropischen Verhältnissen in sahnen Gewässern mit Erfolg möglich. Allerdings bleibt die Algen-Biomassekonzentration im Medium ca. um eine Zehnerpotenz hinter der von Pilz- oder Bakterienkulturen zurück und es müssen große Flächen bewirtschaftet werden, um industriell interessierende ß-Carotin- Ausbeuten zu erlangen.
Aus diesem Grunde konzentriert sich die Entwicklung zunehmend auf Mikroorganismen, die gleichzeitig Biomassekonzentrationen > 20 - 30 g/1 und eine hohe Anreicherung von ß-Carotin erreichen. Dafür werden im Allgemeinen Wildstämme oder ausgewählte Selektanten verwendet, die einer Mutagenese unterzogen wurden. Die daraus abgeleiteten und selektierten Hochleistungsmutanten werden kultiviert und bei Einstellung optimaler Prozessbedingungen für die fermentative Biosynthese eingesetzt. Bekannte Verfahren der Mutagenese sind die Behandlung mit Nitrosoguanidinen unterschiedlicher Konzentration allein oder z.B. in Kombination mit UV- Bestrahlung (Cubero et al., 1993, Kuntschikova, 2000).
Die höchste Ausbeute an ß-Carotin (3 - 4 g/1) erhält man nach Weide, Paca, Knorre („Biotechnologie", Gustav-Fischer Verlag, 1987) bei der Fermentation einer Mischkultur der Halbstämme von Blakeslea trispora (+)- und (-)-Stämmen (Hochleistungsmutanten). Die ß-Carotin-Bildung des (-)-Stammes wird durch Trisporsäure gefördert (Bu'Lock et al., Arch. Microbiol. 97, 239 - 244, 1974). Die Fermentation läuft bei 28 °C ab und dauert 6 - 8 Tage.
Die gemeinsame Züchtung der unterschiedlich sexuellen Halbstämme von Blakeslea trispora wurde ursprünglich von Hesseltine und Anderson entwickelt (US-2 865 814, US-2 890 989) und von verschiedenen Unternehmen weiterentwickelt.
Zusätze von Thiamin, Isoniazid und ß-Ionon fordern die Carotinsynthese (Vandamme E. J., Biotechnology of Vitamins, Pigments and Growth Factors, 31 - 33, Elsevier Science Publishers LTD, 1989).
Die Bedeutung der Trisporsäure liegt darin begründet, dass diese Säure gemeinsam mit den genetischen Informationen die Bildung eines Überschusses an ß-Carotin in dem (-)- Halbstamm fordert (Caglioti L., et al, Tetrahedron Suppl., 7, 175 - 187, 1966). Eine gezielte Verminderung der Trisporsäure durch Chemikalien führt zu einer verminderten ß-Carotin-Bildung (Lampila). Eine fördernde Wirkung wird durch Zusatz von Abscissinsäure (wie ß-Carotin ein Terpen), ß-Ionon (Terpen) (siehe u.a. Feofilova, Arbuzov Mikrobiologija Vol. 44, 3, 1975, alpha-Ionon (Terpen) und Vitamin A (Terpen) erzielt (US 005328845 vom 12. Juli 1994). Der Zusatz dieser Substanzen beschleunigt die RNA- Translation und fuhrt zu einer verstärkten Synthese der Enzyme de novo, die Carotinoide bilden. Weitere untersuchte Zusatzstoffe sind Penicillin, Retinol, Kerosin, Aromaten wie Dimethylphthalat und Veratrol, und stickstoffhaltige heterozyklische Verbindungen wie Iproniazid (neben Isoniazid s.o.).
Als Beschleuniger der ß-Carotin-Synthese wirken Substanzen, die einen Sauerstoff-Stress erzeugen. So kann durch Zusatz von oberflächenaktiven Substanzen (z.B. Span 20: Seon-Won Kim et.al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 84, No. 4 330 -332, 1997) die Sauerstoffübertragung in das wässrige Medium beschleunigt und damit die Sauerstoffverfügbarkeit erhöht werden. Sauerstoff-Stress kann ebenfalls erzeugt werden, wenn Ozon zugesetzt oder unmittelbar in der Fermentation erzeugt wird. Ebenso ist der Zusatz von Wasserstoffperoxid beschrieben, der eine wesentliche Erhöhung der ß-Carotinbildung bewirkt (Jae-Cheol Jeong et. al., Biotechnology letters 21, 683- 686, 1999).
Die Beeinflussung der ß-Carotinsynthese durch Variation der Inhaltsstoffe der Nährlösung wird auch durch einen Mangel an Phosphat (Goncharova, O., Konova, L, Biruzova, V., Biochemical and structural features of Blakeslea trispora dependent on medium composition, Microbiology 65, 47, 1996) erreicht, wodurch es zu einer Veränderung der Zellwand bei Blakeslea trispora BS01(+) und BSOl(-) kommt.
Die Auswahl der Kohlenstoffsubstrate hat ebenfalls Einfluss auf die ß-Carotin- Synthese. So wurde gefunden, dass komplexe Substrate am günstigsten sind, wenn sie Kohlenhydrate und organische Stickstoffverbindungen gleichzeitig enthalten (Soja, Sojamehl, Sojaextraktionsschrot) (Lampila). Auch der Zusatz von Fetten und Ölen verbessert die ß-Carotin-Synthese (US 5 422 247 A, EP 1 367 131 AI).
So wurde durch Zusatz von Sojaöl, Baumwollöl oder Fettsäuren aus diesen Ölen sowie Soapstock (ausgefällte Fettsäuren als Produkt der Ölraffination) eine erhöhte ß-Carotin-Bildung bis zum 80-fachen der Vergleichsprobe erreicht (Lampila). Über den Einfluss verschiedener Lipide auf die Bildung von Carotinoiden des gemischten Paares berichten Pazola et.al., Acta Microbiologica Polonica Vol. 17,1, pp 75 -82, 1968. Die Zusammensetzung der Lipide ist wichtig für die Bildung des Speicherlipids, des Lösungsmittels für ß-Carotin in der Zelle. Es wurde dabei festgestellt, dass das Fettsäurespektrum entscheidenden Einfluss auf den endogenen Lipidpool besitzt.
Die grundlegenden Untersuchungen zur Sexualität der pilzlichen ß-Carotinproduzenten und zur Carotinoidbiosynthese wurden im Schüttelkolbenmaßstab durchgeführt. Eine anwendungsbezogene Erzeugung von ß-Carotin mit einem großtechnischen Verfahren ist kaum beschrieben, allerdings ist bekannt, dass verschiedene Unternehmen ß-Carotin fermentativ produzieren. Dafür werden Mutanten von Blakeslea trispora und Phycomyces blakesleeanus eingesetzt.
Die heute verwandten Verfahren gehen auf den von Ninet und Renaut 1979 entwickelten Fermentationsansatz für eine kleintechnische Fermentation im 320 1 - Maßstab bei einer Fermentationsdauer von 185 Stunden zurück, wobei grundsätzlich der (+)- und der (-)-Halbstamm getrennt voneinander vermehrt und erst in der letzten Stufe zusammengeführt werden. Dazu werden beide Halbstämme in die Nährlösung der Fermentationsstufe dosiert, dort gemeinsam vermehrt und durch Zufügung eines Stimulators zu einem festgelegten Zeitpunkt die Biosynthese des ß-Carotin ausgelöst. Grundsätzlich ist diese Technologie durch die Erzeugung von Antibiotika und Enzymen bekannt. Dort wird immer ein mehrstufiges, aseptisches Verfahren gewählt, in dem aus dem Schüttelkolben in einem ersten Fermentor Biomasse gezüchtet wird, die in einem zweiten Fermentor weiter angereichert wird (Größenstufen 1:10). Die eigentliche Synthese des Zielproduktes erfolgt in der dritten Stufe, indem dort erst Biomasse erzeugt wird und durch Änderung der Fermentationsbedingungen die Erzeugung des Zielproduktes (Primärmetabolit oder Sekundärmetabolit) stattfindet. Allen Verfahren ist gemeinsam, dass sie aseptisch ablaufen. Zur Gewährleistung der Sterilität wählt man die diskontinuierliche Betriebsweise. Nach Erreichen des Ziels der Stufe wird der Fermentor entleert und für den wiederholten Einsatz sterilisiert. In jedem oben beschriebenen Verfahren werden Einzelkulturen eingesetzt. Es wird darauf orientiert, dass die eingesetzten Mikroorganismen moφhologisch homogen sind, da mit solchen Organismen die Einhaltung der erforderlichen Prozessbedingungen leichter realisierbar ist. Entsprechen sie diesen Forderungen nicht, werden im Allgemeinen chemische und physikalische Maßnahmen durchgeführt, um die Mikroorganismen entsprechend zu beeinflussen.
Der Nachteil aller bekannten Carotinoid-Verfahren ist, dass diese nur bedingt großtechnisch durchführbar sind.
Derzeit ist nur ein technisches Verfahren zur ß-Carotinherstellung bekannt, wobei lediglich in einem 5-1-Fermentor von Mantzouridou et al., im Jahre 2001 (Biochemical Engineering Journal 3561, 1-13) der Einfluss der Rührintensität und der Begasungsrate untersucht und durch Modellierung die entscheidenden Einflussparameter bestimmt wurde.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung carotinoidhaltiger Biomasse anzugeben, dass aufwandtgering im großtechnischen Umfang antibiotikafrei realisierbar ist.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieser Lösung sind in den nachgeordneten Ansprüchen offenbart.
Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass carotinoidhaltige, insbesondere ß-Carotin enthaltende Biomasse in submerser Kultur durch heterothallische Pilze aus dem Stamm Zygomycota, Ordnung Mucorales, bspw. Blakeslea trispora (Hochleistungsmutanten) großtechnisch unter dem Zusatz von Trisporsäurederivaten und Trisporsäure in kulturlösungshaltigen Fermentern erzeugt wird, indem: • aus den (+)- und (-)-Halbstämmen des tropischen Blakeslea trispora erfindungsgemäß nach dem zehn- bis zwölftägigen emersen Wachstum auf einem stickstofflimitierten Komplexmedium unter Verwendung eines ionenfreien Wassers mit einem l%igen Tensidzusatz reine Sporensuspensionen gewonnen werden, wobei die Sporensedimente von 10 ml Sporensuspension einer Eprouvettenkultur mit 1 ml ionenfreiem Wasser resuspendiert und dann mit 9 ml Glycerol aufgefüllt werden und diese Sporensuspensionen, die nicht gequollene Sporangiosporen enthalten, in Röhrchen abgefüllt und bei - 80°C bis - 85°C deponiert werden, dem mehrstufig vermehrten (-)-Halbstamm anstelle des (+)-Halbstammes Trisporsäure und/oder eine Trisporsäure-Cosubstanz zu dem Zeitpunkt zugesetzt wird, zu dem in der bisherigen Verfahrensführung die Biomasse des (+)-Halbstammes zugesetzt wurde und das Gemisch im Anschluss daran einer Reifezeit unterworfen wird, bevor eine erneute Biomasseproduktion ausgelöst wird.
• nur der (-)-Halbstamm einer üblichen mehrstufigen Biomassevermehrung unterworfen und zur ß-Carotinsynthese genutzt wird und der (+)-Halbstamm in kontinuierlicher, zyklischer oder diskontinuierlicher Kultur im Labormaßstab gezogen wird, wobei je nach Verfalirensführung aus dieser Kultur Biomasse, Kulturflüssigkeit, Biomassehomogenisat oder die gamonartigen Stimulatoren oder Trisporsäure dem (-)-Halbstamm nach dem Abschluß der exponentiellen Wachstumsphase für die Biomasse, Biomassehomogenisat und Kulturflüssigkeit im Verhältnis 1 : 100 und für die gamonartigen Stimulatoren bzw. für die Trisporsäure im Verhältnis 1 : 1000 bis 1500 als biosynthesestimulierende Zuschlagstoffe zugefügt werden. Weiterhin erfindungsgemäß ist:
• Vorteilhaft ist es Stimulatoren einzusetzen, die die Biosynthese von ß-Carotin unterstützen. Stimulatoren können Vitamine und andere Stoffe sein, die vom chemischen Aufbau dem ß-Carotin verwandte Strukturen aufweisen.
• Es wird die Nährlösung im Produktfermentor so zusammengesetzt, dass sie zum Zeitpunkt des Abschlusses der Induktionszeit die Phosphorkonzentration durch Limitation zur Begrenzung des Biomassewachstums in der gesamten Kultur führt und die Synthese von ß-Carotin ausgelöst wird. Diese kann auch in Verbindung mit dem Zeitpunkt der Phosphorlimitation durch einen Sauerstoffschock und/oder eine Temperaturerniedrigung um wenigstens 4 °C eingeleitet werden.
• Es wird die Nährlösung so zusammengesetzt, dass sowohl beim Auskeimen der Sporen als auch bei der Biomassevermehrung der Chitinaufbau in den Zellwänden eingeschränkt wird und dadurch eine bessere lösemittelfreie Extrahierbarkeit des ß-Carotin aus den Pilzzellen erreicht wird (wie beispielsweise im Ausfuhrungsbeispiel 1 angegeben).
• Vorteilhafter Weise wird die Viskosität der Nährlösung durch einen Zusatz von Enzymen oder Enzymgemischen so eingestellt, dass optimale Durchmischungs- und Gasaustauschbedingungen entstehen und dadurch ein wirtschaftlicher Betrieb der Fermentation als technischer Prozess ermöglicht wird.
Es können zusätzlich Aktivatoren eingesetzt werden, die die Biosynthese von ß-Carotin schützen. Diese können Substanzen sein, die vom chemischen Aufbau dem ß-Carotin verwandte Strukturen aufweisen. • Es werden die Prozesse Biomasseproduktion und ß-Carotinsynthese durch die Phosphorlimitation voneinander getrennt, so dass sie nacheinander ablaufen und dadurch eine deutliche Begrenzung der Fermentationsdauer auf < 90 bis 100 Stunden bei hoher ß-Carotin- Ausbeute von > 25 g / kg Trockenbiomasse erreicht wird.
Die Gewinnung des ß-Carotins aus der Pilzbiomasse erfolgt durch lösemittelfreie Extraktion mit Pflanzenöl auf an sich bekannter Weise.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, das unter Nutzung von zur ß-Carotin-Bildung befähigten heterothallischen Pilze aus dem Stamm Zygomycota, Ordnung Mucorales die industrielle Produktion von ß- carotinhaltiger Pilzbiomasse unter optimalen wirtschaftlichen und technischen Bedingungen gestattet.
Dabei wird die Biomasse ausschließlich aus Sporen getrennt nach (+)- und (-)- Paarungstyp mehrstufig vermehrt.
Zur Biomasse des (-)-Paarungstyp werden erst nach Abschluss der letzten Biomassevermehrungsphase vor der Produktfermentation Biomasse des (+)- Paarungstypes oder Kulturflüssigkeit des (+)-Paarungstypes oder homogenisierte Biomasse des (+)-Paarungstypes oder gamonartige Stimulatoren oder Laktone oder Trisporsäure oder Trisporsäurederivate zugesetzt, wobei mit diesem submersen Gemisch nach einer ein- bis mehrstündigen Reifezeit im Impffermenter die Produktfermentation gestartet wird. Die Nährlösung ist so zusammengesetzt, dass zum Zeitpunkt tw die Wachstumsphase der Biomasse durch P-Limitation abgeschlossen ist.
Die Synthese von ß-Carotin kann im Rahmen der Erfindung zusätzlich durch Erzeugung einer kurzfristigen Stress-Situation ausgelöst werden. Zusätzlich wird durch ein phosphorratenlimitiertes Wachstum und eine Phosphorlimitierung während der Wachstumsphase die lösemittelfreie Extraktion des ß-Carotins vermittels pflanzlichem Öl aus der resultierenden Trockenbiomasse von Blakeslea trispora BSOl(-) ermöglicht. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten (+)-Paarungstypen sind nur Induktionsstämme und ihre Biomasse wird in kontinuierlicher oder zyklischer Kultur angezogen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten (-)-Halbstämme hingegen sind nur Produktionsstämme für Carotinoide.
Die Biomassen der (+)-Paarungstypen werden in zyklischer Kultur angezogen. Die (-)-Paarungstypen hingegen werden stetig neu mehrstufig vermehrt. Das Verhältnis von Biomasse des jeweiligen (+)-Paarungstypes zu der des jeweiligen (-)-Paarungstypes beim Mating beträgt 1 : 10 bis 1 : 200 vorzugsweise 1 : 45 bis 1 : 75. Die Matingphase d.h. die Dereprimierungsphase des (-)-Halbstammes wird durch den Einsatz von Kulturflüssigkeit, Homogenisaten oder Syntheseprodukten des (+)-Halbstammes stammspezifisch bestimmt und beträgt 1 - 180 Minuten, vorzugsweise 30 - 90 Minuten.
Die Nährlösung besteht aus polymeren Nährstoffen, weist eine Phosphorlimitierung auf, wobei das polymere Kohlenstoffsubstrat im Verlauf der Mediumssterilisation nach einer Verkleisterung einer enzymbedingten Verflüssigung unterzogen wird, die die Viskosität der Lösung stark herabsetzt, aber keine monomere Kohlenstoffsubstrate entstehen lässt.
Die Nährlösung ist so zusammengesetzt und präpariert, dass das Biomassewachstum in der Kultur gleichmäßig und schnell mit reduzierter Chitinbiosynthese verläuft und nach Wachstumsabschluss infolge der Phosphorlimitierung nur Substrate für die Produktbildung zur Verfügung stehen, so dass nach weiterem enzymatischen Aufschluss durch den produzierenden Pilz eine erneute sekundäre Biomassebildung nicht möglicht wird.
Erfindungsgemäß ist, dass als ß-Carotinbildner heterothallische Pilze mit einem ß-Carotin-Synthesepotential > 2,0 % des Trockengewichtes eingesetzt werden, insbesondere Blakeslea trispora und davon durch Mutagenese abgeleitete Stämme, wobei die unterschiedlichen Paarungstypen auch aus unterschiedlichen Stammlinien stammen können. Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren werden die Hochleistungsmutanten BS01(+) und BSOl(-) von Blakeslea trispora verwendet, die in der Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSZM) hinterlegt sind.
Erfindungswesentlich ist, dass die Produktions- und Hilfskulturen grundsätzlich nur aus Sporen gezogen werden. Bis zu einer Reaktorgröße von 120 1 werden beide Halbstämme in getrennter Anzucht gleich behandelt. Danach wird der BS01(+)-Halbstamm in dem Reaktor als kontinuierliche oder zyklische Kultur weitergeführt, der BS01(-)-Halbstamm wird weiter vermehrt bis zu einem Biomassevolumen von 5 m3. Zum Ende der Wachstumsphase des BS01(-)- Halbstammes, wenn zu diesem Zeitpunkt die Nährsubstratkonzentrationen im Reaktor abgesenkt sind, werden Trisporsäurederivate und/oder Trisporsäure im Verhältnis 1 : 1000 - 1500 zur BS01(-)-Biomasse hinzugefügt. Die Trisporsäurederivate und/oder Trisporsäure werden aus der BS01(+)- Halbstammkultur gewonnen. Sie können als BS01(+)-Biomasse oder Homogenisat (dann im Verhältnis 1 : 10 bis 1 : 100), Kulturlösung oder separiertes Stimulatorgemisch zugefügt werden. Nach einer entscheidenden Kontaktzeit von 30 - 180 Minuten unter fermentativen Bedingungen wird mit diesem induzierten Myzelgemisch die Nährlösung für die ß-Carotinsynthese im Produktfermentor inokuliert. Die Nährlösung ist so zusammengesetzt, dass nach 24 Stunden der phosphorratenlimitierte Biomassezuwachs durch die Phosphorlimitation abgeschlossen wird und die ß-Carotinsynthese beginnt. Diese wird durch mindestens dreistündigen Sauerstoffstress zusätzlich induziert und wird vorwiegend nach 78 - 94 Stunden durch sofortige Fest-Flüssigtrennung und anschließende Trocknung beendet.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist die Stamn altung und die Kultivierung der homozygoten Paarungstypen BS01(+) und BSOl(-) des mutagen behandelten Blakeslea trispora von Wichtigkeit, um die genetische Stabilität zu gewährleisten. Der Stamm wurde durch Mutagenese mit Nitrosoguanidin in einer Konzentration von 500 mg / ml einer Sporensuspension von 0,02 - 0,1 % für BS01(+) und in der Kombination mit einer UV-Bestrahlung bei einer Uberlebensfähigkeit der Sporen von 5 - 7 % und Nitrosoguanidin in der gleichen Konzentration für BSOl(-) gewonnen. BSOl(-) zeichnet sich durch einen reduzierten Chitingehalt der Zellwand aus, beide Halbstämme spalten Öle in Glycerol und Fettsäuren, können aber die Spaltprodukte nicht verwerten. Außerdem sind sie durch einen hohen Verzweigungsgrad ihrer Hyphen gekennzeichnet. Die asexuelle Reproduktion der Sporangiosporen erfolgt separat für die Halbstämme auf einem stickstofflimitierten Medium, um eine ausreichend hohe Sporulation zu erzielen. Der homogene Sporenrasen beider Halbstämme wird nach morphologischer Ausdifferenzierung der Sporangiosporen nach zwölftägigem Wachstum mit ionenfreiem Wasser unter Verwendung eines l%igen Tensidzusatzes abgeschwemmt, das Sporensediment nochmals mit ionenfreiem Wasser gewaschen und mit Glycerol resuspendiert. Diese Suspension wird in Ampullen abgefüllt und bei -80°C bis -85°C deponiert. Solche master- Konserven mit nicht gequollenen Sporen infolge verhinderter Wassereinlagerung durch Ionenfreiheit sind ein Jahr Ausgangsmaterial für die Fermentationen unabhängig von ihrer Volumengröße.
Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ausführungsbeispielen und Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.
Nachfolgend soll das erfindungsgemäße Verfahren anhand der zwei Ausführungsbeispiele zur Kultivierung von Blakeslea trispora BS01(+) und BSOl(-) näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diesen Pilz zu beschränken, da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch andere Pilze der Ordnung Mucorales zum Einsatz kommen können. 1. Ausfuhrungsbeispiel
0,3 1 Medium mit der Zusammensetzung Sojapepton 20 g/1, Maisstärke 30 g/1, KH2P04 0,5 g/1, Sonnenblumenöl 6,5 ml/1, Vitamin Bl 0,002 g/1, Vitamin B2 0,001 g/1 nach einer Amylasebehandlung mit 20 mg Amylase (BAN 800 MG, Novo Nordisk) pro 2 1 Medium werden in 2-1-Steilbrustkolben gefüllt und nach der Autoklavierung von 30 min. bis 45 min. bei 125 °C mit 1 ml Sporensuspension mit einer Sporenkonzentration von 2,0 x 106 bis 4,0 x 106 / ml Sporensuspension inokuliert. Diese Sporensuspension wurde durch Abschwemmung einer 12 Tage alten Eprouvettenkultur, die mit 0,1 ml master- Konserve beimpft wurde, mit 11 ml ionenfreien Wasser gewonnen.
Die erste Vermehrungsstufe erfolgt im 2-1-Schüttelkolben mit 180 U/min. mit einer Amplitude von 10 cm bei 27 °C +/- 1 °C 24 h für beide Halbstämme gleich. Der Mediumsansatz für einen 30-1-Impffermentor besteht aus Sojamehl 20 g/1, Maisstärke 20 g/1, KH2P04 0,5 g/1, Sonnenblumenöl 1,5 g/1, Vitamin Bl 0,002 g/1. Die Sojamehl- und Maisstärkeeinwaage in 10 1 Leitungswasser wird im Fermentor auf 100 °C erhitzt, nach Abkühlung auf 60 °C das Kaliumdihydrogenphosphat und vorautoklaviertes Sonnenblumenöl zugesetzt und das Volumen auf 22 1 ergänzt. Nach der pH-Einstellung auf pH = 6,5 bis 7,0 erfolgt die Sterilisation bei 121 °C für 45 min. Die Inokulation des Impf ermenters erfolgt mit 0,6 1 Schüttelkultur des BS01(-)-Halbstammes. Parallel zum Start wird der BS01(+)-Halbstamm in 2-1-Schüttelkolben in der beschriebenen Weise kultiviert. Nach dem 24-Stunden- Wachstum erfolgt die Biosyntheseinduktion im BS01(-)-Stamm durch Zufügen von 0,36 1 BS01 (+)-Kultur im Fermenter für 60 bis 180 Minuten. Die Kultivierung des durch den zugefügten BS01(+)-Halbstamm biosyntheseinduzierten BS01(-)-Stammes verläuft mit einer konstanten Rührung von 300 U/min. und einer Belüftung von 0,5 wm bei 27,5 °C. Das Medium des 500-1-Produktfermentors setzt sich aus Sojamehl 25 g/1, Maismehl 10 g/1, Maisstärke 40 g/1, tocopherolhaltige Ölfraktion 2 g/1 zusammen. Der Mediumsansatz von 22,5 kg wird mit 2,25 g Amylase (BAN 800 MG, Novo Nordisk) in 150 1 Leitungswasser eingerührt, nach der pH-Einstellung auf pH = 6,8 - 7,0 wird dieser auf 73 °C hochgeheizt und nach 10 Minuten wird die Temperatur auf 100 °C geführt. Nach dem Abkühlen auf 60 °C wird die tocopherolhaltige Fraktion zugeführt und das Volumen auf 300 1 eingestellt. Die Autoklavierung des so präparierten Mediums erfolgt 45 min. bei 121 °C. Nach dem Einstellen der Startbedingungen, 250 U/min., Belüftung 0,4 wm und 27,5 °C wird die fermentierte Induktionskultur durch Drucküberlagerung in den Produktfermenter überführt. Mit der Belüftungsrate (bis 1,0 wm) und der Rührergeschwindigkeit, die 300 U/min. nicht übersteigt, wird der p02- Abfall beginnend von 100 % nur auf 10 % bis 20 % zugelassen. Von diesem Wert erfolgt in 72 Stunden ein Anstieg des p02- Wertes auf 40 % bis 60 %. Die pH- Wertführung wird durch Zweipunktregelung bei pH = 7,2 bis 7,4 mit einer 20%igen Lauge bzw. 20%igen Säure realisiert. Das Wachstum mit der Verwertung von Proteinen bis zur Phosphorlimitation zur 24. Stunde erfolgt mit einer Säuerungsphase, die anschließend durch eine Alkalisierungsphase mit einer moderaten NH4-N-Freisetzung abgelöst wird. Das Primärwachstum ist nach 24 Stunden mit 30 g Biomasse/1 durch eine Phosphorlimitation abgeschlossen. Gleichzeitig ist, bedingt durch die im Impffermentor schon erfolgte Induktion der ß-Carotinbiosynthese im BS01(-)-Halbstamm, die ß-Carotinbildung frühzeitig ab 20. Fermentationsstunde im Produktfermentor induziert. Der ß-Carotingehalt entwickelt sich in Abhängigkeit von der Mediumskomposition und -präparation bis zur 84. Stunde bis zu 4 % der Biotrockenmasse. Zum Abbruchzeitpunkt ist das tiefrote Pilzmyzel homogen und gut dekantierbar. 2. Ausführungsbeisniel
Die Anzucht der beiden mutierten Halbstämme von Blakeslea trispora erfolgt nach der im Beispiel 1 für die erste Vermehrungsstufe angeführten Weise. Das Medium und die Inokulation des 30-1-Impffermenters mit dem BS01(-)- Halbstamm sind ebenfalls identisch mit den im Beispiel 1 erfolgten Angaben. Die Kultivierung des BS01(+)-Halbstammes erfolgt unter kontinuierlichen und/oder zyklischen Bedingungen in einem 5-1-Bioreaktor mit einem Nettovolumen von 4 1 Kultur. Das partikelfreie Medium enthält pflanzliche Gelatine 5 g/1, Maisquellwasser (100%ig) 10 g/1, Glukose 5 g/1 und Rhodigel (Rhodia Food) 0,5 g/1. Die Rhodigelzuführung zum Medium zwecks Einstellung einer Viskosität zur Aufrechterhaltung eines homogenen Pilzwachstums erfolgt mit einer Stammlösung. Zur Herstellung dieser Stammlösung werden 5 g Rhodigel/1 in eine Wasservorlage mit einem Ultraturrax langsam eingerührt. Das Medium wird 35 min. bei 125 °C autoklaviert, nachdem die Einstellung des pH-Wertes pH = 7,0 erfolgte. Die Inokulation des Mediums wird mit 0,3 1 Schüttelkultur des BS01(+)- Halbstammes vorgenommen. Nach einer diskontinuierlichen Wachstumsphase von 5 Stunden erfolgt der Übergang zu einer kontinuierlichen Kulturführung mit D = 0,1 h"1. Die Produktivität der Kultur beträgt 0,5 g/1 x h. Für die Biosyntheseinduktion (Mating) im 30-1-Impfreaktor mit einer Biomassekonzentration von 8 - 10 g/1 werden der 22 1 (-)-Kultur 0,36 1 BS01(+)- Kultur zugeführt. Auf diese Weise wird die kontinuierliche Kultivierung des BS01(+)-Halbstammes durch einen Zyklus unterbrochen. Die Induktionsbedingungen entsprechen denen im Beispiel 1, ebenso sind die Produktionsbedingungen identisch. Unabhängig vom periodischen Ablauf der Produktfermentation mit der Induktionskultur steht Biomasse des BS01(+)- Halbstammes zur Gewinnung von aktiver Biomasse, homogenisierter Biomasse und der gamonartigen und dereprimierenden Substanzen zur Verfügung. INTERNATIONALES FORMBLATT
BIOSYNERGY GmbH Margarethenhain 7 04579 Espenhain LEBENSFÄHIG EΓΓSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name: BIOSYNERGY GmbH Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Margarethenhain 7 zugeteilte EINGANGSNUMMER: 04579 Espenhain
Anschrift: DSM 16754 Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung1: 2004-09-23 in. LEBENSFAHIGKEΓΓSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 2004-09-27 2 geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
(χ)3 lebensfähig ( )3 nicht mehr lebensfähig
IV. BEDINGUNGEN. UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST4
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschriften) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig ( ' ,
Figure imgf000019_0001
Datum: 2004-10-06 Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Wciterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung. In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkeitsprüfiing. Zutreffendes ankreuzen. Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.
Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 12/2001 INTERNATIONALES FORMBLATT
BIOSYNERGY GmbH
Margarethenhain 7 EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, 04579 Espenhain ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER BS 01 (+) DS 16754
II WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung ( ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen)
III EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 2004-09-23 (Datum der Ersthinterlegung)1 eingegangen ist
IV EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst- hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Etsthmterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)
V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschπft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten Anschrift Mascheroder Weg lb D 38124 Braunsehweig ( . ^xC Datum 2004-10-06 1 Falls Regel 64 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 12/2001 INTERNATIONALES FORMBLATT
BIOSYNERGY GmbH Margarethenhain 7 EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTΗINTERLEGUNG, 04579 Espenhain ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: BS 01 (-) DSM 16755
II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung ( x ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen).
III. EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 2004-09-23 (Datum der Erst- hinterlegung)1 eingegangen ist.
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter 1 bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Eist- hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten: Anschri ft: Mascheroder Weg I b D-38124 Braunschweig
Datum: 2004-10-06 Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 12/2001 INTERNATIONALES FORMBLATT
BIOSYNERGY GmbH Margarethenhain 7 04579 Espenhain LEBENSFAHIGKEΓΓSBESCHEΓNIGUNG ausgestellt gemäß Regel 102 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I HINTERLEGER π KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name BIOSYNERGY GmbH Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Margarethenhain 7 zugeteilte EINGANGSNUMMER 04579 Espenham
Anschrift DSM 16755 Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung1 2004-09-23 m LEBENSFAHIGKEITSBESCHEIN1GUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 2004-09-27 ! geprüft worden Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
( )3 lebensfähig ( )3 nicht mehr lebensfähig
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Anschrift Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig ( , Cist ? Datum 2004-10-06 Angabe des Datums der Ersthmterlegung Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung In den in Regel 10 2 Buchstabe a Ziffer u und in vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lebensfälugkeitsprufung Zutreffendes ankreuzen Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung ß-carotinhaltiger Biomasse auf der Grundlage der mikrobiologischen Synthese durch Mutagenese veränderten heterothallischen Pilzen mit erhöhter Synthese und Speicherkapazität von ß-Carotin in submersen Kulturen dadurch gekennzeichnet, • dass die Biomasse ausschließlich aus Sporen getrennt nach (+)- und (-)-Paarungstyp mehrstufig vermehrt wird, • die Sporen des (+)- und (-)-Paarungstyp nach Waschung mit ionenfreiem Wasser unter Glycerolschutz bei - 80 °C bis - 85 °C in verschlossenen Röhrchen gelagert werden, • zur Biomasse des (-)-Paarungstyp nach Abschluss der letzten Biomassevermehrungsphase vor der Produktfermentation Biomasse des (+)-Paarungstypes oder Kulturflüssigkeit des (+)-Paarungstypes oder homogenisierte Biomasse des (+)-Paarungstypes oder gamonartige Stimulatoren oder Laktone oder Trisporsäure oder Trisporsäurederivate zugesetzt werden und • dieses submerse Gemisch nach einer zeitabhängigen ein- bis fünfstündigen Mating- oder Induktionszeit in die Nährlösung der Produktfermentation überführt wird, wobei die Nährlösung so zusammengesetzt ist, dass zum Zeitpunkt tw die phosphorratenlimitierte Wachstumsphase der Biomasse ausschließlich durch Phosphor-Limitation abgeschlossen, • die Synthese von ß-Carotin in der Produktkultur zusätzlich durch Erzeugung einer drei- bis siebenstündigen Temperatur- und Sauerstoff- Stress-Situation ausgelöst wird, • wobei durch eine Phosphorlimitierung nur nach der phosphorratenlimitierten Wachstumsphase ohne weiteren Zusatz von anorganischen Phosphorverbindungen zum Medium die lösemittelfreie Extraktion des ß-Carotins aus der resultierenden Trockenbiomasse stammabhängig ermöglicht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die (+)-Paarungstypen nur Induktionsstämme sind und ihre Biomasse in kontinuierlicher und zyklischer Kultur gezogen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die (-)-Halbstämme nur Produktionsstämme für Carotinoide sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomassen der (+)-Paarungstypen in zyklischer Kultur gezogen werden und nur die (-)-Paarungstypen stetig neu mehrstufig vermehrt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Biomasse des jeweiligen (+)-Paarungstypes zu der des jeweiligen (-)-Paarungstyρes beim Mating 1 : 10 bis 1 : 200, vorzugsweise 1 : 45 bis 1 : 75 beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Matingzeit bzw. die Reifezeit bei Einsatz von Kulturflüssigkeit, Homogenisaten oder Syntheseprodukten in Abhängigkeit von den eingesetzten Mikroorganismen bestimmt wird und 1 - 180 Minuten, vorzugsweise 30 bis 180 Minuten beträgt.
. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung aus polymeren Substraten besteht, eine Phosphorlimitierung aufweist, während der Präparation nach einer Verkleisterung des polymeren Kohlenstoffsubstrats einer enzymbedingten Verflüssigung unterzogen wird, die die Viskosität der Lösung stark herabsetzt, aber keine monomere Kohlenstoffsubstrate entstehen lässt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung so zusammengesetzt und präpariert ist, dass das Biomassewachstum in der Kultur gleichmäßig und schnell mit reduzierter Chitinbiosynthese verläuft und nach Wachstumsabschluss infolge der Phosphor-Limitation nur Nährsubstrate für die Produktbildung zur Verfügung stehen, so dass nach weiterem enzymatischen Aufschluss durch den produzierenden Pilz eine erneute sekundäre Biomasseentwicklung nicht ermöglicht wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass während der Fermentation Stressoren eingesetzt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Stressoren Sauerstoffüberschuß und/oder Antioxydantien sind.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Stimulatoren eingesetzt werden.
12. Verfahren nach Ansprach 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Stimulatoren Vitamine und/oder Vorstufen von Vitaminen und/oder vom chemischen Aufbau dem ß-Carotin verwandte Strukturen sind.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die vom chemischen Aufbau dem ß-Carotin verwandte Strukturen ß-Ionon, Trisporinsäure, Carotenoide, Bruchstücke von Carotinoiden und/oder Laktone sind.
14. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass als ß-Carotinbildner heterothallische Pilze mit einem ß-Carotin-Synthese- potential > 2,0 % des Trockengewichtes eingesetzt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die hetero-thallischen Pilze Blakeslea trispora und davon durch Mutagenese abgeleitete Stämme sind.
16. Verfahren nach Ansprach 15, dadurch gekennzeichnet, dass die heterothallischen Pilze Blakeslea trispora BS01(+) und BSOl(-) sind.
17. Verfahren nach Ansprach 14, dadurch gekennzeichnet, dass die unterschiedlichen Paarangstypen der heterothallischen Pilze aus einer Stammlinie stammen.
18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die unterschiedlichen Paarungstypen der heterothallischen Pilze aus unterschiedlichen Stammlinien stammen.
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