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Die Erfindung betrifft ein einfaches und effektives Verfahren zur Herstellung von ß-Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (–)-Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora, das durch eine hohe Produktivität der B. trispora-Stämme gekennzeichnet ist. Die hohe Produktivität wird durch die erfindungsgemäße Verfahrensführung erreicht, die den morphologischen Zustand der filamentös wachsenden Halbstämme und den Wachstumszustand beim Vermischen der Stämme (dem sogenannten Mating) berücksichtigt.
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Carotinoide sind natürliche Farbstoffe, die eine gelbe bis rötliche Färbung verursachen und häufig in Gemüsepflanzen vorkommen. Sie waren und sind aufgrund ihrer Eigenschaften als Antioxidantien und als Vorstufe für Vitamin A Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Auf Grund ihrer antioxidativen Wirkung sollen sie vielen Erkrankungen wie z. B.Krebs, Arteriosklerose, Rheuma oder Alzheimer vorbeugen. Lycopin (vorkommend z.B. in Tomaten) hat dabei das größte antioxidative Potenzial und gilt als wirksamster Schutz vor dem besonders reaktiven Singulett-Sauerstoff. Industriell werden die Carotenoide als Nahrungsmittelzusatzstoffe und farbgebende Mittel z. B. in Margarinen, Ölen, Saucen, Suppen und Fruchtsäften verwendet, aber auch als Futterzusatzstoffe.
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Carotenoide sind chemisch und biotechnologisch herstellbar. Mittels biotechnologischer Herstellung sind Carotenoide komplexerer Struktur und auch die natürlich vorkommenden Konformationsisomere sehr einfach zugänglich. Der industrielle biotechnologische Prozess zur Herstellung von ß-Carotin basiert auf der Verwendung der Alge Dunaliella salina oder des Pilzes Blakeslea trispora, wobei bei Verwendung von B. trispora eine gemischte Fermentation der (+)- und (–)-Stämme durchgeführt wird, um eine maximale Ausbeute an ß-Carotin zu erhalten.
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Im Stand der Technik ist die Herstellung von ß-Carotin durch Fermentation von B. trispora in zahlreichen Patentdokumenten beschrieben, beispielsweise in
EP 1 367 131 A1 ,
WO 93/20183 A1 oder
WO 02/010429 A1 . Alle beschriebenen Fermentationsverfahren basieren auf dem Prinzip, dass die (+)- und (–)-Halbstämme gemeinsam in den Bioreaktor inokuliert werden.
WO 93/20183 A1 beschreibt die Produktion von ß-Carotin unter Verwendung ausgewählter mutierter B. trispora-Stämme unter spezifischen Fermentationsbedingungen.
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WO 02/010429 A1 offenbart ein Fermentationsverfahren mit definierter pH-Wert-Regelung während der Fermentation und dem Zusatz von Sojalecithin zum Kulturmedium, um die Erzeugung von ß-Carotin in Bezug auf andere Carotinoide zu erhöhen. Die in
EP 1 367 131 A1 beschriebenen Fermentationsbedingungen sehen sowohl eine programmierte Zugabe von Sauerstoff und/oder ß-Ionon als auch eine Kontrolle der vegetativen Wachstumsphase der verwendeten Stämme vor.
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In der Literatur wird auch die Anwendung chemischer Komponenten zur Produktsteigerung beschrieben. Solche Inhaltsstoffe können jedoch toxisch sein und deren nahrungs- oder arzneimittelrechtliche Zulassung kann in Frage stehen.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein effektives Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden, insbesondere ß-Carotin und Lycopin, bereitzustellen, dass gute Produktausbeuten liefert, ohne chemische Zusätze zu benötigen. Daneben soll es möglichst kostengünstig sowie in der Durchführung einfach und wenig aufwändig sein und eine Reduzierung der Fermentationsdauer erlauben.
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Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines Carotinoids ausgewählt aus ß-Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (–)-Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora und Gewinnung des Carotinoids aus der erhaltenen Biomasse gelöst, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass zunächst der (–)- und der (+)-Stamm getrennt bis zur vollen morphologischen Ausbildung vorkultiviert werden, dann der (–)-Stamm in den Bioreaktor inokuliert wird und während des exponentiellen Wachstums des (–)-Stammes der (+)-Stamm dem (–)-Stamm im Verhältnis 1:5 bis 1:100 (Matingverhältnis) zur Induktion der Carotinoidbildung zugesetzt wird und beide Stämme gemeinsam ohne pH-Regulierung und ohne Regulierung des Sauerstoffpartialdrucks bei 18 bis 24 °C bis zum Ende der Carotinoidbildung (Idiophase) fermentiert werden.
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Die getrennte Vorkultivierung der Stämme erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung jeweils bei 26–30°C, besonders bevorzugt bei 28°C. Die getrennte Vorkultivierung des (–)-Stammes wird ca. 55 Stunden durchgeführt. Nach ca. 55 Stunden wird der (–)-Stamm dann in den Bioreaktor überführt. Die Fermentation des (–)-Stammes im Bioreaktor erfolgt ebenfalls vorzugsweise bei 26–30°C, besonders bevorzugt bei 28°C. Die Kultivierung des (–)-Stammes im Bioreaktor wird für ca. 13 bis 14 Stunden durchgeführt (Trophophase).
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Es ist ebenfalls besonders bevorzugt, dass die gemeinsame Fermentation des (+)- und (–)-Stammes (Idiophase) zur Carotinoidbildung bei 22°C vorgenommen wird.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Kultivierung des (–) Halbstammes im Reaktormaßstab bis zu einer vollständigen Hyphenausbildung durchgeführt (Trophophase) und erst dann der (+) Halbstamm als Induktionsmaßnahme während des exponentiellen Wachstums des (–)-Stammes zugegeben. Dadurch kann der Fermentationsprozess zeitlich verkürzt und Kosten eingespart werden. Zusätzlich findet zwischen Tropho- und Idiophase ein Temperaturshift von für das Wachstum optimalen 26–30°C auf 18 bis 24°C statt. Die niedrigere Temperatur inhibiert die Vitalität der Pilzhalbstämme nicht, fördert jedoch die Stabilität des Produktes während der Fermentation. Für die erfolgreiche Kultivierung mit guten Produktausbeuten ist im vorliegenden Verfahren keine Regelung von pH oder Sauerstoffgehalt erforderlich. Da keine Regelung des pH-Wertes stattfinden muss, ist kein Einsatz von Säuren oder Basen erforderlich und es werden Kosten gespart.
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Begasungsrate, Drehzahl und Temperatur werden während der gesamten Produktbildung (Idiophase) konstant gehalten, was offensichtlich eine Adaptierung der Pilze an die vorherrschenden Bedingungen begünstigt. Das Einsetzten der Produktbildung ist gekennzeichnet durch gleichzeitige Abnahme des BTS(Biotrockensubstanz)-Gehalts und pH-Wertes. Das Abbruchkriterium der Carotinoid-Bildung kann durch eine deutliche Zunahme des pH-Wertes detektiert werden. D.h., dass nach einem pH-Wert-Anstieg um 0,5 bis 0,8 die Carotinoidbildung abgebrochen wird.
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Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, die Rührgeschwindigkeit während der Kultivierung des (–)-Stammes im Bioreaktor (Trophophase) auf 230 bis 350 rpm, besonders bevorzugt auf 244 bis 344 rpm, einzustellen. Die Rührgeschwindigkeit während der getrennten Vorkultivierung der Stämme beträgt bevorzugt 130 bis 156 rpm.
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Der Begasungsvolumenstrom während der Trophophase beträgt vorzugsweise ca. 1 vvm (Volumen Luft/ Volumen Fermenter/ Minute).
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In der Idiophase (Produktbildung) sind die Bedingungen für die Rührgeschwindigkeit und den Begasungsvolumenstrom die gleichen wie in der Trophophase.
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Das Matingverhältnis (jeweils (+)-Stamm zu (–)-Stamm) beträgt in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung 1:5 bis 1:20, besonders bevorzugt 1:5 bis 1:10.
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Als Substrate können in der Idiophase des Verfahres der vorliegenden Erfindung die für B. trispora allgemein bekannten Substrate eingesetzt werden, insbesondere solche, die Kohlenhydrate und organische Stickstoffverbindungen gleichzeitig enthalten. Auch Lipide können dem Substrat zugesetzt werden. Als Kohlenhydrate werden erfindungsgemäß bevorzugt Stärke oder Zucker im Substraten verwendet. Es hat sich gezeigt, dass insbesondere mit zuckerhaltigen Substraten mit einem Zuckergehalt von 10 bis 50g/L gute Ausbeuten an Carotinoid erhalten werden. Als zuckerhaltige Substratzusätze dienen erfindungsgemäß insbesondere Melasse und/oder Bierwürze.
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Soll mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Lycopin hergestellt werden, so ist es erforderlich dem Substrat bei der gemeinsamen Fermentation des (+)- und (–)-Stammes (Idiophase) einen Cyclaseinhibitor zuzusetzen, vorzugsweise Imidazol und/oder ein Imidazolderivat.
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Im Verfahren der Erfindung können alle bekannten und in Kultursammlungen öffentlich zugänglichen B. trispora-Halbstämme eingesetzt werden, so z. B. der (–)-Stamm DSM 2388 und der (+)-Stamm DSM 2387 oder der (–)-Stamm ATCC 14272 und der (+)-Stamm ATCC 14271. In einer Ausführungsform der Erfindung können auch der Stamm BS 01(–), der in der Internationalen Hinterlegungsstelle der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Deutschland unter der Nummer DSM 16755 hinterlegt ist, und der Stamm BS 01(+), der ebendort unter der Nummer DSM 16754 hinterlegt ist, eingesetzt werden.
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In einer ganz besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren durch die nachfolgenden Schritte gekennzeichnet:
- (1) Der (–) Stamm wird ca. 55 h und der (+) Stamm ca. 68 h im Erlenmeyerkolben bei 28°C und 145 rpm getrennt vorkultiviert.
- (2) Nach ca. 55 h wird der (–) Stamm in einen Reaktor überführt und für ca. 13–14 h bei 28°C, einer Begasungsrate von ca. 1 vvm und einer Rührerdrehzahl von 244 bis 344 rpm fermentiert.
- (3) Nach der Zugabe des (+) Stammes wird die Kultivierungstemperatur auf 22 °C eingestellt. Das Volumenverhältnis zwischen (+) und (–) Stamm beträgt 1:9.
- (4) Eine Regelung des pH-Wertes wird nicht vorgenommen. Die Aufarbeitung der Biomasse wird nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden durchgeführt, zum Beispiel durch Fest-Flüssig-Trennung bzw. Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender trocknung des Biomassepellets.
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Zusammenfassend ist festzustellen, dass das vorliegende Verfahren eine hohe Produktivität von Blakeslea-Stämmen allein durch die Steuerung physikalischer Parameter gewährleistet, wodurch bei der nahrungs- bzw. arzneimittelrechtlichen Zulassung der erfindungsgemäß hergestellten Carotinoide keinerlei Probleme zu erwarten sind, da durch das erfindungsgemäße Verfahren keine toxischen oder andersartig gefährlichen Stoffe im Produkt hinterlassen werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Carotinoid-Ausbeuten in der Biotrockenmasse von mindestens 2 % erzielt, vorzugsweise von 4 bis 6%.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken.
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Beispiel 1:
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Die Halbstämme DSM 2387 und DSM 2388 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
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Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121°C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2·106 Sporen beimpft. Der (–)-Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm.
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Ein Reaktor mit einem Nennvolumen von 5 L wird mit 3200 mL des Flüssigmediums (YPsS ohne Hefeextrakt) befüllt und für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (360 mL) und Thiamin (12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C wird der Reaktor mit 200 mL der DSM 2388 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 13 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Anschließend werden 400 mL der DSM 2387 Kultur zur Induktion der Carotinoidbildung zugegeben. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der 36 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein.
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Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des pO2-Wertes nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm. Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse (Fest-Flüssig-Trennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von β-Carotin in der Biomasse beträgt 3,2 bis 6,18 %.
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Beispiel 2:
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Die Halbstämme DSM 2387 und DSM 2388 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
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Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Bierwürze: 10 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2·106 Sporen beimpft. Der (–)-Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm.
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Ein Reaktor mit einem Nennvolumen von 5 L wird mit 3200 mL des Flüssigmediums (Bierwürze: 10 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1,0 g/L, Agar: 2 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt und für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (14,292 g/360 mL) und Thiamin (0,0072 g/12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C wird der Reaktor mit 200 mL der DSM 2388 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 13 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Anschließend werden 400 mL der DSM 2387 Kultur zur Induktion der Carotinoidbildung zugegeben. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der 40 bis 56 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein.
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Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des pO2-Wertes nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
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Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse (Fest-Flüssig-Trennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von β-Carotin in der Biomasse beträgt 1,8 bis 2,3 %.
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Beispiel 3:
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Die Halbstämme ATCC 14271 und ATCC 14272 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
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Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2·106 Sporen beimpft. Der (–)-Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm.
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Zwei Reaktoren mit einem Nennvolumen von 5 L werden mit jeweils 3200 mL des Flüssigmediums (YPsS ohne Hefeextrakt) befüllt und für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (360 mL) und Thiamin (12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach Einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C werden die Reaktoren jeweils mit 200 mL der ATCC 14271 Kultur und der ATCC 14272 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 14 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet.
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In einem Reaktor mit einem Nennvolumen von 15 L werden 9 L YPsS-Medium vorgelegt, sterilisiert und mit 500 mL ATCC 14272 angeimpft. Der Pilz befindet sich nach 14 Stunden im exponentiellen Wachstum. Es werden 1 L des ATCC 14271 Kultur zugegeben um die Produktbildung zu induzieren. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der nächsten 50 bis 64 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein.
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Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des pO2-Wertes nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
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Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse (Fest-Flüssig-Trennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von β-Carotin in der Biomasse beträgt 3,8 bis 4,5 %.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- EP 1367131 A1 [0004, 0005]
- WO 93/20183 A1 [0004, 0004]
- WO 02/010429 A1 [0004, 0005]