DE60023693T2

DE60023693T2 - Herstellungsverfahren für lycopen

Info

Publication number: DE60023693T2
Application number: DE60023693T
Authority: DE
Inventors: Ana Teresa Marcos; Antonio Estrella De Castro; Bina Mehta; Bruno Diez Garcia; Javier Costa Perez; Carmelita Rodriguez Otero; Enrique Peiro Cezon; Enrique Cerda Olmedo; Alfonso J. Collados De La Vieja; Francisco Salto Maldonado; Manuel Esteban Morales; Ermanno Bernasconi
Original assignee: Vitatene SA
Current assignee: Vitatene SA
Priority date: 1999-06-09
Filing date: 2000-06-06
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2020-06-07
Also published as: ATE308622T1; DE60023693D1; ES2156735B1; ES2252009T3; EP1184464B1; CN1353765A; JP2003502052A; JP3904924B2; CN1252276C; ES2156735A1; EP1184464A2; WO2000077234A2; AU5079200A; WO2000077234A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren für die Produktion von Carotinoiden, insbesondere Lycopin, ausgehend von untergetauchten Kulturen von Mucor-Pilzen der Art Blakeslea. Ein Fermentationsverfahren wird beschrieben, durch das es möglich ist, einen Anstieg der Produktion von Lycopin zu erhalten, basierend auf der Zuführung von Extrakten, angereichert mit Trisporsäuren. Das Verfahren wird durchgeführt, ausgehend von Wildstämmen oder Mutanten derselben in Einfach- oder Mischkultur. Trisporsäuren können zu Beginn oder während der Fermentation zugefügt werden.
STAND DER TECHNIK
Die Carotinoide sind Verbindungen, die häufig in Früchten und Pflanzen auftreten und die etlichen Untersuchungen im Hinblick auf ihre Eigenschaften als Antioxidantien und als Vitamin A-Vorläufer unterzogen wurden. Lycopin verhindert zusätzlich zu seinen antioxidativen Eigenschaften kardiovaskuläre Erkrankungen und einige Krebsarten, wie Prostatakrebs und Gastrointestinalkrebs und ist bei der Kontrolle des Wachstums aktiv (Stahl W. und Sies, H. 1996. Arch. Biochem. Biophys. 336: 1–9; Clinton, SK. 1998. Nutr. Rev. 56: 35–51). Aufgrund ihrer gelblich bis rötlichen Färbung werden die Carotinoide ebenfalls als Nahrungsmittelzusatz und Färbemittel für Margarine, Butter, Salatöle, Suppen und Soßen verwendet (Ninet L. und Renaut J. 1979. In: Pepper HJ., Perlman D. (Hrsg.). Microbial Technology, 2. Ausgabe, Band 1 Academic Press, NY, S. 529–544).
Lycopin ist ein Carotinoid, das als Intermediat im Biosyntheseweg von β-Carotin ( GB 1034944 und GB 1114043 ) und Xanthophyllen erzeugt wird.
MEVALONAT
Lycopin-Präparationen werden von der Tomate (Patente PCT WO 97/48287, EP 608027 ) erhalten oder durch Fermentation der Mucor-Pilze, wie Phycomyces, Blakeslea und Choanephora (Patente GB 1008469 , US 3097146 , US 3369974, JP 73016189 , JP 73016190 und RU 2102416 ).
Die Patente GB 1008469 und US 3097146 beschreiben ein Fermentationsverfahren für den Pilz Blakeslea trispora, bestehend aus einem Kulturmedium, dessen pH auf oberhalb von 7,0 und bis zu 9,5 gehalten wird. Nach 7 Tagen Inkubation werden 9,97 mg Lycopin pro 100 ml Medium erhalten.
Die japanischen Patente JP 73016189 und JP 73016190 beschreiben ein Fermentationsverfahren mit Mucorales-Pilzen, wie Phycomyces, Blakeslea und Choanephora, wozu tertiäre Amine hinzugefügt werden, um die Bildung von β-Carotin zu verhindern und die Anhäufung von Lycopin zu unterstützen. Die folgenden werden als Beispiele tertiärer Amine zitiert: Hordenin, 2-Dimethylaminoethanol; 3-Dimethylamino-1-propanol; 1-Dimethylamino-2-propanol; 2-Diethylaminoethanol; 3-Diethylamino-1-propanol; 1-Diethylamino-2-propanol; Triethylamin; 2-Diisopropylaminoethan; 3-Diisopropylamino-1-propanol; 1-Diisopropylamino-2-propanol; 2-Di-n-propylaminoethanol; 3-Di-n-propylamino-1-propanol; 1-Di-n-propylamino-2-propanol; 2-Dimethylaminoethylbenzol; 2-Diethylaminoethylbenzol; p-(2-Diethylaminoethyl)phenol. Das Patent RU 2102416 beschreibt die Addition von Aminomethylpyridinen und Tabakresten, um eine Anhäufung von Lycopin zu induzieren. Zusätzlich zu den in diesen Patenten beschriebenen Substanzen gibt es Beschreibungen für die Verwendung anderer nitrierter heterozyklischer Basen, die die Synthese von Carotinoiden auf dem Lycopin-Niveau blockieren können, wie z.B. Nikotin (japanisches Patent JP 09313167 ), Imidazol, Pyridin, Morpholin, Chinolin und einige substituierte Derivate (US-Patent 3369974; Ninet L., Renaut J. 1979. In: Peppler HJ, Perlman D (Hrsg.). Microbial Technology, 2. Ausgabe, Bd. 1 Academic Press, NY, S. 529–544).
Mutanten von B. trispora, die Lycopin anhäufen, ohne dass tertiäre Amine zugefügt werden müssen, wurden ebenfalls beschrieben (Mehta B. und Cerdá-Olmedo E. 1995. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 836–838).
Bei allen diesen Herstellungsverfahren für β-Carotin mit dem Pilz B. trispora werden Mischkulturen des Pilzes verwendet, woraufhin sehr viel höhere Erträge von β-Carotin erhalten werden als die, die bei (+)- und (–)-Stämmen separat angetroffen werden (Ciegler, A. 1965. Advances in Applied Microbiology 7: 1–34; Plempel, M. 1965 Planata 65: 225–231; Sutter, RP. und Rafelson, ME. 1968. J. Bacteriology 95: 426–432). Der Anstieg der Produktion von β-Carotin in Mischkulturen korreliert mit der Produktion einer Familie von sauren Verbindungen, die Faktor β oder Trisporsäuren genannt werden (Caglioti L., Cainelli G., Camerino B., Mondelli R., Prieto A., Quilico A., Salvatori T., Selva A. 1966. Tetrahedron Supplement 7: 175–187). Es wurde vorgeschlagen, dass die Trisporsäuren Sexualhormone bei Mucorales-Pilzen sind, wie z.B. B. trispora, Phycomyces blakesleanus und Mucor mucedo, da sie zusätzlich zu einer Stimulation der Produktion von β-Carotin die Bildung von Zygophoren stimulieren (van den Ende, H. 1968. J. Bacteriology 96: 1298–1303; Austin DJ., Bu'Lock JD., Gooday G. W. 1969. Nature 223: 1178–1179; Reschke, T. 1969. Tetrahedron Letters 29: 3435–3439; van den Ende H., Wiechmann AHCA., Reyngoud DJ., Hendricks T. 1970. J. Bacteriology 101: 423–428).
Chemisch sind die Trisporsäuren oxidierte, ungesättigte Derivate von 1,1,3-Trimethyl-2-(3-methyloctyl)cyclohexan. Diese Verbindungen können als Sesquiterpene klassifiziert werden, erzeugt oder produziert bei dem Abbau von Diterpenen oder Carotinoiden. Die Trisporsäuren wurden als Mischung von drei Substanzen charakterisiert: Trisporsäuren A, B und C, auch als Faktor β₁, β₂, β₃ bezeichnet (aufgrund der Tatsache, dass sie die Synthese von β-Carotin stimulieren). Die Trisporsäure C ist die am häufigsten vorliegende und wurde mit 80% in Mischkulturen von B. trispora angetroffen (Caglioti, L., Cainelli, G., Camerino, B., Mondelli, R., Prieto, A., Quilico, A., Salvatori, T., Selva, A. 1966. Tetrahedron Supplement 7: 175–187).
Die Trisporsäuren werden aus β-Carotin synthetisiert, erzeugt sowohl von dem (+)-Stamm als auch von dem (–)-Stamm. β-Carotin wird über Retinal zu 4-Hydrotrisporol verstoffwechselt. Diese Verbindung wird durch den (+)-Stamm zu 4-Dihydrotrisporsäure und ihre Methylester verstoffwechselt und der (–)-Stamm wandelt das 4-Hydrotrisporol zu Trisporol um. Diese beiden Intermediate werden erst in Trisporsäure umgewandelt, nachdem sie in das Medium zu dem Stamm des entgegengesetzten Geschlechts diffundiert sind (Übersicht von Gooday GW. und Carlile MJ. 1997. Mycologist 11: 26–30). D.h. der (–)-Stamm erzeugt die Intermediate, die von dem (+)-Stamm zu Trisporsäure umgewandelt werden und umgekehrt, und zwar gemäß dem obigen Schema.
Die aus Mischkulturen von B. trispora erhaltenen Trisporsäuren können verwendet werden, um die Produktion von β-Carotin in Kulturen mit getrennten Stämmen anzuheben. Z.B. erhöht die Addition von 21,8 Einheiten von Faktor β den Ertrag von β-Carotin vom (–)-Stamm um 422% und den Ertrag vom (+)-Stamm um 71%. Die Stimulation der Carotinogenese pro Einheit Faktor β in den Kulturen des (–)-Stamms betrug jedoch nur 20 bis 30% der Carotinogenese, erzeugt in Mischkulturen und mit ähnlichen Mengen Faktor β (Sutter RP. und Rafelson ME. 1968. J. Bacteriology 95: 426–432).
Trisporsäuren können durch verschiedene Verfahren gereinigt werden, wie z.B. die von Sutter R. 1970. Science 168: 1590–1592 oder Sutter RP., Capage DA., Harrison TL., Keen WA. 1973. J. Bacteriology 114: 1074–1082 beschriebenen.
Es ist nicht bekannt, ob eine positive Wirkung eines Anstiegs des Ertrags von Lycopin durch Addition von Trisporsäuren beschrieben wurde. Die Produktion von Lycopin basiert auf der Unterdrückung der Lycopincyclaseaktivität, die Lycopin in β-Carotin umwandelt, was zu niedrigen Niveaus β-Carotin bei der Fermentation führt. Die Trisporsäuren, die die Geschlechtshormone sind, die die Carotinogenese induzieren, werden aus β-Carotin synthetisiert. Daher ist die Abwesenheit eines Vorläufers (β-Carotin) der Punkt, der die Bildung dieser Hormone inhibiert und einen Anstieg der Produktion von Lycopin durch Trisporsäuren ermöglicht, da die Zugabe von Trisporsäuren keine Wirkung in Mischkulturen hat, die β-Carotin erzeugen, (wie im Fall des Mutanten SB34(–) mit ASA2(+) in den Beispielen 5 und 6).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung beansprucht einen Anstieg der Produktion von Carotinoiden, insbesondere Lycopin, in einem Fermentationsverfahren mit Mucorales-Pilzen (Blakeslea, Choanephora oder Phycomyces), insbesondere B. trispora. Die Erfindung besteht aus der Kultivierung des Pilzes B. trispora in einem Fermentationsmedium und der Addition von Trisporsäuren (oder Faktor β), teilweise gereinigt (PTA) oder selbst ungereinigt (NPTA) von irgendeiner anderen Quelle, z.B. aus einem Medium für die Erzeugung von β-Carotin.
Die Wirkung der Trisporsäuren auf die Fermentation von Lycopin basiert auf der Tatsache, dass diese Hormone aus β-Carotin synthetisiert werden, einer Verbindung, die bei der Fermentation von Lycopin nicht gebildet werden kann. Unter diesen Umständen befindet sich der Pilz ohne den Vorläufer für die Synthese dieser Hormone und die Carotinogenese wird nicht in ihrem maximalen Ausmaß induziert.
Die für die Fermentation verwendeten Organismen können isolierte Stämme oder eine Mischung der (+)- und (–)-Stämme von Mucorales-Pilzen sein, insbesondere B. trispora oder alternativ Mutanten von B. trispora, die zu einer Anhäufung von Lycopin in der Lage sind. Verschiedene Mischungen von (+)- und (–)-Stämmen des Pilzes können bei dem Fermentationsverfahren dieser Erfindung verwendet werden. Wenn Stämme von B. trispora verwendet werden, die Erzeuger von β-Carotin sind, werden Verbindungen zugefügt, die dazu fähig sind, die Carotinogenese auf dem Niveau des Lycopins zu blockieren (z.B. tertiäre Amine und andere früher erwähnte). Wenn Mutanten verwendet werden, die im Hinblick auf die Biosynthese von Carotinoiden aus Lycopin blockiert sind, wird es nicht notwendig sein, tertiäre Amine und verwandte Verbindungen zuzuführen. In beiden oben erwähnten Fällen werden die Trisporsäuren teilweise gereinigt (PTA) oder ungereinigt (NPTA) aus irgendeiner Quelle für sie zugefügt, z.B. aus einem Kulturmedium, abstammend von einer Fermentation von β-Carotin und in beiden Fällen mit einer ungefähren Konzentration von 0,35 mg/ml. Die Bezeichnung NPTA korrespondiert zu einem β-Carotinmedium. Die Konzentration der Trisporsäuren in den Medien kann als Funktion des Inkubationstags aus 1 berechnet werden (am 4. Tag würde es 350 bis 400 μg/ml geben).
Das Produktionsverfahren von Carotinoiden aus Mucorales-Pilzen und insbesondere von Lycopin mit gewählten Stämmen oder Mutanten von B. trispora kann in jedem Kulturmedium durchgeführt werden, das ein oder mehr Kohlenstoffquellen, ein oder mehr Stickstoffquellen, Mineralsalze und Thiamin enthält. Die Kohlenstoffquellen können als einfache oder komplexe Nährstoffe zugefügt werden und beinhalten Kohlenhydrate oder Fette, wie z.B. Dextrine, Stärken, Glucose, Saccharose, Fruktose, tierische oder pflanzliche Öle. Das Kulturmedium muss auch eine assimilierbare Stickstoffquelle aufweisen, die organisch oder anorganisch sein kann, wie z.B. Sojamehl, Maismehl, lösliche Destillate, Hefeextrakt, Baumwottsamenmehl, Pepton, Casein, Ammoniumsulfat usw. Die Mineralsalze, die dem Kulturmedium zugefügt werden können beinhalten Phosphate, Sulfate, Chloride, Natrium, Kalium, Ammonium, Kalzium und Magnesium. Die Anteile der Nährstoffe werden auf der Basis der Anforderungen für das Wachstum der Mikroorganismen und an das Produktionsniveau bestimmt. Die Fermentation wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen und in untergetauchter Kultur durchgeführt. Die Fermentationstemperatur kann zwischen 20 und 32°C variieren, obwohl zwischen 25 und 28°C bevorzugt wird.
Die Addition von Trisporsäuren in einem Konzentrationsbereich von 0,001 bis 1.000 mg/ml kann aus einer teilweise gereinigten Präparation oder irgendeiner Quelle bewirkt werden, z.B. einem Kulturmedium, abstammend von einer Fermentation von β-Carotin von irgendeinem Mucor-Pilz. Die Addition wird vorzugsweise zwischen 72 und 144 Stunden nach Beginn der Fermentation bewirkt.
Das Lycopin wird durch irgendein Verfahren extrahiert, das für einen Zellaufbruch beschrieben wurde und dazu in der Lage ist, den Zellinhalt freizusetzen, gelöst in irgendeinem Lösungsmittel, worin sie löslich sind. Die Konzentration kann durch Messung von Spektrophotometrie bestimmt werden, jedoch wird die Verwendung einer Flüssigchromatographie (HPLC) bevorzugt, durch irgendeines der Verfahren, die in der Bibliografie beschrieben werden.
Die verwendeten Stämme sind die folgenden: Mutanten, die Erzeuger von β-Carotin sind: ASA2(+) und ASA25(–). Ein Mutant, der Erzeuger von Lycopin ist SB34(–). Dieser zuletzt erwähnte Mutant erzeugt auch 25% β-Carotin (siehe Tabelle 1). Die Auswahl der Mutanten ist vom Standpunkt der Wirkung des Anstiegs der Carotinproduktion aufgrund der Trisporsäuren per se irrelevant. D.h., die Wirkung aufgrund der Verbindungen würde in irgendeinem anderen ähnlichen mutierten Stamm reproduzierbar sein, obwohl dies zu einer niedrigeren Basalproduktion von Lycopin führen würde, wie sie beispielsweise bei Elternstämmen auftritt. Die Elternstämme werden in einer Sammlung hinterlegt und sie sind lebensfähig und für die Öffentlichkeit zugänglich.
BEISPIEL 1
Bestimmung der Konzentration von Trisporsäuren während der Fermentation von β-Carotin und Lycopin.
Es wird ein Inokulationsmedium hergestellt, das pro Liter folgendes enthält: Sojamehl 23 g; Maismehl 47 g; Monokaliumphosphat 0,5 g; Thiaminhydrochlorid 0,002 g. Der anfängliche pH ist 6,3. Das Medium wird auf 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit einer Rate von 67 oder 100 ml verteilt. Nach der Sterilisation werden die Stämme B. trispora ASA2(+) und B. trispora ASA25(–) aus Suspensionen von Sporen auf getrennte Kolben ausgesät und bei 25°C für 48 Stunden inkubiert.
Die mutierten Stämme B. trispora ASA2(+) und B. trispora ASA25(–) werden durch Mutation mit NTG aus den Wildtyp-Stämmen B. trispora F208(–) und F117(+) erhalten, hinterlegt bei der Collection of Industrial Microorganisms (VKM), in Moskau, Russland, wodurch beide Stämme der Öffentlichkeit zugänglich sind.
Ein Grundfermentationsmedium wird hergestellt, das pro Liter folgendes enthält: Sojamehl 44 g; Maismehl 19 g; dibasisches Phosphat 0,55 g; Thiaminhydrochlorid, 0,002 g; pflanzliches Öl 10%. Der anfängliche pH wird auf 7,5 mit Kaliumhydroxid eingestellt. Das Medium wird auf 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit einer Rate von 20 ml verteilt.
Für die Fermentation von β-Carotin werden die Kolben, die ein Grundmedium enthalten, inokuliert, und zwar mit 10% einer Mischkultur der Stämme B. trispora ASA2(+) und B. trispora ASA25(–). Für die Fermentation von Lycopin wird ein chemisches Mittel dem Grundmedium mit dem Ziel zugefügt, den Biosyntheseweg auf dem Niveau von Lycopin zu blockieren, z.B. 2 ml/l Pyridin. Dieses Medium wird mit 10% einer Mischkultur der Stämme B. trispora ASA2(+) und ASA25(–) inokuliert. Alle Kolben werden bei 25°C in einer Orbital-Rührervorrichtung bei 250 UPM inkubiert. Beginnend mit dem zweiten Tag der Fermentation wird alle 24 Stunden eine Probe genommen und die Konzentration der Trisporsäuren wird in den Kolben bestimmt, die β-Carotin erzeugen und in den Kolben der Lycopin erzeugen.
Die Konzentration der Trisporsäuren wird durch Extraktion mit einem Volumen Chloroform nach Ansäuern der Probe auf pH 2 bestimmt. Die organische Fraktion wird mit einem Volumen einer 4%igen Lösung Natriumbicarbonat extrahiert, die wässrige Phase wird gesammelt und angesäuert und dann wiederum mit Chloroform extrahiert. Dann wird das Chloroform zur Trockne verdampft und der Rest, bestehend aus Trisporsäuren, wird in einem Ethanol oder Tris-Sulfatpuffer gelöst. Die Trisporsäuren werden quantitativ durch Absorptionsspektrophotometrie beim 325 nm bestimmt, wobei eine Absorptivität von 70 ml × mg^–1 × cm^–1 angenommen wird (Sutter RP., Capage DA., Harrison TL., Keen WA. 1973. J. Bacteriology 114: 1074–1082).
Es wurde festgestellt, dass die Konzentration der Trisporsäuren im Verlauf der Fermentation von β-Carotin und Lycopin variiert und für das letztere signifikant niedriger liegt. Der maximale Unterschied wurde am 4. Tag gefunden, mit einer Konzentration von 378 μg/ml bei der Fermentation von β-Carotin und einer von 46 μg/ml bei der Fermentation on Lycopin (ungefähr ein 8-facher Unterschied) (1).
BEISPIEL 2
Wirkung der Addition von Trisporsäuren auf die Fermentation eines in der Biosynthese von β-Carotin teilweise blockierten Mutanten, der Form die Lycopin anhäuft.
Das inokulierende Medium wird wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Nach der Sterilisation wird der Stamm B. trispora SB34(–) aus einer Suspension von Sporen ausgesät und bei 25°C 48 Stunden inkubiert.
Der mutierte Stamm B. trispora SB34(–) wurde durch Mutation mit NTG, ausgehend vom Wildtyp-Stamm B. trispora F921(–) erhalten, hinterlegt in der Collection of cultures VKM, Moskau, Russland und steht der Öffentlichkeit zur Verfügung.
Ein Fermentationsmedium desselben Typs wie in Beispiel 1 beschrieben wird hergestellt. Nach der Sterilisation wird eine Reihe von Kolben mit 10% des Stamms B. trispora SB34(–) inokuliert, der dadurch gekennzeichnet ist, dass es sich um einen partiell blockierten Mutanten der Biosynthese von β-Carotin in der Form handelt, die Lycopin anhäuft. Alle Kolben werden bei 25°C in einer Orbital-Rührvorrichtung bei 250 UPM inkubiert.
Die Kontrollkolben sind diejenigen, die keine Addition von Trisporsäuren aufweisen. Die Gruppe von Kolben, die eine Addition von Trisporsäuren erhält, wird unter denselben Bedingungen wie die Kontrolle bis zum 4. Tag erhalten, zu welchem Zeitpunkt eine Präparation, angereichert mit Trisporsäuren und gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben, auf eine Endkonzentration von 350 μg/ml zugefügt wird.
Durch die Zugabe von teilweise gereinigten Trisporsäuren (PTA) erhalten wir einen Anstieg von 0,11 bis 0,24 mg Lycopin pro Gramm Trockengewicht (einen Anstieg von 2,18-fach desjenigen der Kontrolle am 6. Tag der Fermentation, 2).
BEISPIEL 3
Wirkung der Addition von Trisporsäuren auf die Fermentation von Lycopin mit einem β-Carotin-erzeugenden Mutanten, dessen Biosynthese auf dem Lycopin-Niveu durch ein chemisches Mittel blockiert ist.
Das inokulierende Medium wird auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Nach der Sterilisation wird der Stamm B. trispora ASA25(–) aus einer Suspension von Sporen ausgesät und bei 25°C für 48 Stunden inkubiert.
Ein Fermentationsmedium derselben Art, wie in Beispiel 1 beschrieben, wird hergestellt. Nach der Sterilisation wird ein chemisches Mittel zugefügt, das die Biosynthese von Carotinoiden auf dem Lycopin-Niveau blockiert, z.B. Imidazol auf eine Endkonzentration von 0,75 mg/ml. Dieses Medium wird außerdem mit Phosphatpuffer, pH 7,5, auf eine Endkonzentration von 25 mM versetzt und ist mit 10% des Stamms B. trispora ASA25(–) inokuliert. Die Kolben werden bei 25°C in einer Orbital-Rührvorrichtung bei 250 UPM inkubiert.
Die Kontrollkolben sind diejenigen, die keine Addition von Trisporsäuren erhalten. Die Gruppe von Kolben, die eine Addition von Trisporsäuren enthält, wird bis zum 4. Tag oder denselben Bedingungen wie die Kontrolle gehalten, zu welchem Zeitpunkt eine Präparation, angereichert mit Trisporsäuren auf eine Endkonzentration von 350 μg/ml zugefügt wird. Die Trisporsäuren werden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gereinigt.
Durch die Zugabe von teilweise gereinigten Trisporsäuren (PTA) erhalten wir einen Anstieg von 0,16 bis 1,09 mg Lycopin pro Gramm Trockengewicht (einen 6,8-fachen Anstieg relativ zur Kontrolle am 6. Tag der Fermentation, 3).
BEISPIEL 4
Wirkung der Addition von teilweise gereinigten Trisporsäuren (PTA) oder ungereinigten Trisporsäuren (NPTA) auf die Fermentation des Mutanten B. trispora ASA25(–) in Mischkultur mit B. trispora ASA2(+).
Das Inokulationsmedium wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Nach Sterilisation werden die Stämme B trispora ASA25(–) und B. trispora ASA2(+) aus Suspensionen von Sporen in getrennten Kolben ausgesät und 48 Stunden bei 25°C inkubiert..
Ein Fermentationsmedium desselben Typs wie in Beispiel 1 beschrieben wird hergestellt. Nach der Sterilisation wird Imidazol auf eine Endkonzentration von 0,75 mg/ml und Phosphatpuffer, pH 7,5, auf eine Endkonzentration von 25 mM zugefügt. Dieses Medium wird mit 10% einer Mischung der Stämme B. trispora ASA25(–) und B. trispora ASA2(+) inokuliert. Die Kolben werden bei 25°C in einer Orbital-Rührvorrichtung bei 250 UPM inkubiert.
Um eine Quelle ungereinigter Trisporsäuren (NPTA) zu erhalten, wird ein Fermentationsmedium derselben Art, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Nach Sterilisation wird eine Mischkultur mit 10% der Stämme B. trispora ASA2(+) und B. trispora ASA25(–) ausgesät, die β-Carotin-Erzeuger sind. Die Kolben werden bei 25°C in einer Orbital-Rührvorrichtung bei 250 UPM inkubiert.
Die Kontrollkolben sind diejenigen, die keine Addition von Trisporsäuren erhalten. Die Gruppe von Kolben, die eine Addition von teilweise gereinigten Trisporsäuren (PTA) erhält, wird bis zum 4. Tag unter denselben Bedingungen wie die Kontrolle gehalten, zu welchem Zeitpunkt Trisporsäuren auf eine Endkonzentration von 350 μg/ml zugefügt werden. Die Trisporsäuren werden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gereinigt. Die Gruppe von Kolben, die eine Addition von ungereinigten Trisporsäuren (NPTA) erhält, wird bis zum 4. Tag unter denselben Bedingungen wie die Kontrolle gehalten und wird dann einen Filtrationsprozess durch einen 20 μm Nylonfilter unterzogen, was es ermöglicht, das Mycel der Stämme B. trispora ASA25(–) und B. trispora ASA2(+) aus dem Kulturmedium abzutrennen, wo sie in Gegenwart von Imidazol wuchsen. Parallel wird eine Abtrennung von Mycel und Kulturmedium durch einen 20 μm Nylonfilter bewirkt, jedoch in diesem Fall bei Kolben, die die beiden Stämme B. trispora ASA2(+) und B. trispora ASA25(–) enthalten, unter Produktionsbedingungen von β-Carotin, deren Kulturmedium als ungereinigte Quelle von Trisporsäuren (NPTA) angesehen wird. Nach Abschluss der Abtrennung von Mycel und Kulturmedium wird das Mycel der Stämme B. trispora ASA25(–) und ASA2(+), gezüchtet mit Imidazol, mit dem Kulturmedium derselben Stämme, gezüchtet in Abwesenheit von Imidazol, vermischt. Imidazol wird dem Kulturmedium zugefügt, betrachtet als ungereinigte Quelle von Trisporsäuren (NPTA), um eine Endkonzentration von 0,75 mg/ml zu erhalten. Diese Kolben werden bei 25°C und 250 UPM inkubiert.
Durch die Zugabe von teilweise gereinigten Trisporsäuren (PTA) erhalten wir einen Anstieg von 29,14 auf 43,58 mg Lycopin pro Gramm Trockengewicht (ein 50%iger Anstieg relativ zu der Kontrolle am 6. Tag der Fermentation, 3) und durch Addition von Kulturmedium von β-Carotin erhielten wir einen Anstieg von 29,14 auf 41,07 mg Lycopin pro Gramm Trockengewicht (ein 41%iger Anstieg relativ zur Kontrolle am 6. Tag der Fermentation, 4). Dieses Beispiel zeigt, dass die Wirkung der Trisporsäuren unabhängig von ihrem Reinigungsgrad ist.
BEISPIEL 5
Wirkung der Addition von Trisporsäuren auf die Fermentation des Mutanten B. trispora SB34(–) in Mischkultur mit B. trispora ASA2(+)
Das Inokulationsmedium wird auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Nach Sterilisation werden die Stämme B. trispora SB34(–) und B. trispora ASA2(+) aus Suspensionen von Sporen in getrennten Kolben ausgesät und bei 25°C für 48 Stunden inkubiert.
Ein Fermentationsmedium derselben Art wie in Beispiel 1 wird hergestellt und nach Sterilisation wird mit 10% einer Mischung der Stämme B. trispora SB34(–) und B. trispora ASA2(+) inokuliert. Die Kolben werden bei 25°C in einer Orbital-Rührvorrichtung bei 250 UPM inkubiert.
Die Kontrollkolben sind diejenigen, die keine Addition von Trisporsäuren erhalten. Die Gruppe von Kolben, die eine Addition von Trisporsäuren erhält wird bis zum 4. Tag unter denselben Bedingungen wie die Kontrolle gehalten, zu welchem Zeitpunkt eine Präparation, angereichert mit Trisporsäuren auf eine Endkonzentration von 350 μg/ml zugefügt wird. Die Trisporsäuren werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt.
Die Addition einer mit Trisporsäuren angereicherten Präparation hat keine signifikante Wirkung auf die Produktion von Lycopin, wenn die Fermentation des Mutanten SB34(–) in Mischkultur durchgeführt wird (5).
BEISPIEL 6
Analyse des Anteils von Carotinoiden in Mischfermentationen der Stämme B. trispora SB34(–) oder B. trispora ASA25(–) mit B. trispora ASA2(+).
Das Inokulationsmedium wird wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Nach Sterilisation werden die Stämme B. trispora SB34(–), B. trispora ASA25(–) und B. trispora ASA2(+) aus Suspensionen von Sporen in getrennte Kolben ausgesät und bei 25°C für 48 Stunden inkubiert.
Ein Fermentationsmedium derselben Art wie in Beispiel 1 beschrieben wird hergestellt. Nach dem Sterilisieren wird dieses Medium auf zwei Gruppen verteilt. Eine Gruppe von Kolben wird mit 10% einer Mischung der Stämme B. trispora SB34(–) und B. trispora ASA2(+) inokuliert. Der anderen Gruppe von Kolben wird nach Sterilisieren Imidazol auf eine Endkonzentration von 0,75 mg/ml zugefügt und Phosphatpuffer, pH 7,5, auf eine Endkonzentration von 25 mM. Dieses Medium wird mit 10% einer Mischung der Stämme B. trispora ASA25(–) und B. trispora ASA2(+) inokuliert. Alle Kolben werden bei 25°C in einer Orbital-Rührvorrichtung bei 250 UPM inkubiert.
Die Kontrollkolben sind diejenigen, die keine Addition von Trisporsäuren erhalten. Die Gruppe von Kolben, die eine Addition von Trisporsäuren erhält wird bis zum 4. Tag unter denselben Bedingungen wie die Kontrolle gehalten, zu welchem Zeitpunkt eine Präparation, angereichert mit Trisporsäuren auf eine Endkonzentration von 350 μg/ml zugefügt wird. Die Trisporsäuren werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt.
Proben werden von den Kulturen am 5. und 6. Tag der Fermentation für eine Analyse des Anteils an Carotinoiden durch Flüssigchromatographie (HPLC) entnommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE 1 Prozentsatz der Carotinoide am 5. und 6. Fermentationstag in Mischkultur der Stämme B. trispora SB34(–) oder ASA25(–) mit B. trispora ASA2(+)
Die Analyse des Prozentsatzes an Carotinoiden, erhalten bei der Fermentation von Lycopin unter Verwendung einer Mischkultur der Stämme B. trispora SB34(–) oder B. trispora ASA25(–) mit B. trispora ASA2(+) zeigt einen signifikanten Unterschied in dem Prozentsatz von Lycopin und β-Carotin (Tabelle 1). Diese Unterschiede sind unabhängig von der Zugabe von Trisporsäuren. Die Mischung von Carotinoiden, die am 6. Tag durch Fermentation mit B. trispora SB34(–) erhalten wird, weist 63% Lycopin auf, während die mit B. trispora ASA25(–) erhaltene 88% aufweist (was ein Produkt ergibt, das 25% reiner ist). In derselben Mischung ist der Anteil an β-Carotin in der Fermentation mit B. trispora SB34(–) 10-fach höher als bei B. trispora ASA25(–).
Da β-Carotin der Vorläufer der Trisporsäuren ist, könnten diese Daten folgendes erklären:

1. Der Unterschied in der Konzentration von Trisporsäuren zwischen einer Fermentation von β-Carotin und einer Fermentation von Lycopin (Beispiel 1).
2. Die Tatsache, dass die Addition von Trisporsäuren (gereinigt oder ungereinigt) einen Anstieg zwischen 40 und 50% des Lycopin-Ertrags am 6. Tag der Fermentation in Mischkultur ergibt, wenn B. trispora ASA25(–) als negativer Stamm verwendet wird, dessen Mischungen von Carotinoiden nur 2% β-Carotin enthalten (Beispiele 4 und 6).
3. Die Tatsache, dass die Addition von Trisporsäuren keine Wirkung auf die Mischkultur hat, wenn B. trispora SB34(–) als negativer Stamm verwendet wird, dessen Mischung von Carotinoiden mehr als 20% β-Carotin enthält (Beispiele 5 und 6).

Dies Ergebnisse demonstrieren, dass die Wirkung der Trisporsäuren auf die Fermentation von Lycopin in Mischkulturen auf die Abwesenheit eines Vorläufers für ihre Biosynthese zurückzuführen ist. Das ist der Grund, warum ihre Verwendung bei der industriellen Produktion von Lycopin mit hoher Reinheit besonders vorteilhaft ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 Konzentration von Trisporsäuren im Verlauf der Fermentation von β-Carotin und Lycopin. Eine Mischkultur der Stämme B. trispora ASA25(–) und B. trispora ASA2(+) wird in beiden Fermentationen verwendet. Bei der Fermentation von Lycopin (Quadrate) wird ein chemisches Mittel, das die Anhäufung von Lycopin unterstützt, in diesem Fall Pyridin, dem Kulturmedium zugefügt. Die Fermentation von β-Carotin (Diamanten) wird unter denselben Bedingungen, jedoch ohne Pyridin, durchgeführt. Abszisse: Zeit in Tagen. Ordinate: Konzentration an Trisporsäuren (μg/ml).
2 Produktion von Lycopin durch den mutierten Stamm B. trispora SB34(–) blockiert in seiner Synthese von β-Carotin auf dem Lycopin-Niveau, mit und ohne Addition von Trisporsäuren. Die Werte für den Lycopin-Ertrag, erhalten in einer Kontrollfermentation ohne Addition von Trisporsäuren sind durch Diamanten angegeben. Die Wirkung der Addition von teilweise gereinigten Trisporsäuren (PTA) am 4. Tag der Fermentation auf den Ertrag von Lycopin werden durch Quadrate angegeben. Die Werte zeigen den Durchschnitt von zwei unabhängigen Proben. Die Fehlerstangen repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelpunkt. Abszisse: Zeit in Tagen. Ordinate: mg Lycopin/g Trockengewicht.
3 Erzeugung von Lycopin durch den mutierten Stamm B. trispora ASA25(–), Übererzeuger von β-Carotin, mit und ohne Zugabe von Trisporsäuren. Das Fermentationsmedium ist mit Imidazol versetzt, um die Anhäufung von Lycopin zu unterstützen. Die Werte für den Lycopin-Ertrag, erhalten in einer Kontrollfermentation ohne Addition von Trisporsäuren sind durch Diamanten repräsentiert. Die Wirkung der Addition von teilweise gereinigten Trisporsäuren (PTA) am 4. Tag der Fermentation auf den Ertrag von Lycopin werden durch Quadrate angegeben. Die Werte repräsentieren das Mittel von zwei unabhängigen Proben. Die Fehlerstangen repräsentieren die Standardabweichung vom Mittel. Abszisse: Zeit in Tagen. Ordinate: mg Lycopin/g Trockengewicht.
4 Produktion von Lycopin in Mischkultur der mutierten Stämme, Übererzeuger von β-Carotin, B. trispora ASA25(–) und B. trispora ASA2(+), mit und ohne Addition von Trisporsäuren. Das Fermentationsmedium ist mit Imidazol versetzt, um die Anhäufung von Lycopin zu unterstützen. Die Werte für den Lycopin Ertrag, erhalten in einer Kontrollfermentation ohne Addition von Trisporsäuren sind durch Diamanten repräsentiert. Die Wirkung der Addition von teilweise gereinigten Trisporsäuren (PTA) am 4. Tag der Fermentation auf den Ertrag von Lycopin werden durch Quadrate angegeben. Der Ertrag von Lycopin, erhalten durch Addition von ungereinigten Trisporsäuren (NPTA) am 4. Tag der Fermentation wird durch Kreise repräsentiert. Die Werte repräsentieren das Mittel von zwei unabhängigen Proben. Die Fehlerstangen repräsentieren die Standardabweichung vom Mittel. Abszisse: Zeit in Tagen. Ordinate: mg Lycopin/g Trockengewicht.
5 Produktion von Lycopin in Mischkultur von den Stämmen B. trispora SB34(–) und B. trispora ASA2(+), mit und ohne Addition von Trisporsäuren. Die Werte für den Lycopin-Ertrag, erhalten in einer Kontrollfermentation ohne Addition von Trisporsäuren sind durch Diamanten repräsentiert. Die Wirkung der Addition von teilweise gereinigten Trisporsäuren (PTA) am 4. Tag der Fermentation auf den Ertrag von Lycopin werden durch Quadrate angegeben. Die Werte repräsentieren das Mittel von zwei unabhängigen Proben. Die Fehlerstangen repräsentieren die Standardabweichung vom Mittel. Abszisse: Zeit in Tagen. Ordinate: mg Lycopin/g Trockengewicht.

Claims

Methode für die Herstellung von Lycopen durch Gärung von (+) und (–)-Stämmen von Mucoralespilzkulturen unter Bedingungen, die die Produktion von β-Karoten verhindern, dadurch gekennzeichnet, dass irgendwann während der Gärung Dreisporensäuren hinzugegeben werden und das Lycopen zurückgewonnen wird.
Methode entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem für die Gärung benutzten Mucoralespilz um Blakeslea trispora handelt.
Methode entsprechend irgendeinem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultur verwandt wird, die einen mutierenden Stamm von B. trispora enthält, dessen β-Karotenbiosynthesekapazität wegen der Mutation vollkommen oder teilweise blockiert ist und Lycopen anhäuft.
Methode entsprechende Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass irgendwann während der Gärung ein β-Karotenbiosyntheseverzögerer zu der Kultur gegeben wird, um die Anhäufung von Lycopen anzuregen.
Methode entsprechend irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Hinzufügen von Dreisporensäuren so durchgeführt wird, dass ihre erreichte Konzentration zwischen 0,001 und 1000 mg/ml schwankt.
Methode entsprechend irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe der Dreisporensäuren 72 bis 144 Stunden nach dem Gärungsbeginn erfolgt.
Methode entsprechend irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hinzugegebenen Dreisporensäuren teilweise gereinigt sind.
Methode entsprechend irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Dreisporensäuren ungereinigt, vorzugsweise aus einem von einer β-Karotengärung wiedergewonnenen Kulturmittel, hinzugefügt werden.