CN1252276C - 生产番茄红素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种获得类胡萝卜素的新方法，特别是由布拉霉获得类胡萝卜素的新方法。本发明公开了一种发酵方法，其基于三孢酸的加入能够提高番茄红素的产率。该方法在单独的或混合的培养物中，从野生菌株或其突变体起进行。三孢酸的加入可在发酵开始或发酵过程中进行，其起始物可以是部分纯化的制剂或是其非纯化的来源。
Description
发明领域
本发明涉及由布拉霉(Blakeslea)类毛霉属真菌浸没培养物起生产类胡萝卜素，特别是番茄红素的新方法。公开了一种发酵方法，通过加入富集三孢酸的提取物，可提高番茄红素的产率。该方法由野生菌株或其突变体起，在单一的或混合的培养液中进行。三孢酸可在发酵开始时或发酵过程中加入。
背景技术
类胡萝卜素是一类在水果和蔬菜中大量存在的化合物，由于其具有作为抗氧剂和维生素A前体的性质，所以是广泛研究的主题。番茄红素，除了其抗氧剂性能外，可抑制心血管疾病和某些类型的癌症如前列腺癌和胃肠癌，并且可控制生长(Stahl W.and Sies，H.1996.Arch.Biochem.Biophys.336：1-9；Clinton，SK.1998.Nutr.Rev.56：35-51).由于它们具有由黄到红的颜色，类胡萝卜素也可在人造黄油、黄油、色拉油、汤和酱油中用作食品添加剂和着色剂(Ninet L.and Renaut J.1979.In：Peppler HJ.，Perman D.(eds.).Microbial Technology，2nd ed.，Vol.1Academic Press，NY，p.529-544).
番茄红素是一种类胡萝卜素，其是在β-胡萝卜素(GB 1034944和GB1114043)和叶黄素的生物合成过程中作为中间体生产的。
番茄红素制剂得自番茄(专利PCT WO 97/48287，EP 608027)，或通过如Phycomyces，Blakeslea和Choanephora的毛霉属真菌发酵制得(PatentsGB 1008469，US 3097146，US 3369974，JP 73016189，JP 73016190和RU2102416)。
专利GB 1008469和US 3097146描述了三孢布拉霉(Blakesleatrispora)真菌的发酵方法，该方法包括pH维持在7.0以上，最高为9.5的培养介质。培育7天后，每100ml介质得到9.97mg番茄红素。
日本专利JP 73016189和JP 73016190描述了用诸如Phycomyces，Blakeslea和Choanephora的毛霉菌目真菌发酵的方法，向其中加入叔胺以抑制β-胡萝卜素的形成和促进番茄红素的累积。下面列举叔胺的实例：对二甲氨乙基苯酚；2-二甲氨基-乙醇；3-二甲氨基-1-丙醇；1-二甲氨基-2-丙醇；2-二甲氨基-乙醇；3-二乙氨基-1-丙醇；1-二乙氨基-2-丙醇；三乙胺；2-二异丙基氨基-乙醇；3-二异丙基氨基-1-丙醇；1-二异丙基氨基-2-丙醇；2-二正丙基氨基-乙醇；3-二正丙基氨基-1-丙醇；1-二正丙基氨基-2-丙醇；2-二甲氨基乙苯；2-二乙氨基乙苯；对-(2-二乙基氨基乙基)苯酚。专利RU 2102416描述了加入氨甲基吡啶和烟草残渣可引起番茄红素的累积。除上述专利描述的物质外，本发明描述了能够在番茄红素阶段中断类胡萝卜素合成的其它含氮杂环碱的应用，例如烟碱(日本专利JP09313167)，咪唑，吡啶，吗啉，喹啉和某些取代衍生物(美国专利3369974；Ninet L.，Renaut J.1979.In：Peppler HJ，Perlman D(eds.).MicrobialTechnology，2nd Ed.，Vol.1Academic Press，NY，p.529-544)。
不需加入叔胺就能够累积番茄红素的三孢布拉霉的突变体也有描述(Mehta B.and Cerdá-Olmedo E.1995.Appl.Microbial.Biotechnol.42：836-838)。
在任何使用三孢布拉霉(B.Trispora)真菌生产β-胡萝卜素的方法中，使用混合的真菌培养物与分别使用(+)和(-)菌株的培养物相比，可以得到更高产率的β-胡萝卜素(Ciegler，A.1965.Advances in Applied Microbiology7：1-34；Plempel，M.1965.Planta 65：225-231；Sutter，RP.and Rafelson，ME.1968.J.Bacteriology 95：426-432)。在混合培养物中β-胡萝卜素产率的提高与被称作β因子或三孢酸的酸性化合物体系的产生有关。(Caglioti L.，Cainelli G.，Camerino B.，Mondelli R.，Prieto A.，Quilico A.，Salvatori T.，Selva A.1966.Tetrahedron Supplement 7：175-187)。据认为，三孢酸是诸如三孢布拉霉，Phycomyces blakesleanus和Mucor mucedo的毛霉菌目真菌中的性激素，因为除了刺激β-胡萝卜素的生产外，它们还刺激接合枝的形成(van den Ende，H.1968.J.Bacteriology 96：1298-1303；Austin DJ.，Bu’Lock JD.，Gooday G.W.1969.Nature 223：1178-1179；Reschke，T.1969.Tetrahedron Letters 29：3435-3439；van den Ende H.，Wiechmann AHCA.，Reyngoud DJ.，Hendricks T.1970.J.Bacteriology 101：423-428)。
在化学上，三孢酸是被氧化的1，1，3-三甲基-2-(3-甲基辛基)环己烷的不饱和衍生物。所述化合物的分类为在二萜类或类胡萝卜素降解中形成或产生的倍半萜类。三孢酸的特征在于其是三种物质的混合物：三孢酸A，B和C，也称作β1，β2和β3因子(因为它们可刺激β-胡萝卜素的合成)。三孢酸C是最丰富的，并且发现其在三孢布拉霉的混合培养物中存在80％(Caglioti，L.，Cainelli，G.，Camerino，B.，Mondelli，R.，Prieto，A.，Quilico，A.，Salvatori，T.，Selva，A.1966.Tetrahedron Supplement 7：175-187)。
该三孢酸是由(+)菌株和(-)菌株制备的β-胡萝卜素合成的。β-胡萝卜素通过视黄醛代谢为4-氢三孢醇。该化合物通过(+)菌株代谢为4-二氢三孢酸和其甲酯，并通过(-)菌株将4-氢三孢醇转化为三孢醇。这两种中间体仅在介质中扩散到达异性菌株之后才转化为三孢酸(Reviewby Gooday GW.and Carlile MJ.1997.Mycologist 11：26-30)。也就是说，根据上述流程图，(-)菌株生产通过(+)菌株转化为三孢酸的中间体，反之亦然。
得自三孢布拉霉的混合培养物的三孢酸，可用来提高在使用分离的菌株的培养物中的β-胡萝卜素的产率。例如，加入21.8单位的β因子，可使得自(-)菌株的β-胡萝卜素的产率提高422％，使得自(+)菌株的产率提高71％。但是，在相同量的β因子条件下，每单位β因子在(-)菌株的培养物中对胡萝卜素形成作用的刺激仅为在混合培养物中产生的胡萝卜素形成作用的20-30％(Sutter RP.and Rafelson ME.1968.J.Bacteriology 95：426-432)。
三孢酸可通过各种方法纯化，例如Sutter，R.1970.Science 168：1590-1592 or Sutter RP.，Capage DA.，Harrison TL.，Keen WA.1973.J.Bacteriology 114：1074-1082中描述的那些方法。
目前还不知道，通过加入三孢酸提高番茄红素产率的正面影响是否已被公开。番茄红素的生产是基于抑制番茄红素环化酶活性进行的，导致发酵液中β-胡萝卜素的含量较低，其中所述环化酶将番茄红素转化为β-胡萝卜素。三孢酸，是诱导胡萝卜素形成作用的性激素，可由β-胡萝卜素合成。由于在生产β-胡萝卜素的混合介质中(如在实施例5和6中SB34(-)与ASA2(+)突变体的情况下)，加入三孢酸没有作用，所以缺少前体(β-胡萝卜素)可抑制所述激素的形成，并且通过三孢酸的作用可提高番茄红素的产率。
发明详述
本发明的目的是提高类胡萝卜素，特别是番茄红素的产率，所述类胡萝卜素是在用毛霉菌目真菌(Blakeslea，Choanephora或Phycomyces)的发酵方法中，更准确地说是在三孢布拉霉中生产的。本发明包括在发酵介质中培养真菌三孢布拉霉，和加入来自某些其它来源(例如来自生产β-胡萝卜素的介质)的部分纯化(PTA)和未经纯化(NPTA)的三孢酸(或β因子)。
三孢酸对番茄红素发酵的作用是基于所述的激素是由β-胡萝卜素合成得到的，所述β-胡萝卜素是在番茄红素发酵中不能形成的一种化合物。在这些条件下，真菌没有用于合成所述激素的前体，不能最大程度地诱导胡萝卜素形成作用。
用于发酵的有机体可以是毛霉菌目真菌的经分离的菌株或(+)和(-)菌株，更具体而言是三孢布拉霉，或者是能够累积番茄红素的三孢布拉霉的突变体。在本发明的发酵方法中可以使用真菌的(+)和(-)菌株的各种混合物。当使用β-胡萝卜素的生产者三孢布拉霉菌株时，加入能够在番茄红素阶段中断胡萝卜素形成作用的化合物(例如，叔胺和其它前述物质)。当使用能中断番茄红素到类胡萝卜素的生物合成的突变体时，将不需要加入叔胺和相关化合物。在上述两种情况中的任一种情况下，加入来自某些来源(例如来自得自β-胡萝卜素发酵的培养介质)的部分纯化(PTA)和未经纯化(NPTA)的三孢酸，并且在这两种情况下加入的浓度都大约为0.35mg/ml。术语NPTA对应于β-胡萝卜素介质。三孢酸在所述介质中的浓度可根据图1的培育天数的函数计算出来(在第4天将为350-400μg/ml)。
从毛霉菌目真菌生产类胡萝卜素的方法，更具体而言，用选自三孢布拉霉的菌株或突变体生产番茄红素的方法，可在任何含有一种或多种碳源、一种或多种氮源、矿物盐和硫胺的培养介质中进行。碳源可以以简单的或复杂的营养物形式加入，并且包括碳水化合物或脂肪，例如糊精，淀粉，葡萄糖，蔗糖，果糖，动物或植物油。培养介质还应当含有可同化的氮源，有机或无机的，例如大豆粉，玉米粉，可溶的蒸馏物，酵母萃取物，棉籽粉，胨，干酪素，硫酸铵等。可加入到培养介质中的矿物盐包括磷酸盐，硫酸盐，氯化物，钠盐，钾盐，铵盐，钙盐和镁盐。根据微生物的生长需要和生产水平来确定营养物的比例。发酵优选是在有氧条件下和浸没的培养物中进行。发酵温度可在20～32℃之间改变，尽管优选25～28℃。
加入部分纯化制备的或任何来源(例如任何毛霉属真菌的β-胡萝卜素发酵得到的培养介质)的浓度为0.001-1000mg/ml的三孢酸可起作用。优选在发酵开始起的72-144h之间加入。
番茄红素可用任何已公开的用于细胞碎裂的方法进行萃取，所述方法可释放细胞内含物，这些内含物溶解在任何可溶的溶剂中。其浓度可通过分光光度测定法确定，但优选使用液相色谱法(HPLC)，采用任何在参考资料中所述的方法。
所使用的菌株如下：突变体，其是β-胡萝卜素的生产者：ASA2(+)和ASA25(-)。突变体，其是番茄红素的生产者：SB34(-)。后面提到的突变体也产生25％β-胡萝卜素(见表1)。从有效提高胡萝卜素产率的观点出发，由于三孢酸本身的原因，突变体的选择是不相关的。即，该结果是由于所述化合物在任何其它类似的突变体菌株中将能再生，尽管这将使番茄红素的基础产率降低，例如如使用母体菌株所出现的情况。该母体菌株存放在保藏机构，能够存活并且公众可获得。
实施例1
β-胡萝卜素和番茄红素发酵过程中三孢酸浓度的确定
制备一种接种介质，每升含有：23g大豆粉；47g玉米粉；0.5g磷酸二氢钾；0.002g盐酸硫胺素。其初始pH值为6.3。将该介质以67或100ml分配在500ml锥形烧瓶中。消毒后，在各烧瓶中分别接种来自孢子悬浮液的菌株三孢布拉霉ASA2(+)和三孢布拉霉ASA25(-)，并在25℃培育48h。
通过使用NTG进行突变，由存放在俄罗斯莫斯科工业微生物收藏中心(VKM)的野生菌株三孢布拉霉F208(-)和F117(+)得到突变菌株三孢布拉霉ASA2(+)和三孢布拉霉ASA25(-)，其中的两种起始物是公众可获得的。
制备一种碱性发酵介质，每升含有：44g大豆粉；19g玉米粉；0.55g二代磷酸盐；0.002g盐酸硫胺素；10％的植物油。用氢氧化钾将其初始pH值调到7.5。将该介质以20ml分配在250ml锥形烧瓶中。
对于β-胡萝卜素的发酵，烧瓶用含有10％的菌株三孢布拉霉ASA2(+)和三孢布拉霉ASA25(-)混合培养物的基本介质接种。对于番茄红素的发酵，向基本介质中加入能在番茄红素阶段中断生物合成路线的化学试剂，例如2ml/l吡啶。用10％菌株三孢布拉霉ASA2(+)和三孢布拉霉ASA25(-)的混合培养物对该介质进行接种。所有烧瓶在250rpm的定轨搅拌器中，于25℃进行培育。从发酵的第二天起，每隔24h进行取样，以确定生产β-胡萝卜素的烧瓶中和生产番茄红素的烧瓶中的三孢酸的浓度。
在将样品的pH值酸化到2后，通过用1体积的氯仿进行萃取来确定三孢酸的浓度。有机部分用1体积4％的碳酸氢钠溶液萃取，收集水相并酸化，然后用氯仿再萃取一次。随后蒸发氯仿至干，将由三孢酸构成的残余物溶解在乙醇或三硫酸盐缓冲液中。通过在325nm处的吸收光谱来确定三孢酸的数量，假定吸收率为70ml×mg-1×cm-1(Sutter RP.，Capage DA.，Harrison TL.，Keen WA.1973.J.Bacteriology 114：1074-1082)。
结果发现，在β-胡萝卜素和番茄红素发酵过程中三孢酸的浓度是不同的，后者明显较低。发现在第4天差别最大，在β-胡萝卜素发酵液中三孢酸的浓度为378μg/ml，在番茄红素发酵液中三孢酸的浓度为46μg/ml(大约8倍的差别)(图1)。
实施例2
加入三孢酸对在累积番茄红素的β-胡萝卜素的生物合成中部分中断的突变体的发酵的影响
如实施例1所述制备接种介质。消毒后，接种来自孢子悬浮液的菌株三孢布拉霉SB34(-)，并在25℃培育48h。
通过用NTG进行突变，由存放在俄罗斯莫斯科工业微生物收藏中心VKM的、公众可获得的野生菌株三孢布拉霉F921(-)得到突变菌株三孢布拉霉SB34(-)。
如实施例1所述，制备相同类型的发酵介质。消毒后，对一系列烧瓶接种10％的菌株三孢布拉霉SB34(-)，其特征在于其在累积番茄红素的β-胡萝卜素的生物合成中是部分中断的突变体。所有烧瓶在250rpm的定轨搅拌器中，于25℃进行培育。
对照烧瓶中不加三孢酸。将准备加入三孢酸的烧瓶组在与对照样相同的条件下保存到第4天，然后向其中加入如实施例1所述进行纯化的富集三孢酸的制剂，至最终浓度为350μg/ml。
随着部分纯化的三孢酸(PTA)的加入，每克干重中番茄红素的量由0.11增加到0.24mg(相对于在发酵第6天的对照样增加2.18倍，图2)。
实施例3
加入三孢酸对具有β-胡萝卜素产生的突变体的番茄红素的的发酵的影响，该生物合成在番茄红素阶段被化学试剂中断
按照实施例1所述的方式制备接种介质。消毒后，接种来自孢子悬浮液的菌株三孢布拉霉ASA25(-)，并在25℃培育48h。
如实施例1所述，制备相同类型的发酵介质。消毒后，加入能在番茄红素阶段中断类胡萝卜素生物合成的化学试剂，例如咪唑，至最终浓度为0.75mg/ml。该介质用pH为7.5的磷酸盐缓冲液补充至最终浓度为25mM，并接种10％的菌株三孢布拉霉ASA25(-)。烧瓶在250rpm的定轨搅拌器中，于25℃进行培育。
对照烧瓶中不加三孢酸。将准备加入三孢酸的烧瓶组在与对照样相同的条件下保存到第4天，然后加入富集三孢酸的制剂至最终浓度为350μg/ml。三孢酸按照实施例1所述的同样方式进行纯化。
随着部分纯化的三孢酸(PTA)的加入，每克干重中番茄红素的量由0.16增加到1.09mg(相对于在发酵第6天的对照样增加6.8倍，图3)。
实施例4
部分纯化的三孢酸(PTA)或未纯化的三孢酸(NPTA)的加入，对三孢布拉霉ASA2(+)的混合培养物中的突变体三孢布拉霉A5A25(-)发酵的影响
如实施例1所述制备接种介质。消毒后，分别在各烧瓶中接种来自孢子悬浮液的菌株三孢布拉霉ASA25(-)和三孢布拉霉ASA2(+)，并在25℃培育48h。
如实施例1所述，制备相同类型的发酵介质。消毒后，加入咪唑至最终浓度为0.75mg/ml，和pH为7.5的磷酸盐缓冲液至最终浓度为25mM。该介质接种10％的菌株三孢布拉霉ASA25(-)和三孢布拉霉ASA2(+)。烧瓶在250rpm的定轨搅拌器中，于25℃进行培育。
为得到未纯化的三孢酸(NPTA)源，如实施例1所述，制备相同类型的发酵介质。消毒后，混合培养物用10％的菌株三孢布拉霉ASA2(+)和三孢布拉霉ASA25(-)接种，后者是β-胡萝卜素的生产者。烧瓶在250rpm的定轨搅拌器中，于25℃进行培育。
对照烧瓶中不加三孢酸。将准备加入部分纯化的三孢酸(PTA)的烧瓶组在与对照样相同的条件下保存到第4天，然后向其中加入三孢酸至最终浓度为350μg/ml。该三孢酸按照如实施例1所述的同样方式进行纯化。将准备加入未纯化三孢酸(PTA)的烧瓶组在与对照样相同的条件下保存到第4天，然后通过20μm的尼龙过滤器进行过滤，通过过滤可从培养介质中分离菌株三孢布拉霉ASA25(-)和三孢布拉霉ASA2(+)的菌丝体，在培养介质中它们在咪唑存在的条件下可生长。同样地，用20μm的尼龙过滤器分离菌丝体和培养介质也是有效的，但在含有两种菌株三孢布拉霉ASA2(+)和三孢布拉霉ASA25(-)的烧瓶中，在生产β-胡萝卜素的条件下，这些培养介质被认为是未纯化的三孢酸的来源(NPTA)。在完成菌丝体和培养介质分离时，用咪唑生长的菌株三孢布拉霉ASA25(-)和ASA2(+)的菌丝体，与在没有咪唑的条件下生长的相同菌株的培养介质进行混合。向被认为是未纯化的三孢酸(NPTA)来源的培养介质中加入咪唑，得到最终浓度为0.75mg/ml。这些烧瓶在25℃和250rpm下培育。
随着部分纯化的三孢酸(PTA)的加入，每克干重中番茄红素的量由29.14增加到43.58mg(相对于在发酵第6天的对照样增加50％，图3)，而通过加入β-胡萝卜素的培养介质，每克干重中番茄红素的量由29.14增加到41.07mg(相对于在发酵第6天的对照样增加41％，图4)。该实施例表明，三孢酸的作用不取决于它们的纯度。
实施例5
三孢酸的加入对三孢布拉霉ASA2(+)的混合培养物中的突变体三孢布拉霉SB34(-)发酵的影响
按照实施例1所述的方式制备接种介质。消毒后，分别在各烧瓶中接种来自孢子悬浮液的菌株三孢布拉霉SB34(-)和三孢布拉霉ASA2(+)，并在25℃培育48h。
如实施例1所述，制备相同类型的发酵介质。消毒后，用10％的菌株三孢布拉霉SB34(-)和三孢布拉霉ASA2(+)的混合物接种。该烧瓶在250rpm的定轨搅拌器中，于25℃进行培育。
对照烧瓶中不加三孢酸。将准备加入三孢酸的烧瓶组在与对照样相同的条件下保存到第4天，然后向其中加入富集三孢酸的制剂至最终浓度为350μg/ml。三孢酸按照如实施例1所述的同样方式进行纯化。
当在混合培养物中进行突变体SB34(-)的发酵时，加入富集三孢酸的制剂对番茄红素的生产没有明显作用(图5)。
实施例6
分析菌株三孢布拉霉SB34(-)或三孢布拉霉A5A25(-)与三孢布拉霉ASA2(+)的混合发酵液中的类胡萝卜素的比例
如实施例1所述制备接种介质。消毒后，分别在各烧瓶中接种来自孢子悬浮液的菌株三孢布拉霉SB34(-)，三孢布拉霉ASA25(-)和三孢布拉霉ASA2(+)，并在25℃培育48h。
如实施例1所述，制备相同类型的发酵介质。消毒后，将该介质分为两组。一组烧瓶用10％的菌株三孢布拉霉SB34(-)和三孢布拉霉ASA2(+)的混合物接种。另一组烧瓶在消毒后，向其中加入咪唑至最终浓度为0.75mg/ml，并加入pH为7.5的磷酸盐缓冲液至最终浓度为25mM。该介质接种10％的菌株三孢布拉霉ASA25(-)和三孢布拉霉ASA2(+)。所有烧瓶在250rpm的定轨搅拌器中，于25℃进行培育。
对照烧瓶中不加三孢酸。将准备加入三孢酸的烧瓶组在与对照样相同的条件下保存到第4天，然后向其中加入富集三孢酸的制剂至最终浓度为350μg/ml。三孢酸按照如实施例1所述的同样方式进行纯化。
在发酵的第5天和第6天从培养物中取样，用液相色谱法(HPLC)分析类胡萝卜素的比例。所得结果列于表1中。
表1.在发酵第5天和第6天，类胡萝卜素在菌株三孢布拉霉SB34(-)或三孢布拉霉A5A25(-)与三孢布拉霉ASA2(+)的混合培养物中的百分比
| 菌株 | 三孢酸 | 天数 | 链孢红素(％) | 番茄红素(％) | γ-胡萝卜素(％) | β-胡萝卜素(％) |
| SB34(-)xASA2(+) | 无 | 第5天 | 3 | 57 | 16 | 25 |
| SB34(-)xASA2(+) | 无 | 第6天 | 3 | 64 | 12 | 21 |
| SB34(-)xASA2(+) | 有 | 第5天 | 3 | 55 | 15 | 28 |
| SB34(-)xASA2(+) | 有 | 第6天 | 2 | 62 | 12 | 23 |
| ASA25(-)xASA2(+) | 无 | 第5天 | 1 | 88 | 9 | 2 |
| ASA25(-)xASA2(+) | 无 | 第6天 | 1 | 89 | 8 | 2 |
| ASA25(-)xASA2(+) | 有 | 第5天 | 1 | 85 | 10 | 3 |
| ASA25(-)xASA2(+) | 有 | 第6天 | 1 | 88 | 9 | 2 |
采用菌株三孢布拉霉SB34(-)或三孢布拉霉A5A25(-)与三孢布拉霉ASA2(+)的混合培养物，在番茄红素发酵液中得到的类胡萝卜素的百分比的分析结果表明，番茄红素和β-胡萝卜素的百分比有明显不同(表1)。这些不同不取决于三孢酸的加入。在用三孢布拉霉SB34(-)发酵第6天得到的类胡萝卜素的混合物中含有63％的番茄红素，而用三孢布拉霉ASA25(-)得到的混合物中含有88％的番茄红素(得到的产物纯度提高25％)。在相同的混合物中，使用三孢布拉霉SB34(-)的发酵液中的β-胡萝卜素的比例是使用三孢布拉霉ASA2S(-)的10倍。
因为β-胡萝卜素是三孢酸的前体，这些数据能够说明：
1.三孢酸浓度在β-胡萝卜素发酵和番茄红素发酵之间的区别(实施例1)。
2.当使用三孢布拉霉ASA25(-)作为负菌株时，加入三孢酸(纯化或未纯化的)可使在混合培养物中发酵第6天时番茄红素的产率提高40％-50％，该类胡萝卜素的混合物中仅含有2％β-胡萝卜素(实施例4和6)。
3.当使用三孢布拉霉SB34(-)作为负菌株时，加入三孢酸对混合培养物没有影响，该类胡萝卜素混合物含有超过20％的β-胡萝卜素(实施例5和6)。
这些结果表明，在混合培养物中三孢酸对番茄红素发酵的影响是由于缺少用于其生物合成的前体。这就是在高纯度番茄红素的工业化生产中使用三孢酸是非常有利的原因。
附图详述
图1.在β-胡萝卜素发酵和番茄红素发酵过程中三孢酸的浓度。在这两种发酵中均使用菌株三孢布拉霉ASA25(-)和三孢布拉霉ASA2(+)的混合培养物。在番茄红素发酵时(正方形)，向混合培养介质中加入促进番茄红素累积的化学试剂，在这种情况下为吡啶。β-胡萝卜素的发酵(菱形)在相同条件下进行，但不加吡啶。横坐标：以天计的时间。纵坐标：三孢酸的浓度(μg/ml)。
图2.采用在番茄红素阶段中断β-胡萝卜素合成的突变菌株三孢布拉霉SB34(-)，在加入或不加三孢酸的条件下生产番茄红素。在不加三孢酸的对照发酵液中得到的番茄红素的产率值用菱形表示。在发酵第4天加入部分纯化的三孢酸(PTA)对番茄红素产率的影响用正方形表示。这些值表示两个独立的样品的平均值。误差条线表示平均值的标准偏差。横坐标：以天计的时间。纵坐标：mg番茄红素/g干重。
图3.采用突变菌种三孢布拉霉ASA25(-)，β-胡萝卜素的超生产者(overproducer)，在加入和不加三孢酸的条件下生产番茄红素。用咪唑补充发酵介质以促进番茄红素的累积。在不加三孢酸的对照发酵液中得到的番茄红素的产率值用菱形表示。在发酵第4天加入部分纯化的三孢酸(PTA)对番茄红素产率的影响用正方形表示。这些值表示两个独立的样品的平均值。误差条线表示平均值的标准偏差。横坐标：以天计的时间。纵坐标：mg番茄红素/g干重。
图4.在突变菌株，β-胡萝卜素的超生产者(overproducer)，三孢布拉霉ASA25(-)和三孢布拉霉ASA2(+)的混合培养物中，在加入或不加三孢酸的条件下生产番茄红素。用咪唑补充发酵介质以促进番茄红素的累积。在不加三孢酸的对照发酵液中得到的番茄红素的产率值用菱形表示。在发酵第4天加入部分纯化的三孢酸(PTA)对番茄红素产率的影响用正方形表示。在发酵第4天通过加入未纯化的三孢酸(PTA)得到的番茄红素的产率用圆形表示。这些值表示两个独立的样品的平均值。误差条线表示平均值的标准偏差。横坐标：以天计的时间。纵坐标：mg番茄红素/g干重。
图5.在菌株三孢布拉霉SB34(-)和三孢布拉霉ASA2(+)的混合培养物中，在加入或不加三孢酸的条件下生产番茄红素。在不加三孢酸的对照发酵液中得到的番茄红素的产率值用菱形表示。在发酵第4天加入部分纯化的三孢酸(PTA)对番茄红素产率的影响用正方形表示。这些值表示两个独立的样品的平均值。误差条线表示平均值的标准偏差。横坐标：以天计的时间。纵坐标：mg番茄红素/g干重。
Claims (9)
1.在抑制β-胡萝卜素生产的条件下，通过三孢布拉霉培养物发酵生产番茄红素的方法，其特征在于在发酵过程的任何时候加入三孢酸，并且回收产生的番茄红素。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于使用的混合培养物含有三孢布拉霉的(+)和(-)菌株。
3.根据权利要求1或2中任何一个的方法，其特征在于使用的培养物含有三孢布拉霉的突变菌株，由于生物物种的突变其生物合成β-胡萝卜素的能力被完全或部分中断，这样能够累积番茄红素。
4.根据权利要求1或2中任何一个的方法，其特征在于在发酵过程的任何时候向培养物中加入β-胡萝卜素的生物合成抑制剂，以诱导番茄红素的累积。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于以这样的方式加入三孢酸，使其最终浓度在0.001-1000mg/ml之间。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于向培养物中加入三孢酸是在发酵开始起的72-144h之间进行的。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于加入的三孢酸是部分纯化的。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于加入的三孢酸是未经纯化的。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于从β-胡萝卜素发酵液中回收的培养介质。
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