ES2252009T3 - Metodo de produccion de licopeno. - Google Patents
Metodo de produccion de licopeno.Info
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Abstract
Procedimiento para la producción de licopeno. La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la obtención de carotenoides, especialmente como Blakeslea. Se describe un método de fermentación que permite obtener un incremento en la producción de licopeno, basado en la adición de ácidos trispóricos. El proceso se lleva a cabo a partir de estirpes silvestres o mutantes de las mismas, en cultivo simple o mixto. La adición de ácidos trispóricos puede hacerse al inicio de la fermentación o durante la misma y su origen puede ser una preparación parcialmente purificada o una fuente no purificada de los mismos.
Description
Método de producción de licopeno.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para la producción de carotenoides, especialmente
licopeno, a partir de cultivos sumergidos de hongos mucorales tipo
Blakeslea. Se describe un método de fermentación mediante el
cual es posible obtener un incremento en la producción de licopeno,
basado en la adición de extractos enriquecidos en ácidos
trispóricos. El proceso se lleva a cabo a partir de estirpes
silvestres, o mutantes de las mismas, en cultivo simple o mixto. La
adición de ácidos trispóricos puede hacerse al inicio de la
fermentación o durante la misma.
Los carotenoides son compuestos abundantes en
frutas y vegetales, y han sido sujeto de numerosos estudios debido a
sus propiedades como antioxidantes y como precursores de vitamina A.
El licopeno, además de su propiedad antioxidante, previene las
enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer como el
cáncer de próstata y el cáncer gastrointestinal y actúa en el
control del crecimiento (Stahl W. y Sies, H. 1996. Arch. Biochem.
Biophys. 336:1-9; Clinton, SK. 1998. Nutr. Rev.
56:35-51). Los carotenoides, debido a su coloración
amarilla a roja, son utilizados también como suplemento y colorante
alimenticio de margarina, mantequilla, aceites para ensaladas,
sopas y salsas (Ninet L. y Renaut J. 1979. En: Peppler HJ., Perlman
D. (eds). Microbial Technology, 2ª Edn., Vol. 1 Academic Press, NY,
pp. 529-544).
El licopeno es un carotenoide que se produce como
intermediario en la ruta biosintética de
\beta-caroteno (patentes GB 1034944 y GB 1114043)
y xantofilas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las preparaciones de licopeno se obtienen a
partir de tomate (Patentes PCT WO 97/48287, EP 608027), o mediante
la fermentación de hongos mucorales como Phycomyces,
Blakeslea y Choanephora (Patentes GB 1008469, US
3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190 y RU 2102416).
Las patentes GB 1008469 y US 3097146 describen un
método de fermentación del hongo Blakeslea trispora que
consiste en un medio de cultivo cuyo pH se mantiene por encima de
7,0 y hasta 9,5. Después de siete días de incubación se obtienen
9,97 mg de licopeno por cada 100 ml de medio.
Las patentes japonesas JP 73016189 Y JP 73016190
describen un método de fermentación con hongos mucorales como
Phycomyces, Blakeslea y Choanephora, en el cual
se adicionan aminas terciarias para impedir la formación de
\beta-caroteno y favorecer la acumulación de
licopeno. Como ejemplo de aminas terciarias se citan las siguientes:
hordenina, 2-dimetilamino-etanol;
3-dimetilamino-1-propanol;
1-dimetilamino-2-propanol;
2-dietilamino-etanol;
3-dietilamino-1-propanol;
1-dietilamino-2-propanol;
trietilamina;
2-diisopropilamino-etanol;
3-diisopropilamino-1-propanol;
1-diisopropilamino-2-propanol;
2-di-n-propilamino-etanol;
3-di-n-propilamino-1-propanol;
1-di-n-propilamino-2-propanol;
2-dimetilaminoetilbenceno;
2-dietilaminoetilbenceno;
p-(2-dietilaminoetil)fenol. La patente RU
2102416 describe la adición de aminometilpiridinas y restos de
tabaco para inducir la acumulación de licopeno. Además de las
sustancias descritas en dichas patentes, se ha descrito el uso de
otras bases nitrogenadas heterocíclicas capaces de bloquear la
síntesis de carotenoides a nivel del licopeno, como nicotina
(Patente japonesa JP 09313167), imidazol, piridina, morfolina,
quinolina y algunos derivados sustituidos (Patente US 3369974; Ninet
L., Renaut J. 1979. En: Peppler HJ, Perlman D (eds.). Microbial
Technology, 2ª Edn., Vol. 1 Academic Press, NY, pp.
529-544).
Se han descrito también mutantes de B.
trispora que acumulan licopeno sin la necesidad de adicionar
aminas terciarias (Mehta B. y Cerdá-Olmedo E. 1995. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 42:836-838).
En cualquiera de los métodos de producción de
\beta-caroteno con el hongo B. trispora se
utilizan cultivos mixtos del hongo, como resultado de lo cual se
obtienen rendimientos de \beta-caroteno muy
superiores a los encontrados en las estirpes (+) y (-) por separado
(Ciegler, A. 1965. Advances in Applied Microbiology
7:1-34; Plempel, M. 1965. Planta
65:225-231; Sutter, RP. y Rafelson, ME. 1968. J.
Bacteriology 95:426-432). El incremento de
producción de \beta-caroteno en cultivos mixtos
está correlacionado con la producción de una familia de compuestos
ácidos denominados factor \beta o ácidos trispóricos. (Caglioti
L., Cainelli G., Camerino B., Mondelli R., Prieto A., Quilico A.,
Salvatori T, Selva A. 1966. Tetrahedron Supplement
7:175-187). Se ha propuesto que los ácidos
trispóricos son hormonas sexuales en hongos mucorales como B.
trispora, Phycomyces blakesleanus y Mucor mucedo,
ya que además de estimular la producción de
\beta-caroteno, estimulan la formación de
zigóforos (van den Ende, H. 1968. J. Bacteriology
96:1298-1303; Austin DJ., Bu’Lock JD., Gooday G.W.
1969. Nature 223:1178-1179; Reschke, T. 1969.
Tetrahedron Letters 29:3435-3439; van den Ende H.,
Wiechmann AHCA., Reyngoud DJ., Hendricks T. 1970. J. Bacteriology
101:423-428).
Químicamente, los ácidos trispóricos son
derivados oxidados e insaturados de
1,1,3-trimetil-2-(3-metiloctil)ciclohexano.
Dichos compuestos pueden ser clasificados como sesquiterpenos
elaborados o productos de la degradación de diterpenos o
carotenoides. Los ácidos trispóricos han sido caracterizados como
una mezcla de tres sustancias: ácido trispórico A, B y C, también
denominados factor \beta_{1}, \beta_{2} y \beta_{3} (debido a
que estimulan la síntesis de
\beta-caroteno)_{.} El más abundante es
el ácido trispórico C, que se encuentra presente en un 80% en
cultivos mixtos de B. trispora (Caglioti, L., Cainelli, G.,
Camerino, B., Mondelli, R., Prieto, A., Quilico, A., Salvatori, T,
Selva, A. 1966. Tetrahedron Supplement
7:175-187).
Los ácidos trispóricos se sintetizan a partir de
\beta-caroteno producido tanto por la estirpe (+)
como por la estirpe (-). El \beta-caroteno es
metabolizado vía retinal en 4-hidrotrisporol. Este
compuesto es metabolizado por la estirpe (+) en ácido
4-dihidrotrispórico y en su metil éster, y la
estirpe (-) convierte el 4-hidrotrisporol en
trisporol. Estos dos intermediarios son convertidos en ácido
trispórico sólo después de difundir en el medio hasta la estirpe del
sexo opuesto (Recopilado por Gooday GW. y Carlile MJ. 1997.
Mycologist 11:26-30). Es decir, la estirpe (-)
produce los intermediarios que son convertidos en ácido trispórico
por la estirpe (+) y viceversa, según el esquema anterior.
Los ácidos trispóricos obtenidos a partir de
cultivos mixtos de B. trispora pueden utilizarse para
incrementar la producción de \beta-caroteno en
cultivos con estirpes independientes. Por ejemplo, la adición de
21,8 unidades de factor b incrementa un 422% el rendimiento de
\beta-caroteno de la estirpe (-) y un 71% el
rendimiento de la estirpe (+). Sin embargo, la estimulación de la
carotenogénesis por unidad de factor \beta en cultivos de estirpe
(-) fue sólo un 20-30% de la carotenogénesis
producida en cultivos mixtos y con cantidades similares de factor
\beta. (Sutter RP. y Rafelson ME. 1968. J. Bacteriology
95:426-432).
La purificación de ácidos trispóricos puede
realizarse por diversos métodos, tales como los descritos por
Sutter, R. 1970. Science 168:1590-1592 ó Sutter RP.,
Capage DA., Harrison TL., Keen WA. 1973. J. Bacteriology
114:1074-1082.
No se conoce que se haya descrito un efecto
positivo de incremento del rendimiento de licopeno mediante la
adición de ácidos trispóricos. La producción de licopeno se basa en
suprimir la actividad licopeno ciclasa que convierte licopeno en
\beta-caroteno, lo que trae como consecuencia
bajos niveles de \beta-caroteno en la
fermentación. Los ácidos trispóricos, que son las hormonas sexuales
que inducen la carotenogénesis, se sintetizan a partir de
\beta-caroteno. Es por tanto, la ausencia de
precursor (\beta-caroteno) la que inhibe la
formación de dichas hormonas y la que permite incrementar la
producción de licopeno mediante el uso de ácidos trispóricos, ya que
en cultivos mixtos que producen \beta-caroteno
(como en el caso del mutante SB34(-) con ASA2(+) de los ejemplos 5 y
6), la adición de ácidos trispóricos no tiene ningún efecto.
El objeto de la presente invención pretende
incrementar la producción de carotenoides, especialmente de
licopeno, en un proceso de fermentación con hongos mucorales
(Blakeslea, Choanephora o Phycomyces), más
específicamente en B. trispora. La invención consiste en
cultivar el hongo B. trispora en un medio de fermentación y
adicionar ácidos trispóricos (o factor \beta) parcialmente
purificados (PTA) o bien no purificados (NPTA) de cualquier otra
fuente, como por ejemplo, de un medio para la producción de
\beta-caroteno.
El efecto de los ácidos trispóricos sobre la
fermentación de licopeno se fundamenta en el hecho de que dichas
hormonas son sintetizadas a partir de
\beta-caroteno, compuesto que no puede formarse en
la fermentación de licopeno. En estas condiciones el hongo carece de
precursor para la síntesis de dichas hormonas y la carotenogénesis
no está inducida en su grado máximo.
Los organismos utilizados para la fermentación
pueden ser estirpes aisladas o una mezcla de las estirpes (+) y (-)
de hongos mucorales, más específicamente B. trispora, o
alternativamente mutantes de B. trispora capaces de acumular
licopeno. Varias mezclas de estirpe (+) y (-) del hongo pueden ser
utilizadas en el proceso de fermentación de esta invención. En el
caso de utilizar estirpes de B. trispora que son productoras
de \beta-caroteno, se adicionan compuestos que son
capaces de bloquear la carotenogénesis a nivel de licopeno (por
ejemplo aminas terciarias y otros citados anteriormente). En el caso
de utilizar mutantes bloqueados en la biosíntesis de carotenoides a
partir de licopeno, no será necesaria la adición de aminas
terciarias y compuestos relacionados. En cualquiera de los dos casos
citados, los ácidos trispóricos se adicionan parcialmente
purificados (PTA) o no purificados (NPTA) a partir de alguna fuente
de los mismos, como por ejemplo a partir de medio de cultivo
procedente de una fermentación de \beta-caroteno,
y en ambos casos en una concentración aproximada de 0,35 mg/ml. El
término NPTA corresponde a un medio de
\beta-caroteno. En la Fig. 1 se pueden calcular,
en función del día de incubación, la concentración en dichos medios
de ácidos trispóricos (al 4º día estaría entre los
350-400 \mug/ml).
El proceso para la producción de carotenoides a
partir de hongos mucorales, y más específicamente de licopeno con
estirpes seleccionadas o mutantes de B. trispora, puede
realizarse en cualquier medio de cultivo que contenga una o más
fuentes de carbono, una o más fuentes de nitrógeno, sales minerales
y tiamina. Las fuentes de carbono se pueden añadir como nutrientes
sencillos o complejos e incluyen carbohidratos o grasas, tales como
dextrinas, almidones, glucosa, sacarosa, fructosa, aceites animales
o vegetales. El medio de cultivo debe llevar también una fuente
asimilable de nitrógeno, orgánico o inorgánico, tal como harina de
soja, harina de maíz, destilados solubles, extracto de levadura,
harina de semilla de algodón, peptona, caseína, sulfato amónico,
etc. Entre las sales minerales que pueden adicionarse al medio de
cultivo se encuentran fosfatos, sulfatos, cloruros, sodio, potasio,
amonio, calcio y magnesio. Las proporciones de los nutrientes se
determinan en base a las necesidades de crecimiento del
microorganismo y a los niveles de producción. La fermentación se
lleva a cabo preferiblemente en condiciones aeróbicas y en cultivo
sumergido. La temperatura de fermentación puede oscilar entre 20 y
32ºC, aunque se prefiere entre 25 y 28ºC.
La adición de ácidos trispóricos en una
concentración que oscila entre 0,001-1000 mg/ml
puede realizarse a partir de una preparación parcialmente purificada
o a partir de cualquier fuente de los mismos, como por ejemplo de
medio de cultivo procedente de una fermentación de
\beta-caroteno de cualquier hongo mucoral. La
adición se realiza preferiblemente entre 72-144 h
del comienzo de la fermentación.
La extracción del licopeno se realiza mediante
cualquier método descrito de ruptura celular que permita liberar el
contenido intracelular, que se disuelve en cualquier disolvente en
el que sea soluble. Su concentración se puede determinar mediante
medida espectrofotométrica, pero se prefiere el uso de cromatografía
líquida (HPLC), mediante cualquiera de los métodos descritos en la
bibliografía.
Las estirpes utilizadas son las siguientes:
Mutantes productores de \beta-caroteno: ASA2(+) y
ASA25(-). Mutante productor de licopeno SB34(-). Este último mutante
produce también un 25% de \beta-caroteno (ver
Tabla 1). La selección de los mutantes es irrelevante desde el punto
de vista del efecto de incremento de la producción de caroteno
debido a los ácidos trispóricos per se. Es decir, el efecto
debido a dichos compuestos sería reproducible en cualquier otra cepa
mutante análoga, aunque tuviera una menor producción basal de
licopeno, como ocurre con las cepas parentales, por ejemplo. Las
cepas parentales están depositadas en una colección y son viables y
accesibles al público.
Se prepara un medio de inóculo que contiene por
litro: harina de soja, 23 g; harina de maíz, 47 g; fosfato
monopotásico 0,5 g; hidrocloruro de tiamina, 0,002 g. Su pH inicial
es de 6,3. El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 500 ml a
razón de 67 ó 100 ml. Después de esterilizar, se siembran a partir
de suspensiones de esporas las estirpes B. trispora ASA2(+) y
B. trispora ASA25(-) en matraces separados y se incuban a
25ºC durante 48 horas.
Las estirpes mutantes B. trispora ASA2(+)
y B. trispora ASA25(-) se obtienen por mutación con NTG a
partir de las estirpes silvestres de B. trispora F208(-) y
F117(+) depositadas en la Colección de Microorganismos Industriales
(VKM), sita en Moscú, Rusia, siendo ambas cepas accesibles al
público.
Se prepara un medio base de fermentación que
contiene por litro: harina de soja, 44 g; harina de maíz, 19 g;
fosfato dibásico 0,55 g; hidrocloruro de tiamina, 0,002 g; aceite
vegetal 10%. Su pH inicial se ajusta a 7,5 con hidróxido potásico.
El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 250 ml a razón de 20
ml.
Para la fermentación de
\beta-caroteno se inoculan matraces que contienen
medio base con un 10% de un cultivo mixto de las estirpes B.
trispora ASA2(+) y B. trispora ASA25(-). Para la
fermentación de licopeno se añade al medio base un agente químico
con el fin de bloquear la ruta biosintética a nivel del licopeno,
como por ejemplo 2 ml/l de piridina. Este medio se inocula con un
10% de un cultivo mixto de las estirpes B. trispora ASA2(+) y
B. trispora ASA25(-). Todos los matraces se incuban a 25ºC en
un agitador orbital a 250 rpm. A partir del segundo día de
fermentación se toma una muestra cada 24 horas y se determina la
concentración de ácidos trispóricos en matraces productores de
\beta-caroteno y en matraces productores de
licopeno.
La determinación de la concentración de ácidos
trispóricos se lleva a cabo mediante la extracción con un volumen de
cloroformo después de acidificar la muestra a pH 2. La fracción
orgánica se extrae con un volumen de una solución de bicarbonato
sódico al 4%, se recoge la fase acuosa, que se acidifica para
extraerla nuevamente con cloroformo. Posteriormente el cloroformo es
evaporado hasta sequedad y el residuo constituido por ácidos
trispóricos se disuelve en etanol o tampón
Tris-sulfato. Los ácidos trispóricos se cuantifican
mediante espectrometría de absorción a 325 nm, asumiendo una
absortividad de 70 ml x mg^{-1} x cm^{-1} (Sutter RP., Capage
DA., Harrison TL., Keen WA. 1973. J. Bacteriology
114:1074-1082).
La concentración de ácidos trispóricos resultó
ser diferente a lo largo de la fermentación de
\beta-caroteno y de licopeno, siendo
significativamente inferior en esta última. La máxima diferencia se
encontró al 4º día, con una concentración de 378 \mug/ml en la
fermentación de \beta-caroteno y de 46 \mug/ml
en la fermentación de licopeno (una diferencia de 8 veces
aproximadamente) (Fig. 1).
El medio de inóculo se prepara del modo descrito
en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se siembra a partir de una
suspensión de esporas la estirpe B. trispora SB34(-) y se
incuba a 25ºC durante 48 horas.
La estirpe mutante B. trispora SB34(-) se
obtuvo por mutación con NTG a partir de la estirpe silvestre B.
trispora F921(-) depositada en la colección de cultivos VKM,
Moscú, Rusia y accesible al público.
Se prepara un medio de fermentación del mismo
tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar se
inocula una serie de matraces con un 10% de la estirpe B.
trispora SB34(-), que se caracteriza por ser un mutante
bloqueado parcialmente en la biosíntesis de
\beta-caroteno de forma que acumula licopeno.
Todos los matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250
rpm.
Los matraces control son aquellos que no reciben
adición de ácidos trispóricos. El grupo de matraces que recibe
adición de ácidos trispóricos se mantiene en las mismas condiciones
que el control hasta el 4º día, en que se adiciona una preparación
enriquecida en ácidos trispóricos, purificada como se describe en el
Ejemplo 1, a una concentración final de 350 \mug/ml.
Con la adición de ácidos trispóricos parcialmente
purificados (PTA) se consigue un incremento de 0,11 a 0,24 mg de
licopeno por gramo de peso seco (un incremento de 2,18 veces con
respecto al control al 6º día de fermentación, Fig. 2).
El medio de inóculo se prepara del modo descrito
en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se siembra a partir de una
suspensión de esporas la estirpe B. trispora ASA25(-) y se
incuba a 25ºC durante 48 horas.
Se prepara un medio de fermentación del mismo
tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se
añade un agente químico que bloquea la biosíntesis de carotenoides a
nivel del licopeno, como por ejemplo imidazol a una concentración
final de 0,75 mg/ml. Este medio se suplementa también con tampón
fosfato de pH 7,5 a una concentración final de 25 mM y se inocula
con un 10% de la estirpe B. trispora ASA25(-). Los matraces
se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm.
Los matraces control son aquellos que no reciben
adición de ácidos trispóricos. El grupo de matraces que recibe
adición de ácidos trispóricos se mantiene en las mismas condiciones
que el control hasta el 4º día, en que se adiciona una preparación
enriquecida en ácidos trispóricos a una concentración final de 350
\mug/ml. La purificación de ácidos trispóricos se realiza del
mismo modo descrito en el Ejemplo 1.
Con la adición de ácidos trispóricos parcialmente
purificados (PTA) se consigue un incremento de 0,16 a 1,09 mg de
licopeno por gramo de peso seco (un incremento de 6,8 veces con
respecto al control al 6º día de fermentación, Fig. 3).
El medio de inóculo se realiza del modo descrito
en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se siembran a partir de
suspensiones de esporas las estirpes B. trispora ASA25(-) y
B. trispora ASA2(+) en matraces separados y se incuban a 25ºC
durante 48 horas.
Se prepara un medio de fermentación del mismo
tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se
añade imidazol a una concentración final de 0,75 mg/ml y tampón
fosfato de pH 7,5 a una concentración final de 25 mM. Este medio se
inocula con un 10% de una mezcla de las estirpes B. trispora
ASA25(-) y B. trispora ASA2(+). Los matraces se incuban a
25ºC en un agitador orbital a 250 rpm.
Para la obtención de una fuente de ácidos
trispóricos no purificados (NPTA) se prepara un medio de
fermentación del mismo tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después
de esterilizar se siembra un cultivo mixto con un 10% de las
estirpes B. trispora ASA2(+) y B. trispora ASA25(-),
que son productoras de \beta-caroteno. Los
matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm.
Los matraces control son aquellos que no reciben
adición de ácidos trispóricos. El grupo de matraces que recibe
adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA), se
mantiene en las mismas condiciones que el control hasta el día 4º,
en que se adicionan ácidos trispóricos a una concentración final de
350 \mug/ml. La purificación de ácidos trispóricos se realiza del
mismo modo descrito en el Ejemplo 1. El grupo de matraces que recibe
la adición de ácidos trispóricos no purificados (NPTA) se mantiene
en las mismas condiciones que el control hasta el 4º día, para ser
luego sometido a un proceso de filtración a través de un filtro de
nylon de 20 mm que permite separar el micelio de las estirpes B.
trispora ASA25(-) y B. trispora ASA2(+) del medio de
cultivo donde han crecido en presencia de imidazol. Paralelamente se
realiza la separación de micelio y medio de cultivo a través de un
filtro de nylon de 20 \mum, pero en este caso de matraces que
contienen las dos estirpes B. trispora ASA2(+) y B.
trispora ASA25(-), en condiciones de producción de
\beta-caroteno, cuyo medio de cultivo es
considerado una fuente no purificada de ácidos trispóricos (NPTA).
Finalizada la separación de micelio y medio de cultivo, se mezcla el
micelio de las estirpes B. trispora ASA25(-) y ASA2(+)
crecidas con imidazol, con el medio de cultivo de las mismas
estirpes crecidas en ausencia de imidazol. Al medio de cultivo
considerado como una fuente no purificada de ácidos trispóricos
(NPTA) se le añade imidazol para obtener una concentración final de
0,75 mg/ml. Estos matraces se incuban a 25ºC y 250 rpm.
Con la adición de ácidos trispóricos parcialmente
purificados (PTA) se consigue un incremento de 29,14 a 43,58 mg de
licopeno por gramo de peso seco (un incremento del 50% con respecto
al control al 6º día de fermentación, Fig. 3) y mediante la adición
de medio de cultivo de \beta-caroteno se consigue
un incremento de 29,14 a 41,07 mg de licopeno por gramo de peso seco
(un incremento del 41% con respecto al control al 6º día de
fermentación, Fig. 4). Este ejemplo demuestra que el efecto de los
ácidos trispóricos es independiente de su grado de purificación.
El medio de inóculo se prepara del modo descrito
en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se siembran a partir de
suspensiones de esporas las estirpes B. trispora SB34(-) y
B. trispora ASA2(+) en matraces separados y se incuban a 25ºC
durante 48 horas.
Se prepara un medio de fermentación del mismo
tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar se
inocula con un 10% de una mezcla de las estirpes B. trispora
SB34(-) y B. trispora ASA2(+). Los matraces se incuban a 25ºC
en un agitador orbital a 250 rpm.
Los matraces control son aquellos que no reciben
adición de ácidos trispóricos. El grupo de matraces que recibe
adición de ácidos trispóricos se mantiene en las mismas condiciones
que el control hasta el 4º día, en que se adiciona una preparación
enriquecida en ácidos trispóricos a una concentración final de 350
\mug/ml. La purificación de ácidos trispóricos se realiza del
mismo modo descrito en el Ejemplo 1.
La adición de una preparación enriquecida en
ácidos trispóricos no tiene efecto significativo sobre la producción
de licopeno cuando la fermentación del mutante SB34(-) se realiza en
cultivo mixto (Fig. 5).
El medio de inóculo se prepara del modo descrito
en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se siembran a partir de
suspensiones de esporas las estirpes B. trispora SB34(-),
B. trispora ASA25(-) y B. trispora ASA2(+) en matraces
separados y se incuban a 25ºC durante 48 horas.
Se prepara un medio de fermentación del mismo
tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, este
medio se divide en dos grupos. Un grupo de matraces se inocula con
un 10% de una mezcla de las estirpes B. trispora SB34(-) y
B. trispora ASA2(+). Al otro grupo de matraces, después de
esterilizar, se añade imidazol a una concentración final de 0,75
mg/ml y tampón fosfato de pH 7,5 a una concentración final de 25 mM.
Este medio se inocula con un 10% de una mezcla de las estirpes B.
trispora ASA25(-) y B. trispora ASA2(+). Todos los
matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm.
Los matraces control son aquellos que no llevan
adición de ácidos trispóricos. El grupo de matraces que recibe
adición de ácidos trispóricos se mantiene en las mismas condiciones
que el control hasta el 4º día, en que se adiciona una preparación
enriquecida en ácidos trispóricos a una concentración final de 350
\mug/ml. La purificación de ácidos trispóricos se realiza del
mismo modo descrito en el Ejemplo 1.
Se recogen muestra de los cultivos al 5º y 6º día
de fermentación con el fin de analizar la proporción de carotenoides
mediante cromatografía líquida (HPLC). Los resultados obtenidos se
muestran en la Tabla 1.
| Estirpes | Ácidos trispóricos | Día | Neurosporeno | Licopeno | \gamma-caroteno | \beta-caroteno |
| (%) | (%) | (%) | (%) | |||
| SB34(-)xASA2(+) | No | 5º | 3 | 57 | 16 | 25 |
| SB34(-)xASA2(+) | No | 6º | 3 | 64 | 12 | 21 |
| SB34(-)xASA2(+) | Sí | 5º | 3 | 55 | 15 | 28 |
| SB34(-)xASA2(+) | Sí | 6º | 2 | 62 | 12 | 23 |
| ASA25(-)xASA2(+) | No | 5º | 1 | 88 | 9 | 2 |
| ASA25(-)xASA2(+) | No | 6º | 1 | 89 | 8 | 2 |
| ASA25(-)xASA2(+) | Sí | 5º | 1 | 85 | 10 | 3 |
| ASA25(-)xASA2(+) | Si | 6º | 1 | 88 | 9 | 2 |
El análisis del porcentaje de carotenoides
obtenido en la fermentación de licopeno utilizando un cultivo mixto
de las estirpes B. trispora SB34(-) o B. trispora
ASA25(-) con B. trispora ASA2(+) muestra una diferencia
significativa en el porcentaje de licopeno y
\beta-caroteno (Tabla 1). Dichas diferencias son
independientes de la adición de ácidos trispóricos. La mezcla de
carotenoides obtenida al 6º día mediante fermentación con B.
trispora SB34(-) tiene un 63% de licopeno, mientras que la
obtenida con B. trispora ASA25(-) posee un 88% (rindiendo un
producto que es un 25% más puro). En la misma mezcla, la proporción
de \beta-caroteno es 10 veces superior en la
fermentación con B. trispora SB34(-) que con B.
trispora ASA25(-).
Dado que el \beta-caroteno es
el precursor de los ácidos trispóricos, estos datos podrían
explicar:
- 1.
- La diferencia de concentración de ácidos trispóricos entre una fermentación de \beta-caroteno y una fermentación de licopeno (Ejemplo 1).
- 2.
- El hecho de que la adición de ácidos trispóricos (purificados o no purificados) incremente entre un 40 y 50% el rendimiento de licopeno al 6º día de fermentación en cultivo mixto cuando se usa como estirpe negativa B. trispora ASA25(-), cuya mezcla de carotenoides contiene sólo un 2% de \beta-caroteno (Ejemplos 4 y 6).
- 3.
- El hecho de que la adición de ácidos trispóricos no tenga ningún efecto sobre el cultivo mixto cuando se usa como estirpe negativa B. trispora SB34(-), cuya mezcla de carotenoides contiene más de un 20% de \beta-caroteno (Ejemplos 5 y 6).
Estos resultados demuestran que el efecto de los
ácidos trispóricos sobre la fermentación de licopeno en cultivos
mixtos se debe a la ausencia de precursor para su biosíntesis. De
ahí que su utilización en la producción industrial de licopeno de
alta pureza sea altamente ventajosa.
Fig. 1. Concentración de ácidos trispóricos a lo
largo de una fermentación de \beta-caroteno y una
fermentación de licopeno. En ambas fermentaciones se utiliza un
cultivo mixto de las estirpes B. trispora ASA25(-) y B.
trispora ASA2(+). En la fermentación de licopeno (cuadrados) se
adiciona al medio de cultivo un agente químico que favorece la
acumulación de licopeno, en este caso piridina. La fermentación de
\beta-caroteno (rombos) se lleva a cabo en las
mismas condiciones pero sin piridina. Abscisas: tiempo en días.
Ordenadas: concentración de ácidos trispóricos (\mug/ml).
Fig. 2. Producción de licopeno por la estirpe
mutante B. trispora SB34(-), bloqueada en la síntesis de
\beta-caroteno a nivel de licopeno, con y sin
adición de ácidos trispóricos. Los valores de producción de licopeno
obtenidos en una fermentación control sin adición de ácidos
trispóricos se representan mediante rombos. El efecto de la adición
de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA) al 4º día de
fermentación sobre la producción de licopeno se indica con
cuadrados. Los valores representan la media de dos muestras
independientes. Las barras de error representan la desviación
estándar del promedio. Abscisas: tiempo en días. Ordenadas: mg
licopeno/g peso seco.
Fig. 3. Producción de licopeno por la estirpe
mutante B. trispora ASA25(-), superproductora de
\beta-caroteno, con y sin adición de ácidos
trispóricos. El medio de fermentación se suplementa con imidazol
para favorecer la acumulación de licopeno. Los valores de producción
de licopeno obtenidos en una fermentación control sin adición de
ácidos trispóricos se representan mediante rombos. El efecto de la
adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA) al 4º
día de fermentación sobre la producción de licopeno se indica con
cuadrados. Los valores representan la media de dos muestras
independientes. Las barras de error representan la desviación
estándar del promedio. Abscisas: tiempo en días. Ordenadas: mg
licopeno/g peso seco.
Fig. 4. Producción de licopeno en cultivo mixto
de las estirpes mutantes superproductoras de
\beta-caroteno B. trispora ASA25(-) y B.
trispora ASA2(+), con y sin adición de ácidos trispóricos. El
medio de fermentación se suplementa con imidazol para favorecer la
acumulación de licopeno. Los valores de producción de licopeno
obtenidos en una fermentación control sin adición de ácidos
trispóricos se representan mediante rombos. El efecto de la adición
de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA) al 4º día de
fermentación sobre la producción de licopeno se indica con
cuadrados. La producción de licopeno obtenida mediante adición de
ácidos trispóricos no purificados (NPTA) al 4º día de fermentación
se representa mediante círculos. Los valores representan la media de
dos muestras independientes. Las barras de error representan la
desviación estándar del promedio. Abscisas: tiempo en días.
Ordenadas: mg licopeno/g peso seco.
Fig. 5. Producción de licopeno en cultivo mixto
de las estirpes B. trispora SB34(-) y B. trispora
ASA2(+), con y sin adición de ácidos trispóricos. Los valores de
producción de licopeno obtenidos en una fermentación control sin
adición de ácidos trispóricos se representan mediante rombos. El
efecto de la adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados
(PTA) al 4º día de fermentación sobre la producción de licopeno se
indica con cuadrados. Los valores representan la media de dos
muestras independientes. Las barras de error representan la
desviación estándar del promedio. Abscisas: tiempo en días.
Ordenadas: mg licopeno/g peso seco.
Claims (8)
1. Un procedimiento de producción de licopeno por
fermentación de estirpes (+) y (-) de hongos mucorales en
condiciones inhibitorias para producir
\beta-caroteno, caracterizado porque se
adicionan ácidos trispóricos en cualquier momento durante la
fermentación y se recupera el licopeno producido.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el hongo mucoral utilizado en la
fermentación es Blakeslea trispora.
3. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por utilizarse un
cultivo que contiene una estirpe mutante de B. trispora cuya
capacidad de biosíntesis de \beta-caroteno está
total o parcialmente bloqueada, debido a la mutación, y que acumula
licopeno.
4. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por adicionarse al
cultivo, en cualquier momento de la fermentación, un inhibidor de la
biosíntesis de \beta-caroteno, para inducir la
acumulación de licopeno.
5. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la adición
de ácidos trispóricos se realiza de forma que se alcance una
concentración de los mismos que oscile entre 0,001 y 1000 mg/ml.
6. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la adición
de ácidos trispóricos al cultivo se produce entre 72 y 144 h del
inicio de la fermentación.
7. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los ácidos
trispóricos se añaden parcialmente purificados.
8. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los ácidos
trispóricos se añaden sin purificar, preferentemente a partir de un
medio de cultivo recuperado de una fermentación de
\beta-caroteno.
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