ES2336199T3 - Blakeslea trispora productora de un rendimiento elegvado de licopeno en un medio adecuado en ausencia de un inhibidor exogeno de la carotenogenesis. - Google Patents
Blakeslea trispora productora de un rendimiento elegvado de licopeno en un medio adecuado en ausencia de un inhibidor exogeno de la carotenogenesis. Download PDFInfo
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Abstract
Una cepa VKPM F-822 de Blakeslea trispora, en donde la cepa produce al menos 0,3 g/l de licopeno, cuando se co-cultiva durante al menos 3 días con una cepa adecuada de Blakeslea trispora del tipo de acoplamiento opuesto en un medio adecuado en ausencia de un inhibidor exógeno de la carotenogénesis específico.
Description
Blakeslea trispora productora de un
rendimiento elevado de licopeno en un medio adecuado en ausencia de
un inhibidor exógeno de la carotenogénesis.
La invención se refiere a la cepa de
Blakeslea trispora (B. trispora) VKPM
F-822, productora de licopeno en un medio adecuado
en ausencia de un inhibidor exógeno de la carotenogénesis, a un
proceso natural y deficiente de producción de licopeno por estas
cepas, a un medio sumamente adecuado para este proceso y a un
proceso de aislamiento adecuado para cualquier compuesto
carotenoide, preferiblemente para licopeno.
El licopeno es un carotenoide rojo, que se
encuentra a niveles bajos en muchos organismos, siendo un precursor
biosintético de la mayoría de los carotenoides encontrados en la
naturaleza. Sin embargo, son raras las fuentes que contienen
niveles altos de este colorante natural. Entre tanto, existe un
interés comercial creciente en este compuesto debido a sus
propiedades antioxidantes y otras propiedades potencialmente
ventajosas.
En el momento actual, se conocen varios métodos
para la producción de licopeno. El primer método es una síntesis
química (Meyer (2002), Chemie in unserer Zeit 36(3):
178-192). El método químico tiene el inconveniente
de no proporcionar un producto que se perciba como natural. Un
segundo método es la extracción a partir de los tomates (WO
97/48287 o EP 608027). La extracción a partir de las plantas es un
proceso muy costoso debido a la baja concentración de licopeno en
el fruto del tomate.
El licopeno puede producirse también por
fermentación de B. trispora. B. trispora ha sido
utilizada para la producción de \beta-caroteno
desde finales de los años 1950. El primer intento de la producción
de licopeno por fermentación se describe en la patente EE.UU.
3097146. En dicho documento, se reivindica que en condiciones de
fermentación favorables específicas, se produce licopeno por B.
trispora, prácticamente con exclusión de otros carotenoides.
Sin embargo, no se describe claramente cuáles serían estas
condiciones específicas, aparte de un valor de pH de cultivo que es
mayor que 5,6 a todo lo largo de la fermentación. El rendimiento de
licopeno es muy bajo, con un nivel máximo de 150 mg/l. No se
presenta dato experimental alguno para respaldar la reivindicación
de que el carotenoide producido es esencialmente licopeno puro.
Enfoques posteriores han utilizado inhibidores
específicos de la carotenogénesis química para evitar la formación
de \beta-caroteno y promover la acumulación de
licopenos. Ejemplos de esta tecnología pueden encontrarse en los
documentos US 3369974, JP 48016189, JP 48016190, JP 73016189, JP
73016190, RU 2102416, JP 09313167 y EE.UU. 3369974. Por este
método, se han alcanzado concentraciones de licopeno hasta 1030
mg/l, produciéndose concomitantemente 205 mg/l de
\beta-caroteno. Hasta ahora, se han testado muchos
compuestos como inhibidores del metabolismo del licopeno, pero no
se ha encontrado compuesto alguno de grado alimentario que sea
eficaz (Mehta & Cerdá-Olmedo (1999). Mycoscience
40:307-310).
Es sabido que podría existir un problema en
relación con la producción de carotenoides cuando se bloquea la
síntesis de \beta-caroteno. La carotenogénesis es
estimulada por ácidos trispóricos, que son hormonas sexuales que se
producen cuando se cultivan juntamente las cepas (+) y (-). Al mismo
tiempo, \beta-caroteno son precursores de los
ácidos trispóricos, y por consiguiente el bloqueo de la producción
de \beta-caroteno equivaldría a una disminución
en la producción de todos los carotenoides. WO 00/77234 expone que
el problema de estimulación de la carotenogénesis en ausencia de
una producción suficiente de \beta-caroteno puede
resolverse por adición de ácidos trispóricos procedentes de una
fuente externa. Esta solicitud describe un proceso para producir
licopeno por fermentación de productores B. trispora de
\beta-caroteno o por mutantes de los mismos que
acumulan licopeno. Mutantes que acumulan licopeno fueron descritos
ya en Mehta B et al. (1995), Appl. Microbiol. Biotechnol.,
42:836-838). Tales mutantes productores de licopeno
se designarán en lo sucesivo como mutantes Mehta. Los mutantes
Mehta se obtenían por mutagénesis y producían un rendimiento bajo de
licopeno, 200 \mug/g de peso seco sin adición de inhibidor alguno
en placas de agar. Mehta llegó a la conclusión de que los mutantes
Mehta son inútiles en aplicaciones biotecnológicas debido a sus
escasos rendimientos de licopeno. En WO 00/77234, la producción de
licopeno por este mutante Mehta era claramente inferior a la
producción obtenida utilizando los productores de
\beta-caroteno y que tenían imidazol añadido como
inhibidor, dado que la producción máxima de licopeno por el mutante
Mehta es aproximadamente 4% del nivel de producción que se obtiene
por utilización de los productores de
\beta-caroteno y el inhibidor en las mismas
condiciones. Aunque no se dan productividades volumétricas, lo que
hace difícil la comparación con la tecnología de la técnica
anterior, suponiendo una producción de biomasa de 50 g/l (que es ya
una estimación alta para cultivos de hongos en matraces de
sacudidas), los autores de la presente invención calculan que puede
haber sido producida por el mutante Mehta una concentración máxima
de aproximadamente 60 mg/l de licopeno. Esta estimación de
producción es todavía menor que la que se ha obtenido anteriormente
en EE.UU. 3097146, arriba
descrita.
descrita.
Por consiguiente, existe todavía necesidad de un
método más eficiente que proporcione rendimiento elevado de
licopeno utilizando un proceso natural de fermentación y
aislamiento. La presente solicitud proporciona dicho método: la
producción de licopeno por una nueva cepa de B. trispora en
un medio microbiológico adecuado, que no contiene inhibidor exógeno
específico alguno de la carotenogénesis, y que contiene únicamente
ingredientes empleados comúnmente en fermentación. Las ventajas de
la cepa de la invención consisten en que la misma hace posible
producir licopeno en un proceso de fermentación, en el cual no está
presente compuesto alguno que pudiera comprometer el carácter
natural del proceso, y no se añade producto alguno que pudiera
comprometer el carácter de grado alimentario del licopeno
producido.
En contraste con los métodos conocidos en la
técnica para producción de licopeno, la presente solicitud
proporciona una producción elevada de licopeno en un medio adecuado
utilizado comúnmente en fermentación, sin adición externa alguna
que inhiba el camino de la carotenogénesis. Esto se consigue por el
uso de un mutante, obtenido por mutagénesis química y selección.
Teniendo en cuenta las características de los mutantes encontrados
previamente por mutagénesis clásica (1995, Appl. Microbiol.
Biotechnol., 42: 836-838), es sumamente sorprendente
que pueda encontrarse un mutante de este tipo.
La invención se refiere en primer lugar a la
cepa VKPM F-822 de Blakeslea trispora, que es
capaz de producir al menos 0,3 g/l de licopeno, cuando se cultiva
juntamente durante al menos tres días con una cepa adecuada de
Blakeslea trispora del tipo de acoplamiento opuesto en un
medio adecuado en ausencia de un inhibidor exógeno de la
carotenogénesis específico. Preferiblemente, se producen al menos
0,5 g/l de licopeno, con preferencia al menos 0,7, preferiblemente
al menos 0,8, más preferiblemente al menos 1,0, muy preferiblemente
al menos 1,2 e incluso más preferiblemente al menos 1,5 g/l. La
cantidad de licopeno producida se mide al final del proceso de
fermen-
tación.
tación.
Un medio adecuado significa un medio que
comprende únicamente ingredientes utilizados comúnmente en medios
de fermentación. Así, no está presente compuesto alguno que pudiera
comprometer el carácter natural del proceso y/o no se añade
producto alguno que pudiera comprometer el carácter de grado
alimentario del licopeno producido y/o no se añade aditivo costoso
alguno.
Este medio no comprende inhibidor exógeno alguno
de la carotenogénesis. En el contexto de la invención, un inhibidor
de la carotenogénesis es una sustancia que previene específicamente
la formación de \beta-caroteno y promueve la
acumulación de licopeno. Un inhibidor de la carotenogénesis puede
definirse también como una sustancia que inhibe específicamente el
metabolismo del licopeno. Los únicos inhibidores específicos de la
carotenogénesis que pueden estar presentes durante la fermentación
son los producidos posiblemente por las cepas propiamente dichas.
Ejemplos de inhibidores de la carotenogénesis son los descritos en
WO 2000 77234, EE.UU. 3369974, JP 48016189 y JP 48016190, Mehta
& Cerdá-Olmedo (1999), Cerdá Olmedo & Hütterman (1986)
Angewandte Botanik 60:59-70, JP73016189,
JP73016190, RU2102416, JP09318167, US3369974. Estos inhibidores
pueden ser compuestos N-heterocíclicos, tales como
imidazol, piridina, morfolina y sus derivados sustituidos, o
compuestos amínicos terciarios. En el contexto de esta solicitud,
la tiamina no se consideraría como una amina terciaria. La tiamina
es una vitamina esencial para B. trispora, y por consiguiente
debería estar presente en el medio de fermentación.
Preferiblemente, un inhibidor de la
carotenogénesis será capaz de prevenir al menos 10% p/p de la
formación de \beta-caroteno y promover
concomitantemente al menos 10% p/p de formación de licopeno en
comparación con la situación en la que no está presente inhibidor
de la carotenogénesis alguno. Preferiblemente, al menos se previene
20% de la formación de \beta-caroteno, más
preferiblemente al menos 30%, aún más preferiblemente al menos 40%,
muy preferiblemente al menos 50% y aún más preferiblemente al menos
60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, y al
menos 99%.
Preferiblemente, no se añaden ácidos trispóricos
durante la fermentación. Si no se añaden ácidos trispóricos durante
la fermentación, la única fuente de ácidos trispóricos que puede
estar presente son los ácidos trispóricos nativos producidos por
las cepas propiamente dichas.
Preferiblemente, un medio adecuado comprende una
o más fuentes de carbono, una o más fuentes de nitrógeno, sales
minerales y tiamina. Las fuentes de carbono que pueden añadirse son
nutrientes simples o complejos e incluyen carbohidratos o grasas,
tales como dextrinas, almidones, glucosa, sacarosa, fructosa,
maltosa, maltodextrinas, y aceites animales o vegetales. El medio
adecuado tiene preferiblemente una fuente de nitrógeno asimilable,
orgánica o inorgánica, tal como harina de soja, harina de maíz,
destilados solubles, extracto de levadura, harina de semilla de
algodón, peptona, caseína, amoníaco, sales de amonio, nitrato,
extracto de maíz, sólidos de maceración de maíz y licor de
maceración de maíz, etc. Las sales minerales que están presentes
preferiblemente en el medio adecuado incluyen fosfatos, sulfatos,
cloruros, sodio, potasio, amonio, calcio y magnesio. La proporción
de los nutrientes puede determinarse sobre la base de los
requerimientos de crecimiento de la cepa de B. trispora y de
los niveles de producción de licopeno. La fermentación se lleva a
cabo preferiblemente en condiciones aerobias y en cultivo
sumergido. Preferiblemente, el medio adecuado comprende un alto
contenido de azúcar como fuente de C, como se define ulteriormente
en la solicitud. El medio más preferido se define más adelante en
la Tabla 1. El proceso de fermentación puede llevarse a cabo a una
temperatura comprendida entre 20 y 34ºC. Alternativamente, el
proceso de fermentación puede llevarse a cabo a dos o más
temperaturas diferentes dentro de este intervalo, a fin de permitir
una optimización independiente de las fases subsiguientes del
proceso. Preferiblemente, la temperatura puede seleccionarse en un
primer paso de la fermentación de modo que sea adecuada para el
crecimiento óptimo del hospedador, y en un segundo paso, adecuada
para la producción óptima de licopeno por el hospedador. Más
preferiblemente, la temperatura adecuada para producción de licopeno
es menor que la temperatura adecuada para crecimiento del
hospedador. Ambas temperaturas están comprendidas entre 20 y 34ºC.
Preferiblemente, la temperatura adecuada para el crecimiento está
comprendida entre 25 y 32ºC, más preferiblemente es 32ºC, y la
temperatura adecuada para la producción de licopeno está comprendida
entre 20 y 25ºC, siendo más preferiblemente 22ºC.
Alternativamente, el proceso de fermentación es
un proceso de fermentación alimentado por lotes. En un proceso de
fermentación alimentado por lotes de este tipo, se suministran uno o
más nutrientes por alimentación del sistema de fermentación durante
la fermentación, además de un suministro de dichos nutrientes en el
medio adecuado al comienzo de la fermentación. Alternativamente, se
suministran uno o más nutrientes por alimentación del sistema de
fermentación durante la fermentación; reponiendo de este modo los
nutrientes consumidos durante la fermentación. Una de las ventajas
de un sistema alimentado por lotes es que pueden evitarse altas
concentraciones indeseables de nutrientes tales como azúcar. Otro
ejemplo de un nutriente potencialmente dañino que puede ser
suministrado por una alimentación es el amoníaco, o cualquier otro
nutriente para el cual sean indeseables concentraciones elevadas.
Una segunda ventaja de la fermentación alimentada por lotes es la
posibilidad de prolongación de la fermentación después del momento
en que ha llegado a agotarse uno de los nutrientes, por
alimentación de dicho nutriente. El uso de un proceso de
alimentación por lotes da a menudo como resultado mayor
concentración de biomasa y mayor concentración de producto.
La concentración de los carotenoides presentes
al final del proceso de fermentación puede medirse
espectrofotométricamente después de extracción de los carotenoides,
teniendo en cuenta los máximos de absorción característicos de los
diversos carotenoides. Alternativamente, los carotenoides pueden
separarse por HPLC u otros métodos cromatográficos, después de los
cuales puede producirse la detección a una longitud de onda de
absorción común, o una vez más a diferentes longitudes de onda
específicas para los diversos carotenoides. Puede prestarse una
atención específica a la existencia de estereoisómeros de los
carotenoides, que pueden tener propiedades cromatográficas o
espectrales diferentes. Se conoce en la técnica que el producto
primario de los caminos biosintéticos es el isómero trans, y que la
isomerización a diferentes isómeros cis puede ocurrir en diversos
grados durante el procesamiento de las muestras o el aislamiento
del producto. Por tanto, el nivel total de producción de una especie
carotenoide se considera que es la suma de los niveles de todos sus
estereoisómeros.
Pude ser difícil detectar todos los isómeros de
todos los carotenoides. Por tanto, puede ser más conveniente
caracterizar los mutantes carotenogénicos por la relación de dos
productos bien detectados. En el contexto de la presente solicitud,
los dos carotenoides más importantes son
\beta-caroteno, que es el producto principal de
la cepa originaria, y licopeno, que es el producto principal de los
mutantes. Los mutantes o las condiciones de proceso pueden
caracterizarse por la relación de licopeno y
\beta-caroteno presente en muestras relevantes.
Alternativamente, los mutantes pueden caracterizarse por la cantidad
de licopeno total producida como porcentaje de los carotenoides
totales presentes. Como consecuencia, en el contexto de la solicitud
(a no ser que se indique otra cosa) una concentración de licopeno,
o respectivamente \beta-caroteno corresponde a la
suma de la concentración de licopeno cis y trans y
\beta-caroteno cis y trans respectivamente. Debido
a la presencia de carotenoides múltiples, la suma de
\beta-caroteno y licopeno es aproximadamente 90%
p/p de la cantidad total de carotenoides producida por la cepa (a
no ser que se indique otra
cosa).
cosa).
La cepa utilizada es capaz de producir al menos
70% p/p de licopeno y menos de 20% p/p de
\beta-caroteno, cuando se cultiva juntamente
durante al menos 3 días con una cepa adecuada de Blakeslea
trispora del tipo de acoplamiento opuesto en un medio adecuado
en ausencia de un inhibidor exógeno de la carotenogénesis
específico, preferiblemente al menos 75% y menos de 15%, más
preferiblemente al menos 80% y menos de 10%, muy preferiblemente al
menos 85% y menos de 5%. Los porcentajes representan el porcentaje
de licopeno o respectivamente \beta-caroteno como
porcentaje de la cantidad total de carotenoides producidos por la
cepa.
La cepa utilizada produce al menos 70% p/p de
licopeno, cuando se cocultiva durante al menos 3 días con una cepa
adecuada de Blakeslea trispora del tipo de acoplamiento
opuesto en un medio adecuado en ausencia de un inhibidor exógeno de
la carotenogénesis específico de la carotenogénesis, preferiblemente
al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, muy preferiblemente
al menos 85%. Los porcentajes dados aquí representan el porcentaje
de licopeno como porcentaje de la cantidad total de carotenoides
producidos por la cepa.
La cepa utilizada producía una mezcla de
carotenoides, en la cual la relación de licopeno a
\beta-caroteno es mayor que 4:1, cuando esta cepa
se ha co-cultivado durante al menos 3 días con una
cepa adecuada de Blakeslea trispora del tipo de acoplamiento
opuesto en un medio adecuado en ausencia de un inhibidor exógeno de
la carotenogénesis específico. En otra realización preferida
adicional, la cepa produjo mezclas de carotenoides con licopeno
como componente principal. En otra realización preferida adicional,
la cepa produjo mezclas de carotenoides que comprenden el camino
biosintético de fitoeno a \beta-caroteno.
Se proporcionan mezclas de carotenoides, en las
cuales la relación de licopeno a \beta-caroteno es
mayor que 4:1. Preferiblemente, se proporcionan mezclas de
carotenoides con licopeno como componente principal. En otra
realización preferida adicional, se proporcionan mezclas de
carotenoides que comprenden el camino biosintético de fitoeno a
\beta-caroteno. En otra realización preferida
adicional, se proporciona una biomasa que contiene una mezcla de
carotenoides como se han definido arriba. De acuerdo con ello, esta
biomasa puede utilizarse ulteriormente en aplicaciones
alimentarias, de piensos o cosméticas.
Las mezclas de carotenoides proporcionadas más
preferidas comprenden:
0-5% p de Neurospoeno,
0-5% p de Fitoeno, 0-10% p de
\beta-caroteno, 5-20% p de
\beta-caroteno (sic) 70-90% p de
Licopeno. Mezclas aún más preferidas comprenden 0-2%
p de Neurospoeno, 0-2% p de Fitoeno,
0-5% p de \beta-caroteno,
5-15% p de \beta-caroteno (sic),
80-90% p de Licopeno.
Una cepa puede obtenerse por mutagénesis química
y selección. Diversos métodos de mutagénesis se conocen en la
técnica (véase por ejemplo Rowlands (1984), Enzyme Microb. Technol.
6:3-10). Uno de estos métodos es el tratamiento con
productos químicos mutagénicos, que incluyen
nitroso-guanidina (NTG),
etil-metano-sulfonato (EMS), u
óxido de nitroquinolina (NQO). Otro método es el tratamiento con
radiación mutagénica, tal como luz UV, rayos gamma o rayos X. Con
respecto al método de selección, la selección para desviación del
color de la colonia después de cultivo en medio de agar es
particularmente potente para los mutantes carotenogénicos, pero
pueden utilizarse también otros criterios tales como morfología de
colonias y micelios, características de esporulación, tasa de
crecimiento, resistencia contra compuestos inhibidores o condiciones
de estrés, y otros métodos utilizados comúnmente en programas de
mejora de cepas.
La cepa productora de licopeno es Blakeslea
trispora lyc26(-). Esta cepa se obtuvo por tandas múltiples de
mutagénesis y selección, utilizando
1-metil-3-nitro-nitrosoguanidina
(NG) y rayos gamma como factores mutagénicos, a partir de la cepa
originaria productora de \beta-caroteno B.
trispora 111(-). Cuando se deja crecer en
co-cultivo con una cepa (+) adecuada de la especie,
tal como una cepa utilizada en la producción de
\beta-caroteno, en un medio de crecimiento
adecuado como se ha definido arriba, la cepa lyc26(-)
producirá licopeno como el carotenoide más abundante, ascendiendo a
más del 70% de los carotenoides totales. Blakeslea trispora
lyc26(-) ha sido depositada en la Colección Rusa de
Microorganismos Comerciales como Blakeslea trispora VKPM
F-822, y está disponible de este modo al público. El
licopeno es el carotenoide primario producido en todos los medios
de crecimiento testados por la cepa lyc26(-).
Preferiblemente, los mutantes de la solicitud se cultivan en un
medio que tiene un contenido elevado de azúcar como fuente de C como
se define más adelante en la solicitud. Muy preferiblemente, los
mutantes se cultivan en el medio presentado en la Tabla 1.
Preferiblemente, la cepa utilizada tiene esencialmente las mismas
características que la cepa depositada bajo VKPM
F-822.
La cepa utilizada puede obtenerse a partir de la
cepa depositada bajo VKPM F-822 o es una progenie de
la misma.
La solicitud se refiere adicionalmente al uso de
la cepa como se ha definido arriba para producir licopeno,
preferiblemente utilizando el proceso definido en el Ejemplo 8.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
solicitud, se proporciona un medio adecuado que tiene un contenido
elevado de azúcar como fuente de C. Un contenido elevado de azúcar
como fuente de C significa un contenido elevado de azúcares
fácilmente asimilables como fuente de C. Un medio de este tipo es
sumamente adecuado para la producción de licopeno por los mutantes
de B. trispora. A este respecto, los azúcares fácilmente
asimilables se definen como mezclas constituidas principalmente por
monosacáridos y disacáridos. Ejemplos de tales fuentes de C son
dextrosa, glucosa, fructosa o jarabes ricos en maltosa. En
contraste, los medios de producción empleados tradicionalmente para
producción de \beta-caroteno comprenden fuentes de
C que contienen almidón como la fuente de azúcar asimilable
principal, tal como harina de soja o harina de maíz, por ejemplo el
medio descrito en la Tabla 3. Alternativamente, se han utilizado
medios que contienen de hecho fuentes de azúcar fácilmente
asimilables, pero en combinación con otras fuentes de C, tales como
aceites vegetales, por ejemplo el medio descrito en la Tabla 11. La
explicación racional que subyace en estos diseños de medio es que se
cree que el carbono fácilmente asimilable reprime la formación de
carotenoides, aunque es muy adecuada para el crecimiento.
Sorprendentemente, se encontró que la producción de licopeno por
mutantes de B. trispora era sumamente eficiente en medios de
producción que contengan azúcares fácilmente asimilables como su
fuente principal de carbono. Preferiblemente, estos medios
contienen al menos 50% de su carbono en peso en forma de azúcares
fácilmente asimilables, más preferiblemente al menos 60%, aún más
preferiblemente al menos 70%, y muy preferiblemente al menos 80%.
En estos porcentajes, se ha tenido también en cuenta el carbono
contenido en la fuente de nitrógeno. Preferiblemente, estos medios
contienen al menos 5% p de azúcares fácilmente asimilables, más
preferiblemente al menos 6% p y muy preferiblemente al menos 10%
p.
Muy preferiblemente, el medio es como se define
más adelante en la Tabla 1.
No se ha encontrado que el pH a todo lo largo de
la fermentación sea un parámetro crítico que influya en la
producción de licopeno. El pH pre-esterilización
puede estar comprendido entre 6,2 y 8,4, preferiblemente entre 7,5
y 8,4.
La solicitud se refiere también al uso de este
medio preferido como se ha definido arriba o preferiblemente como
se define en la Tabla 1 para producir licopeno utilizando un
hospedador adecuado.
Otro aspecto de la solicitud se refiere a un
proceso para producir licopeno utilizando la cepa que se ha definido
arriba, sometiendo la misma a co-cultivo durante al
menos 3 días con una cepa adecuada de Blakeslea trispora del
tipo de acoplamiento opuesto en un medio adecuado. Preferiblemente,
el medio adecuado utilizado es el medio adecuado como se ha
definido anteriormente en la descripción. El proceso se realiza en
presencia de un inhibidor exógeno de la carotenogénesis específico
tal como los arriba descritos. De acuerdo con otra realización
preferida, el proceso se realiza en presencia de ácidos trispóricos
exógenos. Más preferiblemente, el proceso se realiza utilizando el
medio optimizado arriba definido en la Tabla 1. El cultivo puede
realizarse en etapas múltiples, por ejemplo etapas separadas
vegetativas y de producción. La etapa vegetativa puede separarse
para cada tipo de acoplamiento, seguida por un cultivo de
producción conjunta. Asimismo, el cultivo de producción puede
iniciarse con sólo uno de los tipos de acoplamiento, añadiéndose el
otro más tarde al comienzo de la fase de producción real.
Preferiblemente, las cepas se someten a co-cultivo
durante al menos dos días, más preferiblemente al menos 3 días, aún
más preferiblemente al menos 4 días y muy preferiblemente al menos 5
días.
Después del co-cultivo, el caldo
puede desactivarse, por ejemplo por pasteurización, y la biomasa se
recoge, por ejemplo por filtración. A continuación, la biomasa
puede estabilizarse adicionalmente por secado, secado a vacío,
secado en lecho fluidizado o secado en cinta.
El licopeno no se separa del micelio. Se
proporciona la biomasa que contiene una mezcla de carotenoides como
se ha definido arriba. De acuerdo con ello, esta biomasa puede
utilizarse ulteriormente en aplicaciones alimentarias, de piensos o
cosméticas.
Alternativamente y de modo más preferible, el
licopeno se separa del micelio húmedo o seco por cualquier método
que haya sido descrito para rotura de células que hace posible
liberar el contenido celular. El licopeno puede disolverse
ulteriormente en cualquier disolvente en el que sea soluble. Se
prefieren dos maneras de separar el licopeno del micelio:
extracción, o aislamiento. Preferiblemente, esto puede hacerse por
extracción con un disolvente adecuado, tal como alcoholes, cetonas
o ésteres, tales como acetona o acetato de etilo, o alcanos tales
como n-hexano. Alternativamente, esto puede hacerse
por extracción supercrítica, por ejemplo con CO_{2}, posiblemente
con un disolvente orgánico que funcione como
co-disolvente.
Alternativamente y de modo más preferible, esto
se hace por un método de aislamiento directo, caracterizado por el
uso de un disolvente inmiscible con el agua, y aislamiento de la
capa de interfase que contiene los carotenoides como se describe en
WO 01/55100. Preferiblemente, el método de aislamiento directo
utilizado es el que se define más adelante en esta memoria.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la
solicitud, se proporciona un proceso de aislamiento directo, que es
un proceso para la preparación de un compuesto carotenoide
cristalino, comprendiendo dicho proceso los pasos siguientes:
- (a)
- rotura de las células que contienen carotenoides, preferiblemente procedentes de una fuente microbiana,
- (b)
- lavado de la mezcla de células rotas que contienen carotenoides cristalinos con un disolvente adecuado para separar lípidos, preferiblemente acetato de etilo, más preferiblemente n-butanol, y separación de la interfase que contiene los carotenoides,
- (c)
- tratamiento de la capa de carotenoides cristalinos apropiada obtenida en el paso (b) con álcali a un pH de 9-12 y a una temperatura de 10-95ºC, preferiblemente 30-85ºC, muy preferiblemente 50-75ºC, opcionalmente en presencia de un alcohol inferior,
- (d)
- adición opcional de una sal a la suspensión de carotenoides cristalinos tratada con álcali,
- (e)
- separación opcional de la suspensión de carotenoides cristalinos de la fase líquida,
- (f)
- lavado opcional de la suspensión de carotenoides cristalinos con una solución acuosa que contiene sal,
- (g)
- opcionalmente, lavado de la suspensión de carotenoides cristalinos con una solución acuosa ácida; teniendo el pH de la solución de lavado preferiblemente un valor entre 1 y 5, más preferiblemente entre 2 y 4, opcionalmente en presencia de un alcohol inferior. La relación de alcohol inferior a agua en la mezcla alcohol inferior/agua está comprendida preferiblemente entre 5:1 y 1:5, más preferiblemente entre 1:1 y 1:2,
- (h)
- lavado de la suspensión de carotenoides cristalinos en un primer procedimiento de lavado con un alcohol inferior, en donde el orden de realización de los pasos (b)-(e) y (f) es arbitrario,
- (i)
- lavado de los cristales brutos de carotenoides resultantes de los pasos de proceso (a)-(f) en un segundo procedimiento de lavado con agua o con una mezcla de un alcohol inferior y agua,
- (j)
- lavado de los cristales con un disolvente fresco, y
- (k)
- secado de los cristales.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células microbianas que contienen
carotenoides pueden obtenerse de cualquier proceso de fermentación
adecuado de un microorganismo productor de carotenoides de
elección. El microorganismo que contiene carotenoides puede ser una
bacteria, un hongo, un alga o una levadura. Preferiblemente, el
mismo es un hongo del orden Mucorales, preferiblemente
Blakeslea trispora, un alga del género Dunallella, o
una levadura del género Phaffia, preferiblemente Phaffia
rhodozyma. Más preferiblemente, el mutante de Blakeslea
trispora definido anteriormente es el microorganismo que
contiene carotenoides. Este proceso permite el aislamiento de
cualesquiera compuestos carotenoides conocidos. Compuestos
carotenoides preferidos con licopeno,
\beta-caroteno, fitoeno y astaxantina.
Paso
(a)
El caldo de fermentación resultante que
comprende células microbianas y fluido de fermentación puede
utilizarse directamente para el aislamiento de cristales de
carotenoides. Alternativamente, antes de la realización del proceso
de la solicitud, las células microbianas pueden separarse del fluido
de fermentación por cualquier método adecuado, tal como filtración
o centrifugación.
Las células microbianas que contienen
carotenoides se abren por rotura de las paredes celulares mediante
un tratamiento mecánico, químico y/o enzimático. Por ejemplo, las
células pueden someterse a homogeneización, tratamiento por
ultrasonidos, autólisis, osmólisis y/o plasmólisis, opcionalmente
con adición de agentes adecuados tales como detergentes, ácidos,
bases, enzimas, sustancias mejoradoras de la autólisis, agentes
osmolizantes tales como sales, y/o agentes plasmolizantes. De este
modo, se libera de las células una mixtura de células rotas que
contiene carotenoides cristalinos.
Paso
(b)
La mezcla de células rotas que contiene
carotenoides cristalinos así obtenida se purifica a
continuación.
Para mejorar el rendimiento del proceso de
recuperación, la mezcla de células rotas que contiene carotenoides
cristalinos se lava con un disolvente adecuado para eliminar entre
otras cosas lípidos, preferiblemente un disolvente orgánico no
miscible con el agua, en la cual el carotenoide cristalino tiene una
solubilidad baja. Este disolvente se añade en una cantidad de 1% a
100% de la cantidad de suspensión de carotenoides cristalinos,
preferiblemente 10% a 40%, más preferiblemente 20% a 30%. Debe
indicarse que la cantidad de disolvente necesaria para la
eliminación de los lípidos es sustancialmente menor que la cantidad
de disolvente necesaria para la extracción con disolventes de un
carotenoide a partir de la biomasa microbiana. Un disolvente
preferido no miscible con el agua es hexano, o acetato de etilo.
Preferiblemente, el disolvente es acetato de etilo. Otro disolvente
preferido es un alcohol tal como isopropanol o
n-butanol. El n-butanol se conoce
también como 1-butanol. Muy preferiblemente, el
disolvente es n-butanol.
\newpage
El lavado, como se designa en esta solicitud,
incluye un paso de suspensión o agitación del material a lavar en
una cantidad adecuada del disolvente de elección y un paso de
decantación o centrifugación y recuperación subsiguiente de la capa
apropiada.
Paso
(c)
El paso de purificación siguiente consiste en el
tratamiento con álcali de la capa de carotenoides cristalinos
apropiada obtenida en el primer paso. El tratamiento con álcali
comprende la adición de una solución acuosa alcalina que tiene un
pH entre 9 y 12 a la capa de carotenoides y la incubación
subsiguiente, preferiblemente bajo agitación, durante un periodo de
tiempo apropiado a una temperatura comprendida entre 10 y 95ºC,
preferiblemente entre 30 y 85ºC, más preferiblemente entre 50 y
75ºC. La relación de la solución alcalina a la capa de carotenoides
puede variar de modo conveniente desde aproximadamente 5:1 a
aproximadamente 1:1 (p/p). La duración del tratamiento alcalino
dependerá típicamente del pH y la temperatura aplicados, en el
sentido de que cuanto más bajos sean el pH y la temperatura aplica
durante el tratamiento, tanto más largo deberá ser el tratamiento.
Por ejemplo, el tratamiento alcalino puede realizarse durante 2
horas a pH 12 y una temperatura de 75ºC o durante 8 horas a pH 10 y
una temperatura de 50ºC. Opcionalmente, el tratamiento alcalino
puede llevarse a cabo en presencia de un alcohol
inferior.
inferior.
Pasos (d), (e),
(f)
Después del tratamiento con álcali, puede
añadirse opcionalmente una sal soluble en agua, tal como cloruro de
sodio, más preferiblemente acetato de sodio, a la capa de
carotenoides cristalinos tratada con álcali. La capa de
carotenoides cristalinos puede separarse luego de la fase líquida y
puede lavarse opcionalmente con una solución acuosa que contenga
sal. La separación de la capa de carotenoides cristalinos puede
llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica, tal
como filtración, centrifugación o enfriamiento.
Antes de aplicar el paso de purificación
siguiente, la capa de carotenoides cristalinos puede lavarse una o
más veces con agua.
Paso
(g)
Opcionalmente, los cristales de carotenoides
brutos pueden modificarse ulteriormente por aplicación de un
segundo procedimiento de lavado que comprende lavar los cristales
una o más veces con agua o con una mezcla de un alcohol inferior y
agua. El pH de la solución de lavado tiene preferiblemente un valor
comprendido entre 1 y 5, más preferiblemente entre 2 y 4. El agua
puede acidificarse con cualquier ácido adecuado, tal como ácido
sulfúrico o ácido clorhídrico o con una solución tampón ácida, tal
como un tampón borato/ácido clorhídrico o un tampón citrato/ácido
clorhídrico. La relación de alcohol inferior a agua en la mezcla
alcohol inferior/agua está comprendida preferiblemente entre 5:1 y
1:5, más preferiblemente entre 1:1 y 1:2.
Los cristales se separan subsiguientemente de la
fase líquida por cualquier método adecuado, tal como filtración o
centrifugación.
Pasos (h),
(i)
La capa de carotenoides cristalinos se somete
luego a un primer procedimiento de lavado que comprende lavar la
suspensión con un alcohol inferior, obteniéndose cristales de
carotenoides brutos. Este primer procedimiento de lavado puede
repetirse una o más veces.
Típicamente, un paso de lavado realizado de
acuerdo con la solicitud incluye agitar la capa de carotenoides
cristalinos o los cristales de carotenoides (brutos) con el líquido
de lavado y separar subsiguientemente la capa de carotenoides
cristalinos o los cristales de la fase líquida.
Preferiblemente, los pasos de proceso (a)-(g)
como se han descrito arriba se realizan en el orden (a), (b), (c),
(d), (e), (f), (g). Preferiblemente, los pasos de proceso (a)-(g)
como se han descrito arriba se realizan en el orden (a), (g), (b),
(c), (d), (e), (f).
A lo largo de la presente solicitud, un alcohol
inferior se define como un alcohol (C_{1-6}), por
ejemplo metanol, etanol, 1-propanol,
2-propanol y 1-butanol. El alcohol
inferior como se utiliza en la presente solicitud puede ser un solo
alcohol o puede ser una mezcla de dos o más alcoholes.
Preferiblemente, el alcohol inferior es etanol,
1-butanol o una mezcla de 1-butanol
y etanol.
Paso
(j)
A continuación, los cristales se lavan una o más
veces con un disolvente fresco. El disolvente fresco es un alcohol
inferior, preferiblemente etanol, o un éster acetato de un alcohol
inferior, preferiblemente acetato de etilo. Más preferiblemente, el
disolvente fresco es un disolvente de grado alimentario.
\newpage
Preferiblemente, el alcohol inferior utilizado
en los dos primeros procedimientos de lavado de la suspensión de
carotenoides cristalinos y el disolvente fresco utilizado en el paso
de lavado final de los cristales son el mismo disolvente.
Paso
(k)
En un paso final del proceso de la solicitud, se
secan los cristales.
Una ventaja importante de la presente solicitud
en comparación con los procesos convencionales de
extracción/cris-
talización para el aislamiento de un carotenoide cristalino es que se evita el uso de disolvente orgánico para la extracción del carotenoide. Como consecuencia, sustancialmente no se incorpora disolvente alguno en la red cristalina del compuesto carotenoide resultante.
talización para el aislamiento de un carotenoide cristalino es que se evita el uso de disolvente orgánico para la extracción del carotenoide. Como consecuencia, sustancialmente no se incorpora disolvente alguno en la red cristalina del compuesto carotenoide resultante.
En otro aspecto de la solicitud, se utiliza el
proceso de la presente solicitud para aumentar el contenido de
carotenoides de cualquier composición carotenoide cristalina bruta,
preferiblemente de cualquier suspensión de carotenoides cristalina
bruta.
La invención se ilustra adicionalmente por los
ejemplos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa Blakeslea trispora
lyc26(-) se obtuvo por tandas múltiples de mutagénesis y
selección, utilizando
1-metil-3-nitro-nitrosoguanidina
(NG) o rayos gamma como factores mutagénicos, partiendo de la cepa
originaria productora de \beta-caroteno B.
trispora 111(-). Para el tratamiento mutagénico, se
prepararon suspensiones de esporas
(10^{6}-10^{7} esporas por ml) en una solución
de glicerol al 10% y lactosa al 5% en agua. Para la mutagénesis con
NG, se utilizó una solución de 150 \mug/ml de NG en un tampón
Tris-HCl 100 mM (pH = 8,0). Para la mutagénesis con
rayos gamma, se utilizó una dosis de aproximadamente 1 Mrad. En
ambos métodos, la exposición al mutagénico tenía como objetivo
alcanzar 1% de supervivencia de las esporas. Los mutantes
productores de licopeno se seleccionaron por su color rojo
característico, cuando se cultiva sobre placas de agar mosto.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa lyc26(-) exhibe las
características morfológicas siguientes:
En agar mosto:
- Crecimiento de la colonia: restringido
- Micelio aéreo: ligeramente velloso, entrelazado, de color carmesí claro
- Formación de esporas: escasa
\vskip1.000000\baselineskip
En agar SM17-1:
- Crecimiento de la colonia: restringido con colonias planares
- Micelio aéreo: denso, color rosado, ligeramente elevado en el centro
- Formación de esporas: muy escasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las características de la cepa lyc26(-)
son estables. La cepa es no patógena.
\newpage
El agar SM17-1 tiene la
composición siguiente que se presenta en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Sobre agar SM 17-1 modificado,
utilizando una amplia gama de mono- y disacáridos (v.g., glucosa,
arabinosa, fructosa, lactosa, maltosa) como fuente de carbono, el
micelio de la cepa de B. trispora lyc26(-) tenía
color carmesí cuando las colonias se superpusieron con discos
filtrantes impregnados con un extracto de un cultivo de producción
de \beta-caroteno. Aparentemente, los ácidos
trispóricos producidos en el cultivo acoplado de las cepas B.
trispora (+) y (-) utilizadas para la producción de
\beta-caroteno, eran eficaces en la estimulación
de la producción de licopeno en el mutante lyc26(-). Las
cepas utilizadas para el cultivo de producción de
\beta-caroteno eran la cepa originaria
111(-) y las cepas (+)VKPM F-820 o VKPM
F-821.
\vskip1.000000\baselineskip
Un medio de maíz-soja, conocido
en la técnica como adecuado para la producción de
\beta-caroteno, se utilizó para la producción de
licopeno con la cepa B. trispora lyc26(-), en cultivo
conjunto con una cepa adecuada de B. trispora (+). En este
ejemplo, se utilizaron como cepas (+) las cepas VKPM
F-820 y VKPM F-821.
Las cepas (-) y (+) se cultivaron por separado
sobre cultivos en pico de flauta de agar mosto a una temperatura de
28ºC durante 20 horas en la oscuridad, y subsiguientemente durante
8-12 días bajo iluminación con lámparas de luz
diurna a una temperatura de 22ºC. Para obtener el material de
plantas de semillero se eliminaron el micelio aéreo y las esporas
por lavado de la superficie de agar con agua destilada.
\newpage
La suspensiones así obtenidas se utilizaron para
sembrar matraces Erlenmeyer de 750 ml que contenían 50 ml de un
medio líquido compuesto como se indica en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas (-) y (+) se cultivaron por separado
en un aparato rotativo de sacudidas (250 rpm) durante 48 horas a
una temperatura de 26-27ºC. Las suspensiones de
cultivo así obtenidas se utilizaron para inocular matraces de
producción de 750 ml, que contenían 50 ml de un medio de producción
(1) con la composición siguiente que se indica en la
Tabla 4.
Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para la inoculación, se utilizaron 10 ml de
cultivo de la cepa (-) y 1 ml de cultivo de la cepa (+).
Subsiguientemente, los matraces de producción se incubaron en un
aparato de sacudidas rotativo (250 rpm) durante 5 días a
26-27ºC.
Después de 5 días, se diluyó una muestra de 0,5
ml de caldo de cultivo con 1 ml de agua, y se centrifugó. El
sedimento se suspendió de nuevo en u1 ml de etanol al 96%, y se
centrifugó. El sedimento se recogió y se homogeneizó en un tubo
Potter con cloroformo. Se recogió el cloroformo y se continuó la
homogeneización con cloroformo fresco. Se repitió esto hasta que ya
no era capturado color alguno por la fracción de cloroformo. Las
fracciones de cloroformo recogidas se reunieron, y el volumen total
se ajustó a 10 ml con cloroformo. Los niveles de producción de
\beta-caroteno y licopeno se determinaron por HPLC
(Tabla 5). Las muestras para el análisis se prepararon por dilución
de 0,5 ml del extracto clorofórmico con 95 ml de acetona. En este
ejemplo, se midió la presencia de \beta-caroteno y
licopeno. La presencia de otros carotenoides menores no se midió
como hicieron los autores de la invención en el Ejemplo 6. El
contenido de licopeno como se calcula en la última columna de la
Tabla 5 representa la relación entre la cantidad de licopeno
producida y la cantidad de licopeno y
\beta-caroteno producida.
Está claro que el mutante lyc26(-)
produce licopeno como producto carotenoide principal, siendo su
producción de licopeno 4-5 veces mayor que su
producción de \beta-caroteno, con indiferencia de
la cepa (+) utilizada para el cultivo acoplado. Está claro también
que el nivel absoluto de los carotenoides producidos por el mutante
depende mucho más de su interacción con una cepa (+) adecuada y que
diferentes cepas (+) pueden dar resultados más o menos
favorables.
En un experimento comparativo, se testó la
producción de licopeno y \beta-caroteno de la cepa
originaria 111 productora de
\beta-caroteno, utilizando el mismo juego de cepas
(+) y las mismas condiciones experimentales. La producción de
licopeno por la cepa 111 era menor que 0,03 g/l. La
producción de \beta-caroteno de la cepa
111 estaba comprendida entre 2,8 y 3,4 g/l.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de los cultivos de siembra
separados para las cepas (+) y (-) se realizó como en el Ejemplo 3,
utilizando las mismas cepas. Sin embargo, esta vez los precultivos
de las cepas (+) se incubaron sólo durante 24 horas. Estas
suspensiones de las cepas (-) y (+) se utilizaron para inocular un
medio de producción (2) con la composición siguiente como se
presenta en la Tabla 8.
Las condiciones de incubación de los cultivos de
producción y los procedimientos analíticos fueron como en el
Ejemplo 3. Los resultados se dan en la Tabla 7. En este ejemplo, se
midió la presencia de \beta-caroteno y licopeno.
La presencia de otros carotenoides menores no se midió como se hizo
en el Ejemplo 6. El contenido de licopeno tal como se calcula en la
última columna de la Tabla 7 representa la relación entre la
cantidad de licopeno producida y la cantidad de licopeno y
\beta-caroteno producida.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Está claro que el medio de producción (2)
soporta niveles de producción de licopeno mucho mayores por el
mutante que el medio de producción (1) (compárense la Tablas 5 y
7). El medio de producción (2) es también mejor que el medio de
producción (1) en cuanto a la relación de licopeno a
\beta-caroteno (compárense la Tablas 5 y 7). Este
ejemplo, la cepa (+) VKPM F-820 utilizada para el
acoplamiento proporciona una producción de licopeno mucho mayor que
la cepa VKPM F-821. En el Ejemplo 3, la cepa VKPM
F-821 (+) producía los resultados más favorables en
cuanto a la concentración de licopeno producida. Esto puede ser
debido al conocido problema de optimización de la relación de las
cepas (+) a (-): las diferentes cepas pueden tener diferentes tasas
de crecimiento en diferentes medios, lo que puede esperarse que
conduzca a diferencias en la cantidad real de biomasa de cada cepa
presente en la fase de producción y por consiguiente a diferencias
en términos de rendimiento en licopeno. Está dentro de la
competencia ordinaria de los expertos en la técnica la optimización
de la relación de las cepas acopladas una vez que se han
seleccionado las otras condiciones experimentales, tales como el
medio.
En un experimento comparativo, se testó la
producción de licopeno de la cepa originaria productora de
\beta-caroteno 111 en este medio mejorado,
utilizando el mismo juego de cepas (+) y las mismas condiciones
experimentales. La producción de licopeno la cepa 111 no era
mayor que 20-30 mg/l, mientras que los niveles de
producción de \beta-caroteno por la cepa
originaria alcanzaban 2,5-3,2 g/l en este medio.
Se llega a la conclusión de que la producción de
\beta-caroteno por la cepa parental 111 no
está influenciada por el medio utilizado (compárese con el Ejemplo
3). Este medio mejorado es muy adecuado para la producción de
licopeno por el mutante lyc26(-).
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de los cultivos de siembra
separados para las cepas (+) y (-) se realizó como en el Ejemplo 3,
excepto que se utilizaron matraces de 2000 ml, llenos con 200 ml del
medio como se define a continuación. Se utilizaron matraces
múltiples para obtener suficiente material de inoculación para los
cultivos del fermentador.
\newpage
El medio de producción (3) estaba basado en el
utilizado en el Ejemplo 4, pero con algunas modificaciones,
utilizando materias primas disponibles industrialmente para permitir
un aumento de escala más fácil hasta volúmenes mayores como se da
en la Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo de producción se efectuó en un
fermentador de 10 litros con un contenido inicial de medio de 4 kg
a una temperatura de 32ºC, una velocidad de agitación de 200 rpm, y
una aireación de 6 l por minuto. Se añadió un agente antiespumante
Basildon (Basildon Chemical Co., Abingdon, Reino Unido) en caso
necesario y el oxígeno disuelto era siempre superior al 25% de la
saturación. El medio se inoculó con un matraz que contenía una
mezcla de 1000 g de cultivo de siembra maduro de la cepa (-), 500 g
de cultivo de siembra maduro de la cepa (+) y 120 g de aceite de
soja estéril. Después de la inoculación, la temperatura del cultivo
se mantuvo a 32ºC durante 48 horas. Después de ajuste de la
temperatura a 22ºC, se prolongó el cultivo durante 72 a 120 horas
más. El pH del cultivo no se controló. El valor inicial era 6,2, y
subsiguientemente el pH aumentó hasta que alcanzó 6,8 al final de
la fermen-
tación.
tación.
Se tomaron muestras a intervalos de tiempo
regulares para análisis. Se utilizó directamente Una parte de la
muestra para análisis espectrofotométrico del licopeno y para el
contenido de materia seca del caldo. La otra parte de la muestra se
homogeneizó, y se congeló a -20ºC para utilizarse más tarde en un
análisis más detallado del espectro de carotenoides, como se
describe en el Ejemplo 6.
Para análisis espectrofotométrico, se diluyeron
0,5 ml del caldo con 3 volúmenes de agua, y se centrifugó. La
fracción de sedimento se suspendió de nuevo con 1,5 ml de etanol de
96%, y se centrifugó.
El pelet se transfirió a un tubo Potter, y se
trató con cloroformo hasta que todo el color había sido extraído en
la fracción clorofórmica. La fracción clorofórmica se filtró para
eliminar el material particulado. Una porción del extracto se
diluyó 100 veces con acetona para medida de la absorción a 507 nm
contra una muestra en blanco de acetona. Después de 5 días de
fermentación, se encontró que el nivel de licopeno era 1,36 y 1,60
g/l en medidas duplicadas. El contenido de materia seca del caldo
era 42 g/kg, de tal modo que el contenido de licopeno en la biomasa
era 3,5% como promedio.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras congeladas obtenidas en el Ejemplo
5 se descongelaron. Se añadieron cuentas de vidrio (5 g) a 250 mg
de muestra, y la mezcla se agitó enérgicamente mediante sacudidas
durante 30 segundos. Subsiguientemente, se añadieron 2 ml de una
mezcla de cloroformo y piridina (200:1 en volumen) y las muestras se
agitaron enérgicamente mediante sacudidas durante 90 minutos. Se
añadieron luego 8 ml de una solución del antioxidante BHT
(hidroxi-tolueno butilado) en acetona (100 mg/l), y
la muestra total se mezcló concienzudamente. Subsiguientemente, se
centrifugaron durante 5 minutos 5 ml de esta solución a 3000 rpm, y
se determinó el espectro de carotenoides en la fracción
sobrenadante por HPLC, con detección de los diversos picos a
longitudes de onda múltiples, utilizando una columna Beckman
Ultrasphere ODS, y una mezcla de 800 ml de acetonitrilo, 200 ml de
metanol, 80 ml de hexano y 1 ml de trietilamina como fase
móvil.
Las longitudes de onda utilizadas para la
detección de los carotenoides específicos y los Coeficientes de
Extinción utilizados para la corrección se dan a continuación en la
Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las cantidades relativas de los carotenoides se
calcularon a partir de la absorción a su longitud de onda
específica, corregida por las diferencias en sus coeficientes de
extinción. Se encontraron las cantidades relativas siguientes de
los carotenoides que se muestran en la Tabla 10.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Está claro que el licopeno es el carotenoide más
abundante producido por la cepa de B. trispora
lyc26(-). La forma de licopeno producida por el camino de
biosíntesis de B. trispora es el estereoisómero trans. La
isomerización a la forma cis ocurre en diversas proporciones durante
el procesamiento de la muestra o el aislamiento del licopeno,
dependiendo de las condiciones de procesamiento. La cantidad
relativa de licopeno total producida (trans y cis) es 82,9%. La
cantidad relativa de \beta-caroteno total
producida (trans y cis) es 10,7%. Se encontró una relación de
licopeno a \beta-caroteno de 7,7.
\newpage
Se realizó un experimento en matraz de sacudidas
de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 3,
utilizando las mismas cepas. Se llevó a cabo un experimento
paralelo, utilizando el mismo procedimiento de inoculación y
cultivo siembra, pero empleando un medio de producción adecuado para
\beta-caroteno. Este medio de producción de
\beta-caroteno tenía la composición siguiente dada
en la Tabla 11.
La diferencia principal entre el medio de
producción de licopeno del Ejemplo 3 y el medio de producción de
\beta-caroteno de este ejemplo es el nivel mucho
más alto de azúcares en el medio de producción de licopeno. La
relación de licopeno a \beta-caroteno producida en
ambos medios se muestra en la Tabla 12.
Se llegó a la conclusión de que el tipo de medio
utilizado influye en el espectro de carotenoides producido por el
mutante lyc26; siendo el medio de licopeno del Ejemplo 3 que
contiene alto nivel de azúcares particularmente adecuado para
obtener rendimiento elevado de licopeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Tres litros de caldo de fermentación, producido
en un fermentador de 10 l de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 5, se filtraron utilizando un filtro Seitz de 2 litros. La
torta del filtro se lavó con 1800 ml de agua de proceso.
Subsiguientemente, la torta lavada se extruyó y se secó durante una
noche a 40ºC a vacío.
Se recuperaron aproximadamente 100 g de biomasa
con un contenido de materia seca de 78%. La biomasa se extrajo con
porciones subsiguientes de 500 ml de acetato de etilo fresco a 40ºC
durante 10 minutos. En total, se realizaron 8 ciclos de extracción,
dando finalmente como resultado 3800 g de extracto.
El extracto se filtró y se concentró a 40ºC
hasta que el volumen final fue aproximadamente 500 ml. Se
interrumpió el calentamiento y se continuó la evaporación por una
reducción progresiva de la presión. La operación se detuvo a una
temperatura de 9ºC. La suspensión resultante se filtró utilizando un
filtro de vidrio G2. Se observaron cristales en forma de
agujas.
Los cristales se lavaron a la temperatura
ambiente con 100 ml de acetato de etilo fresco, seguido por un
lavado con 100 ml de etanol fresco. Finalmente se recuperaron 0,23
g de cristales después de secar durante una noche a 40ºC. El
contenido de licopeno de los cristales era 50-80%,
siendo 4-8% del licopeno el isómero cis.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos litros de caldo de fermentación, producido
en un fermentador de 10 l de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 5, se homogeneizaron por 3 pasadas a 500 bar a través de un
homogeneizador APV Lab60. Se añadieron a este caldo homogeneizado
0,3 volúmenes de 1-butanol, y la mezcla se
centrifugó durante 5 minutos a 5000 rpm. Se utilizaron también las
mismas condiciones de centrifugación para todos los pasos de
centrifugación subsiguientes. Se recogió la fracción de la
interfase, y se lavó con 100 volúmenes de 1-butanol.
La mezcla se centrifugó, y se recogió la fracción de sedimento. Se
preparó una mezcla constituida por sedimento,
1-butanol y agua en una relación volumétrica de
1:2:10. El pH se ajustó a 11,5-12,6 con NaOH, y la
mezcla se incubó durante 2 horas a 80ºC. Se añadió acetato de sodio
a una concentración final de 50 g/l y se centrifugó la mezcla.
Subsiguientemente, se añadieron 10 volúmenes de agua a la capa
superior, se ajustó el pH de la capa superior a 3,5 con HCl, y se
incubó la mezcla durante 45 minutos a la temperatura ambiente.
Subsiguientemente, se añadieron 0,1 volúmenes de
1-butanol, y se centrifugó la mezcla total. Se
recogió la interfase, y se añadieron 10 volúmenes de etanol. Se
centrifugó la mezcla, y se recogió la fracción de sedimento. Esta
fracción se lavó con 10 volúmenes de etanol, se centrifugó, y se
secó durante 145 minutos a 40ºC a vacío.
Se encontró que los cristales así obtenidos
contenían 80% de trans-licopeno, 1% de
cis-licopeno y 3,5% de
\beta-caroteno.
Claims (1)
1. Una cepa VKPM F-822 de
Blakeslea trispora, en donde la cepa produce al menos 0,3 g/l
de licopeno, cuando se co-cultiva durante al menos
3 días con una cepa adecuada de Blakeslea trispora del tipo
de acoplamiento opuesto en un medio adecuado en ausencia de un
inhibidor exógeno de la carotenogénesis específico.
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