JPWO2013002398A1

JPWO2013002398A1 - カロテノイド組成物の製造方法

Info

Publication number: JPWO2013002398A1
Application number: JP2013523000A
Authority: JP
Inventors: 健登金谷; 木下　浩一; 浩一木下; 優平野
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2015-02-23
Also published as: CN103649328A; EP2728012A1; US9096508B2; WO2013002398A1; EP2728012A4; US20140179657A1; CN103649328B

Abstract

本発明は、キサントフィロマイセス属酵母の培養物から、特殊な抽出設備、煩雑な精製工程を要することなく、また必ずしも人体に有害な有機溶媒を使用することなく、アスタキサンチンなどを高含量に含んだ天然物由来のカロテノイド組成物を効率的に工業生産できる製造法を提供する。カロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、３０℃以下の有機溶媒（Ａ）を用いて洗浄した後に、１０〜７０℃の温度で有機溶媒（Ｂ）により酵母中のカロテノイドを抽出することを特徴とする、カロテノイド組成物の製造方法。

Description

本発明はカロテノイド組成物の製造方法に関する。さらに詳しくは、キサントフィロマイセス属酵母からアスタキサンチンなどのカロテノイドを抽出することを特徴とする、カロテノイド組成物の製造方法に関する。

カロテノイドは自然界に広く分布する、黄色、橙色から赤色、または紫色を呈する天然色素として知られており、中でもその一種であるアスタキサンチンは、魚類、鶏卵の色揚げ剤として飼料用途に広く使われている。またアスタキサンチンは食品添加物としても認められており、油脂加工食品、蛋白質性食品、水性液状食品、健康食品などに幅広く使用されている。さらに近年、アスタキサンチンは、そのフリーラジカルによって誘起される脂質の過酸化に対する抗酸化活性、α−トコフェロールの数百倍に達する一重項酸素消去作用などの強力な抗酸化作用を利用し、体内の過剰な活性酸素を抑え、シミやしわの改善、白内障、動脈硬化や心臓病等の予防、免疫力強化やがんの予防等、化粧品類や機能性食品、医薬品としての用途が期待されている。

アスタキサンチンは、サケ、マス、マダイ等の魚類、カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類など広く自然界に分布すると共に、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等に属する細菌類、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ）等の藻類、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）（別名：ファフィア・ロードジーマ（Ｐｈａｆｆｉａｒｈｏｄｏｚｙｍａ））等の酵母類といった微生物によっても生産される。アスタキサンチンやゼアキサンチン等のカロテノイドは、供給の安定性やコストの問題から現在では化学合成品が広く用いられている。しかしながら、化学合成品には製法由来の不純物、特に合成反応に用いられる人体に有害な劇薬類の混入の不安があり、安全性の面から天然由来の原料からなる製品の供給が望まれている。

このような背景から特に、工業規模での大量生産に適していると考えられる天然物の藻類や微生物を利用した、アスタキサンチンをはじめとするカロテノイドの製造方法が数多く報告されている。例えば、ヘマトコッカス藻類の場合、培養した藻類のシスト細胞を熱アセトン処理し、夾雑物であるクロロフィルを溶出させた後、エタノールでアスタキサンチンを抽出する方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、同法で得られるカロテノイド組成物には多くの生体由来の夾雑物が含まれるため、産業上、十分なアスタキサンチン含量を含んだカロテノイド組成物を製造することは難しいことに加えて、製造に使用するアセトンを例えば食品添加物使用の規定値以下のレベルに除去することは困難である。

また、細胞壁を破壊したヘマトコッカス藻類を、水、グリセリン等の補助溶剤と混練して形成した成形体を抽出槽内に充填し、超臨界流体を供給してアスタキサンチンを抽出し、人体に有害な有機溶媒を使用することなく０．５〜６０％含量のアスタキサンチンを得る方法が報告されている（特許文献２）。しかしながら、同法では大量生産の際に特殊な設備が必要となるほか、十分な収率を達成するため長時間の抽出操作を要する上、高含量アスタキサンチンの取得には別途濃縮操作が必要になるなど、高含量のカロテノイド組成物を工業生産するには簡便性、経済性を満足できるものではない。

キサントフィロマイセス属（ファフィア属）酵母を用いる方法として、該酵母の菌体をｎ−ヘキサン−エタノールの混合溶媒中、圧縮粉砕機で粉砕しつつ抽出し、抽出物を濃縮して得られた油状物質を−５０℃の冷却状態で懸濁、濾過することにより遊離脂肪酸とトリグリセリドを除き、さらに色素油中の残存遊離脂肪酸を金属セッケン化して除くことでアスタキサンチンを高濃度化する方法が開示されている（特許文献３）。また、キサントフィロマイセス属（ファフィア属）酵母の破砕菌体を有機溶媒で抽出し、抽出液を濃縮して得られた油状の粗抽出エキスを、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等の精製手段でアスタキサンチンまたはそのエステルを得る方法が開示されている（特許文献４）。しかしこれらの方法はいずれも工程が複雑であり、特に後者では低濃度のアスタキサンチンの粗液を複数のカラムクロマトグラフィーにて精製を行うという煩雑な工程をとっているため、工業化が困難である。

一方、アスタキサンチンを生産する新規な細菌（Ｅ−３９６株）を用い、低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合物を用いて抽出し、その後濃縮して得られた沈殿物を低級アルコール類で洗浄することにより、アスタキサンチン含量４０％以上の乾燥物を得た例が報告されている（特許文献５、６）。同法ではエタノール等の安全性の高い溶媒と水のみで高含量のアスタキサンチン組成物の製造が可能であるものの、８０℃以上の温度で抽出する特許文献５の場合、密閉式の圧力容器中で処理する必要があり、また、そのような高温操作では、天然由来のフリー体トランス型アスタキサンチンの一部がシス型化する可能性があり、目的の構造を有するアスタキサンチンの精製収率が低下する問題がある。更に特許文献５や６の方法は、実際にその製造が確認された新規な細菌以外で、適用可能かどうか不明である。

上記以外に、培養後のキサントフィロマイセス属（ファフィア属）酵母菌体をアセトンで抽出し、得られた抽出液を濃縮して得られる粗抽出物に炭化水素系溶剤を加え、晶析させる製造方法が報告されている（特許文献７）。同法は簡便性が高く、組成物中のアスタキサンチン含量が４０％以上の高含量のものが得られるなどの利点があるが、製造過程で炭化水素系溶剤を使用するため、最終的に得られる組成物中にこれらの溶剤が残留する懸念がある。

特に、キサントフィロマイセス属酵母は、乾燥菌体重量当たり２５重量％前後もの脂質を含むことが知られており、該酵母から得られる抽出液の組成は、該脂質が主成分となるため、このような抽出液を濃縮して得られる濃縮物はべとついた粘性液となってしまう。従って、キサントフィロマイセス属酵母を使用して、アスタキサンチンが高濃度に含まれる組成物を得るためには、脂質を始めとする多くの夾雑物を製造中に除去する必要があり、その結果、上述のような複雑かつ非工業的な手段を伴うか、人体に有害で最終製品中の残存量に規制を伴うヘキサン等の有機溶媒を使用する必要があった。

こうした状況から、取扱いが容易で、なおかつ残留溶剤の少ない、もしくは残留溶剤が問題とならない方法によりアスタキサンチンを高濃度で含有する天然由来のカロテノイド組成物を製造する方法が求められていた。

特開平１１−５６３４６号公報特開２００４−４１１４７号広報特開平７−１０１８２７号公報特開平１０−２７６７２１号広報ＷＯ２００９／０２８６４３号公報特開２００７−３１９０１５号公報特開２００４−２０８５０４号公報

上述したように、従来のアスタキサンチンを高濃度で含有する天然由来のカロテノイド組成物の製造方法においては、抽出操作に特殊な設備が必要であったり、菌体由来の脂質等の夾雑物を除去するために複雑かつ非工業的な手段を要したりするなど、操作の煩雑化、コストの増大を招くという問題があった。さらには製造過程で炭化水素系溶剤など、食用用途に適さない有機溶媒を使用する場合は、残留溶剤の除去が問題となっていた。特に、脂質含量の多いキサントフィロマイセス属酵母では、高濃度のアスタキサンチンを得るための精製操作が困難であるか、可能でも非常に煩雑なものとなっており、なかでもアスタキサンチン含有組成物の粉末化は工業的レベルでは事実上不可能と考えられていた。例えば、上記特許文献５の方法を、本発明者がキサントフィロマイセス属酵母に実際に適用したところ、沈殿物中に多量の脂質が残存し、洗浄工程で濾過等の操作が行えず、満足な効率にて製造することが難しいことがわかった。

本発明は、キサントフィロマイセス属酵母の培養物から、特殊な抽出設備、煩雑な精製工程を要することなく、また必ずしも人体に有害な有機溶媒を使用することなく、アスタキサンチンなどを高濃度に含んだ天然由来のカロテノイド組成物を効率的に工業生産できる製造法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、キサントフィロマイセス属酵母からカロテノイドを抽出する前に、特定の条件で該酵母を洗浄することによって、キサントフィロマイセス属酵母からアスタキサンチン等のカロテノイドを効率的に抽出できること、また該方法は、工業生産にも適していることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、
カロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、３０℃以下の有機溶媒（Ａ）を用いて洗浄する工程、及び、
洗浄した酵母中のカロテノイドを、１０〜７０℃の温度で有機溶媒（Ｂ）により抽出する工程を含む、カロテノイド組成物の製造方法に関する。

カロテノイドがアスタキサンチンであることが好ましい。

有機溶媒（Ａ）が、ケトン類、アルコール類、炭化水素類、エーテル類及び脂肪酸エステル類からなる群より選択される少なくとも１種類の有機溶媒であることが好ましい。

有機溶媒（Ｂ）が、アルコール類、炭化水素類及びエーテル類からなる群より選択される少なくとも１種の有機溶媒であることが好ましい。

有機溶媒（Ａ）及び有機溶媒（Ｂ）が、ともにエタノールであることが好ましい。

さらに、得られたカロテノイドの抽出液を濃縮して油状組成物とする工程を含むことが好ましい。

得られる油状組成物中のアスタキサンチン含有量が１〜２０重量％であることが好ましい。

さらに、得られたカロテノイドの抽出液からカロテノイドを析出させ、得られる析出物を固液分離して粉末組成物とする工程を含むことが好ましい。

得られる粉末組成物中のアスタキサンチン含有量が２０〜８０重量％であることが好ましい。

さらに本発明は、粉末Ｘ線回折において、回折角１３．３°（２θ±０．２°）、１３．８°（２θ±０．２°）、１４．３°（２θ±０．２°）、１５．８°（２θ±０．２°）、１６．３°（２θ±０．２°）、１８．２°（２θ±０．２°）、２０．５°（２θ±０．２°）、２４．８°（２θ±０．２°）、及び、２５．３°（２θ±０．２°）にピークを有し、なおかつ（３Ｒ、３’Ｒ）の化学構造を有するアスタキサンチンを含有するカロテノイド組成物にも関する。

上記カロテノイド組成物は、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数が６０以上の粉体であることが好ましい。

上記カロテノイド組成物中のアスタキサンチン含有量が２０〜８０重量％であることが好ましい。

さらに本発明は、キサントフィロマイセス属酵母由来のアスタキサンチンを含有し、組成物中のアスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合が４０重量％以下であることを特徴とする油状組成物である、カロテノイド組成物にも関する。

上記カロテノイド組成物のアスタキサンチン含有量が１〜２０重量％で、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度が０．０１〜１Ｐａ・ｓであることが好ましい。

本発明の製造方法では、キサントフィロマイセス属酵母に含まれる脂質等の夾雑物の大半を事前に除去することで、その後のカロテノイドの抽出、濃縮操作を効率良くできるため、簡便で、工業生産にも適した、天然物由来のカロテノイド組成物の製造方法を提供できる。また本発明の製造方法では、食用用途に適用可能な安全な溶媒のみで操作することも可能であり、取扱いが容易で、なおかつ残留溶剤の少ない、もしくは残留溶剤が問題とならない方法にて製造することが可能である。

さらに本発明で製造し得るカロテノイド組成物は、アスタキサンチン等の目的とするカロテノイドを高濃度で含有しているだけでなく、優れた粉体流動特性を持つ粉体として得ることもできる。また、本発明で製造し得るカロテノイド組成物に食用の液体油脂を添加し、油状物とした場合でも、従来の方法で作製し得る同じアスタキサンチン含有量の油状物と比較すると、粘度が低く、取り扱いに優れた油状物として得ることができる。

実施例１４、比較例５、及び、参考例１の組成物の吸収性の評価結果を示した図である。

以下に本発明の実施形態を詳細に説明する。

本発明の製造方法は、カロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、３０℃以下の有機溶媒（Ａ）を用いて洗浄した後に、１０〜７０℃の温度で有機溶媒（Ｂ）により酵母中のカロテノイドを抽出することを特徴とする、カロテノイド組成物の製造方法である。

本発明におけるカロテノイドとしては特に限定されないが、具体的には、αカロテン、βカロテン、γカロテン、δカロテン、リコペン等のカロテン類、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アスタキサンチン、アンテラキサンチン等のキサントフィル類等が挙げられ、特にその中でも、本発明の製造方法は、カロテノイドとして、特にアスタキサンチンを得るのに適している。この場合、得られるアスタキサンチンとしては、アスタキサンチン以外のカロテノイドとの混合物として得られる態様も含まれる。

本発明の製造方法の原料として用いるキサントフィロマイセス属酵母は、カロテノイドを生産するものであれば特に限定されないが、特にカロテノイドとしてアスタキサンチンを製造するキサントフィロマイセス属酵母の具体例として、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）（別名：ファフィア・ロードジーマ（Ｐｈａｆｆｉａｒｈｏｄｏｚｙｍａ））等が挙げられる。

なお、本発明においては、上記キサントフィロマイセス属酵母の野生株のみならず、例えば、上記キサントフィロマイセス属酵母の目的とするカロテノイド類の生合成に関与する遺伝子の転写及び翻訳活性、あるいは発現蛋白質の酵素活性を、改変あるいは改良した変異体や組換え体も好ましく使用することができる。

本発明に用いられるキサントフィロマイセス属酵母の培養方法は特に限定されず、対象となるキサントフィロマイセス属酵母に適した、あるいは目的とするカロテノイドの生産に適した培養方法を適宜選択すればよい。培養に用いる炭素源としては、例えば、スクロース、グルコース、キシロース、マルトース、コーンシロップ、糖蜜、デンプン、グリセリン、エタノール、酢酸、乳酸、クエン酸、コハク酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの炭素源は単独で用いてもよく、菌体中のカロテノイド含有量の向上を目的として、２種以上組み合わせて用いてもよい。２種以上の炭素源を組み合わせて用いる場合、それらの炭素源を同時に培地中に添加してもよく、培養の途中で添加する炭素源を変更してもよい。後者の例として、培養の前半はグルコースを、培養の後半はキシロースを炭素源として培養する方法、同様に、前半はグルコース、後半はマルトースで培養する方法、前半はグルコース、後半はエタノールで培養する方法、前半はグルコース、後半はグリセリンで培養する方法、および、前半はグルコース、後半はクエン酸で培養する方法等が挙げられるが、これらの組み合わせに限定されず、如何なる炭素源の組み合わせでも、同様に実施しうる。培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニア、アンモニウム塩、尿素、アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの窒素源は単独で用いてもよく、炭素源の場合と同様に、２種以上組み合わせて用いてもよい。炭素源、窒素源以外の栄養素としては、例えば、リン酸等のリン源、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、銅、鉄、亜鉛、マンガン、モリブデン等のミネラル類、ビオチン等のビタミン類等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。炭素源、窒素源、および、その他の栄養素は、一括添加、分割添加、あるいは連続添加等の方法で供給することができる。培養温度は特に限定されないが、１５〜２６℃の範囲が好ましい。培養液のｐＨは特に限定されないが、３〜７の範囲が好ましい。

本発明の製造方法においては、上述したような培養によって得られるカロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母から、酵母細胞中のカロテノイドを抽出するに際して、培養後のキサントフィロマイセス属酵母から直接抽出することもできるが、所望により前記キサントフィロマイセス属酵母を破砕して細胞破砕物とし、該破砕物から抽出することもできる。従って、本発明の製造方法で用いられる「キサントフィロマイセス属酵母」としては、酵母細胞そのもの、凍結乾燥、噴霧乾燥等により乾燥したもの、以下に記載する細胞破砕処理を施したもののいずれもその対象である。特に酵母細胞の破砕は、キサントフィロマイセス属酵母中に生産・蓄積されたカロテノイドの効率的な抽出に寄与する。細胞破砕処理は、必ずしも必要ではないが、細胞が破砕されていないと、細胞中に生産・蓄積されたカロテノイドの回収効率は低下する。なお、本発明における酵母細胞の破砕は、目的とするカロテノイドの抽出が可能である程度に細胞壁等の表面構造が損傷を受ければよく、必ずしも細胞壁が完全に破れる、あるいは酵母細胞が断片化される必要はない。

上記細胞破砕及び／又は後述の有機溶媒（Ａ）による洗浄の対象となるキサントフィロマイセス属酵母の形態は、該酵母を含む培養液、その培養液を濃縮したもの、それら培養液から加圧濾過、減圧濾過、自然濾過、遠心分離、デカンテーション等の一般的な方法によりキサントフィロマイセス属酵母を湿菌体として採取したもの、該湿菌体を洗浄したもの、湿菌体を溶媒（例えば、水、生理食塩水、緩衝液等も含む）に懸濁したもの、前記湿菌体を乾燥させた乾燥菌体、または該酵母を含む培養液を噴霧乾燥や凍結乾燥などにより乾燥させた乾燥菌体、これら乾燥菌体を溶媒（例えば、水、生理食塩水、緩衝液等も含む）に懸濁したもの等が挙げられ、そのいずれでもよい。また、上記濾過操作を行う場合、操作の効率化のために濾過助剤を使用してもよく、その場合、使用した濾過助剤を除去することなく湿菌体又は乾燥菌体として以降の操作を実施することもできる。細胞破砕時においては、好ましくはキサントフィロマイセス属酵母が水性の溶媒に懸濁している水性懸濁液の形態であり、操作性等の面から、より好ましくは、キサントフィロマイセス属酵母を含む培養液そのもの、該培養液を濃縮したものや、キサントフィロマイセス属酵母の湿菌体を溶媒に懸濁させたものがキサントフィロマイセス属酵母の水性懸濁液として使用できる。

上記キサントフィロマイセス属酵母の破砕は、以下の１つ、または幾つかの破砕方法を任意の順序で行うことにより行われる。破砕方法としては、例えば、物理的処理、化学的処理、酵素的処理の他、加熱処理、自己消化、浸透圧溶解、原形質溶解等を挙げることができる。

上記物理的処理としては、例えば、高圧ホモジナイザー、回転刃式ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー、フレンチプレス、ボールミル等の使用、あるいは、これらの組み合わせを挙げることができる。

上記化学的処理としては、例えば、塩酸、硫酸等の酸（好ましくは強酸）を用いる処理、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の塩基（好ましくは強塩基）を用いる処理等や、これらの組み合わせを挙げることができる。

上記酵素的処理としては、例えば、リゾチーム、ザイモリアーゼ、グルカナーゼ、ノボザイム、プロテアーゼ、セルラーゼ等を用いる方法を挙げることができ、適宜これらを組み合わせて用いても良い。

上記加熱処理としては、例えば、６０〜１４０℃で３０分〜３時間程度の処理を挙げることができる。

上記自己消化としては、例えば、酢酸エチル等の溶媒による処理のほか、３０〜６０℃で１〜４８時間程度、加温する処理等を挙げることができる。

また、細胞内の塩濃度と異なる溶液で処理することにより、細胞の浸透圧溶解や原形質溶解を引き起こすこともできる。ただし、この方法のみでは細胞破砕効果が不十分な場合が多いため、上記のような物理的処理、化学的処理、酵素的処理、加熱処理、自己消化等と合わせて用いるのが好ましい。上記破砕方法の中でも、物理的処理、化学的処理（特に酸処理、好ましくは強酸（例えば、水溶液中におけるｐＫａが２．５以下の酸））や加熱処理が好ましく、破砕効率の点から物理的処理、化学的処理がより好ましい。

本発明の製造方法においては、上記のようにして調製されたカロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、３０℃以下の有機溶媒（Ａ）を用いて洗浄を行う。ここで、洗浄は、カロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、湿菌体、乾燥菌体、または水性懸濁液とした状態で行うのが好ましい。また、その場合の湿菌体、乾燥菌体の含水率や、水性懸濁液中の菌体濃度は特に制限されないが、湿菌体であれば、含水率が通常２０〜７５重量％の範囲、乾燥菌体であれば、含水率が通常０．０１〜２０重量％の範囲が好ましく、また、水性懸濁液であれば、乾燥重量換算の菌体濃度として、通常１〜２５重量％の範囲のものが使用できる。

本発明の製造方法において、洗浄時に用いる有機溶媒（Ａ）としては、特に限定されないが、目的とするカロテノイドに対する洗浄条件での溶解度があまり高くないものが好ましい。そのような有機溶媒としては、例えば、ケトン類、アルコール類、炭化水素類、エーテル類、及び、脂肪酸エステル類が好ましく使用できる。

上記ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくはアセトンである。

上記アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６である。なかでも、炭素数１〜５の１価アルコール、炭素数２〜５の２価アルコール、炭素数３の３価アルコールが好ましい。

これらアルコール類の具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等の１価アルコール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等の２価アルコール；グリセリン等の３価アルコールを挙げることができる。

１価アルコールとしては、好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等である。より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、シクロヘキサノール等である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール等である。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール等であり、最も好ましくは、エタノールである。

２価アルコールとしては、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール等が好ましく、１，２−エタンジオールが最も好ましい。３価アルコールとしては、グリセリンが好ましい。

上記炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。このなかでも脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。

脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数５〜１２、より好ましくは炭素数５〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、２−ペンテン、１−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、１−ノネン、１−デセン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン、シクロヘキセン等を挙げることができる。好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン等である。より好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等であり、さらに好ましくは、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等であり、特に好ましくは、酸化からの防護効果が特に高いという点から、ヘプタン、メチルシクロヘキサンであり、最も好ましくはヘプタンである。

芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１２、より好ましくは炭素数７〜１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン等である。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、テトラリン等である。最も好ましくは、クメンである。

ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。より好ましくは塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素であり、さらに好ましくは塩素化炭化水素である。また、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜２のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン，１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。

上記エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数４〜１２、より好ましくは炭素数４〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。

上記脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸エステル、ギ酸エステルであり、より好ましくは酢酸エステルである。エステル基としては、特に制限されないが、通常、炭素数１〜８のアルキルエステル、炭素数７〜１２のアラルキルエステルが、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステルが、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルが用いられる。

プロピオン酸エステルの具体例としては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。好ましくはプロピオン酸エチル等である。

酢酸エステルの具体例としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル等である。より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル等であり、最も好ましくは、酢酸エチルである。

ギ酸エステルの具体例としては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチル等である。最も好ましくは、ギ酸エチルである。

本発明における有機溶媒（Ａ）は、言うまでもなく上記溶媒を単一で使用することも可能であるし、２種類以上を組み合わせて使用することもできる。また、上記溶媒を水と混合した状態で使用することもできる。つまり含水有機溶媒も、本発明における有機溶媒（Ａ）に含まれる。

本発明の製造方法において、洗浄時の温度条件としては、洗浄に使用する有機溶媒（Ａ）の温度が３０℃以下となる条件であれば特に限定されないが、２０℃以下がより好ましく、１０℃以下がさらに好ましく、８℃以下が特に好ましい。有機溶媒（Ａ）の温度が３０℃を超えると、洗浄液中のカロテノイド含有量が高くなり、結果、酵母中から抽出し得るカロテノイド量が低下し、カロテノイドの回収率が悪化するという問題がある。

また、洗浄に使用する有機溶媒（Ａ）の量は、使用する有機溶媒（Ａ）の種類や洗浄時の温度、目的とするカロテノイドの種類にもより特に限定されないが、例えば、有機溶媒（Ａ）に対するカロテノイドの溶解度が３０重量％以下となる条件、具体的には、菌体の乾燥重量１重量部に対する有機溶媒（Ａ）の量として２００重量部以下、より好ましくは５０重量部以下、さらに好ましくは２０重量部以下とすることで洗浄時のカロテノイドの損失をある程度抑えることができる。但し、洗浄時の有機溶媒（Ａ）の温度がかなり低い場合や、目的のカロテノイドをほとんど溶解しない有機溶媒（Ａ）（例えば、グリセリン、ヘキサン、酢酸エチル、トルエン等）を使用する場合は、より多くの有機溶媒（Ａ）を洗浄に使用しても、同様の目的を達成することができる。

特に、カロテノイドとしてアスタキサンチンを得ることを目的とする場合、有機溶媒（Ａ）としては、ケトン類またはアルコール類を使用するのが好ましく、その中でもアセトン又はエタノールを使用するのがより好ましく、エタノールを使用するのがさらに好ましい。例えば、有機溶媒（Ａ）としてアセトン又はエタノールを使用する場合の使用量としては、特に限定されないが、例えば、菌体の乾燥重量１重量部に対して、好ましくは０．１重量部以上、より好ましくは１重量部以上、さらに好ましくは５重量部以上で、好ましくは２００重量部以下、より好ましくは５０重量部以下、さらに好ましくは２０重量部以下である。

本発明の製造方法において、有機溶媒（Ａ）を用いてカロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を洗浄する際の洗浄方式には特に制限はなく、例えば、撹拌翼や静止型ミキサー、ポンプ等による混合や、菌体の濾過操作時に濾板上のキサントフィロマイセス属酵母に有機溶媒（Ａ）を添加し、濾過洗浄しても良いが、洗浄効率の観点から撹拌翼を用いて有機溶媒（Ａ）とカロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を一定時間接触・混合させ、その後、該ファフィア属酵母と有機溶媒（Ａ）を分離することで洗浄操作を行うことが好ましい。その場合の洗浄時間（すなわち有機溶媒（Ａ）とカロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母の接触時間）は、特に制限されないが、２４時間以内が好ましく、より好ましくは１分〜６時間の範囲であり、さらに好ましくは、１０分〜３時間の範囲である。なおここで、洗浄時間を適宜調整することで、洗浄時のカロテノイドの損失をある程度抑えることもできる。また、洗浄終了後のキサントフィロマイセス属酵母と有機溶媒（Ａ）との分離操作の種類には特に制限は無く、加圧濾過、減圧濾過、自然濾過、遠心分離、デカンテーション等の一般的な方法により実施することができ、言うまでもなく、これらの操作を組み合わせて行うこともできる。濾過操作を行う場合、操作の効率化のために濾過助剤を使用しても良い。

本発明の製造方法においては、上記のようにして抽出操作の前に有機溶媒（Ａ）を用いてキサントフィロマイセス属酵母を予め洗浄することで、菌体内に多量の脂質を含むキサントフィロマイセス属酵母から、脂質をはじめとする菌体由来の夾雑物の大半が除去され、最終的に製造し得る目的のカロテノイド組成物の高含有量化、油状組成物とした場合の粘度の低減や、粉末組成物として得た場合の粉体流動性の向上が図れるほか、製造過程においても残存脂質に起因して生じるべとつきが抑えられ、装置内の付着等の問題が大幅に改善されるなど、生産効率や生産性を向上させることができる。

次に、本発明の製造方法では、上記有機溶媒（Ａ）を用いて洗浄を行ったキサントフィロマイセス属酵母から、１０〜７０℃の温度で有機溶媒（Ｂ）を用いて目的とするカロテノイドの抽出を行う。

本発明の製造方法において、抽出に用いる有機溶媒（Ｂ）としては、目的のカロテノイドを効率よく抽出できるものであれば特に限定されないが、例えば、アルコール類、炭化水素類及びエーテル類が好ましく使用できる。

本発明における有機溶媒（Ｂ）は、言うまでもなく上記溶媒を単一で使用することも可能であるし、２種類以上を組み合わせて使用することもできる。また、洗浄に用いる有機溶媒（Ａ）と抽出に用いる有機溶媒（Ｂ）とは、同一でも異なっていても良い。使用した溶媒の回収・再利用の点からは、洗浄に用いる有機溶媒（Ａ）と抽出に用いる有機溶媒（Ｂ）として同一の有機溶媒を使用するのが好ましい。また、残留溶剤が問題とならないという観点では、洗浄に用いる有機溶媒（Ａ）と抽出に用いる有機溶媒（Ｂ）として、両方エタノールを使用するのが最も好ましい。

本発明の製造方法において、抽出溶媒として使用する有機溶媒（Ｂ）の使用量は特に限定されないが、有機溶媒（Ｂ）の使用量が菌体の乾燥重量に対し著しく多い場合、得られる抽出液中のカロテノイド濃度が極端に希薄となってしまい、効率的な精製処理が困難となる。一方、菌体の乾燥重量に対し、有機溶媒（Ｂ）の使用量が著しく少ない場合は、高濃度のカロテノイド抽出液が得られるものの、有機溶媒（Ｂ）のカロテノイドに対する飽和溶解度の観点から、菌体中のカロテノイドを効率良く抽出することは極めて難しい。そのような観点から、本発明の製造方法における有機溶媒（Ｂ）の好ましい使用量は、菌体の乾燥重量１重量部に対し１重量部以上であり、より好ましくは５重量部以上であり、最も好ましくは１０重量部以上である。また、その上限も特に限定されないが、好ましくは１０００重量部以下であり、より好ましくは５００重量部以下であり、最も好ましくは３００重量部以下である。

本発明の製造方法において、有機溶媒（Ｂ）による抽出時の温度は、１０〜７０℃の範囲であり、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、特に好ましくは３５℃以上である。また、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。なお、抽出時の温度が高いほど抽出効率は向上するが、７０℃を超える場合、カロテノイド中のアスタキサンチンの一部がシス体化するなど、カロテノイドの構造が変質する問題がある。一方、１０℃未満の抽出温度では、有機溶媒（Ｂ）に対するカロテノイドの溶解度が低いため、満足な収率を得ることが困難となる。

本発明の製造方法においては、有機溶媒（Ｂ）を用いた抽出操作を行う際の、有機溶媒（Ｂ）とキサントフィロマイセス属酵母の混合方式には特に制限はなく、例えば、撹拌翼や静止型ミキサー、ポンプ等や、高圧ホモジナイザー、回転刃式ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー等の破砕・乳化装置を用いることもでき、言うまでもなく、これらの装置を組み合わせて抽出することもできる。

本発明の製造方法において、抽出手段としては、回分抽出、連続抽出のどちらの方法でも採用することができ、これらの操作を複数回繰り返すこともできるが、工業的には連続抽出が生産性の面で好ましく、連続抽出の中でも向流多段抽出が特に好ましい。回分抽出の場合の撹拌時間は、特に制限されないが、通常５分以上であり、連続抽出の場合の平均滞留時間は、特に制限されないが、通常１０分以上である。また回分抽出の回数も特に限定されず、１回の抽出でも効率よく抽出できるが、２回以上抽出を繰り返すのが収率の観点からは好ましい。

なお、本発明の製造方法においては、有機溶媒（Ｂ）による抽出を行う前に、洗浄後のキサントフィロマイセス属酵母を、抽出に使用する有機溶媒（Ｂ）と接触させた状態で加温処理するのが、その後の抽出工程での抽出効率を向上させ、抽出に使用する有機溶媒（Ｂ）の使用量を大幅に低減させることが可能な点で、好ましい。加温処理時に使用する有機溶媒（Ｂ）の使用量は、抽出に使用する有機溶媒（Ｂ）の使用量の一部分、例えば、抽出に使用する有機溶媒（Ｂ）の使用全量に対し１０〜７０％程度の量であっても効果を発揮しうる。具体的には、菌体の乾燥重量１重量部に対し、好ましくは１〜５０重量部以上、より好ましくは５〜３０重量部程度の有機溶媒（Ｂ）を加温処理時に使用することが出来る。当該加温処理時の温度は、４０℃以上であれば特に限定されないが、好ましくは５０〜８０℃の範囲で実施される。加温時間も特に限定されないが、好ましくは１〜１２０分、より好ましくは１５〜６０分である。加温方法としても特に限定されず、キサントフィロマイセス属酵母を有機溶媒（Ａ）で洗浄した後、所定温度に加温した有機溶媒（Ｂ）を加えてもよいし、常温の有機溶媒（Ｂ）を加えた後に、当該混合物を所定温度まで加温してもよい。また加温時において有機溶媒（Ｂ）とキサントフィロマイセス属酵母は静置状態でも撹拌された状態でもかまわないが、適宜撹拌された状態にあるのが好ましい。その場合の撹拌方式には特に制限はなく、抽出時に使用する混合方法及び／又は装置がそのまま使用できる。本発明の製造方法においては、上記加温処理後、加温処理に使用した有機溶媒（Ｂ）を一部又は全量除去した後、次の抽出を実施してもよいが、加温処理後の有機溶媒（Ｂ）とキサントフィロマイセス属酵母の混合物を分離することなく、引き続き次の抽出工程を実施するのが好ましい。また、抽出時に、必要に応じてさらに抽出に必要な有機溶媒（Ｂ）を追加してもよい（すなわち、加温処理後に残留する有機溶媒（Ｂ）とその後必要に応じて追加された有機溶媒（Ｂ）の合計が、抽出に使用される有機溶媒（Ｂ）となる）。なお、加温処理時の温度が抽出温度よりも高い場合は、所望の温度まで冷却した後、次の抽出操作を実施することが出来る。

上記有機溶媒（Ｂ）を用いたカロテノイドの抽出操作が完了した後、キサントフィロマイセス属酵母と有機溶媒（Ｂ）との分離を行う。分離操作の種類には特に制限は無く、加圧濾過、減圧濾過、自然濾過、遠心分離、デカンテーション等の一般的な方法により実施することができ、言うまでもなく、これらの操作を組み合わせて行うこともできる。

本発明の製造方法においては、キサントフィロマイセス属酵母中に含まれるアスタキサンチンなどのカロテノイドを高い効率で抽出することが可能であり、その抽出率は、通常５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上である。

本発明の製造方法においては、上記のようにして得られたカロテノイドの抽出液をそのまま、あるいは適宜加工することでカロテノイド組成物とすることが出来る。本発明の製造方法によって得られるカロテノイド組成物の性状は特に限定されないが、好ましくは、以下に説明するような処理を行って得られる、油状組成物、または粉末組成物である。

上記油状組成物は、有機溶媒（Ｂ）によるカロテノイドの抽出液を濃縮することで製造できる。この場合の濃縮操作の方式には特に制限は無く、タンク内での減圧濃縮、フラッシュ濃縮、薄膜濃縮等の操作を適用することができる。

上記濃縮操作は油状組成物中の有機溶媒（Ａ）、または有機溶媒（Ｂ）が十分に除去されるまで実施するのが好ましい。油状組成物中の有機溶媒（Ａ）及び有機溶媒（Ｂ）の残存濃度は、食品、化粧品、医薬品として人体に害を及ぼさない程度であれば特に制限はないが、油状組成物中の残存量として１重量％以下が好ましく、より好ましくは０．１重量％以下であり、さらに好ましくは０．０１重量％以下である。

上記濃縮操作における温度条件は、濃縮中にカロテノイドの分解やシス体化等の変質が著しく生じることのない条件であれば特に制限はなく、好ましくは１０〜８０℃の範囲であり、より好ましくは２０〜７０℃の範囲であり、さらに好ましくは２５〜６０℃の範囲である。また、本発明における濃縮操作においては、必要に応じて、減圧下で操作してもよい。

本発明の製造方法においては、上記濃縮により得られる濃縮物が油状である場合、それをそのまま油状組成物として利用することもできるが、乾固物として得られた場合やその他製品としての取り扱い易さの観点から、該濃縮物に液体油脂を添加、混合することで、目的とする油状組成物を調製しても良い。なお、本発明における「油状組成物」とは、カロテノイドとその他の成分が均一に油状状態で混合している場合だけでなく、カロテノイドが一部析出し、スラリー状となっている形態も含まれる。

上記添加することのできる液体油脂としては、アスタキサンチンなどのカロテノイドの濃縮物を溶解または分散させることのできる油脂であれば特に制限はなく、例えば、動植物からの天然油脂であってもよく、合成油脂や加工油脂であってもよい。より好ましくは、食品、化粧品又は医薬用に許容されるものである。植物油脂としては、例えば、ヤシ油、パーム油、パーム核油、アマニ油、つばき油、玄米胚芽油、菜種油、米油、落花生油、コーン油、小麦胚芽油、大豆油、エゴマ油、綿実油、ヒマワリ種子油、カポック油、月見草油、シア脂、サル脂、カカオ脂、ゴマ油、サフラワー油、オリーブ油等を挙げることができ、動物油脂としては、例えば、豚脂、乳脂、魚油、牛脂等を挙げることができ、さらに、これらを分別、水素添加、エステル交換等により加工した油脂（例えば、硬化油）も挙げることができる。言うまでもなく、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）も使用しうる。又、これらの混合物を使用しても良い。中鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、例えば、脂肪酸の炭素数が各々６〜１２、好ましくは８〜１２のトリグリセリドを挙げることができる。

上記、油脂のうち、取り扱い易さ、臭気等の面から植物油脂、合成油脂や加工油脂等が好ましく、そのより好ましい具体例として、ヤシ油、パーム油、パーム核油、菜種油、米油、大豆油、綿実油、サフラワー油、オリーブ油、ＭＣＴ等を挙げることができる。

上記液体油脂は、カロテノイドの抽出液の濃縮物を作製後に添加、混合することで目的とするカロテノイドの油状組成物を調製してもよいし、抽出操作、または濃縮操作の前やその途中で予め添加しておき、その後の処理を行っても良い。

本発明におけるカロテノイドを含有する油状組成物中のカロテノイド含量としては特に限定されず、目的とする製品の求められる用途に応じて適宜選択しうるが、例えばカロテノイドとしてアスタキサンチンを目的とする場合、取り扱いやすい粘度・性状を有する油状組成物を調製するという観点においては、油状組成物中のアスタキサンチン含有量の上限として、３０重量％以下が好ましく、より好ましくは２０重量％以下、さらにより好ましくは１５重量％以下である。また油状組成物中のアスタキサンチン含有量の下限としては特に限定されず、０．１重量％以上が好ましく、より好ましくは１重量％以上、さらにより好ましくは３重量％以上である。

特に、本発明の製造方法では、キサントフィロマイセス属酵母由来のエルゴステロールの含有量が低い油状組成物を製造することが出来る。例えば、本発明の製造方法によって得られる油状組成物中の、アスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合（エルゴステロール含有量／アスタキサンチン含有量）は４０重量％以下である。すなわち、そのような、キサントフィロマイセス属酵母由来のアスタキサンチンを含有し、アスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合が４０重量％以下となるカロテノイド含有油状組成物もまた、その製造方法によらず、本発明の範疇である。エルゴステロール含有量の割合は、３５重量％以下であることが好ましく、３０重量％以下であることがより好ましい。アスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合は、高速液体クロマトグラフィー等により測定することができる。

さらに、本発明の製造方法においては、アスタキサンチンを高濃度で含有する油状組成物を容易に得ることが出来るだけでなく、得られた油状組成物は、従来公知の製造方法で得られるキサントフィロマイセス属酵母由来のアスタキサンチン含有油状組成物と比較して、非常に低粘度で、取り扱いしやすい性状を有するという特徴も有している。例えば、本発明の好ましい製造方法を採用することで、アスタキサンチン含有量が１〜２０重量％で、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度が０．０１〜１Ｐａ・ｓ、好ましくは０．０１〜０．７Ｐａ・ｓの範囲である、従来にない高濃度で且つ低粘度のカロテノイド含有油状組成物を製造することが出来る。すなわち、キサントフィロマイセス属酵母由来のアスタキサンチンを含有し、アスタキサンチン含有量が１〜２０重量％で、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度が０．０１〜１Ｐａ・ｓ、好ましくは０．０１〜０．７Ｐａ・ｓである、カロテノイド含有油状組成物もまた、その製造方法によらず、本発明の範疇である。

さらに、本発明の製造方法で得られるカロテノイド組成物は、従来公知の製造方法で得られるキサントフィロマイセス属酵母由来のカロテノイド組成物と比べて、生体への吸収性にも優れていることも確認された。

一方、本発明の製造方法では、有機溶媒（Ｂ）によるカロテノイドの抽出液に対し濃縮及び／又は冷却などの処理を行うことにより、カロテノイドを析出させ、得られる析出物を固液分離することで、カロテノイド組成物として、アスタキサンチンが高濃度に含まれた粉末組成物を製造することもできる。

なお、キサントフィロマイセス属酵母からカロテノイドを抽出する場合、抽出工程よりも前に有機溶媒による洗浄工程を実施しなかった場合、抽出液を濃縮しても粘調な濃縮物が得られるのみで、カロテノイドを分離可能な状態で析出させることは出来ず、例えば特許文献５、６のように、当該濃縮液をエタノールなどで洗浄してもカロテノイド、特にアスタキサンチンを結晶として得ることは出来ない。従って、本発明の製造方法においては、特にカロテノイド組成物を粉末状とする目的において、有機溶媒（Ｂ）による抽出よりも先に有機溶媒（Ａ）による洗浄を行うという順序が重要である。

本発明の製造方法において、カロテノイドを析出させる方法には特に制限は無く、例えば抽出液を濃縮しながら蒸発晶析する方法、抽出液をそのままあるいは適宜濃縮したものにカロテノイドに対する貧溶媒を添加してカロテノイドを析出させる方法、抽出液をそのままあるいは適宜濃縮したものをカロテノイドの飽和溶解度を超える条件に冷却し晶析する方法等が挙げられる。本発明は、言うまでもなく、これらの操作を組み合わせて製造することもできるが、収率や操作性の観点から、抽出液を濃縮し、ある程度カロテノイド結晶が析出した状態で、貧溶媒を添加するか冷却することでカロテノイドを析出させることが望ましい。

上記粉末組成物の製造において、抽出液の濃縮操作を行う場合、抽出液の濃縮倍率が低すぎると、目的のカロテノイドのほとんどが母液側に溶解したままとなり、製造し得る粉末組成物の総量は少なくなり、満足な収率、生産性は得られない傾向がある。一方、抽出液の濃縮倍率が高すぎる場合、カロテノイド以外のキサントフィロマイセス属酵母由来の夾雑物の析出が顕著となり、製造し得る粉末組成物中のアスタキサンチン含有量が低下する問題がある。従って、粉末組成物の製造にあたっては、十分な収率、生産性、含有量を満たすためには適切な濃縮倍率まで抽出液を濃縮するのがよく、例えば、抽出液の濃縮倍率が１０〜１０００倍の範囲まで濃縮するのが好ましく、５０〜５００倍の範囲まで濃縮するのがより好ましい。

粉末組成物の製造においては、次に、上記析出操作の後、抽出に用いた有機溶媒と析出物の固液分離を行う。上記固液分離には通常の固液分離操作を適用することができ、例えば、デカンテーション、遠心分離、加圧濾過、減圧濾過、自然濾過等が挙げられ、さらに、必要に応じてケーキ洗浄を行い、さらに、真空乾燥などの乾燥処理を行って残存する有機溶媒等を除去することにより、カロテノイド組成物を乾燥粉末として取得することができる。

アスタキサンチンには、粉末Ｘ線回折において、回折角１３．３°（２θ±０．２°）、１３．８°（２θ±０．２°）、１４．３°（２θ±０．２°）、１５．８°（２θ±０．２°）、１６．３°（２θ±０．２°）、１８．２°（２θ±０．２°）、２０．５°（２θ±０．２°）、２４．８°（２θ±０．２°）、及び、２５．３°（２θ±０．２°）に強いピークを有するＦｏｒｍＩ、並びに、回折角１２．２°（２θ±０．２°）、１３．２°（２θ±０．２°）、１３．５°（２θ±０．２°）、１６．１°（２θ±０．２°）、１６．６°（２θ±０．２°）、２０．１°（２θ±０．２°）、２１．３°（２θ±０．２°）、２２．７°（２θ±０．２°）、２４．６°（２θ±０．２°）、及び、２７．５°（２θ±０．２°）に強いピークを有するＦｏｒｍＩＩの２種類の結晶多形が知られているが、上記本発明の製造方法によって得られる粉末組成物は、粉末Ｘ線回折において、回折角１３．３°（２θ±０．２°）、１３．８°（２θ±０．２°）、１４．３°（２θ±０．２°）、１５．８°（２θ±０．２°）、１６．３°（２θ±０．２°）、１８．２°（２θ±０．２°）、２０．５°（２θ±０．２°）、２４．８°（２θ±０．２°）、及び、２５．３°（２θ±０．２°）に強いピークを有することがわかった。すなわち、本発明の製造方法によって得られる粉末組成物は、結晶形としてＦｏｒｍＩのアスタキサンチンを高含有するカロテノイド組成物であるといえる。さらに本発明の製造方法によって得られるカロテノイド組成物中のアスタキサンチンは、キサントフィロマイセス属由来のアスタキサンチンであり、（３Ｒ、３’Ｒ）の化学構造を有する。従来、キサントフィロマイセス属酵母由来で、そのような結晶形かつ化学構造を有するアスタキサンチンを高含有する粉末状の組成物は報告されていない。従って、粉末Ｘ線回折において、回折角１３．３°（２θ±０．２°）、１３．８°（２θ±０．２°）、１４．３°（２θ±０．２°）、１５．８°（２θ±０．２°）、１６．３°（２θ±０．２°）、１８．２°（２θ±０．２°）、２０．５°（２θ±０．２°）、２４．８°（２θ±０．２°）、及び、２５．３°（２θ±０．２°）に強いピークを有し、（３Ｒ、３’Ｒ）の化学構造を有するアスタキサンチンを含有するカロテノイド組成物もまた、その製造方法によらず、本発明の範疇である。

本発明の製造方法においては、製造過程で有機溶媒（Ａ）を用いて菌体洗浄することにより、キサントフィロマイセス属酵母由来の脂質等の夾雑物の大半が除去されるため、カロテノイド組成物として得られる粉末組成物は、粉体流動特性にも優れている。具体的には、本発明の好ましい製造方法によって得られる粉末組成物は、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数が６０以上の粉末として得られる。粉体流動特性の観点から、その指数は高いほど好ましく、上記好ましい製造条件を適宜選択することで、７０以上、さらには８０以上の粉末組成物を得ることも出来る。一方特許文献７の方法で得られるアスタキサンチン含有粉末組成物は、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数が６０を下回り、流動性が悪く、カロテノイド粉末の移送時の効率が悪化したり、装置充填がスムーズにできない等、生産性や操作性に問題を有している。従って、上記アスタキサンチンを含有するカロテノイド組成物として、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数が６０以上である粉体もまた、本発明のカロテノイド組成物の好ましい態様の一つである。

なお、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数は、粒子の安息角、圧縮度、スパチュラ角、均一度を総合的に評価した指数であり、ＣＨＥＭＩＣＡＬＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，Ｊａｎｕａｒｙ１８（１９６５）において定義されたものである。上述の粉体流動特性指数に関する定義を表１に示す。

さらに、上記本発明の製造方法によって得られる粉末組成物中のアスタキサンチン含有量は、２０〜８０重量％の範囲であることが好ましく、より好ましくは３０〜８０重量％、さらに好ましくは４０〜８０重量％である。従来の製造方法では、このようにキサントフィロマイセス属酵母由来のアスタキサンチンを高濃度で含有し、夾雑物が少ない粉末組成物を得ることは事実上困難であった。すなわち、キサントフィロマイセス属酵母由来のアスタキサンチンを含有し、アスタキサンチン含有量が２０〜８０重量％の範囲となる粉末組成物もまた、本発明のカロテノイド組成物の好ましい態様の一つである。

次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（高速液体クロマトグラフィー分析条件）
カラム：ＦｉｎｅＰａｋＳＩＬＣ１８Ｔ−５、４．６×２５０ｍｍ（日本分光株式会社製）
移動相：アセトニトリル／酢酸エチル／蟻酸／蒸留水＝６００／３００／６０／４０
流速：０．８ｍＬ／分
検出波長：４７１ｎｍ
（ガスクロマトグラフィー分析条件）
カラム：Ｊ＆ＷＤＢ−６２４、３０ｍ×０．３２ｍｍ、Ｆｉｌｍｔｈｉｃｈｎｅｓｓ１．８μｍ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
ガス：Ｈｅ（７０ｋＰａ）、Ａｉｒ（５０ｋＰａ）、Ｈ_２（６０ｋＰａ）
検出：ＦＩＤ
（粘度測定条件）
装置：ＴＡインスツルメンツ社製ＡＲ−Ｇ２
せん断速度：１０〜１０００ｓ^−１
コーン：４０ｍｍ２°アルミコーン
温度：３０℃
（粉末Ｘ線回折測定条件）
装置：株式会社リガク製ＭｉｎｉＦｌｅｘＩＩ
使用Ｘ線：Ｃｕ・Ｋα線、Ｘ線強度：３０ｋＶ・１５ｍＡ、角度域：２θ＝２〜６０°
走査速度：２°／ｍｉｎ
サンプリング間隔：０．０２°
発散スリット：１．２５°
散乱スリット：１．２５°

なお、本実施例で使用したエタノールは９９．５ｗ／ｗ％以上（比重約０．７９）の無水エタノール、その他の有機溶媒はいずれも試薬レベルのものである。

（合成例１）
５ｍＬのＹＭ培地（ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モルトエキス０．３％、グルコース１．０％）を含む試験管４本に、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株（独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より入手）をＮＴＧで変異処理して得られた変異株であるＫＮＫ−１１株を接種し、２０℃で４８時間培養した。培養液を５０ｍＬのＹＭ培地を含む５００ｍＬ容の坂口フラスコ４本に移し、２０℃で４８時間の培養を行なった。培養液を２５００ｍＬの培地（リン酸アンモニウム１．３％、リン酸カリウム０．７％、酵母エキス０．３％、グルコース１％を含む）を含む５０００ｍＬ容のジャーファーメンターに移し、２０℃で培養し、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する菌体を含む培養液を得た。培養中は、ｐＨを４．４〜５．６の間にコントロールし、溶存酸素濃度は飽和の３０〜８０％となるようにグルコースを流加した。
得られた培養液のうち、３０００ｍＬに硫酸４００ｇを添加し、７０℃で１時間攪拌を行った。その後、３０％水酸化ナトリウムを１３００ｇ添加して中和した培養液に、濾過助剤としてセライトを１５０ｇ添加混合してから減圧濾過し、湿菌体（水分含量６０重量％、菌体含量２０重量％（乾燥重量として））を調製した。

（実施例１）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したエタノール１００ｍＬ（７９ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ−１にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。得られたケーキ−２に更にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−２と濾液−３を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物２．５ｇ中のアスタキサンチン含有量は４．０重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％であった。なお、この油状物中のアスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合（＝エルゴステロール含有量／アスタキサンチン含有量；以下同じ）は３３．０重量％、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度は０．３０Ｐａ・ｓであった。

（実施例２）
合成例１と同様の操作にて得られた湿菌体６４６ｋｇ（アスタキサンチン２．５８ｋｇ含有）に８℃に冷却したエタノール２０００Ｌ（１５８０ｋｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを加圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ−１にエタノール１６０００Ｌ（１２６４０ｋｇ）を加え、室温にて１時間攪拌した。それを加圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。得られたケーキ−２に更にエタノール１６０００Ｌ（１２６４０ｋｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを加圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−２と濾液−３を合わせた液中のアスタキサンチン量は２．１３ｋｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油３２．６ｋｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物５０．０ｋｇ中のアスタキサンチン含有量は４．２重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．０４重量％であった。なお、この油状物中のアスタキサンチン含有量に対するエルゴステロールの含有量の割合は２９．５重量％、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度は０．３３Ｐａ・ｓであった。

（実施例３）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したアセトン５０ｍＬ（３９．５ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．０３重量％であった。得られたケーキ−１にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。得られたケーキ−２に更にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−２と濾液−３を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１０ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物２．５ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．６重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．２重量％であった。なお、この油状物中のアスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合は３８．３重量％、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度は０．６２Ｐａ・ｓであった。

（実施例４）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したエタノール１００ｍＬ（７９ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ−１に２０容量％のｎ−ヘプタンを含むエタノール８００ｍＬ（６１４ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。得られたケーキ−２に更に２０容量％のｎ−ヘプタンを含むエタノール８００ｍＬ（６１４ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−２と濾液−３を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．０９ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物２．５ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．２重量％であった。また、得られた油状物中の残存ｎ−ヘプタンとエタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、それぞれ０．１重量％以下であった。なお、この油状物中のアスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合は３２．０重量％、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度は０．４０Ｐａ・ｓであった。

（実施例５）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したエタノール１００ｍＬ（７９ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ−１にエタノール１６００ｍＬ（１２６４ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。濾液−２中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物２．５ｇ中のアスタキサンチン含有量は４．０重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％であった。なお、この油状物中のアスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合は３２．２重量％、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度は０．２６Ｐａ・ｓであった。

（実施例６）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したメタノール５０ｍＬ（３９．５ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．０１８重量％であった。得られたケーキ−１に２−プロパノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。得られたケーキ−２に更に２−プロパノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−２と濾液−３を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、ＭＣＴ１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物２．５ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．９重量％であった。また、得られた油状物中の残存２−プロパノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％であった。なお、この油状物中のアスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合は２８．６重量％、せん断速度１００ｓ^−１における粘度は０．１８Ｐａ・ｓであった。

（実施例７）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（乾燥重量１２．９ｇ、アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に、５℃に冷却したエタノール１００ｍＬ（７９ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ−１にエタノール２００ｍＬ（１５８ｇ）を加え、６０℃にて３０分攪拌した。その後さらにエタノール４００ｍL（３１６ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。濾液−２中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物２．５ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．９重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％であった。

（実施例８）
５ｍＬのＹＭ培地（ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モルトエキス０．３％、グルコース１．０％）を含む試験管４本に、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株（独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より入手）を接種し、２０℃で４８時間培養した。培養液を５０ｍＬのＹＭ培地を含む５００ｍＬ容の坂口フラスコ４本に移し、２０℃で４８時間の培養を行なった。培養液を２５００ｍＬの培地（リン酸アンモニウム１．３％、リン酸カリウム０．７％、酵母エキス０．３％、グルコース１％を含む）を含む５０００ｍＬ容のジャーファーメンターに移し、２０℃で培養した。培養中は、ｐＨを４．４〜５．６の間にコントロールし、溶存酸素濃度は飽和の３０〜８０％となるようにグルコースを流加した。
得られた培養液のうち、３０００ｍＬに硫酸４００ｇを添加し、７０℃で１時間攪拌を行った。その後、３０％水酸化ナトリウムを１３００ｇ添加して中和した培養液に、濾過助剤としてセライトを１５０ｇ添加混合してから減圧濾過し、湿菌体（水分含量５８重量％、菌体含量２１重量％（乾燥重量として））を調製した。
上記のようにして得られた湿菌体５００ｇ（アスタキサンチン０．００６ｇ含有）に１０℃に冷却したエタノール１４００ｍＬ（１１０６ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．０００１重量％であった。得られたケーキ−１に１０℃に冷却したエタノール１４００ｍＬ（１１０６ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ２−と濾液−２を得た。濾液−２中のアスタキサンチン濃度は０．０００１重量％であった。得られたケーキ−２にエタノール１５０００ｍＬ（１１８５０ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−３中のアスタキサンチン量は０．００３２ｇであった。この液を１／１０００になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油０．５ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物１．０ｇ中のアスタキサンチン含有量は０．３重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％であった。

（実施例９）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したエタノール１００ｍＬ（７９ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ−１にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。得られたケーキ−２に更にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−２と濾液−３を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、濃縮液を減圧濾過して固液分離し、さらに得られた固形分を室温で減圧乾燥して黒紫色の粉末を得た。得られた粉末０．２０ｇ中のアスタキサンチン含有量は５１．４重量％であった。また、得られた粉末を粉末Ｘ線回折で測定したところ、結晶形はＦｏｒｍＩであった。なお、得られた粉末をパウダーテスタ（ホソカワミクロン株式会社製パウダーテスタＰＴ−Ｒ型、以下同じ）にて粉体流動特性の評価を行ったところ、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数は８１となり、流動特性の程度は「良好（Ｇｏｏｄ）」となった。

（実施例１０）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したエタノール１００ｍＬ（７９ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ−１にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。得られたケーキ−２に更にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−２と濾液−３を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を１／１５０になるまで減圧濃縮した後、濃縮液を減圧濾過して固液分離し、さらに得られた固形分を室温で減圧乾燥して黒紫色の粉末を得た。得られた粉末０．２１ｇ中のアスタキサンチン含有量は４５．１重量％であった。また、得られた粉末を粉末Ｘ線回折で測定したところ、結晶形はＦｏｒｍＩであった。なお、得られた粉末をパウダーテスタ（ホソカワミクロン株式会社製パウダーテスタＰＴ−Ｒ型、以下同じ）にて粉体流動特性の評価を行ったところ、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数は７６となり、流動特性の程度は「やや良好（Ｆａｉｒ）」となった。

（実施例１１）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したエタノール１００ｍＬ（７９ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ−１にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。得られたケーキ−２に更にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−２と濾液−３を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を１／５０になるまで減圧濃縮した後、濃縮液を５℃まで冷却した。冷却した濃縮液を減圧濾過して固液分離し、さらに得られた固形分を室温で減圧乾燥して黒紫色の粉末を得た。得られた粉末０．３４ｇ中のアスタキサンチン含有量は３０．７重量％であった。また、得られた粉末を粉末Ｘ線回折で測定したところ、結晶形はＦｏｒｍＩであった。なお、得られた粉末をパウダーテスタ（ホソカワミクロン株式会社製パウダーテスタＰＴ−Ｒ型、以下同じ）にて粉体流動特性の評価を行ったところ、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数は６４となり、流動特性の程度は「普通（Ｐａｓｓａｂｌｅ）」となった。

（実施例１２）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したアセトン５０ｍＬ（３９．５ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．０３重量％であった。得られたケーキ−１にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。得られたケーキ−２に更にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−２と濾液−３を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１０ｇであった。この液を１／１５０になるまで減圧濃縮した後、濃縮液を減圧濾過して固液分離し、さらに得られた固形分を室温で減圧乾燥して黒紫色の粉末を得た。得られた粉末０．２０ｇ中のアスタキサンチン含有量は４８．６重量％であった。また、得られた粉末を粉末Ｘ線回折で測定したところ、結晶形はＦｏｒｍＩであった。なお、得られた粉末をパウダーテスタ（ホソカワミクロン株式会社製パウダーテスタＰＴ−Ｒ型、以下同じ）にて粉体流動特性の評価を行ったところ、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数は８０となり、流動特性の程度は「良好（Ｇｏｏｄ）」となった。

（実施例１３）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したメタノール５０ｍＬ（３９．５ｇ）を加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ−１と濾液−１を得た。濾液−１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．０１８重量％であった。得られたケーキ−１に２−プロパノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。得られたケーキ−２に更に２−プロパノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−３と濾液−３を得た。濾液−２と濾液−３を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を１／５０になるまで減圧濃縮した後、濃縮液を５℃まで冷却した。冷却した濃縮液を減圧濾過して固液分離し、さらに得られた固形分を室温で減圧乾燥して黒紫色の粉末を得た。得られた粉末０．３６ｇ中のアスタキサンチン含有量は２８．８重量％であった。また、得られた粉末を粉末Ｘ線回折で測定したところ、結晶形はＦｏｒｍＩであった。なお、得られた粉末をパウダーテスタ（ホソカワミクロン株式会社製パウダーテスタＰＴ−Ｒ型、以下同じ）にて粉体流動特性の評価を行ったところ、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数は６４となり、流動特性の程度は「普通（Ｐａｓｓａｂｌｅ）」となった。

（比較例１）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）にアセトン１６００ｍＬ（１２６４ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキと濾液を得た。濾液中のアスタキサンチン量は０．１２ｇであった。この液を減圧濃縮した後、ＭＣＴ１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物２．９ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．５重量％であった。また、得られた油状物中の残存アセトン含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．２重量％であった。なお、この油状物中のアスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合は４０．８重量％、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度は３．２Ｐａ・ｓであった。

（比較例２）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−１と濾液−１を得た。得られたケーキ−１に更にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。濾液−１と濾液−２を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を減圧濃縮した後、ＭＣＴ１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物３．６ｇ中のアスタキサンチン含有量は２．８重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％であった。なお、この油状物中のアスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合は５８．９重量％、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度は２．１Ｐａ・ｓであった。

（比較例３）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）にエタノール８００ｍＬ（６３２ｇ）を加え、８５℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキと濾液を得た。濾液中のアスタキサンチン量は０．１２ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、得られた濃縮液から沈殿物を固液分離するため減圧濾過を試みたが、沈殿物のべとつきが著しく、濾過することができなかった。

（比較例４）
合成例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）を４８時間凍結乾燥し、１５．８ｇの乾燥菌体を得た。これにアセトン４００ｍＬ（３１６ｇ）を加え、室温にて３時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ−１と濾液−１を得た。得られたケーキ−１をアセトン２００ｍＬ（１５８ｇ）に懸濁させた後、再度減圧濾過し、ケーキ−２と濾液−２を得た。濾液−１と濾液−２を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１２ｇであった。この液を１／１３になるまで減圧濃縮した後、濃縮液に脱イオン水１０ｇを添加して攪拌し、さらに減圧濃縮した後に静置させ、分離した水相を除去した。これにヘキサンを５０ｇ添加し、攪拌した後に減圧濾過して固液分離し、固形分を得た。得られた固形分をヘキサン３０ｇに懸濁させた後、減圧濾過して固液分離し、さらに得られた固形分を室温で減圧乾燥して黒紫色の粉末を得た。得られた粉末０．１８ｇ中のアスタキサンチン含有量は５０．７重量％であった。また、得られた粉末を粉末Ｘ線回折で測定したところ、結晶形はＦｏｒｍＩＩであった。なお、得られた粉末をパウダーテスタ（ホソカワミクロン株式会社製パウダーテスタＰＴ−Ｒ型、以下同じ）にて粉体流動特性の評価を行ったところ、Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数は５３となり、流動特性の程度は「やや不良（Ｐｏｏｒ）」となった。

表２に実施例１〜６、比較例１、２における仕込み条件と、得られたカロテノイド油状物中のアスタキサンチン含有量、アスタキサンチンに対するエルゴステロール重量％、および油状物の粘度の結果を示す。また、表３に実施例９〜１３、比較例３、４における仕込み条件と、得られたカロテノイド粉末中のアスタキサンチン含有量、粉末の結晶形、および粉体流動特性指標の結果を示す。

（実施例１４、比較例５、及び、参考例１）
＜投与する組成物の調製＞
実施例１及び比較例１で得た油状物、さらに参考のために市販のアスタキサンチン組成物（ヘマトコッカス由来）に、サフラワー油を混合し、それぞれアスタキサンチン濃度が０．５重量％となる組成物を調製した。それぞれ、実施例１４、比較例５、及び、参考例１の組成物とする。
＜マウスを用いた吸収性の評価＞
当該組成物をマウスに経口投与した場合の吸収性を以下の方法で比較した。７週齢の雄性ＩＣＲマウス（入手元：日本チャールズリバー）に上記の組成物を、それぞれアスタキサンチンとして５０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。被験物質投与２，４、６時間後に、それぞれ各マウスより肝臓を採取した。採取した肝臓をハサミで細かくミンスし、０．３ｇを秤量した。それに２ｍＬの蒸留水を加えて、ポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。２ｍＬのメタノール（５００ｐｐｍのＢＨＴを含む）を加えて１０秒間撹拌し、徐蛋白処理した。次に４ｍＬのｎ−ヘキサンを加え、振とう機を用いて５分間混合した。遠心分離(３０００ｒｐｍ×１０分)を行った後、ヘキサン層中のアスタキサンチンをＨＰＬＣを用いて定量し、肝臓中のアスタキサンチン濃度を算出した。
＜ＨＰＬＣによるアスタキサンチンの定量＞
以下の分析系でアスタキサンチンを定量した。以下の分析系で、アスタキサンチンの保持時間は、９．１分であった。アスタキサンチンの標準には、シグマ社製の試薬を使用した。
カラム：ＳＹＭＭＥＴＲＹＣ１８２５０ｍｍ×φ４．６ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：アセトニトリル／酢酸エチル／水／ギ酸＝６００／３００／６０／４０（体積比）
検出波長：４７１ｎｍ
流速：０．８ｍL／分

結果を図１に示す。実施例１の油状物を含有する組成物（実施例１４）は、比較例１の従来公知の方法により得られた油状物を含有する組成物（比較例５）と比較して、摂取後の肝臓中のアスタキサンチン濃度が高く、生物体内への吸収性が高いことが確認された。

Claims

カロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、３０℃以下の有機溶媒（Ａ）を用いて洗浄する工程、及び、
洗浄した酵母中のカロテノイドを、１０〜７０℃の温度で有機溶媒（Ｂ）により抽出する工程を含む、カロテノイド組成物の製造方法。
カロテノイドがアスタキサンチンである、請求項１記載の製造方法。
有機溶媒（Ａ）が、ケトン類、アルコール類、炭化水素類、エーテル類及び脂肪酸エステル類からなる群より選択される少なくとも１種類の有機溶媒である請求項１又は２に記載の製造方法。
有機溶媒（Ｂ）が、アルコール類、炭化水素類及びエーテル類からなる群より選択される少なくとも１種の有機溶媒である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
有機溶媒（Ａ）及び有機溶媒（Ｂ）が、ともにエタノールである請求項１又は２に記載の製造方法。
さらに、得られたカロテノイドの抽出液を濃縮して油状組成物とする工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
得られる油状組成物中のアスタキサンチン含有量が１〜２０重量％であることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
さらに、得られたカロテノイドの抽出液からカロテノイドを析出させ、得られる析出物を固液分離して粉末組成物とする工程を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
得られる粉末組成物中のアスタキサンチン含有量が２０〜８０重量％であることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
粉末Ｘ線回折において、回折角１３．３°（２θ±０．２°）、１３．８°（２θ±０．２°）、１４．３°（２θ±０．２°）、１５．８°（２θ±０．２°）、１６．３°（２θ±０．２°）、１８．２°（２θ±０．２°）、２０．５°（２θ±０．２°）、２４．８°（２θ±０．２°）、及び、２５．３°（２θ±０．２°）にピークを有し、なおかつ（３Ｒ、３’Ｒ）の化学構造を有するアスタキサンチンを含有するカロテノイド組成物。
Ｄｒ．Ｃａｒｒの粉体流動特性指数が６０以上の粉体であることを特徴とする請求項１０に記載のカロテノイド組成物。
組成物中のアスタキサンチン含有量が２０〜８０重量％であることを特徴とする請求項１０または１１に記載のカロテノイド組成物。
キサントフィロマイセス属酵母由来のアスタキサンチンを含有し、組成物中のアスタキサンチン含有量に対するエルゴステロール含有量の割合が４０重量％以下であることを特徴とする油状組成物である、カロテノイド組成物。
アスタキサンチン含有量が１〜２０重量％で、３０℃、せん断速度１００ｓ^−１における粘度が０．０１〜１Ｐａ・ｓである、請求項１３に記載のカロテノイド組成物。