JP2010193865A - カロテノイドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カロテノイドを産生する微生物の培養物を、水溶性有機溶媒で抽出する工程;得られる抽出液を、水中に分散させミセル化する工程;得られるミセル化液を、溶媒中で加熱攪拌してミセルを破壊し、目的のカロテノイド成分を沈殿させて沈殿物を得る工程;前記沈殿物を回収してエタノールで加熱洗浄する工程;及び沈殿物をさらに粉砕乾燥する工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法、並びに該カロテノイド含有組成物を含有する食品、医薬組成物、又は化粧品。
【選択図】なし
Description
アスタキサンチンは、魚類、鶏卵の色揚げ剤として広く使用されている。また、食品添加物としても認められており、油脂加工食品、タンパク質性食品、水性液状食品などに幅広く使用されている。さらに、フリーラジカルによって誘起される脂質の過酸化に対する抗酸化活性、α−トコフェロールの数百倍に達する一重項酸素消去作用などから、アスタキサンチンは、その強力な抗酸化活性を生かした機能性食品、化粧品、又は医薬品としての用途が期待されている。
アスタキサンチンは、サケ、マス、マダイ等の魚類、カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類など広く自然界に分布すると共に、アグロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、パラコッカス属に属する細菌類、ヘマトコッカス属緑藻類、ファフィア属酵母類等の微生物によっても生産されている。アスタキサンチンやゼアキサンチン等のカロテノイドは、化学合成法により工業的に生産されているが、安全面の不安から天然物由来のものが求められている。
例えば、ヘマトコッカス藻類の場合、培養後の藻類のシスト細胞を熱アセトン処理し、夾雑物であるクロロフィルを溶出させた後、該シスト細胞をスプレードライし、得られた乾燥細胞からエタノールでカロテノイドを抽出する方法(特許文献1)などが報告されている。しかしこのような製造方法で得られる組成物には、まだ多くの生体由来の夾雑物が含まれており、1)カロテノイドの含量、2)アスタキサンチンの含量、等の点で満足のいくものではない。
こうした状況から、特殊な設備を用いない簡便な方法によってアスタキサンチンを高含量で含む高純度カロテノイドを工業的に製造する方法の確立が切望されている。
カンタキサンチンは、摂取許容量が0.025mg/kg/日と定められておりカロテノイド含有物を過剰摂取する際には摂取許容量を超えるおそれがあるという望ましくない状況を伴っていた。本発明のカロテノイド含有組成物においては、目的のカロテノイド成分(例えば、アスタキサンチン)の比率を選択的に高めることによって、所望されないカロテノイド成分(例えば、カンタキサンチン)の含有率を低くすることが可能である。
すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
(1) 以下の1)〜3)の工程を含むカロテノイドの精製方法。
1)カロテノイドを産生する微生物の培養物を、水溶性有機溶媒で抽出する工程
2)得られる抽出液を、水中に分散させミセル化する工程
3)得られるミセル化液を、溶媒中で加熱攪拌してミセルを破壊し、目的のカロテノイド成分を沈殿させる工程
(2) 以下の1)〜5)の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1)カロテノイドを産生する微生物の培養物を、水溶性有機溶媒で抽出する工程
2)得られる抽出液を、水中に分散させミセル化する工程
3)得られるミセル化液を、溶媒中で加熱攪拌してミセルを破壊し、目的のカロテノイド成分を沈殿させて沈殿物を得る工程
4)前記沈殿物を回収してエタノールで加熱洗浄する工程
5)沈殿物をさらに粉砕乾燥する工程
(3) 水溶性有機溶媒が、エタノールである(1)または(2)に記載の方法。
(4) 目的のカロテノイド成分がアスタキサンチンである、(1)〜(3)のいずれか1項に記載の方法。
(5) カロテノイド含有組成物が、カロテノイドを85%以上含有する組成物である(1)〜(4)のいずれか1項に記載の方法。
(6) カロテノイド含有組成物に含まれるカロテノイドに対するアスタキサンチンの比率が40%以上である(1)〜(5)のいずれか1項に記載の方法。
(7) カロテノイド含有組成物に含まれるアスタキサンチンに対するカンタキサンチンの比率が2.5%以下である(1)〜(6)のいずれか1項に記載の方法。
(8) カロテノイド含有組成物に含まれるアスタキサンチンのトランス型に対するシス型の比率が20%以下である(1)〜(7)のいずれか1項に記載の方法。
(9) カロテノイド含有組成物に含まれるエタノール含量が200ppm以下である(1)〜(8)のいずれか1項に記載の方法。
(10) 微生物が、Paracoccus属に属する細菌である(1)〜(9)のいずれか1項に記載の方法。
(11) 微生物の16SリボゾームRNAに対応するDNAの塩基配列が、配列番号1に記載の塩基配列と実質的に相同である(1)〜(10)のいずれか1項に記載の方法。
(12) 微生物が、E−396株(FERM BP−4283)又はその変異株である(1)〜(11)のいずれか1項に記載の方法。
(13) (1)〜(12)のいずれか1項に記載の方法で得られる、カロテノイド含有組成物。
(14) カロテノイドがフリー体である、(13)に記載のカロテノイド含有組成物。
(15) (13)および(14)に記載のカロテノイド含有組成物を含有する食品、医薬組成物、又は化粧品。
本発明に用いることができる微生物としては、カロテノイドを生産する微生物であればなんら限定されないが、パラコッカス属細菌、ヘマトコッカス属藻類、ファフィア属酵母などを用いることができる。パラコッカス細菌としては、例えばParacoccus carotinifaciens、Paracoccus marcusii、Paracoccus haeundaensis、Paracoccus zeaxanthinifaciens、Paracoccus denitrificans、Paracoccus aminovorans、Paracoccus aminophilus、Paracoccus kourii、Paracoccus halodenitrificansおよびParacoccus alcaliphilusが挙げられる。また、ヘマトコッカス属藻類としては、例えばHaematococcus pluvialis、Haematococcus lacustris、Haematococcus capensis、Haematococcus droebakensisおよびHaematococcus zimbabwiensisなどが挙げられ、ファフィア属酵母としては、例えばPhaffia rhodozymaが挙げられる。ただし、本発明に用いられる微生物は、これに限定されるものではない。
特に増殖速度の速さ、カロテノイド類の生産性から、Paracoccus属に属する細菌が好ましい。また、カロテノイド産生細菌として、好ましくは16SリボソームRNAに対応するDNAの塩基配列が配列番号1に記載されるE−396株の塩基配列と実質的に相同である細菌が好ましい。実質的に相同であるとは、DNAの塩基配列決定のエラー頻度等を考慮し、配列番号1の配列と比較対象の配列とが、95%以上、好ましくは96%以上、より好ましくは98%以上の相同性を有することを意味する。このような細菌のなかでも、特にParacoccus carotinifaciensE−396株(FERM BP−4283)が好ましい。また、これらの微生物を変異処理してカロテノイド生産性を向上させるために選択したカロテノイド高生産株を用いることも大変に好適な例として挙げられる。
ここで、変異処理する方法は、突然変異を誘発するものであれば特に限定されない。たとえば、N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルホネート(EMS)などの変異剤による化学的方法、紫外線照射、X線照射などの物理的方法、遺伝子組換え、トランスポゾンなどによる生物学的方法などを用いることができる。この変異処理は1回でもよいし、また、例えばこの突然変異処理によりアスタキサンチン生産微生物の変異体を得て、これをさらに突然変異処理するというように2回以上の変異処理を行うこともできる。
本発明に用いる微生物の培養に使用される栄養培地としては、生産菌の生育に必要な炭素源、窒素源及び無機塩を含む栄養培地であれば十分であるが、ビタミン類を添加するとさらに好ましい場合がある。また、さらにアミノ酸、核酸塩基等を添加すると好ましい場合もある。その他として、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーンスチープリカー、乾燥酵母、大豆粕等を適宜添加しても良い。
炭素源としてはグルコース、シュークロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、マルトース等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、ピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール、グリセノール等のアルコール類、大豆油、ヌカ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油、アマニ油等の油脂類などが挙げられ、1種又は2種以上の炭素源を用いることができる。添加割合は炭素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地1L当たり1〜100g、好ましくは2〜50gである。
窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素等の1種又は2種以上が用いられる。添加割合は窒素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地1Lに対し0.1g〜30g、好ましくは1〜10gである。
無機塩としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム等の1種又は2種以上が用いられる。添加割合は無機塩の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地1Lに対し0.001〜10gである。
ビタミン類を加える場合、添加割合はビタミン類の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地1Lに対し0.1〜1,000mgであり、好ましくは1〜100mgである。
アミノ酸、核酸塩基、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーンスチープリカー、乾燥酵母、大豆粕等の添加割合は、物質の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地1Lに対し0.2g〜200g、好ましくは3〜100gである。
培地のpHは2〜12、好ましくは6〜9に調整する。培養条件は15〜80℃、好ましくは20〜35℃の温度であり、通常1日〜20日間、好ましくは2〜8日間、好気条件で培養を行う。好気条件としては、例えば、振とう培養又は通気撹拌培養等が挙げられる。
エタノールの量としては、抽出時の温度によって規定されるが、菌体内に含有されるアスタキサンチン量を溶解できる量であれば良く、乾燥菌体からエタノールを用いて抽出する場合、菌体内に含まれるアスタキサンチン量1gに対して、300〜3,000g、好ましくは500〜2,000g、より好ましくは、800〜1,600gである。
例えば、前記した約20mgのアスタキサンチンを含む乾燥菌体1gからの抽出を95℃のエタノールで行う場合は、好ましくは10〜35g程度の量のエタノールを用いると良い。
エタノール水溶液から蒸留回収したエタノールのように、含水エタノールで抽出を行っても良い。含水量は特に限定されるものではないが、好ましくは10%以下である。含水エタノールでの抽出の際は、無水エタノールでの抽出の際よりもアスタキサンチンを含むカロテノイドの溶解度が低下することから、抽出温度を高めに設定した方が、抽出効率が高くなる。
上記酸化防止剤は、最終的にはカロテノイド組成物から除くことが望ましいが、用いる酸化防止剤の種類(例えば、ビタミンC)によっては除去不要である。
また、光によるカロテノイドの分解を極力防止するために、光を当てない条件下で行うことができる。
また、抽出時間については特に制限する必要はないが、熱分解による収率低下を少なくするためにも短時間処理が良く、好ましくは60分以内であり、30分以内がより好ましい。
沈殿化が進行すると、アスタキサンチン沈殿化速度は次第に遅くなるが、カンタキサンチン沈殿化速度はそれほど低下しないため、時間とともに沈殿したカンタキサンチンの量は次第に増え、カンタキサンチンの比率は沈殿原液(ミセル化液)の組成に近づく。従って、望ましい時点で沈殿化を終了し、後述する沈殿物の分離回収を行うことになる。
ミセル化液中で保持する溶媒濃度は、沈殿化速度に影響し、高濃度ほど沈殿化速度が速くなる。エタノールの場合、濃度が1%上昇すると沈殿化速度は約1.7倍速くなる。一方、エタノール濃度を変更しても得られる沈殿物のカロテノイド含量は変わらず品質的に影響しない。また前述のとおり、沈殿化が進行しアスタキサンチン収率が上昇するのに伴い、沈殿物のカンタキサンチン比率が上昇し沈殿原液(ミセル化液)の組成に近づくが、このアスタキサンチン収率とカンタキサンチン比率との関係は溶媒濃度を変更しても変わらず選択性に影響しない。従って、溶媒濃度を適切に設定することにより沈殿化速度のコントロールを行うことが可能である。水と溶媒の混合液全体の容量に対する溶媒の容量パーセントで定義される溶媒濃度は、好ましくは、5%以上、より好ましくは10%以上、さらに好ましくは13%以上であり、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは26%以下である。沈殿化時間は通常10分間〜24時間の範囲で行うが、沈殿物のカンタキサンチン比率の経時変化や分離回収時の濾過所要時間などを考慮して溶媒濃度と沈殿化時間を決定すれば良い。溶媒濃度を調整するには、水と噴射添加する抽出液の容量比を変えても良く、ミセル化後に溶媒を追加あるいは水を添加して希釈することによっても良い。
沈殿化のための加熱温度(沈殿化温度という)は、沈殿化速度に影響し、高温ほど沈殿化速度が速くなる。この時沈殿化温度が高い方が得られる沈殿物のカロテノイド含量は高く品質的に有利である。また沈殿化温度が高いほど、アスタキサンチン収率に対するカンタキサンチン比率が低くなるため、アスタキサンチンに対する選択性が高く有利である。沈殿化温度は40℃以上が好ましく、50℃以上がより好ましく、60℃以上がさらに好ましい。温度上限としては、例えばエタノールを使用した場合、沸点を考慮して、80℃以下が好ましく、70℃以下がより好ましい。
沈殿化の際の攪拌速度は、沈殿化速度に影響し、攪拌速度を上げると沈殿化速度は速くなる。一方、このとき得られる沈殿物のカロテノイド含量は変わらず品質に影響しない。またアスタキサンチン収率とカンタキサンチン比率との関係は、撹拌速度を変更しても変わらず選択性に影響しない。従って、攪拌速度により沈殿化速度のコントロールを行うことも可能である。ただし、あまり高速で攪拌すると攪拌子や攪拌羽や容器壁に沈殿物が付着し、沈殿回収に支障が出る場合があるため、容器や攪拌羽の形状に応じ攪拌の上限を決めるべきである。容器内が均一に攪拌できている程度の低速攪拌の場合は、沈殿付着が起こらない点で好ましい。
上記酸化防止剤は、最終的にはカロテノイド組成物から除くことが望ましいが、用いる酸化防止剤の種類(例えば、ビタミンC)によっては除去不要である。
また、光によるカロテノイドの分解を極力防止するために、光を当てない条件下で行うことができる。
洗浄の方法としては、例えば75℃付近に加熱し1時間加熱懸濁攪拌後に冷却し濾取する方法が挙げられる。純度に応じてこの操作を2回以上実施しても良い。
この時、カロテノイド以外の不純物はエタノールによって溶解除去され、高純度カロテノイドが得られる。またシス型アスタキサンチンはトランス型アスタキサンチンよりエタノールに易溶性であるため、得られるカロテノイド含有組成物に含まれるシス型アスタキサンチンの量は低減され、トランス型アスタキサンチンの比率が高まる。本発明の方法で得られるカロテノイド含有組成物においては、トランス型アスタキサンチンに対するシス型アスタキサンチンの比率は20%以下であり、好ましくは15%以下であり、さらに好ましくは10%以下である。
本明細書において、フリー体のカロテノイドとは、カロテノイドに存在する水酸基が脂肪酸とエステル結合していない状態を指す。
常温洗浄では得られた沈殿物の洗浄効果は低く、加熱洗浄の方が洗浄効果が高い。
なお、残存溶媒量を減らすため、濾取洗浄の最後に温水で溶媒置換的に洗浄する工程を加えることもできる。
上記酸化防止剤は、最終的にはカロテノイド組成物から除くことが望ましいが、用いる酸化防止剤の種類(例えば、ビタミンC)によっては除去不要である。
また、光によるカロテノイドの分解を極力防止するために、光を当てない条件下で行うことができる。
本発明の方法は、従来技術に比較して、1)複雑な操作を必要としない、2)低濃度溶液の高純度化のような非効率的な精製操作を必要としない、という点において、工業的な観点から著しく有利である。そして本発明の特徴として、3)アスタキサンチンを高含量で含む高純度カロテノイド組成物を安価に提供できる点、4)カンタキサンチン含量が少なく、食品や医薬組成物として安全なカロテノイド組成物を提供できる点、5)残留溶媒が少なく、食品や医薬組成物や化粧品として安全かつ加工しやすいカロテノイド組成物を提供できる点で優れた工業的製造方法を提供するものである。
本発明の製造方法により製造されるアスタキサンチン高含量の高純度カロテノイドを含有する医薬品の剤型としては、散剤、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル剤、速崩剤、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は定法に従って調製されるが、カロテノイドは水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー(高圧ホモジナイザー)を用いて水溶液中に分散、乳化させたり、温度をかけて溶解させたりして用いる。さらに、カロテノイドの吸収性を高めるために、平均粒子径を1ミクロン程度まで微粉砕し用いることも可能である。
カロテノイドを医薬品として使用する場合、用法及び用量として、大人(体重60 kg)1 日あたり、1mg〜3g 、好ましくは3mg 〜1g 、より好ましくは10mg〜670mgである。大人 1日あたり、体重1kg換算では、それぞれ17μg〜50mg 、50μg〜17mg 、160μg〜12mgとなる。上記用量は1から数回に分けて投与される。但し、薬学的な有効量、投与方法または投与手段および投与期間は、投与対象の臨床状態、性別、年齢、体重などに応じて当業者により適宜設定することができる。
カロテノイドを食品又はサプリメントとして使用する場合、用法及び用量として特に限定されるものではないが、大人(体重60 kg)1日あたり、体重1kg換算で、17μg〜50mg 、好ましくは50μg〜17mg 、より好ましくは160μg〜12mgである。
また、カロテノイドを化粧品として使用する場合、化粧品100gあたり10μg〜5g 、好ましくは10μg〜2g 、より好ましくは10μg〜1gの量を配合することができる。
なお、実施例におけるアスタキサンチン、カンタキサンチン及びカロテノイドの定量は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて行った。カラムはWakosil−II SIL−100(φ4.6×250mm)(和光純薬製)を2本連結して使用した。溶出は、移動相であるn−ヘキサン−テトラヒドロフラン−メタノール混合液(40:20:1)を室温付近一定の温度にて毎分1.0ml流すことで行った。測定においては、サンプルをテトラヒドロフランで溶解したものを移動相にて100倍希釈した液20μlを注入量とし、カラム溶離液の検出は波長470nmで行った。また、定量のための標準品としては、シグマ社製アスタキサンチン(Cat.No.A9335)を用いた。標準液のアスタキサンチン濃度の設定は、標準液の477nmの吸光度(A)及び上記条件でHPLC分析を行ったときのアスタキサンチンピークの面積百分率%(B)を測定した後に、以下の式を用いて行った。
アスタキサンチンの濃度(mg/l)=A÷2150×B×100
測定においては、サンプルをテトラヒドロフランで溶解した液5μlを注入量とし、カラム溶離液の検出は波長470nmで行った。また、標準品としては、シグマ社製アスタキサンチン(Cat.No.A9335)および、該サンプルをクロロホルムに溶解した後加熱処理したシス型アスタキサンチンとトランス型アスタキサンチンの混合溶液を用いた。
工程1:エタノール抽出工程
E−396菌株(FERM BP−4283)を培養して得られた菌体であって、その1g中に20mgのアスタキサンチンと0.72mgのカンタキサンチンを含む乾燥菌体25gに、エタノール500mlを加え、高圧容器内で窒素置換した雰囲気下95℃にて2分間攪拌しながらアスタキサンチンを含むカロテノイドの抽出を行った。50℃に冷却後、濾過にて菌体を除き、さらに菌体ケークをエタノールにて洗浄してアスタキサンチン濃度668μg/ml、カンタキサンチン濃度24μg/ml、カロテノイド濃度1370μg/ml、 カンタキサンチン/アスタキサンチン比率3.53%の抽出液589mlを得た。
本実施例の工程1で得られた抽出液589mlを、65℃の温水2,590ml上に、350rpmで攪拌しながら、200ml注射器を用いて10分間かけて噴射し分散ミセル化させた。この時エタノール濃度は、18.7%であった。これを密封し引き続き65℃に保温しながら150rpmで3.5時間攪拌し、アスタキサンチンを優先的に沈殿化させたのち、冷却せずに沈殿物を濾取し、濾取の最後に沈殿ケーク上に65℃温水100mlを加えて洗浄した。沈殿物のカンタキサンチン/アスタキサンチン比率は1.46%であった。
なお、沈殿化の途中でサンプリングして沈殿物を濾取分析し、沈殿物のカンタキサンチン/アスタキサンチン比率の経時変化を見たところ、2時間目で0.72%、2.5時間目で0.97%、3時間目で1.20%であった。
本実施例の工程2で得られた沈殿物を、エタノール70mlに懸濁し、品温75℃で1時間加熱攪拌洗浄したのち室温に冷却し、沈殿物を濾取し、濾取の最後に5mlのエタノール、続いて5mlの65℃温水を加え洗浄した。これを40℃12時間真空乾燥し、350mgの乾燥物を取得した。この乾燥物中のアスタキサンチン含量は71.6%、カロテノイド含量は99.8%、カンタキサンチン/アスタキサンチン比率は1.46%、シス型アスタキサンチン/トランス型アスタキサンチン比率は2.84%、エタノール含量は3,240ppm(w/w)であった。
本実施例の工程3で得られた乾燥物を、密閉型乳鉢式粉砕機(CMT社(東京)振動ミル)中で窒素置換下5分間粉砕し、40℃1時間真空乾燥する操作を2回行った。この粉砕乾燥物のアスタキサンチン含量は71.5%、カロテノイド含量は98.9%、カンタキサンチン/アスタキサンチン比率は1.44%、シス型アスタキサンチン/トランス型アスタキサンチン比率は4.80%、エタノール含量は40.3ppm(w/w)であった。
粉砕乾燥によりエタノール含量が大きく低下することがわかる。またこの時シス型アスタキサンチン/トランス型アスタキサンチン比率がやや増加するが、アスタキサンチン含量とカロテノイド含量とカンタキサンチン/アスタキサンチン比率は大きな変化はない。
実施例1における沈殿加熱洗浄の代わりに室温洗浄を行う以外は同様に工程1から工程3まで実施したところ、得られた乾燥物中のアスタキサンチン含量は53.5%、カロテノイド含量は80.5%、カンタキサンチン/アスタキサンチン比率は1.46%、シス型アスタキサンチン/トランス型アスタキサンチン比率は12.3%、エタノール含量は119ppm(w/w)であった。
室温洗浄では、加熱洗浄と比較してアスタキサンチン含量とカロテノイド含量とが低く、洗浄による不純物除去効果が低いことがわかる。またシス型アスタキサンチン/トランス型アスタキサンチン比率が高く、シス型アスタキサンチンの除去効果も低いことがわかる。
工程1:エタノール抽出工程
E−396菌株(FERM BP−4283)を培養して得られた菌体であって、その1g中に20mgのアスタキサンチンと0.72mgのカンタキサンチンを含む乾燥菌体25gに、90%(v/v)エタノール500mlを加え、高圧容器内で窒素置換した雰囲気下100℃にて2分間攪拌しながらアスタキサンチンを含むカロテノイドの抽出を行った。50℃に冷却後、濾過にて菌体を除き、さらに菌体ケークを90%(v/v)エタノールにて洗浄してアスタキサンチン濃度605μg/ml、カンタキサンチン濃度20 μg/ml、カロテノイド濃度1,210μg/ml、 カンタキサンチン/アスタキサンチン比率3.32%の抽出液568mlを得た。
本実施例の工程1で得られた抽出液568mlを、65℃の温水2,180ml上に、350rpmで攪拌しながら、200ml注射器を用いて10分間かけて噴射し分散ミセル化させた。この時エタノール濃度は、18.7%であった。これを密封し引き続き65℃に保温しながら150rpmで5.4時間攪拌し、アスタキサンチンを優先的に沈殿化させたのち、冷却せずに沈殿物を濾取し、濾取の最後に沈殿ケーク上に65℃温水100mlを加えて洗浄した。沈殿物のカンタキサンチン/アスタキサンチン比率は1.44%であった。
なお、沈殿化の途中でサンプリングして沈殿物を濾取分析し、沈殿物のカンタキサンチン/アスタキサンチン比率の経時変化を見たところ、2時間目で0.53%、3時間目で0.76%、4時間目で1.04%、5時間目で1.34%であった。
本実施例の工程2で得られた沈殿物を、90%(v/v)エタノール70mlに懸濁し、品温75℃で1時間加熱攪拌洗浄したのち室温に冷却し、沈殿物を濾取し、濾取の最後に5mlの90%(v/v)エタノール、続いて5mlの65℃温水を加え洗浄した。これを40℃12時間真空乾燥し、264mgの乾燥物を取得した。この乾燥物中のアスタキサンチン含量は70.2%、カロテノイド含量は99.1%、カンタキサンチン/アスタキサンチン比率は1.49%、シス型アスタキサンチン/トランス型アスタキサンチン比率は4.93%、エタノール含量は1,810ppm(w/w)であった。
本実施例の工程3で得られた乾燥物を、密閉型乳鉢式粉砕機(CMT社(東京)振動ミル)中で窒素置換下5分間粉砕し、40℃1時間真空乾燥する操作を2回行った。この粉砕乾燥物のアスタキサンチン含量は69.1%、カロテノイド含量は98.3%、カンタキサンチン/アスタキサンチン比率は1.48%、シス型アスタキサンチン/トランス型アスタキサンチン比率は6.08%、エタノール含量は63.2ppm(w/w)であった。
抽出溶媒および沈殿加熱洗浄溶媒に90%(v/v)エタノールを使用しても、実施例1と同様の品質の粉砕乾燥物が取得できることがわかる。
抗酸化剤及び着色剤として、実施例1で得たアスタキサンチン組成物を、マーガリンの5重量%になるように植物油に添加した後、乳化剤などと共に均一になるように攪拌し、通常の方法によりマーガリンを作成した。このマーガリンは、通常のマーガリンと比較して、アスタキサンチンの存在により、薄い赤色を呈していた。
実施例1で得たアスタキサンチン組成物を、オリーブ油の0.25重量%になるように添加した後、50℃にて攪拌して溶解させ、常温まで冷却した。このオリーブ油は、通常のオリーブ油と比較して、アスタキサンチンの存在により、濃い赤色を呈していた。またアスタキサンチン組成物の添加量を変更することで色の濃さは変化させることができた。さらに長時間放置しても一度溶解したアスタキサンチンは、析出しなかった。
実施例1で得たカロテノイド含有組成物110重量部に対して結晶セルロース330重量部、カルメロース−カルシウム15重量部、ヒドロキシプロピルセルロース10重量部及び精製水60重量部を用いて通常の方法にて配合、乾燥した後、10重量部のステアリン酸マグネシウムを添加し、打錠を行い、1錠あたりカロテノイド含有組成物を20mg含有する100mgの錠剤を得た。
実施例1で得たカロテノイド含有組成物1重量部に、5倍重量部の大豆油に懸濁し、均一になるように十分に混合した後、カプセル充填機にてカプセル充填し、内容物約300mgの赤褐色のカプセルを得た。
実施例1で得たアスタキサンチン含有組成物を、白色ワセリンに10重量%になるように添加し、芳香剤などと共に、均一になるように分散し、通常の方法によりクリーム剤を作製した。
国際寄託当局:独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
(旧名称:通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所)
〒305-8566
茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6
識別のための表示:E−396
受託番号:FERM BP−4283
原寄託日:平成5年(1993年)4月27日
Claims (15)
- 以下の1)〜3)の工程を含むカロテノイドの精製方法。
1)カロテノイドを産生する微生物の培養物を、水溶性有機溶媒で抽出する工程
2)得られる抽出液を、水中に分散させミセル化する工程
3)得られるミセル化液を、溶媒中で加熱攪拌してミセルを破壊し、目的のカロテノイド成分を沈殿させる工程 - 以下の1)〜5)の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1)カロテノイドを産生する微生物の培養物を、水溶性有機溶媒で抽出する工程
2)得られる抽出液を、水中に分散させミセル化する工程
3)得られるミセル化液を、溶媒中で加熱攪拌してミセルを破壊し、目的のカロテノイド成分を沈殿させて沈殿物を得る工程
4)前記沈殿物を回収してエタノールで加熱洗浄する工程
5)沈殿物をさらに粉砕乾燥する工程 - 水溶性有機溶媒が、エタノールである請求項1または2に記載の方法。
- 目的のカロテノイド成分がアスタキサンチンである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- カロテノイド含有組成物が、カロテノイドを85%以上含有する組成物である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- カロテノイド含有組成物に含まれるカロテノイドに対するアスタキサンチンの比率が40%以上である請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- カロテノイド含有組成物に含まれるアスタキサンチンに対するカンタキサンチンの比率が2.5%以下である請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- カロテノイド含有組成物に含まれるアスタキサンチンのトランス型に対するシス型の比率が20%以下である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- カロテノイド含有組成物に含まれるエタノール含量が200ppm以下である請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物が、Paracoccus属に属する細菌である請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物の16SリボゾームRNAに対応するDNAの塩基配列が、配列番号1に記載の塩基配列と実質的に相同である請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物が、E−396株(FERM BP−4283)又はその変異株である請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法で得られる、カロテノイド含有組成物。
- カロテノイドがフリー体である、請求項13に記載のカロテノイド含有組成物。
- 請求項13および14に記載のカロテノイド含有組成物を含有する食品、医薬組成物、又は化粧品。
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