JP2003520847A - カロテノイド結晶の単離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、純度が少なくとも９５％で、結晶格子中に取り込まれた溶剤が殆ど無い結晶性カロテノイド化合物、例えば、β−カロテンに関する。更に、本発明は、溶剤抽出及び／又は抗溶剤結晶化方法の使用なしに、その様な高純度の結晶性カロテノイド化合物を微生物から調製する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、結晶性カロテノイドの結晶格子内に取り込まれた有機溶剤の実質的
な量を含まない純度９５％以上の結晶性カロテノイド化合物及びその製造方法に
関する。 （発明の背景） カロテノイドは、自然界で見出される顔料の最も多く且つ広範囲に分布する群
である。カロテノイドの幾つかの特定の例としては、β−カロテン、β−アポ−
４′−カロテナール、β−アポ−８′−カロテナール、β−アポ−１２′−カロ
テナール、β−アポ−８′−カロテン酸、アスタキサンチン、カンタキサンチン
、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、シトラナキサンチン、ルテイン、リコ
ペン、トルラロジン−アルデヒド、トルラロジン−エチルエステル、ニューロス
ポラキサンチン−エチルエステル、ζ−カロテン及びデヒドロプレクタニアキサ
ンチンが挙げられる。更に、カロテノイドは、食品、化粧品、医薬用の着色用と
して広く使用される顔料の一つである事も知られている。

【０００２】 カロテノイド結晶は、一般に、通常の化学的方法によって製造される。然しな
がら、今日では、自然界の資源に由来する製品に対するかなりの要望がある。自
然界の資源に由来する場合、カロテノイドは、殆どが油状抽出物（パーム油、藻
類油）の形態である。又、自然界の資源、例えば、野菜（例えば、ニンジン）又
は微生物（例えば、藻類（デュナリエラ(Dunaliella)））又は真菌（ブラケスレ
ア(Blakeslea)）から、結晶性カロテノイド、例えば、β−カロテンを得る事も
できるが、これら自然界の資源から比較的に純粋な結晶を得る為に現在利用され
ている方法には重大な欠点がある。 例えば、β−カロテンの様な結晶性カロテノイドの自然界の資源からの単離に
は、例えば、国際特許出願ＷＯ９８０３４８０に記載されている様な前記自然界
の資源からのβ−カロテンの抽出工程と、更なる精製工程が含まれる。この抽出
工程は、様々な有機溶剤、例えば、アセトン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ヘキサ
ン、二塩化メタン又はヘキサン、植物油、又は、プロパンの様な超臨界流体、エ
チレン又は二酸化炭素で行われる。比較的純粋なβ−カロテン製剤を得る為には
、抽出物の更なる精製が必要である。幾つかの精製方法が開示されていて、その
中には、クロマトグラフィー、吸着／放出方法及び結晶化又は沈殿がある。

【０００３】 例えば、溶剤の蒸発によって、適当な自然界の資源の溶剤抽出後に得られた抽
出物から結晶化されるカロテノイド結晶は、出発物質の独特の臭いを有し、一般
に、幾らかの不純物、例えば、溶剤それ自身及び抽出工程を発生源とする不純物
を含む。その様な場合には、例えば、米国特許第３，２６８，６０６号明細書及
び第４，４３９，６２９号明細書に開示されている様な再結晶化が必要となる。
再結晶化の主たる欠点は、カロテンを溶解するのに多量の溶剤を必要とする事で
ある。更に、十分に高い収率でカロテンを再結晶化させる為には、多量の抗溶剤
（沈殿溶剤）を同様に必要とする。従って、これらの方法は、多量の溶剤を必要
とする事及びカロテンのかなりの損失が起こる点で不利である。更に、溶剤は結
晶性カロテノイドの結晶格子内に取り込まれる。

【０００４】 国際特許出願ＷＯ９８５０５７４には、微生物量から結晶性カロテノイド化合
物を単離する方法が開示されていて、この方法は、微生物量の洗浄を含めて、微
生物の細胞壁を破壊する工程及びカロテノイド含有残さから細胞砕片を分離する
工程を含む。破壊された細胞量又はカロテノイド含有残さは、脂質を除去する為
に適当な溶剤で処理され、得られたカロテノイド結晶を水中に懸濁させて結晶を
浮遊させる。その後、結晶性生成物が分離され、任意に、更に精製される。国際
特許出願ＷＯ９８４３６２０、ＷＯ９７２３４３６及びＷＯ９７３１８９４には
、含油樹脂からのカロテノイド化合物の製造方法が開示されていて、この方法は
、有機媒体中でアルカリ試薬での処理、次いで、結晶性カロテノイド化合物を得
る為の抗溶剤の添加を含む。溶剤中での破壊された細胞量の溶解及び抗溶剤の添
加の主たる欠点はカロテノイド結晶中に溶剤を包含する事である。

【０００５】 驚くべきことに、本発明者は、結晶格子中に殆ど溶剤のない極めて純粋なカロ
テノイド結晶が、抽出／抗溶剤方法の使用なしに、微生物資源の結晶性懸濁液か
ら効率良く単離でき、少なくとも９５％の純度のカロテノイド結晶を得る事がで
きる事を見出した。 （発明の開示) 本発明は、純度９５％以上、好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以
上、尚好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の結晶性カロテノイド
であって、結晶格子中に実質的に溶剤を含まない結晶性カロテノイドに関する。
「実質的に溶剤を含まない」とは、溶剤の量が０．５％（ｗ／ｗ）未満、好まし
くは０．２％（ｗ／ｗ）未満、更に好ましくは０．１％（ｗ／ｗ）未満、最も好
ましくは０．０５％（ｗ／ｗ）未満である事を意味する。

【０００６】 更に、前記カロテノイド化合物の単離、好ましくは微生物細胞からの単離の為
の効率的で且つ好ましい方法が開示される。本発明方法によれば、カロテノイド
結晶は微生物細胞から、結晶格子中に溶剤を取り込む事なしに、結晶性カロテノ
イド懸濁液中に存在する全ての不純物を除去することによって精製される。 本発明方法は、以下の工程を含む。 （ａ）カロテノイド含有細胞、好ましくは微生物資源からの細胞を破壊して、油
状結晶性カロテノイド懸濁液を分離する工程、 （ｂ）該油状結晶性カロテノイド懸濁液を、ｐＨ９〜１２のアルカリで、１０〜
９５℃の温度で、好ましくは３０〜８５℃、最も好ましくは５０〜７５℃の温度
で、任意に、低級アルコールの存在下で処理する工程、 （ｃ）該アルカリ処理された結晶性カロテノイド懸濁液に塩を添加する任意の工
程、 （ｄ）該結晶性カロテノイド懸濁液を液相から分離する任意の工程、 （ｅ）該結晶性カロテノイド懸濁液を、塩を含む水溶液で任意に洗浄する工程、 （ｆ）該結晶性カロテノイド懸濁液を低級アルコールで第一洗浄工程において洗
浄する工程（（ｂ）〜（ｅ）の工程と（ｆ）の工程の実施順序は任意である）、 （ｇ）（ａ）〜（ｆ）の処理工程から得られる粗カロテノイド結晶を、水又は低
級アルコールと水との混合物で第二洗浄工程において洗浄する工程、 （ｈ）該結晶を新鮮な溶剤で洗浄する工程、及び、 （ｉ）該結晶を乾燥する工程。

【０００７】 カロテノイド含有微生物細胞は、選抜きのカロテノイド産生微生物の適当な培
養法から得ても良い。カロテノイド含有微生物は、バクテリア、真菌、藻類又は
酵母であっても良い。好ましくは、ムコラレス目(Mucorales)の真菌であり、好
ましくは、ブラケスレア−トリスポラ(Blakeslea trispora)、デュナリエラ属の
藻類、又は、ファフィア属(Phaffia)の酵母、好ましくはファフィア−−ロドチ
マ(Phaffia rhodozyma)である。 微生物細胞と培養液を含む培養ブロスは、直接、カロテノイド結晶の単離に使
用されても良い。或いは、本発明方法を実施する前に、微生物細胞は、適当な方
法、例えば濾過又は遠心分離によって培養液から分離されてもよい。

【０００８】 カロテノイド含有微生物細胞は、機械的、化学的及び／又は酵素処理手段によ
って細胞壁を破壊する事よって開かれる。例えば、細胞は、均質化処理、超音波
処理、自己融解処理、浸透圧融解処理(osmolysis)及び／又はプラズマ融解処理(
plasmolysis)に掛けられても良く、任意に、界面活性剤、酸、塩基、酵素、自己
融解促進物質、塩の様な浸透圧融解剤、及び／又はプラズマ融解剤を添加しても
良い。この方法で、油状結晶性カロテノイド懸濁液が細胞から放出され、それに
よって油状結晶性カロテノイド懸濁液が細胞砕片から、好ましくは遠心分離によ
って分離される。 この様にして得られた油状結晶性カロテノイド懸濁液は、次いで、更に、精製
される。次の精製工程を適用する前に、油状結晶性カロテノイド懸濁液は、水で
一度以上洗浄されても良い。

【０００９】 次の精製工程は、アルカリでの油状結晶性カロテノイド懸濁液の処理から成る
。アルカリ処理は、ｐＨ９〜１２を有するアルカリ水溶液の油状カロテノイド懸
濁液への添加及び、好ましくは、適当な時間、１０〜９５℃、好ましくは３０〜
８５℃、更に好ましくは５０〜７５℃の温度で、攪拌下でのその後の培養を含む
。アルカリ溶液／油状カロテノイド懸濁液の比は、約５：１〜約１：１（ｗ／ｗ
）が好ましい。アルカリ処理の期間は、処理中に適用されるｐＨと温度が低けれ
ば低い程、処理時間は益々長くなるので、一般的に、適用するｐＨと温度に依存
する。例えば、アルカリ処理は、ｐＨ１２で温度７５℃では２時間、ｐＨ１０で
温度５０℃では８時間行われても良い。任意に、アルカリ処理は、低級アルコー
ルの存在下で行われても良い。

【００１０】 アルカリ処理後、水溶性塩、例えば、塩化ナトリウムが、アルカリ処理された
結晶性カロテノイド懸濁液に添加されても良い。次いで、結晶性カロテノイド懸
濁液は液相から分離され、任意に、塩含有水溶液で洗浄されても良い。結晶性カ
ロテノイド懸濁液の分離は、当該技術分野において公知の方法、例えば、濾過、
遠心分離又は冷却によって行っても良い。 次いで、結晶性カロテノイド懸濁液は、懸濁液を低級アルコールで洗浄して粗
カロテノイド結晶を生成する事を含む第一洗浄工程に掛けられても良い。この第
一洗浄工程は一回以上繰返されても良い。 一般的に、本発明により行われる洗浄工程は、洗浄液と共に（油状）結晶性カ
ロテノイド懸濁液又は（粗）カロテノイド結晶を攪拌する工程及び、続いて、液
相から（油状）結晶性カロテノイド懸濁液又は結晶を分離する工程を含む。 本発明の一つの実施態様では、粗カロテノイド結晶は先の工程とは別の順序で
得られる。

【００１１】 破壊された細胞からの、結晶の分離後に得られる油状結晶性カロテノイド懸濁
液は、先ず初めに水で一回以上洗浄され、次いで、前述のアルカリ処理される。
アルカリ処理は、低級アルコールの存在下で任意に行われる。或いは、低級アル
コールでの第一洗浄は、ｐＨ９〜１２のアルカリ水で、任意に低級アルコールの
存在下で、そして、任意に昇温において結晶性カロテノイド懸濁液を一回以上洗
浄した後に行われる。 次いで、結晶性カロテノイド懸濁液が液相から分離されて粗カロテノイド結晶
が生成される。

【００１２】 好ましくは、上述の処理工程（ａ）〜（ｆ）は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（
ｄ）、（ｅ）、（ｆ）の順序で実施される。 本発明を通して、低級アルコールとは、１〜６個の炭素原子のアルコール、例
えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール及び１−
ブタノールである。本発明で使用される低級アルコールは単独のアルコールでも
、或いは、二種以上のアルコールの混合物であっても良い。好ましくは、低級ア
ルコールは、エタノール、１−ブタノール又は１−ブタノールとエタノールとの
混合物である。

【００１３】 粗カロテノイド結晶は、更に、結晶を水又は低級アルコールと水との混合物で
一回以上洗浄する事を含む第二洗浄工程を適用する事によって精製される。洗浄
溶液のｐＨは、好ましくは１〜５、更に好ましくは２〜４の値を有する。水は、
適当な酸、例えば、硫酸又は塩酸で、或いは酸性緩衝溶液、例えば、ボレート／
塩酸又はシトレート／塩酸緩衝液で酸性化されても良い。低級アルコール／水混
合物中における低級アルコール／水の比は、好ましくは５：１〜１：５、更に好
ましくは１：１〜１：２である。 結晶は、次いで、適当な方法、例えば、濾過或いは遠心分離によって液相から
分離される。 この後に、結晶は新鮮な溶剤で一回以上洗浄される。この新鮮な溶剤は低級ア
ルコールであり、好ましくは、エタノール、又は低級アルコールのアセテートエ
ステル、好ましくは酢酸エチルである。更に好ましくは、新鮮な溶剤は食品等級
の溶剤である。

【００１４】 本発明の好ましい実施態様では、結晶性カロテノイド懸濁液の最初の二つの洗
浄工程で使用される低級アルコールと結晶の最後の洗浄工程で使用される新鮮な
溶剤とは同じ溶剤である。 本発明方法の最終工程で結晶が乾燥される。 本発明方法は、食品化学規格(Food Chemical Codex)(FCC)(page 90, Edition
IV (1996), National Academy Press, Washington DC)に記載されている様な方
法によって少なくとも９５％の純度の結晶をもたらす。 結晶性カロテノイドの単離の為の従来の抽出／結晶化方法と比較して、本発明
の重要な利点は、カロテノイドの抽出の為の有機溶剤の使用が避けられる点であ
る。その結果、得られるカロテノイド化合物の結晶格子中に溶剤は実質的に導入
されない。

【００１５】 本発明のその他の観点では、本発明方法は、粗結晶性カロテノイド、好ましく
は粗結晶性カロテノイド懸濁液のカロテノイド含有量を増加させる為に使用され
る。 β−カロテン及びアスタキサンチンは本発明の好ましいカロテノイド化合物で
ある。

【００１６】 実施例１ ブラケスレア−トリスポラの均質化された培養ブロスから得られた結晶性β−
カロテン懸濁液からβ−カロテン結晶の調製 （Ｉ）β−カロテンを０．９ｇ／ｌ含むブラケスレア−トリスポラの培養ブロ
スを、ホモジナイザー(APV Gaulin)で６００ｂａｒで一度均質化した。次いで、
均質化されたブロスを円板遠心分離機で遠心分離した。β−カロテン結晶を含む
最上層を遠心分離機から分離し、この最上層を様々な実施例の出発材料として使
用した。 （ＩＩ）３０００ｍｌの水を、このβ−カロテン含有最上層２２００ｇに添加
し、次いで、この混合物を、ｐＨ１２（８Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ調整した）で７５
℃で２時間培養した。反応混合物を室温まで冷却し、３５０ｇの塩化ナトリウム
を添加した。得られた混合物を５分間、５０００ｒｐｍで遠心分離した。この様
にして得られた結晶性β−カロテン懸濁液をｐＨ７の緩衝液で一度洗浄して、そ
れに５０ｇ／ｌの塩化ナトリウムを添加した。 遠心分離後、β−カロテン懸濁液を、２．５容量（約５０００ｍｌ）の新鮮な
１−ブタノールで四回洗浄した。遠心分離後に回収されて得られた結晶を、緩衝
液／ブタノールの比が２：１の、１−ブタノールとｐＨ２の緩衝液（シトレート
／塩酸）との混合物で三回洗浄した。 最後に、β−カロテンが濃縮された中間物を２５００ｍｌの９６％エタノール
で二度洗浄した。遠心分離後に得られた湿潤結晶を一晩、真空下で４２℃で乾燥
した。 得られた結晶のＦＣＣ法(Food Chemical Codex, Edition IV (1996), Nationa
l Academy Press, Washington DC, page 90に記載されている)による分析結果は
次の通りである。

【００１７】

【表１】 実施例２ １−ブタノール、エタノール及び水の混合物で結晶生成物を洗浄する事による
、β−カロテン結晶を含有する最上層から結晶性β−カロテンの調製 １０００ｍｌの水を、実施例１で回収されたβ−カロテン懸濁液２５０ｇに添
加し、ｐＨ１２で７５℃で培養した。室温に冷却後、５０ｇの塩化ナトリウムを
この反応混合物に添加し、得られた混合物を５分間、５０００ｒｐｍで遠心分離
した。

【００１８】 この様にして得られたβ−カロテン懸濁液をｐＨ７の緩衝液で洗浄し、それに
５０ｇ／ｌの塩化ナトリウムを添加した。遠心分離後、懸濁液を２．５容量（＝
５００ｍｌ）の新鮮な１−ブタノールで洗浄した。この工程を三回繰返した。 １−ブタノールで洗浄後、ペレットを、１−ブタノールとエタノールと水が２
：３：１の比の混合物２５０ｍｌで三回洗浄した。最後に、β−カロテンが濃縮
されたペレットを５０ｍｌの９６％エタノールで二度洗浄した。遠心分離後に得
られたペレットを一晩真空下で４０℃で乾燥した。ＦＣＣ法で決定された得られ
たβ−カロテン結晶の純度は９８％であり、結晶中の溶剤量は８７０ｐｐｍであ
った。

【００１９】 実施例３ 最初に１−ブタノールで、続いて１−ブタノールとｐＨ１０の緩衝液との混合
物で懸濁液を洗浄する事による、結晶性β−カロテン懸濁液から結晶性β−カロ
テンの調製 実施例１の（Ｉ）で回収された最上層の２５０ｇを２．５容量（＝５００ｍｌ
）の新鮮な１−ブタノールで洗浄した。この工程を三度繰返した。 １−ブタノールで洗浄後、結晶性β−カロテン懸濁液を、１―ブタノールとｐ
Ｈ１０の緩衝液との混合物２５０mlに室温で懸濁した。遠心分離後、β−カロテ
ン懸濁液を、１―ブタノールとｐＨ１０の緩衝液との混合物で二度洗浄した。最
後に、β−カロテンが濃縮された懸濁液を５０ｍｌの９６％エタノールで、５０
℃の温度で３０分間、二度にわたって洗浄した。遠心分離後に得られた結晶を一
晩、真空下で４０℃で乾燥した。ＦＣＣ法により決定されたβ−カロテン結晶の
純度は９６％であった。

【００２０】 実施例４ １−ブタノールと水での洗浄を繰返し行う事による、β−カロテン結晶を含む
懸濁液から結晶性β−カロテンの単離 β−カロテン含有量が平均して１ｇ／ｌのブラケスレア−トリスポラの五つの
異なる培養ブロスを９００ｂａｒで一度均質化した。様々なブロスの均質化され
ら混合物を遠心分離して、β−カロテン結晶を含む約６００ｍｌの最上層を得た
。この最上層を約６００ｍｌの脱塩水で三回洗浄した。 次いで、９００ｍｌの水を、回収されたβ−カロテン懸濁液５０ｇに添加した
。ｐＨを８Ｎ−水酸化ナトリウムで１２に調整した。このｐＨで７５℃で二時間
の培養後、反応混合物を室温に冷却した。 ２５０ｍｌの１−ブタノールを５００ｍｌの反応混合物に添加し、５分間攪拌
後、１−ブタノール層をデカントし、２５０ｍｌの新鮮な１−ブタノールを添加
した。更に５分間攪拌後、混合物を遠心分離した。β−カロテン結晶を含有する
中間物を分離し、２０ｍｌの水と１５ｍｌの１−ブタノールとの混合物に懸濁し
、５分間攪拌し、β−カロテン結晶を含む中間層を遠心分離で分離した。この工
程を５回繰返した。この後、β−カロテン結晶を４０ｍｌのエタノール（９６％
）で洗浄し、真空下で１６時間、３５℃で乾燥した。ＦＣＣ法による得られた結
晶の純度は９７％であり、溶剤の濃度は３４０ｐｐｍであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウォルフ ヨハネス ヘンドリック オランダ エヌエル−2285 カーセー リ ースウィーク ランゲ ドレーフ 195 (72)発明者 シャープ アルベルト オランダ エヌエル−2993 ベーヘー バ ーレンドレヒト スミッツフーク 13アー Ｆターム(参考） 4H006 AA01 AA02 AB10 AB27 AD17 AD18 BB14 BB17 BC53 UC12

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】結晶格子中に実質的に溶剤を含まない、純度９５％以上の結晶性カ
   ロテノイド化合物。
2. 【請求項２】請求項１の結晶性カロテノイド化合物の製造方法であって、 （ａ）カロテノイド含有細胞、好ましくは微生物資源からの細胞を破壊して、油
   状結晶性カロテノイド懸濁液を分離する工程、 （ｂ）該油状結晶性カロテノイド懸濁液を、ｐＨ９〜１２のアルカリで、１０〜
   ９５℃の温度で、好ましくは３０〜８５℃、最も好ましくは５０〜７５℃の温度
   で、任意に、低級アルコールの存在下で処理する工程、 （ｃ）該アルカリ処理された結晶性カロテノイド懸濁液に塩を添加する任意の工
   程、 （ｄ）該結晶性カロテノイド懸濁液を液相から分離する任意の工程、 （ｅ）該結晶性カロテノイド懸濁液を、塩を含む水溶液で任意に洗浄する工程、 （ｆ）該結晶性カロテノイド懸濁液を低級アルコールで第一洗浄工程において洗
   浄する工程（（ｂ）〜（ｅ）の工程と（ｆ）の工程の実施順序は任意である）、 （ｇ）（ａ）〜（ｆ）の処理工程から得られる粗カロテノイド結晶を、水又は低
   級アルコールと水との混合物で第二洗浄工程において洗浄する工程、 （ｈ）該結晶を新鮮な溶剤で洗浄する工程、及び、 （ｉ）該結晶を乾燥する工程、 を含む事を特徴とする方法。
3. 【請求項３】（ａ）〜（ｆ）の工程が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
   ）、（ｆ）の順序で実施される、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】（ａ）〜（ｆ）の工程が、（ａ）、（ｆ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ
   ）、（ｅ）の順序で実施される、請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】工程（ｇ）が、１〜５のｐＨで実施される、請求項２〜４の何れか
   一項に記載の方法。
6. 【請求項６】低級アルコールが、１〜６個の炭素原子のアルコール、好ましくは
   エタノール及び１−ブタノールから成る群から選ばれる、請求項２〜５の何れか
   一項に記載の方法。
7. 【請求項７】工程（ｈ）で結晶を洗浄するのに使用される新鮮な溶剤がエタノー
   ル又は酢酸エチルである、請求項２〜６の何れか一項に記載の方法。
8. 【請求項８】工程（ａ）〜（ｇ）で使用される低級アルコールと工程（ｈ）で使
   用される新鮮な溶剤が同じ溶剤である、請求項２〜７の何れか一項に記載の方法
   。
9. 【請求項９】微生物資源が、バクテリア、真菌、藻類又は酵母である、請求項２
   〜８の何れか一項に記載の方法。
10. 【請求項１０】真菌がムコラレス目に属する、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】真菌がブラケスレア−トリスポラである、請求項１０に記載の方
    法。
12. 【請求項１２】酵母がファフィア属に属し、好ましくはファフィア−ロドチマ種
    に属する、請求項８に記載の方法。
13. 【請求項１３】カロテノイド化合物がβ−カロテンである、請求項２〜１２の何
    れか一項に記載の方法。
14. 【請求項１４】カロテノイド化合物がアスタキサンチンである、請求項２〜１２
    の何れか一項に記載の方法。
15. 【請求項１５】請求項２の処理工程（ｂ）〜（ｉ）を適用して結晶性カロテノイ
    ド化合物のカロテノイド含有量を増加させる方法。