CN103012229B

CN103012229B - 制备高纯度虾青素提取物的方法

Info

Publication number: CN103012229B
Application number: CN201210562276.XA
Authority: CN
Inventors: 黄胜奎; 马建; 陈黎明
Original assignee: NINGBO HONGLONG BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: NINGBO HONGLONG BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2032-12-21
Also published as: CN103012229A

Abstract

本发明公开了一种制备高纯度虾青素提取物的方法，依次包括以下步骤：1）取虾青素粗提物，用无水乙醇稀释，然后加入浓度为6~12 mmol/L的NaOH-无水乙醇溶液置于暗处室温皂化；2）所得皂化液加入二氯甲烷-水的溶液中，静置分层，下层液体浓缩，得浸膏；3）所得浸膏溶于正己烷:丙酮=4:1（体积比）溶液中，上样到硅胶柱；依次进行以下洗脱：以正己烷:丙酮=4:1（体积比）溶液作为洗脱液Ⅰ进行洗脱，得黄色馏分；以正己烷:丙酮=1:1（体积比）溶液作为洗脱液Ⅱ进行洗脱，得橙色馏分；以甲醇洗脱至硅胶柱无色；4）橙色馏分真空减压浓缩，所得的紫红色浸膏为高纯度虾青素提取物。

Description

制备高纯度虾青素提取物的方法

技术领域

本发明属于天然产物分离纯化，主要涉及一种制备高纯度虾青素提取物的方法。

背景技术

虾青素是一种红色的类胡萝卜素，化学名称为3,3’-二羟基-β,β’-胡萝卜素-4,4’-二酮，分子式为C₄₀H₅₂O₄(式1)。虾青素在工业上具有广泛的用途：第一，虾青素具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤、抗衰老等保健功能，可用于食品、保健品、药品和化妆品行业；第二，虾青素是一种良好的食用色素，可作为食品的着色剂；第三，虾青素也可用作饲料添加剂，用于观赏性鱼、虾的养殖中，使其颜色更加鲜艳。从来源上讲，虾青素既可以通过人工合成，也可从生物体中提取。人工合成的虾青素由于存在安全隐患，其应用受到很大的限制。因此，人们更倾向于从生物体中提取天然虾青素。天然虾青素普遍存在于水产动物、藻类及鸟类的羽毛中，如虾壳、蟹壳、鲑鱼肉、雨生红球藻及火烈鸟的羽毛等。

虾青素单体是虾青素提取物中的主要活性成分。另外，虾青素作为一种色素，在提取过程中其他的色素也会被提取出来，如叶黄素、角黄素、β-胡萝卜素等。由于结构相似，一般的提取条件难以将虾青素与其他色素分离。如何减少虾青素中的其他色素以提高其纯度也成为亟待解决的问题之一。虽然大型的制备色谱可以实现虾青素单体的分离，但短期内无法实现工业化生产。

虾青素的粗提物例如可按照已经公开发表《中药材》2010年第33卷第1期处的《超临界CO₂流体萃取法》进行制备，当然，也能通过市购的方式获得，例如可购自宁波红龙生物科技有限公司。

式1

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、高效、适于工业化推广的制备高纯度虾青素提取物的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种制备高纯度虾青素提取物的方法，依次包括以下步骤：

1)、取虾青素粗提物，用无水乙醇稀释后，得稀释后的虾青素粗提物；

在稀释后的虾青素粗提物中加入浓度为6~12mmol/L的NaOH-无水乙醇溶液，混匀后置于暗处室温(25~30℃)皂化0.5~1h，得皂化液；

2)、将步骤1)所得皂化液加入二氯甲烷-水的溶液中，充分混匀后静置分层，弃去上层液体；下层液体于35~45℃真空减压浓缩，得浸膏；

3)、将步骤2)所得浸膏溶于正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液中，上样到硅胶柱；依次进行以下洗脱：

以正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液作为洗脱液I进行洗脱，得黄色馏分；

以正己烷:丙酮=1:1(体积比)溶液作为洗脱液I进行洗脱，得橙色馏分；

以甲醇洗脱至硅胶柱无色；

备注说明：上述3种洗脱时，流速均控制在8~12mL/min。

4)、步骤3)所得橙色馏分于35~45℃真空减压浓缩后，得紫红色浸膏，该紫红色浸膏为高纯度虾青素提取物。

作为本发明的制备高纯度虾青素提取物的方法的改进：步骤1)中虾青素粗提物与无水乙醇的体积比为1:5~10，得稀释后的虾青素粗提物；

稀释后的虾青素粗提物与NaOH-无水乙醇溶液的体积比为1:3~6。

作为本发明的制备高纯度虾青素提取物的方法的进一步改进：步骤2)中：二氯甲烷-水的溶液中二氯甲烷与水的体积比为1~2:1；二氯甲烷-水的溶液与稀释后的虾青素粗提物的体积比为10~30:1。

作为本发明的制备高纯度虾青素提取物的方法的进一步改进：步骤3)中洗脱液I、洗脱液I的用量均为1~3倍柱体积。

作为本发明的制备高纯度虾青素提取物的方法的进一步改进：步骤1)中：

虾青素粗提物与无水乙醇的体积比为1:5，得稀释后的虾青素粗提物；

稀释后的虾青素粗提物与浓度为12mmol/L的NaOH-无水乙醇溶液的体积比为1:4；

皂化时间为1h。

备注说明：在步骤3)中：将步骤2)所得浸膏溶于正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液，正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液的用量只要求能使浸膏被完全溶解即可。

在步骤3)中，硅胶用量至少是步骤2)所得浸膏的80质量倍；柱体积是指硅胶和填充溶剂填进柱子后形成的体积，一般为柱长的2/3处左右，且需保证填充溶剂盖过填料(即硅胶)。以正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液为填充溶剂。

正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液，即为：正己烷与丙酮按照4:1的体积比混合而得的溶液。

本发明的高纯度虾青素提取物的制备方法，虾青素粗提物例如可选用宁波红龙生物科技有限公司生产的天然虾青素油剂，硅胶例如可选用青岛海洋化工厂生产的柱层析硅胶100~200目。

采用本发明方法制备而得的高纯度虾青素提取物中，虾青素单体含量至少能达到55%。

发明人经过大量的实验才获得了虾青素粗提物与NaOH-无水乙醇溶液的体积比及其皂化时间。NaOH-无水乙醇溶液的用量过大或皂化时间太长，会使皂化出的虾青素单体发生部分降解或氧化，造成资源浪费的同时，也降低了虾青素的纯度；而NaOH-无水乙醇溶液的用量过少或皂化时间太短，则会影响虾青素的皂化度，使皂化不完全，最终影响产物的纯度。

发明人同样经过大量的实验才获得了硅胶柱层析的洗脱液比例；正己烷:丙酮=4:1溶液可将一部分色素杂质洗脱下来，虾青素单体不会被该溶液洗脱；正己烷:丙酮=1:1溶液可将虾青素单体彻底洗脱下来，且不会有拖尾和死吸附，保证了洗脱的效率。

发明人同样经过大量的实验证实，未经皂化的虾青素粗提物直接经硅胶柱层析后，虾青素单体与类胡萝卜色素未能得到较好的分离效果，所得虾青素馏分与皂化后的粗提物相比，虾青素单体的含量偏低，类胡萝卜色素的含量偏高。

采用本发明方法制备而得的高纯度虾青素提取物经HPLC分析检测，虾青素单体含量可高达60.10%，其余为叶黄素等类胡萝卜素。虾青素单体及叶黄素等类胡萝卜素具有很强的抗氧化活性，其总量约占高纯度虾青素提取物的90%以上。因此，利用本发明方法制备而得的高纯度虾青素提取物具有良好的保健功能，开发价值高，具有良好的推广应用前景。

具体实施方式

以下实施例中所选用的虾青素粗提物均为宁波红龙生物科技有限公司生产的天然虾青素油剂，经HPLC法检测，其虾青素单体含量仅为4.34%。

实施例1、一种制备高纯度虾青素提取物的方法，依次进行以下步骤：

1)、取1mL宁波红龙生物科技有限公司生产的天然虾青素油剂，用5mL无水乙醇稀释，得稀释后的虾青素粗提物；

取1mL稀释后的虾青素粗提物加入4mL12mmol/L的NaOH-无水乙醇溶液中，混匀后置于暗处室温(25℃)皂化1h，得皂化液；

2)、将步骤1)所得皂化液加入二氯甲烷-水的溶液(由5mL二氯甲烷+5mL水混合而得)中，充分混匀后静置分层，弃去上层液体。下层液体于45℃真空减压(0.09MPa)浓缩，得浸膏(约200mg)；

3)、将步骤2)所得浸膏溶于1mL正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液中，全部上样到2.5cm×40cm硅胶柱。硅胶柱以20g青岛海洋化工厂生产的100~200目柱层析硅胶填料，正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液为填充溶剂(使柱体积为柱长的2/3处左右)。以300mL正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液洗脱，得黄色馏分；然后以300mL正己烷:丙酮=1:1(体积比)溶液洗脱，得橙色馏分；最后以甲醇(约400mL)洗脱至硅胶柱无色；

上述3种洗脱时，流速均控制在10mL/min左右；

4)、步骤3)所得橙色馏分于45℃真空减压浓缩后，得紫红色浸膏2.3mg，紫红色浸膏为高纯度虾青素提取物。

对比例1、相对于实施例1作如下改动：

取消步骤1)和步骤2)；

步骤3)：取0.17mL宁波红龙生物科技有限公司生产的天然虾青素油剂替代实施例1步骤3)中的“步骤2)所得浸膏”，其余同实施例1的步骤3)。

步骤4)同实施例1的步骤4)。

所得的紫红色浸膏为未经皂化的高纯度虾青素提取物。

对比例2、将实施例1的步骤1)中的皂化时间由1h改成1.5h，其余同实施例1。

对比例3、将实施例1的步骤1)中的皂化时间由1h改成0.2h，其余同实施例1。

对比例4、将实施例1的步骤1)中“加入4mL12mmol/L的NaOH-无水乙醇溶液”改成“加入8mL14mmol/L的NaOH-无水乙醇溶液”，其余同实施例1。

对比例5、将实施例1的步骤1)中“加入4mL12mmol/L的NaOH-无水乙醇溶液”改成“加入2mL5mmol/L的NaOH-无水乙醇溶液”，其余同实施例1。

对比例6、将实施例1的步骤3)中首次洗脱的洗液由正己烷:丙酮=4:1改成正己烷:丙酮=5:1，其余同实施例1。

对比例7、将实施例1的步骤3)中首次洗脱的洗液由正己烷:丙酮=4:1改成正己烷:丙酮=3:1，其余同实施例1。

对比例8、将实施例1的步骤3)中二次洗脱的洗液由正己烷:丙酮=1:1改成正己烷:丙酮=1.5:1，其余同实施例1。

对比例9、将实施例1的步骤3)中二次洗脱的洗液由正己烷:丙酮=1:1改成正己烷:丙酮=0.5:1，其余同实施例1。

将上述实施例1以及对比例1~对比例5所得的高纯度虾青素提取物进行虾青素单体含量的检测，所得结果如表1所示；将实施例1以及对比例6~对比例9的洗脱液用量及最终所得的紫红色浸膏(即高纯度虾青素提取物)进行比较，结果如表2所示。

表1、提取物中虾青素单体含量(为质量%)

	虾青素单体含量(%)
		实施例1	60.10
对比例1	26.28
		对比例2	27.85
对比例3	15.67
		对比例4	27.24
对比例5	16.76

表2、洗脱液用量及浸膏量

经检测：对比例6~对比例9所得的紫红色浸膏中虾青素单体含量为52~56%。

实施例2、一种制备高纯度虾青素提取物的方法，依次进行以下步骤：

1)、取0.1mL宁波红龙生物科技有限公司生产的天然虾青素油剂，用0.5mL无水乙醇稀释后，得稀释后的虾青素粗提物；

取0.1mL稀释后的虾青素粗提物加入0.4mL6mmol/L的NaOH-无水乙醇溶液中，混匀后置于暗处室温(30℃)皂化0.5h，得皂化液；

2)、将步骤1)所得皂化液加入二氯甲烷-水(2mL+1mL)的溶液中，充分混匀后静置分层，弃去上层液体。下层液体于40℃真空减压浓缩，得浸膏；

3)、将步骤2)所得浸膏溶于1mL正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液中，全部上样到2.5cm×40cm硅胶柱。硅胶柱以15g青岛海洋化工厂生产的100~200目柱层析硅胶填料，正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液为填充溶剂。以200mL正己烷:丙酮=4:1(体积比)溶液洗脱，得黄色馏分；然后以200mL正己烷:丙酮=1:1(体积比)溶液洗脱，得橙色馏分；最后以200mL甲醇洗脱至硅胶柱无色；

上述3种洗脱时，流速均控制在10mL/min左右；

4)、步骤3)所得橙色馏分于40℃真空减压浓缩至膏状物，所得的紫红色浸膏为高纯度虾青素提取物。

对比例10、相对于实施例2作如下改动：

取消步骤1)和步骤2)；

步骤3)：取0.02mL宁波红龙生物科技有限公司生产的天然虾青素油剂替代实施例2步骤3)中的“步骤2)所得浸膏”，其余同实施例2的步骤3)。

步骤4)同实施例2的步骤4)。

所得的紫红色浸膏为未经皂化的高纯度虾青素提取物。

将上述实施例2以及对比例10所得的高纯度虾青素提取物进行虾青素单体含量的检测，所得结果如表3所示。

表3、提取物中虾青素单体含量

	实施例2	对比例10
			虾青素含量(%)	57.23	25.83

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.制备高纯度虾青素提取物的方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、取虾青素粗提物，用无水乙醇稀释后，得稀释后的虾青素粗提物；所述虾青素粗提物与无水乙醇的体积比为1:5；

在稀释后的虾青素粗提物中加入浓度为12mmol/L的NaOH-无水乙醇溶液，混匀后置于暗处室温皂化1h，得皂化液；所述稀释后的虾青素粗提物与NaOH-无水乙醇溶液的体积比为1:4；

2)、将步骤1)所得皂化液加入二氯甲烷-水的溶液中，充分混匀后静置分层，弃去上层液体；下层液体于35～45℃真空减压浓缩，得浸膏；

3)、将步骤2)所得浸膏溶于正己烷:丙酮＝4:1(体积比)溶液中，上样到硅胶柱；依次进行以下洗脱：

以正己烷:丙酮＝4:1(体积比)溶液作为洗脱液Ⅰ进行洗脱，得黄色馏分；

以正己烷:丙酮＝1:1(体积比)溶液作为洗脱液Ⅱ进行洗脱，得橙色馏分；

以甲醇洗脱至硅胶柱无色；

4)、步骤3)所得橙色馏分于35～45℃真空减压浓缩后，得紫红色浸膏，紫红色浸膏为高纯度虾青素提取物。

2.根据权利要求1所述的制备高纯度虾青素提取物的方法，其特征是：所述步骤2)中：二氯甲烷-水的溶液中二氯甲烷与水的体积比为1～2:1；二氯甲烷-水的溶液与稀释后的虾青素粗提物的体积比为10～30:1。

3.根据权利要求2所述的制备高纯度虾青素提取物的方法，其特征是：所述步骤3)中洗脱液Ⅰ、洗脱液Ⅱ的用量均为1～3倍柱体积。