EP3143155A1 - Verfahren zur herstellung von carotinoiden durch submersfermentation mit mischkulturen von (+) und (-) - stämmen des pilzes blakeslea trispora - Google Patents

Verfahren zur herstellung von carotinoiden durch submersfermentation mit mischkulturen von (+) und (-) - stämmen des pilzes blakeslea trispora

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Publication number
EP3143155A1
EP3143155A1 EP15721715.9A EP15721715A EP3143155A1 EP 3143155 A1 EP3143155 A1 EP 3143155A1 EP 15721715 A EP15721715 A EP 15721715A EP 3143155 A1 EP3143155 A1 EP 3143155A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
oil
strain
carotenoid
fermentation
substrate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP15721715.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Robert Reinhard Pätz
Thomas Papert
Vivien Peter
Sarah Polage
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JAECKERING RESEARCH GMBH
Original Assignee
Hochschule Anhalt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hochschule Anhalt filed Critical Hochschule Anhalt
Publication of EP3143155A1 publication Critical patent/EP3143155A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D7/00—Edible oil or fat compositions containing an aqueous phase, e.g. margarines
    • A23D7/005—Edible oil or fat compositions containing an aqueous phase, e.g. margarines characterised by ingredients other than fatty acid triglycerides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A61K31/015—Hydrocarbons carbocyclic

Definitions

  • the invention relates to a simple and effective method for the production of ⁇ -carotene or lycopene by submerged fermentation with mixed cultures of (+) and (-) strains of the fungus Blakeslea trispora, which is characterized by a high productivity of B. trispora strains.
  • the high productivity is achieved by the method according to the invention, which takes into account the morphological state of the filamentous half-growths and the growth state in the mixing of the strains (the so-called mating).
  • Carotenoids are natural dyes that cause a yellow to reddish color and are common in vegetables. They were and are due to their properties as antioxidants and as a precursor for vitamin A subject of many studies. Due to their antioxidant effect they are many diseases such. For example, cancer, arteriosclerosis, rheumatism or Alzheimer's disease. Lycopene (occurring, for example, in tomatoes) has the greatest antioxidant potential and is considered to be the most effective protection against the particularly reactive singlet oxygen. Industrially, the carotenoids are used as food additives and coloring agents e.g. As used in margarines, oils, sauces, soups and fruit juices, but also used as feed additives.
  • Carotenoids can be produced chemically and biotechnologically. By means of biotechnological production, carotenoids of more complex structure and also the naturally occurring conformational isomers are very easily accessible.
  • the industrial biotechnological process for the production of ⁇ -carotene is based on the use of the alga Dunaliella salina or the fungus Blakeslea trispora, wherein using B. trispora, a mixed fermentation of the (+) and (-) strains is carried out to obtain a to obtain maximum yield of beta-carotene.
  • EP 1 367 131 A1 The fermentation conditions described in EP 1 367 131 A1 provide for both a programmed addition of oxygen and / or ⁇ -ionone and a control of the vegetative growth phase of the strains used.
  • US Pat. No. 5,422,247 A and WO 2005/030976 A2 disclose further fermentation processes which comprise a regulation of the pH value and, if appropriate, of the oxygen partial pressure.
  • the literature also describes the use of chemical components to increase the product. However, such ingredients may be toxic and their nutritional or drug regulatory approval may be in question.
  • the object of the invention is a method for producing a carotenoid selected from ß-carotene or lycopene by submerged fermentation with mixed cultures of (+) and (-) - strains of the fungus Blakeslea trispora and recovery of the carotenoid from the obtained biomass or from the oil phase of Fermentation broth characterized in that first the (-) and (+) strains are pre-cultured separately until full morphological formation, then the (-) strain is inoculated into the bioreactor and during the exponential growth of the (-) -) strain of the (+) strain is added to the (-) strain in a volume ratio of 1: 5 to 1: 100 (also referred to as mating ratio) to induce carotenoid formation and both strains together without pH regulation and without regulation of oxygen partial pressure at 18 to 24 ° C, if necessary, until the end of carotenoid formation (idiophase) fermented.
  • the separate Vorkultiv ist of the strains is carried out in a preferred embodiment of the invention in each case at 26 - 30 ° C, particularly preferably at 28 ° C. Separate pre-cultivation of the (-) strain is carried out for about 55 hours. After about 55 hours, the (-) strain is transferred to the bioreactor. The fermentation of the (-) - strain in the bioreactor is also preferably carried out at 26-30 ° C, more preferably at 28 ° C. The Cultivation of the (-) strain in the bioreactor is carried out for about 13 to 14 hours (trophophase).
  • co-fermentation of the (+) and (-) strain (idiophase) be carried out for carotenoid formation at 22 ° C.
  • cultivation of the (-) half-stem is carried out on a reactor scale until complete hyphae formation (trophophase) and only then the (+) half-stem is added as an induction measure during the exponential growth of the (-) strain.
  • the fermentation process can be shortened in time and costs can be saved.
  • no regulation of pH or oxygen content is required in the present process. Since there is no need to control the pH, no use of acids or bases is required and costs are saved.
  • Fumigation rate, rotational speed and temperature are kept constant during the entire product formation (idiophase), which obviously favors adaptation of the fungi to the prevailing conditions.
  • the onset of product formation is characterized by a simultaneous decrease in BTS (biosolute substance) content and pH.
  • BTS biologically treated substance
  • the termination criterion of carotenoid formation can be detected by a significant increase in the pH. That is, after a pH rise of 0.5 to 0.8, carotenoid formation is stopped.
  • the stirring rate during the separate pre-cultivation in the shaking flask of the strains is preferably 130 to 156 rpm. It is preferred according to the invention, the stirring rate during the cultivation of the (-) - strain in the bioreactor (trophophase) to 230 to 350 rpm, more preferably 244 to 344 rpm, adjust.
  • the gassing volume flow during the trophophase is preferably about 1 vvm (volume of air / volume of fermenter / minute).
  • idiophase ie in the phase of product formation also referred to as the phase of the common fermentation of the (+) - and (-) - strains after induction, are the Conditions for the stirring rate and the gassing volume flow the same as in the trophophase.
  • the mating ratio expressed as the volume ratio (in each case (+) strain to (-) strain), in a particular embodiment of the invention is 1: 5 to 1:20, particularly preferably 1: 5 to 1:10.
  • the substrates well known for B. trispora are used, in particular those containing carbohydrates and organic nitrogen compounds simultaneously. Lipids can also be added to the substrate.
  • Starch or sugar are preferably used in the substrate according to the invention as carbohydrates. It has been shown that, in particular with sugar-containing substrates with a sugar content of 10 to 50 g / L, good yields of carotenoid are obtained.
  • Sugar-containing substrates preferably comprise molasses, beer wort or by-products of the starch industry or combinations thereof.
  • the substrate for the phase of the common fermentation of the (+) - and (-) strains after induction contains lipids.
  • the lipids are preferably one or more oils.
  • the oil or oils are preferably one or more native oils.
  • vegetable oils preferably native vegetable oils, can be used in the substrate. Examples of suitable vegetable oils are olive oil, rapeseed oil, corn oil and sunflower oil.
  • lycopene is to be prepared by the process according to the invention, preference is given to adding a cyclase inhibitor, preferably imidazole and / or an imidazole derivative, to the substrate during the joint fermentation of the (+) and (-) strain (idiophase).
  • a cyclase inhibitor preferably imidazole and / or an imidazole derivative
  • the process of the invention allows the production of lycopene without addition of possibly toxic chemicals such. Cyclaseinhibitoren.
  • lycopene is preferably obtained from the oil phase of the fermentation broth.
  • the process of the invention it is possible to use all known B. trispora half-strains which are publicly available in culture collections, such as e.g.
  • the strain BS 01 (FIG. -), in the International Depositary Office of the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Germany under the number DSM 16755, and the strain BS 01 (+), which is deposited there under the number DSM 16754, are used.
  • the method is characterized by the following steps:
  • the (-) strain is precultured separately for about 55 h and the (+) strain for about 68 h in an Erlenmeyer flask at 28 ° C. and 145 rpm.
  • the (-) strain is transferred to a reactor and fermented for about 13-14 h at 28 ° C, a gassing rate of about 1 vvm and a stirrer speed of 244 to 344 rpm.
  • the cultivation temperature is adjusted to 22 ° C.
  • the volume ratio between (+) and (-) strain is 1: 9.
  • the stirrer speed preferably remains at 244 to 344 rpm.
  • a control of the pH value is not carried out.
  • the workup of the biomass is carried out by methods generally known to the person skilled in the art, for example by solid-liquid separation or extraction of the solid, if appropriate after gentle drying of the biomass pellet.
  • the present method ensures a high productivity of Blakeslea strains solely by the control of physical parameters, which in the food or drug regulatory approval of carotenoids according to the invention no problems are to be expected since the inventive method no toxic or otherwise dangerous substances are left in the product.
  • carotenoid yields are achieved in the dry biomass of at least 2%, preferably from 4 to 6%.
  • the carotenoid can be obtained not only from the biomass obtained, but can alternatively or additionally be obtained from the oil phase of the fermentation broth.
  • the carotenoid formation increasingly occurs during the idiophase, wherein initially in the (-) - a lipid or oil storage takes place.
  • the carotenoid in particular the hydrophobic beta-carotene, is incorporated into this intracellular oil phase.
  • the carotenoid can be removed from the obtained biomass are obtained by the cells are digested and the carotenoid or carotenoid-oil mixture extracted from the intracellular oil phase.
  • the process according to the invention for preparing a carotenoid selected from ⁇ -carotene or lycopene by submerged fermentation with mixed cultures of (+) and (-) strains of the fungus Blakeslea trispora and obtaining the carotenoid from the oil phase of the fermentation broth is characterized in that the (-) and (+) strains are pre-cultured separately until full morphological training, then the (-) strain is inoculated into the bioreactor and during the exponential growth of the (-) strain the (+) strain the (-) - strain in the volume ratio 1: 5 to 1: 100 (also referred to as mating ratio) is added to induce carotenoid formation and both strains together without pH regulation and without regulation of the oxygen partial pressure at 18 to 24 ° C, optionally in the phase of carotenoid formation (idiophase), be fermented.
  • the oil phase is separated from the fermentation broth and filtered if necessary, so that macroscopic constituents, ie components with an average diameter of 1 ⁇ or more, are removed from the oil phase.
  • a carotenoid-containing oil or oil mixture is obtained, which can be used as such further or which can be subjected to a further purification to obtain even purer carotenoid fractions.
  • an oil phase is formed in the fermentation broth in the process according to the invention, from which the carotenoid can be obtained, regardless of whether the fermentation substrate itself is a lipid or contains oil or not.
  • substrates for the production of the carotenoid from the fermentation broth which contain one or more lipids.
  • the lipids are preferably one or more oils.
  • the oil or oils are preferably one or more native oils.
  • suitable vegetable oils are olive oil, rapeseed oil, corn oil and sunflower oil.
  • the inventive method for obtaining carotenoids from the oil phase of the fermentation broth also allows a continuous or at least multi-cyclic process management.
  • substrate is again supplied to the fermentation batch after the induction, so that the nutrient supply in the fermentation batch allows further cultivation of the batch.
  • the addition of fermentation substrate can take place, for example, once, repeatedly or regularly.
  • the addition of fermentation substrate is preferably such that in the fermentation batch, the concentration of the carbon source does not fall below a threshold at which the organisms die off.
  • the first addition of fermentation substrate occurs in a period of 20h to 60h after induction by introduction of the (+) strain.
  • the addition of fermentation substrate can be repeated or regular.
  • the first addition of fermentation substrate occurs in a period of 20h to 60h after induction by introduction of the (+) strain, while any further addition occurs within a period of 24h to 48h after the previous addition.
  • the time between each additional addition may also be shorter or longer. It is crucial that the substrate content does not decrease permanently or for a longer period of time below a concentration which leads to the inhibition of the fungus.
  • the method according to the invention for producing a carotenoid selected from ⁇ -carotene or lycopene by submerged fermentation with mixed cultures of (+) and (-) strains of the fungus Blakeslea trispora and recovery of the carotenoid from the oil phase of the fermentation broth is characterized by the following steps : (1) The (-) strain is precultured separately for about 55 h and the (+) strain in the conical flask at 28 ° C. and 145 rpm for about 68 h.
  • the (-) strain is transferred to a reactor and fermented for about 13-14 h at 28 ° C, a gassing of about 1 vvm and a stirrer speed of 244 to 344 rpm.
  • the cultivation temperature is adjusted to 22 ° C.
  • the volume ratio between (+) and (-) strain is 1: 9.
  • the secondary metabolites such as carotenoids
  • This process is similar to detoxification and ensures the survival of the fungus.
  • the carotenoid can be obtained directly as the oil phase of the fermentation broth and a costly and time-consuming separation of the carotenoids from the biomass is no longer necessary. Consequently, no mechanical, thermal, enzymatic or chemical treatment of the biomass must be carried out, the carotenoids can be removed as native carotenoids directly as the oil phase of the fermentation broth.
  • the production of carotenoids can be operated as a continuous process in which set higher yields than in the conventional process, especially if the carotenoids are obtained not only from the oil phase of the fermentation broth but also additionally from the biomass.
  • the content of carotenoids and xanthophylls in the oil product can be increased in the process according to the invention.
  • the inventive method and the one or more additional additions of (+) or (-) half-strain to the fermentation broth are carried out and, accordingly, the oil is further enriched with carotenoids.
  • oils or oil mixtures which have a content of carotenoid, in particular of native carotenoid, of 400 mg / L or more, preferably 1, 500 mg / l or more, especially from 400 to 1, 500 mg / l and more.
  • oils or oil mixtures which have a content of lycopene, in particular of native lycopene, of 2 mg / L or more, preferably 2 to 20 mg / L and more.
  • the method according to the invention allows the production of native carotenoid, which has not been affected by processes during cell disruption.
  • the present invention also relates to native carotenoid or to an oil or oil mixture containing a native carotenoid, wherein the native carotenoid can be prepared or prepared by a method according to the invention.
  • the carotenoid-containing oil or oil mixture according to the invention preferably has a native carotenoid concentration of 400 mg / l or more.
  • the carotenoid-containing oil or oil mixture according to the invention is preferably characterized in that the concentration of beta-carotene is 20 to 1500 mg / L, more preferably 30 to 1300 mg / L, most preferably from 300 to 1300 mg / L.
  • the carotenoid-containing oil or oil mixture prepared by the process according to the invention preferably has a concentration of lycopene of more than 2 mg / L, more preferably from 2 to 20 mg / L, most preferably from 2 to 15 mg / L.
  • the carotenoid-containing oil or oil mixture according to the invention has at least 30 mg / L beta-carotene and at least 2 mg / L lycopene, preferably at least 400 mg / L beta-carotene and at least 5 mg / L lycopene.
  • the carotenoid-containing oil or oil mixture according to the invention can be, for example:
  • the carotenoid-containing oil or oil mixture according to the invention is a mixture according to the invention:
  • the carotenoid-containing oil or oil mixture according to the invention can be, for example:
  • FIGS. 1 to 7 show:
  • Fig. 1 an HPLC chromatogram of the native sunflower oil.
  • Fig. 2 an HPLC chromatogram of the carotenoid-containing oil after 3 Nach Schotterungen with starchy substrate (sunflower oil).
  • Fig. 3 an HPLC chromatogram of the carotenoid-containing oil after 5 Nach Schotterept with starchy substrate (sunflower oil).
  • Fig. 4 a HPLC chromatogram of the carotenoid-containing oil after 5 Nach Schotterept with glucose-containing substrate (sunflower oil).
  • Fig. 5 an HPLC chromatogram of corn oil.
  • FIG. 6 shows an HPLC chromatogram of the carotenoid-containing oil after a post-feeding with starch-containing substrate (maize germ oil).
  • Fig. 7 a HPLC chromatogram of the carotenoid-containing oil after 5 Nach sympatterept with starchy substrate (corn oil).
  • the half-stems DSM 2387 and DSM 2388 are separated on YPsS solid medium (starch: 15 g / L, yeast extract: 4 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 20 g / L). Spore formation starts within 3 days. From the 3rd day of cultivation, the spores can be rinsed off with a sterile 0.2% Span20 solution.
  • a 300 mL flask is charged with 200 mL YPsS medium (starch: 15 g / L, yeast extract: 4 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 2 g / L , Thiamine: 0.002 g / L, sunflower oil: 30 g / L).
  • the steam sterilized at 121 ° C for 20 minutes, medium is inoculated to room temperature with 2 * 10 6 spores after cooling.
  • the (-) strain is precultured separately for 55 hours and the (+) strain for 68 hours at 28 ° C.
  • the shaking frequency is 145 rpm.
  • a reactor with a nominal volume of 5 L is filled with 3200 ml of the liquid medium (YPsS without yeast extract) and sterilized for 30 minutes at 121 ° C. After cooling the medium, the sterile yeast extract (360 mL) and thiamine (12 mL) are added. The weight of the individual components of the liquid medium was 3572 mL. After adjusting the cultivation temperature of 28 ° C, the reactor is seeded with 200 mL of DSM 2388 culture. Cultivation takes place for 13 hours so that the fungus is within the exponential growth phase. Subsequently, 400 ml of the DSM 2387 culture are added to induce carotenoid formation. For the idiophase, the temperature is lowered to 22 ° C. Within 36 to 48 hours, an intense orange coloration of the biomass begins. For the cultivation neither a control of the pH value nor the pO2 value is necessary. Fumigation is continuous with 1 vvm at a stirrer speed of 300 rpm.
  • the half-stems DSM 2387 and DSM 2388 are separated on YPsS solid medium (starch: 15 g / L, yeast extract: 4 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 20 g / L). Spore formation starts within 3 days. From the 3rd day of cultivation, the spores can be rinsed off with a sterile 0.2% Span20 solution.
  • a 300 mL flask is charged with 200 mL YPsS medium (wort: 10 g / L, yeast extract: 4 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 2 g / L , Thiamine: 0.002 g / L, sunflower oil: 30 g / L).
  • the steam sterilized at 121 ° C for 20 minutes, medium is inoculated to room temperature with 2 * 10 6 spores after cooling.
  • the (-) strain is precultured separately for 55 hours and the (+) strain for 68 hours at 28 ° C.
  • the shaking frequency is 145 rpm.
  • a reactor with a nominal volume of 5 L is mixed with 3200 mL of the liquid medium (wort: 10 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 2 g / L, sunflower oil: 30 g / L) and sterilized for 30 minutes at 121 ° C. After cooling the medium, the sterile yeast extract (14.292 g / 360 mL) and thiamine (0.0072 g / 12 mL) are added. The weight of the individual components of the liquid medium was 3572 mL. After adjusting the cultivation temperature of 28 ° C, the reactor is seeded with 200 mL of DSM 2388 culture.
  • the liquid medium wort: 10 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 2 g / L, sunflower oil: 30 g /
  • the half strains ATCC 14271 and ATCC 14272 are separated on YPsS solid medium (starch: 15 g / L, yeast extract: 4 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 20 g / L). Spore formation starts within 3 days. From the 3rd day of cultivation, the spores can be rinsed off with a sterile 0.2% Span20 solution.
  • a 300 mL flask is charged with 200 mL YPsS medium (starch: 15 g / L, yeast extract: 4 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 2 g / L , Thiamine: 0.002 g / L, sunflower oil: 30 g / L).
  • the steam sterilized at 121 ° C for 20 minutes, medium is inoculated to room temperature with 2 * 10 6 spores after cooling.
  • the (-) strain is precultured separately for 55 hours and the (+) strain for 68 hours at 28 ° C.
  • the shaking frequency is 145 rpm.
  • Two reactors with a nominal volume of 5 L are each filled with 3200 ml of the liquid medium (YPsS without yeast extract) and sterilized for 30 minutes at 121 ° C. After cooling the medium, the sterile yeast extract (360 mL) and thiamine (12 mL) are added. The weight of the individual components of the liquid medium was 3572 mL. After adjusting the culture temperature of 28 ° C, the reactors are each inoculated with 200 mL of the ATCC 14271 culture and the ATCC 14272 culture. There is cultivation for 14 hours so that the fungus is within the exponential growth phase.
  • the half-stems DSM 2387 and DSM 2388 are separated on YPsS solid medium (starch: 15 g / L, yeast extract: 4 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 20 g / L). Spore formation starts within 3 days. From the 3rd day of cultivation, the spores can be rinsed off with a sterile 0.2% Span20 solution.
  • a 300 mL flask is charged with 200 mL YPsS medium (starch: 15 g / L, yeast extract: 4 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 2 g / L , Thiamine: 0.002 g / L, sunflower oil: 30 g / L).
  • the steam sterilized at 121 ° C for 20 minutes, medium is, after cooling to room temperature * inoculated each with 2106 spores.
  • the (-) strain is precultured separately for 55 hours and the (+) strain for 68 hours at 28 ° C.
  • the shaking frequency is 145 rpm.
  • a reactor with a nominal volume of 5 L is filled with 3200 ml of the liquid medium (YPsS without yeast extract) and sterilized for 30 minutes at 121 ° C. After cooling the medium, the sterile yeast extract (360 mL) and thiamine (12 mL) are added. The weight of the individual components of the liquid medium was 3572 mL. After adjusting the cultivation temperature of 28 ° C, the reactor is seeded with 200 mL of DSM 2388 culture. Cultivation takes place for 13 hours so that the fungus is within the exponential growth phase. Subsequently, 400 ml of the DSM 2387 culture are added to induce carotenoid formation. For the idiophase, the temperature is lowered to 22 ° C. Within 36 to 48 hours, an intense orange coloration of the biomass begins. For the cultivation neither a control of the pH value nor the p02 value is necessary. Fumigation is continuous with 1 vvm at a stirrer speed of 300 rpm.
  • the half strains ATCC 14271 and ATCC 14272 are separated on YPsS solid medium (starch: 15 g / L, yeast extract: 4 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 20 g / L). Spore formation starts within 3 days. From the 3rd day of cultivation, the spores can be rinsed off with a sterile 0.2% Span20 solution.
  • a 300 mL flask is charged with 200 mL YPsS medium (starch: 15 g / L, yeast extract: 4 g / L, magnesium sulfate: 0.45 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1.0 g / L, agar: 2 g / L , Thiamine: 0.002 g / L, corn oil: 30 g / L).
  • the steam sterilized at 121 ° C for 20 minutes, medium is, after cooling to room temperature * inoculated each with 2106 spores.
  • the (-) strain is precultured separately for 55 hours and the (+) strain for 68 hours at 28 ° C.
  • the shaking frequency is 145 rpm.
  • a reactor with a nominal volume of 5 l is filled with 3200 ml of the liquid medium (YPsS without yeast extract) and sterilized for 30 minutes at 121 ° C. After cooling the medium, the sterile yeast extract (360 mL) and thiamine (12 mL) are added. The weight of the individual components of the liquid medium was 3572 mL. After adjusting the cultivation temperature of 28 ° C, the reactor is seeded with 200 mL of DSM 2388 culture. Cultivation takes place for 13 hours so that the fungus is within the exponential growth phase. Subsequently, 400 ml of the DSM 2387 culture are added to induce carotenoid formation. For the idiophase, the temperature is lowered to 22 ° C. Within 36 to 48 hours, an intense orange coloration of the biomass begins.
  • UV-VIS detector Merck Hitachi L-4250
  • the oil but also parts of the fermentation broth and biomass, would be separated by decanting (pouring off). By centrifuging the sample at 3044 g for 5 min, a clear separation between the biomass, fermentation broth and oil phase could be obtained.
  • the oil samples were withdrawn and filtered for HPLC determination (pore size 0.45 ⁇ , PTFE syringe filter, Carl Roth GmbH + Co. KG) to ensure a particle-free sample.
  • HPLC determination pore size 0.45 ⁇ , PTFE syringe filter, Carl Roth GmbH + Co. KG
  • Figs. 1-7 Exemplary spectra of the oils studied are shown in Figs. 1-7.
  • 1 shows a HPLC chromatogram of the native sunflower oil
  • 2 is a HPLC chromatogram of a carotenoid-containing oil according to Example 4 after 3 Nach Schotterungen with starchy substrate (sunflower oil).
  • 3 is a HPLC chromatogram of a carotenoid-containing oil according to Example 4 after 5 Nach Schotterache with starchy substrate (sunflower oil).
  • FIG. 4 is a HPLC chromatogram of a carotenoid-containing oil according to Example 4 after 5 Nach Schotterept with glucose-containing substrate (sunflower oil); 5 shows a HPLC chromatogram of the maize germ oil; 6 is a HPLC chromatogram of a carotenoid-containing oil according to Example 5 after a post-feeding with starch-containing substrate (corn oil); and FIG. 7 shows an HPLC chromatogram of a carotenoid-containing oil according to Example 5 after 5 restorations with starch-containing substrate (maize germ oil).
  • the composition of the oils used was determined in the first step.
  • the peak areas determined were from the peak areas of the carotenoid-containing oil samples subtracted. The significant peaks were detected as lutein, ⁇ -cryptoxanthin, lycopene and ⁇ -, ⁇ - and Y-carotene (Table 3).
  • Table 3 Minima and maxima of the content determined by HPLC in mg L -1 at different cultivation conditions.
  • the minima and maxima values represent in each case the lowest and highest value of all carotenoid-containing oil samples.
  • the ⁇ -carotene content of 1295 mg L -1 was reached on the reactor scale after repeated feeding 8. In the shake flask experiments the maximum was about 4 to 5 post-feedings at around 700 mg L "1 .
  • the content of carotenoids in the oil phase was dependent on the process strategy. After one or two additional replenishment, the content of, for example, ⁇ -carotene was about 50 to 100 mg L -1 .
  • the content of ⁇ -carotene in the oil could be increased by repeated replenishment with starch, molasses or glucose-containing medium with four to five replenishment to about 500 to 800 mg L "1 and with a 7 to 10maligen Nach Stahl Stahl Stahl Stahl Stahl Stahl Stahl Sttt für to over 1000 mg L " 1.
  • the distance of the feeding was in the current investigations between 20 and 50 hours, however
  • the content of carotenoids and xanthophylls is mainly dependent on the number of post-feeds, the oil used and the substrate.
  • the main proportion of carotenoids was about 80 to 97% ß-carotene, the detection of other carotenoids was dependent on the substrate used, oil used and number of Nach spatterept. Above all, the number of Nach spattans lowers the proportion of other carotenoids and thus increases the percentage of ß-carotene, which can be done by synthesis processes, a change in the content of carotenoid-containing oil.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein einfaches und effektives Verfahren zur Herstellung von ß-Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) -Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora, das durch eine hohe Produktivität der B. trispora -Stämme gekennzeichnet ist. Die hohe Produktivität wird durch die erfindungsgemäße Verfahrensführung erreicht, die den morphologischen Zustand der filamentös wachsenden Halbstämme und den Wachstumszustand beim Vermischen der Stämme (dem sogenannten Mating)berücksichtigt.

Description

Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora
Die Erfindung betrifft ein einfaches und effektives Verfahren zur Herstellung von ß-Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora, das durch eine hohe Produktivität der B. trispora - Stämme gekennzeichnet ist. Die hohe Produktivität wird durch die erfindungsgemäße Verfahrensführung erreicht, die den morphologischen Zustand der filamentös wachsenden Halbstämme und den Wachstumszustand beim Vermischen der Stämme (dem sogenannten Mating) berücksichtigt.
Carotinoide sind natürliche Farbstoffe, die eine gelbe bis rötliche Färbung verursachen und häufig in Gemüsepflanzen vorkommen. Sie waren und sind aufgrund ihrer Eigenschaften als Antioxidantien und als Vorstufe für Vitamin A Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Auf Grund ihrer antioxidativen Wirkung sollen sie vielen Erkrankungen wie z. B.Krebs, Arteriosklerose, Rheuma oder Alzheimer vorbeugen. Lycopin (vorkommend z.B. in Tomaten) hat dabei das größte antioxidative Potenzial und gilt als wirksamster Schutz vor dem besonders reaktiven Singulett-Sauerstoff. Industriell werden die Carotinoide als Nahrungsmittelzusatzstoffe und farbgebende Mittel z. B. in Margarinen, Ölen, Saucen, Suppen und Fruchtsäften verwendet, aber auch als Futterzusatzstoffe eingesetzt.
Carotinoide sind chemisch und biotechnologisch herstellbar. Mittels biotechnologischer Herstellung sind Carotinoide komplexerer Struktur und auch die natürlich vorkommenden Konformationsisomere sehr einfach zugänglich. Der industrielle biotechnologische Prozess zur Herstellung von ß-Carotin basiert auf der Verwendung der Alge Dunaliella salina oder des Pilzes Blakeslea trispora, wobei bei Verwendung von B. trispora eine gemischte Fermentation der (+)- und (-)- Stämme durchgeführt wird, um eine maximale Ausbeute an ß- Carotin zu erhalten.
Im Stand der Technik ist die Herstellung von ß-Carotin durch Fermentation von B.trispora in zahlreichen Patentdokumenten beschrieben, beispielsweise in EP 1 367 131 A1 , WO 93/20183 A1 oder WO 02/010429 A1 . Alle beschriebenen Fermentationsverfahren basieren auf dem Prinzip, dass die (+) - und (-)- Halbstämme gemeinsam in den Bioreaktor inokuliert werden. WO 93/20183 A1 beschreibt die Produktion von ß-Carotin unter Verwendung ausgewählter mutierter B.trispora - Stämme unter spezifischen Fermentationsbedingungen. WO 02/010429 A1 offenbart ein Fermentationsverfahren mit definierter pH-Wert - Regelung während der Fermentation und dem Zusatz von Sojalecithin zum Kulturmedium, um die Erzeugung von ß-Carotin in Bezug auf andere Carotinoide zu erhöhen. Die in EP 1 367 131 A1 beschriebenen Fermentationsbedingungen sehen sowohl eine programmierte Zugabe von Sauerstoff und/oder ß-lonon als auch eine Kontrolle der vegetativen Wachstumsphase der verwendeten Stämme vor. In US 5,422,247 A und WO 2005/030976 A2 werden weitere Fermentationsverfahren offenbart, die eine Regulation des pH-Wertes sowie ggf. des Sauerstoffpartialdrucks umfassen. In der Literatur wird auch die Anwendung chemischer Komponenten zur Produktsteigerung beschrieben. Solche Inhaltsstoffe können jedoch toxisch sein und deren nahrungs- oder arzneimittelrechtliche Zulassung kann in Frage stehen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein effektives Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden, insbesondere ß-Carotin und Lycopin, bereitzustellen, das gute Produktausbeuten liefert, ohne chemische Zusätze zu benötigen. Daneben soll es möglichst kostengünstig sowie in der Durchführung einfach und wenig aufwändig sein und eine Reduzierung der Fermentationsdauer erlauben. Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines Carotinoids ausgewählt aus ß-Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora und Gewinnung des Carotinoids aus der erhaltenen Biomasse oder aus der Ölphase der Fermentationsbrühe gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zunächst der (-)- und der (+) - Stamm getrennt bis zur vollen morphologischen Ausbildung vorkultiviert werden, dann der (-) - Stamm in den Bioreaktor inokuliert wird und während des exponentiellen Wachstums des (-)-Stammes der (+) - Stamm dem (-) - Stamm im Volumenverhältnis 1 : 5 bis 1 :100 (auch als Matingverhältnis bezeichnet) zur Induktion der Carotinoidbildung zugesetzt wird und beide Stämme gemeinsam ohne pH-Regulierung und ohne Regulierung des Sauerstoffpartialdrucks bei 18 bis 24 °C, ggf. bis zum Ende der Carotinoidbildung (Idiophase), fermentiert werden.
Die getrennte Vorkultivierung der Stämme erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung jeweils bei 26 - 30°C, besonders bevorzugt bei 28°C. Die getrennte Vorkultivierung des (-) - Stammes wird ca. 55 Stunden durchgeführt. Nach ca. 55 Stunden wird der (-) - Stamm dann in den Bioreaktor überführt. Die Fermentation des (-) - Stammes im Bioreaktor erfolgt ebenfalls vorzugsweise bei 26-30°C, besonders bevorzugt bei 28°C. Die Kultivierung des (-) - Stammes im Bioreaktor wird für ca. 13 bis 14 Stunden durchgeführt (Trophophase).
Es ist ebenfalls besonders bevorzugt, dass die gemeinsame Fermentation des (+)- und (-)- Stammes (Idiophase) zur Carotinoidbildung bei 22°C vorgenommen wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Kultivierung des (-) Halbstammes im Reaktormaßstab bis zu einer vollständigen Hyphenausbildung durchgeführt (Trophophase) und erst dann der (+) Halbstamm als Induktionsmaßnahme während des exponentiellen Wachstums des (-)-Stammes zugegeben. Dadurch kann der Fermentationsprozess zeitlich verkürzt und Kosten eingespart werden. Zusätzlich findet zwischen Tropho - und Idiophase ein Temperaturshift von für das Wachstum optimalen 26-30°C auf 18 bis 24°C statt. Die niedrigere Temperatur inhibiert die Vitalität der Pilzhalbstämme nicht, fördert jedoch die Stabilität des Produktes während der Fermentation. Für die erfolgreiche Kultivierung mit guten Produktausbeuten ist im vorliegenden Verfahren keine Regelung von pH oder Sauerstoffgehalt erforderlich. Da keine Regelung des pH-Wertes stattfinden muss, ist kein Einsatz von Säuren oder Basen erforderlich und es werden Kosten gespart.
Begasungsrate, Drehzahl und Temperatur werden während der gesamten Produktbildung (Idiophase) konstant gehalten, was offensichtlich eine Adaptierung der Pilze an die vorherrschenden Bedingungen begünstigt. Das Einsetzten der Produktbildung ist gekennzeichnet durch gleichzeitige Abnahme des BTS (Biotrockensubstanz) - Gehalts und pH-Wertes. Das Abbruchkriterium der Carotinoid-Bildung kann durch eine deutliche Zunahme des pH-Wertes detektiert werden. D.h., dass nach einem pH-Wert-Anstieg um 0,5 bis 0,8 die Carotinoidbildung abgebrochen wird.
Die Rührgeschwindigkeit während der getrennten Vorkultivierung im Schüttelkolben der Stämme beträgt bevorzugt 130 bis 156 rpm. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, die Rührgeschwindigkeit während der Kultivierung des (-) - Stammes im Bioreaktor (Trophophase) auf 230 bis 350 rpm, besonders bevorzugt auf 244 bis 344 rpm, einzustellen.
Der Begasungsvolumenstrom während der Trophophase beträgt vorzugsweise ca. 1 vvm (Volumen Luft/ Volumen Fermenter/ Minute).
In der Idiophase, also in der Phase der Produktbildung auch bezeichnet als Phase der gemeinsamen Fermentation der (+)- und (-)-Stämme nach der Induktion, sind die Bedingungen für die Rührgeschwindigkeit und den Begasungsvolumenstrom die gleichen wie in der Trophophase.
Das Matingverhältnis, angegeben als Volumenverhältnis (jeweils (+)-Stamm zu (-)-Stamm), beträgt in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung 1 :5 bis 1 :20, besonders bevorzugt 1 :5 bis 1 :10.
Als Substrat oder Fermentationssubstrat können in der Idiophase des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, also in der Phase der Produktbildung auch bezeichnet als Phase der gemeinsamen Fermentation der (+)- und (-)-Stämme nach der Induktion, die für B.trispora allgemein bekannten Substrate eingesetzt werden, insbesondere solche, die Kohlenhydrate und organische Stickstoffverbindungen gleichzeitig enthalten. Auch Lipide können dem Substrat zugesetzt werden. Als Kohlenhydrate werden im Substrat erfindungsgemäß bevorzugt Stärke oder Zucker verwendet. Es hat sich gezeigt, dass insbesondere mit zuckerhaltigen Substraten mit einem Zuckergehalt von 10 bis 50g/L gute Ausbeuten an Carotinoid erhalten werden. Zuckerhaltige Substrate weisen bevorzugt Melasse, Bierwürze oder Nebenprodukte der Stärkeindustrie oder Kombinationen davon auf. Bevorzugt enthält das Substrat für die Phase der gemeinsamen Fermentation der (+)- und (-)-Stämme nach der Induktion Lipide. Bei den Lipiden handelt es sich bevorzugt um ein oder mehrere Öle. Bei dem oder den Ölen handelt es sich bevorzugt um ein oder mehrere native Öle. Insbesondere können im Substrat Pflanzenöle, bevorzugt native Pflanzenöle, verwendet werden. Beispiele für geeignete Pflanzenöle sind Olivenöl, Rapsöl, Maiskeimöl und Sonnenblumenöl.
Soll mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Lycopin hergestellt werden, so wird bevorzugt dem Substrat bei der gemeinsamen Fermentation des (+)- und (-)-Stammes (Idiophase) einen Cyclaseinhibitor zuzusetzen, vorzugsweise Imidazol und/oder ein Imidazolderivat. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Herstellung von Lycopin auch ohne Zusatz von ggf. toxischen Chemikalien wie z.B. Cyclaseinhibitoren. Dabei wird Lycopin bevorzugt aus der Ölphase der Fermentationsbrühe gewonnen.
Im Verfahren der Erfindung können alle bekannten und in Kultursammlungen öffentlich zugänglichen B. trispora - Halbstämme eingesetzt werden, so z. B. der (-)-Stamm DSM 2388 und der (+)- Stamm DSM 2387 oder der (-)-Stamm ATCC 14272 und der (+)-Stamm ATCC 14271. In einer Ausführungsform der Erfindung können auch der Stamm BS 01 (-), der in der Internationalen Hinterlegungsstelle der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Deutschland unter der Nummer DSM 16755 hinterlegt ist, und der Stamm BS 01 (+), der ebendort unter der Nummer DSM 16754 hinterlegt ist, eingesetzt werden.
In einer ganz besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren durch die nachfolgenden Schritte gekennzeichnet:
(1 ) Der (-) Stamm wird ca. 55 h und der (+) Stamm ca. 68 h im Erlenmeyerkolben bei 28°C und 145 rpm getrennt vorkultiviert.
(2) Nach ca. 55 h wird der (-) Stamm in einen Reaktor überführt und für ca.13 - 14 h bei 28°C, einer Begasungsrate von ca. 1 vvm und einer Rührerdrehzahl von 244 bis 344 rpm fermentiert.
(3) Nach der Zugabe des (+) Stammes wird die Kultivierungstemperatur auf 22 °C eingestellt. Das Volumenverhältnis zwischen (+) und (-) Stamm beträgt 1 :9. Bevorzugt bleibt die Rührerdrehzahl bei 244 bis 344 rpm.
(4) Eine Regelung des pH-Wertes wird nicht vorgenommen. Die Aufarbeitung der Biomasse wird nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden durchgeführt, zum Beispiel durch Fest-Flüssig-T rennung bzw. Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass das vorliegende Verfahren eine hohe Produktivität von Blakeslea-Stämmen allein durch die Steuerung physikalischer Parameter gewährleistet, wodurch bei der nahrungs- bzw. arzneimittelrechtlichen Zulassung der erfindungsgemäß hergestellten Carotinoide keinerlei Probleme zu erwarten sind, da durch das erfindungsgemäße Verfahren keine toxischen oder andersartig gefährlichen Stoffe im Produkt hinterlassen werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Carotinoid- Ausbeuten in der Biotrockenmasse von mindestens 2 % erzielt, vorzugsweise von 4 bis 6%.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich das Carotinoid nicht nur aus der erhaltenen Biomasse gewinnen, sondern kann alternativ oder zusätzlich aus der Ölphase der Fermentationsbrühe gewonnen werden.
Es ist bekannt, dass in Blakeslea trispora die Carotinoid-Bildung vermehrt während der Idiophase abläuft, wobei zunächst im (-)-Stamm eine Lipid- oder Öleinlagerung erfolgt. In diese intrazelluläre Ölphase wird das Carotinoid, insbesondere das hydrophobe beta- Carotin, eingelagert. Nach Abschluss der Fermentation kann das Carotinoid aus der erhaltenen Biomasse gewonnen werden in dem die Zellen aufgeschlossen werden und das Carotinoid oder Carotinoid-Öl-Gemisch aus der intrazellulären Ölphase extrahiert wird.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass bei Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens signifikante Mengen an Carotinoid von den Organismen während der Fermentation freigesetzt und in die Fermentationsbrühe als Carotinoid-Öl-Gemisch abgegeben werden. Damit erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Gewinnung von Carotinoid mittels Separation der Ölphase der Fermentationsbrühe. Es ist kein Zellaufschluss notwendig und das gewonnene Carotinoid kann ohne weitere Prozessschritte weiterverwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Carotinoids ausgewählt aus ß- Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora und Gewinnung des Carotinoids aus der Ölphase der Fermentationsbrühe gelöst, zeichnet sich dadurch aus, dass zunächst der (-)- und der (+) - Stamm getrennt bis zur vollen morphologischen Ausbildung vorkultiviert werden, dann der (-) - Stamm in den Bioreaktor inokuliert wird und während des exponentiellen Wachstums des (-)-Stammes der (+) - Stamm dem (-) - Stamm im Volumenverhältnis 1 : 5 bis 1 :100 (auch als Matingverhältnis bezeichnet) zur Induktion der Carotinoidbildung zugesetzt wird und beide Stämme gemeinsam ohne pH-Regulierung und ohne Regulierung des Sauerstoffpartialdrucks bei 18 bis 24 °C, ggf. in der Phase der Carotinoidbildung (Idiophase), fermentiert werden. Anschließend wird die Ölphase von der Fermentationsbrühe abgetrennt und ggf. filtriert, so dass makroskopische Bestandteile, also Bestandteile mit eine mittleren Durchmesser von 1 μηι oder mehr, aus der Ölphase entfernt werden. Damit wird ein Carotinoid-haltiges Öl oder Ölgemisch erhalten, welches als solches weiter verwendet werden kann oder welches einer weiteren Aufreinigung unterzogen werden kann um noch reinere Carotinoid-Fraktionen zu erhalten.
Dadurch, dass die Organismen während der Idiophase gebildetes Carotinoid als Carotinoid-Öl-Gemisch aus dem Zellinneren freisetzen, bildet sich im erfindungsgemäßen Verfahren eine Ölphase in der Fermentationsbrühe aus, aus der das Carotinoid gewonnen werden kann, unabhängig davon, ob das Fermentationssubstrat selbst ein Lipid oder Öl enthält oder nicht.
Bevorzugt kommen im erfindungsgemäßen Verfahren für die Gewinnung des Carotinoids aus der Fermentationsbrühe Substrate zum Einsatz, die ein oder mehrere Lipide enthalten. Bei den Lipiden handelt es sich bevorzugt um ein oder mehrere Öle. Bei dem oder den Ölen handelt es sich bevorzugt um ein oder mehrere native Öle. Insbesondere können im Substrat Pflanzenöle, bevorzugt native Pflanzenöle, verwendet werden. Beispiele für geeignete Pflanzenöle sind Olivenöl, Rapsöl, Maiskeimöl und Sonnenblumenöl.
Im Gegensatz zu bisherigen Verfahren, bei denen das Carotinoid aus der erhaltenen Biomasse gewonnen wird und die damit in der Regel diskontinuierlich gestaltet sind, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Carotinoiden aus der Ölphase der Fermentationsbrühe auch eine kontinuierliche oder wenigstens mehrzyklische Verfahrensführung. Um eine mehrzyklische oder kontinuierliche Verfahrensführung zu gewährleisten, wird dem Fermentationsansatz nach der Induktion erneut Substrat zugeführt, so dass das Nährstoffangebot im Fermentationsansatz eine Weiterkultur des Ansatzes erlaubt. Die Zugabe von Fermentationssubstrat kann dabei beispielsweise einmalig, mehrmalig oder regelmäßig erfolgen.
Die Zugabe von Fermentationssubstrat erfolgt bevorzugt derart, dass im Fermentationsansatz die Konzentration der Kohlenstoffquelle nicht unter einen Schwellenwert sinkt, bei dem die Organismen absterben. Beispielsweise erfolgt die erste Zugabe von Fermentationssubstrat in einem Zeitraum von 20h bis 60h nach Induktion durch Einbringen des (+)-Stamms.
Die Zugabe von Fermentationssubstrat kann mehrmalig oder regelmäßig erfolgen. Beispielsweise erfolgt die erste Zugabe von Fermentationssubstrat in einem Zeitraum von 20h bis 60h nach Induktion durch Einbringen des (+)-Stamms, während jede weitere Zugabe innerhalb eines Zeitraums von 24h bis 48h nach der vorhergehenden Zugabe erfolgt. Die Zeitspanne zwischen jeder weiteren Zugabe kann auch kürzer oder länger sein. Entscheidend ist, dass der Substratgehalt nicht dauerhaft oder für einen längeren Zeitraum unter eine Konzentration absinkt, die zur Inhibition des Pilzes führt.
In einer besonderen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Carotinoids ausgewählt aus ß-Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora und Gewinnung des Carotinoids aus der Ölphase der Fermentationsbrühe durch folgende Schritte gekennzeichnet: (1 ) Der (-)-Stamm wird ca. 55 h und der (+)-Stamm ca. 68 h im Erlenmeyerkolben bei 28°C und 145 rpm getrennt vorkultiviert.
(2) Nach ca. 55 h wird der (-)-Stamm in einen Reaktor überführt und für ca.13 - 14 h bei 28°C, einer Begasungsrate von ca. 1 vvm und einer Rührerdrehzahl von 244 bis 344 rpm fermentiert. (3) Nach Induktion der Carotinoidproduktion durch die Zugabe des (+)-Stammes wird die Kultivierungstemperatur auf 22 °C eingestellt. Das Volumenverhältnis zwischen (+) und (-) - Stamm beträgt 1 :9.
(4) Eine Regelung des pH-Wertes wird nicht vorgenommen.
(5) Nach 20h - 60h nach Zugabe des (+)-Stamms wird neues Fermentationssubstrat, optional mit Öl, der Fermentationsbrühe zugesetzt.
(6) Optional erfolgen weitere Zugaben von Fermentationssubstrat zur Fermentationsbrühe, wobei jede weitere Zugabe innerhalb eines Zeitraums von 24h bis 48h nach der vorhergehenden Zugabe von Fermentationszugabe erfolgt. In der Zwischenzeit wird die Fermentation bevorzugt unter unveränderten Bedingungen fortgeführt.
(7) Abtrennung der (Carotinoid-haltigen) Ölphase von der restlichen Fermentationsbrühe und ggf. Filtration des gewonnenen Carotinoid-haltigen Öls oder Ölgemisches.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden z.B. durch veränderte Umgebungsbedingungen, wie beispielsweise die erneute oder zusätzliche Zufuhr von Nährstoffen durch Zugabe von Fermentationssubstrat, die sekundären Stoffwechselprodukte, wie Carotinoide, in mikrobiellem Öl von den Pilzen ausgeschieden. Dieser Vorgang ähnelt einer Entgiftung und sichert den Fortbestand des Pilzes. Durch das Ausschleusen des intrazellulären Carotinoid- Öl-Gemisches in die Fermentationsbrühe kann das Carotinoid direkt als Ölphase der Fermentationsbrühe gewonnen werden und eine kosten- und zeitaufwändige Abtrennung der Carotinoide aus der Biomasse ist nicht mehr notwendig. Folglich muss keine mechanische, thermische, enzymatische oder chemische Behandlung der Biomasse mehr erfolgen, die Carotinoide können als native Carotinoide direkt als Ölphase der Fermentationsbrühe entnommen werden. Durch die hier vorgeschlagene Verfahrensführung lässt sich die Gewinnung von Carotinoiden als kontinuierliches Verfahren betreiben, bei dem sich höhere Ausbeuten einstellen als bei der konventionellen Verfahrensführung, insbesondere wenn die Carotinoide nicht nur aus der Ölphase der Fermentationsbrühe gewonnen werden sondern zusätzlich auch noch aus der Biomasse.
Durch mehrmalige Nachfütterung mit Fermentationssubstrat kann im erfindungsgemäßen Verfahren der Gehalt an Carotinoiden und Xanthophyllen im Ölprodukt erhöht werden. Um eine kontinuierliche oder zyklische Verfahrensführung mit möglichst vielen Nachfütterungszyklen zu erlauben, kann im erfindungsgemäßen Verfahren auch die einmalige oder mehrmalige zusätzliche Zugabe von (+) bzw. (-) Halbstamm zur Fermentationsbrühe erfolgen und dementsprechend das Öl weiter mit Carotinoiden angereichert werden.
Es hat sich gezeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere bei der Gewinnung der Carotinoide aus der Ölphase der Fermentationsbrühe, Öle oder Ölgemische herstellen lassen, die einen Gehalt an Carotinoid, insbesondere an nativem Carotinoid, von 400 mg/L oder mehr, bevorzugt von 1 .500 mg/l oder mehr, insbesondere von 400 bis 1 .500 mg/L und mehr aufweisen.
Es hat sich gezeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere bei der Gewinnung der Carotinoide aus der Ölphase der Fermentationsbrühe, Öle oder Ölgemische herstellen lassen, die einen Gehalt an Lycopin, insbesondere an nativem Lycopin, von 2 mg/L oder mehr, bevorzugt von 2 bis 20 mg/L und mehr aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt also die Produktion von nativem Carotinoid, welches nicht durch Prozesse während des Zellaufschlusses beeinträchtigt worden ist. Damit bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf natives Carotinoid bzw. auf ein Öl oder Öl-Gemisch enthaltend ein natives Carotinoid, wobei das native Carotinoid nach einem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar oder hergestellt ist. Das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch weist bevorzugt eine Konzentration an nativem Carotinoid von 400 mg/l oder mehr auf. Das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch ist bevorzugt dadurch charakterisiert, dass die Konzentration an beta-Carotin 20 bis 1500 mg/L, besonders bevorzugt 30 bis 1300 mg/L , ganz besonders bevorzugt von 300 bis 1300 mg/L beträgt. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch weist bevorzugt eine Konzentration an Lycopin auf von mehr als 2 mg/L, besonders bevorzugt von 2 bis 20 mg/L, ganz besonders bevorzugt von 2 bis 15 mg/L.
In einer besonderen Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch mindestens 30 mg/L beta Carotin sowie mindestens 2 mg/L Lycopin auf, bevorzugt mindestens 400 mg/L beta-Carotin und mindestens 5 mg/L Lycopin.
Das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch kann beispielsweise:
> 0,25 mg/L Lutein,
> 2 mg/L beta-Cryptoxanthin,
> 2 mg/L Lycopin, > 3 mg/L gamma-Carotin,
> 0,25 mg/L alpha-Carotin, und
> 30 mg/L beta-Carotin
enthalten.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch:
0,25 bis 1 mg/L Lutein,
2 bis 25 mg/L beta-Cryptoxanthin,
2 bis 15 mg/L Lycopin,
3 bis 35 mg/L gamma-Carotin,
0,2 bis 25 mg/L alpha-Carotin, und
30 bis 1300 mg/L beta-Carotin
enthalten. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch beispielsweise:
0,28 bis 0,71 mg/L Lutein,
2,05 bis 24,9 mg/L beta-Cryptoxanthin,
2,09 bis 14,35 mg/L Lycopin,
3,01 bis 31 ,8 mg/L gamma-Carotin,
0,29 bis 24,9 mg/L alpha-Carotin, und
30,9 bis 1295 mg/L beta-Carotin
enthalten. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken.
Figuren:
Die Figuren 1 bis 7 zeigen:
Fig. 1 : ein HPLC-Chromatogramm des nativen Sonnenblumenöls.
Fig. 2: ein HPLC-Chromatogramm des Carotinoid-haltigen Öls nach 3 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl).
Fig. 3: ein HPLC-Chromatogramm des Carotinoid-haltigen Öls nach 5 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl). Fig. 4: ein HPLC-Chromatogramm des Carotinoid-haltigen Öls nach 5 Nachfütterungen mit glukosehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl). Fig. 5: ein HPLC-Chromatogramm des Maiskeimöls.
Fig. 6: ein HPLC-Chromatogramm des Carotinoid-haltigen Öls nach einer Nachfütterung mit stärkehaltigem Substrat (Maiskeimöl). Fig. 7: ein HPLC-Chromatogramm des Carotinoid-haltigen Öls nach 5 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Maiskeimöl).
Beispiele Beispiel 1 :
Die Halbstämme DSM 2387 und DSM 2388 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2*106 Sporen beimpft. Der (-)- Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm.
Ein Reaktor mit einem Nennvolumen von 5 L wird mit 3200 mL des Flüssigmediums (YPsS ohne Hefeextrakt) befüllt und für 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (360 mL) und Thiamin (12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C wird der Reaktor mit 200 mL der DSM 2388 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 13 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Anschließend werden 400 mL der DSM 2387 Kultur zur Induktion der Carotinoidbildung zugegeben. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der 36 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein. Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des pO2-Wert.es nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse (Fest-Flüssig- Trennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von ß-Carotin in der Biomasse beträgt 3,2 bis 6,18 %.
Beispiel 2:
Die Halbstämme DSM 2387 und DSM 2388 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Bierwürze: 10 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2*106 Sporen beimpft. Der (-)- Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm.
Ein Reaktor mit einem Nennvolumen von 5 L wird mit 3200 mL des Flüssigmediums (Bierwürze: 10 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt und für 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (14,292 g/360 mL) und Thiamin (0,0072 g/12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C wird der Reaktor mit 200 mL der DSM 2388 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 13 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Anschließend werden 400 mL der DSM 2387 Kultur zur Induktion der Carotinoidbildung zugegeben. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der 40 bis 56 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein.
Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des pO2-Wert.es nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse (Fest-Flüssig- Trennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von ß-Carotin in der Biomasse beträgt 1 ,8 bis 2,3 %. Beispiel 3:
Die Halbstämme ATCC 14271 und ATCC 14272 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2*106 Sporen beimpft. Der (-)- Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm. Zwei Reaktoren mit einem Nennvolumen von 5 L werden mit jeweils 3200 mL des Flüssigmediums (YPsS ohne Hefeextrakt) befüllt und für 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (360 mL) und Thiamin (12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach Einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C werden die Reaktoren jeweils mit 200 mL der ATCC 14271 Kultur und der ATCC 14272 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 14 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet.
In einem Reaktor mit einem Nennvolumen von 15 L werden 9 L YPsS-Medium vorgelegt, sterilisiert und mit 500 mL ATCC 14272 angeimpft. Der Pilz befindet sich nach 14 Stunden im exponentiellen Wachstum. Es werden 1 L des ATCC 14271 Kultur zugegeben um die Produktbildung zu induzieren. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der nächsten 50 bis 64 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein.
Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des pO2-Wert.es nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse (Fest-Flüssig- Trennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von ß-Carotin in der Biomasse beträgt 3,8 bis 4,5 %. Beispiel 4:
Die Halbstämme DSM 2387 und DSM 2388 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2*106 Sporen beimpft. Der (-)- Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm.
Ein Reaktor mit einem Nennvolumen von 5 L wird mit 3200 mL des Flüssigmediums (YPsS ohne Hefeextrakt) befüllt und für 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (360 mL) und Thiamin (12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C wird der Reaktor mit 200 mL der DSM 2388 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 13 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Anschließend werden 400 mL der DSM 2387 Kultur zur Induktion der Carotinoidbildung zugegeben. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der 36 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein. Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des p02-Wert.es nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
Nach 24h nach Zugabe des (+)-Stamms wird neues Fermentationssubstrat, der Fermentationsbrühe zugesetzt. Die Zugabe von Kultivierungsmedium wird in einem Abstand von 12 bis 48 Stunden mehrmals wiederholt und somit der Effekt verstärkt. Innerhalb 10 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orange- bis Rotfärbung des Sonnenblumenöls ein. Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse und der Ölphase (Fest- Flüssig-T rennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von ß-Carotin in der Biomasse beträgt 3 bis 6 %, der Gehalt an ß-Carotin in der Ölphase beträgt 500 bis 1500 mg L-1 bei 7 maliger Zugabe von neuem Fermentationssubstrat. Beispiel 5:
Die Halbstämme ATCC 14271 und ATCC 14272 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Maiskeimöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2*106 Sporen beimpft. Der (-)-Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm. Ein Reaktor mit einem Nennvolumen von 5 L wird mit 3200 mL des Flüssigmediums (YPsS ohne Hefeextrakt) befüllt und für 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (360 mL) und Thiamin (12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C wird der Reaktor mit 200 mL der DSM 2388 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 13 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Anschließend werden 400 mL der DSM 2387 Kultur zur Induktion der Carotinoidbildung zugegeben. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der 36 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein.
Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des p02-Wert.es nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
Nach 30h nach Zugabe des (+)-Stamms wird neues Fermentationssubstrat, der Fermentationsbrühe zugesetzt. Die Zugabe von Kultivierungsmedium wird in einem Abstand von 12 bis 48 Stunden mehrmals wiederholt und somit der Effekt verstärkt. Innerhalb 10 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orange- bis Rotfärbung des Sonnenblumenöls ein. Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse und der Ölphase (Fest- Flüssig-T rennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von ß-Carotin in der Biomasse beträgt 3 bis 6 %, der Gehalt an ß-Carotin in der Ölphase beträgt 400 bis 600 mg L-1 bei 4 maliger Zugabe von neuem Fermentationssubstrat. Beispiel 6:
Zur Bestimmung der Olzusammensetzung hinsichtlich der Carotinoide und Xanthophylle wurde eine HPLC Analyse (Tabelle 1 ) der Carotinoid-haltigen Öle aus den Beispielen 4 und 5 durchgeführt.
Tabelle 1 : HPLC Methode
t [min] A (Aceton) [%] B (Wasser) [%]
0,0 80 20
7,0 100 0
7,5 80 20
12 80 20
T = 30 °C; V|„j. = 10 μί; Säule: C18 (Agilent XDB); Detektion: λ = 450 nm; Flow: 1 mL/,
HPLC:
Pumpe: Merck Hitachi L-6200A
Autosampier: Merck Hitachi AS-4000A
UV-VIS-Detektor: Merck Hitachi L-4250
Interface: Agilent Interface 35900E
Software: OpenLAB
Um die Konzentration der Carotinoiden und Xanthophylle im erfindungsgemäßen Öl zu bestimmen, wurden Stammlösungen der vorhandenen Standards (Tabelle 2) hergestellt. Dazu wurde einen definierte Menge in Öl bzw. Aceton (Carl Roth GmbH + Co. KG) gelöst und in einer braunen Flasche gelagert. Vor der HPLC Analyse wurden die Stammlösungen filtriert, um eine partikelfreie Lösung zu gewährleisten. Anhand der ermittelten Kalibriergerade (Konzentration zu Fläche) konnte von den Peakfläche im carotinoidhaltigen Öl auf die Konzentration geschlussfolgert werden. Tabelle 2: Standards
Zur Analyse der carotinoidhaltigen Öle würde das Öl, jedoch auch Teile der Fermentationsbrühe und Biomasse, durch dekantieren (abgießen) abgetrennt. Durch zentrifugieren der Probe bei 3044 g für 5 min konnte eine klare Trennung zwischen der Biomasse, Fermentationsbrühe und Ölphase gezogen werden. Die Ölproben wurden abgezogen und für die HPLC Bestimmung filtriert (Porengröße 0,45 μηη; PTFE Spritzenfilter; Carl Roth GmbH + Co. KG), um eine partikelfreie Probe zu gewährleisten. Diese Herangehensweise ist insbesondere für den Labormaßstab geeignet, bei einer Umsetzung im Technikumsmaßstab sollten Separatoren und Dekanter, zur flüssig-flüssig Trennung, eingesetzt werden.
Beispielhafte Spektren der untersuchten Öle sind in den Figuren 1 bis 7 dargestellt. Dabei zeigen Fig. 1 ein HPLC-Chromatogramm des nativen Sonnenblumenöls; Fig. 2 ein HPLC- Chromatogramm eines Carotinoid-haltigen Öls entsprechend Beispiel 4 nach 3 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl); Fig. 3 ein HPLC- Chromatogramm eines Carotinoid-haltigen Öls entsprechend Beispiel 4 nach 5 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl); Fig. 4 ein HPLC- Chromatogramm eines Carotinoid-haltigen Öls entsprechend Beispiel 4 nach 5 Nachfütterungen mit glukosehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl); Fig. 5 ein HPLC- Chromatogramm des Maiskeimöls; Fig. 6 ein HPLC-Chromatogramm eines Carotinoidhaltigen Öls entsprechend Beispiel 5 nach einer Nachfütterung mit stärkehaltigem Substrat (Maiskeimöl); und Fig. 7 ein HPLC-Chromatogramm eines Carotinoid-haltigen Öls entsprechend Beispiel 5 nach 5 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Maiskeimöl).
Um eine exakte Quantifizierung der Carotinoide und Xanthophylle vornehmen zu können, wurde im ersten Schritt die Zusammensetzung der eingesetzten Öle bestimmt. Die ermittelten Peakflächen wurden von den Peakflächen der carotinoidhaltigen Ölproben subtrahiert. Die daraus signifikanten Peaks wurden als Lutein, ß-Cryptoxanthin, Lycopin sowie als a-, ß- und Y-Carotin detektiert (Tabelle 3).
Tabelle 3: Minima und Maxima des über HPLC ermittelten Gehaltes in mg L"1 bei verschiedenen Kultivierungsbedingungen.
Die Minima und Maxima Werte stellen dabei jeweils den niedrigsten und höchsten Wert aller carotinoidhaltigen Ölproben dar. Der ß-Carotin-Gehalt von 1295 mg L"1, wurde im Reaktormaßstab nach 8 maliger Nachfütterung erreicht. In den durchgeführten Schüttelkolbenversuchen lag das Maximum nach etwa 4 bis 5 Nachfütterungen bei rund 700 mg L"1.
Der Gehalt an Carotinoiden in der Ölphase war abhängig von der Verfahrensstrategie. Nach einer ein- bis zweimaligen Nachfütterung lag der Gehalt an bspw. ß-Carotin bei etwa 50 bis 100 mg L"1. Durch wiederholte Nachfütterungen mit Stärke-, Melasse- oder Glucose-haltigen Medium konnte der Gehalt an ß-Carotin im Öl gesteigert werden, bei einer vier- bis fünfmaligen Nachfütterung auf ca. 500 bis 800 mg L"1 und bei einer 7 bis 10maligen Nachfütterung auf über 1000 mg L"1. Der Abstand der Fütterung betrug bei den jetzigen Untersuchungen zwischen 20 und 50 Stunden jedoch ist ein kürzerer oder längerer Abstand ebenso möglich. Der Gehalt an Carotinoiden und Xanthophyllen ist vorwiegend von der Anzahl der Nachfütterungen, dem eingesetztem Öl und dem Substrat abhängig.
Den Hauptanteil an Carotinoiden nahm mit ca. 80 bis 97 % ß-Carotin ein, die Detektion der übrigen Carotinoide war abhängig vom eingesetzten Substrat, verwendeten Öl und Anzahl an Nachfütterungen. Vor allem die Anzahl an Nachfütterung erniedrigt den Anteil der übrigen Carotinoiden und erhöht somit den prozentuellen Anteil an ß-Carotin, wobei auch durch Synthesevorgänge eine Veränderung des Gehaltes im carotinoidhaltigen Öl erfolgen kann.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Herstellung eines Carotinoids ausgewählt aus ß-Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes
Blakeslea trispora und Gewinnung des Carotinoids aus der erhaltenen Biomasse und/oder aus der Ölphase der Fermentationsbrühe,
dadurch gekennzeichnet, dass
zunächst der (-)- und der (+) - Stamm getrennt bis zur vollen morphologischen Ausbildung vorkultiviert werden, dann der (-) - Stamm in den Bioreaktor inokuliert wird und während des exponentiellen Wachstums des (-)-Stammes der (+) - Stamm dem (-) - Stamm im Volumenverhältnis 1 : 5 bis 1 :100 zur Induktion der Carotinoidbildung zugesetzt wird und beide Stämme gemeinsam ohne pH-Regulierung und ohne Regulierung des Sauerstoffpartialdrucks bei 18 bis 24 °C fermentiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass beide Stämme nach der Induktion gemeinsam ohne pH-Regulierung und ohne Regulierung des Sauerstoffpartialdrucks bei 18 bis 24 °C bis zum Ende der Carotinoidbildung fermentiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
die getrennte Vorkultivierung der Stämme und die Kultivierung des (-) - Stammes im Bioreaktor jeweils bei 26-30°C vorgenommen werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der (+)-Stamm dem (-)-Stamm im Volumenverhältnis 1 :5 bis 1 :20, vorzugsweise 1 :5 bis 1 :10, zugesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die gemeinsame Fermentation des (+)- und (-)-Stammes zur Carotinoidbildung bei 22°C vorgenommen wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat für die gemeinsame Fermentation des (+)- und (-)-Stammes Kohlenhydrate und organische Stickstoffverbindungen enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als kohlenhydrathaltiger Anteil des Substrats Stärke, Melasse oder Bierwürze dient.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat für die gemeinsame Fermentation des (+)- und (-)-Stammes Lipide enthält, bevorzugt ein oder mehrere Öle, besonders bevorzugt ein oder mehrere native Öle, ganz besonders bevorzugt native Pflanzenöle, insbesondere beispielsweise Olivenöl, Rapsöl, Maiskeimöl und/oder Sonnenblumenöl.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall der Herstellung von Lycopin dem Substrat für die gemeinsame Fermentation des (+)- und (-)-Stammes ein Cyclaseinhibitor zugesetzt wird, vorzugsweise Imidazol und/oder ein Imidazolderivat.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass bei der gemeinsamen Fermentation des (-) - und (+) - Stammes Begasungsrate, Rührerdrehzahl und Temperatur konstant gehalten werden.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der (-)-Stamm DSM 2388 und der (+)- Stamm DSM 2387 oder der (-)-Stamm ATCC 14272 und der (+)-Stamm ATCC 14271 eingesetzt werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das die Carotinoid-haltige Ölphase von der restlichen Fermentationsbrühe abgetrennt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltene Carotinoid-haltige Ölphase filtriert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren kontinuierlich betrieben wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass dem Fermentationsansatz nach der Induktion erneut Substrat zugeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die erneute Zugabe von Substrat in einem Zeitraum von 20h bis 60h nach Induktion des Fermentationsansatzes durch Einbringen des (+)-Stamms erfolgt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass weitere Zugaben von Substrat erfolgen, wobei bevorzugt jede weitere Zugabe innerhalb eines Zeitraums von 24h bis 48h nach der vorhergehenden Zugabe von Substrat erfolgt.
18. Öl oder Olgemisch enthaltend natives Carotinoid, dadurch gekennzeichnet, dass das Öl oder Olgemisch nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 17 hergestellt ist.
19. Öl oder Olgemisch nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Öl oder Olgemisch eine Konzentration an nativem Carotinoid von 400mg/l oder mehr aufweist.
20. Öl oder Olgemisch nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Öl oder Olgemisch eine Konzentration von mindestens 400 mg/L beta-Carotin und mindestens 5 mg/L Lycopin aufweist.
21 . Öl oder Olgemisch nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Öl oder Olgemisch enthält:
> 0,25 mg/L Lutein,
> 2 mg/L beta-Cryptoxanthin,
> 2 mg/L Lycopin,
> 3 mg/L gamma-Carotin,
> 0,25 mg/L alpha-Carotin, und
> 30 mg/L beta-Carotin.
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