Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora
Die Erfindung betrifft ein einfaches und effektives Verfahren zur Herstellung von ß-Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora, das durch eine hohe Produktivität der B. trispora - Stämme gekennzeichnet ist. Die hohe Produktivität wird durch die erfindungsgemäße Verfahrensführung erreicht, die den morphologischen Zustand der filamentös wachsenden Halbstämme und den Wachstumszustand beim Vermischen der Stämme (dem sogenannten Mating) berücksichtigt.
Carotinoide sind natürliche Farbstoffe, die eine gelbe bis rötliche Färbung verursachen und häufig in Gemüsepflanzen vorkommen. Sie waren und sind aufgrund ihrer Eigenschaften als Antioxidantien und als Vorstufe für Vitamin A Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Auf Grund ihrer antioxidativen Wirkung sollen sie vielen Erkrankungen wie z. B.Krebs, Arteriosklerose, Rheuma oder Alzheimer vorbeugen. Lycopin (vorkommend z.B. in Tomaten) hat dabei das größte antioxidative Potenzial und gilt als wirksamster Schutz vor dem besonders reaktiven Singulett-Sauerstoff. Industriell werden die Carotinoide als Nahrungsmittelzusatzstoffe und farbgebende Mittel z. B. in Margarinen, Ölen, Saucen, Suppen und Fruchtsäften verwendet, aber auch als Futterzusatzstoffe eingesetzt.
Carotinoide sind chemisch und biotechnologisch herstellbar. Mittels biotechnologischer Herstellung sind Carotinoide komplexerer Struktur und auch die natürlich vorkommenden Konformationsisomere sehr einfach zugänglich. Der industrielle biotechnologische Prozess zur Herstellung von ß-Carotin basiert auf der Verwendung der Alge Dunaliella salina oder des Pilzes Blakeslea trispora, wobei bei Verwendung von B. trispora eine gemischte Fermentation der (+)- und (-)- Stämme durchgeführt wird, um eine maximale Ausbeute an ß- Carotin zu erhalten.
Im Stand der Technik ist die Herstellung von ß-Carotin durch Fermentation von B.trispora in zahlreichen Patentdokumenten beschrieben, beispielsweise in EP 1 367 131 A1 , WO 93/20183 A1 oder WO 02/010429 A1 . Alle beschriebenen Fermentationsverfahren basieren auf dem Prinzip, dass die (+) - und (-)- Halbstämme gemeinsam in den Bioreaktor inokuliert werden. WO 93/20183 A1 beschreibt die Produktion von ß-Carotin unter Verwendung ausgewählter mutierter B.trispora - Stämme unter spezifischen Fermentationsbedingungen.
WO 02/010429 A1 offenbart ein Fermentationsverfahren mit definierter pH-Wert - Regelung während der Fermentation und dem Zusatz von Sojalecithin zum Kulturmedium, um die Erzeugung von ß-Carotin in Bezug auf andere Carotinoide zu erhöhen. Die in EP 1 367 131 A1 beschriebenen Fermentationsbedingungen sehen sowohl eine programmierte Zugabe von Sauerstoff und/oder ß-lonon als auch eine Kontrolle der vegetativen Wachstumsphase der verwendeten Stämme vor. In US 5,422,247 A und WO 2005/030976 A2 werden weitere Fermentationsverfahren offenbart, die eine Regulation des pH-Wertes sowie ggf. des Sauerstoffpartialdrucks umfassen. In der Literatur wird auch die Anwendung chemischer Komponenten zur Produktsteigerung beschrieben. Solche Inhaltsstoffe können jedoch toxisch sein und deren nahrungs- oder arzneimittelrechtliche Zulassung kann in Frage stehen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein effektives Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden, insbesondere ß-Carotin und Lycopin, bereitzustellen, das gute Produktausbeuten liefert, ohne chemische Zusätze zu benötigen. Daneben soll es möglichst kostengünstig sowie in der Durchführung einfach und wenig aufwändig sein und eine Reduzierung der Fermentationsdauer erlauben. Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines Carotinoids ausgewählt aus ß-Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora und Gewinnung des Carotinoids aus der erhaltenen Biomasse oder aus der Ölphase der Fermentationsbrühe gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zunächst der (-)- und der (+) - Stamm getrennt bis zur vollen morphologischen Ausbildung vorkultiviert werden, dann der (-) - Stamm in den Bioreaktor inokuliert wird und während des exponentiellen Wachstums des (-)-Stammes der (+) - Stamm dem (-) - Stamm im Volumenverhältnis 1 : 5 bis 1 :100 (auch als Matingverhältnis bezeichnet) zur Induktion der Carotinoidbildung zugesetzt wird und beide Stämme gemeinsam ohne pH-Regulierung und ohne Regulierung des Sauerstoffpartialdrucks bei 18 bis 24 °C, ggf. bis zum Ende der Carotinoidbildung (Idiophase), fermentiert werden.
Die getrennte Vorkultivierung der Stämme erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung jeweils bei 26 - 30°C, besonders bevorzugt bei 28°C. Die getrennte Vorkultivierung des (-) - Stammes wird ca. 55 Stunden durchgeführt. Nach ca. 55 Stunden wird der (-) - Stamm dann in den Bioreaktor überführt. Die Fermentation des (-) - Stammes im Bioreaktor erfolgt ebenfalls vorzugsweise bei 26-30°C, besonders bevorzugt bei 28°C. Die
Kultivierung des (-) - Stammes im Bioreaktor wird für ca. 13 bis 14 Stunden durchgeführt (Trophophase).
Es ist ebenfalls besonders bevorzugt, dass die gemeinsame Fermentation des (+)- und (-)- Stammes (Idiophase) zur Carotinoidbildung bei 22°C vorgenommen wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Kultivierung des (-) Halbstammes im Reaktormaßstab bis zu einer vollständigen Hyphenausbildung durchgeführt (Trophophase) und erst dann der (+) Halbstamm als Induktionsmaßnahme während des exponentiellen Wachstums des (-)-Stammes zugegeben. Dadurch kann der Fermentationsprozess zeitlich verkürzt und Kosten eingespart werden. Zusätzlich findet zwischen Tropho - und Idiophase ein Temperaturshift von für das Wachstum optimalen 26-30°C auf 18 bis 24°C statt. Die niedrigere Temperatur inhibiert die Vitalität der Pilzhalbstämme nicht, fördert jedoch die Stabilität des Produktes während der Fermentation. Für die erfolgreiche Kultivierung mit guten Produktausbeuten ist im vorliegenden Verfahren keine Regelung von pH oder Sauerstoffgehalt erforderlich. Da keine Regelung des pH-Wertes stattfinden muss, ist kein Einsatz von Säuren oder Basen erforderlich und es werden Kosten gespart.
Begasungsrate, Drehzahl und Temperatur werden während der gesamten Produktbildung (Idiophase) konstant gehalten, was offensichtlich eine Adaptierung der Pilze an die vorherrschenden Bedingungen begünstigt. Das Einsetzten der Produktbildung ist gekennzeichnet durch gleichzeitige Abnahme des BTS (Biotrockensubstanz) - Gehalts und pH-Wertes. Das Abbruchkriterium der Carotinoid-Bildung kann durch eine deutliche Zunahme des pH-Wertes detektiert werden. D.h., dass nach einem pH-Wert-Anstieg um 0,5 bis 0,8 die Carotinoidbildung abgebrochen wird.
Die Rührgeschwindigkeit während der getrennten Vorkultivierung im Schüttelkolben der Stämme beträgt bevorzugt 130 bis 156 rpm. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, die Rührgeschwindigkeit während der Kultivierung des (-) - Stammes im Bioreaktor (Trophophase) auf 230 bis 350 rpm, besonders bevorzugt auf 244 bis 344 rpm, einzustellen.
Der Begasungsvolumenstrom während der Trophophase beträgt vorzugsweise ca. 1 vvm (Volumen Luft/ Volumen Fermenter/ Minute).
In der Idiophase, also in der Phase der Produktbildung auch bezeichnet als Phase der gemeinsamen Fermentation der (+)- und (-)-Stämme nach der Induktion, sind die
Bedingungen für die Rührgeschwindigkeit und den Begasungsvolumenstrom die gleichen wie in der Trophophase.
Das Matingverhältnis, angegeben als Volumenverhältnis (jeweils (+)-Stamm zu (-)-Stamm), beträgt in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung 1 :5 bis 1 :20, besonders bevorzugt 1 :5 bis 1 :10.
Als Substrat oder Fermentationssubstrat können in der Idiophase des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, also in der Phase der Produktbildung auch bezeichnet als Phase der gemeinsamen Fermentation der (+)- und (-)-Stämme nach der Induktion, die für B.trispora allgemein bekannten Substrate eingesetzt werden, insbesondere solche, die Kohlenhydrate und organische Stickstoffverbindungen gleichzeitig enthalten. Auch Lipide können dem Substrat zugesetzt werden. Als Kohlenhydrate werden im Substrat erfindungsgemäß bevorzugt Stärke oder Zucker verwendet. Es hat sich gezeigt, dass insbesondere mit zuckerhaltigen Substraten mit einem Zuckergehalt von 10 bis 50g/L gute Ausbeuten an Carotinoid erhalten werden. Zuckerhaltige Substrate weisen bevorzugt Melasse, Bierwürze oder Nebenprodukte der Stärkeindustrie oder Kombinationen davon auf. Bevorzugt enthält das Substrat für die Phase der gemeinsamen Fermentation der (+)- und (-)-Stämme nach der Induktion Lipide. Bei den Lipiden handelt es sich bevorzugt um ein oder mehrere Öle. Bei dem oder den Ölen handelt es sich bevorzugt um ein oder mehrere native Öle. Insbesondere können im Substrat Pflanzenöle, bevorzugt native Pflanzenöle, verwendet werden. Beispiele für geeignete Pflanzenöle sind Olivenöl, Rapsöl, Maiskeimöl und Sonnenblumenöl.
Soll mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Lycopin hergestellt werden, so wird bevorzugt dem Substrat bei der gemeinsamen Fermentation des (+)- und (-)-Stammes (Idiophase) einen Cyclaseinhibitor zuzusetzen, vorzugsweise Imidazol und/oder ein Imidazolderivat. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Herstellung von Lycopin auch ohne Zusatz von ggf. toxischen Chemikalien wie z.B. Cyclaseinhibitoren. Dabei wird Lycopin bevorzugt aus der Ölphase der Fermentationsbrühe gewonnen.
Im Verfahren der Erfindung können alle bekannten und in Kultursammlungen öffentlich zugänglichen B. trispora - Halbstämme eingesetzt werden, so z. B. der (-)-Stamm DSM 2388 und der (+)- Stamm DSM 2387 oder der (-)-Stamm ATCC 14272 und der (+)-Stamm ATCC 14271. In einer Ausführungsform der Erfindung können auch der Stamm BS 01 (-), der in der Internationalen Hinterlegungsstelle der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Deutschland unter der Nummer DSM
16755 hinterlegt ist, und der Stamm BS 01 (+), der ebendort unter der Nummer DSM 16754 hinterlegt ist, eingesetzt werden.
In einer ganz besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren durch die nachfolgenden Schritte gekennzeichnet:
(1 ) Der (-) Stamm wird ca. 55 h und der (+) Stamm ca. 68 h im Erlenmeyerkolben bei 28°C und 145 rpm getrennt vorkultiviert.
(2) Nach ca. 55 h wird der (-) Stamm in einen Reaktor überführt und für ca.13 - 14 h bei 28°C, einer Begasungsrate von ca. 1 vvm und einer Rührerdrehzahl von 244 bis 344 rpm fermentiert.
(3) Nach der Zugabe des (+) Stammes wird die Kultivierungstemperatur auf 22 °C eingestellt. Das Volumenverhältnis zwischen (+) und (-) Stamm beträgt 1 :9. Bevorzugt bleibt die Rührerdrehzahl bei 244 bis 344 rpm.
(4) Eine Regelung des pH-Wertes wird nicht vorgenommen. Die Aufarbeitung der Biomasse wird nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden durchgeführt, zum Beispiel durch Fest-Flüssig-T rennung bzw. Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass das vorliegende Verfahren eine hohe Produktivität von Blakeslea-Stämmen allein durch die Steuerung physikalischer Parameter gewährleistet, wodurch bei der nahrungs- bzw. arzneimittelrechtlichen Zulassung der erfindungsgemäß hergestellten Carotinoide keinerlei Probleme zu erwarten sind, da durch das erfindungsgemäße Verfahren keine toxischen oder andersartig gefährlichen Stoffe im Produkt hinterlassen werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Carotinoid- Ausbeuten in der Biotrockenmasse von mindestens 2 % erzielt, vorzugsweise von 4 bis 6%.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich das Carotinoid nicht nur aus der erhaltenen Biomasse gewinnen, sondern kann alternativ oder zusätzlich aus der Ölphase der Fermentationsbrühe gewonnen werden.
Es ist bekannt, dass in Blakeslea trispora die Carotinoid-Bildung vermehrt während der Idiophase abläuft, wobei zunächst im (-)-Stamm eine Lipid- oder Öleinlagerung erfolgt. In diese intrazelluläre Ölphase wird das Carotinoid, insbesondere das hydrophobe beta- Carotin, eingelagert. Nach Abschluss der Fermentation kann das Carotinoid aus der
erhaltenen Biomasse gewonnen werden in dem die Zellen aufgeschlossen werden und das Carotinoid oder Carotinoid-Öl-Gemisch aus der intrazellulären Ölphase extrahiert wird.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass bei Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens signifikante Mengen an Carotinoid von den Organismen während der Fermentation freigesetzt und in die Fermentationsbrühe als Carotinoid-Öl-Gemisch abgegeben werden. Damit erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Gewinnung von Carotinoid mittels Separation der Ölphase der Fermentationsbrühe. Es ist kein Zellaufschluss notwendig und das gewonnene Carotinoid kann ohne weitere Prozessschritte weiterverwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Carotinoids ausgewählt aus ß- Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora und Gewinnung des Carotinoids aus der Ölphase der Fermentationsbrühe gelöst, zeichnet sich dadurch aus, dass zunächst der (-)- und der (+) - Stamm getrennt bis zur vollen morphologischen Ausbildung vorkultiviert werden, dann der (-) - Stamm in den Bioreaktor inokuliert wird und während des exponentiellen Wachstums des (-)-Stammes der (+) - Stamm dem (-) - Stamm im Volumenverhältnis 1 : 5 bis 1 :100 (auch als Matingverhältnis bezeichnet) zur Induktion der Carotinoidbildung zugesetzt wird und beide Stämme gemeinsam ohne pH-Regulierung und ohne Regulierung des Sauerstoffpartialdrucks bei 18 bis 24 °C, ggf. in der Phase der Carotinoidbildung (Idiophase), fermentiert werden. Anschließend wird die Ölphase von der Fermentationsbrühe abgetrennt und ggf. filtriert, so dass makroskopische Bestandteile, also Bestandteile mit eine mittleren Durchmesser von 1 μηι oder mehr, aus der Ölphase entfernt werden. Damit wird ein Carotinoid-haltiges Öl oder Ölgemisch erhalten, welches als solches weiter verwendet werden kann oder welches einer weiteren Aufreinigung unterzogen werden kann um noch reinere Carotinoid-Fraktionen zu erhalten.
Dadurch, dass die Organismen während der Idiophase gebildetes Carotinoid als Carotinoid-Öl-Gemisch aus dem Zellinneren freisetzen, bildet sich im erfindungsgemäßen Verfahren eine Ölphase in der Fermentationsbrühe aus, aus der das Carotinoid gewonnen werden kann, unabhängig davon, ob das Fermentationssubstrat selbst ein Lipid oder Öl enthält oder nicht.
Bevorzugt kommen im erfindungsgemäßen Verfahren für die Gewinnung des Carotinoids aus der Fermentationsbrühe Substrate zum Einsatz, die ein oder mehrere Lipide enthalten. Bei den Lipiden handelt es sich bevorzugt um ein oder mehrere Öle. Bei dem oder den Ölen handelt es sich bevorzugt um ein oder mehrere native Öle. Insbesondere können im
Substrat Pflanzenöle, bevorzugt native Pflanzenöle, verwendet werden. Beispiele für geeignete Pflanzenöle sind Olivenöl, Rapsöl, Maiskeimöl und Sonnenblumenöl.
Im Gegensatz zu bisherigen Verfahren, bei denen das Carotinoid aus der erhaltenen Biomasse gewonnen wird und die damit in der Regel diskontinuierlich gestaltet sind, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Carotinoiden aus der Ölphase der Fermentationsbrühe auch eine kontinuierliche oder wenigstens mehrzyklische Verfahrensführung. Um eine mehrzyklische oder kontinuierliche Verfahrensführung zu gewährleisten, wird dem Fermentationsansatz nach der Induktion erneut Substrat zugeführt, so dass das Nährstoffangebot im Fermentationsansatz eine Weiterkultur des Ansatzes erlaubt. Die Zugabe von Fermentationssubstrat kann dabei beispielsweise einmalig, mehrmalig oder regelmäßig erfolgen.
Die Zugabe von Fermentationssubstrat erfolgt bevorzugt derart, dass im Fermentationsansatz die Konzentration der Kohlenstoffquelle nicht unter einen Schwellenwert sinkt, bei dem die Organismen absterben. Beispielsweise erfolgt die erste Zugabe von Fermentationssubstrat in einem Zeitraum von 20h bis 60h nach Induktion durch Einbringen des (+)-Stamms.
Die Zugabe von Fermentationssubstrat kann mehrmalig oder regelmäßig erfolgen. Beispielsweise erfolgt die erste Zugabe von Fermentationssubstrat in einem Zeitraum von 20h bis 60h nach Induktion durch Einbringen des (+)-Stamms, während jede weitere Zugabe innerhalb eines Zeitraums von 24h bis 48h nach der vorhergehenden Zugabe erfolgt. Die Zeitspanne zwischen jeder weiteren Zugabe kann auch kürzer oder länger sein. Entscheidend ist, dass der Substratgehalt nicht dauerhaft oder für einen längeren Zeitraum unter eine Konzentration absinkt, die zur Inhibition des Pilzes führt.
In einer besonderen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Carotinoids ausgewählt aus ß-Carotin oder Lycopin durch Submersfermentation mit Mischkulturen von (+) und (-) - Stämmen des Pilzes Blakeslea trispora und Gewinnung des Carotinoids aus der Ölphase der Fermentationsbrühe durch folgende Schritte gekennzeichnet: (1 ) Der (-)-Stamm wird ca. 55 h und der (+)-Stamm ca. 68 h im Erlenmeyerkolben bei 28°C und 145 rpm getrennt vorkultiviert.
(2) Nach ca. 55 h wird der (-)-Stamm in einen Reaktor überführt und für ca.13 - 14 h bei 28°C, einer Begasungsrate von ca. 1 vvm und einer Rührerdrehzahl von 244 bis 344 rpm fermentiert.
(3) Nach Induktion der Carotinoidproduktion durch die Zugabe des (+)-Stammes wird die Kultivierungstemperatur auf 22 °C eingestellt. Das Volumenverhältnis zwischen (+) und (-) - Stamm beträgt 1 :9.
(4) Eine Regelung des pH-Wertes wird nicht vorgenommen.
(5) Nach 20h - 60h nach Zugabe des (+)-Stamms wird neues Fermentationssubstrat, optional mit Öl, der Fermentationsbrühe zugesetzt.
(6) Optional erfolgen weitere Zugaben von Fermentationssubstrat zur Fermentationsbrühe, wobei jede weitere Zugabe innerhalb eines Zeitraums von 24h bis 48h nach der vorhergehenden Zugabe von Fermentationszugabe erfolgt. In der Zwischenzeit wird die Fermentation bevorzugt unter unveränderten Bedingungen fortgeführt.
(7) Abtrennung der (Carotinoid-haltigen) Ölphase von der restlichen Fermentationsbrühe und ggf. Filtration des gewonnenen Carotinoid-haltigen Öls oder Ölgemisches.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden z.B. durch veränderte Umgebungsbedingungen, wie beispielsweise die erneute oder zusätzliche Zufuhr von Nährstoffen durch Zugabe von Fermentationssubstrat, die sekundären Stoffwechselprodukte, wie Carotinoide, in mikrobiellem Öl von den Pilzen ausgeschieden. Dieser Vorgang ähnelt einer Entgiftung und sichert den Fortbestand des Pilzes. Durch das Ausschleusen des intrazellulären Carotinoid- Öl-Gemisches in die Fermentationsbrühe kann das Carotinoid direkt als Ölphase der Fermentationsbrühe gewonnen werden und eine kosten- und zeitaufwändige Abtrennung der Carotinoide aus der Biomasse ist nicht mehr notwendig. Folglich muss keine mechanische, thermische, enzymatische oder chemische Behandlung der Biomasse mehr erfolgen, die Carotinoide können als native Carotinoide direkt als Ölphase der Fermentationsbrühe entnommen werden. Durch die hier vorgeschlagene Verfahrensführung lässt sich die Gewinnung von Carotinoiden als kontinuierliches Verfahren betreiben, bei dem sich höhere Ausbeuten einstellen als bei der konventionellen Verfahrensführung, insbesondere wenn die Carotinoide nicht nur aus der Ölphase der Fermentationsbrühe gewonnen werden sondern zusätzlich auch noch aus der Biomasse.
Durch mehrmalige Nachfütterung mit Fermentationssubstrat kann im erfindungsgemäßen Verfahren der Gehalt an Carotinoiden und Xanthophyllen im Ölprodukt erhöht werden. Um eine kontinuierliche oder zyklische Verfahrensführung mit möglichst vielen Nachfütterungszyklen zu erlauben, kann im erfindungsgemäßen Verfahren auch die
einmalige oder mehrmalige zusätzliche Zugabe von (+) bzw. (-) Halbstamm zur Fermentationsbrühe erfolgen und dementsprechend das Öl weiter mit Carotinoiden angereichert werden.
Es hat sich gezeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere bei der Gewinnung der Carotinoide aus der Ölphase der Fermentationsbrühe, Öle oder Ölgemische herstellen lassen, die einen Gehalt an Carotinoid, insbesondere an nativem Carotinoid, von 400 mg/L oder mehr, bevorzugt von 1 .500 mg/l oder mehr, insbesondere von 400 bis 1 .500 mg/L und mehr aufweisen.
Es hat sich gezeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere bei der Gewinnung der Carotinoide aus der Ölphase der Fermentationsbrühe, Öle oder Ölgemische herstellen lassen, die einen Gehalt an Lycopin, insbesondere an nativem Lycopin, von 2 mg/L oder mehr, bevorzugt von 2 bis 20 mg/L und mehr aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt also die Produktion von nativem Carotinoid, welches nicht durch Prozesse während des Zellaufschlusses beeinträchtigt worden ist. Damit bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf natives Carotinoid bzw. auf ein Öl oder Öl-Gemisch enthaltend ein natives Carotinoid, wobei das native Carotinoid nach einem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar oder hergestellt ist. Das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch weist bevorzugt eine Konzentration an nativem Carotinoid von 400 mg/l oder mehr auf. Das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch ist bevorzugt dadurch charakterisiert, dass die Konzentration an beta-Carotin 20 bis 1500 mg/L, besonders bevorzugt 30 bis 1300 mg/L , ganz besonders bevorzugt von 300 bis 1300 mg/L beträgt. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch weist bevorzugt eine Konzentration an Lycopin auf von mehr als 2 mg/L, besonders bevorzugt von 2 bis 20 mg/L, ganz besonders bevorzugt von 2 bis 15 mg/L.
In einer besonderen Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch mindestens 30 mg/L beta Carotin sowie mindestens 2 mg/L Lycopin auf, bevorzugt mindestens 400 mg/L beta-Carotin und mindestens 5 mg/L Lycopin.
Das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch kann beispielsweise:
> 0,25 mg/L Lutein,
> 2 mg/L beta-Cryptoxanthin,
> 2 mg/L Lycopin,
> 3 mg/L gamma-Carotin,
> 0,25 mg/L alpha-Carotin, und
> 30 mg/L beta-Carotin
enthalten.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch:
0,25 bis 1 mg/L Lutein,
2 bis 25 mg/L beta-Cryptoxanthin,
2 bis 15 mg/L Lycopin,
3 bis 35 mg/L gamma-Carotin,
0,2 bis 25 mg/L alpha-Carotin, und
30 bis 1300 mg/L beta-Carotin
enthalten. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Carotinoid-haltige Öl oder Ölgemisch beispielsweise:
0,28 bis 0,71 mg/L Lutein,
2,05 bis 24,9 mg/L beta-Cryptoxanthin,
2,09 bis 14,35 mg/L Lycopin,
3,01 bis 31 ,8 mg/L gamma-Carotin,
0,29 bis 24,9 mg/L alpha-Carotin, und
30,9 bis 1295 mg/L beta-Carotin
enthalten. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken.
Figuren:
Die Figuren 1 bis 7 zeigen:
Fig. 1 : ein HPLC-Chromatogramm des nativen Sonnenblumenöls.
Fig. 2: ein HPLC-Chromatogramm des Carotinoid-haltigen Öls nach 3 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl).
Fig. 3: ein HPLC-Chromatogramm des Carotinoid-haltigen Öls nach 5 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl).
Fig. 4: ein HPLC-Chromatogramm des Carotinoid-haltigen Öls nach 5 Nachfütterungen mit glukosehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl). Fig. 5: ein HPLC-Chromatogramm des Maiskeimöls.
Fig. 6: ein HPLC-Chromatogramm des Carotinoid-haltigen Öls nach einer Nachfütterung mit stärkehaltigem Substrat (Maiskeimöl). Fig. 7: ein HPLC-Chromatogramm des Carotinoid-haltigen Öls nach 5 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Maiskeimöl).
Beispiele Beispiel 1 :
Die Halbstämme DSM 2387 und DSM 2388 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2*106 Sporen beimpft. Der (-)- Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm.
Ein Reaktor mit einem Nennvolumen von 5 L wird mit 3200 mL des Flüssigmediums (YPsS ohne Hefeextrakt) befüllt und für 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (360 mL) und Thiamin (12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C wird der Reaktor mit 200 mL der DSM 2388 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 13 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Anschließend werden 400 mL der DSM 2387 Kultur zur Induktion der Carotinoidbildung zugegeben. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der 36 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein.
Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des pO2-Wert.es nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse (Fest-Flüssig- Trennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von ß-Carotin in der Biomasse beträgt 3,2 bis 6,18 %.
Beispiel 2:
Die Halbstämme DSM 2387 und DSM 2388 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Bierwürze: 10 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2*106 Sporen beimpft. Der (-)- Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm.
Ein Reaktor mit einem Nennvolumen von 5 L wird mit 3200 mL des Flüssigmediums (Bierwürze: 10 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt und für 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (14,292 g/360 mL) und Thiamin (0,0072 g/12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C wird der Reaktor mit 200 mL der DSM 2388 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 13 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Anschließend werden 400 mL der DSM 2387 Kultur zur Induktion der Carotinoidbildung zugegeben. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der 40 bis 56 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein.
Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des pO2-Wert.es nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse (Fest-Flüssig- Trennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von ß-Carotin in der Biomasse beträgt 1 ,8 bis 2,3 %.
Beispiel 3:
Die Halbstämme ATCC 14271 und ATCC 14272 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2*106 Sporen beimpft. Der (-)- Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm. Zwei Reaktoren mit einem Nennvolumen von 5 L werden mit jeweils 3200 mL des Flüssigmediums (YPsS ohne Hefeextrakt) befüllt und für 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (360 mL) und Thiamin (12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach Einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C werden die Reaktoren jeweils mit 200 mL der ATCC 14271 Kultur und der ATCC 14272 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 14 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet.
In einem Reaktor mit einem Nennvolumen von 15 L werden 9 L YPsS-Medium vorgelegt, sterilisiert und mit 500 mL ATCC 14272 angeimpft. Der Pilz befindet sich nach 14 Stunden im exponentiellen Wachstum. Es werden 1 L des ATCC 14271 Kultur zugegeben um die Produktbildung zu induzieren. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der nächsten 50 bis 64 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein.
Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des pO2-Wert.es nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse (Fest-Flüssig- Trennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von ß-Carotin in der Biomasse beträgt 3,8 bis 4,5 %.
Beispiel 4:
Die Halbstämme DSM 2387 und DSM 2388 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Sonnenblumenöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2*106 Sporen beimpft. Der (-)- Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm.
Ein Reaktor mit einem Nennvolumen von 5 L wird mit 3200 mL des Flüssigmediums (YPsS ohne Hefeextrakt) befüllt und für 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (360 mL) und Thiamin (12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C wird der Reaktor mit 200 mL der DSM 2388 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 13 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Anschließend werden 400 mL der DSM 2387 Kultur zur Induktion der Carotinoidbildung zugegeben. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der 36 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein. Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des p02-Wert.es nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
Nach 24h nach Zugabe des (+)-Stamms wird neues Fermentationssubstrat, der Fermentationsbrühe zugesetzt. Die Zugabe von Kultivierungsmedium wird in einem Abstand von 12 bis 48 Stunden mehrmals wiederholt und somit der Effekt verstärkt. Innerhalb 10 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orange- bis Rotfärbung des Sonnenblumenöls ein. Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse und der Ölphase (Fest- Flüssig-T rennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von ß-Carotin in der Biomasse beträgt 3 bis 6 %, der Gehalt an ß-Carotin in der Ölphase beträgt 500 bis 1500 mg L-1 bei 7 maliger Zugabe von neuem Fermentationssubstrat.
Beispiel 5:
Die Halbstämme ATCC 14271 und ATCC 14272 werden getrennt auf YPsS-Festmedium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 20 g/L) kultiviert. Die Sporenbildung setzt innerhalb von 3 Tagen ein. Ab dem 3. Kultivierungstag können die Sporen mit einer 0,2 % Span20 Lösung steril abgespült werden.
Ein 300 mL Kolben wird mit 200 mL YPsS-Medium (Stärke: 15 g/L, Hefeextrakt: 4 g/L, Magnesiumsulfat: 0,45 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat: 1 ,0 g/L, Agar: 2 g/L, Thiamin: 0,002 g/L, Maiskeimöl: 30 g/L) befüllt. Das bei 121 °C für 20 Minuten dampfsterilisierte Medium wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit jeweils 2*106 Sporen beimpft. Der (-)-Stamm wird für 55 Stunden und der (+)-Stamm für 68 Stunden bei 28°C getrennt voneinander vorkultiviert. Die Schüttelfrequenz beträgt 145 rpm. Ein Reaktor mit einem Nennvolumen von 5 L wird mit 3200 mL des Flüssigmediums (YPsS ohne Hefeextrakt) befüllt und für 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums wird das sterile Hefeextrakt (360 mL) und Thiamin (12 mL) hinzugegeben. Die Einwaage der einzelnen Komponenten des Flüssigmediums erfolgte auf 3572 mL. Nach einstellen der Kultivierungstemperatur von 28°C wird der Reaktor mit 200 mL der DSM 2388 Kultur angeimpft. Es findet eine Kultivierung für 13 Stunden statt, sodass der Pilz sich innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Anschließend werden 400 mL der DSM 2387 Kultur zur Induktion der Carotinoidbildung zugegeben. Für die Idiophase wird die Temperatur auf 22°C gesenkt. Innerhalb der 36 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orangefärbung der Biomasse ein.
Für die Kultivierung ist weder eine Steuerung des pH-Wertes noch des p02-Wert.es nötig. Begast wird durchgehend mit 1 vvm bei einer Rührerdrehzahl von 300 rpm.
Nach 30h nach Zugabe des (+)-Stamms wird neues Fermentationssubstrat, der Fermentationsbrühe zugesetzt. Die Zugabe von Kultivierungsmedium wird in einem Abstand von 12 bis 48 Stunden mehrmals wiederholt und somit der Effekt verstärkt. Innerhalb 10 bis 48 Stunden setzt eine intensive Orange- bis Rotfärbung des Sonnenblumenöls ein. Nach Abschluss der Kultivierung erfolgt die Aufarbeitung der Biomasse und der Ölphase (Fest- Flüssig-T rennung, Extraktion des Feststoffes gegebenenfalls nach schonender Trocknung des Biomassepellets). Der Ertrag von ß-Carotin in der Biomasse beträgt 3 bis 6 %, der Gehalt an ß-Carotin in der Ölphase beträgt 400 bis 600 mg L-1 bei 4 maliger Zugabe von neuem Fermentationssubstrat.
Beispiel 6:
Zur Bestimmung der Olzusammensetzung hinsichtlich der Carotinoide und Xanthophylle wurde eine HPLC Analyse (Tabelle 1 ) der Carotinoid-haltigen Öle aus den Beispielen 4 und 5 durchgeführt.
Tabelle 1 : HPLC Methode
t [min] A (Aceton) [%] B (Wasser) [%]
0,0 80 20
7,0 100 0
7,5 80 20
12 80 20
T = 30 °C; V|„j. = 10 μί; Säule: C18 (Agilent XDB); Detektion: λ = 450 nm; Flow: 1 mL/,
HPLC:
Pumpe: Merck Hitachi L-6200A
Autosampier: Merck Hitachi AS-4000A
UV-VIS-Detektor: Merck Hitachi L-4250
Interface: Agilent Interface 35900E
Software: OpenLAB
Um die Konzentration der Carotinoiden und Xanthophylle im erfindungsgemäßen Öl zu bestimmen, wurden Stammlösungen der vorhandenen Standards (Tabelle 2) hergestellt. Dazu wurde einen definierte Menge in Öl bzw. Aceton (Carl Roth GmbH + Co. KG) gelöst und in einer braunen Flasche gelagert. Vor der HPLC Analyse wurden die Stammlösungen filtriert, um eine partikelfreie Lösung zu gewährleisten. Anhand der ermittelten Kalibriergerade (Konzentration zu Fläche) konnte von den Peakfläche im carotinoidhaltigen Öl auf die Konzentration geschlussfolgert werden.
Tabelle 2: Standards
Zur Analyse der carotinoidhaltigen Öle würde das Öl, jedoch auch Teile der Fermentationsbrühe und Biomasse, durch dekantieren (abgießen) abgetrennt. Durch zentrifugieren der Probe bei 3044 g für 5 min konnte eine klare Trennung zwischen der Biomasse, Fermentationsbrühe und Ölphase gezogen werden. Die Ölproben wurden abgezogen und für die HPLC Bestimmung filtriert (Porengröße 0,45 μηη; PTFE Spritzenfilter; Carl Roth GmbH + Co. KG), um eine partikelfreie Probe zu gewährleisten. Diese Herangehensweise ist insbesondere für den Labormaßstab geeignet, bei einer Umsetzung im Technikumsmaßstab sollten Separatoren und Dekanter, zur flüssig-flüssig Trennung, eingesetzt werden.
Beispielhafte Spektren der untersuchten Öle sind in den Figuren 1 bis 7 dargestellt. Dabei zeigen Fig. 1 ein HPLC-Chromatogramm des nativen Sonnenblumenöls; Fig. 2 ein HPLC- Chromatogramm eines Carotinoid-haltigen Öls entsprechend Beispiel 4 nach 3 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl); Fig. 3 ein HPLC- Chromatogramm eines Carotinoid-haltigen Öls entsprechend Beispiel 4 nach 5 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl); Fig. 4 ein HPLC- Chromatogramm eines Carotinoid-haltigen Öls entsprechend Beispiel 4 nach 5 Nachfütterungen mit glukosehaltigem Substrat (Sonnenblumenöl); Fig. 5 ein HPLC- Chromatogramm des Maiskeimöls; Fig. 6 ein HPLC-Chromatogramm eines Carotinoidhaltigen Öls entsprechend Beispiel 5 nach einer Nachfütterung mit stärkehaltigem Substrat (Maiskeimöl); und Fig. 7 ein HPLC-Chromatogramm eines Carotinoid-haltigen Öls entsprechend Beispiel 5 nach 5 Nachfütterungen mit stärkehaltigem Substrat (Maiskeimöl).
Um eine exakte Quantifizierung der Carotinoide und Xanthophylle vornehmen zu können, wurde im ersten Schritt die Zusammensetzung der eingesetzten Öle bestimmt. Die ermittelten Peakflächen wurden von den Peakflächen der carotinoidhaltigen Ölproben
subtrahiert. Die daraus signifikanten Peaks wurden als Lutein, ß-Cryptoxanthin, Lycopin sowie als a-, ß- und Y-Carotin detektiert (Tabelle 3).
Tabelle 3: Minima und Maxima des über HPLC ermittelten Gehaltes in mg L"1 bei verschiedenen Kultivierungsbedingungen.
Die Minima und Maxima Werte stellen dabei jeweils den niedrigsten und höchsten Wert aller carotinoidhaltigen Ölproben dar. Der ß-Carotin-Gehalt von 1295 mg L"1, wurde im Reaktormaßstab nach 8 maliger Nachfütterung erreicht. In den durchgeführten Schüttelkolbenversuchen lag das Maximum nach etwa 4 bis 5 Nachfütterungen bei rund 700 mg L"1.
Der Gehalt an Carotinoiden in der Ölphase war abhängig von der Verfahrensstrategie. Nach einer ein- bis zweimaligen Nachfütterung lag der Gehalt an bspw. ß-Carotin bei etwa 50 bis 100 mg L"1. Durch wiederholte Nachfütterungen mit Stärke-, Melasse- oder Glucose-haltigen Medium konnte der Gehalt an ß-Carotin im Öl gesteigert werden, bei einer vier- bis fünfmaligen Nachfütterung auf ca. 500 bis 800 mg L"1 und bei einer 7 bis 10maligen Nachfütterung auf über 1000 mg L"1. Der Abstand der Fütterung betrug bei den jetzigen Untersuchungen zwischen 20 und 50 Stunden jedoch ist ein kürzerer oder längerer Abstand ebenso möglich. Der Gehalt an Carotinoiden und Xanthophyllen ist vorwiegend von der Anzahl der Nachfütterungen, dem eingesetztem Öl und dem Substrat abhängig.
Den Hauptanteil an Carotinoiden nahm mit ca. 80 bis 97 % ß-Carotin ein, die Detektion der übrigen Carotinoide war abhängig vom eingesetzten Substrat, verwendeten Öl und Anzahl an Nachfütterungen. Vor allem die Anzahl an Nachfütterung erniedrigt den Anteil der übrigen Carotinoiden und erhöht somit den prozentuellen Anteil an ß-Carotin, wobei auch durch Synthesevorgänge eine Veränderung des Gehaltes im carotinoidhaltigen Öl erfolgen kann.