DE1196153B

DE1196153B - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von beta-Carotin

Info

Publication number: DE1196153B
Application number: DER35331A
Authority: DE
Inventors: Leon Ninet; Jacques Renaut; Robert Charles Francoi Tissier
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1962-06-05
Filing date: 1963-06-04
Publication date: 1965-07-08
Also published as: NL293669A; FR1344264A

Description

Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von ß-Carotin Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von fl-Carotin durch Fermentation.
Es ist bekannt, ß-Carotin durch Submers-Fermentation von Mikroorganismen des Genus Choanephora oder Blakeslea zu erzeugen. In verschiedentlichen Veröffentlichungen sind die Bedingungen beschrieben, die die Produktion von fl-Carotin begünstigen. B a r n e t t und Mitarb. (Science, 1956, Band 123, S. 141) haben gezeigt, daß die Produktion von ß-Carotin durch gleichzeitige Züchtung entgegengesetzten Formen ein und derselben Species verbessert wird. Diese Untersuchung wurde dann auf die Züchtung von entgegengesetzten Formen verschiedener Speeies ausgedehnt (C. H e s s e 1 t i n e, Mycologia, 1957, B. 49, S. 449). Die Züchtungsmedien wurden ebenfalls untersucht, und es hat sich geziegt, daß die Zugabe von vollständigem oder hydrolysiertem Getreide, pflanzlichen Ölen oberflächenaktiven Mitteln, Antioxidantien und Verdickungsmitteln die Ausbeute an ß-Carotin erhöhen. (R. A n d e r s o n und Mitarb., J. Agr. Food. Chem., 1958, B. 6, S. 543; A. C i e g 1 e r und Mitarb., Appl. Mierob., 1959, B. 7, S. 94 und 98.) Schließlich haben M a c k i n n e y und Mitarb. (J. Am. Chem. Soe., 1952, B. 74, S. 3456) gezeigt, daß die Zugabe von ß-Jonon zu einer ruhenden Kultur eines Phycomyces die Bildung von ß-Carotin auf Kosten anderer Carotinoidfarbstoffe stark erhöht. A n d e r s o n und Mitarb. haben die gleicheWirkung bei bewegter Kultur von Blakeslea und Choanephora loc. cit.) festgestellt. Dieser Vorläufer kann gemäß einem älteren Vorschlag durch andere Produkte, wie beispielsweise 2,2,6-Trimethylcyclohexanon, ersetzt werden.
Es wurde nun gefunden, daß die Zugabe gewisser anderer sauerstoffhaltiger organischer Produkte zu den Züchtungsmedien eine starke Erhöhung des Ausmaßes der Produktion an fl-Carotin bewirkt.
Ausgehend von einem Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von fl-Carotin durch aerobe Züchtung der + - und --Formen von Blakeslea trispora in Nährmedien und bei Bedingungen die hierfür üblich sind, setzt man daher dem Nährmedium erfindungsgemäß mindestens ein Amid der allgemeinen Formel RCONRIR, I in der R ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit höchstens 6 Kohlenstoffatomen, einen Arylrest oder einen Arylrest bedeutet und Ri und R, die gleich oder voneinander verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen darstellen, ein Imid der allgemeinen Formel ein Lactam der allgemeinen Formel in denen R, einen zweiwertigen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit höchstens 8 Kohlenstoffatomen und X ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder einen Alkyl-oder Hydroxyalkylrest mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder ein Dialkylsulfoxyd IV mit Alkylresten von maximal 4 Kohlenstoffatomen bzw. Gemische dieser Verbindung zu. Diese organischen Substanzen können dem Züchtungsmedium in Mengen von 0, 1 bis 10 g je Liter zu Beginn oder im Verlauf der Fermentation einmal oder mehrere Male. zugesetzt werden. Vorzugsweise verwendet man je Liter zwischen 0,5 und 2 g der Verbindungen 1 oder IV oder 2 bis 6 g der Verbindung II oder 0,5 bis 6 g der Verbindung III oder von einem Gemisch dieser verschiedenen Verbindungen und nimmt die Zugabe zu Beginn der Züchtung vor. Gleichgültig, welche Menge zugegeben wird und zu welchem Zeitpunkt die Zugabe dieser Produkte erfolgt, ist es zweckmäßig, die Züchtung 6 bis 10 Tage nach der Beimpfung fortzusetzen, um die maximale Produktion an ß-Carotin zu erzielen. Das Züchtungsmedium kann variieren, doch enthält es im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, Antioxydantien, oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel und gegebenenfalls Vorläufer.
Als assimflierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Dextrine, Stärke; tierische oder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl, Sojaöl oder Baumwollsamenöl, verwenden. Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig: Sie können chemische Verbindungen oder komplexe Substanzen sein, die den Stickstoff hauptsächlich in proteidischer Form enthalten, wie beispielsweise Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Sojamehle, Arachismehle, Hefeextrakte, Distillers Solubles und Maisquellwasser.
Unter den zugesetzten Mineralstoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate.
Unter den Wachstumsfaktoren ist der am häufigsten verwendete das Vitamin B, oder Thiamin. Unter den Antioxydantien kann man das N,N'-Diphenylp-phenylendiamin, daß 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy- 1,2-dihydrochinolin, die Ascorbinsäure oder die Sorbinsäure nennen. Die oberflächenaktiven Mittel sind vorzugsweise von nichtionischer Art, wie beispielsweise Sorbitderivate von Fettsäuren oder Produkte auf der Basis von Kondensaten des Äthylenoxyds. Unter den Verdichtungsmitteln sind die am häufigsten verwendeten Stärke, Carboxymethyleellulose, Agar.
Als Vorläufer kann man eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe ß-Jonon, 2,2,6-Trimethylcyclohexanon und Derivate dieses Ketons, wie beispielsweise das Semicarbazon, Oxim oder Hydrazon, verwenden.
Das so hergestellte Züchtungsmedium wird anschließend mit einer Kultur von Plus- und Minus-Formen von Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457) beimpft.
Die Erhöhung des Ausmaßes der Produktion an ß-Carotin in Gegenwart einer erfindungsgemäßen Verbindung ist je nach den Arbeitsbedingungen mehr oder weniger ausgeprägt. Sie tritt jedoch auf, gleichgültig, ob man Antioxydantien oder Vorläufer zu den Züchtungsmedien zusetzt, oder nicht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1 Man stellt ein Züchtungsmedium A wie folgt her: 500 cm" Wasser, das 75 g Distillers Solubles enthält, werden 15 Minuten zum Sieden gebracht. Nach Ab- kühlen setzt man die folgenden Substanzen zu: Maisstärke .......................... 50 g Sojaöl .................... *»*'**«»** 30 cm,' Baumwollsamenöl ........ » ........... 30 cms Tween 80 ...... ................... 5 cm3 Hefeextrakt . # ........................ 1 g Monokaliumphosphat ................. 0,5 g Thiamin-hydrochlorid ................. 0,01 g Man füllt mit destilliertem Wasser auf 1000 CM3 auf. Das Gemisch wird mit Natronlauge auf pH 6,0 eingestellt, in 300-CM3-Erlenmeyerkolben in einer Menge von 50 CM3 je Kolben verteilt und dann 20 Minuten bei NO'C sterilisiert. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man unter sterilen Bedingungen in jeden Kolben 0,5 cm3 Leuchtpetroleum ein.
In der gleichen Weise stellt man ein Züchtungsmedium B her, wobei man zu den verschiedenen Bestandteilen des Mediums A 4 g Dimethylformamid (DMF) je Liter zufügt.
Jeder Kolben wird anschließend mit 5 cms einer gerührten, bzw. geschüttelten Kultur, die zwei Formen + und - des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und NRRL 2457) enthält und 24 Stunden gealtert wurde, beimpft. Die Kolben werden anschließend in einem Raum bei 27'C auf einen Drehtisch gebracht, der mit 220 Drehungen je Minute rotiert wird. Nach 2tägiger Inkubation werden in jeden Züchtungskolben unter sterilen Bedingungen 0,5 cm3 Leuchtpetroleum eingebracht. Die Züchtungen werden unter gleichen Bedingungen noch 8 Tage, fortgesetzt. Nach dieser Zeitspanne ist die Produktion an fl-Carotin in allen Kolben maximal.
Die Bestimmung des ß-Carotins wird wie folgt durchgeführt: Das Mycel wird durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann über Nacht im Vakuum bei 35'C getrocknet. Das Trockenmycel wird dann mit Hexan extrahiert. Man trennt das ß-Carotin von den anderen vorhandenen Carotinoiden durch eine Chromatographie des Extrakts an Aluminiumoxyd ab. Die das fl-Carotin enthaltenden Elutionsfraktionen werden vereinigt, und der Gehalt wird spektrophotometrisch gegen eine reine ß-Carotinprobe bestimmt.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten: MediumA: 425 mg ß-Carotin je Liter, MediumB(mitDMF): 520mgß-CarotinjeLiter.
Beispiel 2 Die MedienA und B werden wie im Beispiell hergestellt und beimpft. Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiell beschriebenen Bedingungen setzt man steril jedem Kolben 50 mg 2,2,6-Trimethylcyclohexanon (TMCH), gelöst in 0,5 cm3 Leuchtpetroleum, zu. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.
Aus der wie im Beispiel 1 durchgeführten Bestimmung des ß-Carotins ergibt sich, daß die folgenden Produktionen erhalten wurden: Medium A + (TMCH): 455 mg/l, Medium B (mit DMF) + (TMCH): 550 mg/l. Beispiel 3 Die Medien A und B werden wie im Beispiel 1 hergestellt und beimpft. Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man steril in jeden Kolben 50 mg ß-Jonon, gelöst in 0,5 cm' Leuchtpetroleum, ein. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.
Die wie im Beispiel 1 durchgeführte Bestimmung des fl-Carotins ergibt, daß die erhaltenen Produktionen die folgenden sind: Medium A + ß-Jonon: 770 mg/l, Medium B (mit DMF) + fl-Jonon: 885 mg/l. Beispiel 4 Man stellt ein Medium C in der gleichen Weise, wie es im Beispiel 1 für das Medium A beschrieben ist, her, ersetzt jedoch nach Sterilisation und Abkühlen die Zugabe des Leuchtpetroleums durch eine Zugabe von 0,5 cm3 einer sterilen 1 O/Oigen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum in jeden Kolben.
Ferner stellt man ein Medium Dp in der gleichen Weise, wie es im Beispiel 1 für das Medium A beschrieben ist, her, setzt jedoch mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums 2 g Dimethylformamid je Liter zu. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man in jeden Kolben 0,5 cm3 einer 10/,igen sterilen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.
Die Medien C und D2 werden anschließend beimpft, und die Kulturen werden wie im Beispiel 1 beschrieben entwickelt. Nach 2tägiger Inkubation bringt man in jeden Züchtungskolben unter sterilen Bedingungen 0,5 cm3 Leuchtpetroleum ein. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.
Die erhaltenen Produktionen an ß-Carotin sind die folgenden -.
Medium C: 440 mg/l, Medium D, (mit DMF): 735 mg/l. Beispiel 5 Die MedienC und D, werden wie im Beispie14 beschrieben hergestellt und beimpft.
Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man in jeden Züchtungskolben unter sterilen Bedingungen 50 mg 2,2,6-Trimethylcyclohexanon(TMCM,gelöstin 0,5CM3 Leuchtpetroleum, ein. Die Züchtungen werden noch 8 Tage fortgesetzt.
Die erzielten Produktionen an ß-Carotin sind die folgenden: Medium C -#- (TMCH): 650 mg/l, Medium D, (mit DMF) + (TMCH): 840 mg/l. Beispiel 6 Man stellt das Medium C und das Medium D, wie im Beispiel 4 beschrieben her. Ferner stellt man ein Medium D, und ein Medium D4 in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 für das Medium A beschrieben her, wobei man jedoch mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums 1 bzw. 4 g Dimethylformamid je Liter zugibt. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man injeden Kolben noch 0,5cm3 einer sterilen l"/,igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.
Diese Medien C, D, D, und D, werden wie im Beispiel 1 beschrieben beimpft. Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man in jeden Züchtungskolben steril 50 mg fl-Jonon, gelöst in 0,5 cm3 Leuchtpetroleum, ein. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.
Die erhaltenen Produktionen an fl-Carotin sind die folgenden: Medium C + fl-Jonon: 1045 mg/ l, Medium D, (mit DMF) + fl-Jonon: 1220 mg/l, Medium D, (mit DMF) + fl-Jonon: 1275 mg/l, Medium D, (mit DMF) + fl-Jonon: 1265 mg/l. Beispiel 7 Man stellt ein Medium E in der gleichen Weise, wie es im Beispiel 1 für das Medium A beschrieben ist, her, wobei man jedoch mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums 100 mg N,N'-Diphenyl-p-phenylendiamin (DPPD) je Liter zusetzt. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man steril in jeden Kolben wie bei der Herstellung des Mediums A 0,5 cm3 Leuchtpetroleum ein.
In der gleichen Weise, wie es im Beispiel 1 für das Medium A beschrieben ist, stellt man ein Medium F her, wobei man jedoch mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums 100 mg (DPPD) je Liter und 4 g Dimethylformamid je Liter zugibt. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man steril in jeden Kolben wie bei der Herstellung des Mediums A 0,5 cm,' Leuchtpetroleum ein.
Die Medien E und F werden wie im Beispiel 1 beschrieben beimpft. Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man in jeden Züchtungskolben 0,5 cm3 steriles Leuchtpetroleum ein.
Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt. Die erhaltenen Produktionen an fl-Carotin sind die folgenden-.
Medium E: 435 mg/l, Medium F (mit DMF): 525 mg/l. Beispiel 8 Die MedienE und F werden wie im-Beispie17 beschrieben hergestellt und beimpft.
Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man steril in jeden Züchtungskolben 50 mg 2,2,6-Trimethylcyclohexanon, gelöst in 0,5 cm3 Leuchtpetroleum, ein. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.
Die erhaltenen Produktionen an ß-Carotin sind die folgenden: Medium E + (TMCH): 585 mgll, Medium F (mit DMF) + (TMCH): 735 mg/l. Beispiel 9 Die Medien E und F werden wie im Beispiel 7 beschrieben hergestellt und beimpft.
Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man in jedenjKol-C ben steril 50 mg fl-Jonon, gelöst in 0,5 cm3 Leuchtpetroleum, ein. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.
Die erhaltenen Produktionen an P-Carotin sind die folgenden: Medium E + ß-Jonon: 785 mg/l, Medium F (mit DMF) + ß-Jonon: 1085 mg/l. Beispiel 10 Man stellt ein MediumC wie im Beispie14 beschrieben her. Ferner stellt man ein Medium G in der gleichen Weise, wie es im Beispiel 1 für das Medium A beschrieben ist, her, wobei man jedoch mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums 4 g Dimethylsulfoxyd (DMS) je Liter zugibt. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man steril in jeden Kolben wie bei der Herstellung des Mediums C 0,5 cms einer 10/jgen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.
Die Medien C und G werden wie im Beispiel 1 beschrieben beimpft. Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebnen Bedingungen bringt man in jeden Züchtungskolben steril 50 mg fl-Jonon, gelöst in 0,5 cm3 Leuchtpetroleum, ein. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.
Die erhaltenen Produktionen an ß-Carotin sind die folgenden: Medium C + ß-Jonon: 960 mg/l, Medium G (mit DMS) + fl-Jonon: 1040 mg/l. Beispiel 11 Man stellt ein MediumC wie im Beispie14 beschrieben her. Ferner stellt man ein Medium H, wie es im Beispiel 1 für das Medium A beschrieben ist, her, wobei man jedoch mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums 2 g Acetamid je Liter zugibt. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man steril in jeden Kolben wie bei der Herstellung des Mediums C 0,5 cm3 einer 10/,igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-Dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.
Die Medien C und H werden wie im Beispiel 1 beschrieben beimpft. Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man in jeden Züchtungskolben steril 50 mg fl-Jonon, gelöst in 0,5 cms Leuchtpetroleum, ein. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt. Die erhaltenen Produktionen an P-Carotin sind die folgenden: Medium C + ß-Jonon: 1040.mg/l, Medium H (Acetamid) + ß-Jonon: 1245 mg/ 1. Beispiel 12 Man stellt ein MediumC wie im Beispie14 beschrieben her. Ferner stellt man die Medien K, L und N in der gleichen Weise, wie es im Beispiel 1 für das Medium A beschrieben ist, her, wobei man jedoch mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums in das Medium K 2 g Dimethylacetamid je Liter, in das Medium L 2 g Propionamid je Liter und in das Medium N 2 g Butyramid je Liter zugibt. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man steril injeden Kolben wie bei der Herstellung des Mediums C 0,5 em3 einer 101,1.igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.
Die Medien C, K, L und N werden wie im Beispiel 1 beschrieben beimpft. Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen werden in jeden Züchtungskolben steril 50 mg ß-Jonon, gelöst in 0,5 em3 Leuchtpetroleum, eingebracht. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.
Die erhaltenen Produktionen an fl-Carotin sind die folgenden: Medium C + fl-Jonon: 1195 mg/l, Medium K (Dimethylacetamid) + ß-Jonon: 1260 mg/l, Medium L (Propionamid) + ß-Jonon: 1295 mg/l, Medium N (Butyramid) + ß-Jonon: 1370 mg/l. Beispiel 13 In ein Fermentationsgefäß von 301 bringt man 1125 g Distillers Solubles und 111 Wasser ein.
Das Gemisch wird 10 Minuten unter Rühren bei 95'C erhitzt. Nach Abkühlen stellt man den pH-Wert mit 60 cm3 10 n-Natronlauge auf 6,25 ein und vervollständigt das Medium mit den folgenden Materialien: Maisstärke ......................... 750 g Sojaöl ............................. 450 cm3 Baumwollsamenöl .................. 450 cm3 »Tween 80« ......................... 75 cm3 Hefeextrakt ...................... 15 g Monokaliumphosphat ............... 7,5 g Mangansulfat-Monohydrat ........... 1,5 g Lösung von Thiamin-hydrochlorid mit 0,3 g/1 ....................... 250 cm3 Das Volumen wird mit Wasser auf 15,5 1 eingestellt. Der pH-Wert des Gemischs liegt bei 6,20. Das Medium wird während 50 Minuten bei 122'C durch Einleiten von Dampf sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt der pH-Wert 5,7. Das Volumen beträgt 15,5 1.
Man setzt dann steril 1,5 g 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in 150 cm3 Leuchtpetroleum zu. Das Fermentationsgefäß wird dann mit 1,51 einer Impfkultur aus einem Fermentationsgefäß, die die zwei Formen des Stammes Blaskeslea trispora (NRRL 2456 und NRRL 2457) enthält und 49 Stunden gealtert ist, beimpft. Die Kultur wird bei 27'C unter Bewegung mit einer Turbine mit 400 UpM und Belüftung mit einer Menge von 1,2 m3/h entwickelt. Nach 40stündiger Entwicklung setzt man steril 15 em3 fl-Jonon, gelöst in 150 cm3 Leuchtpetroleum, zu. Nach dieser Zugabe wird die Züchtung unter den gleichen Bedingungen bezüglich Belüftung, Bewegung und Temperatur noch 5 Tage fortgesetzt.
Die wie im Beispiel bestimmte Produktion an ß-Carotin beträgt 1385 mg/l.
In einem anderen Fermentationsgefäß von 30 1 stellt man in der gleichen Weise das oben beschriebene Medium her.
Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man unter sterilen Bedingungen 1,5 g 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in 150 CM3 Leuchtpetroleum und 30 CM3 Dimethylformamid ein. Das Medium wird dann unter den oben beschriebenen Bedingungen mit der gleichen Impfkultur beimpft. Nach 40stündiger Entwicklung setzt man steril 15 cm3 ß-Jonon in 150 CM3 Leuchtpetroleum zu. Nach dieser Zugabe wird die Züchtung unter den gleichen Bedingungen bezüglich Belüftung, Bewegung und Temperatur noch 5 Tage fortgesetzt.
Die erhaltene Produktion an ß-Carotin beträgt 1620 mg/l. Beispiel 14 Man stellt ein Züchtungsmedium C wie im Beispiel 4 beschrieben her.
Auf die gleiche Weise stellt man ein Züchtungsmedium P her, wobei man mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums C 4 g Succinimid je Liter zugibt. Nach Sterilisieren und Abkühlen bringt man in jeden Kolben 0,5 cm3 einer sterilen 10/,igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.
Jeder Kolben der Medien C und P wird unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Züchtung bringt man steril in jeden Kolben 0,5 cm3 Leuchtpetroleum ein. Die Züchtungen werden unter den gleichen Bedingungen noch 8 Tage fortgesetzt. Nach dieser Zeitspanne ist die Produktion an fl-Carotin in allen Kolben maximal. Die erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden: Medium C: 490 mg ß-Carotin je Liter, Medium P (mit Succinimid): 580 mg ß-Carotin je Liter. Beispiel 15 Die Medien C und P werden wie in den Be " ispielen 4 und 14 beschrieben hergestellt und beimpft.
Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man steril in jeden Kolben 50 mg 2,2,6-Trimethylcyclohexanon (TMCM, gelöst in 0,5 cm3 Leuchtpetroleum, ein. Die Züchtungen werden unter den gleichen Bedingungen noch 8 Tage fortgesetzt. Die erhaltenen Produktionen an ß-Carotin sind dann die folgenden: Medium C + TMCH: 560 mg/1 Medium P (mit Succinimid) + TMCH: 690 mg/l: Beispiel 16 Die Medien C und P werden wie in den Beispielen 4 und 14 beschrieben hergestellt und beimpft.
Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man injeden Kolben steril 70 mg des Semicarbazons von TMCH in Form von Kristallen und 0,5 cm3 Leuchtpetroleum ein. Die Züchtungen werden unter den gleichen Bedingungen noch 8 Tage fortgesetzt.
Die Produktionen an ß-Carotin sind die folgenden: Medium C + Semicarbazon des TMCH: 540 mg/l, Medium P (mit Succinimid) +Semicarbazon des TMCH: 640 mg/l. Beispiel 17 Die Medien C und P werden wie in den Beispielen 4 und 14 angegeben hergestellt und beimpft.
Nach 2tägiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man steril in jeden Kolben 50 mg ß-Jonon, gelöst in 0,5 cm3 Leuchtpetroleum, ein. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt. Die erhaltenen Produktionen an ß-Carotin sind die f olgenden: Medium C + ß-Jonon: 880 mg/l, Medium P (mit Succinimid) +ß-Jonon: 1590 mg/l. Beispiel 18 In 300-cm3-Erlenmeyer-Kolben stellt man die Medien C, D, und P wie in den Beispielen 4 und 14 beschrieben her. Ferner stellt man das Medium Q her, wobei man mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums C je Liter 2 g Dimethylformamid und 3 g Succinimid zugibt. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man in jeden Kolben 0,5 CM3 einer sterilen 1 0/,igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.
In die wie im Beispiel 1 beimpften und inkubierten Kolben der vier Medien bringt man nach 2tägiger Züchtung steril 50 mg ß-Jonon, gelöst in 0,5 cm3 Leuchtpetroleum, ein. Die Züchtungen werden unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.
Die erhaltenen Produktionen an ß-Carotin sind die folgenden: Medium C + ß-Jonon: 1125 mg/l, Medium D, (mit DMF) + ß-Jonon: 1360 mg/l, Medium Q (mit DMF und Succinimid) + fl-Jonon: 1635 mg/l, Medium P (mit Succinimid) +ß-Jonon: 1700 mg/l. Beispiel 19 In ein Fermentationsgefäß von 301 bringt man 1500 g Distillers Solubles und 111 Wasser ein.
Das Gemisch wird unter Bewegung während 10 Minuten bei 95'C erhitzt. Nach Abkühlen stellt man den pH-Wert mit 70 cm3 10 n-Natronlauge auf 6,45 ein und ergänzt das Medium mit den folgenden Materialien: Stärke »Fox head« ................ 750 g Sojaöl ........................ 450 CM3 Baumwollsamenöl ................ 450 CM3 »Tween 80« ...................... 75 cm3 Hefeextrakt ........................ 15 g Monokaliumphosphat ............. 7,5 g 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin ....................... 1, 5 cm3 Mangansulfat-Monohydrat ......... 1,5 g Lösung von Thiamin-hydrochlorid mit 0,3 g/1 ..................... 250 cm3 Das Volumen wird mit Wasser auf 151 eingestellt. Der pH-Wert des Gemisches beträgt 6,40. Das Medium wird während 50 Minuten bei 122'C durch Einführen von Dampf sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt der pH-Wert 5,85 und das Volumen 14,2 1.
Man setzt dann steril 150 CM3 Leuchtpetroleum und 30 cm3 Dirnethylformamid zu. Das Fermentationsgefäß wird anschließend mit zwei 49 Stunden gealterten Kulturen aus einem Fermentationsgefäß in einer Menge von 750 cm3 einer Impfkultur der Form + (Blakeslea trispora NRRL 2456) und 750 cm3 einer Impfkultur der Form - (Blakeslea trispora NRRL 2457) beimpft. Die Kultur wird unter Bewegen mittels einer Turbine mit 400 üpM und Belüftung mit einer Menge von 1,2 m3/h bei 270 C entwickelt. Nach 48stündiger Entwicklung setzt man steril 15 cm3 fl-Jonon, gelöst in 150 cms Leuchtpetroleum, zu. Nach dieser Zugabe wird die Züchtung unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur, Bewegung und Belüftung noch 5 Tage fortgesetzt.
Die Produktion an P-Carotin beträgt 965 mg/l.
In einem anderen Fermentationsgefäß von 301 stellt man in der gleichen Weise das oben beschriebene Medium her. Nach Sterilisieren und Abkühlen setzt man steril 150 cm8 Leuchtpetroleum und 60 g Succinimid, gelöst in 500 cm8 Wasser, zu. Das Medium wird dann unter den oben beschriebenen Bedingungen mit den zwei gleichen Impfkultuten beimpft. Nach 48-stündiger Entwicklung setzt man steril 15 cm3 ß-Jonon, gelöst in 150 Cin3 Leuchtpetroleuffi, zu. Nach dieser Zugabe wird die Züchtung unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur, Bewegung und Belüftung noch 5 Tage fortgesetzt.
Die erhaltene Produktion an ß-Carotin beträgt 1225 rüg/l.
Beispiel 20 Man stellt ein ZüchtungsrhediumC wie im Beispie14 beschrieben her. In der gleichen Weise stellt man ferner ein Züchtungsmedium R her, wobei man mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums C 2 g n-Bromsuccinimid je Liter zugibt, Nach Aufteilen in 300 cm3-Erlenmeyer-Kolben in einer Menge von 50 cm3 je Kolben, Sterilisieren und Abkühlen, bringt man in jeden Kolben wie bei der Herstellung des Mediums C 0,5 em3 einer 10/()igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.
Die Züchtunggkölben der Mediefi C und R werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Inkubation bringt man Ateril In jeden Kolben 50 mg ß#Jonon, gelöst in 0,5 cm" Leuchtpetroleume ein. Nach dieser Zugabe werden die ZÜChtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt. Die wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführte Bestimmung des ß-Carotins ergibt die folgenden Produktionen: Medium C (mit ß-Jonon): 975 ing/l, Medium R (mit N-Bromsuccinimid und ß-Jonon): 1180 nig/l. J5elSPIC1 .41 Man stellt ein Züchtungsmedium S auf folgende Weise her-. 500 eins Wasser, die 90 g Distillers Solubles enthalten, werden während 15 Minuten zum Sieden erhitzt. Nach Abkühlen gibt than die folgenden Bestandtelle zu: Maisstärke .......................... 60 g Sojaöl ........ i ............ e ........ 35 CM3 BatlinwoRgaftienöl .... i.# ............ 35 cms *Tween SO« .......................... 5 cm3 Hefeextrakt ......................... 1 g Mofiokalitimphüsphät ................ 0,5 g Mangansulfat-Monohydrat ............ 0,01 g Thiamin-hydrochlorid ................ 0i01 g Man bringt das Volumen mit destilliertem Wasser auf 1000 cm3. Das Gemisch wird mit Natronlauge auf pH 6,2 eingestellt, in 300-crnl#-Erlenmeyer-Kolben in einer Menge von 50 em3 je Kolben verteilt und dann während 20 Minuten bei 120'C sterilisiert. Nach Sterilisieren und Abkühlen bringt man in jeden Kolben 0,5 cm3 einer sterilen 1 0/,igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.
Das Züchtun.-.smedium T wird auf die gleiche Weise wie das Medium S hergestellt. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man in jeden Kolben 0,5 cm3 einer sterilen 10/,igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum und 0,5 cm3 einer sterilen 100/,igen Lösung von N-Hydroxymethylsuccinimid in destilliertem Wasser ein.
Die Kolben der Kulturen der Medien S und T werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Inkubation setzt man steril jedem Kolben 50 mg ß-Jonon, gelöst in 0,5 CM3 Leuchtpetroleum, zu. Nach dieser Zugabe werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt. Die erhaltenen Produktionen an ß-Carotin sind die folgenden: Medium S (mit fl-Jonon): 1135 mg/l, Medium T (mit N-Hydroxymethylsuccinimid und ß-Jonon): 1485 mg/l. Beispiel 22 Man stellt ein Züchtungsmedium V wie folgt her: 500 cm3 Wasser, die 60 g Distillers Solubles enthalten, werden während 15 Minuten zum Sieden erhitzt. Nach Abkühlen setzt man die folgenden Bestandteile zu: Stärke .......... 4 ............. ..... 60 g Sojaöl ..... ; ........................ 35 CM3 Baumwollsamenöl ................... 35 cm3 *Tween 80« ...................... 5 cm3 Hefeextrakt ......................... 1 g Monokaliumphosphat ................ 0,5 g Mangansulfat-Monöhydrat ..... i .... i. OJ g Thiamin-hydrochlorid .. ; .......... i.. 0,01 g Man stellt das Volumen mit destilliertem Wasser auf 1000 CM3 ein. Das Gemisch wird mit Natronlauge auf pH 6,3 eingestellt, in 300-cm3-Erlenmeyer-Kolben in einer Menge von 50 em3 je Kolben aufgeteilt und dann 20 Minuten bei 120'C sterilisiert. Nach Sterilisation und Abkühlen setzt man jedem Kolben 0,5 etn3 einer sterilen 1%igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum zu.
Auf die gleiche Weise stellt man ein Züchtungsmedium W her, wobei man mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums V 1 g Caprolactam je Liter zugibt. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man in jeden Kolben 0,5 CM3 einer sterilen'l O/Oigen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinölin in Leuchtpetroleum ein.
In jeden der unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpften und inkubierten Kolben der Medien V und W bringt man nach 2tägiger Züchtung steril 50 mg fl-Jonon, gelöst in O#5 cms Leuchtpetröleurn, ein. Die Züchtungen werden unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.
Die wie im Beispiel 1 bestimmten Produktionen an ß-Carotin sind die folgenden: Medium V + ß-Jonon: 1465 mg/l, Medium W (mit Caprolactam) +ß-Jonon: 1730 mg/l. lielsplei zi In 300-cm3-Erlenmeyer-Kolben stellt man das Züchtungsmedium V wie im Beispiel 22 beschrieben her. Ferner stellt man auf die gleiche Weise die Züchtungsmedien X, und X, her, indem man mit der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen des Mediums V 1 bzw. 3 g cc-Pyrrolidon je Liter zugibt. Nach der Verteilung in 300-cm3-Erlenmeyer-Kolben in einer Menge von 50 cm3 je Kolben, Sterilisation und Abkühlen bringt man in jeden Kolben noch 0,5 cm3 einer sterilen 10/jgen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.
In jeden unter den Bedingungen vom Beispiel 1 bimpften und inkubierten Kolben der Medien V, X, und X3 bringt man nach 2tägiger Züchtung steril 50 mg ß-Jonon, gelöst in 0,5 cm3 Leuchtpetroleum, ein. Die Züchtungen werden unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung 8 Tage fortgesetzt.
Die erhaltenen Produktionen an fl-Carotin sind die folgendenden - Medium V + ß-Jonon: 1465 mg/l, Medium X, (mit 1 g/1 oc-Pyrrolidon) + fl-Jonon. 1730 mg/l, Medium X3 (mit 3 g/1 x-Pyrrolidon) -#- ß-Jonon - 1970 mg/l.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur mikrobiolo,:,ischen Herstellung von P-Carotin durch aerobe Züchtung der + und - Formen von Blakeslea trispora in Nährmedien und bei Bedingungen, die hierfür üblich sind, d a - durch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium mindestens ein Amid der allgemeinen Formel RCONR,R, wobei R ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit höchstens 6 Kohlenstoffatomen, einen Arylrest oder einen Aralkylrest bedeutet und R, und R2, die gleich oder voneinander verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, ein Imid der allgemeinen Formel wobei R, einen zweiwertigen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit höchstens 8 Kohlenstoffatomen und X einWasserstoff- oder Halogenatom oder einen Alkyl- oder Hydroxylkylrest mit maximal 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, ein Lactam der allgemeinen Formel wobei R3 die oben angegebene Bedeutung besitzt, oder ein Dialkylsulfoxyd mit Alkylresten von maximal 4 Kohlenstoffatomenbzw. Gemische dieser Verbindungen zusetzt.