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Verfahren zur Herstellung einer neuen anabolen und östrogenen Substanz
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen und wertvollen anabolen und östrogenen Substanz.
Infolge des beträchtlichen Aufwandes, der mit der Aufzucht fleischerzeugender Tiere verbunden ist, sind verschiedene Hilfsmittel entwickelt worden, in dem Bestreben, die Wachstumsrate solcher Tiere zu steigern. Viele dieser Hilfsmittel, darunter gewisse anabole Östrogene, wie Diäthylstilbestrol, haben jedoch im praktischen Gebrauch Nachteile, wie Giftigkeit, unerwünschte Nebeneffekte und Schwierigkeit bei der Verabreichung.
Es wurde nun eine neue anabole und östrogene Substanz gefunden, die nicht nur die Steigerung der Wachstumsrate bei fleischerzeugenden Tieren unterstützt, sondern auch sicher und wirtschaftlich ohne Auftreten von Nebeneffekten verabreicht werden kann.
Die neue anabole Zusammensetzung, die eine Gewichtszunahme bei fleischliefernden Tieren erbringt, lässt sich leicht durch Züchtung eines neuen Stammes von Gibberella zeae (Gordon) auf einem geeigneten Nährmedium gewinnen. Eine lebende Kultur dieses Stammes ist bei der Northern Utilization Research and Development Division der United States Department of Agriculture unter der Nummer NRRL-2830 hinterlegt. Der Organismus wurde aus Mais isoliert, der auf einer Farm nahe Delphi, Indlana, gewachsen war, und die Kultur wurde durch mehrere Isolierungen einzelner Kolonien gereinigt.
Die bekannte Species ist von Wollenweber und Reinking in dem Buch"Die Fusarien", Berlin [1953], Herausgeber Paul Parey auf S. 83 beschrieben. Dort wird der Organismus als Gibberella saubineti bezeichnet. Später in Ann. Mycol., Band 34, S. 256-260, findet sich der von Petch geänderte Name Gibberella zeae. Eine spätere Beschreibung findet sich noch von W. L. Gordon in Canadian Journal of Botany, Band 30 [1952], S. 209-251.
Im folgenden wird die Morphologie des neuen Stammes beschrieben, der auf Czapek's Dextroseagar von der in Tabelle I angegebenen Zusammensetzung gezüchtet wurde :
Tabelle I
EMI1.1
<tb>
<tb> Czapek's <SEP> Dextrose-Agar <SEP> g/l
<tb> Natriumnitrat <SEP> 2,0
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 0,5
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0,5
<tb> Ferrosulfat <SEP> 0, <SEP> 01
<tb> Saures <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> Dextrose <SEP> 50,0
<tb> Agar <SEP> 15, <SEP> 0
<tb>
EMI1.2
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wollartiges Luftmycel, und das Koloniezentrum zeigt eine dunkelgelbe Farbe, die gegen die Kolonieperipherie in rosa oder weiss übergeht. Unter einer Beleuchtungsstärke von 450 Fuss Kerzen Fluoreszenzlicht ist die Kolonie dunkler gelb bei geringerem LuftmyceL Reserve der Kultur ist tiefrot infolge der Erzeugung von wasserunlöslichem Pigment.
Die Erzeugung von Macroconidia ist selten in der Dunkelheit und übermässig im Licht. Die Macroconidia werden in schleimigen Massen erzeugt, deren Länge im Bereich von 7, 6 bt bis 44 u schwankt, und
EMI2.1
Perithecia werden in der Kultur unter normalen Lichtbedingungen in drei Wochen spärlich erzeugt.
Die Perithecia sind schwarz und elliptisch mit einem Durchmesser von 220 mal 170 p. Asci innerhalb der
Perithecia sind gestreckt (50-60 jan lang und 6, 6 li breit). Ascosporen sind gerade oder schwach gebogen mit 3 Septen und glasartig (hyalin). Die Ascosporen sind 19-22 lui lang und 2 tel breit und an den Enden zugespitzt.
Die hier erwähnte neue. anabole Substanz wird durch Bebrüten der Sporen des neuen Organismus in einem geeigneten Impfmedium und darauf Überführen des vegetativen Impfmediums in ein Gärmedium, das eines der üblichen Getreide als Kohlehydratquelle enthält, hergestellt.
Bei der Durchführung der Fermentation nach der Erfindung kann man als Kohlehydratquelle jedes übliche Getreide, wie Mais, Hafer, Weizen, Gerste u. dgl., verwenden. Vorzugsweise benutzt man Mais.
Die Temperatur des Gärmediums kann von etwa 22 bis 320C variiert werden, aber vorzugsweise verwendet man Temperaturen von etwa 25 bis etwa 280C. Der pH-Wert des Gärmediums kann in einem weiten Bereich von etwa 3,5 bis etwa 8,5 gehalten werden. Für Höchstausbeuten ist jedoch ein Ausgangs-PHWert von etwa 5,0 bis etwa 5,6 und ein End-PH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 7,6 zu bevorzugen. Obgleich flüssige Gärmedien in befriedigender Weise benutzt werden können, verwendet man vorzugsweise ein mit Wasser gedämpftes, aber im wesentlichen festes Medium. Vorzugsweise wird die Gärung auch in Abwesenheit von Licht durchgeführt.
. Im allgemeinen kann unter den obigen Bedingungen eine geeignete Ausbeute an anaboler Substanz innerhalb eines Zeitraums im Bereich von. 6 bis 20 Tagen erhalten werden. Je nach der Lebenskraft des Organismus kann diese Periode jedoch etwas kürzer oder länger sein.
Die so hergestellte anabole Substanz kann dann Tieren nach irgendeiner Methode, wie orale oder parenterale Verabreichung, gegeben werden. Beispielsweise kann nach der Gärperiode das Gärmedium mit gewöhnlichem Futter verschnitten und dieses unmittelbar den Tieren verfüttert werden. Die anabolische Substanz kÅann auch durch jedes geeignete Verfahren gewonnen und kann in einem geeigneten Injektions-Suspensions-Medium, wie Erdnussöl, suspendiert und parenteral injiziert werden.
Um die anabole Substanz zu gewinnen, wird vorzugsweise das Gärmedium zunächst mit Äthanol, zweckmässig von etwa 95% Konzentration, extrahiert und dann der Extrakt mit der anabolischen Substanz konzentriert. Das Konzentrat wird dann im Chloroform aufgelöst und wieder mit einer Natriumcarbonatlösung, vorzugsweise von einer Konzentration von etwa 5% eingestellt auf PH etwa 9-12, vorzugsweise aber etwa auf PH 11,2, extrahiert. Der PH-Wert des Natriumcarbonatextraktes wird dann mit Salzsäure auf etwa 6,0 bis etwa 6,5 eingestellt, um das feste unreine anabole Material auszufällen. Um möglichst viel Niederschlag zu erhalten, wird eine pH-Einstellung auf etwa 6,2 bevorzugt.
Dieser unreine Niederschlag wird dann mit Äther extrahiert und anschliessend getrocknet, um ein trockenes festes Material zu erhalten, das zur Verfütterung an Vieh geeignet ist. Wenn ein Material höherer Reinheit erwünscht ist, kann die gemäss obigen Angaben erhaltene trockene feste anabole Substanz einer mehrfachen Gegenstromverteilung unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittelsystems unterzogen, und der aktive Bestandteil gemäss der Craig-Methode abgetrennt werden, die in Techniques of Organic Chemistry, Band 3, Kapitel 4, zweite Ausgabe, herausgegeben von A. Weissberger, Interscience Publications Incorporated beschrieben ist.
Diese Methode besteht im wesentlichen darin, dass man in einer jeweils vorgeschriebenen Anzahl von Rohren, von denen das erste eine vorgeschriebene Menge des zu trennenden und zu identifizierenden Materials enthält, eine festgelegte und gleiche Menge eines Lösungsmittelsystems als untere Phase einbringt, dann in das erste Rohr eine Lösungsmittelmenge als obere Phase gleich der Menge der unteren Phase im ersten Rohr zugibt, die beiden Phasen im ersten Rohr innig durchmischt und sie sich wieder trennen lässt, dann die obere Phase in ein zweites Rohr überführt, worauf eine identische Menge frischen Lösungsmittelsystems der oberen Phase wieder dem ersten Rohr zugegeben wird. Diese Behandlung wird für eine gewünschte Anzahl von Rohren fortgesetzt.
Das Rohr, das die grösste Menge aktives Material enthält, wird ermittelt und dann eine physikalische Konstante erhalten, die als Arbeitskoeffizient
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bezeichnet wird. Der Arbeitskoeffizient wird unter Benutzung der folgenden Formel berechnet :
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Hierin ist K der Arbeitskoeffizient, N die Gesamtzahl von Überführungsrohren, die im System benutzt werden, und n ist die Zahl des Rohres, in welchem sich das aktivste Material befindet.
Bei Anwendung der Gegenstromverteilungsmethode zur Reinigung der neuen anabolen Substanz nach der Erfindung kann man jedes geeignete Lösungsmittelsystem gebrauchen, das einen einfachen Verteilungskoeffizienten von nicht weniger als 0, 2 und nicht mehr als 5,0 hat. Als einfacher Verteilungskoeffizient kann das Verhältnis der Menge des Materials, die in der oberen Phase des Lösungsmittelsystems aufgelöst wird, zu der Menge, die sich in der unteren Phase befindet, bezeichnet werden.
Unter den Lösungsmittelsystemen, die sich als brauchbar erwiesen haben, befindet sich ein System, das eine untere Phase, bestehend aus zwei Teilen CHCIs. zwei Teilen CCI., und einer oberen Phase, bestehend aus drei Teilen CHPH, zwei Teilen HO, sämtliche Teile als Volumen, enthält oder ein System, das aus einer unteren Phase, enthaltend zwei Teile CHCI, zwei Teile Cul4, un einer oberen Phase, enthaltend vier Teile CHgOH, ein Teil HO (sämtliche Volumenteile) besteht.
Gewinnt man eine anabole Trockensubstanz durch Züchtung des Organismus Gibberella zeae (Gordon) NRRL-2830 auf mit Wasser gedämpftem Mais, indem man das Medium mit Äthanol extrahiert, das Extrakt konzentriert, in Chloroform auflöst, dann mit wässerigem Natriumcarbonat extrahiert, den PH-Wert mit Salzsäure einstellt, um ein festes Produkt auszufällen, dieses dann mit Äther extrahiert und, wie oben beschrieben, trocknet, und unterwirft man diese Trockensubstanz einer Reinigung nach der Craig-Methode unter Verwendung von 100 Rohren und eines Lösungsmittelsystems aus 2 Vol.-Teilen Chloroform und 2 Vol. Teilen Tetrachlorkohlenstoff als untere Phase sowie 4 Vol. -Teilen Methanol und 1 Vol. -Teil Wasser als obere Phase, so erhält man einen einfachen Verteilungskoeffizienten von 0, 4 und einen Arbeitskoeffizienten von 0, 54.
Die gereinigte neue anabole Substanz ist sehr leicht löslich in Methylenchlorid, Äthanol, Butylazetat, 1, 4-Dioxan und Äthyläther, löslich in Methanol, Butanol, Chloroform und Azeton, schwach löslich in Hexan, Petroläther und Heptan und unlöslich in Dimethylformamid und Wasser.
Diese anabole Substanz gibt einen negativen Ninhydrintest, wenn sie auf Cellulose getrocknet wird, und wird leicht auf Tonerde aus einer Methylenchloridlösung absorbiert.
Ultraviolett-Absorptionsuntersuchungen sind an einer Methanollösung des Östrogens durchgeführt worden. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Materials ist in Fig. 1 gezeigt. Die Kurve zeigt ein Absorptionsmaximum bei 236, 274 und 313 m/l und ein Absorptionsminimum bei 255 und 300 mu.
Eine Lösung der anabolen Substanz von PH 6,0 in einem Endlösungsmittelgemisch aus zwei Teilen Chloroform, zwei Teilen Tetrachlorkohlenstoff, drei Teilen Methanol und zwei Teilen Wasser (sämtlich V 01. - Teile) ergibt bei Bestrahlung mithochintensivem ultraviolettem Licht eineleuchtende, grünlich-blaue Fluoreszenz.
Ein Infrarotspectrum der neuen anabolen Substanz, mit Kaliumbromid zu Pillen verpresst, ist In Fig. II wiedergegeben. Die folgende Tabelle zeigt die Infrarotabsorptionscharakteristiken der neuen anabolen Substanz.
Tabelle II Infrarotabsorptionsspectrum in li
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<tb>
<tb> 3, <SEP> 04 <SEP> S <SEP> 7, <SEP> 15 <SEP> Sh <SEP> 9, <SEP> 05 <SEP> W <SEP> 11, <SEP> 13 <SEP> W <SEP>
<tb> 3, <SEP> 31 <SEP> W <SEP> 7, <SEP> 25 <SEP> W <SEP> 9,25 <SEP> Sh <SEP> 11, <SEP> 34 <SEP> W
<tb> 3, <SEP> 44 <SEP> S <SEP> 7, <SEP> 39 <SEP> W <SEP> 9, <SEP> 31 <SEP> W <SEP> 11, <SEP> 45 <SEP> W <SEP>
<tb> 3,50 <SEP> Sh <SEP> 7, <SEP> 62 <SEP> M <SEP> 9, <SEP> 5 <SEP> W <SEP> 11,76 <SEP> M
<tb> 5,88 <SEP> Sh <SEP> 7, <SEP> 94 <SEP> S <SEP> 9,55 <SEP> Sh <SEP> 12, <SEP> 05W
<tb> 5,93 <SEP> S <SEP> 8, <SEP> 10 <SEP> Sh <SEP> 9,65 <SEP> Sh <SEP> 12, <SEP> 38 <SEP> W <SEP>
<tb> 6,07 <SEP> M <SEP> 8, <SEP> 20 <SEP> W <SEP> 9, <SEP> 73 <SEP> Sh <SEP> 12,53 <SEP> V. <SEP> W.
<tb>
6. <SEP> 20W <SEP> 8, <SEP> 36 <SEP> M <SEP> 9, <SEP> 83 <SEP> W <SEP> 12,68 <SEP> W
<tb> 6, <SEP> 34M <SEP> 8,57 <SEP> M <SEP> 9,94 <SEP> Sh <SEP> 13, <SEP> 05 <SEP> W <SEP>
<tb> 6, <SEP> 70 <SEP> Br <SEP> 8, <SEP> 76 <SEP> W <SEP> 10,31 <SEP> M <SEP> 13, <SEP> 63 <SEP> M
<tb> 6,85 <SEP> W <SEP> 8, <SEP> 88 <SEP> Sh <SEP> 10, <SEP> 54 <SEP> W <SEP> 14, <SEP> 21 <SEP> M <SEP>
<tb> 6. <SEP> 96 <SEP> W <SEP> 8, <SEP> 96 <SEP> W <SEP> 10, <SEP> 73 <SEP> V. <SEP> A. <SEP> 14, <SEP> 57 <SEP> V. <SEP> W.
<tb>
S - Starke Absorption, M - Mittlere Absorption, W - Schwache Absorption,
Sh-Schulter, Br-Breite Absorption, V. W.-Sehr schwach.
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tierischen Ernährung. Die folgende Tabelle III zeigt die Ergebnisse an Hammelwachstumsuntersuchungen unter Benutzung von acht Hammeln, die mit einer handelsüblichen Ration 48 Tage lang gefüttert wurden.
Die mittlere tägliche Gewichtszunahme dieser Hammel betrug 0,122 kg (0, 27 Pfund).
Tabelle III
EMI4.2
<tb>
<tb> Anfangsgewicht <SEP> der <SEP> Hammel <SEP> ohne <SEP> Endgewicht <SEP> nach <SEP> Beendigung
<tb> Injektion <SEP> mit <SEP> anabolischer <SEP> Substanz <SEP> des <SEP> 28tägigen <SEP> Versuches
<tb> Pfund <SEP> kg <SEP> Pfund <SEP> kg
<tb> 74, <SEP> 0 <SEP> 33, <SEP> 6 <SEP> 74, <SEP> 5 <SEP> 33, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 65, <SEP> 0 <SEP> 29, <SEP> 5 <SEP> 72.
<SEP> 5 <SEP> 32, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 61,0 <SEP> 23, <SEP> 1 <SEP> 66, <SEP> 0 <SEP> 29, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 69,0 <SEP> 31, <SEP> 3 <SEP> 78,0 <SEP> 35, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 71, <SEP> 5 <SEP> 32, <SEP> 4 <SEP> 84, <SEP> 0 <SEP> 38, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 72, <SEP> 5 <SEP> 32, <SEP> 9 <SEP> 79, <SEP> 0 <SEP> 35, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 76,0 <SEP> 34, <SEP> 5 <SEP> 83,0 <SEP> 37, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 77,0 <SEP> 34, <SEP> 9 <SEP> 88, <SEP> 5 <SEP> 40, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 70, <SEP> 8 <SEP> im <SEP> Mittel <SEP> 31, <SEP> 9 <SEP> 79, <SEP> 4 <SEP> im <SEP> Mittel <SEP> 36, <SEP> 0
<tb>
Tabelle IV zeigt die Ergebnisse von Hammelwachstumsuntersuchungen unter Benutzung desselben Handelsfutters wie bei den Hammeln in Tabelle III,
jedoch unter zusätzlichen täglichen subkutanen Injektionen von 33 Einheiten der neuen anabolen Substanz während 2S-Tagen. Eine Einheit der anabolen Substanz ist die Menge hievon. die erforderlich ist, um eine Wirkung entsprechend l jig Diäthylstilbestrol zu ergeben. Die mittlere tägliche Gewichtszunahme dieser mit der neuen anabolen Substanz behandelten Hammel betrug 0, 172 kg (0, 38 Pfund), was eine 4 oige Verbesserung in der Gewichtszunahme gegenüber den Hammeln der Tabelle bedeutet.
Tabelle IV
EMI4.3
<tb>
<tb> Anfangsgewicht <SEP> von <SEP> Hammeln, <SEP> die <SEP> Endgewicht <SEP> am <SEP> Ende <SEP> des
<tb> täglich <SEP> mit <SEP> drei <SEP> Einheiten <SEP> anaboler <SEP> 28tägigen <SEP> Versuches
<tb> Substanz <SEP> injiziert <SEP> wurden
<tb> Pfund <SEP> kg <SEP> Pfund <SEP> kg
<tb> 68,0 <SEP> 30, <SEP> 8 <SEP> 75, <SEP> 0 <SEP> 34,0
<tb> 66, <SEP> 0 <SEP> 29, <SEP> 9 <SEP> 80, <SEP> 5 <SEP> 36, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 70, <SEP> 0 <SEP> 31, <SEP> 7 <SEP> 81, <SEP> 0 <SEP> 36, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 71, <SEP> 5 <SEP> 32, <SEP> 4 <SEP> 81, <SEP> 5 <SEP> 37, <SEP> 0
<tb> 74, <SEP> 0 <SEP> 33, <SEP> 6 <SEP> 86, <SEP> 0 <SEP> 39, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 77,0 <SEP> 34,9 <SEP> 93, <SEP> 5 <SEP> 42,4
<tb> 79, <SEP> 5 <SEP> 36, <SEP> 1 <SEP> 82, <SEP> 0 <SEP> 41, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 71, <SEP> 6 <SEP> im <SEP> Mittel <SEP> 32, <SEP> 5 <SEP> 82,
<SEP> 8 <SEP> im <SEP> Mittel <SEP> 37, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
Die mittlere Futterumwandlung der acht Hammel, denen keine anabole Substanz verabreicht wurde,
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lere Futterumwandlung für die Hammel, denen die anabole Substanz verabreicht war, 3, 66 kg (8,08 Pfund) Futterverbrauch je 0, 45 kg (1 Pfund) Gewichtszunahme betrug.
Das folgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung. Ohne diese jedoch auf die besonderen Materialien, Mengen und dargelegten Massnahmen zu beschränken. Das erste Beispiel erläutert die Zubereitung eines geeigneten Impfmittels, das den Organismus Gibberella zeae (Gordon) NRRL-2830 enthält. a) Impfgutherstellung.
Eine Sporensandkultur, die Gibberella zeae (Gordon) NRRL-2830 enthielt, wurde unter sterilen Bedingungen in ein Nährmedium gebracht, das 15 ml Czapek's Dox Lösung und eine kleine Menge Agar
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enthielt. Dieses Medium wurde dann etwa 168 h bei ungefähr 250C bebrütet. Am Ende der Bebrütung wur- de das Medium mit 5 ml sterilem entionisiertem Wasser abgeschwemmt und das Material in ein steriles
Rohr übergeführt, das 45 ml Czapek's Dox Lösung enthielt. Es wurde weiter etwa 96 h bei ungefähr 250C bebrütet, worauf das Material zur Impfung eines Gärmediums verfügbar war.
Das folgende Beispiel erläutert die b) Fermentation des Organismus Gibberella zeae (Gordon) NRRL-2830.
In einen 2 l Kolben wurden 300 g feinverteilter Mais gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wurden dann sterilisiert und darauf mit 150 ml sterilem entionisiertem Wasser versetzt. Die Mischung in dem
Kolben wurde dann mit 45 ml Impfgut, das nach dem Verfahren unter a) hergestellt war, versetzt und das Material wurde innig durchgemischt. Das gemischte Material wurde dann etwa 20 Tage bei 250C in einem dunklen Raum in mit Wasser gesättigter Atmosphäre bebrütet. c) Gewinnung der anabolen Substanz aus dem Gärmedium.
Ein Anteil von 300 ml des vergorenen Materials, hergestellt nach der Methode unter b), wurde in 500 ml entionisiertes Wasser gegeben und aufgeschlämmt. Der Brei wurde dann etwa 15 min auf 750C erhitzt, 300 g Filterhilfsmittel wurden zugegeben, und das Material wurde filtriert. Das feste filtrierte Material mit der anabolischen Substanz wurde dann an Luft getrocknet und 333 g des getrockneten Ku- chens wurden darauf mit 500 mI Äthanol extrahiert. Dieses Verfahren wurde noch dreimal wiederholt.
Der Äthanolextrakt wurde dann unter Vakuum getrocknet, um 6, 84 g festes Material zu ergeben. Dieses feste Material wurde dann in 20 ml Chloroform aufgelöst und mit 30 ml einer wässerigen Lösung extrahiert, die 5 Gew.-% Natriumcarbonat enthielt und auf PH etwa 11, 2 eingestellt war. Das Extraktionsverfahren wurde noch siebenmal wiederholt. Der pH-Wert des Natriumcarbonatextraktes wurde dann mit Salzsäure auf 6, 2 eingestellt, um einen die anabole Substanz enthaltenden Niederschlag zu liefern. Der Niederschlag und der wässerige Natriumcarbonatextrakt wurden dann je für sich wieder mit 75 ml Äthyl- äther extrahiert. Diese Massnahme wurde noch dreimal wiederholt, um eine hellgelbe ätherische Lösung zu ergeben, die darauf getrocknet wurde, um 116 mg feste anabole Substanz zu liefern.
Dieses Material wurde darauf der mehrfachen Übertragungsgegenstromverteilung unter Benutzung von 100 Rohren und eines Lösungsmittelsystems unterzogen, das aus zwei Teilen Chloroform und zwei Teilen Tetrachlorkohlenstoff als untere Phase und vier Teilen Methanol und ein Teil Wasser als obere Phase (sämtliche Volumenteile) bestand. Das hiebei erhaltene feste Material wurde dann auf seine physiologische Aktivität gemäss dem bekannten Maus-Uterin-Test untersucht. Der Maus-Uterin-Test bestand in der Verfütterung festen Materials, das durch Trocknung von 5 ml der oberen Phase und 5 ml der unteren Phase aus jedem der ausgewählten Rohre erzeugt war, u. zw. wurde ein Standardfutter von 75 g an 5 Mäuse während eines Zeitraums von 5 Tagen verfüttert ; während dieser Periode war das ganze Futter verbraucht.
Am Ende des Zeitraums wurden die Tiere gewogen, und die Uteri wurden entfernt und gewogen. Ein positives Ansprechen auf den Versuch wurde mit dem physiologisch aktivsten Material hervorgerufen, das in den Rohren 30-40 enthalten war. Dieses aus den Rohren 30-40 gesammelte feste Material wog 59 mg.
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