DE1965267A1

DE1965267A1 - 4-Nitropyrrol-2-carbonsaeureamidderivate,Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Info

Publication number: DE1965267A1
Application number: DE19691965267
Authority: DE
Inventors: Masanao Shimizu; Shigeru Yamabe; Tadatsugu Yamamoto
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1968-12-29
Filing date: 1969-12-29
Publication date: 1970-07-16
Also published as: DE1965267B2; CA973883A; FR2027285B1; FR2027285A1; DE1965267C3

Description

PATENTANWÄLTE

_s : _ — —-

Dr. D. Thomsen H- Tiedtke G. Bühling Dipl.-Chem. Dipl.-Ing. Dipl.-Chem.

u «

8000 MÖNCHEN 2

TAL 33

TELEFON 0811/226894

TELEGRAMMADRESSE: THOPATENT

MÖNCHEN 29. Dezember 1969 . case K-19(DP)/HK / T 3446

Dainippon'Pharmaceutical Co., Ltd. Osaka / Japan

4-Nitropyrrol-2-carbonsäureamidderivate, Verfahren zu deren-

Herstellung und deren Verwendung

Die Erfindung bezieht sich auf 4-Nitropyrrol-2-carbonsäureamidderivate, auf Verfahren zu deren Herstellung, auf pharmazeutische Präparate, die diese Derivate'enthalten. und auf ein Verfahren zur Anwendung der Präparate.

Es wurde gefunden, daß die neuen 4-Nitropyrrol-2-carbonsäureamidderivate der· Erfindung eine Wirkung gegen · Trichomonas vaginalis sowie eine einzigartige Wirkung zur Förderung des Ilerauslösens bzw. des Freisetzens von Viren aus Zellen aufweisen. · '

Demgemäß werden nach der Erfindung neue und wert-' volle 4->Jitropyrrol-2-carbonsäurearaidderivate der allgemeinen Formel 009829/1888 ' >

MOmHIdW AbTMtMi, [iwbtMAdfr· dureh Ttltfon, b»diffen MhrlftlleNr BuUUlgung

· PoMMhMkkonteMOnchm 11ββ74 *thr\ DRiPIMAf

°2^N "CT7-C-NH-R.

IN H

geschaffen, worin R ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl- · gruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen darstellt und R₁ eine Amino-, Amidino- oder __Ν_ρ^2 -

" V

-Gruppe bedeutet,R2 und R₃ jeweils Wasserstoff, Alkylgruppen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen,darstellen, welche gleich oder verschieden sein können.

In der vorstehenden allgemeinen Formel I bedeutet R vorzugsweise ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, die geradkettig oder verzweigt sein können, beispielsweise eine Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl-, tert.*- Butyl-, Penty1- oder Isopentylgruppe, wobei u.a. Wasserstoff oder Die Methylgruppe bevorzugt sind. R. stellt eine Amino-, Amidino- oder -N=C^ 2 -Gruppe dar, worin R^ und R, gleich

^R3
oder verschieden sein können. Bevorzugte Gruppen R- bzw. R₃ sind jeweils Wasserstoff, geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, z.B. Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, aek.-Butyl-, tert.-Butyl-, Pentyl- oder Isopentylgruppen, Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen, wobei bevorzugte Substituenten

009828/1888 ., '

_ßA0 ORIGINAL

in der Phenylgruppe Hydroxyl-, Carboxyl-, geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, z.B. Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobu- .

tyl-, sek.-Butyl-, tert.-Butyl-, Pentyl- und Isopentylgrup pen, geradkettige oder verzweigte Alkoxygruppen mit 1 bis.

5 Kohlenstoffatomen, z.B. Methoxy-, Äthoxy-, Propoxy-, iso propoxy-, Butoxy-, Isobutpxy-, sek.-Butoxy-, Pentyloxy-

und Isopentyloxygruppen, Halogenatome, z.B. Fluor, Chlor, *

Brom oder Jod sowie Nitrogruppen sind. Es ist besonders

bevorzugt, daß R, eine Amino-, Amidino-, N-Isopropyliden amino-, N-(1-Phenyl)äthylidenamino- oder eine N-(ortho-Hy- droxy)benzylidenaminogruppe darstellt.

Als einige spezielle 4-Nitropyrrol-2-carbonsäure-

amidderivate können folgende genannt werden: ' '

4-Nitropyrrol-2-carbonsäurehydrazid (Verbindung A).

l-Methyl-4-nitropyrrol-2-carbonsäurehydrazid (Ver- λ bindung B).

2-Amidinocarbamoyl-4-nitropyrrol (Verbindung C). · 2-Amidinocarbamoyl-l-methyl-4-nitropyrrol (Verbindung D)

4-Nitropyrrol-2-carbonsäureisopropylidenhydrazid (Verbindung E). '.

l-Methyl^-nitropyrrol^-carbonsäureisopropyliden-' hydrazid (Verbindung F).

^-Nitropyrrol^-carbonsäure-l-phenyläthylidenhydrazid (Verbindung G).

l-Methyl-4-nitropyrrol-2-carbonsäure(ortho-hydroxy)-benzylidenhydrazid '(Verbindung HU *

009829/1888

Unter den genannten Verbindungen sind für die . Zwecke der Erfindung besonders die Verbindungen B, E, F ' und H bevorzugt. . : '

Im vorliegenden Zusammenhang können "Alkylgruppen··' mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen" geradkettig oder verzweigt sein und schließen Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, ·. Butyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl-, tert.-Butyl-, Pentyl- und. Isopentylgruppen ein.

Auch die "Alkoxygruppen mit 1 bis -5 Kohlenstoffatomen" können geradkettig oder verzweigt sein und schließen Methoxy-, Äthoxy-, Propoxy-, Isopropoxy-, Butoxy-, Iso- , butoxy-, sek.-Butoxy-, Pentyloxy- und Isopentyloxygruppen : u.dgl. ein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung schließen "Halogenatome" Chlor, Brom, Jod und Fluor ein.

Die 4-Nitropyrrol-2-carbonsäureamidderivate der . allgemeinen Formel I

to ^₁/ ** C-NH-R

worin R und R. die vorstehend angegebenen Bedeutungen be sitzen, können dadurch hergestellt werden, "4aß man

OADORiGiNAL

a) die Verbindungen der allgemeinen Formel II

O₀N

² "ir r,

II

/₂

C-NHN = C_v * Ia

¹ 0 3

ο -

oo worin R, R₀ und R-, die vorstehend angegebene Bedeu

"> tung besitzen

Zl . dadurch erhalten werden, daß man die Verbindungen der

0 .
R

worin R die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt und

R¹ Halogenatome oder Alkoxygruppen mit 1 bis Kohlenstoffatomen bedeutet,
mit den Verbindungen der allgemeinen Formel III

NH₂-R₁ ' III

worin R₁ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt,
umsetzt.

b) Ferner können die Verbindungen der allgemeinen · Formel Ia, die im Rahmen der 4-Nitropyrrol-2-carbonsäure- ^ amidderivate der Formel I liegen, nämlich

BAD

allgemeinen Formel Ib

O₀N -ν η ' Ib

worin R die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt, mit den Verbindungen der allgemeinen Formel IV

• R₅ ^

S C=O IV

^R3

worin R₂ und Ro die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, umsetzt. . .

c) Ferner können die Verbindungen der allgemeinen Formel Ia¹, die im Rahmen der vorstehenden Verbindungen der. Formeln I und Ia liegen, nämlich

C-NHN=*C f ² Ia¹

Il *

R ° ^R3

R₄ 3

worin R₂ und R₃ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen und

Ct R₄ eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine Alky!gruppe

«o mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeutet, .

*f dadurch erhalten werden, daß man die Verbindungen der allge- _* meinen Formel Ia"

JJ ² ^mJ-C-NHN-C C ² Ia"

H O ^R3

worin R. und R- die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen,
mit den Verbindungen der allgemeinen Formel V

R₄-Y V

worin R₄ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt und Y ein Halogenatom, ein Schwefelsäurealkylesterrest oder ein Toluolsulfonsäureesterrest ist, umsetzt.

. Die Reaktion des vorstehenden Verfahrens a) wird vorteilhaft durchgeführt, wenn eine Verbindung der allgemeinen Formel II mit Halogen als die Gruppe R¹, vorzugsweise ' Chlor oder Brom,als eine der Ausgangsverbindungen in einem wasserfreien, organischen Lösungsmittel, das unter den' Reak-

tionsbedingungen inert 1st, z.B. wasserfreies Benzol, Toluol, Chloroform, u.dgl., vorzugsweise wasserfreies Benzol bei Temperaturen im Bereich von 0 C bis Raumtemperatur einige Stunden lang, vorzugsweise 1 bis 3 Stunden umgesetzt wird. Vorzugsweise werden wasserfreie Reaktionskomponenten angewendet. Es ist auch zulässig, die Reaktion gewünschtenfalls* ' unter Kühlung zu starten und anschließend die Reaktion bei

° Raumtemperatur fortzusetzen. Wenn dagegen eine Ausgangsvero

j£ bindung der allgemeinen Formel II mit einer Alkoxygruppe mit k> 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einer Methoxy-, Xthoxy- -* oder Propoxygruppe als die Gruppe R¹ verwendet wird, kann • · die Reaktion in einem Lösungsmittel, das unter den Reaktiönsbedingungen inert ist, wie Wasser, Alkohol, z.B. niederem.

BAO

Alkanol, wie Methanol, Äthanol u.dgl., oder ohne Lösungsmittel unter Erhitzen auf 100° bis 200°C, vorzugsweise 140° bis 160°C 3 bis 10 Stunden lang, vorzugsweise 6 bis η~ Stunden lang, durchgeführt werden. Eine bevorzugte Arbeitsweise ist es, die Reaktion bei erhöhten Drücken, z.B. in ,. einem versiegelten Rohr, durchzuführen. Das Reaktionsver- . fahren a) kann unter Verwendung einer überschüssigen Menge' der Verbindung der allgemeinen Formel III als Säurebinder durchgeführt werden.

Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formel Ia und Ia¹, die durch die Verfahren b) und c) hergestellt werden, als auch diejenigen der allgemeinen Formel Ib und Ia.".,. die als Ausgangsmaterialien in diesem Verfahren verwendet werden, liegen im Bereich der Verbindungen der allgemeinen Formel I, die durch das vorstehend beschriebene Verfahren a) hergestellt werden. Demgemäß können die Verfahren b) und c) als untereinander austauschbare Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I angesehen werden. *

Das Verfahren b) kann ausgeführt werden, indem man' die Reaktionskomponenten in Gegenwart eines Lösungsmittels, · das unter den Reaktionsbedingungen inert ist, wie V7asser

•v^ oder Alkohol, z.B. niederem Alkanol, wie Methanol oder Äthanol bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 8O⁰C, vorzugsweise 50° bis 80°C während 1 bis 30 Minuten, vorzugsweise 1 bis 10 Minuten hält. Gewünschtenfalls kann das

BAD ORIQlNAL'

Lösungsmittel durch eine überschüssige Menge der Ausgangs-'' Verbindung ersetzt werden.

Die Reaktion des vorstehenden Verfahrens c) kann dadurch ausgeführt werden, daß man die Verbindung der allgemeinen Formel Ia" in einem wasserfreien Alkohol, z.B. . · niederem Alkanol, wie Methanol, Äthanol u.dgl., der ein Alkalialkoxyd, z.B. Natrium- oder Kaliummethoxyd oder Ha-- μ triuitt- oder Kaliumäthoxyd enthält, löst, um die Verbindung der allgemeinen Formel Ia" zu dem entsprechenden Alkalisalz umzusetzen, ferner hierzu die Verbindung der allgemeinen Formel V gibt und das System bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 80 c, vorzugsweise bei Raum.'" temperatur, einige Stunden, vorzugsweise 4 bis 5 Stunden lang hält.

Die so hergestellten Verbindungen der allgemeinen Formeln I, Ia und Ia¹ können durch üblicherweise angewendete Maßnahmen, z.B. Umkristallisation, gewonnen werden. .

Bei dem Verfahren a) können die Verbindungen der ο

^ allgemeinen Formel II und III/ die als Ausgangsmaterialien

no verwendet werden, aus bekannten Verbindungen hergestellt

"^ werden oder aus solchen Verbindungen, die entsprechend der.

Herstellung bekannter Verbindungen hergestellt wurden

Die bei dem Verfahren b) zu verwendenden Ausgangs- . verbindungen der allgemeinen Formel Ib sind diejenigen, · die durch das Verfahren a) erhalten v/erden und die durch ■· Umsetzung der Verbindungen der allgemeinen Formel II mit . Hydrazin gemäß Verfahren a) hergestellt v/erden können. Die Verbindungen der allgemeinen Formel IV sind an sich bekannt und leicht erhältlich.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel Ia¹*, die als Ausgangsmaterialien für das Verfahren c) verwendet v/erden, werden durch das vorstehende Verfahren a) oder b) erhalten. D.h., sie können entweder dadurch hergestellt werden, daß man die Verbindungen der allgemeinen Formel I Ia

°2^Ν

V-s-^R1

worin R¹ ein Halogenatom oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellt, mit den Verbindungen der allgemeinen Formel VI

R₉
2

R,

NKH₀ VI

no worin R_ und R- die vorstehend angegebene Bedeutung

CD 2 J

besitzen, entsprechend dem vorstehenden Verfahren a)

BAD ORIGfNAL

umsetzt oder dadurch, daß man die Verbindungen der. •allgemeinen Formel Ha mit Hydrazin entsprechend dem Verfahren a) umsetzt und anschließend die entstehenden Verbindungen der allgemeinen Formel Ib

O-N'i¹

² V-^C-NHNKL Ib¹

N „ 2

H °

mit den Verbindungen der allgemeinen Formel IV entsprechend dem Verfahren b) umsetzt.

Die Verbindungen der Formel I der Erfindung können als freie Base oder als Additionssalz einer geeigneten Säure erhalten v/erden. Zu solchen Säureadditionssalzen gehören diejenigen von anorganischen Säuren, wie Sulfate, Hydrohalo- · genide, Perchlorate, Nitrate und Phosphate und diejenigen von organischen Säuren, wie Methansulf onate, iithansulf onate , Hydroxyäthansulfonate, Äthylensulfonate, Benzolsulfonate, Toluolsulfonate und Naphthalinsulfonate, von denen die Sulfate und Hydrolialogenide besonders bevorzugt sind. Diese Verbindungen können gemäß einer praktischen Arbeits%?eise in Form "

ο eines Säureadditionssalzes sowie in Form der freien Base ο

•° verwendet werden.
oo

_» Die neuen Verbindungen der allgemeinen Fomel I

eo gemäß der Erfindung v/eisen interessante, chemotherapeutische oo

Eigenschaften auf, wie sie durch die Versuche demonstriert

werden, die in üblicher Weise gegenüber Trichomonas vaginalis durchgeführt v/erden. Einer der Versuche v/urde beispielsweise folgendermaßen durchgeführt: Steriles Pferdeserum wurde zu einem Kulturmedium aus 20 g Hefeextrakt, 10 g Glukose,. 5 g UaCl, 2 g Cystein, 20 g Pepton, 2 ml Methylenblau-Lösung (1 mg/ml) und 1 000 ml destilliertem Wasser gegeben, zu dem ferner eine verdünnte Flüssigkeit der TEstverbindung gegeben wurde. Anschließend wurde Trichomonas vaginalis in dieses Medium eingeimpft, worauf· eine 4tägige Züchtung bei 37 C folgte. · Die Mindestkonzentration der zur Inhibierung des Wachstums von Trichomonas vaginalis erforderlichen Testverbindung (JITr-Mindestinhibierungskonzentration) wurde in der nachstehenden Tabelle angegeben. Bei den angegebenen Konzentrationen wurde Icein Wachstum von Trichomonas vaginalis in dem beschriebenen Kulturmedium am dritten Tage, gerechnet von der Einimpfung, beobachtet.

MIC gegenüber Trichomonas Vaginalis (in vitro)

getestete Verbindung MIC (mcg/ml)

Λ ■ 30

B 10

D 10

E 30

F 10

G 10

H 10

009829/1888

SAD ORIGINAL

Wie ersichtlich, sind die neuen Verbindungen der . allgemeinen Formel I gemäß der Erfindung wertvoll als AntiProtozoen-Mittel gegen schädliche Protozoen, wie Trypanosoma (T. gambiense, T. rhodesiense, T. cruzi), Leishmania (L. dono vani, L. tropica, L. brasiliensis), Trichomonas (T. buccalis, T. hominis, T. pulmonalia, T. vaginalis), Sporozoa (Plasmodium spp.), Endamoeba (Έ. histolytica), u.dgl., insbesondere als anti-trichomonale Mittel gegen Trichomonas.

Dementsprechend bezieht sich die Erfindung auch auf pharmazeutische Präparate, die als aktive Bestandteile die' Verbindungen der allgemeinen Formel I mit pharmazeutisch akzeptablen organischen oder anorganischen festen oder flüssigen Trägern vermischt, enthalten.

Die Präparate der Erfindung können oral oder parenteral oder lokal in das Rektum. von Menschen, Haustieren, wie Kühen , Schweinen und Hunden sowie Haushühnern verabreicht werden.

Zu geeigneten Trägern, die für die Präparate brauchbar sind, gehören solche Hilfsmittel, die normalerweise angewendet werden, v/ie Wasser, Lactose, Stärke, Talk, Magnesiunstearat, Pflanzenöl, Benzylalkohol, Trgantgummi, Polyalkylenglykol u.dgl.

00 982 9/1888

Als oral zu verabreichende Präparate können Tabletten, Kapseln, Pillen, körnige Präparate, Sirup u.dgl., die in üblicher Weise bereitet wurden, genannt v/erden. Die angebrachte Dosis pro Tag der pharmazeutisch aktiven Verbindung liegt in diesen Fällen im Bereich von 100 bis 500 rag, vorzugsweise 300 bis 450 rag, die einmal bis dreimal pro Tag verabreicht werden kann.

Als lokal oder in das Rektum zu verabreichende Präparate können solche verwendet v/erden, die die pharmazeutisch wirksame Menge des aktiven Bestandteils mit üblicherweise verwendeter Salbengrundlage, wie wäßriges Lanolin, Vaseline, weiche Vaseline, Polyäthylenglykol und deren Gemische, vermischt enthalten.

Es wurde nun gefunden, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel I der Erfindung die Wirkung besitzen. Viren aus Zellen freizusetzen."

Beispielsweise sind Phage, Phage I1S2 (Davis J. E., Strauss u.EI. und Sinsheimer R. L.: Science 134, 1427 (1961)), GA und Qß (I. Watanabe, T. Miyake, T. Sakurai, T. Shiba und T. Ohnos Pros, Japan Acad. 4_3, 2O4 (1961)), She (T. Nishihara und I. Watanabe; Virus Γ7, 118 (1967)) und T₄ die Viren, die

009829/1883

BAD ORIGINAL

Bakterien infizieren und sich in den Bakterien fortpflanzend Es wurde ein Agar-Kulturmedium als Nährquelle für Bakterien' verfestigt und darauf vmrde weiches Agar-Kulturmedium, das mit Bakterien (z.B. etwa 2 χ 10 /ml und Phage (etwa 300/ml) vermischt worden war/ als Schicht aufgetragen (laminiert) und verfestigt, worauf über Nacht bei 37°C gebrütet vmrde. Die Bakterien wuchsen in dem Kulturmedium wobei sie letztere trüb werden ließen, und an den Punkten, wo Phage sich fortpflanzte, fand ein Zellenzerfall statt, wobei sich kleine kreisförmige transparente Flecken bildeten. Solche Kreise . werden als "Plaques" bezeichnet.

Die Phagenanzahl kann durch Zählen der Anzahl sol- . eher Plaquen bestimmt werden. Wenn beispielsweise 1 ml Flüssigkeit, welche Phagen in unbekannter Konzentration enthält, mit Bakterien gemäß der vorstehend beschriebenen Methode vermischt v/ird und die Anzahl von in Kulturmedium ä gemessener Plaquen gezählt wird, wird die Phagenkonzentration für den Fall, daß die Anzahl 300 ist, als 300 plaquenbilcende Einheiten/ml (p.f.u.) bestimmt. In Abhängigkeit von Faktoren wie Art der mit Phage zu infizierenden Bakterien trifft es nicht immer zu, daß ein Phagenteilchen einer plaquenbildonden Einheit entspricht. Daher wird die Phagenkonzentration durch p.f.u. ausgedrückt.

009829/1888

Wenn Baktcriophage die Gastbakterion infiziert, tritt lediglich die Kernsäure des Ph'ages in die Bakterien ein,und es wird eine Phagenbrut in den Bakterien erzeugt, ' welche Zellenzerfall bewirkt, worauf eine Freisetzung der Phagenbrut aus den Bakterien bewirkt wird. Der eine Zyklus von der Infektion mit Ph'agen zum Freisetzen von Phagen wird als "Einstufenwachstum" bezeichnet. Die Wiederholung des Einstufenwachsturns wird als "Vielstufenwachstum" bezeichnet. Plaque ist ein Agglomerat vieler zerfallener Zellen, hervorgerufen durch das Vielstufenwachstum von Phagen. Daher wird der Durchmesser einer Plaque umso größer, je mehr Wachstumsstufen stattfinden.

Es wurde gefunden, daß wenn Bakterien und Phagen in Gegenwart der neuen Verbindung gemäß der allgemeinen Formel I der Erfindung gemischt und über Nacht im Kulturmedium bebrütet werden, der gebildete Plaquendurchmesser mehr als zweimal größer wird als in Falle der Abwesenheit der neuen Verbindung. Das Phänomen der Plaquenvergrößerung wird durch Figuren 1 und 2 demonstriert, wobei Fig. 1 die in Anwesenheit einer Verbindung der Erfindung gebildete Plaque zeigt und Fig. 2 diejenige zeigt, die bei Abwesenheit der Verbindung gebildet wird, im übrigen unter identischen Bedingungen (Kontrolle). Diese Tatsache beweist klar, daß die neue Verbindung der Erfindung sowohl für (A)

009829/1888

BAD ORIGINAL

die Erhöhung der aus jedem' Gastbakterium froigesetzen Phagennon-ge wirksam ist als auch (B) für die Verkürzung der Zeit, die für ein Einstufenwachstum erforderlich ist, d.h., die Erhöhung der Anzahl von innerhalb einer definierten Zeit durchführbaren Wachsturnszyklen.

Bisher ist Ice ine'Verbindung bekannt, die den erläuterten Effekt (A) aufweist. Demgegenüber ist eine Mutante von T.-Phage, T.^r bekannt, die einen kürzerzeitigen Wachstumszyklus aufweist als die ursprüngliche Phage /ß. Benzer: Proc. Natl. Acad., Sei. USA £1, 344 (1955]_7. Jedoch wird die erhöhte Wirkung.bezüglich des Wachstumszyklus durch Mutation der genetischen Eigenschaft von Phagen erreicht, wogegen eine Verbindung die die beschriebene Wirkung besitzt, noch nicht bekannt ist.

Die geeignete Menge zur Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung für diesen Zweck liegt im Bereich von 30-bis 300 mcg/ml, vorzugsweise etwa 100 mcg/ml; diejenige der Bakterien liegt im Bereich von 10 bis 10 Zellen/ml, vorzugsweise 10 Zellen/ml und diejenige von Phagen im Bereich von 100 bis 1000 p.f.u./ml, vorzugsweise 200 p.f.u./ml* Das Kulturmedium kann aus den üblicherweise Verwendeten ausgewählt werden, die für das Wachstum verwendeter Bakterien geeignet sind, vorzugsweise ein Agar-Kulturmedium. Die Bebrütung kann in üblicher !$<%%&| ,ausgeführt v/erden und wird ·

beispielsweise bei 37 C über !lacht mit zufriedenstellendem Ergebnis durchgeführt.

Ferner v/urde folgender Einstufera/achstums-Versuch · ausgeführt /Ellis, E.L. und M. Delbrueck, J. Gen. Physical 22, 365 (1939]_7, um zu bestimmen, ob der Plaquen-Vergrößerungseffekt der neuen Verbindung gemäß der Erfindung auf das Phänomen (Λ) oder (B) zurückzuführen ist, Es wurden Bakterien und Phagen in einen flüssigen Kulturmedium vermischt, in welchen die neue Verbindung der Erfindung eingegeben wurde. Separat wurden identische Bakterien und Phagen in dem .gleichen Kulturmediuni vermischt mit der Aus- . nähme, daß die erfindungsgemäße Verbindung durch destillie-rtes Wasser als Kontrolle ersetzt wurde. !lach Bcbrütung bei 37°C während 5 Minuten enthielten die entstehenden flüssigen Gemische jeweils nicht inf izierende Phagen, mit Phagen · infizierte Bakterien und mit Phagen nicht infizierte Bakterien. Dann wurde ein Anti-Phagen-Serun zur Inaktivierung der nicht infizierenden Phagen zugegeben, und unmittelbar

4 darauf v/urde dieses Gemisch auf mindestens das 10 -fache verdünnt, um das Antiserum zu verdünnen. Eine solche Verdünnung bewirkt, daß das Antiserun gegenüber der später freigesetzten Phagenbrut inert wird und die Phagenbrut wird infolge der entstehenden niedrigen Konzentration gegenüber den Bakterien nicht infizierend. So wird mit den Phagen nur ein Einstufem/aclistumpdiirxChgeführt.

BAD ORIGINAL

Das Anfangsstadium der Infektion von Bakterien mit Phagen ist .die Adsorption von Phagen auf der BäktGrienobcr- flache. Die Wahrscheinlichkeit dieser Adsorption ist di rekt proportional zu dem Produkt aus Phagenkonzentration und Bakterienkonzentration. Wenn beispielsweise Phagen und Bakterien jeweils bei Konzentrationen von etwa 10 /ml ge mischt werden, wie es normalerweise durchgeführt wird, ad sorbieren die meisten Phagen auf der Bakterienoberfläche innerhalb einiger Minuten. Wenn dagegen beide bei Konzen-

4 trationen von jeweils 10 /ml gemischt werden _ti wird die

Adsorptionswahrscheinlichkeit auf 1/10 herabgesetzt. Dementsprechend kann mit Sicherheit angenommen werden, daß

die Verdünnung auf das 10 fache bei dem vorstehenden Ein stuf enwachstums-Versuch die Wahrscheinlichkeit der Phagen- Infektion von. Bakterien auf im wesentlichen gleich Null herabsetzt.

Das Phagen-Antiserum verbindet sich mit dem Oberflächen - protein unter Inaktivierung der Phagen. Wenn die Kernsäure der Phagen einmal in die Bakterien eingetreten ist, ist das Antiserum nicht mehr v/irksam. D.h., das Antiseruru wirkt nicht auf mit Phagen infizierte Bakterien, obwohl es bei nicht infizierenden Phagenteilchen wirksam ist.

Der vorstehende Versuch wurde wie folgt fortgesetzt.

009829/1888

_ÖAD

Es wurde jeweils eine definierte Menge des verdünnten Kulturmediums/ welches durch das beschriebene Einstufen- . wachstum erhalten wurde/ in Abständen von 5 Minuten' oder 10 Minuten, beginnend 10 Minuten nach der Infektion und endend 100 Minuten nach der Infektion, entnommen. So wurden 15 bis 19 aus dem verdünnten Kulturmedium entnommene Proben, in denen die erfindungsgemäße Verbindung vorhanden war und ferner 15 bis 19 aus dem verdünnten Kulturmedium entnommene Proben, in denen die neue Verbindung durch destilliertes Wasser ersetzt war, erhalten. Während eine geeignete Anzahl von Proben hergestellt werden kann, genü-r geh 15 bis 19 Proben durchaus dem Zweck des Versuches. Jede

2 4 · ' Probe wurde ferner mit dem Kulturmedium um das 10 bis 10 >· fache verdünnt, wodurch die Verbindung der Erfindung inak-, tiviert wurde. Anschließend wurden die verdünnten Proben jeweils mit Bakterien in weichem A,gar-Kulturmediüm gemischt, das wie vorstehend beschrieben, behandelt wurde, und die entstehenden Plaquen wurden zur Bestimmung dex" entsprechenden Phagenkonζentration gezählt. In der graphischen Darstellung von Fig. 3 wurden plaquenbildende Einheiten/ml jeder Probe gegen die Zeit aufgetragen, die nach der Infektion verstrich. Aus dem Diagramm ist ersichtlich, daß im Falle von Phagen MS2 die Freisetzung der Phagenzucht aus den Bakterien etwa 35 Minuten nach der Infektion in der Kontrolle, beginnt (in der destilliertes Wasser anstelle der erfindungs-

009829/1888 . . .

SAD

geraäßen Verbindung vorhanden war), angezeigt durch die

Kennzeichnung _# », während die Zeit bis zum Be- *. .·

ginn des Freisetzens der Phagenbrut um 5 bis 10 Minuten in Gegenwart der erfindungsgemäßen Verbindung beschleunigt

wurde (& 4) ; und der kleine beträchtliche Unterschied

besteht in der durchschnittlichen Spaltgröße zwischen die-' sen Linien. Diese Tatsache demonstriert, daß die neuen Verbindungen der Erfindung den vorstehend erläuterten Ef- ™ fekt B besitzen, d.h., an der Vergrößerung des Phagenwachsturnszyklus innerhalb der definierten Zeit teilnehmen. Wie ferr ner vorstehend beschrieben, können, wenn die Plaquen innerhalb etwa 20 Minuten nach der Infektion gezählt v/erden, dfe mit Phagen infizierten Bakterien selektiv gezählt werden-, da noch keine Phagenbrut freigesetzt ist. Wenn demgegenüber die Plaquen nach etwa 35 Minuten, gerechnet von der Infektion, gezählt werden, kann die aus den infizierten Bakterien freigesetzte Phagenbrut selektiv gezählt werden. i Die vorstehend erwähnte "durchschnittliche Spaltgröße" der Phagen bedeutet p.f.u. der Phagenbrut/p.f.u. der mit Pha-. .· gen infizierten Bakterien, d.h., durchschnittliche Produktionsmenge von Phagenbrut je ein infiziertes Bakterium. ·' Die zur Bewirkung eines Einstufenwachstums von Phagen geeignete Menge der zuzugebenden neuen Verbindung liegt im Be-

reich von 30 bis 300 mcg/rrtl, vorzugsweise etwa 100 mcg/mT; die Bakterienkonzentration liegt im Bereich, von 10 bis 10

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Zellen/ml, vorzugsweise IO Zellen/ml und die Phagenkon- "·"

zentration ist wahlweise vorzugsweise 10 p.f.u./ml. Die.·' Menge des Phagen-Antiserums hängt von dem Antiserumwert ab, der ausreichend zur Inaktivierung nicht infizierender ' Phagen sein muß. Die Infektion von Bakterien mit Phagen kann ausreichend innerhalb von 5 Minuten durchgeführt werden. Bei den vorstehend genannten Bakterien- und Phagenkonzentrationen wird die Infektion sehr schnell beendet sein. Die anschließende Antiseruinbehandl ing kann etwa 3 Minuten lang während der 5. bis 8. Minute nach der Infektion mit zufriedenstellendem Ergebnis durchgeführt werden, wan-* ' rend eine Behandlung von nur 1 Minute ebenfalls die Inaktivierung von nicht infizierenden Phagen bewirken kann.

Die Menge jeder Probe ist variabel in Abhängigkeit von solchen Faktoren, wie Konzentration der Phagenbrut, die nicht kritisch ist, jedoch vorzugsweise 0,1 ml beträgt.

Wie vorstehend erläutert, weisen die neuen Verbindungen der Erfindung die Wirkung zur Erhöhung der Anzahl von Wachsturnszyklen von Viren innerhalb einer definierten Zeit auf. Um zu bestimmen, ob die Wirkung auf B)-I zurück-* zuführen ist, d.h., die Beschleunigung der Phagenproduktion'sgeschwindigkeit innerhalb der Bakterien oder auf B)-2, d.h.,

009829/1888 .

ÖA ORIGINAL

die Verkürzung der Zeit zur Phagenfreisetζung aus den Bakterien bei unveränderter Phagenproduktionsgeschwindig- . keit innerhalb der Bakterien,wurde folgender Versuch durchgeführt.

Wie bereits erläutert, wurden Proben in verschiedenen Zeitintervallen nach der Infektion,entsprechend dem Einstufenwachstum-Versuch entnommen, wobei jede Probe infizierte Bakterien, Piaagenbrut tragende Bakterien und aus·. Bakterien freigesetzte Fhagenbrut vermischt enthielt. Jede Probe wurde zu einem bekannten Gemisch zur Auflösung von Bakterien zugegeben, beispielsweise einem Gemisch Lysozym-EDTA und Puffer, um zu bewirken, daß das Lysozym 5 bis 30 · Minuten, vorzugsweise IO Hinuten auf die Bakterien einwirkt, um die Auflösung fler Bakterien zn bewirken. Es wurden je^ wells 0,1 ml Proben im abständen von 5 Minuten bis- 60 Minuten, beginnend IO Mizwatea nach der Infektion mit zufriedenstellendem Ergebnis ea^aonsänen. " Die erfindungsgemäße Vor-· bindung war durch die "Verdünnung, wie sie für den vorstehenäen Einstufenwachstian-^/ersuch erläutert wurde „ Inaktiviert·.

O Die entstehendem verdünnten Proben wurden jeweils

*£ mit Bakterien in waiclis® Ägar-Kulturmedium vermischt und

_ω ähnlich, wio vorstehend beschrieben, behandelt_o Die Phagen-

*■* " ■

-* konzentration wurde In jeder Probe gencssen, indan man di'e

Plaquen zählte. In dem in Fig. 4 aufgeführton Diagramm to

sind die so bestimmten lierte p.f.u./ml (Phagenkonzentration)

BAD ORIGINAL

jeder Probe gegen die Zeit· aufgetragen, die nach der.In- · fektion verstrich. Fig.. 4 demonstriert, daß die Menge der Phagenproduktion zwischen den System, das die erfindungsgemäße Verbindung enthält (4 L) und der Kontrolle ( · φ) unverändert ist. Es ist also der

Schluß zu ziehen, daß der Vergrößerungseffekt bezüglich des Phagenwachstumszyklus der erfindungsgemäßen Verbindungen, wie er in Fig. 3 - demonstriert wird, durch das vorstehende Phänomen B)->2 verursacht wird.

In der Fig. 4 entspricht der Eereich unter der gestrichelten Linie, d.h., das Intervall zwischen 10 bis 18 Minuten der sogenannten "latenten Periode".

Der erwähnte Schluß wird durch folgende Arbeitsweise gezogen. Beispielsweise zeigt die Fig. 3 unter der Annahme, daß "a" Minuten, gerechnet von der Phageninfektion, zur Produktion von Phagenbrut erforderlich sind und daß "b" Minuten für die Freisetzung der erzeugten Phagenbrut aus den Bakterien erforderlich sind, daß "a" plus "b" in Gegenwart der erfindungsgemäßen Verbindung verkürzt wird. Es ist offensichtlich, daß die Gesamtzahl von Phagenteilchen innerhalb und außerhalb der Bakterien im Versuch, auf den sich die Fig. 4 bezieht, gezählt wurde. Demgemäß hängt der V p.f.u./ml, der sich aus dem Versuch ergibt, allein von "a"

0 09829/1888

BAD OFHGfNAL

d.h., der Phagenproduktionszeit ab. Demgegenüber zeigt Fig. 4/ daß die Phagenproduktionsgeschwindigkeit zwischen · dem System, das die erfindungsgemäße Verbindung enthält und dem Kontrollsystem identisch ist. Demgemäß ist der einzige logische Schluß, daß der Vergrößerungseffekt bezüglich des Phagenwachsturaszyklus der erfindungsgemäßen Verbindung durch das· Phänomen B)-2 verursacht wird, d.h., die Zeit zur Freisetzung von Phagenbrut aus den Bakterien ist verkürzt, obwohl die Phagenproduktionsrate in den Bakterien unverändert ist.

Es wurden verschiedene Verbindungen bezüglich dieses in der Tat überraschenden Effektes bezüglich der Vergrößerung des Phagenwachstumszyklus untersucht, um festzustellen, daß die 4-Nitropyrrol-2-carbonsäurehydrazidderivate der Formel

°2^NX7-COHII- VII

N
I

wirksam sind. Die wirksamen Derivate sind insbesondere die-. jenigen Verbindungen der allgemeinen Formel I, die u.a. am "' Anfang der Beschreibung aufgeführt sind.

^ Zu den in Betracht kommenden Phagen gehören MS2,

oo GA und Qß'Und die bevorzugten Bakterien sind Escherichia coli 'to to

""* Die erläuterte Aktivität der erfindungsgemäßen Ver- ·

ίο bindungen bezüglich der Vergrößerung des Phagenwachstumszyklus

" . BAO

zeigt die folgende Anwendung der Verbindungen: Als Reagenzien zur Erleichterung der Plaquenbildung von Viren, welche schwierig Plaquen bilden oder als Reagenzien zur Vergrößerung der Plaquenausmaße zur leichteren Beobachtung. Somit haben die Verbindungen eine beträchtliche Bedeutung auf dem Gebiet der Virus-Forschung. Ferner können die Verbindungen v/irksam zur Bereitung von Impfstoff (Vaccinia) gegen Viruserkrankungen verwendet vier den, welche eine Virusproduktion in großen Mengen erfordert, um die zum Viruswachstum erforderliche Zeit und dementsprechend die zur Impfstoffbereitung erforderliche Zeit zu verkürzen.

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1
4-IJitropyrrol-2-carbonsäurehydrazid:

1,84 g Äthyl-4-nitropyrrol-2-carboxylat wurde in 5 bis 10 ml Äthanol gelöst, und 6,2 g Ilydrazinderivat wurden hinzugegeben. Diese wurden in einem versiegelten Rohr bei 150 C während 6 bis 7 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch ximrde unter verminderten Druck zur Trockne konzentriert. Dar Rückstand wurde ausreichend mit verdünnter

009329/1883

⁸AB ORIGINAL

Essigsäure gewaschen und dann mit Wasser gewaschen und getrocknet. Urakrxstallisation aus Methanol ergab 1,1 g t des erwünschten Produktes in Form von schwach-gelblichen Kristallen mit einem Schmelzpunkt bei 263 bis 264 C.

Beispiel 2
4-Nitropyrrol-2-carbonsäurehydrazid: ^

(a) Herstellung von 4-Nitropyrrol-2-carbonsäurechloria:

1,5 g 4-Hitropyrrol-2~carbonsäure wurde in einem Ölbad während 30 bis 45 Minuten zusammen mit 11,9 g Thionylchlorid bei Rückfluß gehalten, und dann wurde überschüssiges Thionylchlorid abdestilliert, um 1,8 g des erwünschten Produktes zu erhalten.

(b) Herstellung von 4-nitropyrrol-2-carbonsäurehydrazid:

1,75 g 4-IIitropyrrol-2-carbonsäurechloricl wurden in wasserfreien Benzol gelöst, und die entstehende Lösung wurde tropfenweise zu einer Emulsion aus 1,0 g v/asser freien Hydrazin in wasserfreiem Benzol bei Raumtemperatur gegeben. Es wurden ausgefällte Kristalle durch Filtration gewonnen und mit verdünnter Essigsäure gewaschen, v/o rauf eine Wasser-' v/aschung und Trocknung folgte. Die Urikrir.tallisation aus !!ethanol ergab 1,5 g des erwünschten Produktes in Fom von schwach-gelblichen Kristallen mit einem Schmelzpunkt bei'

009829/1888 .

263° bis 264°C.

Beispiel 3

l-Methyl^-nitropyrrol^-carbonsäurehydrazid:

1,9 g Äthyl-l-methyl-^-nitropyrrol^-carboxylat . wurden in 5 bis 10 ml Äthanol gelöst, und 6,2 g Hydrazin-· hydrat wurden hinzugegeben. Diese wurden in einem versiegelten Rohr bei 15O°C während 6 bis 7 Stunden umgesetzt.« Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch . ·' unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus · Methanol umkristallisiert, wobei 1,2 g des gewünschten Produktes in Form von farblosen Kristallen mit einem Schmelz- · punkt bei 228° bis 229°C erhalten wurden.

Beispiel 4
l-Methyl-4-nitropyrrol-2-carbonsäurehydrazid ''

(a) Herstellung von l-Methyl-4-nitropyrrolcarbonsäurechlorId:

1,64 g l-Methyl^-nitropyrrol^-carbonsäure. wurden mit 11,9 g Thionylchlorid in einem ölbad während 30 bis 45 Minuten beim Rückfluß gehalten, und überschüssiges Thionylchlorid wurde abdestilliert, .wobei 1,9 g des gewünschten Produktes erhalten wurden.

009829/1888 '

(b) Herstellung von l-Methyl-'i-nitropyrrol-^-carbonsäurehydrazid: :

1,89 g l-Methyl-4-nitropyrrol-carbonsäurechlorid wurden in wasserfreiein Benzol gelöst, und die Lösung wurde tropfenweise zu einer Emulsiqn von 1,0 g wasserfreiem" Hydrazin in wasserfreiem Benzol bei Raumtemperatur unter Rühren hinzugegeben. Ausgefällte Kristalle wurden durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen, getrocknet und. " % aus Methanol umkristallisiert. Dabei wurden 2,0 g des gewünschten Produktes in Form von farblosen Kristallen mit. einem Schmelzpunkt bei 228° bis 229°C erhalten.

Beispiel 5

2-Amidinocarbamoyl-4-nitropyrrol

1,75 g 4-Nitropyrrol-2-carbonsäurechlorid wurden· in wasserfreiem Benzol gelöst, und die Lösung wurde tropfen*- weise zu einer Emulsion von 1,2 g Guanidin in wasserfreiem " Benzol bei Raumtemperatur unter Rühren zugegeben. Ausgefällte Kristalle wurden durch Filtration gewonnen, ausreichend mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus Methanol · umkristallisiert, wobei 1,6g des gewünschten Produktes in Form von schwach gelblichen Kristallen mit einem Schmelzpunkt von über 27O°C erhalten wurden. . '-.

009829/1888

Beispiel 6
2-Amidinocarbamoyl-l~methyl-4-nitropyrrol

1,89 g l~Methyl-4-nitropyrrol-2-carbonsäurechlorid wurden in wasserfreiem Benzol gelöst, und die Lösung wurde tropfenweise zu einer Emulsion aus 1,2g Guanidin in wasserfreiem Benzol bei Raumtemperatur unter Rühren zugegeben. Ausgefällte Kristalle wurden durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus Methanol umkristallisiert, wobei 1,7 g des gewünschten Produktes in Form von schwach gelblichen Kristallen mit einem Schmelzpunkt bei 219° bis 221°C erhalten wurden.

Beispiel 7
4-Nitropyrrol-2-carbonsäureisopropylidenhydrazid

1,75 g 4-Nitropyrrol-2-carbonsäurechlorid wurden · in wasserfreiem Benzol gelöst und die Lösung wurde tropfenweise zu 1,44 g Acetonhydrazon in wasserfreiem Benzol bei Raumtemperatur unter Rühren gegeben. Die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewä-" sehen, getrocknet und aus Aceton umkristallisiert, wobei ' 1,8 g des gewünschten Produktes in Form von schwach geIbIi-. chen Kristallen mit einem Schmelzpunkt bei 247° bis 248°C erhalten wurden*

009829/1888

BAD ORIGINAL. Beispiel 8

4-Nitropyrrolr2-carbonsäureisopropylidenhydra2id

1,84 g Äthyl~4-nitropyrrol-2-carboxylat und 2,2 g ' Acetonhydrazon wurden in Äthanol gelöst, und das Gemisch *- * wurde in einem versiegelten Rohr bei 150°C während 6 bis 7 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter . . μ vermindertem Druck konzentriert, und der Rückstand wurde mit verdünnter Essigsäure gewaschen, worauf eine. Wasserwaschung und Trocknung folgte. Die Umkristallisation aus-. Aceton ergab 1,0 g des gewünschten Produktes in Form von schwach gelblichen Kristallen mit einem Schmelzpunkt bei 247° bis 248°C. .' '

Beispiel 9
4-Nitro-pyrrol-2-carbonsäureisopropylidenhydrazid ; λ

1,7 g 4-Nitropyrrol-2-carbonsäurehydrazid, das gemäß der in Beispielen 1 bzw. 2 beschriebenen Methode her- ' gestellt worden war, wurden in Aceton einige Minuten lang ··. beim Rückfluß gehalten und filtriert. Das Filtrat v/urde . · zur Trockne konzentriert, und der Rückstand wurde aus Aceton umkristallisiert, wobei 1,9 g des gewünschten Produktes in Form von schwach gelblichen Kristallen mit einem Schmelz-

s 248°C erhalten
009829/1888

punkt bei 247° bis 248°C erhalten wurden.

Be'ispiel 10

l-Methyl^-nitropyrrol^-carbonsäureisopropylidenhydrazid . ·'

1,89 g l-Methyl-4-nitropyrrol-2-carbonsäurechlorid "wurden in wasserfreiem Benzol gelöst, und die Lösung wurde tropfenweise zu 1,44 g Acetonhydrazon in wasserfreiem Benzol bei Raumtemperatur unter Rühren gegeben. Ausgefällte .Kristalle wurden durch Filtration gewonnen, mit. Wasser gewaschen, getrocknet und aus Aceton umkristallisiert, wobei . 1,8 g des gewünschten Produktes in Form von schwach gelb- . liehen Kristallen mit einem Schmelzpunkt bei 210° bis 212°C erhalten wurden. · '

Beispiel 11

l-Methyl-^-nitropyrrol-^-carbonsäureisopropylidenhydrazid

1,8 g l-Methyl-4-nltropyrrol-2-carbonsSurehydrazid das gemäß der im Beispiel 3 bzw. 4 beschriebenen Methode hergestellt worden war, wurden in Aceton erhitzt, um das Hydrazid darin aufzulösen, worauf filtriert wurde. Das . . . · Filtrat wurde zur Trockne konzentriert, und der Rückstand wurde aus Aceton umkristallisiert, wobei 2,1 g des gewünschten Produktes in Form von schwach gelblichen Kristallen mit

einem Schmelzpunkt bei 210° bis 212°C erhalten wurden. ·

009829/1988 <

ORiGfNAL INSPECTED

Beispiel 12

l-Ilethyl-4-nitropyrrol-carbonsäureisopropyliden- . • hydrazid . ..

2,1 g 4-Nitropyrrol-2-carbonsäureisopropylidenhy-· " drazid, das gemäß der in Beispielen 7, 8 bzw. 9 beschrie- .· benen Arbeitsweise hergestellt worden war, wurde in wasserfreiem Äthanol, das 0,54g Natriummethylat enthielt, suspendiert. Zu der Suspension wurden 4,3g Methyljodid tropfenweise bei Raumtemperatur hinzugegeben, und das Gemisch wurde 4 bis 5 Stunden lang gerührt. Nach Beendigung der · Reaktion wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck konzentriert. Zu dem Rückstand wurden 5% Salzsäure¹ hinzugegeben. Unlösliche Bestandteile wurden durch Filtration entfernt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der Rückstand wurde Über Silicagel chromatographisch behah- ' delt und' die Säule wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Aceton und Chloroform im Verhältnis von 1:2 beschickt. Das¹ erste Eluat wurde gesammelt', und das Lösungsmittel wurde daraus destilliert. Dann wurde der Rückstand aus Aceton um - '

kristallisiert, wobei 0,51 g des gewünschten Produktes in ο

° Form von schwach gelblichen Kristallen mit einem Schmelz

punkt bei 210° bis 212°C erhalten wurden.

eo Beispiel 13

co ■ ·

** 4-Nitropyrrol-2-carbonsäure (1-phenyl) äthylidenhydraziv.".

1,7 g 4-Nitropyrrol-2-carbonsäurehydrazid,. das gemäß

-■■■■ ORIGINAL INSPECTED

der in Beispiel 1 bzw. 2 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt worden war,und 1,32 g Acetophenon wurden in Methanol . beim Rückfluß gehalten. Nachdem das System abgekühlt worden war, wurden ausgefällte' Kristalle durch Filtration ge-r sammelt und aus Methanol umkristallisiert, wobei 2,5 g des erwünschten Produktes in Form von schwach gelblichen Kristallen mit einem Schmelzpunkt bei 247° bis 249°C erhalten wurden. . · · ·

Beispiel 14

l-Methyl-4-nitropyrrol-2-carbonsäure-fc>rtho-hydroxy) benzylidenhydrazid

1,04 g l-Methyl-4-nitropyrrol-2-carbonsäurehydrazid, das nach der in Beispiel 3 bzw. 4 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt worden war, und 1,34 g Salicylaldehyd wurden in Methanol bei Rückfluß gehalten, um das Hydräzid darin zu lösen. Nachdem das System gekühlt worden war, wurden ausgefällte Kristalle durch Filtration gewonnen und aus Methanol ' umkristallisiert, wobei 2,8 g des gewünschten Produktes in Form von schwach gelblichen Nadeln mit einem Schmelzpunkt . von über 26O°C erhalten wurden.

Beispiel 15

Vergrößerungseffekt bezüglich des Plaquenausmaßes von Phage HS2 .

0,1ml einer Über Nacht gezüchteten Kulturbrühe von 009829/18IÖ

ORIGINAL INSPECTED

n.coli E102, die in Üblicher Weise erhalten worden war,und 0,1 ml eines Phagenpräparates (1000 bis 3000 p.f.u./ml), das durch Vermehrung und Verdünnung in üblicher Weise erhalten worden war, wurden mit 2,5 ml eines geschmolzenen weichen Agar-Mediums vermischt, welches die Verbindung
B, E, F bzw. H (100 pg/ml) enthielt, wobei das Medium aus · 5. g NaCl, 5,5 g Agar, 20 g Pepton, 2 g Glucose und 1000 ml destilliertem Wasser erhalten worden war und der pH des . ™ Mediums auf 7,2 mit einer wäßrigen ln-NaOH-Lösung eingestellt worden war. Das entstehende Gemisch wurde in eine Petrischale gegossen, die eine basische Agarschicht mit der Verbindung B, E, F bzv/. II bei der gleichen Konzentration wie in dem weichen Agarmedium enthielt, wobei die
Schicht aus 15 g Agar, 10 g Pepton, 5 g NaCl und 1000 ml destilliertem Wasser hergestellt worden war und deren pH auf 7,2 mit einer wäßrigen In NaOH-Lösung eingestellt'worden war. Die Bebrütung wurde bei 37°C über Nacht durchge- · | führt und die Größe der entstehenden Plaquen wurde beobachtet.

Der vorstehende Versuch wurde in der gleichen Weise mit der Ausnahme ausgeführt, daß anstelle der Verbindung eine gleiche Menge destillierten Wassers verwendet wurde, und die Größe der entstehenden Plaquen wurden beobachtet (Kontrolle). Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle I aufgeführt.

009829/1888

INSPECTED

Tabelle I

Verbindung der Probe Vergrößerung des Plaquenausmaßes

Verbindung B +

(PY 10)

Verbindung E +

Verbindung F +

Verbindung H +

+ : mehr als zweimal so groß wie der normale Plaquendurchmesser (Kontrolle).

Beispiel 16

Vergrößerungseffekt bezüglich des Plaquenausmaßes " verschiedener Phagen ·

Es wurden Versuche in der gleichen Weise wie in Beispiel 15 unter Verwendung der Verbindung B und als Phage MS2, GA bzw. Qß durchgeführt. Die Größen der entstehenden Plaquen wurden beobachtet. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II
Phage Vergrößerung des Plaquenausmaßes

MS 2 +

GA +

Oß +

+: mehr als zweimal so groß wie der normale Plaquendurchmesser (Kontrolle).

009829/1888

ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 17

Effekt der Verbindung B auf das Einstufcnwachstum von Phage MS2

In einem PGYC-Medium gezüchtete E. coli E IQ2 (bestehend aus einem Gemisch von 20 g Pepton, 5 g WaCl, 2 g Glucose, 0,255 Hefeextrakt, 0,01 Mol CaCl₂ und 1000 ml destilliertem Wasser, wobei der pH-Wert auf 7,2 mit einer (J wäßrigen ln-NaQH-Lösung eingestellt worden war) mit einer Dichte von 2,8 χ 10 Sellen/ml wurden in 2 gleiche Anteile von jeweils 4,5 ml aufgeteilt. Zu einem der Anteile wurde die Verbindung B in einer solchen Menge hinzugegeben, daß die Konzentration der Verbindung B 100 mcg/ml und das Ge-. · samtvolumen 5 ml betrug. Su dem anderen Anteil wurde der gleiche'Volumenanteil destilliertes Wasser anstelle der Verbindung B als Kontrolle hinzugegeben. Beide Anteile wurden mit Phage MS2 bei einem Infektionsvielfacheh von 1,3 in- g fiziert (das Vielfache einer Infektion ist das Verhältnis· ' von Phagenkonzentration:E. col!-Konzentration) . 5 Minutennach der Infektion wurde Phage-MS2-Antiserum (K-Wert:55OO) · · zu jedem Anteil hinzugegeben, um eine lOOfache Verdünnung des Antiserums herbeizuführen. Die Phage MS2 wurde der Wirkung dieses Antiserums 3 Minuten lang ausgesetzt, wodurch nicht infizierte Phagen MS2 inaktiviert wurden. Unmittelbar darauf wurden 0,1 ml jedes Anteils um das 10 bis 10 -fache.

009829/1888

WSPECTB)

- 33 -

verdünnt. Proben wurden hergestellt, indem man 0,1 ml jeder Verdünnung 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, · 55, 60, 70, 80, 90 bzw. 100. Minuten nach der Infektion entnahm und indem man jede Fraktion um das 10 bis 10 fache verdünnte. (Durch diese Verdünnung ging die Aktivität der Verbindung verloren). Die Plaque wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 15 hergestellt, indem man · anstelle des Phagenpräparates jeweil's die vorstehenden Proben einzeln ohne Zugabe irgendeiner der in Beispiel verwendeten aktiven Verbindungen verwendete,· Die Werte für p.f.u,/ml der in.jeder Probe enthaltenen Phage MS2 wurden durch Zählen der Anzahl der entstehenden Plaquen bestimmt. Die in Fig. 3 gezeigten Kurven wurden erhalten, indem man diese Werte auftrug. Die durch die Linie -A ~*τ· gezogene Kurve ist diejenige des Anteils, in dem die Verbin-

dung B vorhanden war, und die durch die Linie -«-·- gezogene Kurve ist diejenige des Anteils, In der anstelle der Verbindung B destilliertes Wasser eingesetzt worden war (Kontrolle).

Beispiel 18

Effekt der Verbindung B auf die Produktion von intrazellularen Phagen.

Es wurden Plaquen in der gleichen Weise wie in Beispiel 17 gebildet, jedoch mit der Ausnahme, daß Proben aus jedem Anteil 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5, 30,

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ORIGINAL INSPECTED

32,5, 40 bzw. 60 Minuten nach der Infektion entnommen wur-. den und 0,9· ml eines Auflösungsgemisches /0,7 ml eines 1/20 m-Tris-HCl Puffers (pH = 8,0), 0,1 ml einer Lysozymr' lösung (2 mg/ml), 0,1 ml EDTÄ (40 mg/ml) und 2 Tropfen Chloroform/ zu 0,1 ml jeder Probe direkt nach der Probe- · nähme zugegeben wurde, worauf die Zellenauflösung bei 37 C 10 Minuten lang erfolgte. Die p.f.u./ml-Werte von Phage MS2, das in jeder Probe vorhanden war, wurden durch Zählen der Anzahl von gebildeten Plaquen bestimmt. Die in Fig. 4 gezeigten Kurven wurden durch Auftragen dieser Werte erhalten. Die durch die !Linie -*-*- gezogene Kurve ist diejenige des Anteils, in dem die Verbindung B vorhanden war und die' ■ durch die Linie -·-·- gezogene Kurve ist diejenige des Anteils, in dem anstelle der Verbindung-.B destilliertes Wasser eingesetzt wurde (Kontrolle).

Beispiel 19 .

Es wurden Tabletten, von denen jede folgende Bestandteile enthielt, durch die übliche Tablettenherstellungsmethode bereitet: . ·

l-Methyl-4-nitropycrol-2-

carbonsSureh* ^"^zLd ............ 200 mg Avicel (mikr .1 rtHtalline Cellulose ... 50 mg Haisstärke ...-.„ 46 mg

Kolloidale Kieselsäure mit hydroly-

sicrter Stärke 2 rag

riagnesiumstearac ..., ,« 2 ng

009828/18SS £?· 3^:oo mg ·

Claims

- 40 Patentansprüche

4-Nitropyrrol-2-carbonsäureamidderivate der allgemeinen Formel I ·

R °

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe · mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen darstellt und R₁ eine Amino-, Amidino- oder -U=C^_n2 -Gruppe darstellt, R₂ und R, gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Phenylr oder ' eine substituierte Phenylgruppe darstellen.

2. 4-Hitropyrrol-2~carbonsäureamidderivate nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel I, in der R ein Wasserstoffatom oder eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellt und R₁ eine Amino-, Amidino- oder -U=C 2 -Gruppe."

^Sr3 ' ' bedeutet, R₂ und R, gleich oder verschieden sein können . . und ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppo mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Phenyl- oder substituierte Phonylgruppe bedeuten, wobei dar Substituent in der Phenylgruppe eine Hydroxyl-, Carboxyl-, geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen,

ORIGINAL INSPECTED

eine geradkettige oder verzweigte Alkoxygruppe mit 1 bis Kohlenstoffatomen, ein Ilalogenatom oder eine Nitrogruppe' ist. ·

.3. 4-Nitropyrrol-2-carbonsäureamidderivate nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet, durch die allgemeine Formel I, worin R Wasserstoff oder eine · Methylgruppe bedeutet und R. eine Amino-, eine Amidino-,' eine N-Isopropylidenamirio-, eine N-(l-PhenyDäthylidenaini'-no- oder eins N- (ortho-IIydroxy) benzylidenaminogruppe darstellt. · ..

4. Verfahren zur Herstellung der 4-lIitropyrrol-2-carbonsäureamidderivate gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche," dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II

₂TTI

² V/*C-R« \ II

R °

worin R die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt und R' ein Halogenatom oder eine Alkoxygruppe mit' 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellt, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III

-R₁ III. ·

009829/1888

worin R. die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt, umsetzt. ■

5. Verfahren nach Anspruch.4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit einer Verbindung der Formel II, in der R¹ ein Halogenatom darstellt, in einem organischen Lösungsmittel, das unter den Reaktionsbedingungen inert ist, bei Temperaturen im Bereich von 0⁰C bis Raumtemperatur aus* führt. ' - · -

6. Verfahren nach einen der Ansprüche 4 oder 5/ dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II, in der R' eine Alkoxygruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellt, in einem Lösungsmittel, das unter den Reaktionsbedingungen inert is.t, bei erhöhtem Druck und bei Temperaturen im Bereich 100 bis' 200⁰C ausführt. ' , * ·

7.. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, entsprechend der allgemeinen Formel

ON-·—π R₉ '

- ² V-^-G-NHN=C Γ ^ Ia

^N " R
¹ O -3

R ^{U J}

worin,R, R₂ und R₃ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen,

dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der all-

009828/1888

gemeinen Formel Ib

ORIGINAL INSpECTEi

Ib

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen darstellt, mit einerVerbindung der allgemeinen Formel IV

> C=O . IV R₃

worin R₂ und R₃ gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Phenyl- oder substituierte Phenylgruppe darstellen, umsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich-' ' net, daß man die Umsetzung zwischen den Verbindungen Ib und IV, in denen R ein Wasserstoffatom oder eine geradkettige ' oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist, bzw. R₂ und R₃ gleich oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte Alkfrlgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Phenyl- oder· substituierte Phenylgruppe ^sdeutet, wobei der Substituont in der Phenylgruppe ei" . ^y-. v-oxy!=-, Carboxyl-, geradkettige oder verzweigte Alkyl^i.', ^** mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen · eine geradkettige oder vfci.-^ reigte Alkoxygrup_t:·i mit 1 bis 5 'Kohle*.-* off atomen, 1 IIa,„ "anat^m oder aine Nitrogruppe darstellt

- 44 -

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß nan die Umsetzung mit einer Verbindung der allgemeinen Formel Ib, in der R Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeutet und einer Verbindung der Formel IV, in der · R₂ und R₃ jeweils eine Methylgruppe darstellen oder eine dieser Gruppen eine Methylgruppe und die andere eine Phenylgruppe bedeutet oder eine der Gruppen Wasserstoff und die andere eine ortho-Hydroxyphenylgruppe darstellt, vornimmt..

10. Verfahren nach einem der Ansprache 7 bis 9,

dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in einem L8-_ sungsmittel, das unter den Reaktionsbedingungen iner"t ist und bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 80°C ausführt.

11. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Ansprüchen 1 bis 3, entsprechend der allgemeinen Formel Ia¹

0 Hip-T| ^R

^ \/ - C-NIIN=C _N ^Δ Ia¹ "it r>

R ° ³

^K4 '

worin R- und R_ gleich oder verschieden sein kön-

<o nen und jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- ■

κ> gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Phenyl— ^ oder substituierte Phenylgruppe darstellt und

C₀ R₄ eine Alkylgruppe mit 1 bis 0 Kohlenstoffatomen

darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Ver-

BAD ORlGiNAU

bindung der allgemeinen Formel Ia"

₀j^ ,₂

² \/*· C-HmJ=C C ² Ia"

"R

· 0 ^R3

worin R₂ und R₃ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, ~~ mit einer Verbindung der allgemeinen Formel V

R₄-Y

worin R. die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt und Y ein Halogenatom, einen Schwefelsäurealkylesterrest oder einen Toluolsulfonsäureesterrest darstellt, umsetzt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung Ia" verwendet, in der die Gruppen R- und R₃ gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte Alky!gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Phenyl- oder eine substituierte Phenylgruppe darstellen, wobei der Substituent in der Phenylgruppe eine Hydroxyl-, Carboxyl-, geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine ·

J₀ geradkettige oder verzweigte Alkoxygruppe mit 1 bis 5 Kohlen-

ro stoff atomen, ein Ilalogenaton oder eine Nitrogruppe darstellt. ■ so

2£ 13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeieh-

net, daß man die Umsetzung zwischen den Verbindungen Ia"

und V, in denen die Gruppen R₂ und R- jeweils eine Methyl- . gruppe darstellen oder eine der Gruppen eine Methylgruppe und die andere eine Phenylgruppe ist oder eine der Gruppen . Wasserstoff und die andere eine ortho-Hydroxyphenylgruppe ist und R. eine Methylgruppe ist, vornimmt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in wasserfrei-· em Alkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in Gegenwart eines Alkalialkoxyds bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 80°C vornimmt.

15. Verwendung der .4-Nitropyrrol-2-carbonsäureamidderivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 als Wirkstoff in Präparaten, vermischt mit pharmazeutisch akzeptablen anorganischen oder organischen ' festen oder flüssigen Trägern.

16. Verwendung der 4-Nitropyrrol-2-carbonsäureamidderivate gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, entsprechend der allgemeinen Formel

°2^N 1.^-CONH- VII '

• ι

zur Züchtung von Zellen in einem Kulturmedium in an sich bekannter Weise, Beimpfung des Mediums mit Viren, Züchtung der Viren unter Förderung des Freisetzens der Viren aus

den Zellen.

009829/1888

SAD ORT(GlNAL

17. Verwendung nach Anspruch 16, mit Mikroorganismen als Zellen und mit Phagen als Viren.

18. Verwendung nach Anspruch 17 mit Escherichia coli als Zellen und mit Phagen als Viren.

009829/1888

ORIGINAL INSPECTED

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