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Verfahren zur Herstellung eines anabolen Beifuttermittels Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen anabolen Beifuttermittels durch
Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Gibberella in Gärmedien. Für die Aufzucht
fleischerzeugender Tiere wurden verschiedene Mittel entwickelt, um die Wachstumsrate
solcher Tiere zu steigern. Viele dieser Mittel, darunter gewisse anabole Östrogene,
wie Diäthylstilböstrol, haben jedoch im praktischen- Gebrauch Nachteile, wie Giftigkeit,
unerwünschte Nebenwirkungen, und bereiten Schwierigkeiten bei der Verabreichung.
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Es ist bekannt, als wachstumssteigerndes Beifuttermittel ein Gemisch
eines Nährstoffverdünnungsmittels und des Mycelkuchens von Gibberella fujikuroi
oder Gibberellin zu verwenden, das bei der Züchtung von Gibberella fujikuroi isoliert
werden kann, doch ergeben diese Beifuttermittel nur eine relativ geringe prozentuale
Verbesserung in der Futterumwandlung.
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Es wurde nun eine anabole und östrogene Zusammensetzung gefunden,
die nicht nur die Steigerung der Wachstumsrate bei fleischerzeugenden Tieren in
wesentlich stärkerem Maße fördert, sondern auch in wirtschaftlicher Weise und ohne
Schwierigkeiten sowie ohne Nebenwirkungen verabreicht werden kann.
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Das Verfahren zur Herstellung dieses aus einem flüssigen Gärmedium
bestehenden, anabolen Beifuttermittels durch Züchtung von Mikroorganismen der Gattung
Gibberella in Gärmedien nach der Erfindung besteht darin, daß der Mikroorganismus
Gibberella zeae (Gordon) NRRL-2830 bei einer Temperatur von etwa 22 bis 32°C und
bei einem pH-Wert des Gärmediums von etwa 3,5 bis 8,5 unter aeroben Bedingungen
auf einem ein Getreide enthaltenden Nährboden gezüchtet wird.
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Der Organismus wurde aus Mais isoliert, und die Kultur wurde durch
mehrere Isolierungen einzelner Kolonien gereinigt. Im folgenden wird die Morphologie
des Organismus beschrieben, der auf Czapeks Dextroseagar von der in Tabelle I angegebenen
Zusammensetzung gewachsen war:
| Tabelle I |
| Czapeks Dextrose-Agar g/1 |
| Natriumnitrat.................... 2,0 |
| Kaliumchlorid ................... 0,5 |
| Magnesiumsulfat ................ 0,5 |
| Ferrosulfat...................... 0,01 |
| Saures Kaliumphosphat .......... 1,0 |
| Dextrose........................ 50,0 |
| Agar ........................... 15,0 |
aufgefüllt auf 1000 ml mit destilliertem Wasser. Der Organismus ist ein rasch wachsender
Fungus, der einen Koloniedurchmesser von 9 cm in 4 Tagen bei 22 bis 25°C erreicht.
In diffusem Licht oder in der Dunkelheit entwickelt sich ein ausgedehntes baumwollartiges
Luftmycel, und das Koloniezentrum zeigt eine dunkelgelbe Farbe, die gegen die Kolonieperipherie
in Rosa oder Weiß übergeht. Unter einer Beleuchtungsstärke von 450 Fuß Kerzen Fluoreszenslicht
ist die Kolonie dunkler gelb bei geringerem Luftmycel.
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Die Erzeugung von Macroconidia ist selten in der Dunkelheit und übermäßig
im Licht. Die Macroconidia werden in schleimigen Massen geboren, deren Länge im
Bereich von 7,6 bis 44 #t schwankt, und sie enthalten null bis fünf Septationen
mit einer gut definierten Fußzelle. Die Breite der Macroconidia ist konstanter und
liegt im Bereich von 2,5 bis 5 #t, im allgemeinen bei ungefähr 4,5 #t. Die Macroconidia
sind gekrümmt mit drei bis vier Septationen mit einer Länge von 30 bis 40 p,. Chlamydosporen
sind eingestreut und selten.
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Perithecia werden in der Kultur unter normalen Lichtbedingungen in
3 Wochen spärlich erzeugt. Die Perithecia ist schwarz und elliptisch mit einem Durchmesser
von 220 - 170 #t. Asci innerhalb der Perithecia sind gestreckt (50 bis 60 p, lang
und 6,6 #t breit). Asosporen sind gerade oder schwach gebogen mit drei Septationen
und glasartig. Die Ascosporen sind
19 bis 22 #t lang und 2 p, breit
und an den Enden zugespitzt.
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Die neue anabole Substanz wird durch Brüten der Sporen des vegetativen
Mycels des neuen Organismus in einem geeigneten Impfmedium und. darauf Einführung
des microorganismenhaltigen Impfmediums in ein Gärmedium; das eines der üblichen
Getreide, wie Mais, Hafer, Weizen oder Gerste, als Kohlenhydratquelle enthält, hergestellt.
Vorzugsweise benutzt man dabei Mais.
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Vorteilhafterweise wird die Gärung bei 25 bis 28°C unter Ausschluß
von Licht durchgeführt. Obgleich flüssige Gärmedien in zufriedenstellender Weise
verwendet werden können, benutzt man vorzugsweise einen mit Wasser gedämpften, im
wesentlichen festen Nährboden, der einen pH-Wert von etwa 5,0 bis 7,6 aufweist.
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Im allgemeinen kann unter den obigen Bedingungen eine geeignete Ausbeute
an anaboler Substanz innerhalb eines Zeitraumes von 6 bis 20 Tagen erhalten werden.
Je nach der Lebenskraft des Organismus kann diese Periode jedoch etwas länger oder
kürzer sein.
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Die so hergestellte anabole Substanz kann dann Tieren nach bekannten
Methoden, wie oral oder parenteral, verabreicht werden. Beispielsweise kann das
Gärmedium nach der Gärperiode mit gewöhnlichem Futter verschnitten und dieses unmittelbar
den Tieren verfüttert werden. Auch kann die anabole Substanz in einem geeigneten
Injektions-Suspensionsmedium, wie Erdnußöl, suspendiert und parenteral injiziert
werden.
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Vorteilhafterweise wird die anabole Substanz durch Extraktion aus
dem Nährboden abgetrennt. Hierzu wird vorzugsweise das Gärmedium zunächst mit Äthanol,
zweckmäßig von etwa 950/0 Konzentration, extrahiert und dann der Extrakt
mit der anabolen Substanz konzentriert. Das Konzentrat wird dann in Chloroform aufgelöst
und wiederum mit einer Natriumcarbonatlösung, vorzugsweise von einer Konzentration
von etwa 5 °/o, etwa auf einen pH-Wert von 9 bis 12, vorzugsweise aber etwa 11,2,
eingestellt und extrahiert. Der pH-Wert des Natriumcarbonatextraktes wird dann mit
Salzsäure auf etwa 6,0 bis etwa 6,5 eingestellt, um das feste unreine anabole Material
auszufällen. Um möglichst viel Niederschlag zu erhalten, wird eine pH-Einstellung
auf etwa 6,2 bevorzugt. Dieser unreine Niederschlag wird dann mit Äther extrahiert
und anschließend getrocknet, um ein trockenes, festes Material zu erhalten, das
zur Verfütterung an Vieh geeignet ist. Wenn ein Material höherer Reinheit erwünscht
ist, kann die nach obigen Angaben erhaltene trockene feste anabole Substanz einer
Mehrfachübertragung und Gegenstromverteilung unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittelsystems
unterzogen und der aktive Bestandteil nach der Craig-Methode (Techniques of Organic
Chemistry, Bd. 3, Kapitel 4, 2. Ausgabe, herausgegeben von A. W e i s s b e r g
e r, Interscience Publications Incorporated) abgetrennt werden. Diese Methode besteht
im wesentlichen darin, daß man in einer jeweils vorgeschriebenen Anzahl von Rohren,
von denen das erste eine bestimmte Menge des zu trennenden und zu identifizierenden
Materials enthält, eine festgelegte Menge eines Lösungsmittel. systems als untere
Phase einbringt, dann in das erste Rohr eine Lösungsmittelmenge als obere Phase
gleich der Menge der unteren Phase im ersten Rohr zugibt, die beiden Phasen im ersten
Rohr innig durchmischt und sie sich wieder trennen läßt, dann die obere Phase in
ein zweites Rohr überführt, worauf eine identische Menge frischen Lösungsmittelsystems
der oberen Phase wiederum dem ersten Rohr zugegeben wird. Diese Behandlung wird
für eine gewünschte Anzahl von Rohren fortgesetzt. Das Rohr, das die größte Menge
aktives Material enthält, wird ermittelt, wobei man eine physikalische Konstante
erhält, die als Arbeitskoeffizient bezeichnet wird. Der Arbeitskoeffizient wird
unter Benutzung der folgenden Formel berechnet:
Hierin ist K der Arbeitskoeffizient, N die Gesamtzahl von Überführungsrohren, die
im System benutzt werden, und n die Zahl des Rohres, in welchem sich das aktivste
Material befindet.
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Bei Anwendung der Gegenstromverteilungsmethode zur Reinigung der neuen
anabolen Substanz nach der Erfindung kann man jedes geeignete Lösungsmittelsystem
gebrauchen, das einen einfachen Verteilungskoeffizienten von nicht weniger als 0,2
und nicht mehr als 5,0 hat. Als einfacher Verteilungskoeffizient kann das Verhältnis
der Menge des Materials, die in der oberen Phase des Lösungsmittelsystems aufgelöst
wird, zu der Menge, die sich in der unteren Phase befindet, bezeichnet werden. Unter
den Lösungsmittelsystemen, die sich als brauchbar erwiesen haben, ist besonders
vorteilhaft ein System, das eine untere Phase, die im wesentlichen aus 2 Volumteilen
CHCl$ und 2 Volumteilen CC14, und eine obere Phase, die im wesentlichen aus 3 bis
4 Volumteilen CH30H und 1 bis 2 Volumteilen HZO besteht, enthält.
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Bei Benutzung der Craig-Reinigungsmethode mittels hundert Rohren,
wie oben beschrieben, eines Lösungsmittelsystems aus 2 Teilen Chloroform und 2 Teilen
Tetrachlorkohlenstoff als untere Phase und 4 Teilen Methanol und 1 Teil Wasser als
obere Phase, der durch Züchtung des Organismus Gibberella zeae (Gordon) NRRL-2830
auf einem mit Wasser gedämpften Mais erhaltenen, trockenen anabolen Substanz, die
durch Extraktion des Mediums mit Äthanol, Konzentrierung des Extraktes, Auflösung
in Chloroform, Extraktion mit wäßrigem Natriumcarbonat, pH-Einstellung mit Salzsäure
zur Ausfällung eines festen Produktes gewonnen ist, das dann mit Äther extrahiert
und wie oben beschrieben, getrocknet wird, erhält man einen einfachen Verteilungskoeffizient
von 0,4 und einen Arbeitskoeffizienten von 0,54.
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Die gereinigte anabole Substanz ist sehr leicht löslich in Methylenchlorid,
Äthanol, Butylacetat, 1,4-Dioxan und - Äthyläther, löslich in Methanol; Butanol,
Chloroform und Aceton, schwach löslich in Hexan, Petroläther und Heptan und unlöslich
in Dimethylformamid und Wasser.
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Die anabole Substanz gibt eine negative Ninhydrinreaktion, wenn sie
auf Cellulose getrocknet wird, und wird leicht auf Tonerde aus einer Methylenchloridlösung
absorbiert. .
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Ultraviolette Absorptionsuntersuchungen sind an einer Methanollösung
des Östrogens durchgeführt worden. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Materials
ist in F i g. 1 gezeigt. Die Kurve zeigt Absorptionsmaxima bei 236, 274 und 313
m#t und Absorptionsminima bei 255 .und 300 m#t.
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Eine Lösung der anabolen Substanz vom pH-Wert 6,0, bestehend aus 2
Teilen Chloroform, 2 Teilen
Tetrachlorkohlenstof% 3 Teilen Methanol
und 2 Teilen Wasser ergibt bei Bestrahlung mit hochintensivem, ultraviolettem Licht
eine leuchtende, grünlichblaue Fluoreszens.
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Das Infrarotspektrum der neuen anabolen Substanz, mit Kaliumbromid
zu Pillen verpreßt, ist in F i g. 2 wiedergegeben. Die folgende Tabelle II zeigt
die Infrarotabsorptionscharakteristiken der neuen anabolen Substanz.
| Tabelle II |
| Infrarotabsorptionsspektrum in Micron |
| 3,04S 7,15 Sh 9,05 W 11,13 W |
| 3,31 W 7,25 W 9,25 Sh 11,34 W |
| 3,44S 7,39 W 9,31 W 11,45 W |
| 3,50 Sh 7,62M 9,5 W 11,76M |
| 5,88 Sh 7,94S 9,55 Sh 12,05 W |
| 5,93S 8,10 Sh G 9,65 Sh 12,38 W |
| 6,07M 8,20 W 9,73 Sh 12,53 V. W. |
| 6,20 W 8,36M 9,83 W 12,68 W |
| 6,34M 8,57M 9,94 Sh 13,05 W |
| 6,70 Br 8,76 W 10,31M 13,63M |
| 6,85 W 8,88 Sh 10,54 W 14,21M |
| 6,96 W 8,96 W 10,73 V. W. 14,57 V. W. |
| S = Starke Absorption Sh = Schulter |
| M = Mittlere Absorption Br = Breite Absorption |
| W = Schwache Absorption V. W. = Sehr schwach |
Die anabole Substanz besitzt einen Schmelzpunkt von 164 bis 165°C und hat die folgende
optische Drehung in Methanol: [a]ö = -109,5°. Sie ist ein wirksames Material zur
Wachstumsförderung beim Gebrauch in der tierischen Ernährung. Die folgende Tabelle
III zeigt die Ergebnisse von Wachstumsuntersuchungen unter Benutzung von acht Hammeln,
die mit einer handelsüblichen Ration 48 Tage lang gefüttert wurden. Die mittlere
tägliche Gewichtszunahme dieser Hammel betrug 0,122 kg.
| Tabelle III |
| Anfangsgewicht der Endgewicht nach |
| Hammel ohne Injektion Beendigung des |
| der anabolen Substanz 28tägigen Versuches |
| Pfund I kg Pfund I kg |
| 74,0 33,6 74,5 33,8 |
| 65,0 29,5 72,5 32,9 |
| 61,0 23,1 66,0 29,9 |
| 69,0 31,3 78,0 35,4 |
| 71,5 32,4 84,0 38,1 |
| 72,5 32,9 79,0 35,8 |
| 76,0 34,5 83,0 37,6 |
| 77,0 34,9 88,5 40,2 |
| 70,8 im Mittel I 31,9 I 79,4 im Mittel I 36,0 |
Tabelle IV zeigt die Ergebnisse von Hammelwachstumsuntersuchungen unter Benutzung
desselben Handelsfutters wie bei den Hammeln in Tabelle III, jedoch unter zusätzlichen
täglichen subkutanen Injektionen von 33 Einheiten der neuen anabolen Substanz während
28 Tagen. Eine Einheit der anabolen Substanz ist die Menge hiervon, die erforderlich
ist, um eine Wirkung entsprechend 1 Microgramm Diäthylstüböstrol zu ergeben. Die
mittlere tägliche Gewichtszunahme dieser mit der neuen anabolen Substanz behandelten
Hammel betrug 0,172 kg, was eine 40°/oige Verbesserung in der Gewichtszunahme gegenüber
den Hammeln der Tabelle III bedeutet.
| Tabelle IV |
| Anfangsgewicht von |
| Hammeln, die täglich Endgewicht am Ende des |
| mit 3 Einheiten anaboler 28tägigen Versuches |
| Substanz injiziert wurden |
| Pfund I kg Pfund I kg. |
| 68,0 30,8 75,0 34;0 |
| 66,0 29,9 80,5 36,5 |
| 70,0 31,7 81,0 36,7 |
| 71,5 32,4 81,5 37,0 |
| 74,0 33,6 86,0 39,0 |
| 77,0 34,9 93,5 42,4 |
| 79,5 36,1 82,0 41,7 |
| 71,6 im Mittel I 32,5 82,8 im Mittel 37,5 |
Die mittlere Futterumwandlung der acht Hammel, denen keine anabole Substanz verabreicht
wurde, betrug 4,66 kg Futterverbrauch je 0,45 kg Gewichtszunahme, während die mittlere
Futterumwandlung für die Hammel, denen die anabole Substanz verabreicht war, 3,66
kg Futterverbrauch je 0,45 kg Gewichtszunahme betrug.
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Das folgende Beispiel.dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel Eine Sporensandkultur, die Gibberella zeae (Gordon) NRRL-2830 enthielt,
wurde aseptisch in ein steriles Rohr gebracht, das 15 ml Czapeks-Dox-Lösung und
eine kleine Menge Agar enthielt. Dieses Medium wurde dann etwa 168 Stunden bei ungefähr
25°C bebrütet. Am Ende der Brütperiode wurde das Medium mit 5 ml sterilem entionisiertem
Wasser gewaschen und in ein steriles Rohr übergeführt, das 45 ml Czapeks-Dox-Lösung
enthielt. Der Inhalt des Rohres wurde dann etwa 96 Stunden bei ungefähr 25°C bebrütet,
worauf das Material zum Gebrauch bei der Impfung eines Gärmediums verfügbar war.
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In einen 2-1-Kolben wurden 300 g feinverteilter Mais gegeben. Der
Kolben und sein Inhalt wurden dann sterilisiert und darauf mit 150 ml sterilem,
entionisiertem Wasser versetzt. Die Mischung in dem Kolben wurde dann mit 45 ml
Impfe, die wie oben hergestellt war, versetzt, und das Material wurde innig durchmischt.
Das gemischte Material wurde dann etwa 20 Tage bei 25°C in einem dunklen Raum in
mit Wasser gesättigter Atmosphäre bebrütet.
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Ein Anteil des so hergestellten vergorenen Materials von 300 g wurde
in 500 ml entionisiertem Wasser aufgeschlämmt. Der Brei wurde dann etwa 15 Minuten
auf 75°C erhitzt, 300 g Filterhilfsmittel wurden zugegeben, und das Material wurde
filtriert. Das feste filtrierte Material mit der anabolen Substanz wurde dann an
Luft getrocknet, und 333 g des getrockneten Kuchens wurden mit 500 ml Äthanol extrahiert.
Dieses Verfahren wurde noch dreimal wiederholt. Der Äthanolextrakt wurde dann unter
Vakuum getrocknet, um 6,84 g festes Material zu ergeben. Dieses feste Material wurde
dann in 20 ml Chloroform aufgelöst und mit 30 ml einer wäßrigen Lösung extrahiert,
die 5 Gewichtsprozent Natriumcarbonat enthielt und auf einen pH-Wert von etwa 11,2
eingestellt war. Das Extraktionsverfahren wurde noch siebenmal
wiederholt.
Der pH-Wert des Natriumcarbonatextraktes wurde dann mit Salzsäure auf 6,2 eingestellt,
um einen die anabole Substanz enthaltenden Niederschlag zu liefern. Der Niederschlag
und der wäßrige Natriumcarbonatextrakt wurden dann jeder für sich wiederum mit 75
ml Äthyläther extrahiert. Diese Maßnahme wurde noch dreimal wiederholt, um eine
hellgelbe ätherische Lösung zu ergeben, die darauf getrocknet wurde und 116 mg feste
anabole Substanz ergab. Dieses Material wurde darauf der Mehrfachübertragung und
Gegenstromverteilung unter Benutzung von 100 Rohren und eines Lösungsmittelsystems
unterzogen, das aus 2 Volumteilen Chloroform und 2 Volumteilen Tetrachlorkohlenstoff
als untere Phase und 4 Volumteilen Methanol und 1 Volumteil Wasser als obere Phase
bestand. Das hierbei erhaltene feste Material wurde dann auf seine physiologische
Aktivität nach dem bekannten Maus-Uterin-Test untersucht. Bei der Durchführung bestand
der Maus-Uterin-Test in der Verfütterung festen Materials, das durch Trocknung von
5 ml der oberen Phase und 5 ml der unteren Phase aus jedem der ausgewählten Rohre
erzeugt war, und zwar wurde ein Standardfutter von 75 g an fünf Mäuse während eines
Zeitraumes von 5 Tagen. verfüttert; während dieser Periode war das ganze Futter
verbraucht. Am Ende des Zeitraumes wurden die Tiere gewogen, und die Uteri wurden
entfernt und gewogen. Ein positives Ansprechen auf den Versuch wurde mit dem physiologisch
aktivsten Material hervorgerufen, das in- den Rohren 30 bis 40 enthalten war. Dieses
aus den Rohren 30 bis 40 gesammelte feste Material wog 59 mg.