<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Gewinnung von Chlortetracyclin und/oder Tetracyclin
EMI1.1
<Desc/Clms Page number 2>
logische und physiologische Wirkung von den bereits bekannten. In der beigefügten Tabelle sind die Ergebnisse der charakteristischsten Unterschiede zusammengefasst. Es wird der Streptomyces lusitanus mit Streptomyces rimosus, platensis, aureofaciens und viridifaciens verglichen. Die angegebenen Nährflüssigkeiten haben die gleiche Zusammensetzung wie die in der USA-Patentschrift Nr. 2, 886, 595 und in der kanadischen Patentschrift Nr. 520 836 bzw. der brit. Patentschrift Nr. 713, 795 beschriebenen.
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
<tb>
<tb>
Glycerin-Asparagin <SEP> Czapek-Dox-Agar <SEP> Glucose-Asparagin <SEP> Czapek-Dox-Dextrin <SEP> Nähr-Agat <SEP> gequollener <SEP> Purpurmilch
<tb> Agar <SEP> Agar <SEP> Agar <SEP> Mais-Agar <SEP> "Difco"
<tb> Streptomyces <SEP> G <SEP> : <SEP> keine <SEP> G <SEP> : <SEP> keine <SEP> G <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> keine <SEP> Peptonisierung
<tb> rimosus <SEP> gut <SEP> gutes <SEP> Wachstum
<tb> AH <SEP> : <SEP> weisslich <SEP>
<tb> Sp <SEP> sehr <SEP> schlecht <SEP>
<tb> DP <SEP> fast <SEP> gelb
<tb> Streptomyces <SEP> G <SEP> : <SEP> gut <SEP> G <SEP> : <SEP> mässig <SEP> G <SEP> : <SEP> mässig <SEP> G <SEP> : <SEP> gut <SEP> PH <SEP> schwach <SEP> alkaplatensis <SEP> AH <SEP> : <SEP> gut <SEP> AH <SEP> : <SEP> dito <SEP> ; <SEP> weiss, <SEP> AH <SEP> : <SEP> ohne <SEP> lisch
<tb> Sp <SEP> : <SEP> schwer <SEP> grau <SEP> und <SEP> Sp <SEP> :
<SEP> ohne <SEP> sehr <SEP> langsame
<tb> DP <SEP> : <SEP> keine <SEP> schwarz <SEP> im <SEP> Dp <SEP> : <SEP> schwach <SEP> Peptonisierung
<tb> R <SEP> : <SEP> tief <SEP> olive <SEP> Mosaik <SEP> braun <SEP> Wachstum <SEP> kärgSp <SEP> : <SEP> mässig <SEP> R <SEP> : <SEP> cremgelb <SEP> lich <SEP>
<tb> DP <SEP> : <SEP> schwach
<tb> braun <SEP> oder
<tb> ohne
<tb> Streptomyces <SEP> G <SEP> : <SEP> befriedigend <SEP> G <SEP> : <SEP> dünn <SEP> bis <SEP> G <SEP> : <SEP> gut <SEP> G <SEP> : <SEP> reich-keine <SEP> pH-Ände- <SEP>
<tb> aureofaciens <SEP> bis <SEP> gut <SEP> befriedigend <SEP> AH <SEP> : <SEP> befriedi-lich <SEP> rung
<tb> AH <SEP> : <SEP> weiss <SEP> AH <SEP> : <SEP> dünn <SEP> gend <SEP> AH <SEP> : <SEP> gut <SEP> keine <SEP> Peptonisierung
<tb> Sp <SEP> : <SEP> schwach <SEP> Sp <SEP> : <SEP> sehr <SEP> schlecht <SEP> Sp <SEP> :
<SEP> befriedi <SEP> - <SEP> Sp <SEP> : <SEP> sehr <SEP> Wachstum <SEP> gut
<tb> Dp <SEP> : <SEP> gelb <SEP> DP <SEP> : <SEP> keine <SEP> gend <SEP> gut
<tb> R <SEP> : <SEP> gelb <SEP> bis <SEP> R <SEP> : <SEP> farblos <SEP> DP <SEP> : <SEP> strohgelb <SEP> DP <SEP> : <SEP> grün- <SEP>
<tb> olive <SEP> lich
<tb> gelb
<tb> R <SEP> : <SEP> braun
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
<tb>
<tb> Glycerin-Asparagin <SEP> Czapek-Dox-Agar <SEP> Glucose-Asparagin <SEP> Czapek-Dox-Dextrin <SEP> Nähr-Agar <SEP> gequollener <SEP> Purpurmilch
<tb> Agar <SEP> Agar <SEP> Agar <SEP> Mais-Agar"Difco"
<tb> Streptomyces <SEP> G <SEP> : <SEP> gut <SEP> G <SEP> : <SEP> befriedigend <SEP> G <SEP> : <SEP> befriedi-alkalischer <SEP> PH <SEP> mit
<tb> viridifaciens <SEP> AH <SEP> : <SEP> gut <SEP> bis <SEP> gut <SEP> gend <SEP> bis <SEP> Peptonisierung
<tb> Sp <SEP> :
<SEP> gut <SEP> AH <SEP> : <SEP> gut <SEP> gut <SEP> sehr <SEP> gutes <SEP> WachsDP <SEP> : <SEP> gelblich <SEP> grün <SEP> Sp <SEP> : <SEP> gut <SEP> AH <SEP> : <SEP> keine <SEP> turn
<tb> R <SEP> : <SEP> braun <SEP> DP <SEP> : <SEP> keine <SEP> Sp <SEP> : <SEP> keine
<tb> R <SEP> : <SEP> schwach <SEP> DP <SEP> : <SEP> zimtbraun <SEP> farben
<tb> R <SEP> : <SEP> schwach
<tb> gelb
<tb> Streptomyces <SEP> G <SEP> : <SEP> dünn <SEP> G <SEP> : <SEP> keine <SEP> G <SEP> : <SEP> dünn <SEP> G <SEP> : <SEP> ohne <SEP> G <SEP> : <SEP> reichlich <SEP> G <SEP> : <SEP> sehr <SEP> kein <SEP> Wachstum
<tb> lusitanus <SEP> AH <SEP> : <SEP> weiss <SEP> AH <SEP> : <SEP> ohne <SEP> AH <SEP> : <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Sp <SEP> : <SEP> dünn <SEP> Sp <SEP> : <SEP> ohne <SEP> Sp <SEP> : <SEP> sehr <SEP> gut <SEP> AH <SEP> : <SEP> sehr
<tb> DP <SEP> : <SEP> milchig <SEP> rosa <SEP> DP <SEP> :
<SEP> rosa <SEP> DP <SEP> : <SEP> bräun- <SEP> gut
<tb> R <SEP> : <SEP> farblos <SEP> R <SEP> : <SEP> braun <SEP> lichrot <SEP> SP <SEP> : <SEP> sehr
<tb> R <SEP> : <SEP> sehr <SEP> gelb <SEP> gut.
<tb> gleichmässig
<tb> DP <SEP> : <SEP> orange
<tb> R <SEP> : <SEP> rotbraun, <SEP>
<tb> dann
<tb> bronze
<tb>
Abkürzungen : G : Wachstum der Kolonie
AH : Wachstum und/oder Farbe belüfteter Hyphase Sp : Sporenbildung
DP : diffusibles Pigment
R : Reversion der Kolonie
<Desc/Clms Page number 5>
Die einfache Tatsache, dass Streptomyces lustianus nicht auf"Czapek-Dox-Agar","Czapek-Dox- Dextrin-Agar"oder"Purpurmilch" (Difco) wächst, reicht bereits zum Beweis dafür aus, dass der erfindungsgemäss verwendete Streptomyces-lusitanus-Stamm zu einer neuen Gattung gehört.
Streptomyces lusitanus erzeugt Chlortetracyclin in den bekannten Nährflüssigkeiten, die allgemein bei der Chlortetracyclin-Fermentierung und, wenn sie im wesentlichen chlorfrei sind, bei der Tetracyclin-Fermentierung üblich sind. Wenn diese Kulturmedien Dibenzyläthylendiamindiacetat (DBÄDA) oder ein anderes äquivalentes Salz wie ein Lactat enthalten, besteht der gebildete, antibiotisch wirksame Stoff jeweils aus dem DBÄD-Komplex des Chlortetracyclins bzw. des Tetracyclins.
Der Streptomyces lusitanus-Stamm vermehrt sich stark und ergibt eine Ausbeute von über 7 g/l Nährflüssigkeit, wenn unter submersen aerobischen Bedingungen fermentiert wird. Er ist daher besonders für grosstechnische Zwecke geeignet.
Da DBÄD mit grosser Leichtigkeit und praktisch selektiv mit Chlortetracyclin oder Tetracyclin in einer bereits fermentierten Brühe reagiert, erhält man bei pH-Werten von 7, 5 bis 9, 5 einen praktisch wasserunlöslichen Niederschlag. Es kann daher vorteilhaft zum Isolieren des Aktivstoffes aus beliebigen Chlortetracyclin oder Tetracyclin enthaltenden Fermentierungsbrühen verwendet werden.
Die Komplexe können natürlich auch durch Umsetzung von DBÄD mit einer Lösung von bereits gereinigtem Chlortetracyclin oder Tetracyclin erhalten werden.
Die Komplexe bilden bei alkalischen pH-Werten Basen und in stark sauren Medien mit Säuren Salze. Eine der interessantesten Eigenschaften der erfindungsgemäss hergestellten Komplexe ist eine höhere Stabilität sowohl bei sauren als auch bei alkalischen pH-Werten. Diese Tatsache ermöglicht in Verbindung mit ihrer stark selektiven Unlöslichkeit die Herstellung eines sehr reinen Produktes in hoher Ausbeute nach einem stark vereinfachten Trennungs- und Reinigungsverfahren. Das erfindungsgemässe Verfahren ist also wirtschaftlicher als die bisher bekannten.
Der DBÄD-Chlortetracyclin-Komplex kann katalytisch zum DBÄD-Tetracyclin-Komplex hydriert werden. Die Gewinnung von reinem Chlortetracyclin oder Tetracyclin aus den Komplexen ist leicht durchzuführen, wenn man den entsprechenden Komplex in einem organischen Lösungsmittel bis zu seinem isoelektrischen Punkt in einem organischen, wassermischbaren Lösungsmittel ansäuert und anschliessend das reine Chlortetracyclin oder das Tetracyclin durch Zugabe von wechselnden Volumenteilen Wasser ausfällt.
Durch weiteres Ansäuern der Komplexe in entsprechenden organischen Lösungsmitteln, die gegebenenfalls eine geringe Menge Wasser enthalten, bis zu einem pH-Wert von 2 bis 0, 1 erhält man die Säuresalze des Chlortetracyclins oderdes Tetracyclins in reinem Zustand oder inGegenwart vonNatriumchlorid neben den Säuresalzen der entsprechenden Diaminkomplexe.
Eines der bevorzugten Merkmale bei der Anwendung von DBÄD oder dessen Homologen zur Isolierung der Aktivstoffe aus der Fermentierungsbrühe ist der erstaunlich hohe Reinheitsgrad der Rohkristalle ; etwa 97 - 100% in der ersten Kristallisationsstufe bei einer Ausbeute zwischen 60 und 90% je nach den Bedingungen.
Das Verfahren kann vorteilhaft zur Rückgewinnung von in Mutterlaugen niedriger Konzentration verbleibenden Aktivstoffen, die bisher verworfen wurden, bei den bekannten Verfahren zur Herstellung von Tetracyclinen angewendet werden. Man erhält die entsprechenden Komplexe in grosser Reinheit.
Diese Komplexe können dann entweder zur Gewinnung von reinem Chlortetracyclin oder Tetracyclin verwendet werden oder in Anbetracht der Tatsache, dass DBÄD nicht giftig ist und die Komplexe oral gut absorbiert werden, zur Herstellung von Nahrungsmittelzusätzen verwendet werden.
Zur Herstellung der DBÄD-Komplexe durch Fermentierung werden 1, 0-5, 0 DBÄD/1 Nährflüssigkeit vor der Fermentierung zugegeben. Das Medium kann ein übliches Medium sein, beispielsweise :
Stärke 60 g
Specköl 1, 8% V/V
Erdnussmehl (entfettet) 3 g CaC03 4 g (NHSO 4, 5 g NHCl 1, 5g
Flüssigkeit mit gequollenem Mais je Liter Leitungswasser. 4 g (Feststoff)
<Desc/Clms Page number 6>
Bei Verwendung von Streptomyces lusitanus als Fermentierungsmittel enthält die Flüssigkeit nach 120 h 6 - 10 g Aktivstoff/l. Aus der angesäuerten und filtrierten Brühe wird der DBÄD-Komplexe durch Zusatz von Ammoniak (10loig) bei zu einem PH-Wert von 8 bis 8, 5 ausgefällt.
Bei Verwendung von Alkali- oder Erdalkalihydroxyden zum Ausfällen (PH 8, 0-8, 8) erhält man den entsprechenden Metall-DBÄD-Komplex. Ein Zusatz eines geringen Überschusses von DBÄDA vor dem Alkalizusatz kann unter Umständen die Ausbeute erhöhen. Der so erhaltene Niederschlag ist im Gegensatz zu den einfachen Erdalkalikomplexen des Chlortetracyclins, die bisher zur Reinigung verwendet wurden, stabil. Nach 36 - 48 h beträgt der Aktivitätsverlust der rohen DBÄD -Komplexe sogar im feuchten Zustand unter 1%.
Der Niederschlag wird dann filtriert, mit Wasser gewaschen und gut entwässert. Man suspendiert dann in einem Äthylenglykolmonoalkyläther (üblicherweise Äthylcellosolve) ohne vorher zu trocknen und säuert unter gutem Rühren mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 0, 3 bis 2, 0 an.
Nach mehreren Stunden Rühren fällt das reine Hydrochlorid aus. Es wird dann nacheinander mit Äthylenglykolmonoalkyläther, Wasser und Isopropanol gewaschen. Die Aktivität beträgt 980 - 1000 mg/g bei einer Ausbeute von 55 bis 75%.
Wenn man zu der Suspension vor dem Ansäuern Natriumchlorid gibt (10go - 20% Gew. /Gew. des feuchten Komplexniederschlages), erhält man das Hydrochlorid des DBÄD-Komplexes mit einer Reinheit von 97 bis 991o und einer Ausbeute von 75 bis 90%.
Der Dibenzyläthylendiaminkomplex des Chlortetracyclins lässt sich in Gegenwart von Palladium-Holzkohle als Katalysator und von Äthylenglykolmonoalkyläther oder Butanol als Lösungsmittel und von Triäthylamin, um die Reaktionsmischung neutral oder schwach basisch zu halten, leicht katalytisch hydrieren.
Ein sehr bedeutender wirtschaftlicher Vorteil der grosstechnischen Hydrierung des DBÄD-Komplexes im Vergleich zu den bisher bekannten Verfahren, ist die Möglichkeit, die Rohkristalle des Hydrochlorids des DBÄD-Komplexes von Chlortetracyclin (das in der ersten Säurekrisrallisationsstufe erhalten wird) ohne weitere Reinigung katalytisch mit hoher Ausbeute zu hydrieren und ein hochreines Produkt zu erhalten, während die rohen Hydrochloridkristalle, die in der entsprechenden Verfahrensstufe der bekannten Verfahren erhalten werden, ohne weitere Reinigung für eine katalytische Hydrierung nicht geeignet sind.
Die Erfindung wird nachstehend erläutert. Die Beispiele 1 und 3 stellenAusführungsbeispielederEr- findung dar.
Beispiel l : 3001 eines sterilisierten Kulturmediums, wie es vorstehend beschrieben wurde, das 2, 5 g DADA/1 enthält, wird mit suspendierten Sporen von Streptomyces lusitanus geimpft. Die Brühe wird dann unter submersen aeroben Bedingungen in einem entsprechenden Fermentationsbehälter, der mit einem Rührwerk versehen ist, bei 26 fermentiert, wobei sterilisierte Luft mit einem Druck von 0, 5 kg/cmz eingeblasen wird. Nach 120 h beträgt die Aktivität des gebildeten DBÄD-Komplexes des Chlortetracyclins 9, 2 g/l reines Chlortetracyclin. Nach der Abtrennung des Mycelium durch Filtrieren der angesäuerten Brühe (mit H. SO4 verdünnt) verringert sich auf Grund der Verdünnung die Aktivität auf 5, 8g/l.
Man gibt anschliessend eine zusätzliche Menge von 0, 3g/l DBÄDA zu, um einen schwachen Überschuss davon zu erhalten. Durch Zugabe einer 10% eigen wässerigen Ammoniaklösung wird dann der PH auf 8, 2 eingestellt.
Der erhaltene Niederschlag wird dann durch einen geeigneten Filter (Filterpresse) abfiltriert, mit Wasser gewaschen und gut entwässert. Der noch feuchte Niederschlag wiegt 7, 2 kg. Es wird anschliessend in 6300 ml Äthylenglykolmonoäthyläther suspendiert und unter starkem Rühren 864 g Natriumchlorid und konzentrierte Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 0, 45 gegeben. Nach 12h Rühren werden die gebildeten Kristalle abfiltriert und nacheinander mit Äthylenglykolmonoäthyläther, Isopropanol und Wasser gewaschen. Das erhaltene trockene Hydrochlorid des DBÄD-Komplexes von Chlortetracyclin wiegt 1, 753 g und hat eine Aktivität von 835 mg/g. Ausbeute : 63, 5%. Der Schmelzbereich liegt zwischen 223 und 2310 (unter Zersetzung), wobei das Produkt bei 2090 dunkel zu werden beginnt.
[a]-22 (c = 1, 5, in l : l Dimethylformamid-Methanol).
Beispiel 2 : Man gibt zu 250 l filtrierter und angesäuerter, fermentierter Brühe mit einem Ge- halt von 3, 6 g Tetracyclin/1 250 g DBÄDA und stellt den pH-Wert auf 8, 3 durch Zugabe von wässerigem Ammoniak (10going) ein. Der filtrierte, gewaschene und gut entwässerte, jedoch noch feuchte Niederschlag wiegt 6, 7 kg. Nach dem Suspendieren ohne weiteres Trocknen in 6 000 ml Äthylenglykolmonoäthyläther wird mit konzentrierter HC1 bis zu einem PH 1, 4 angesäuert und 804 g Natriumchlorid
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
<Desc/Clms Page number 8>
[a] -215,8, 3 ein. Man filtriert, wäscht den Niederschlag mit Wasser und trocknet die im Filtrat verbliebene Aktivität beträgt 0, 06 g/l.
Das so erhaltene Produkt wird vermahlen und mit Sojamehl (oder einem beliebigen andern tierischen Futtermittel) vermischt, um als Futtermittelzusatz zu dienen.