DE1517850C3

DE1517850C3 - 08.07.65 Frankreich 23961 Verfahren zur Herstellung von beta-Carotin durch aerobe Fermentation einer Kultur der Formen + und - von Blakeslea trispora

Info

Publication number: DE1517850C3
Application number: DE1517850A
Authority: DE
Inventors: Leon Ninet; Jacques Albert Renaut; Robert Charles Francois Maisons-Alfort Seine Tissier
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1965-07-08
Filing date: 1966-07-08
Publication date: 1975-05-22
Also published as: GB1114666A; SE333344B; DE1517850A1; SE319142B; NL6609139A; DK115982B; DE1517850B2; SE326680B; CH463492A; BE683806A; DK116578B; US3421980A; IT962001B; DK115538B; BR6681067D0

Description

Het —CO —NH-NH₂

in der Het einen ein- oder zweikernigen ungesättigten heterocyclischen Rest mit einem oder mehreren Heteroatomen aus der Gruppe der Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoffatome, wobei jeder Ring 5 oder 6 Kettenglieder enthält, bedeutet oder zumindest einen Aktivator aus der Gruppe von

II. Pyridinderivaten der allgemeinen Formel

-R

in der R einen Alkanoylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder den Benzoylrest oder deren funktionell Derivate der Oxogruppe oder den Hydroxylrest, einen Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, den Carbamoylrest, einen Carbamoylrest, der mit einem oder zwei Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist, den Thiocarbamoylrest oder einen Thiocarbamoylrest, der mit einem oder zwei Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist, bedeutet oder

III. Pyridazin, jedoch nicht das Isonicotinoylhydrazin, zusetzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von />'-Carotin durch aerobe Fermentation einer Kultur der Formen + und — von Blakeslea trispora in einem geeigneten Nährmedium und unter der für diese Art von Züchtung üblichen Bedingungen.

Es ist bekannt, /i-Carotin durch Submers-Fermentation von Mikroorganismen des Genus Choanephora oder Blakeslea zu erhalten. In verschiedenen Veröffentlichungen sind die Bedingungen beschreiben, die die Produktion von /^-Carotin begünstigen. Barnett u. Mitarb. (Science, 1956, Bd. 123, S. 141) haben gezeigt, daß die Produktion von /y-Carotin durch gleichzeitige Züchtung von entgegengesetzten Formen ein und derselben Species verbessert wird. Diese Untersuchung wurde auf die Züchtung von entgegengesetzten Formen verschiedener Species ausgedehnt (C. Hesselt ine, Mycologia, 1957. Bd. 49, S. 449). Die Züchtungsmedien wurden ebenfalls untersucht, und es hat sich gezeigt, daß die Zugabe von vollständigem oder hydrolysiertem Getreide, pflanzlichen ölen, oberflächenaktiven Mitteln, Antioxydantien und Verdickungsmittel die Ausbeute an //-Carotin erhöht (R. A η d e r s ο η u. Mitarb., J. Agr. Food. Chem., 1958, Bd. 6, S. 543; A. Ciegler u. Mitarb., App. Microb., 1959, Bd. 7, S. 94 und 98).

Schließlich haben Mackinney u. Mitarb. (J. Am. Chem. Soc, 1952, Bd. 74, S. 3456) gezeigt, daß die Zugabe von /i-Jo'non zu einer ruhenden Kultur eines Phycomyces die Bildung von /v'-Carotin auf Kosten anderer Carotinoidfarbstoffe stark erhöht.

ίο Anderson u. Mitarb, haben die gleiche Wirkung bei bewegter Kultur von Blakeslea und Choanephora festgestellt (loc. cit.).

Aus der französischen Patentschrift 1 377 523 ist es bekannt, 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen als Ausgangssubstanz, die dem Mikroorganismus einen vorgefertigten Molekülbaustein des //-Carotins liefert, dem Fermentationsmilieu zuzusetzen. Dieser Vorläufer..spielt die gleiche Rolle wie /i-Jonon und kann letzteres ganz oder teilweise ersetzen. Es handelt sich dabei jedoch um keine Aktivatorsubstanz. Aktivatorsubstanzen, die nicht sichtbar an der Synthese beteiligt sind, sind aus der französischen Patentschrift 1 344 264 und ihren Zusätzen (l.Add. und 2. Add.)

- bekannt; bei diesen Substanzen handelt es sich um gewisse Amide, Imide und Lactame, die dem Kulturmilieu zugesetzt werden, um die Ausnutzung der Ausgangssubstanzen zu verbessern. Die Verwendung von Isomicotinoylhydrazin als Aktivatoren bei der Herstellung von ß-Carotin durch aerobe Fermentation wurde bereits vorgeschlagen.

Aus der französischen Patentschrift 1 403 839 ist es bekannt, daß bei Zusatz von speziellen heterocyclischen Aktivatoren zu Fermentationsmilieus, die zur Erzeugung von ß-Carotin geeignet sind, dessen Bildung inhibiert wird und statt dessen Lycopin erzeugt wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung von //-Carotin.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei ^Zusatz gewisser heterocyclischer Verbindungen als Aktivatoren zu einem Züchtungsmedium, die Produktion von /-/-Carotin im Vergleich mit bekannten Verfahren erheblich erhöht wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von //-Carotin durch aerobe Fermentation einer Kultur der Formen + und — von Blakeslea trispora in einem geeigneten Nährmedium und unter den für diese Art von Züchtung üblichen Bedingungen, ist dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium in Mengen von 0,1 bis 10 g pro Liter des Nährmediums zumindest einen Aktivator aus der Gruppe von

I. Hydraziden der allgemeinen Formel
55

Het —CO —NH-NH₂

in der Het einen ein- oder zweikernigen ungesättigten heterocyclischen Rest mit einem oder mehreren Heteroatomen aus der Gruppe der Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoffatome, wobei jeder Ring 5 oder 6 Kettenglieder enthält, bedeutet, oder zumindest einen Aktivator aus der Gruppe von

II. Pyridinderivaten der allgemeinen Formel
65

in der R einen Alkanoylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoff-

atomen oder den Benzoylrest oder deren funktionelle Derivate der Oxogruppe oder den Hydroxylrest, einen Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; den Carbamoylrest, einen mit einem oder zwei Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituierten Carbamoylrest, den Thiocarbamoylrest oder einen mit einem oder zwei Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituierten Thiocarbamoylrest bedeutet, oder

III. Pyridazin, jedoch nicht das Isonicotinoylhydrazin, zusetzt.

Der Aktivator kann dem Züchtungsmedium zu Beginn oder im Verlaufe der Fermentation auf einmal oder mehrmals zugegeben werden. Vorzugsweise verwendet man eine Menge zwischen 0,5 und 2 g/l und führt die Zugabe zu Beginn der Züchtung durch. Gleichgültig, welche Menge zugegeben wird und zu welchem Zeitpunkt die Zugabe dieses Produkts erfolgt, ist es zweckmäßig, die Züchtung 6 bis 15 Tage lang nach Beimpfung fortzusetzen, um die maximale Produktion an /i-Carotin zu erhalten. Das Züchtigungsmedium kann variieren, doch enthält es im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, Antioxydantien, oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel und Promotoren.

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Dextrine, Stärke, oder tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl, Sojaöl oder Baumwollsamenöl, verwenden. Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig: sie können chemische Verbindungen oder komplexe Substanzen sein, die den Stickstoff hauptsächlich in proteidischer Form enthalten, wie beispielsweise Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Sojamehle, Arachismehle, Hefeextrakte, Rückstände von der Kornalkoholdestillation, die allgemein als »Distillers Solubles« bezeichnet werden (vgl. »Willem Rudolfs, industrial Wastes, their Disposal and Treatment, Reinhold Publishing Corporation, New York, 1953, S. 102 und 103) und Maisquellflüssigkeit.

Unter den zugesetzten Mineralstoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate.

Unter den Wachstumsfaktoren ist der am häufigsten verwendete das Vitamin B₁ oder Thiamin. Unter den Antioxydantien kann man das N,N'-Diphenylp-phenylendiamin, das 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin, die Ascorbinsäure oder die Sorbinsäure nennen. Die oberflächenaktiven Mittel sind vorzugsweise von nichtionischer Art, wie beispielsweise Sorbitderivate mit Fettsäuren oder Produkte auf der Basis von Äthylenoxydkondensaten. Unter den Verdickungsmitteln sind die am häufigsten verwendeten Stärke, Carboxymethylcellulose und Agar.

Als Promotor kann man /f-Jonon, 2,2,6-Trimethylcyclohexanon oder 2,6,6-Trimethyl-1 -acetylcyclohexen verwenden.

Das so hergestellte Züchtungsmedium wird anschließend mit einer Kultur der Formen + und — von Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457) beimpft.

Die Erhöhung des Produktionsgrades an //-Carotin in Gegenwart von Aktivator aus I, II oder III ist je nach den Arbeitsbedingungen mehr oder weniger ausgeprägt: sie tritt jedoch auf, unabhängig davon, ob man Antioxydantien oder Promotoren zu den Züchtungsmedien zusetzt oder nicht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Man stellt ein Züchtungsmedium A wie folgt her:

500 ecm Wasser mit einem Gehalt von 75 g Rückständen von der Kornalkoholdestillation werden 15 Minuten zum Sieden gebracht. Nach Abkühlen setzt man die folgenden Substanzen zu:

Stärke 70 g

Sojaöl 40 ecm

Baumwollsamenöl 40 ecm

Hefeextrakt Ig

Monokaliumphosphat 0,5 g

Mangansulfat-Monohydrat 0,1 g

Thiamin-hydrochlorid ... 0,01 g

Man füllt mit destilliertem Wasser auf 1000 ecm auf. Das Gemisch wird mit einigen Tropfen 1On-Natronlauge auf pH 6,3 eingestellt, in 300-ccm-Erlenmeyerkolben in einer Menge von 50 ecm je Kolben verteilt und dann 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Nach Sterisation und Abkühlen bringt man unter sterilen Bedingungen in jeden Kolben 1 ecm einer sterilen 2,5%igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-l,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.

Man stellt auch Medien B und C mit den gleichen Bestandteilen und in der gleichen Weise wie bei Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans, gelöst in dem Leuchtpetroleum, die nachfolgenden Mengen einer 2,5%igen sterilen Lösung von 2-Furoyl-hydrazin in Wasser einbringt:

Medium B 0,2 ecm

Medium C 1 ecm

Jeder Kolben mit den Medien A, B und C wird anschließend mit 5 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten Kultur, die die zwei Formen + und — des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457) enthält und 48 Stunden gealtert wurde, beimpft. Die Kolben werden anschließend auf einen Drehtisch, der mit 220 Drehungen je Minute rotiert wird, in einem Brutschrank bei 26° C gebracht. Nach 12tägiger Züchtung unter diesen Bedingungen der Bewegung und der Temperatur ist die Produktion an /i-Carotin in allen Kolben maximal.

Die Bestimmung des ß-Carotins wird wie folgt durchgeführt: Das Mycel wird durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann über Nacht bei 35° C im Vakuum getrocknet. Das Trockenmycel wird anschließend mit Hexan extrahiert. Man trennt das /i-Carotin von den anderen vorhandenen Carotinoiden durch eine Chromatograph!" des Extrakts an Aluminiumoxyd ab. Die das /V-Caroün enthaltenden Elutionsfraktionen werden vereinigt, und der Gehalt wird spektrophotometrisch gegen eine reine /i-Carotinprobe bestimmt.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
65

Medium A

(ohne Adjuvans) 1010 mg

/;-Carotin je Liter

Medium B (mit 0,1 g
2-Furoylhydrazin je
Liter)

Medium C (mit 0,5 g
2-Furoylhydrazin je
Liter)

1150 mg
/j'-Carotin je Liter

1390 mg
/y-Carotin je Liter

B e i s ρ i e 1 2

Man stellt die Züchtungsmedien A und C her und beimpft sie wie es im Beispiel 1 angegeben ist. Nach einer Inkubation von 48 Stunden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man unter sterilen Bedingungen in jeden Züchtungskolben eine Lösung von 50 mg /Kfonon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein. Man setzt darin die Züchtung fort und analysiert unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Zugesetztes Hydrazid

Medium A
(ohne Adjuvans).

Medium C (mit 0,5 g
2-Furoylhydrazin je
Liter)

1770 mg
/i-Carotin je Liter

2505 mg
/^-Carotin je Liter

Beispiel 3

Man stellt verschiedene Medien her, wobei man in der gleichen Weise wie bei der Herstellung des Mediums C arbeitet, jedoch die Zugabe von 2-Furoylhydrazin durch eine Zugabe anderer Hydrazide der Formel I ersetzt. Diese Hydrazide werden in Form einer wäßrigen Lösung zugegeben.

Das Bezugsmedium A und die anderen wie oben angegeben hergestellten Medien werden wie im Beispiel 1 beimpft und inkubiert.

Nach 12tätiger Züchtung wird das /i-Carotin wie im Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. {

Aus Zweckmäßigkeitsgründen wurde der /V-Carotin-Produktion des Vergleichsmediums A der Koeffizient 100 gegeben. Die Koeffizienten der die Hydrazide der allgemeinen Formel I enthaltenden Medien zeigen daher die Erhöhung der Produktion an /9-Carotin, bezogen auf das Vergleichsmedium.

Zugesetztes Hydrazid	Het	I	Zuge setzte Menge in g/i	Pro duktion von ji- Carotin
K.eines (Ver gleichs- medium A) 2-Furoylhydrazin (Medium C)	O	I! N ^NH⁷	0,5	100 138
3-Pyrazolylcarbo- nylhydrazin	0,5	143

5-Methyl-2-pyrimidylcarbo-
nylhydrazin

2-Indolylcarbonylhydrazin

2- Pyrazinylcarbonylhydrazin

4-Thiazolylcarbonylhydrazin

0,5

Produktion von Ii-Carotin

B e i s ρ i e 1 4

Wie im Beispiel 3 stellt man Züchtungsmedien in der gleichen Weise wie das Medium C von Beispiel 1 her. ersetzt jedoch das 2-Furoyl-hydrazin durch andere Hydrazide der Formel I in Lösung in Wasser in den unten angegebenen Mengen.

Die neuen Medien werden gleichzeitig mit einem Vergleichsmedium A und einem Medium C, wie sie im Beispiel 1 beschrieben sind, beimpft, und die Kulturen werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen entwickelt.

Nach 2tägiger Inkubation wird in die Kolben von jedem Medium eine sterile Lösung von 50 mg /Monon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum eingebracht. Die Züchtungen werden anschließend noch 10 Tage fortgesetzt. Das /f-Carotin wird dann wie im Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben, wobei für. die in Koeffizienten ausgedrückte Produktion an ß-Carotin das. gleiche wie im Beispiel 3 gilt.

Zugesetztes Hydrazid	Het	l	^NH'	■	Zuge setzte Menge in g/l	Pro duktion von fi- Carotin
Keines (Ver gleichs- medium A) 2-Furoylhydrazin (Medium C)	O	0,5	100 142
2-Indolylcarbo- nylhydrazin	1	111

Fortsetzung

ΙΟΙ/ÖOU

Zugesetztes Hydrazid	Het	L	Zuge setzte Menge in g/l	Pro duktion von /i- Carotin
2-Pyrazinylcarbo- nylhydrazin		0,5	112

Beispiel 5

Man stellt ein Medium A wie im Beispiel 1 her.

Man stellt auch Medien D und E mit den gleichen Bestandteilen und in der gleichen Weise wie bei dem Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans in Lösung in Leuchtpetroleum die nachfolgend angegebenen Mengen einer sterilen 5%igen . Lösung von 4-Formylpyridin in Wasser einbringt:

Medium D 0,5 ecm

Medium E 1 ecm

Jeder Kolben mit den Medien A, D und E wird anschließend mit 5 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten Kultur, die die zwei Formen + und — des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457) enthält und 48 Stunden gealtert wurde, beimpft. Die Kolben werden anschließend auf einem Drehtisch, der mit 220 Drehungen je Minute rotiert wird, in einem Brutschrank bei 26° C gebracht. Nach 12tägiger Züchtung unter diesen Bedingungen bezüglich Bewegung und Temperatur ist die Produktion an /^-Carotin in allen Kolben maximal. Die Kulturen werden dann wie im Beispiel 1 beschrieben analysiert.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Medium A
(ohne Adjuvans)........ 935 mg

ß-Carotin je Liter
Medium D (mit 0,5 g
4-Formyl-pyridin je

Liter) 1720 mg

/^-Carotin je Liter
Medium E (mit 1 g
4-Formyl-pyridin je

Liter) 2050 mg

/Ϊ-Carotin je Liter

werden dann unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen fortgesetzt und anschließend analysiert. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Medium A 1770 mg

/f-Carotin je Liter
Medium F (mit 2 g
4-Formyl-pyridin je

Liter) 3065 mg

/?-Carotin je Liter

B e i s ρ i e 1 7

Man stellt das Züchtungsmedium A wie im Beispiel 1 beschrieben her.

Man stellt auch ein Medium G mit den gleichen Bestandteilen und in der gleichen Weise wie das Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der. Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans in Lösung in Leuchtpetroleum 3 ecm einer sterilen 5%igen Lösung von 4-Hydroxy-pyridin in Wasser einbringt.

Man beimpft anschließend die Medien A und G wie im Beispiel 1. Nach 48stündiger Inkuba.tion unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man in jeden Züchtungskolben mit dem Medium A unter sterilen Bedingungen 50 mg /J-Jonon in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein.

Die Kolben mit dem Medium G werden in zwei Gruppen G₁ und G₂ geteilt. Man bringt unter sterilen Bedingungen in jeden Züchtungskolben G₁ 50 mg /?-Jonon in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum und in jeden Züchtungskolben G₂ 50 mg 2,6,6-Trimethyl-1-acetylcyclohexen (TMACH) in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein.

Die Züchtungen werden dann unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen fortgesetzt und analysiert.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
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Züch- tungs-j medium	Adjuvans	Promotor	/i-Carotin in mg/I
⁴⁵A ,G₁ .... G₂ ....	keines 4-Hydroxy- pyridin 3 g/l 4-Hydroxy- pyridin 3 g/l	/Wonon /Ϊ-Jonon TMACH	1890 2450 2420

Beispiel 6

Man stellt ein Züchtungsmedium A wie im Beispiel 1 beschrieben her. Man stellt auch ein Züchtungsmedium F mit den gleichen Bestandteilen und in der gleichen Weise wie bei dem Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans in Lösung in Leuchtpetroleum 2 ecm einer sterilen 5%igen sung von 4-Formyl-pyridin in Wasser einbringt.

Man beimpft die Züchtungsmedien A und F wie im Beispiel 1 beschrieben. Nach 48stündiger Inkubation unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man in jeden Züchtungskolben unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 50 mg /klonon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein. Die Züchtungen

Beispiel 8

Man stellt verschiedene Züchtungsmedien her, wobei man in der gleichen Weise wie für die Herstellung des Mediums G von Beispiel 7 " arbeitet, jedoch die Zugabe von 4-Hydroxy-pyridin durch eine Zugabe von anderen Pyridinderivaten in Lösung in Wasser in den nachfolgend angegebenen Mengen ersetzt.

Das Vergleichszüchtungsmedium A und die so • hergestellten Züchtungsmedien werden beimpft und inkubiert, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist. Nach 12tägiger Züchtung wird das /9-Carotin wie im Beispiel 1 bestimmt.

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt, wobei bezüglich der Koeffizienten

509 621/278

der /i-Carotin-Produktion das gleiche wie im Beispiel 3 gilt.

Adjuvans	Zugesetzte Menge an Adjuvans in g/l	Produktion an /i-Carotin
Keines (Vergleichsmedium A) 4-Hydroxy-pyridin 4-Thiocarbamoyl-pyridin ... 4-Hydroxymethyl-pyridin... 4-Benzoyl-pyridin 4-Acetyl-pyridin 4-Formyl-pyridin- thiosemicarbazon	3 0,5 1 0,2 1 2	100 189 180 138 129 121 195

Beispiel 9

IO

•5

20 der mit 220 Umdrehungen je Minute betrieben wird, in einen Brutschrank bei 26° C eingebracht. Nach 2tägiger Inkubation werden die Züchtungskolben mit dem Medium A in zwei Gruppen A₁ und A₂ geteilt. Die Kolben mit dem Medium H werden ebenfalls in zwei Gruppen Hi und H₂ geteilt. In jeden Kolben H₂ und A₂ bringt man unter sterilen Bedingungen 50 mg /i-Ionon in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein. Die Kolben A₁ und H₁ erhalten keinen Zusatz. Die Züchtungen A₁, A₂, H₁ und H₂ werden noch weitere 10 Tage unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung fortgesetzt. Die Produktion an ß-Carotin ist dann in allen Kolben maximal.

Die Bestimmung des /i-Carotins wird wie im Beispiel 1 durchgeführt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Man stellt Züchtungsmedien her, wobei man in der gleichen Weise wie bei der Herstellung der Züch- _ tungsmedien von Beispiel 8 arbeitet. Diese Medien werden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt und beimpft. Nach 48stündiger Inkubation bringt man unter sterilen Bedingungen in jeden Kolben aller Züchtungen eine Lösung von 50 mg ß-Jonon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein. Die Züchtungen werden dann unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen fortgesetzt und analysiert.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt, wobei bezüglich der Koeffizienten der ß-Carotin-Produktion das gleiche wie im Beispiel 3 gilt.

40

45

Adjuvans	Zugesetzte Menge an Adjuvans in g/l	Produk tion an /i-Carotin
Keines	3 0,5 1 0,75	100 129 132 156 126
4-Hydroxy-pyridin 4-Thiocarbamoyl-pyridin ... 4-Hydroxymethyl-pyridin... 4-Acetyl-pyridin

Beispiel 10

Man stellt ein Medium A wie im Beispiel 1 her.

Man stellt auch ein Medium H mit den gleichen Bestandteilen und in der gleichen Weise wie das Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans in Lösung in Leuchtpetroleum 1 ecm einer sterilen 10%igen Lösung von Pyridazin in Wasser einbringt.

Jeder Kolben mit den Medien A und H wird anschließend mit 5 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten Kultur, die die beiden Formen + und — des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457) enthält und 48 Stunden gealtert wurde, beimpft. Die Kolben werden anschließend auf einen Drehtisch,

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	Adjuvans	g/l	Produktion an	in mg/1
		g/l	/j-Carotin
Medium			Kulturen
		Kulturen	mit
		ohne	/j'-Jonon
	—	/Klonon
VIedium A₁ ...	Pyridazin 2	900	1460
Medium A₂...	Pyridazin 2	—	—
VIedium H₁...		1540	2165
Medium H₂...		—

Aus den folgenden Versuchen 1 und 2 geht hervor, daß bei Zusatz der erfindungsgemäßen heterocyclischen Aktivatoren die /i-Carotinausbeute in überraschender Weise gesteigert wird, was bei Kenntnis der französischen Patentschrift 1 403 839, Beispiel 7, nicht zu erwarten war, wo bei Zusatz von 0,1 g Pyridin pro Liter Nährmedium die ß-Carotinausbeute ansteigt, um beim Zusatz von 3 g Pyridin/Liter abrupt abzufallen, wo hingegen die Lycopinausbeute ständig zunimmt.

Versuch 1

Man arbeitet wie im Beispiel 7 und geht dabei von einem Kulturmilieu a) aus, das wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, jedoch keinen Hefeextrakt enthält. Dabei werden die folgenden Ergebnisse erzielt:

55

60

Kultur	Zusatz:	Promotor	/i'-Carotin	[,'-Carotin, bezogen auf
milieu	4-Hydroxy- pyridin	/j'-Jonone	mg/1	die Kontroll probe
a	ohne	lg/1	1870	100
gl	lg/1	OQ	2280	122
g₂	2 g/l	lg/1	2460	131
g3	3 g/l	ig/i	2490	133
g4	4 g/l	lg/1	2530	135

Versuch 2

Man arbeitet wie im Beispiel 10 mit einem Milieu a), das wie im Beispiel 1 hergestellt wurde, welches

1 öl/

jedoch keinen Hefeextrakt enthält. Man erhält die folgenden Ergebnisse:

Kultur milieu	Zusatz: Pyridazin	Promotor /j-Jonone	//-Carotin mg/1	3	//-Carotin, bezogen auf die Kontroll probe
A	ohne	ig/i	1340	100
H₃	3 g/l	ig/i	2280	170
		Versuch

Der folgende Vergleich wurde nach den Verfahren der Beispiele 6, 9 und 10 der vorliegenden Anmeldung durchgeführt. Dabei wurden einerseits die dort angegebenen Zusatzstoffe und andererseits Succinimid als Aktivatoren zugesetzt.

20

Milieu

Blindversuch

Succinimid (4 g/l)

4-Formyl-pyridin (2 g/l)

Blindversuch

Succinimid (4 g/l)

4-Hydroxymethyl-pyridin (1 g/l)

Blindversuch

Succinimid (4 g/l)

Pyridazin (2 g/l)

/i-Carotin (mg/1)

1770 2550 3065 1770 2620 2760

1460 1945 2165

3°

35

A. Erfindungsgemäßes Verfahren

Beispiel	3065	//-Carotin (mg/1)
6	2760	(4-Formyl-pyridin)
9	2505	(4-Hydroxymethyl-pyridin)
2·	2450	(2-Furoylhydrazin)
7	2390	(4-Hydroxy-pyridin)
9	2290	(4-Thiocarbamoyl-pyridin)
4	2230	(2- Py razinyl-carbonylhydrazin)
9	2165	(4-Acetyl-pyridin) "X.
10	(Pyridazin)

B. Deutsche Patentschrift 1 196153 (entsprechend

der französischen Patentschrift 1344 264 mit den

zwei Zusatzanmeldungen)

Die vorstehenden Versuche zeigen, daß die erfindungsgemäßen Aktivatorsubstanzen zu besseren Ergebnissen führen, als das als Zusatz als besonders günstig bekannte Succinimid (vgl. die französischen Patentschriften 1 377 523 und 1 344 264).

Aus dem folgenden Vergleich geht hervor, daß bei Zusatz der erfindungsgemäßen Aktivatoren wesentlich bessere Ausbeuten erzielt werden als bei Zusatz, der aus der französischen Patentschrift 1 344 264 und ihren Zusatzanmeldungen bekannten Aktivatoren.

Beispiel	/i-Carotin (mg/1)
23	197D .
23	1730
22	1730
18	1700
18	1635
13	1620
17	1590
21	1485
12	1370
18	1360
12	1295 ·
6	1275
6	1265
12	1260
11	1245
• 19	1225
6	1220
20	1180
9	1085
10	1040
3	885

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von /^'-Carotin durch aerobe Fermentation einer Kultur der Formen + und — von Blakeslea trispora in einem geeigneten Nährmedium und unter den für diese Art von Züchtung üblichen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium in Mengen von 0,1 bis 10 g pro Liter des Nährmediums zumindest einen Aktivator aus der Gruppe von

I. Hydraziden der allgemeinen Formel