DE2456139B2 - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 20.798 R.P - Google Patents

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 20.798 R.P

Info

Publication number
DE2456139B2
DE2456139B2 DE2456139A DE2456139A DE2456139B2 DE 2456139 B2 DE2456139 B2 DE 2456139B2 DE 2456139 A DE2456139 A DE 2456139A DE 2456139 A DE2456139 A DE 2456139A DE 2456139 B2 DE2456139 B2 DE 2456139B2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
antibiotic
culture
daunorubicin
hours
atcc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE2456139A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2456139C3 (de
DE2456139A1 (de
Inventor
Jean Florent
Jean Lunel
Jacques Renaut
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rhone Poulenc SA
Original Assignee
Rhone Poulenc SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc SA filed Critical Rhone Poulenc SA
Publication of DE2456139A1 publication Critical patent/DE2456139A1/de
Publication of DE2456139B2 publication Critical patent/DE2456139B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2456139C3 publication Critical patent/DE2456139C3/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/843—Corynebacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y10S435/899—Streptomyces lavendulae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

als freie Base oder in Form seiner Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man Daunorubicin der Formel
O OH CO-CH3
-OH
O-
O OH 0-CH-Ch1-CH-CH-CH-CH,
och, I I
NH, OH
in Form der freien Base oder in Form eines seiner Salze mittels einer Kultur eines Mikroorganismus, der ausgewählt wird aus Streptomyces lavendulae ATCC 8664, Streptomyces roseochromogenes ATCC 13 400, Corynebacterium simplex ATCC 6946 oder Bacterium cyclooxydans ATCC 12 673, als isolierte Zellen oder in Form von aus diesen Zellen hergestellten enzymatischen Extrakten, reduziert.
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung des mit der Nummer 20.798 R.P. bezeichneten Antibiotikums, das interessante Antitumoreigenschaften aufweist und das der Formel
O OH CHOH OH
i J!
O OH O (Il ( H, C Il CII CH ClI,
och, ! !
NU, OH
einspricht.
Das Antibiotikum 20.798 R.P. und seine Gewinnung, ausgehend von einer Kulturbrühe von Streptomyces coerulcorubidus NRRL 3045, sind in der französischen Palentschrift 15 83 752 beschrieben. Das Antibiotikum 20.798 R.P. stellt ein Nebenprodukt des mit der Nummer 9.865 RP. bezeichneten Antibiotikums dar, dessen Hauptbestandteil das mit der Nummer 13.057 R.P. bezeichnete Antibiotikum Daunorubicin ist.
Daunorubicin und seine Herstellung sind in der belgischen Patentschrift 6 32 391 beschrieben.
Daunorubiciii entspricht der Formel
O OH (O CII,
OH
(II)
! O Oll O (Il ( II, C 11 (Il ( Il ( II, (XII, !
Nil, OH
Das Antibiotikum 20.798 R.P. kann auch durch Reduktion von Daunomycin oder einem seiner Salze mittels eines Alkaliborhydrids bei einer Temperatur von -20 bis +300C, gemäß dem in der DE-OS 22 02 690 beschriebenen Verfahren, hergestellt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das im vorstehenden Patentanspruch aufgezeigte Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 20.798 R.P. durch mikrobiologische Reduktion von Daunorubicin.
Die Mikroorganismen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind Streptomyces lavendulae ATCC 8664, Streptomyces roseochromogenes ATCC 13400, Corynebacterium simplex ATCC 6946 oder Bacterium cyclooxydans ATCC 12673, wobei die besten Ergebnisse, ausgehend von Kulturen von Corynebacterium simplex ATCC 6946 erzielt werden.
Die Kultur des Mikroorganismus, der das enzymatische System produziert, das dazu geeignet ist, das Daunorubicin zum Antibiotikum 20.798 R.P. zu reduzieren, kann nach jeder aeroben Oberflächen- oder Tiefenbzw. Tauchkulturmes-hode durchgeführt werden, wobei jedoch letztere aus Bequemiichkeitsgriinden bevorzugt wird. Man verwendet zu diesem Zweck die Animpfungs- und Fermentationstechniken und die verschiedenen Vorrichtungstypen, die in der Fermentationsindustrie geläufig sind
Das Kulturmilieu des Mikroorganismus muß im wesentlichen Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff, Mineralelemente und Wachstumsfaktoren enthalten; alle diese Elemente können in Form von definierten Produkten oder durch komplexe Mischungen eingebracht werden, wie sie bei biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs vor'-egen.
Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff kann man Kohlenhydrate wie Glucose oder andere Kohlenwasserstoffsubstanzen, wie Zuckeralkohole oder wie bestimmte organische Säuren verwenden. Bestimmte tierische oder pflanzliche öle, wie Schweineschmalzöl oder Soyaöl können diese Kohlenwasserstoffquellen vorteilhaft ersetzen oder ihnen zugesetzt werden.
Die Quellen für assimilierbaren Stickstoff variieren sehr stark. Sie können sehr einfache chemische Substanzen sein, wie die Mineralsalze oder organischen Salze von Ammonium, Harnstoff, gewissen aminhaltigen Säuren. Sie können auch durch komplexe Substanzen eingebracht werden, die im wesentlichen Stickstoff in peptidischer bzw. proteidischer Form enthalten: Kasein, Lactalbumin, Gluten und ihre Hydrolysate, Sojamehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Pepton, Fleischextrakte, Hefe, »Distillers solubles« (vergleiche z.B. Willem Rudolfs: »Industrial Wastes, their disposal and treatment« [Reinhold Publishing Corp., New York, 1953], Seiten 102 und 103), Mais- bzw. Kornquellflüssigkeit.
Unter den zugesetzten mineralischen Elementen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neulralisierende Wirkung aufweisen, wie die Alkali- oder Erdalkaliphosphate. Andere bewirken das zur Entwicklung des Mikroorganismus notwendige loncngleichgewicht, wie die Chloride und die Sulfate von Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen.
Der pH-Wert des Fernientationsmediums zu Beginn der Kultur sollte 6,0 bis 7,8 und vorzugsweise 6,5 bis 7,5 betragen. Die optimale Temperatur für die Kultur des Mikroorganismus beträgt 2) bis Jl C, jedoch wird eine zufriedenstellende Entwicklung bei Icniperjturen von 26 bis J7°C erzielt.
Die Luftzufuhr zu .lein ΚιιΙΐιιιιιιιΙί·.·ιι k.iiin innerhalb weiter Grenzen variieren. Man hat jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 3 I Luft pro Liter Bouillon und pro Minute besonders zweckmäßig sind.
Darüber hinaus ist es zur Erzielung einer Kultur, die eine gute Reduktionswirkung aufweist, bevorzugt, das Kulturmilieu zu rühren, beispielsweise mit einem Rührer, dessen Rotationsgeschwindigkeit von 100 bis 250 Umdrehungen/Minute variieren kann.
Im allgemeinen erreicht die Kultur des Mikroorgamv mus nach 24 bis 48 Stunden einen zufriedenstellenden Entwicklungsgrad.
Die Reduktionswirksamkeit des so erhaltenen enzymatischen Systems ist von endocellulärer Natur, was sich durch die nicht vorhandene Aktivität von filtrierten Kulturen ergibt.
Darüber hinaus hängt die Reduktionsaktivität im wesentlichen von der Menge der im Verlauf der Kultur gebildeten Zellen ab. Beispielsweise besteht bei isolierten Zellen nach dem Zentrifugieren des Kulturmi-Heus eine direkte Beziehung zwischen der Menge des ausgehend von Daunorubicin gebildeten Antibiotikums 20.798 K.P. zu der Konzentration der Zellen in dem Reaktionsmilieu; ein an Zellen reiches Milieu besitzt eine überlegene Reduktionskraft.
r, Die Reduktion von Daunorubicin zum Antibiotikum 20.798 R.P. wird durch Kontakt einer wäßrigen Lösung von Daunorubicin oder von einem seiner Salz«; mit der Kultur des Mikroorganismus, die einen ausreichenden Entwicklungsgrad und ein ausreichendes Reduktions-
JO vermögen erzielt hat, oder durch Kontakt mit den isolierten Zellen dieser Kulturen oder mit ausgehend von diesen Zellen erhaltenen enzymatischen Extrakten erzielt. Im allgemeinen erfolgt die Reduktion in bewegtem Medium bei einer Temperatur von 23 bis
j-, 370C, vorzugsweise von 26 bis 30°C, und ist nach einer Kontaktzeit von 1 bis 4 Tagen vollständig.
Die Reduktion kann bei einem pH-Wert von 5 bis 10 erfolgen, bevorzugt wird jedoch bei einem pH-Wert von 7 bis 8 gearbeitet.
tn Das Kulturmilieu kann beispielsweise mit einem Rührer gerührt werden, dessen Geschwindigkeit von 100 bis 250 Umdrehungen/Minute variieren kann.
Die Reduktion kann entweder an dem Daunorubicin oder an einem seiner reinen Salze, an einem unreinen
4-, Produkt oder an einem sauren Filtrat einer Kultur, die Daunorubicin produziert hat, vorgenommen werden. Um gute Ergebnisse zu erzielen, beträgt die Konzentration von Daunorubicin in dem Reduktionsmilieu vorteilhaft 0,1 bis 1 g/l zu Beginn der Reduktion.
-,o Das Antibiotikum 20.798 R.P. kann von dem Reduktionsmilieu nach üblichen Isoliermethoden für dieses Antibiotikum abgetrennt werden.
Beispielsweise kann das Antibiotikum 20.798 R.P. aus dem Kulturmilieu mit einem pH-Wert von etwa 9 mit
,-, einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform, Methylenchlorid, n-Butanol oder einer Mischung dieser Lösungsmittel extrahiert werden.
Das Antibiotikum 20.798 RP. kann von den organischen Extrakten nach aufeinanderfolgenden Waschvor-
t,ii gangen und Extraktionen durch Ausfällen nach Konzentralion der Extrakte auf ein geringes Volumen udcr durch Zusatz eines Verdünnungsmittels, worin das Antibiotikum 20.798 R.P. unlöslich ist, wie Hexan, gegebenenfalls nach Umwandlung des Antibiotikums in
ni ein Säureadditionssal/, wie das Chlorhydral. isoliert weiden.
Das Antibiotikum 20.798 RP. kann gegcbcnenf.ills η κ h verschiedenen klassischen Keinigungsveif.ihu n,
wie die Kristallisation oder die Chromatographie, gereinigt werden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Sie zeigen, wie die Erfindung praktisch durchgeführt werden kann. Es werden folgende Maßnahmen angewandt:
a) Die gefärbten Extrakte werden durch Spektrophotometrie bei 480 nm unter Bezugnahme auf eine Eichlisung von Daunorubicin in dem gleichen Lösungsmittel bestimmt,
b) die Identifizierung des Antibiotikums 20.798 R.P. erfolgt durch Dünnschicht-Chromatographie an Siliciumdioxidgel durch Vergleich der Rf-Werte der erhaltenen Produkte mit dem von Daunorubicin oder des Antibiotikums 20.798 R.P. in dem gleichen Lösungsmitteisystem,
c) die Erzeugung des Antibiotikums 20.798 R.P. wird, ausgehend von den Dünnschicht-Chromatogrammen, entweder durch Vergleich der Intensitäten der entsprechenden Flecken des Extrakts mit den des ais Bezug verwendeten reinen Antibiotikums 20.798 R.P. oder durch Vergleich eier Flächen der an der Ablesevorrichtung einer »Chromosanw-Platte aufgezeichneten Peaks oder schließlich durch colorimetrische Bestimmung des aus dem chromatographischen Träger in der Höhe des Fleckens des gewünschten Produkts eluicrten Antibiotikums 20.798 R.P. bestimmt.
Beispiel 1
Man stellt ein Kulturmilieu A mit der folgenden Zusammensetzung her:
Autolysatpulver von Bierhefe
(»yeast amine«) 5 g
Monokaliumphosphat 1 g
Dikaliumphosphat 1 g
Destilliertes Wasser 900 cm1
Nach Einstellen des pH-Wertes durch Zusatz von 1 η-Natronlauge auf 6,9 wird das Milieu 20 Minuten bei 122° C sterilisiert. Nachdem Abkühlen fügt man 100 cm-' einer sterilen Glucoselösung von 50 g/l zu.
Man impft eine Kulturflasche von 300 cm3, die 50 cm3 des Milieus enthält, dessen pH-Wert 6,9 beträgt, mit 2,5 cm3 einer Inoculum-Kultur des Stammes Corynebacterium simplex ATCC 6946 an. Die Kultur wird während 24 Stunden auf einer mit 220 Umdrehungen/Min, bewegten Platte in einer Umgebung von 30°C entwickelt. In die gut entwickelte Kultur, deren pH-Wert 7,45 beträgt, fügt man darauf 1 cm3 einer wäßrigen Lösung von 10 mg/cm' Daunorubicin-Hydrochlorid. Die Reduktionsphasc wird darauf während 24 Stunden unter den für die Entwicklung der Kultur verwendeten Rühr- und Temperaturbedingungen durchgeführt.
Bei beendeter Reduktion wird die gesamte Kultur, deren pH-Wert 8,4 beträgt, mit 25 cm1 eines Boratpuffers so behandelt, daß der pH-Wert auf 9 gebracht wird und anschließend mit 2 χ 50 cm3 einer Mcthylenchlorid/ n-Butanol-Mischung (80 bis 20 Volumenteile) extrahiert. Die organischen Extrakte werden an wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Die Ausbeute der Extraktion (90%) wird durch spcktrophotornetrischc Messung der Absorption bei 480 nm im Vergleich mit der von Daunorubicin uner den gleichen Beding jngcn bestimmt.
Die Produktion von 20.798 R.P. wird durch Dünnschicht-Chromatographie der organischen Extrakte an Siliciumdioxidgel bestimmt. Die Volumen der gebildeten Extrakte entsprechen den Mengen der gefärbten Produkte, ermittelt durch spektroskopische Bestimmung zwischen 1 und 10 ng. Die Platten werden mit der folgenden Mischung entwickelt:
Methylenchlorid — Ameisensäure — Methanol
(80—17—3 Volumenteile), um eine gute Trennung von Daunorubicin und dem Antibiotikum 20.798 R.P. zu erzielen, und die Rf.-Werte der erhaltenen Produkte werden mit denen der Bezugsverbindungen verglichen, die unter den gleichen Bedingungen Chromatographien wurden. Die Bestimmung der quantitativen Erzeugung von 20.798 R.P. zeigt, daß die Kultur von Corynebacterium simplex ATCC 6946 das Daunorubicin mit einer Ausbeute von 73%, bezogen auf das eingesetzte Daunorubicin, zum Antibiotikum 20.798 R.P. reduziert.
Beispiel 2
a) Entwicklung der Rcdük!ionsku!iur
Die Erzeugerkultur wird in einem Fermenter von 800 1, beschickt mit den folgenden Substan7en, hergestellt:
Autolysatpulver von Bierhefe
(»yeast amine«) 2,50 kg
Monokaliumphosphat 0,50 kg
Dikaliumphosphat 0,50 kg
Leitungswasser auf 460 I
Nach Einstellung des pH-Wertes des Milieus auf 6,90 durch Zugabe von 225 cm3 10 η-Natronlauge sterilisiert man das Milieu durch Einsprudeln von Dampf auf 122°C während 40 Minuten. Nach dem Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon wegen der Kondensation von Dampf im Verlauf der Sterilisation 494 1; es wird auf 500 1 durch Zugabe von 61 einer wäßrigen sterilen Lösung ergänzt, die enthält:
Glucosemonohydrat
2,50 kg
Der pH-Wert des Milieus beträgt 6,90. Man impft mit 500 cm3 einer Inoculum-Kultur des Stammes Coryne-
•n bacterium simplex ATCC 6946 an. Die Kultur wird bei 3O0C entwickelt, wobei man mit einer Turbine von 160 Umdrehungen/Min, rührt und mit einem Volumen von 18 mVStunde steriler Luft belüftet. Nach 48 Stunden ist die Kultur zur Bewirkung der biochemischen Umwand-
>o lung von Daunorubicin zum Antibiotikum 20.798 R.P. geeignet.
Man bringt in die Kultur 4 I einer wäßrigen 1 ösung ein,die enthält:
Daunorubicin-Hydrochlorid 108 g
Die Inkubat'on erfolgt während 24 Ständen bei 300C,
wobei man rührt und mit einem Volumen von 15mVStund'? steriler Luft belüftet. Das Daunorubicin wird mit c'nem Reduktionsgrad von etwa 85% zum
mi Antibiotikum .cduziert.
b) Extraklion
Zu 480 I der vorstehend erhaltenen Fermentationswürze fügt man 55 cm3 5 η-Natronlauge, um den ι ι pH-Wert auf 9 zu bringen. Das wirksame Prinzip wird durch Extrahieren im Gegenstrom mit einer Mischung von n-Bulanol-Wasser (6 bis 4 Volumenteile) auf 2 Zentrifugen extrahiert. Der Extrakt, dessen Volumen
305 I beträgt, wird unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bei 40 C bis auf ein Volumen von 20 1 konzentriert.
Der kon/cntricrle Mxtrakl wird mil to I Wassei gewaschen, das auf einen pH-Wert von 9 alkalisch gemacht wurde. Fun Teil des Antibiotikums 20.7SH R.F'.. das mit dem Waschwasser mitgeschleppt wurde, wird zweimal mit 10 1 Methyicnchlorid extrahiert Die Methylene hloridphasc wird auf ein Volumen von 10 I konzcntricrl. und man fügt 10 I n-Butanol zu. Nach dem Konzentrieren auf 5 I vereinigt man das Konzentrat mit dem ersten Biitanolcxtrakt und engt nochmals bis auf ein Volumen von 5 I ein. Man fügt darauf unter Rühren 50 cm1 n-Butanol zu, das 10 Volumcn-% 10 n-Chlorwassersloffsäurc enthalt und konzentriert unter verminder tem Druck (5 bis 10 mm Hg) bei 40 C auf ein Volumen von 3 I.
Das Antibiotikum 20798 R.P. wird in Form des llydrochlorids durch langsame Zugabe der erhaltenen !.ösurig /;; 30! Hexan unter Rühren 2!!c."ci:i!i!. Der Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhall so 105 g des Hydrochlorids des rohen Antibiotikums 20.798 RP.
c) Reinigung
159 g des llydrochlorids des Antibiotikums 20.798 R.P.. das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, werden in 795 cm1 Methanol gelöst Das Produkt, das auskrislallisicrl. wird abgesaugt, gewä sehen und getrocknet. Man erhall so ItIp des Ifydrochloridsdcs Antibiotikums 20.79« R P. in kiislalli ncr Iorm mil einer Reinheit von 80%.
111 g des so erhaltenen Produkts werden in 666 cm1 Wasser gelöst. F>ic Lösung wird über eine sterilisier ti Membran (Porendurchmesser 0.22 μ) filtriert Das Hydrochlorid des Antibiotikums 20.798 R F". kristallisierI durch langsamen Zusatz von 6,6 I Aceton Die Kristalle werden abgesaugt, gewaschen und getrocknet Man erhalt so 93.1 g des reinen Hydrochlorids des Anlibioti kums 20.798 RP. als Hydrat mit 7.8% Wassei. Drehvermögen [t] -1176.9118'.
Beispiel J
Man stellt ein Milieu der Kultur A her und verteilt es in Kulturflaschcn von 300cm1, wie in Beispiel I beschrieben. [)ic sterilisierten Haschen werden mil einer Inoculum Kultur des Stammes Coryncbacterium simplex AT CC 6946 angeimpft und 24 bis 48 Stunde π auf einer bewegten Platte von 220 Umdrehungen/Min bei 30'C inkubiert.
Man fügt darauf zu der gesamten Kultur das Daunorubicin in Form von:
a) einer wäßrigen Lösung von 10 mg/cm3 des reinen Produkts in einer Menge von 1 oder 2.5 cm' pro Flasche (0.2 oder 0,5 g/I).
b) einer wäßrigen Fxisung von 10 mg/cm' eines Rohprodukts, das 47% 13.057 RP. enthält, in einer Menge von 1 oder 2,5 cm3 pro Rasche (0,095 oder 0,24 g/l Daunorubicin).
Die Flaschen werden darauf während wenigstens 24 Stunden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen inkubiert und auf die gleicht Weise behandelt Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgende η Λ abc lic aufgeführt:
Keduklioiismilk'ii
ltIihUcmcs AnIihint:Kum /117'JR RP. (in '".·)
ve)ii Menge elcs /ugefiigk Il I)1IlI 0.(WS 0.74
noruhi eins (in g/h X7 W)
von reines l'rnelukl Rohprodukt
0.7 0.5 7K (VI
(icsamikiiltur von 7.1 42
24 Stunden 89 58
(jesanilkiillur 74 53
30 Stunden ,
(jcsamtkultur 90 70
48 Stunden
M,„ ..„Hi Beispiel 4
Bedingungen Kulturen des Slamnies Corynebacterium simplex ATCC 6946 her. Mit diesen 24 oder 30 Stunden gealterten Kulturen führt man eine Hcduklie>n von Daunorubicin durch, das in dem oxalsäurchaltigen I iltrat einer Kultur des Stammes Strcptomyccs eocrulcemibidiis NRRI. 3045. dem Oz.cugei von Daunorubicin. enthalten ist. Dieses von Oxalsäure durch Behandlung mil Calciumcarbonat befreite I iltrat enthält 90 ro /' Daunorubicin und sein pH-Wert beträgt 7,0. Es wird in einer Menge \on I Volumenteil pre> I Volumenteil der (icsamtkiiltur von Corynebacterium simplex verwendet. Die 50cm1 dics?r Rcaktieinsmi schung enthalicndcn Flaschen (0,045 g/l Fiauneirubicin) werden darauf mindestens 24 Stunden unter den in Beispiel t beschriebenen Bedingungen inkubiert und aiii die gleiche Weise behandelt
Die 24 und 30 Stunden gealterten Kulturen von Corynebacterium simplex ATCC 6946 reduzieren das Daunorubicin zum Antibiotikum 20.798 R.P. mit Aus beuten von 84 bzw. 100%, bezogen auf das eingesetzte Daunorubicin.
Beispiel 5
Man stellt unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen Kulturen des Stammes Corynebacterium simplex ATCC 6946 her und erntet die erzeugten Zellen durch Zentrifugieren der während 30 Stunden entwikkellen Kulturen. Die Reduktion von Daunorubicin (mit verschiedenen Reinheitsgraden) zum Antibiotikum 20.798 RP. wird unter Anwendung dieser Zellen in Suspension durchgeführt:
a) in 50 cm1 eines 0,15-m- Phosphatpuffers vom pH-Wert 8,0, dem 23 cm3 (0,5g/l) einer wäßrigen LxJsung von 10 mg/cm1 reinem Daunorubicin zugesetzt wurden,
b) in 50 cm3 eines 0.15-m-Phosphatpuffers vom pH Wert 8,0, dem 25 cm3 (0,24 g/l) einer wäßrigen Lösung von 10 mg/cm3 Daunorubicin in Form eines Rohprodukts, das 47% reines Daunorubicin enthielt, zugesetzt wurden.
c) in 50 cm3 eines Oxalsäurefiltrats einer Kultur des Stammes Streptomyces coeruleorubidus NRRl. 3045, hergestellt gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Behandlungsweise.
Unter diesen Bedingungen enthält das Rcaktionsmi lieu 0,090 g/l reines Daunorubicin.
IO
Die Maschen werden anschließend 24 Stunden unter i\cn in Heispiel I beschriebenen Hcdingiingen inkubiert und iiuf die gleiche Weise behandelt. Die Ausbeuten un Antibiotikum 20.7^S R.P. liegen folgendermaßen:
85%, ausgehend von 0,5 g/l im reinen Zustand verwendeten Daimorubicins,
77%, ausgehend von 0,24 g/l in l'orm eines Rohprodukts nut 47% Daunorubicin verwendetem Daunorubicin,
91%, ausgehend von 0,090 g/1 von in dem Filtirat einer Kultur von Streptoniyccs coeruleorubidus enthal tenem Daunorubicin.
Beispiel 6
InoculumKulturen von Bacterium eyelooxydans ATCC 12.67 3, Streptomyces roseochromogenes ATCC I i.4(X) und Streptomyces lavendulae ATCC 8664 werden /ur Animpfung der Milieus A, H und C (in der nachfolgenden Tabelle definiert) in JOO cm1 Kulturflaschi:n mit einer Menge von 50cm' pro flasche angeimpft. Die Kulturen werden bei 26 oder 30"C auf mit 220 Umdrehungen/Min, bewegten Platten bis /ur Erzielung einer beträchtlichen Biomasse entwickelt. Main fügt darauf in jede Flasche 1 oder 2,5 cm1 einer wäßrigen Daunorubicinlösung von 10 mg/cm1 (0,2 bis 0,5 g/l) und die Reduktion wird durchgeführt, wobei die Flaschen wahrend 1 bis 3 Tagen nach der Zugabe unter den gleichen Temperatur- und Rührbedingungen wie den /ur Entwicklung der Kultur angewendeten, gehalten wurden. Die Kulturen werden unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen behandelt und analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
Verwendete Mikro Kntwicklungsniilieu S /ur I-ntwicklung Alter der Irhaltenes
organismen (Zusammensetzung in g/l) 5 und Reduktion ver Kulturen Antibiotikum
I wendete Be /um Zeit 20 798 R.l\
I dingungen punkt der in "A
( I emper.itur; Zugabe von
Hewegung) Daunorubi /U gefügtes
20 cin Daunorubi-
4,1 ein in g/l
\0 0.2 0,5
IJ. eyelooxydans Milieu A: 1,0
AIC ( 12 673 2.5
yeast amine M) ( ; 24 Std. 72
Glucose. 220 Upm/Min. 30 Std. 72 19
Monokaliumphosphat 30
Dikaliumphosphat 50
S. roseochromogenes Milieu H: 5
ATCC 13 400 I
Sojamehl 2,5 26 C; 30 Std. 35 52
Cilucose 220 Upm/Min. 54 Std. 48 32
Sojaöl
Dikaliumphosphat
Calciumcarbonat
S. lüvendulae Milieu C:
A rCC 8 664
Sojamehl 26 C; 30 Std. 29 31
Glucose 220 Upm/Min. 54 Std. 30 21
Sojaol
Monokaliumphosphat
Calciumcarbonat
Die in der Beschreibung und den Patentansprüchen genannten Mikroorganismenstämme ATCC und NRRL sind bekannt, in der American Type Culture Collection, Washington, D.G, USA, bzw. im Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt und der Öffentlichkeit zugänglich.
Beispiel 7
Wein1 einer Kultur von Coiyntbatteriiim simplex λ TCC 6946. entwickelt während JO Stunden unter len im vorstehenden Beispiel 'beschriebenen Bedingungen. werden steril in einen 300-cm3-Erlenmeyer-Kolben überführt Nach Einstellen des pH-Wertes auf 7 fügt man 0.25 g Lysozym zu und bringt den Kolben während einer Stunde bei 37° C auf einen mit 200 Umdrehungen/ Min. bewegten Rührer auf. Nach dem Zentrifugieren fügt man zu Jer überstehenden Flüssigkeit 10 mg Daumirubicinhydrochlorid. Die so erhaltene Lösung wird unter Jen in Beispiel I beschriebenen Bedingungen inkubiert. Nach 16 Stunden ist das Daunorubicin zum Antibiotikum 20 7)8 RP. mit einer Ausbeute von 21% redii/itrt.
H 12
. (25 kH/) wahrend I r> Minuten bt;i einer I empcratur von
Beispiel 8 c|wa q,,^. N;Rh t|L.M1 zentrifugieren fügt man /u der
50 cm1 einer Kultur von (orynebacterium simplex überstehenden flüssigkeit IO mg Daunorubicinhydro-
A FCC 6946, während 30 Stunden unter den in Beispiel 2 chlorid. Die so erhaltene Lösung wird unter den in
angegebenen Bedingungen entwickelt, werden steril in , Beispiel I beschriebenen Bedingungen inkubiert. Nach
einen 300-em'-Erlenmeyer Kolben überführt. Ansehlie- 16 Stunden ist das Daunoruhiein in einer Ausbeute von
Bend wird der pH-Wert auf 7 eingestellt, und man 7J% zum Antibiotikum 20.798 R.I'. reduziert,
unterzieht die Kultur der funwii kurig von Ultraschall

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 20.798 R. P. mit der Formel
    O OH CH OH —CHj
    -O
    O OH 0-CH-CH1-CH-Ch-CH-CH3
    OCHj I I
    NH2 OH
DE2456139A 1973-11-27 1974-11-27 Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 20.798 R.P Expired DE2456139C3 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR7342191A FR2252352B1 (de) 1973-11-27 1973-11-27

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2456139A1 DE2456139A1 (de) 1975-05-28
DE2456139B2 true DE2456139B2 (de) 1978-12-14
DE2456139C3 DE2456139C3 (de) 1979-08-23

Family

ID=9128332

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2456139A Expired DE2456139C3 (de) 1973-11-27 1974-11-27 Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 20.798 R.P

Country Status (16)

Country Link
US (1) US4013515A (de)
JP (1) JPS5320597B2 (de)
AT (1) AT335597B (de)
BE (1) BE822618A (de)
CA (1) CA1022096A (de)
CH (1) CH586642A5 (de)
DE (1) DE2456139C3 (de)
DK (1) DK135843B (de)
ES (1) ES432340A1 (de)
FR (1) FR2252352B1 (de)
GB (1) GB1459538A (de)
HU (1) HU168297B (de)
IE (1) IE40748B1 (de)
NL (1) NL7415044A (de)
SE (1) SE7414848L (de)
ZA (1) ZA747509B (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1567392A (en) * 1977-02-22 1980-05-14 Farmaceutici Italia Daunorubicin derivatives
US4077844A (en) * 1977-03-30 1978-03-07 The Upjohn Company Process for preparing steffimycinol
JPS57159496A (en) * 1981-03-28 1982-10-01 Sanraku Inc Preparation of adriamycin
CN101802168B (zh) * 2007-09-14 2013-06-12 明治制果株式会社 非天然型抗生素的制造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH560174A5 (de) * 1965-09-14 1975-03-27 Schering Ag
IE35993B1 (en) * 1971-01-20 1976-07-21 Rhone Poulenc Sa Process for the preparation of antibiotics 20,798 rp and 27,706 rp and the antibiotic 27,706 rp

Also Published As

Publication number Publication date
JPS5320597B2 (de) 1978-06-27
FR2252352A1 (de) 1975-06-20
DK135843C (de) 1977-12-05
DK614774A (de) 1975-07-28
CH586642A5 (de) 1977-04-15
AU7573074A (en) 1976-05-27
DE2456139C3 (de) 1979-08-23
ATA950574A (de) 1976-07-15
IE40748L (en) 1975-05-27
FR2252352B1 (de) 1978-11-03
USB527040I5 (de) 1976-03-23
BE822618A (fr) 1975-05-26
DE2456139A1 (de) 1975-05-28
ZA747509B (en) 1976-01-28
AT335597B (de) 1977-03-25
HU168297B (en) 1976-03-27
ES432340A1 (es) 1977-02-16
NL7415044A (nl) 1975-05-29
DK135843B (da) 1977-07-04
CA1022096A (en) 1977-12-06
US4013515A (en) 1977-03-22
GB1459538A (en) 1976-12-22
JPS5082285A (de) 1975-07-03
IE40748B1 (en) 1979-08-15
SE7414848L (de) 1975-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3242849C2 (de)
DE2413963C3 (de) Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure und deren Salzen auf mikrobiologischem Wege
EP0366060B1 (de) Glykosidase-Inhibitor Salbostatin, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
CH634103A5 (de) Verfahren zur herstellung des neuen antibiotikums am-2282.
DE3036361A1 (de) Antibiotikum u-59 761, verfahren zu seiner gewinnung und isolierung sowie dabei verwendete biologisch reine kultur des mikroorganismus saccharopolyspora hirsuta, stamm 367 (nrrl 12045,dsm 1886)
DE1957980C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin durch Züchtung eines Streptomyces
DE2849696A1 (de) Verfahren zur herstellung des antibiotikums c-15003 p-3
DE2456139C3 (de) Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 20.798 R.P
DE69218700T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Fermentation
DE2746253C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Maytansinol und dessen Derivaten
DE2445581C3 (de) Verfahren zur Herstellung von D-Gluconsäure-dlactam
EP0236894B1 (de) Efomycin G, seine Herstellung und seine Verwendung als Leistungsförderer bei Tieren
DE2660964C2 (de)
EP0019148B1 (de) Antibiotikum zur Unterdrückung des Wachstums von Mikroorganismen sowie dessen Herstellung durch Fermentation
DE2849666A1 (de) Verfahren zur herstellung des antibiotikums c-15003 p 4
DE3003359C2 (de)
DE2034593A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Citro nensaure
DE1924431C2 (de) Antibiotikum 17967RP und seine mikrobiologische Herstellung
DE2026595A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Antibiotika
DE2746209A1 (de) Neues antibiotikum und verfahren zu dessen herstellung
DE2102793B2 (de) Verfahren zur Herstellung von Lbeta,3,4-Dihydroxyphenyl-alpha alanin durch Fermentation
US2970946A (en) Process for the production of tetracycline by fermentation
DE2746252A1 (de) Antibiotikum c-15003 enthaltendes arzneimittel zur behandlung von tumore aufweisenden warmbluetern
DE3031334C2 (de) Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Cholansäurederivaten
DE1620597A1 (de) Decoyinintriester und Verfahren zu ihrer Herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)
EHJ Ceased/non-payment of the annual fee