DE2224640C3 - Verfahren zur Herstellung von 7-(D-S-Amino-S-carboxy-valeramido-S-icarbamoyloxymethyl)- 7-methoxy-3- cephem-4- carbonsäure - Google Patents

Description

7-(n-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoylox >methyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäureIui[ die planare Strukturformel

O NH, O

Il I ' Il

HOC — CH — CH, — CH, — CH, — C — NH OCH₃

Il

CH₂OCNH₂

COOH

Das Antibiotikum (I) ist eine amphotere Verbindung mit einem scheinbaren isoelektrischen Punkt bei einem pH von etwa 3,5 und ist in Lösung bei pH-Werten von etwa 1,5 bis 9,0 beständig.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3 - (carbamoyloXymethyl) - 7 - methoxy - 3 - cephem-4-carbonsäure durch Züchten von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 in einem Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man dem Fermentationsmedium Glycin, L-Phenylalanin, einen Carbaminsäureester, ein Amid oder Gemische dieser Stoffe zusetzt.

Das Nährmedium enthält durch Mikroorganismen assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salze. Außerdem enthält das Fermentationsmedium Spurenmetalle, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind und gewöhnlich als Verunreinigungen in den übrigen Bestandteilen des Nährmediums enthalten sind. Im allgemeinen kann man Kohlehydrat, wie Zucker, z. B. Saccharose, Maltose. Fructose, Lactose und Stärken. wie Korn, z. B. Hafer und Roggen, Maisstärke und Ma'smehl, für sich allein oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwenden. Die genaue Menge der Kohlehydrate in dem Nährmedium richtet sich zum Teil nach den anderen Bestandteilen des Nährmediums. Es wurde jedoch gefunden, daß Kohlehydratmengen zwischen etwa 1 und 6 Gewichtsprozent des Nährmediums genügen. Man kann eine einzige Kohlenstoffquelle verwenden, aber auch mehrere KohlenstofT-quellen in dem Nährmedium kombinieren.

Zufriedenstellende Quellen für Stickstoff sind die zahlreichen Eiweißstoffe, wie die verschiedenen Formen von Caseinhydrolysaien, Sojabohnenmehl. Mais-Juellwasser, lösliche Schlempebestandteile. Hefeproukte und Tomatenbrei. Die verschiedenen SHckstoffquellcn können ebenfalls für sich allein oder in Kombination miteinander verwendet werden und werden dem wäßrigen Medium gewöhnlich in Mengen von 0,2 bis 6 Gewichtsprozent zugesetzt.

Als »komplexe organische Medien« werden hier Nährmedien bezeichnet, in denen einige der Bestandteile nicht chemisch definiert sind. Ein Beispiel für solche Nährmedien besteht aus Hafer. Sojabohnenmehl. Natriumeitrat. Polyglykol und löslichen Schlempebestandteilen.

Es wurde gefunden, daß die Produktion von 7-(_D.5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethvl) - 7 - methoxy - 3 - cephem - 4 - carbonsäure durch Zusatz von Glycin. L-Phenylalanin, einem Carbaminsäureester der allgemeinen Formel Il oder einem Amid der allgemeinen "Formel III zu komplexen organischen und chemisch definierten Fermentationsmedien erhöht wird. Der Carbaminsäureester bzw. das Amid haben die allgemeinen Formeln

40

45 0 R₁

Il /

ROCN

\
R₂

(H)

(III)

R₅

worin R einen Alkylresl. /.. B. einen niederen Alkylrest. wie den Äthyl-. n-Propyl- oder n-Butylrest u. dgl., bedeutet. R, und R₂ gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome. Alkylreste. z. B. niedere Alkylreste. wie den Methyl-. Äthyl-, n-Propyl- oder n-Butylrest u. dgl., oder niedere Hydroxyalkylreste. z. B. den 2-Hydioxyäthyl- oder 3-Hydroxypropylrest. bedeuten können. R, ein Wasscrstoffatom. einen Alkylrest. wie den Methyl-, Äthyl-. n-Propyl-. η-Butyl-, n-Pcntyl- oder Undecylrest u.dgl.. einen oxo-substituicrtcn niederen Alkylrest, wie den 2-Oxopropylrest. oder einen Arylrest. z. B. einen einkernigen Arylrest. wie den Phenylrest. und R₄. und R,. die ebenfalls gleich oder verschieden sein können. Was>erstoffa'omc. Alkylreste, /.. B. niedere Alkylreste. wie den Methyl-.

fts Äthyl-. n-Propyl-. η-Butyl-, Isobutyl- oder n-Pentylrcst. oder niedere Hydroxyalkylreste. wie den 2-Hydroxyäthyl- oder 3-Hydroxypropylrest. bedeuten köni.jn. während X Sauerstoff oder Schwefel bedeutet.

Die zur Förderung der Erzeugung des An iihioiicums erforderliche Menge an Glycin, !--Phenylalanin. Carbaminsäureester (I I) oder Amid ill!) richte! sich nach dem jeweiligen Medium. Im allgemeinen wird eine erhöhte Erzeugung des Antibioticums in Nährmedien beobachtet, die 0,01 bis 0,10% (alle hier für diese Zusätze angegebenen Prozentwerte beziehen sich auf Geuichtsteile je 100 Raumteile Nährmedium) Glycin und 0.05 bis 0,3% L-Phenylalanin enthalten. Bevorzug! werden Konzentrationen von 0,05",, Glycin und 0.3% L-Phenylalanin. Die Carbaminsäureester (II) und die Amide(III) werden in Mengen von etwa 0.0156 bis 2,0% zugesetzt, und besonders ,nute Ausbeulen erhält man mit N-2-Flydroxyäthylcarbamin säurealkylestern, beispielsweise mit 0.2 bis 0.8% Js;;:-Hy droxyäthyicarbaminsäureäthy !ester.

Ferner wurde gefunden, daß der Zusatz eines Amides d:: nachstehend angegebenen allgemeinen Formel zu ivni Fermentationsmedium einen bedeutenden An-SLJ;-in der A'isbeute des Antibioticums zur Folue hat:

O R₇

Il /

R_nCN

in dieser allgemeinen Formel bedeutet R„ ein V. is^erstoffatom oder einen niederen Alkylrest. wie den Methyl- oder Äthylrest, und R- und R_s Wassersti'Uatome oder niedere Alkylreste. insbesondere Isobuiylreste. Bevorzugt sind Formamid und N.N-Dini'-.lrig-alkylformamide, insbesondere Dimethylformamid und N.N-DiisobutylproL.nnsäureamid: der Zusa;. der letzteren Verbindung zum Nährmedium in Konzentrationen von 0.063 bis 0.125 Gewichtsteilen je |!)0 Raumteile Nährmedium ergibt besonders gute Anbeuten. Glycinkonzentrationen von mehralsO.3%. 1-Phenylalaninkonzentrationen von mehr als 0.5% und Carbaminsäureesterkonzentrationen von mehr al¹· 0.8% vermindern die Erzeugung des Antibioticums.

Glycin. L-Phenylalanin, der Carbaminsäureestei der allgemeinen Formel Il und oder das Amid der allgemeinen Formel III brauchen nicht für sich allein angewandt zu werden, sondern können miteinander kombiniert werden, um einen Zusatz /u erhalten, der eine besonders gute Ausbeute an dem Antibioticum ergibt. So eignet sich z. B. die Kombination von 0.05% Glycin. 0,3% L-Phenylalanin und einer gewissen Menge Carbaminsäureester (II) und oder Amid (NI) im Bereich einer Endkonzentration von 0.0156 bis 2.0% besonders zur Erhöhung der Ausbeute an dem Antibioticum. Vorzugsweise ist der Carbaminsäureester in dieser Kombination N-2-Hydroxyäthylcarbaminsäureäthylester. seine Konzentration im Nährmedium beträgt 0,2 bis 0.8%. und das Amid ist N.N-Diisobutylpropionsäureamid. und dessen Konzentration im Nährmedium beträgt 0.063 bis 0.125%.

Obwohl das Antibioticum (I) gemäß der Erfindung in Oberflächenkultur oder in Submerskultur erzeugt werden kann, führt man die Fermentation vorzugsweine in Submerskultur durch. Fermentationen in kleinem Maßstabe werden zweckmäßig durchgeführt, indem man geeignete Mengen des Nährmediums in Kolben einbringt, die Kolben und ihren Inhalt durch f>s Erhitzen auf !20⁰C sterilisiert, die Kolben entweder mit Sporen oder mit einer vegetativen Zellcnkultur von Siicptumyces iaciaiiiduiain NRRL 3802 beimpft.

die Hälse der Kolben locker mit Watte verschließt und die Fermentation 3 bis 5 Tage bei einer konstanten Raumtemperatur von etwa 28 C in der Schütielmaschine durchführt. Für Arbeiten im größeren Maßstab führt man die Fermentation vorzugsweise in großen Behältern mit Rührwerk und Belüftungseinrichtung für das Fermentationsmedium durch. Bei dieser Methode wild das Nährmedium im Behälter angemacht und durch Erhitzen auf 120 C sterilisiert. Nach dem Kühlen wird das sterilisierte Medium mit einer vegetativen Zellenkultur des Streptomyces beimpft und die Fermentation 2 bis 4 Tage unter Rühren und oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung einer Temperatur von etwa 28 C durchgeführt. Diese Methode zur Erzeugung von 7-(D-5-Amino-5-carbo.xyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy-3-cephem-4-carbonsäure eignet sich besonders für die Herstellung des neuen Antibioticums in großen Mengen.

Die Fermentation kann bei Temperaturen von etwa 20 bis 37 C durchgeführt werden. Zur Erzielung der besten Ergebnisse ist es jedoch am zweckmäßigsten, die Fermentationen bei Temperaturen zwischen 26 und 30 C durchzuführen. Der pH-Wert des zum Züchten des Streptomyces und zur Erzeugung des Antibioticums geeigneten Nährmediums kann im Bereich von etwa J bis 9 variieren. Vorzugsweise arbeitel man jedoch bei pH-Werten von etwa 6.0 bis 7.5.

Zur Durchführung der Erfindung stellt man eine Zellensuspension her. indem man steriles Medium einer Agar-Schrägröhrchenkukur des Streptomyces zusetzt. Das Erzeugnis der Schrägröhrchenkultur wird dann zum Beimpfen eines Saatkolbens verwendet, und der Saatkolben wird 1 bis 3 Tage bei 28 C geschüttelt, um ein gutes Wachstum zu erzielen. Dann wird der Saatkolben zur Beimpfung der Produktionskolben verwendet. Man kann den Saatkolben auch mit einer gefriergetrockneten K ultur oder einem eingefrorenen Impfgut beimpfen.

Die Beimpfung wird im allgemeinen mit 1 ml je 40 ml Produktionsmedium durchgeführt. Dann werden die Zusätze in den gewünschten Konzentralionen in die Produktionskolben eingegeben, und die Fermentation wird 2 bis 4 Tage unter Rühren und oder Belüftung des Nährmediums und Innehalturig der Temperatur von etwa 28 C durchgeführt. Alle Prodiiktionskolben. d.h. diejenigen Kolben, die die Zusätze enthalten, und diejenigen Kolben, die für die Leerversuche verwendet werden, werden dann, irr allgemeinen nach 96 Stunden, analysiert, um die Mengt an Antibioticum zu bestimmen, die sich in jedem Kolben gebildet hat.

Das ,Antibioticum 7-(n-5-Amino-5-carbox_\valer amido) - 3 - lcarbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy 3-cephem-4-earbonsäure wird zweckmäßig nach dei Scheiben - Plattenmethode unter Verwendung vor Vibrio percolans MB-1272 (ATCC 8461) als Test Organismus analysiert. Man verwendet Scheiben vor 9.5 cm Durchmesser. Aus bekannten Konzentrationei des Antibioticums wird eine Standardkurve erstellt und die Aktivität wird in ;- je ml freier Säure uusge drückt.

Dann werden die Produktionskolben analysiert indem man die Probe mit 0.02-molarer Phosphat pufferlösung (pH 7) auf eine geeignete Konzentralioi verdünnt. Der Testorganismus ist Vibrio percolan MB-1272 (ATCC 8461). und als Analysenmediun verwendet man Nähragar 4- 0.2% Hefeexlrakt. Di'

Scheiben werden in eine genormte Lösung des Antibioticums getaucht, die 5 ν Antibioticum je ml enthält, und abwechselnd mit der Probe auf die Plane gelegt. Die Platten werden IS Stunden bei 37 C ui'kubiert. worauf man die Zonendurchmesser in Millimeter bestimmt. Es werden fünf Normpiauen verwendet, die vier Konzentrationen des genormten Antibioticum von 25 bis 20 ;■ ml enthalten. Die Analyse wird mit Hilfe eines Nomcgramms berechnet, und die Ergebnisse werden in γ ml angegeben.

Das Antibioticum läßt sich aus dem Fermentatior.smedium nach verschiedenen Verfahren gewinnen. Man kann die filtrierte Fermentationsflüssigkeit durch eine oder mehrere Ionenaustauschersäulen hindurchleiten. Da das Antibioticumli) eine amphotere Verbindung ist. kann man sowohl mit Kationen- als auch mit Anionenaustauschharzen arbeiten, um die beste Gewinnung zu erzielen. Das adsorbierte Antibioticum w ird dann, vorzugsweise mit einem flüchtigen Lösungsmittel, wie Pyridin. das sich leicht entfernen läßt, eluiert.

Das Antibioticum 7 - (d - 5 - Amino - 5 - carboxyvaleramido) - 3 - (carbamcyloxymethyi) - 7 - methoxy-3-cephem-4-carbonsäure(I) und seine Salze hemmen das Wachstum von verschiedenen gram-negativen und gram-positiven Mikroorganismen.

Beispiel 1

Herstellung des Antibioticums: durch Zusatz von
Glycin abgeändertes Fermentaikmsverfahren

Stufe A
Schrägröhrchen

Ein gefriergetrocknetes Glas mit einer Kultur von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 wird aseptisch geöffnet und der Mikroorganismus auf ein Medium der folgenden Zusammensetzung übertragen. Zweite Aussaat

Medium I

1% Melasse.
1 % Brauereihefe,
2.5% Agar. pH 7,0,
mit Wasser aufgefüllt.

Die Schrägröhrchen werden 7 Tage bei 2X ( inktibiert. Wenn sie in der Kälte aufbewahrt werden, halten sie sich länger als 13 Wochen.

Stufe B

Saatstufen: Zweistufiges System
Erste Aussaat

Die erste Aussaat wird direkt aus dem Schrägröhrchen der Stufe A auf 40 ml 1 %iger primärer Trokkenhefe bei einem oH-Wert von 7.0 in einem 250 ail-Erlenmeyerkolben, der im Kolbenboden Vertiefungen aufweist, aufgeimpft. Dann werden die Kolben 2 bis 3 Tage bei 28 'C in einer rotierenden Schüttelmaschine mit 220 U min bei einem Hub von 5 cm ue

Ein 2,5%iges Impfgui von der ersten Aussaat wird in einen Kolben eingegeben, der 2% Hefeautolysat bei einem pH-Wen von 7,0 enthält, in dieser Stufe isi die Kultur charakteristisch hell, und die Inkubation, die so wie in der ersten Stufe bei 28 C durchgerührt wird, wird nicht über 48 Stunden hinaus ausgedehnt.

Stufe C

Grundproduktionsmedium

Das Grundproduktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Medium 11

Losliche Schlempebestar.dteile 3.0%

Primäre Trockenhefe 0.75%

Schaumveihütungsmittel aus

Paraffinwachs, 40,5 Gewichtsprozent
ölsäure, 4.5 Gewichtsprozent

Wasser. 55.0 Gewichtsprozent .... 0.25%
25

Dieses Medium wird mit etwas ke-nzentrierter Natronlauge auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt, auf Erlenrneyerko'iben verteilt und L5 bis 20 Minuten bei 121C im Autoklav behandelt. Nach dem Kühlen wird das Medium mit einem 2,5%igen Impfgut der in Stufe B durchgeführten zweiten Aussaat beimpft. Die Inkubation erfolgt drei Tage bei 28 C mit 220 U min in einer Schüttelmaschine bei einem Hub von

.15 5 cm.

Wenn die Fermentation beendet ist. werden die Zellen abzentrifugiert. und die Fermentationsflüssigkeit wird mit PhosphatpufferlösunglpH λΰ) verdünnt. Die Konzentration der 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy -3 -cephem-4-carbonsäure in der Fermentationsflüssigkeit wird nach der biologischen Scheiber-Analysenmethode bestimmt. Als Testorganismus ve» wendet man Vibrio percolans (ATCC 8461). Filterpapierscheiben werden in verdünnte Fermentationsflüssigkeiten getaucht und auf agarhaltige Petrischalen aufgelegt, die mit dem Testorganismus Vibrio percolans (ATCC 8461) beimpft worden sind. Ferner werden auf diese Petrischalen Scheiben aufgelegt, die zuvor in genormte Lösungen mit bekannten Konzentrationen von 7-(D-5-Amino .5-carboxyvaleramido)-3-(carbam(nloxymethy!)-7-rnethoxy-3-cephem-4-carhorisäure getaucht woruen sind. Die Scheiben werden über Nacht bei 28 C inkubiert und die Durchmesser der Hemmungszonen verzeichnet. Die Konzentration an 7-(n-5-Amino-5-earboxyvaleramido)-3-(carbamo\loxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure in der Fermentationsflüssigkeit wird durch Interpolieren aus der Standardkurve berechnet, die die Beziehung zwischen dem Hemmungszonendurchinesser und bekannten Konzentrationen der 7-(n-5-Amino-5-u\rboxyvaleram.do)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-metho\y-3 - cephem - 4 - carbonsäure - Normlösungen angibt. Nach diesem Verfahren wird berechnet, daß Streptomyees lactamdurans NRRL 3802 in dem Grundproduktionsmedium im Mittel 80,4-· ml 7-|t>5-Amino - 5 - carboxy valeramido)- 3 -(carbamoyloxy metin !)-7-metho\y-3-cephem-4-carbonsäure erzeugt.

Stufe D
Zusatz von Glycin

Der Zusatz von Glycin zu dem Medium II in Stufe C erhöht die Ausbeute an 7-(i>-5-Amino-5-carho.N \ valcramido)-3 -lcarbnmovlox s met h yl I- 7-met ho \\ 3-ccphem-4-carbonsäurc beträchtlich. Das Ausmaü dieser Produklionssteigerunu für verschiedene Komzcntrationcn ergibt sich aus IaOeIIc I. Die Werte dieser Tabelle stammen aus drei Versuchsreihen, in denen der I.ecrvcrsuch jeweils in der für die Stufen A bis C beschriebenen Weise durchgerührt wird, während die übrigen Versuche in der gleichen Weise, aber mit Zusatz der angegebenen Menge an Glycin, durchgeführt werden. Die Analysen werden ebenso wie in Stufe C durchgerührt.

Tabelle I

Versuch

Leerversuch

Leerversuch

Lecrversuch

(ilscin/iisal/ \
/u Medium

0.01
0.10

0.05
0.10

0.075
0.1(K)
0.125

AnIibiolicumer/cuguni!

I; mlI

77 M 97

76

106

93

S8 113 113

9S

/unahmc

gegen ü her

I.ecrvcrsuch

IO 26

41

2X 2S Il

Versuch

ι -Phcnylalanin/usat/

/u
Medium Il

3 j 0.3

cei versuch

0.1

Anlibiolicumer/cugung

I; ml)

90

S 5 KK)

/unahmc gegenüber l.cerversuch

1%)

34 18

B e i s ρ i e I 3

Herstellung des Antibioticum*: Zusatz von I-Pheny!alanin und Glycin

Man arbeitet nach Beispiel I. jedoch unter Zusatz von ι-Phenylalanin zu dem Grundprodiiktionsmedium. welches bereits 0.05% Glycin enthält. Dieses Medium, das nachstehend als Medium III bezeichnet wird, hat die folgende Zusammensetzung:

Medium III

3.0" r 0 7S"

Lösliche Sclilempcbestandtcile .

²^ Primäre Trockenhefe

St !■.aiimvcrhiitungsmillcl aus Paraffinwachs. 40.5 Gewichtsprozent ölsäure. 4.5 Gewichtsprozent Wasser. 55.0 Gewichtsprozent . . . . 0.25'Ό Glycin 0.05",,

In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen. in denen das i.-Phenylalanin zugesetzt wird, und die darauf zurückzuführenden Ausbeuteerhöhungen an Antibioticum (I) angegeben.

Hieraus ergibt sich, daß ein Zusatz von 0.05" η Glycin zu dem Produktionsmedium die Ausheute an 7-(n-5-Amino-5-carboxy\alcramido)-3-lcarbamovloxymethvll-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure am wirksamsten erhöht.

B e i s ρ i e I 2 ₄₅

Herstellung des Antibioticums: Zusatz von !.-Phenylalanin

Man arbeitet nach Beispiel 1. jedoch unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen an [.-Phenylalanin an Stelle des Glycins in Stufe D. In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen, in denen das ι.- Phenylalanin zugesetzt wird, und die darauf zurückzuführenden Ausbeutesteigerungen an Antibioticum (I (angegeben.

Tabelle!!

Versuch

L-Phenylalaninzusatz

zu
Medium II

Leerversuch

0.05
0.1

Antibioticumerzeugung

I- mil

76 82

77

Zunahme gegenüber Leerversuch

	Tabelle	I	Il	el 4	Zunahme gegenüber Leerversuch
Versuch	I.-Phenvl- alanin/usat/ /U Medium III	:Antibioticum-		ril
	. Λ""	l· mil	—
Leerversuch		! 101	23
I	0.1		—
Leerversuch			15
I	0.3		—
Leerver'uch	—		10
1	0.3	124
	Bei spi	103
118
110
121

60 Herstellung des Antibioticums: Zusatz von Carbaminsäureäthylester und Glycin

Man arbeitet nach Beispiel 3. jedoch mit Carbaminsäureäthylester an Stelle des L-Phenylalanins. Als Produktionsmedium verwendet man das Medium III des Beispiels 3. welches 0,05% Glycin enthält. In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen an Carbaminsäureäthylester und die darauf zurückzuführenden Ausbeutesteigerungen an Antibioticum (I) angegeben.

.109 611 Λ44

	9	Antihiiiticum-	Zunahme
		er/eui!iinf!*l	gegenüber l.eerversucl
	Tabelle IV	<;■ ml)	1%)
Versuch	C'arhamin- saiireiilhyl-	109
	esicr/iisat/ zu Medium III	101
Leerversiich		112	2.8
I		141	30
2	0.01	86
3	0.1	126	47
I.ecn ersuch	0.5	124	45
I		118	39
-)	0.3	115	35
3	0.4	98	15
4	0.5	92	8
S	0.6	113
6	0.7	126	Il
Leerversuch	0.8	146	29
I		157	38
	0.1	169	49
3	0.2	165	45
4	0.3	168	4 X
5	0.4
ό	0.5
0.6

Amide, ihre Konzentrationen und die auf ihren Zusatz zurückzuführenden Ausbeuteerhöhungen ergeben sich aus Tabelle V.

Tabelle V

Jeder Ausbeutewert ist der Mittelwert aus acht Ein/el-

Aus den obigen Zahlen ergibt sich, daß ein Zusatz von 0.4" ι. C'arbaminsüureiithylester zu dem Medium III die Ausbeute an Antibioticum III am wirksamsten erhöht.

Beispiel 5 ^₀

Herstellung des Antibiotikums; Zusatz von Amiden

Man arbeitet nach den Stufen Λ bis C des Beispiels I. ledoch mil einer Inkubationszeit in der Stufe C von Tagen bei 28 C und mit einem Grundproduktionsmedium der folgenden Zusammensetzung:

Medium IV

Lösliche Schlempebeslandteile 3.0%

Primäre Trockenhefe 1.0%

Glycin 0.05%

L-Phenylalanin 0.3%

Schaumverhütungsmittel aus
Paraffinwachs, 40,5 Gewichtsprozent ölsäure, 4.5 Gewichtsprozent

Wasser. 55.0 Gewichtsprozent 0.25%

Natriumthiosulfat OJ %

Maisstärke 2.0%

55

6o

Wenn man die in Tabelle V angegebenen Amide zu dem Medium IV zusetzt und im übrigen nach dem Verfahren der Stufe C des Beispiels 1 arbeitet, erzielt man eine Ausbeuteerhöhung an Antibioticum (I). Die

	Επίΐ-	Anti!>iolicumer/eugung. . ,«1	l.eerversuch
Zusatz	kon/entration	mil Zusatz	2
	I'M	I	332 256
hormamid	0.25		354 256
	0.50
M-Methvlform-	1.0	285 254
aniiil	2.0	312 254
N.VDimelhyl-	0.25	287 238	301 256
formamid	0.40	346 273
	0.50	297 238	328 256
	0.80	381 273	387 256
	1.0	388 273
N.N-Diathyl-	0.25	309 254
formamid	0.5	351 254
	1.0	391 254
N.N-Dibut\l-	0.125	260 254
formamid	0.25	285 254	310 256
M-2-H vd ro x\-	0.25		338 256
atln !formamid	0.50		372 256
	1.0		293 256
N.N-Dimcthyl-	0.0312		313 256
ben/amid	0.0625		369 256
	0.125
N.N-Dimctlnl-	n.5	360 254
acetamid	1.0	354 254
	2.0	449 254
N.N-Diätlnl-	0.25	276 238
acetamid	0.5	379 23X
	1.0	335 2IS
N.N-Diprop\l-	0.16	340 238
a ce ta mid	0.31	390 238	296 256
N.N-Dimcthyl-	0.063		330 256
thioacetamid	0.125	28X 254	322 256
	0.25	145 254
N.N-Dimcth\l-	0.5	293 154
acetoacetamid	1.0	286 154
	2.0	380 254
N.N-Dimethyl-	0.5	363 254
propionamid	1.0	369 254
	2.0	282 254	418 256
N.N-Dibutyl-	0.0156		528 256
propionamid	0.0312		350 256
	0.0625		497 256
N.N-Diisobutyl-	0.063		530 256
propionamid	0.125
N,N-Dimethyl-	0,125	322/254
butyratnid	0,25	303/254
	0,5	318/254
N,N-Dimethyl-	0.063	308/254
valeramid	0.125	325/254
	0,25	355/254	291/256
N,N-Dimethyl-	0,0156
dodecanamid

Beispiel 6 Tabelle VI

/usat/

Carbaminsäureäthylester

Carbaminsäuren-propylester

0,2
0,4

0.1
0.2

Antibioticumerzeugung.

;·. ml. mil Zusatz/Leerversuch

353/254 347/254

360/254

348/254

398 273 395273

386/273 417/273 12

Herstellung des Antibioticums; Zusatz von Carbaminsäureestern

Man arbeite» u_ach Beispiel 5, jedoch mit verschiedenen Carbaminsäureestern an Stelle der dort angegebenen Amide. In der folgenden Tabelle sind die Carbaminsäureester, ihre Konzentrationen und die auf ihren Zusatz zurückzuführenden Ausbeutesteigerungen an Antibioticum (I) angegeben. Zusatz

Carbaminsäuren-butylester

N-Methylcarbaminsäureäthylester

N-Äthylcarbaminsäureäthylester

N-Propylcarbaminsäureäthylester

N-2-Hydroxyäthylcarbaminsäureäthylester

N,N-Dimethylcarbaminsäureäthylester

0,2
0,4

0,1
0,2

0,1
0,2

0,2
0,4
0,8

0,2
0,4

Antibioticumerzeugung.

"/ml. mit Zusatz/Leerversuch

321/254
33 1 254

343/254

361/254
363/254

331/254
353/254
349/254

345/273

360/273

323/273

317/273 391/273

389/273 409/273

345/273 442/273 428/273

292/273 339/273

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 7-{u-5-Amino-5 - carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyioxymethy I )-7 - methoxy - 3 - cephem - 4 - carbonsäure durch Züchten von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Fermentationsmedium Glycin, L-Phenylalanin, einen Carbaminsäureester, ein Amid oder Gemische dieser Stoffe

   zusetzt.