DE2224640B2

DE2224640B2 - Verfahren zur herstellung von 7-(d5-amino-5-carboxy-valeramido-3-(carbamoyloxymethyl )-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsaeure

Info

Publication number: DE2224640B2
Application number: DE19722224640
Authority: DE
Inventors: Jerome Morganville Inamine Edward Rahway NJ Birnbaum (V St A)
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1971-05-20
Filing date: 1972-05-19
Publication date: 1973-08-09
Also published as: GB1361764A; CH584285A5; NL7204619A; DE2224640A1; AU458631B2; DD96975A5; NO135186B; AU4233972A; FI49838C; CA986862A; NO135186C; JPS5249071B1; SE385020B; ZA723446B; DK130845B; US3769169A; FR2143671B1; DE2224640C3; FR2143671A1; HU165579B

Description

7-{D-5-Ainino-5-carboxyvaleraniido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure hat die planare Strukturformel

O NH₂ O

Il I Il

HOC — CH — CH₂ — CH₂ — CH₂ — C — NH OCH₃

CH₂OCNH₂

COOH

Das Antibiotikum (I) ist eine amphotere Verbindung mit einem scheinbaren isoelektrischen Punkt bei einem pH von etwa 3.5 und ist in Lösung bei pH-Werten von etwa 1,5 bis 9,0 beständig.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3 - (carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy - 3 - cephem-4-carbonsäure durch Züchten von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 in einem Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man dem Fermentationsmedium Glycin, l-Phenylalanin, einen Carbaminsäureester, ein Amid oder Gemische dieser Stoffe zusetzt.

Das Nährmedium enthält durch Mikroorganismen assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salze. Außerdem enthält das Fermentationsmedium Spurenmetalle, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind und gewöhnlich als Verunreinigungen in den übrigen Bestandteilen des Nährmediums enthalten sind. Im allgemeinen kann man Kohlehydrat, wie Zucker, z. B. Saccharose, Maltose, Fructose, Lactose und Stärken, wie Korn, z. B. Hafer und Roggen, Maisstärke und Maismehl, für sich allein oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwenden. Die genaue Menge der Kohlehydrate in dem Nähnnedium richtet sich zum Teil nach den anderen Bestandteilen des Nährmediums. Es wurde jedoch gefunden, daß Kohlehydratmengen zwischen etwa 1 und 6 Gewichtsprozent des Nährmediums genügen. Man kann eine einzige Kohlenstoffquelle verwenden, aber auch mehrere Kohlenstoffquellen in dem Nähnnedium kombinieren.

Zufriedenstellende Quellen für Stickstoff sind die zahlreichen Eiweißstoffe, wie die verschiedenen Formen von Caseinhydrolysaten, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile, Hefeprodukte und Tomatenbrei. Die verschiedenen Stickstoffquellen können ebenfalls für sich allein oder in Kombination miteinander verwendet werden und werden dem wäßrigen Medium gewöhnlich in Mengen von 0,2 bis 6 Gewichtsprozent zugesetzt.

Als »komplexe organische Medien« werden hier Nährmedien bezeichnet, in denen einige der Bestandteile nicht chemisch definiert sind. Ein Beispiel für solche Nährmedien besteht aus Hafer, Sojabohnenmehl, Natriumeitrat, Polyglykol und löslichen Schlempebestandteilen.

Es wurde gefunden, daß die Produktion von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy - 3 - cephem - 4 - carbonsäure durch Zusatz von Glycin, L- Phenylalanin, einem Carbaminsäureester der allgemeinen Formel II oder einem Amid der allgemeinen Formel III zu komplexen organischen und chemisch definierten Fermentationsmedien erhöht wird. Der Carbaminsäureester bzw. das Amid haben die allgemeinen Formeln

40

45

O	Ri	/	ROCN	\	/
Il		R4	R₃CN.
X
Il	\

(Π)

(ΙΠ)

worin R einen Alkylrest, z. B. einen niederen Alkylrest, wie den Äthyl-, n-Propyl- oder n-Butylrest u. dgl., bedeutet, R, und R₂ gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, Alkylreste, z. B. niedere Alkylreste, wie den Methyl-, Äthyl-, n-Propyl- oder n-Butylrest u. dgl., oder niedere Hydroxyalkylreste, z. B. den 2-Hydroxyäthyl- oder 3-Hydroxypropylrest, bedeuten können, R₃ ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest, wie den Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, η-Butyl-, n-Pentyl· oder Undecylrest u. dgl., einen oxo-substituierten niederen Alkylrest, wie den 2-Oxopropylrest, odei einen Arylrest, z. B. einen einkernigen Arylrest, wi( den Phenylrest, und R₄ und R₅, die ebenfalls gleicr oder verschieden sein können, Wasserstoffatome Alkylreste, z. B. niedere Alkylreste, wie den Methyl-Äthyl-, n-Propyl-, η-Butyl-, Isobutyl- oder n-Pentyl rest, oder niedere Hydroxyalkylreste, wie den 2-Hy droxyäthyl- oder 3-Hydroxypropylrest, bedeuten kön nen, während X Sauerstoff oder Schwefel bedeutet.

Die zur Förderung der Erzeugung des Ar₁ tibioiicums erforderliche Menge an Glycin, L-Phenylalanin. Carbaminsäureester (II) oder Amid (III) richtet sich nach dem jeweiligen Medium. Im allgemeinen wird eine erhöhte Erzeugung des Antibioticums in Nährmedien beobachtet, die 0,01 bis 0,10% (alle hier für diese Zusätze angegebenen Prozentwerte beziehen sich auf Gewichtsteile je 100 Raumteile Nährmedium) Glycin und 0.05 bis 0,3% L-Phenylalanin enthalten. Bevorzugt werden Konzentrationen von 0,05% Gh ein und 0.3% L-Phenylalanin. Die Carbaminsäureester (II) und die Amide(III) werden in Mengen von etwa 0.0156 bis 2,0% zugesetzt, und besonders gute Ausbeuten erhält man mit N-2-Hydroxyäthylcarbaminsäurealkylestern, beispielsweise mit 0.2 bis 0.8% N-2-I-hdroxyäthylcarbaminsäureäthylester.

Ferner wurde gefunden, daß der Zusatz eines Amides der nachstehend angegebenen allgemeinen Formel zu dem Fermentationsmedium einen bedeutenden Ansticn :n der Ausbeute des Antibioticums zur Folge hat:

O R₇

Il /

R₆CN

In dieser allgemeinen Formel bedeutet R₁, ein \Y;i-.serstoffatom oder einen niederen A!k\lrest. wie den Methyl- oder Äthylrest, und R- und R_n Wasserstoffatome oder niedere Alkylreste. insbesondere Isobutvlreste. Bevorzugt sind Formamid und N.N-Dink-dng-alkylformamide, insbesondere Dimethylformamid und Ν,Ν-Düsobutylpropionsäureamid: der Zusatz der letzteren Verbindung .'.um Nährmedium in Konzentrationen von 0,063 bis 0,125 Gewichtsteilen je HX) Raumteile Nährmedium ergibt besonders gute Ausbeuten. Glycinkonzentrationen von mehr als 0,3%. 1,-Phenylalaninkonzentrationen von mehr als 0.5% und Carbaminsäureesterkonzentrationen von mehr als 0,8% vermindern die Erzeugung des Antibioticums.

Glycin, L-Phenylalanin, der Carbaminsäureester der allgemeinen Formel Il und/oder das Amid der allgemeinen Formel III brauchen nicht für sich allein angewandt zu werden, sondern können miteinander kombiniert werden, um einen Zusatz zu erhalten, der eine besonders gute Ausbeute an dem Antibioticum ergibt. So eignet sich z. B. die Kombination von 0,05% Glycin, 0,3% L-Phenylalanin und einer gewissen Menge Carbaminsäureester(II) und/oder Amid (IU) im Bereich einer Endkonzentration von 0,0156 bis 2,0% besonders zur Erhöhung der Ausbeute an dem Antibioticum. Vorzugsweise ist der Carbaminsäureester in dieser Kombination N-2-Hydroxyäthylcarbaminsäureäthylester, seine Konzentration im Nährmedium beträgt 0,2 bis 0,8%, und das Amid ist Ν,Ν-Diisobutylpropionsäureamid, und dessen Konzentration im Nährmedium beträgt 0,063 bis 0,125%.

Obwohl das Antibioticum (I) gemäß der Erfindung in Oberflächenkultur oder in Submerskultur erzeugt werden kann, führt man die Fermentation vorzugsweise in Submerskultur durch. Fermentationen in kleinem Maßstabe werden zweckmäßig durchgeführt, indem man geeignete Mengen des Nährmediums in Kolben einbringt, die Kolben und ihren Inhalt durch Erhitzen auf 120⁰C sterilisiert, die Kolben entweder mit Sporen oder mit einer vegetativen Zellenkultur von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 beimpft, die Hälse der Kolben locker mit Watte verschließt und die Fermentation 3 bis 5 Tage bei einer konstanten Raumtemperatur von etwa 28° C in der Schüttelmaschine durchführt. Für Arbeiten im größeren Maßstab führt man die Fermentation vorzugsweise in großen Behältern mit Rührwerk und Belüftungseinrichtung für das Fermentationsmedium durch. Bei dieser Methode wird das Nährmedium im Behälter angemacht und durch Erhitzen auf 120⁰C sterilisiert. Nach dem Kühlen wird das sterilisierte Medium mit einer vegetativen Zellenkultur des Streptomyces beimpft und die Fermentation 2 bis 4 Tage unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung einer Temperatur von etwa 28°C durchgeführt. Diese Methode zur Erzeugung von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy-3-cephem-4-carbonsäure eignet sich besonders für die Herstellung des neuen Antibioticums in großen Mengen.

Die Fermentation kann bei Temperaturen von etwa 20 bis 37 C durchgeführt werden. Zur Erzielung der besten Ergebnisse ist es jedoch am zweckmäßigsten, die Fermentationen bei Temperaturen zwischen 26 und 30" C durchzuführen. Der pH Wert des zum Züchten des Streptomyces und zur Erzeugung des Antibioticums geeigneten Nährmediums kann im Bereich von etwa 5 bis 9 variieren. Vorzugsweise arbeitet man jedoch bei pH-Werten von etwa 6.0 bis 7.5.

Zur Durchführung der Erfindung stellt man eine Zellensuspension her. indem man steriles Medium einer Agar-Schrägröhrchenkultur des Streptomyces zusetzt. Das Erzeugnis der Schrägröhrchenkultur wird dann zum Beimpfen eines Saatkolbens verwendet, und der Saatkolben wird 1 bis 3 Tage bei 28 C geschüttelt, um ein gutes Wachstum zu erzielen. Dann wird der Saatkolben zur Beimpfung der Produktionskolben verwendet. Man kann den Saatkolben auch mit einer gefriergetrockneten Kultur oder einem eingefrorenen Impfgut beimpfen.

Die Beimpfung wird im allgemeinen mit 1 ml je 40 ml Produktionsmedium durchgeführt. Dann werden die Zusätze in den gewünschten Konzentrationen in die Produktionskolben eing:gebcn, und die Fermentation wird 2 bis 4 Tage unter Rühren und oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung der Temperatur von etwa 28 C durchgeführt. Alle Produktionskolben, d. h. diejenigen Kolben, die die Zusätze enthalten, und diejenigen Kolben, die für die Leerversuche verwendet werden, werden dann, im allgemeinen nach 96 Stunden, analysiert, um die Menge an Antibioticum zu bestimmen, die sich in jedem Kolben gebildet hat.

Das Antibioticum 7-(n-5-Amino-5-carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy-3-cephem-4-carbonsäure wird zweckmäßig nach der Scheiben - Plattenmethode unter Verwendung von Vibrio percolans MB-1272 (ATCC 8461) als Testorganismus analysiert. Man verwendet Scheiben von 9,5 cm Durchmesser. Aus bekannten Konzentrationen des Antibioticums wird eine Standardkurve erstellt, und die Aktivität wird in -,· je ml freier Säure ausgedrückt.

Dann werden die Produktionskolben analysiert, indem man die Probe mit 0,02-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7) auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Der Testorganismus ist Vibrio percolans MB-1272 (ATCC 8461), und als Analysenmedium verwendet man Nähragar + 0,2% Hefeextrakt. Die

Scheiben werden in eine genormte Lösung des Antibioticums getaucht, die 5 -/ Antibioticum je ml enthält, und abwechselnd mit der Probe auf die Platte gelegt. Die Platten werden 18 Stunden bei 37⁰C inkubiert, worauf man die Zonendurchmesser in Millimeter bestimmt. Es werden fünf Normplatten verwendet, die vier Konzentrationen des genormten Antibioticums von 2,5 bis 20y/ml enthalten. Die Aaalyse wird mit Hilfe eines Nomogramms berechnet, und die Ergebnisse werden in v/ml angegeben.

Das Antibioticum läßt sich aus dem Fermentationsmedium nach verschiedenen Verfahren gewinnen. Man kann die filtrierte Fermentationsflüssigkeit durch eine oder mehrere Ionenaustauschersäulen hindurchleiten. Da das Antibioticum (I) eine amphotere Verbindung ist, kann man sowohl mit Kationen- als auch mit Anionenaustauschharzen arbeiten, um die beste Gewinnung zu erzielen. Das adsorbierte Antibioticum wird dann, vorzugsweise mit einem flüchtigen Lösungsmittel, wie Pyridin, das sich leicht entfernen läßt, eluiert.

Das Antibioticum 7 - (D - 5 - Amino - 5 - carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy-3-cephem-4-carbonsäure(I) und seine Salze hemmen das Wachstum von verschiedenen gram-negativen und gram-positiven Mikroorganismen.

Beispiel 1

Herstellung des Antibioticums; durch Zusatz von Glycin abgeändertes Fermentationsverfahren

Stufe A
Schi ägröhrchen

35

Ein gefriergetrocknetes Glas mit einer Kultur von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 wird aseptisch geöffnet und der Mikroorganismus auf ein Medium der folgenden Zusammensetzung übertragen:

Medium I

45

55

1 % Melasse,
1 % Brauereihefe,
2,5% Agar, pH 7,0,
mit Wasser aufgefüllt.

Die Schrägröhrchen werden 7 Tage bei 28^rC inkubiert. Wenn sie in der Kälte aufbewahrt werden, halten sie sich länger als 13 Wochen.

Stufe B
Saatstufen: Zweistufiges System

Erste Aussaat

Die erste Aussaat wird direkt aus dem Schrägröhrchen der Stufe A auf 40 ml 1 %iger primärer Trokkenhefe bei einem pH-Wert von 7,0 in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben, der im Kolbenboden Vertiefungen aufweist, aufgeimpft. Dann werden die Kolben 2 bis 3 Tage bei 28°C in einer rotierenden Schüttelmaschine mit 220 U/min bei einem Hub von 5 cm geschüttelt. Zweite Aussaat

Ein 2,5%iges Impfgut von der ersten Aussaat wird in einen Kolben eingegeben, der 2% Hefeautolysat bei einem pH-Wert von 7,0 enthält. In dieser Stufe i>t die Kultur charakteristisch hell, und die Inkubation, die so wie in der ersten Stufe bei 28⁰C durchgerührt wird, wird nicht über 48 Stunden hinaus ausgedehnt.

Stufe C
Grundproduktionsmedium

Das Grundproduktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Medium II

Lösliche Schlempebestandteile 3,0%

Primäre Trockenhefe 0,75%

Schaumverhütungsmittel aus Paraffinwachs, 40,5 Gewichtsprozent ölsäure, 4,5 Gewichtsprozent

Wasser. 55.0 Gewichtsprozent 0,25%

Dieses Medium wird mit etwas konzentrierter Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, auf Erlenmeyerkolben verteilt und 15 bis 20 Minuten bei 121 C im Autoklav behandelt. Nach dem Kühlen wird das Medium mit einem 2,5%igen Impfgut der in Stufe B durchgeführten zweiten Aussaat beimpft. Die Inkubation erfolgt drei Tage bei 28 C mit 220 LJ min in einer Schüttelmaschine bei einem Hub von 5 cm.

Wenn die Fermentation beendet ist, werden die Zellen abzentrifugiert. und die Fermentationsflüssigkeit wird mit Phosphatpufferlösung (pH 7,0) verdünnt Die Konzentration der 7-(u-5-Amino-5-carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy - 3 - cephem-4-carbonsäure in der Fermentationsflüssigkeit wird nach der biologischen Scheibenanalysenmethode bestimmt. Als Testorganismus verwendet man Vibrio percolans (ATCC 8461). Filterpapierscheiben werden in verdünnte Fermentationsfiüssigkeiten getaucht und auf agarhaltige Petrischalen aufgelegt, die mit dem Testorganismus Vibrio percolans (ATCC 8461) beimpft worden sind. Ferner werden auf diese Petrischalen Scheiben aufgelegt, die zuvor in genormte Lösungen mit bekannten Konzentrationen von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy - 3 -cephem -4 - carbonsäure getaucht worden sind. Die Scheiben werden über Nacht bei 28 C inkubiert und die Durchmesser der Hemmungszonen verzeichnet. Die Konzentration an 7-(n-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxy methyl) - 7 - methoxy - 3 - cephem - 4 - carbonsäure in der Fermentationsflüssigkeit wird durch Interpolieren aus der Standardkurve berechnet, die die Beziehung zwischen dem Hemmungszonendurchmesser und bekannten Konzentrationen der 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy- 3 - cephem - 4 - carbonsäure - Normlösungen angibt. Nach diesem Verfahren wird berechnet, daß Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 in dem Grundproduktionsmedium im Mittel 80,4 y/ml 7-(D-5-Amino - 5 - carboxy valeramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erzeugt.

Stufe D
Zusatz von Glycin

Der Zusatz von Glycin zu dem Medium 11 in Stufe C erhöht die Ausbeute an 7-(i>5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy- 3-cephem-4-carbonsäure beträchtlich. Das Ausmaß dieser Produktionssteigerung Tür verschiedene Konzentrationen ergibt sich aus Tabelle I. Die Werte dieser Tabelle stammen aus drei Versuchsreihen, in denen der Leeiversuch jeweils in der Tür die Stufen A bis C beschriebenen Weise durchgeführt wird, während die übrigen Versuche in der gleichen Weise, aber mit Zusatz der angegebenen Menge an Glycin, durchgeführt werden. Die Analysen werden ebenso wie in Stufe C durchgeführt.

Tabelle I

Versuch 3
Leerversuch

IO L-Phenylaianinzusatz

zu
Medium U

0.3

0,1

Antibioticum erzeugung

(j'/ml)

90

85 100

Zunahme

gegenüber

Leerversuch

34

18

	Glycinzusatz zu Medium Il	Anti-	Zunahme
Versuch	(%)	bioticum- erzeugung	gegenüber Leerversuch
	—	I₇ ml)	(%)
Leerversuch	0,01	77	-
1	0,10	84	10
2	—	97	26
Leerversuch	0,05	76	—
1	0,10	106	41
2	-■	93	•n
Leerversuch	0.075	88
1	0,100	113	28
2	0,125	113	28
3	98	11

Hieraus ergibt sich, daß ein Zusatz von 0.05% GIy-

ein zu dem Produktionsmedium die Ausbeute an 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure am Versuch

wirksamsten erhöht.

B e i s ρ i e 1 2 45

Herstellung des Antibioticums: Zusatz von
L-Phenylalanin

Man arbeitet nach Beispiel 1. jedoch unter Yer- so wendung von verschiedenen Konzentrationen an L-Phenylalanin an Stelle des Glycins in Stufe D. In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen, in denen das L-Phenylalanin zugesetzt wird, und die darauf zurückzuführenden Ausbeutesteigerungen an Anti bioticum«I»angegeben.

Tabelle II Beispiel 3

Herstellung des Antibioticums; Zusatz von L-Phenylalanin und Glycin

Man arbeitet nach Beispiel 1. jedoch unter Zusatz von L-Phenylalanin zu dem Grundproduktionsmedium, welches bereits 0.05% Glycin enthält. Dieses Medium, das nachstehend als Medium 111 bezeichnet wird, hat die folgende Zusammensetzung:

Medium 111

Lösliche Schlempebeslandieile 3,0%

Primäre Trockenhefe 0,75%

Schaumverhütungsmittel aus Paraffinwachs. 40.5 Gewichtsprozent ölsäure, 4,5 Gewichtsprozent

Wasser, 55,0 Gewichtsprozent 0,25%

Glycin 0,05%

In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen in denen das L-Phenylalanin zugesetzt wird, und die darauf zurückzuführenden Ausbeuteerhöhungen ar Antibioticum (I) angegeben.

Tabelle 111

Leerversuch
1

Leerversuch 1

L-Phenylalamnzusatz

zu Medium III

0.1

0.3

0,3

Amibioticumerzeugung

(;■ ml)

101

124

103 118

HO 121

Zunahme

gegenüber

Leerversuch

23 15 10

Versuch

Leerversuch

i-Pbenyl-

ra Medimall

0.05 0.1

,Antibioticum-j j erzeugung ι

! ι- mil j

r ■ ■ t

I 77 ι

/unahroe

60 Bei spiel 4

Herstellung des Antibioticums; Zusatz von Carbaminsäureäthylester und Glycin

Man arbeitet nach Beispiel 3. jedoch mit Carbamii säureäthylester an Stelle des L-Phenylalanms A Produktionsmedium verwendet man das Medium 1 des Beispiels 3. welches 0.05% Glycin enthält. 1 der folgenden Tabelle sind die Konzer.tr.iti *nen ζ Carbaminsäureäthylester und die darauf zurückzi führenden Ausbeutesteigerungen an A«.:;h;oticum 1 angegeben.

309 532/4

Tabelle IV

Versuch

Leerversuch

1 2

Leerversuch

1
2

3 4 5 6

Leerversuch
1

2
3
4
5
6

*) Jeder Ausbeutewert analvsen.

Carbamin-

säureäthyl-

esterzusalz zu

Medium III

Antibioticum- *erzeugung)**	Zunahme gegenüber Leerversuch
109	—
101	—
112	2,8
141	30
86	—
126	47
124	45
118	39
!!5	35
98	15
92	8
113	—
126	11
146	29
157	38
169	49
165	45
168	48

Amide, ihre Konzentrationen und die auf ihren Zusatz zurückzuführenden Ausbeuteerhöhungen ergeben sich aus Tabelle V.

Tabelle V

0,01

0,1

0,5

0,3 0,4 0,5 0,6 0.7 0,8

0,1 0,2 0,3 0.4 0,5 0.6

ist der Mittelwert aus acht Einzel-

Aus den obigen Zahlen ergibt sich, daß ein Zusatz

•on 0,4% Carbaminsäureäthylester zu dem Me- 35 N.N-Dimethyl

diumlll die Ausbeute an Antibioticum(I) am wirk- —'—-^J lamsten erhöht.

Beispiel 5 Herstellung des Antibioticums; Zusatz von Amiden

Man arbeit« nach den Stufen A bis C des Beispiels jedoch mit einer Inkubationszeit in der Stufe C von Tagen bei 28⁰C und mit einem Grundproduktionsmedium der folgenden Zusammensetzung:

Medium IV

Lösliche Schlempebestandteile 3,0%

Primäre Trocfcenhefe 1,0%

Glycin 0.05%

L-Phenylalanin 0.3%

Schaumverhütungsmittel ans Paraffinwachs, 40,5 Gewichtsprozent ölsäure, 44 Gewichtsprozent

Wasser, 55.0 Gewichtsprozent 0.25%

Natriumthiosulfat 0.1 %

Maisstärke 2,0%

Wenn man die in TabeUe V angegebenen Amide zu 4em Medium IV zusetzt and im öbrigen nach dem Verfahren der Stufe C des Beispiels 1 arbeitet, erzieh man eine Ausbeuteerhöhung an Antibioticum (I). Die

	Zusatz	End- conzentration	Antibioiicumerzeugung, r/ml, mit Zusatz/Leerversuch	2
IO		1%)	1	332 256
	Formamid	0,25		354 256
		0,50
	N-Methylform-	1,0	285/254
	amid	ZO	312/254
	N.N-Dimethyl-	0,25	287/238	301 256
	formamid	0,40	346/273
		0.50	297/238	328 256
20		0,80	381/273	387 256
		1.0	388/273
	N.N-Diäthyl-	0.25	309/254
	formamid	0,5	351/254
₂		1,0	391/254
	N.N-Dibutyl-	0,125	260/254
	formamid	0.25	285/254	310 256
	N-2-Hydroxy-	0,25		338 256
	äthylformamid	0,50		372 256
3°		1.0		293 256
	N,N-Dimethyl-	0.0312		313 256
	benzamid	0.0625		369 256
		0.125
35	N.N-Dimethyl-	0.5	360/2M
	acetamid	1.0	354/254
		ZO	449/254
	N,N-Diäthyl-	0.25	276/238
	acetamid	0.5	379/238
4°		1,0	335/238
	N,N-Dipropyl-	0.16	340/238
	acetamid	0.31	390/238	296 256
	N.N-Dimethyl-	0.063		330 256
45	thioacetamid	0.125	288/254	322 256
		0.25	145/254
	N.N-Dimethyl-	0.5	293/154
	acetoacetamid	1.0	286/154
50		ZO	380/254
	N.N-Dimethyi-	0.5	363/254
	propionamid	1.0	369/254
		ZO	282/254	418 256
	N.N-Dibutyl-	0.0156		528 256
55	propionamid	0.0*12		350 256
		0.0625		497 256
	N.N-Diisobutyl-	0.063		530 256
	propionamid	0.125
te	N,N-Dimethyl-	0.125	322/254
	butyramid	0.25	303/254
		0.5	318/254
	N.N-Dimethyl-	0,063	308/254
6s	valeramid	0.125	325/254
		0.25	355/254	291 256
	N,N-BimethyI-	0,0156
	dodecanamid

11

Beispiel 6

Herstellung des Antibioticums; Zusatz von Carbaminsäureestern

Man arbeitet nach Beispiel 5, jedoch mit verschiedenen Carbaminsäureestern an Stelle der dort angegebenen Amide. In der folgenden Tabelle sind die Carbaminsäureester, ihre Konzentrationen und die auf ihren Zusatz zurückzuführenden Ausbeutesteigerungen an Antibioticum (I) angegeben.

Tabelle VI

Zusatz

Carbarninsäureäthylester

Carbaminsäuren-propylester

Endkonzen tration

1%)

0.2 0,4

0,1 0,2

Antibioticumerzeugung,

v/ml, mit Zusatz/Leerversuch

353/254 347/254

360/254 348/254

398/273 395/273

386/273 417/273

Zusatz	End konzen tration	Antibioticu rl mit Zusatz/ 1	merzeugung, ml, Leerversuch 2
Carbaminsäure- n-butylester	0,1		345/273
N- Methylcarbamin- säureäthylester	0,2 0,4	321/254 333/254	360/273 323/273
N-Äthylcarbamin- säureäthylester	0,1 0,2	343/254	317/273 391/273
N-Propylcarbamin- säureäthylester	0,1 0,2	361/254 363/254	389/273 409/273
N-2-Hydroxyäthyl- carbaminsäure- äthylester	0,2 0,4 0,8	331/254 353/254 349/254	345/273 442/273 428/273
Ν,Ν-Dimethyl- carbaminsäure- äthylester	0,2 0,4		292/273 339/273

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 7-{r>5-Amino-5 - carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl)-7 - methoxy - 3 - cephem - 4 - carbonsäure durch Züchten von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Fermentationsmedium Glycin, l-Phenylalanin, einen Carbamin säureester, ein Amid oder Gemische dieser Stoffe zusetzt.