DE1517850B2 - Verfahren zur Herstellung von beta-Carotin durch aerobe Fermentation einer Kultur der Formen + und - von Blakeslea trispora - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von beta-Carotin durch aerobe Fermentation einer Kultur der Formen + und - von Blakeslea trisporaInfo
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Description
Het —CO —NH-NH2
in der Het einen ein- oder zweikernigen ungesättigten heterocyclischen Rest mit einem oder mehreren
Heteroatomen aus der Gruppe der Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoffatome, wobei jeder
Ring 5 oder 6 Kettenglieder enthält, bedeutet oder zumindest einen Aktivator aus der Gruppe
von
II. Pyridinderivaten der allgemeinen Formel
-R
in der R einen Alkanoylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder den Benzoylrest oder deren
funktionell Derivate der Oxogruppe oder den Hydroxylrest, einen Hydroxyalkylrest mit 1 bis
4 Kohlenstoffatomen, den Carbamoylrest, einen Carbamoylrest, der mit einem oder zwei Alkylresten
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist, den Thiocarbamoylrest oder einen Thiocarbamoylrest,
der mit einem oder zwei Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
bedeutet oder
III. Pyridazin, jedoch nicht das Isonicotinoylhydrazin, zusetzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von /S-Carotin durch aerobe Fermentation
einer Kultur der Formen + und — von Blakeslea trispora in einem geeigneten Nährmedium
und unter der für diese Art von Züchtung üblichen Bedingungen.
Es ist bekannt, ^-Carotin durch Submers-Fermentation
von Mikroorganismen des Genus Choanephora oder Blakeslea zu erhalten. In verschiedenen
Veröffentlichungen sind die Bedingungen beschreiben, die die Produktion von /S-Carotin begünstigen.
B ar nett u. Mitarb. (Science, 1956, Bd. 123, S. 141) haben gezeigt, daß die Produktion von
^-Carotin durch gleichzeitige Züchtung von entgegengesetzten Formen ein und derselben Species
verbessert wird. Diese Untersuchung wurde auf die Züchtung von entgegengesetzten Formen verschiedener
Species ausgedehnt (C. Hesseltine, Mycologia, 1957, Bd. 49, S. 449). Die Züchtungsmedien
wurden ebenfalls untersucht, und es hat sich gezeigt, daß die Zugabe von vollständigem oder hydrolysiertem
Getreide, pflanzlichen ölen, oberflächenaktiven Mitteln, Antioxydantien und Verdickungsmitteln die
Ausbeute an /5-Carotin erhöht (R. Anderson u. Mitarb., J. Agr. Food. Chem., 1958, Bd. 6, S. 543;
A. C i e g 1 e r u. Mitarb, App. Microb.·, 1959, Bd. 7, S. 94 und 98).
Schließlich haben Mackinney u. Mitarb. (J. Am. Chem. Soc, 1952, Bd. 74, S. 3456) gezeigt, daß
die Zugabe von /?-Jonon zu einer ruhenden Kultur eines Phycomyces die Bildung von /?-Carotin auf
Kosten anderer Carotinoidfarbstoffe stark erhöht.
ίο Anderson u. Mitarb, haben die gleiche Wirkung
bei bewegter Kultur von Blakeslea und Choanephora festgestellt (loc. cit.).
Aus der französischen Patentschrift 1 377 523 ist es bekannt, 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen als
Ausgangssubstanz, die dem Mikroorganismus einen vorgefertigten Molekülbaustein des ß-Carotins liefert,
dem Fermentationsmilieu zuzusetzen. Dieser Vorläufer spielt die gleiche Rolle wie /?-Jonon und kann
letzteres ganz oder teilweise ersetzen. Es handelt sich dabei jedoch um keine Aktivatorsubstanz. Aktivatorsubstahzen,
die nicht sichtbar an der Synthese beteiligt sind, sind aus der französischen Patentschrift
1344 264 und ihren Zusätzen (l.Add. und 2. Add.)
bekannt; bei diesen Substanzen handelt es sich um gewisse Amide, Imide und Lactame, die dem Kultur-
: milieu zugesetzt werden, um die Ausnutzung der Ausgangssubstanzen zu verbessern. Die Verwendung
! von Isomicotinoylhydrazin als Aktivatoren bei der ; , Herstellung von ß-Carotin durch aerobe Fermentation
wurde bereits vorgeschlagen.
Aus der französischen Patentschrift 1 403 839 ist es bekannt, daß bei Zusatz von speziellen heterocyclischen
Aktivatoren zu Fermentationsmilieus, die zur Erzeugung von /J-Carotin geeignet sind, dessen
Bildung inhibiert wird und statt dessen Lycopin erzeugt wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung von ß-Carotin.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung von ß-Carotin.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei Zusatz gewisser heterocyclischer Verbindungen
als »Aktivatoren zu einem Züchtungsmedium, die Produktion von /?-Carotin im Vergleich mit bekannten
Verfahren erheblich erhöht wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von ß-Carotin durch aerobe Fermentation einer KuI-
'■ tür der Formen + und — von Blakeslea trispora in
einem geeigneten Nährmedium und unter den für diese Art von Züchtung üblichen Bedingungen, isty
dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium in Mengen von 0,1 bis 10 g pro Liter des Nährmediums
zumindest einen Aktivator aus der Gruppe von
I. Hydraziden der allgemeinen Formel 55
Het — CO — NH — NH2
in der Het einen ein- oder zweikernigen ungesättigten heterocyclischen Rest mit einem oder mehreren Heteroatomen
aus der Gruppe der Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoffatome, wobei jeder Ring 5 oder 6 Kettenglieder
enthält, bedeutet, oder zumindest einen Aktivator aus der Gruppe von
II. Pyridinderivaten der allgemeinen Formel ■ /=v
N V-R
in der R einen Alkanoylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoff-
i. Ul/ UOU
tomen oder den Benzoylrest oder deren funktioneile derivate der Oxogruppe oder den Hydroxylrest,
.inen Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatonen; den Carbamoylrest, einen mit einem oder zwei
\lkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituarten Carbamoylrest, den Thiocarbamoylrest oder
inen mit einem oder zwei Alkylresten mit 1 bis Kohlenstoffatomen substituierten Thiocarbamoylest
bedeutet, oder
III. Pyridazin, jedoch nicht das Isonicotinoyl- :ydrazin, zusetzt.
Der Aktivator kann dem Züchtungsmedium zu beginn oder im Verlaufe der Fermentation auf einial
oder mehrmals zugegeben werden. Vorzugsweise verwendet man eine Menge zwischen 0,5 und
. g/l und führt die Zugabe zu Beginn der Züchtung urch. Gleichgültig, welche Menge zugegeben wird
nd zu welchem Zeitpunkt die Zugabe dieses Proukts erfolgt, ist es zweckmäßig, die Züchtung 6 bis
5 Tage lang nach Beimpfung fortzusetzen, um die laximale Produktion an ß-Carotin zu erhalten. Das
;üchtigungsmedium kann variieren, doch enthält es η wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle
nd eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe nd gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, Antioxydan-εη,
oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel und romotoren.
Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man -ohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Dextrine,
tärke, oder tierische oder pflanzliche öle, wie bei-Melsweise Schmalzöl, Sojaöl oder Baumwollsamen-1,
verwenden. Die geeigneten assimilierbaren Stick-.offquellen sind außerordentlich verschiedenartig:
e können chemische Verbindungen oder komplexe ubstanzen sein, die den Stickstoff hauptsächlich in
roteidischer Form enthalten, wie beispielsweise asein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate,
ojamehle, Arachismehle, Hefeextrakte, Rückstände on der Kornalkoholdestillation, die allgemein als
Distillers Solubles« bezeichnet werden (vgl. »Willem udolfs, industrial Wastes, their Disposal and Treatient,
Reinhold Publishing Corporation, New York, 953, S. 102 und 103) und Maisquellflüssigkeit.
Unter den zugesetzten Mineralstoffen können geisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende
/irkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder ^alkaliphosphate.
Unter den Wachstumsfaktoren ist der am häufigen verwendete das Vitamin B1 oder Thiamin. Unter
an Antioxydantien kann man das N,N'-Diphenyl- - phenylendiamin, das 2,2,4 - Trimethyl - 6 - äthoxy-2-dihydrochinolin,
die Ascorbinsäure oder die Sorinsäure nennen. Die oberflächenaktiven Mittel sind
Drzugsweise von nichtionischer Art, wie beispielseise Sorbitderivate mit Fettsäuren oder Produkte
if der Basis von Äthylenoxydkondensaten. Unter ;n Verdickungsmitteln sind die am häufigsten verendeten
Stärke, Carboxymethylcellulose und Agar.
Als Promotor kann man ß-Jonon, 2,2,6-Trimethyl-/clohexanon
oder 2,6,6 - Trimethyl -1 - acetylcycloixen verwenden.
Das so hergestellte Züchtungsmedium wird an- :hließend mit einer Kultur der Formen + und —
Dn Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457) belpft.
Die Erhöhung des Produktionsgrades an ß-Caron
in Gegenwart von Aktivator aus I, II oder III ist
nach den Arbeitsbedingungen mehr oder weniger ausgeprägt: sie tritt jedoch auf, unabhängig davon,
ob man Antioxydantien oder Promotoren zu den Züchtungsmedien zusetzt oder nicht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
B e i s ρ i e 1 1
Man stellt ein Züchtungsmedium A wie folgt her:
500 ecm Wasser mit einem Gehalt von 75 g Rückständen
von der Kornalkoholdestillation werden 15 Minuten zum Sieden gebracht. Nach Abkühlen
setzt man die folgenden Substanzen zu:
Stärke 70g
Sojaöl 40 ecm
; Baumwollsamenöl 40 ecm
Hefeextrakt Ig
Monokaliumphosphat 0,5 g
Mangansulfat-Monohydrat 0,1 g
Thiamin-hydrochlorid 0,01g
Man füllt mit destilliertem Wasser auf 1000 ecm auf. Das Gemisch wird mit einigen Tropfen 1 On-Natronlauge
auf pH 6,3 eingestellt, in 300-ccm-Erlenmeyerkolben in einer Menge von 50 ecm je Kolben
verteilt und dann 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Nach Sterisation und Abkühlen bringt man unter
sterilen Bedingungen in jeden Kolben 1 ecm einer sterilen 2,5%igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-l^-dihydrochinolin
in Leuchtpetroleum ein.
Man stellt auch Medien B und C mit den gleichen Bestandteilen und in der gleichen Weise wie bei
Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans,
gelöst in dem Leuchtpetroleum, die nachfolgenden Mengen einer 2,5 %igen sterilen Lösung
von 2-Furoyl-hydrazin in Wasser einbringt:
Medium B 0,2 ecm
Medium C 1 ecm
Jeder Kolben mit den Medien A, B und C wird anschließend mit 5 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten
Kultur, die die zwei Formen + und — des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457)-enthält
und 48 Stunden gealtert wurde, beimpft. Die j Kolben werden anschließend auf einen Drehtisch,
; der mit 220 Drehungen je Minute rotiert wird, in einem Brutschrank bei 26° C gebracht. Nach 12tägiger
Züchtung unter diesen Bedingungen der Bewegung und der Temperatur ist die Produktion an /?-Carotin
in allen Kolben maximal.
Die Bestimmung des /S-Carotins wird wie folgt
: durchgeführt: Das Mycel wird durch Filtrieren abgetrennt,
mit Wasser gewaschen und dann über Nacht bei 35° C im Vakuum getrocknet. Das Trockenmycel
wird anschließend mit Hexan extrahiert. Man trennt das jS-Carotin von den anderen vorhandenen Carotinoiden
durch eine Chromatographie des Extrakts an Aluminiumoxyd ab. Die das /?-Carotin enthaltenden
Elutionsfraktionen werden vereinigt, und der Gehalt wird spektrophotometrisch gegen eine reine /9-Carotinprobe
bestimmt.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
65
65
Medium A ■
(ohne Adjuvans) 1010 mg
(S-Carotin je Liter
Medium B (mit 0,1 g
2-Furoylhydrazin je
Liter)
2-Furoylhydrazin je
Liter)
Medium C (mit 0,5 g
2-Furoylhydrazin je
Liter)
2-Furoylhydrazin je
Liter)
1150 mg
/?-Carotin je Liter
/?-Carotin je Liter
1390 mg
/?-Carotin je Liter
/?-Carotin je Liter
Man stellt die Züchtungsmedien A und C her und beimpft sie wie es im Beispiel 1 angegeben ist. Nach
einer Inkubation von 48 Stunden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man unter
sterilen Bedingungen in jeden Züchtungskolben eine Lösung von 50 mg /S-Jonon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum
ein. Man setzt darin die Züchtung fort und analysiert unter den im Beispiel 1 beschriebenen
Bedingungen.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Medium A
(ohne Adjuvans).
(ohne Adjuvans).
Medium C (mit 0,5 g
2-Furoylhydrazin je
Liter)
2-Furoylhydrazin je
Liter)
1770 mg
^-Carotin je Liter
^-Carotin je Liter
2505 mg
/S-Carotin je Liter
/S-Carotin je Liter
Man stellt verschiedene Medien her, wobei man in der gleichen Weise wie bei der Herstellung des Mediums
C arbeitet, jedoch die Zugabe von 2-Furoylhydrazin durch eine Zugabe anderer Hydrazide der
Formel I ersetzt. Diese Hydrazide werden in Form einer wäßrigen Lösung zugegeben.
Das Bezugsmedium A und die anderen wie oben angegeben hergestellten Medien werden wie im Beispiel
1 beimpft und inkubiert.
Nach 12tätiger Züchtung wird das /S-Carotin wie im Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Aus Zweckmäßigkeitsgründen wurde der /S-Carotin-Produktion
des Vergleichsmediums A der Koeffizient 100 gegeben. Die Koeffizienten der die Hydrazide
der allgemeinen Formel I enthaltenden Medien zeigen daher die Erhöhung der Produktion an
/S-Carotin, bezogen auf das Vergleichsmedium.
Zugesetztes Hydrazid | I Het |
[ | Il N SNH7 |
Zuge setzte Menge in g/l |
Pro duktion von ß- Carotin |
Keines (Ver gleichs- medium A) 2-Furoylhydrazin (Medium C) |
O | 0,5 | 100 138 |
||
3-Pyrazolylcarbo- nylhydrazin |
0,5 | 143 |
Zugesetztes Hydrazid
5-Methyl-2-pyrimidylcarbo-
nylhydrazin
nylhydrazin
2-Indolylcarbonylhydrazin
2-Pyrazinylcarbonylhydrazin
4-Thiazolylcarbonylhydrazin
Zugesetzte Menge in g/l
0,5
0,5
Produktion
von ß-Carotin
B e i s ρ i e 1 4
Wie im Beispiel 3 stellt man Züchtungsmedien in der gleichen Weise wie das Medium C von Beispiel 1
her. ersetzt iedoch das 2-Furoyl-hydrazin durch andere Hydrazide der Formel I in Lösung in Wasser
in den unten angegebenen Mengen.
Die neuen Medien werden gleichzeitig mit einem Vergleichsmedium A und einem Medium C, wie sie
im Beispiel 1 beschrieben sind, beimpft, und die Kulturen werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen
Bedingungen entwickelt.
Nach 2tägiger Inkubation wird in die Kolben von jedem Medium eine sterile Lösung von 50 mg
/S-Jonon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum eingebracht. Die Züchtungen werden anschließend noch 10 Tage
fortgesetzt. Das /S-Carotin wird dann wie im Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle angegeben, wobei für die in Koeffizienten ausgedrückte Produktion an ^-Carotin das
gleiche wie im Beispiel 3 gilt. >
Zugesetztes Hydrazid | Het | — | Zuge setzte Menge in g/I |
Pro duktion von Ii- Carotin |
Keines (Ver gleichs- medium A) 2-Furoylhydrazin (Medium C) |
\ O |
0,5 | 100 142 |
|
2-Indolylcarbo- nylhydrazin |
1 | 111 | ||
Fortsetzung
Zugesetztes Hydrazid | Het | L | Zuge setzte Menge in g/l |
Pro duktion von jl- Carotin |
2- Pyrazinylcarbo- nylhydrazin |
0,5 | 112 |
B ei s pie I 5
Man stellt ein Medium A wie im Beispiel 1 her.
Man stellt auch Medien D und E mit den gleichen Bestandteilen und in der gleichen Weise wie bei dem
Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans
in Lösung in Leuchtpetroleum die nachfolgend angegebenen Mengen einer sterilen 5%igen
Lösung von 4-Formylpyridin in Wasser einbringt:
Medium D 0,5 ecm
Medium E 1 ecm
Jeder Kolben mit den Medien A, D und E wird anschließend mit 5 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten
Kultur, die die zwei Formen + und — des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457)
enthält und 48 Stunden gealtert wurde, beimpft. Die Kolben werden anschließend auf einem Drehtisch,
der mit 220 Drehungen je Minute rotiert wird, in einem Brutschrank bei 26° C gebracht. Nach 12tägiger
Züchtung unter diesen Bedingungen bezüglich Bewegung und Temperatur ist die Produktion an
/?-Carotin in allen Kolben maximal. Die Kulturen werden dann wie im Beispiel 1 beschrieben analysiert.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Medium A
(ohne Adjuvans) 935 mg
/S-Carotin je Liter
Medium D (mit 0,5 g
4-Formyl-pyridin je
Medium D (mit 0,5 g
4-Formyl-pyridin je
Liter) 1720 mg
/S-Carotin je Liter
Medium E (mit Ig.
4-Formyl-pyridin je
Medium E (mit Ig.
4-Formyl-pyridin je
Liter) 2050 mg
/S-Carotin je Liter
werden dann unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen fortgesetzt und anschließend analysiert.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Medium A 1770 mg
/S-Carotin je Liter
Medium F (mit 2 g
4-Formyl-pyridin je
Medium F (mit 2 g
4-Formyl-pyridin je
Liter) 3065 mg
/S-Carotin je Liter
Man stellt das Züchtungsmedium A wie im Beispiel 1 beschrieben her.
Man stellt auch ein Medium G mit den gleichen Bestandteilen und in der gleichen Weise wie das
Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans
in Lösung in Leuchtpetroleum 3 ecm einer sterilen 5%igen Lösung von 4-Hydroxy-pyridin in
Wasser einbringt.
Man beimpft anschließend die Medien A und G wie im Beispiel 1. Nach 48stündiger Inkubation unter
den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man in jeden Züchtungskolben mit dem Medium A
unter sterilen Bedingungen 50 mg /S-Jonon in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein.
Die Kolben mit dem Medium G werden in zwei Gruppen G1 und G2 geteilt. Man bringt unter sterilen
Bedingungen in jeden Züchtungskolben G1 50 mg jS-Jonon in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum und
in jeden Züchtungskolben G2 50 mg 2,6,6-Trimethyl-1-acetylcyclohexen
(TMACH) in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein.
Die Züchtungen werden dann unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen fortgesetzt und
analysiert.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
40
40
Züch- tungs- ' medium |
Adjuvans | Promotor | ^-Carotin in mg/1 |
45A ,G1 .... G2 .... |
keines 4-Hydroxy- pyridin 3 g/l 4-Hydroxy- pyridin 3 g/l |
/S-Jonon /S-Jonon TMACH |
1890 2450 . 2420 |
Man stellt ein Züchtungsmedium A wie im Beispiel 1 beschrieben her. Man stellt auch ein Züchtungsmedium
F mit den gleichen Bestandteilen und in der gleichen Weise wie bei dem Medium A her,
wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans in Lösung
in Leuchtpetroleum 2 ecm einer sterilen 5% igen sung von 4-Formyl-pyridin in Wasser einbringt.
Man beimpft die Züchtungsmedien A und F wie im Beispiel 1 beschrieben. Nach 48stündiger Inkubation
unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bringt man in jeden Züchtungskolben unter
sterilen Bedingungen eine Lösung von 50 mg /S-Jonon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein. Die Züchtungen
Man stellt verschiedene Züchtungsmedien her, wobei man in der gleichen Weise wie für die Her-
«. stellung des Mediums G von Beispiel 7 ' arbeitet,
jedoch die Zugabe von 4-Hydroxy-pyridin durch eine Zugabe von anderen Pyridinderivaten in Lösung
in Wasser in den nachfolgend angegebenen Mengen ersetzt.
Das Vergleichszüchtungsmedium A und die so hergestellten Züchtungsmedien werden beimpft und
inkubiert, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist. Nach 12tägiger Züchtung wird das /S-Carotin wie im Beispiel
1 bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt, wobei bezüglich der Koeffizienten
409538/99
der /3-Carotin-Produktion das gleiche wie im Beispiel
3 gilt.
Adjuvans | Zugesetzte Menge an Adjuvans in g/I |
Produktion an /f-Carotin |
Keines (Vergleichsmedium A) 4-Hydroxy-pyridin 4-Thiocarbamoyl-pyridin ... 4-Hydroxymethyl-pyridin... 4-Benzoyl-pyridin 4-Acetyl-pyridin 4-Formyl-pyridin- thiosemicarbazon |
3 0,5 1 0,2 1 2 |
100 189 180 138 129 121 195 |
der mit 220 Umdrehungen je Minute betrieben wird, in einen Brutschrank bei 26° C eingebracht. Nach
2tägiger Inkubation werden die Züchtungskolben mit dem Medium A in zwei Gruppen A1 und A2
geteilt. Die Kolben mit dem Medium H werden ebenfalls in zwei Gruppen H1 und H2 geteilt. In
jeden Kolben H2 und A2 bringt man unter sterilen
Bedingungen 50 mg /S-Ionon in Lösung in 0,5 ecm
Leuchtpetroleum ein. Die Kolben A1 und H1 erhalten
keinen Zusatz. Die Züchtungen A1, A2, H1 und
H2 werden noch weitere 10 Tage unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung
fortgesetzt. Die Produktion an /S-Carotin ist dann in allen Kolben maximal.
Die Bestimmung des /S-Carotins wird wie im Beispiel 1 durchgeführt. Es wurden die folgenden Ergebnisse
erhalten:
20
Man stellt Züchtungsmedien her, wobei man in der gleichen Weise wie bei der Herstellung der Züch- _
tungsmedien von Beispiel 8 arbeitet. Diese Medien werden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt und
beimpft. Nach 48stündiger Inkubation bringt man unter sterilen Bedingungen in jeden Kolben aller
Züchtungen eine Lösung von 50 mg /?-Jonon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein. Die Züchtungen werden
dann unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen fortgesetzt und analysiert.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt, wobei bezüglich der
Koeffizienten der /S-Carotin-Produktion das gleiche wie im Beispiel 3 gilt.
40
Adjuvans | g/l | Produktion an | Kulturen | |
g/l | ß-Carotin in mg/1 | mit | ||
Medium | ß-Jonon | |||
Kulturen | ||||
ohne | 1460 | |||
— | fi-Jonön | — | ||
Medium A1... | Pyridazin 2 | 900 | 2165 | |
Medium A2... | Pyridazin 2 | — | ||
Medium H1... | 1540 | |||
Medium H2... | — | |||
Adjuvans | Zugesetzte Menge an Adjuvans in g/l |
Produk tion an /i-Carotin |
Keines | 3 0,5 1 0,75 |
100 129 132 156 126 |
4-Hydroxy-pyridin 4-Thiocarbamoyl-pyridin ... 4-Hydroxymethyl-pyridin... 4-Acetyl-pyridin |
Aus den folgenden Versuchen 1 und 2 geht hervor, daß bei Zusatz der erfindungsgemäßen heterocyclischen
Aktivatoren die ß-Carotinausbeute in überraschender Weise gesteigert wird, was bei Kenntnis
der französischen Patentschrift 1 403 839, Beispiel 7, nicht zu erwarten war, wo bei Zusatz von 0,1 g
Pyridin pro Liter Nährmedium die /9-Carotinausbeute ansteigt, um beim Zusatz von 3 g Pyridin/Liter
abrupt abzufallen, wo hingegen die Lycopinausbeute ständig zunimmt.
Versuch 1
Man arbeitet wie im Beispiel 7 und geht dabei von einem Kulturmilieu a) aus, das wie im Beispiel 1
beschrieben hergestellt wurde, jedoch keinen Hefeextrakt enthält. Dabei werden die folgenden Ergeb-'
nisse erzielt:
Man stellt ein Medium A wie im Beispiel 1 her.
Man stellt auch ein Medium H mit den gleichen Bestandteilen und in der gleichen Weise wie das
Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans
in Lösung in Leuchtpetroleum 1 ecm einer sterilen 10%igen Lösung von Pyridazin in Wasser
einbringt.
Jeder Kolben mit den Medien A und H wird anschließend mit 5 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten
Kultur, die die beiden Formen + und — des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457)
enthält und 48 Stunden gealtert wurde, beimpft. Die Kolben werden anschließend auf einen Drehtisch,
Kultur | Zusatz: | Promotor | /i-Carotin | ^-Carotin, bezogen auf |
milieu | 4-Hydroxy- pyridin |
/i-Jonone | mg/1 | die Kontroll probe |
a | ohne | (TO | 1870 | 100 |
gl | IgA | ig/i | 2280 | 122 |
g2 | 2 g/l | ig/i | 2460 | 131 |
g3 | 3 g/l | ig/i | 2490 | 133 |
g4 | 4 g/l | 2530 | 135 |
65 Versuch 2
Man arbeitet wie im Beispiel 10 mit einem Milieu a), das wie im Beispiel 1 hergestellt wurde, welches
jedoch keinen Hefeextrakt enthält. Man erhält die folgenden Ergebnisse:
Milieu
Slindversuch
Succinimid (4 g/l)
l-Formyl-pyridin (2 g/l)
Blindversuch
juccinimid (4 g/l)
4-Hydroxymethyl-pyridin (1 g/l)
Blindversuch
succinimid (4 g/l)
Pyridazin (2 g/l)
/J-Carotin (mg/1)
1770 2550 3065 1770 2620 2760
1460 1945 2165
A. Erfindungsgemäßes Verfahren
Kultur milieu |
Zusatz: Pyridazin |
Promotor /J-Jonone |
ß-CüTotin mg/I |
3 | /i-Carotin, bezogen auf 5 die Kontroll probe |
IO |
A | ohne | era | 1340 | 100 | ||
H3 | 3 g/l | ig/i | 2280 | |||
Versuch |
Der folgende Vergleich wurde nach den Verfahren der Beispiele 6, 9 und 10 der vorliegenden Anmeldung
durchgeführt. Dabei wurden einerseits die dort angegebenen Zusatzstoffe und andererseits Succinimid als
Aktivatoren zugesetzt.
Beispiel | 3065 | /?-Carotin (mg/1) |
6 | 2760 | (4-Formyl-pyridin) |
9 | 2505 | (4-Hydroxymethyl-pyridin) |
2 | 2450 | (2-Furoylhydrazin) |
7 | 2390 | (4-Hydroxy-pyridin) |
9 | 2290 | (4-Thiocarbamoyl-pyridin) |
4 | 2230 | (2-Pyrazinyl-carbonylhydrazin) |
9 | 2165 | (4-Acetyl-pyridin) |
10 | (Pyridazin) | |
B. Deutsche Patentschrift 1 196153 (entsprechend der französischen Patentschrift 1344 264 mit den
zwei Zusatzanmeldungen)
3°
35
Die vorstehenden Versuche zeigen, daß die erfindungsgemäßen Aktivatorsubstanzen zu besseren Ergebnissen
führen, als das als Zusatz als besonders günstig bekannte Succinimid (vgl. die französischen
Patentschriften 1 377 523 und 1 344 264).
Aus dem folgenden Vergleich geht hervor, daß sei Zusatz der erfindungsgemäßen Aktivatoren
vesentlich bessere Ausbeuten erzielt werden als bei Zusatz, der aus der französischen Patentschrift
I 344 264 und ihren Zusatzanmeldungen bekannten \ktivatoren.
Beispiel | /?-Carotin (mg/1) |
23 | 197Θ * |
,23 | 1730 |
22 | 1730 |
18 | 1700 |
18 | 1635 |
13 | 1620 |
17 | 1590 |
21 | 1485 |
12 | 1370 |
18 | 1360 |
12 | 1295 |
6 | 1275 |
6 | 1265 |
12 | 1260 |
11 | 1245 |
♦ 19 | 1225 |
6 | 1220 |
20 | 1180 |
9 | 1085 |
10 | 1040 |
3 | 885 |
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von /?-Carotin durch aerobe Fermentation einer Kultur der Formen + und — von Blakeslea trispora in einem geeigneten Nährmedium und unter den für diese Art von Züchtung üblichen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium in Mengen von 0,1 bis 10 g pro Liter des Nährmediums zumindest einen Aktivator aus der Gruppe vonI. Hydraziden der allgemeinen Formel
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---|---|---|---|
FR23960A FR1449879A (fr) | 1965-07-08 | 1965-07-08 | Procédé de production de beta-carotène par fermentation en présence de dérivésde la pyridine |
FR23959A FR1456569A (fr) | 1965-07-08 | 1965-07-08 | Procédé de production de beta-carotène par fermentation en présence d'hydrazides hétérocycliques |
FR23961A FR1449880A (fr) | 1965-07-08 | 1965-07-08 | Procédé de production de beta-carotène par fermentation en présence de pyridazine |
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