CN109280685A - 通过增加天然类胡萝卜素发酵过程中溶氧生产天然类胡萝卜素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过增加天然类胡萝卜素发酵过程中溶氧生产天然类胡萝卜素的方法，所述方法将植物油脂通过化学方法或酶法进行适度改性，得到改性植物油脂，随后利用得到的改性植物油脂作为微生物发酵的碳源与培养基通过胶体磨高速剪切混合。发酵完成后最终发酵液中β‑胡萝卜素单位最高可达13.5g/l。发酵完成后调节发酵液pH使细胞破壁，用有机溶剂提取胞内类胡萝卜素，浓缩后结晶就可得高纯度的类胡萝卜素晶体，不需其它的精制分离步骤，其中类胡萝卜素的含量可达96％以上，提取收率在85％左右。在整个生产过程中操作简便，类胡萝卜素素的损失少，杂质少，产率高，易于工业化生产。

Description

通过增加天然类胡萝卜素发酵过程中溶氧生产天然类胡萝卜素 的方法

技术领域

本发明涉及利用微生物发酵生产β-胡萝卜素和番茄红素，包括通过改性植物油增强发酵过程中溶氧的措施，属生物化工领域。本发明涉及到以较高的收率通过微生物发酵并经提取纯化生产天然类胡萝卜素的方法，其中应用到改性植物油增强培养基中溶氧，从而使微生物利用氧的效率得到极大提升，最终高收率地得到天然类胡萝卜素。

发明背景

类胡萝卜素是自然界中发现最多且分布广泛的一类色素物质，类胡萝卜素化合物广泛应用于食品、化妆品、药品等的着色，近年来研究发现类胡萝卜素对预防、延缓和治疗某些疾病，提高机体免疫力方面具有较好的疗效。

其中，β‐胡萝卜素是一种重要的类胡萝卜素，其化学式C₄₀H₅₆，分子量536.88，由四个异戊二烯双键首尾相连而成，主要由全反式、9-顺式、13-顺式及15顺式四种形式，分子结构式如下：

在其分子结构的两端各有一个β-紫罗兰酮环，此β-紫罗兰酮可能以异构性、取代型、开环型的形式存在。

β-胡萝卜素具有重要的生理功能，可以作为维生素A的前体，是联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类营养食品强化剂。有研究表明β-胡萝卜素作为维生素A的前体具有抗氧化、影响繁殖和甲状腺功能等作用。β-胡萝卜素分子中的多个双键，在光、热、氧气及活泼性较强的自由基离子存在下，易被氧化，从而起到抗氧化的作用，保护机体不被破坏。除此之外，研究还表明β-胡萝卜素还具有增强免疫力，提高人体抗癌能力；促进细胞间的连接与交流；抗尼古丁作用等。

β-胡萝卜素有全化学合成和天然来源。全化学合成法得到的β-胡萝卜素由于可能存在着一些化学中间体杂质，近来年，人们越来越偏向于天然来源的β-胡萝卜素，而天然来源的β-胡萝卜素往往又有三种生产方法，分别是从天然植物中提取，通过盐藻养殖得到以及通过微生物发酵法生产。通过从胡萝卜等含微量β-胡萝卜素蔬菜中提取、分离，可获得一定量的天然β-胡萝卜素，采用这种方法生产的不足很显然是耗费原料多，产量低。第二种方法是通过大面积养殖盐藻获得，如大面积养殖杜氏盐藻，通过溶剂萃取法获得，但是盐藻养殖受外界环境条件的严格限制，使其规模很难壮大，远远不能满足市场需求。第三种方法是通过微生物发酵法生产，采用这种方法生产天然β-胡萝卜素因不受环境条件限制，产量高，易于实现工业化生产而受到重视，有越来越多的研究机构和生产厂家投入到这方面的研究中去。国内外用于生产天然β-胡萝卜素的微生物菌种主要有分支杆菌、红酵母等，但应用最为广泛的还是丝状真菌，如三孢布拉霉、好食脉孢霉等，其中又以三孢布拉霉应用为多。

应用三孢布拉霉发酵生产天然β-胡萝卜素的过程中，通过代谢调节剂的调节作用，可以用同一菌株生产天然番茄红素。因为番茄红素与β-胡萝卜素有相同的分子式和分子量，只是其分子结构式两端没有被环化。

应用三孢布拉霉生产天然β-胡萝卜素或番茄红素一般是通过其两种菌株如(+)和(-)菌株进行混合发酵生产的，其具体的代谢途径在先前文献WO 00/77234,Caglioti L.etal.(1966)中有较为详尽的描述，在近阶段的研究中主要集中于如何改变发酵条件或添加前体物质以提高发酵单位，以及如何有效地从发酵菌丝体中分离得到高质量的β-胡萝卜素或番茄红素纯品。较多的专利文献中有这方面的报道，并提出了很多改进措施，但这些措施或者生产工艺中往往存在着这样或那样的技术缺陷，或者由于发酵单位低以至成本高，不利于工业化生产；或者没有采用合适的方法，不仅使提取纯化β-胡萝卜素的工艺复杂，而且使发酵得到的胞内产物不易被提取完全；或者在提取纯化过程中用到毒性较大的有机溶剂，存在食用安全风险；或者得到的β-胡萝卜素或番茄红素含量不高，存在较多的杂质。

利用丝状真菌三孢布拉霉发酵生产天然β-胡萝卜素和番茄红素过程中一个重要且需优化的问题就是解决其溶氧问题。由于三孢布拉霉发酵为有氧发酵，过程中需要大量的氧气，氧气浓度越高越有利于菌丝体生长，从而提高菌液浓度和发酵产率。但由于天然β-胡萝卜素和番茄红素为类胡萝卜素，其分子结构中存在着11个双键，对氧特别不稳定，大量氧气的存在会使部分产生的β-胡萝卜素和番茄红素氧化降解，不仅降低了最终产物收率，而且β-胡萝卜素和番茄红素降解后生成了许多杂质，这些杂质的存在会使后续β-胡萝卜素和番茄红素的分离过程变得更加复杂，使精制纯化步骤延长，降低了终产品收率的同时，得到的β-胡萝卜素和番茄红素晶体纯度也不高。

而且，在常规的应用三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素和番茄红素的过程中，往往是利用天然植物油脂如大豆油、菜籽油、棉籽油、玉米油作为供发酵过程菌体利用的主要碳源物质，植物油脂被菌体分解后生成各种脂肪酸、甘油为三孢布拉霉合成提供代谢中间体。为了使菌体更好地生长，植物油脂的添加量还较大。但植物油脂为脂溶性的，水溶性基质的发酵培养基中大量脂溶性植物油脂的存在会使氧在其中的熔解度大为降低，同时会降低菌丝体利用氧的效率。所以在应用三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素和番茄红素的过程中，大量植物油脂的使用与发酵培养基中氧浓度是一对矛盾，三孢布拉霉的生长需要大量的植物油脂和氧气，但植物油脂会的存在使氧气在培养基中的溶解困难，微生物利用培养基中溶解氧的效率也降低了。

为了解决这一问题，常规工业上的方法就是在加入大量植物油脂的同时，通过加快搅拌速度，强制通入高纯氧气等措施来加大氧在培养基中的溶解度，但过快的搅拌速度会使部分菌丝体断裂，从而阻止了其生长，另外，大量高纯氧气中只有少部分被微生物所利用，其余大量的高纯氧气会使部分生产的β-胡萝卜素和番茄红素降解，产生大量杂质，不仅导致终产品收率不高，而且增大了后续分离纯化难度。

U.S.Patent 3,752,740通过在培养基中添加7.5％的柠檬酸，应用三孢布拉霉发酵生产天然β-胡萝卜素，但最终发酵液中发酵单位很低，不适于工业化生产。

U.S.Patent 7,252,965中公开了对三孢布拉霉的筛选优化，并在发酵过程中通过添加前体物质β-紫罗兰酮和强制增大溶解氧等措施以增加发酵液中β-胡萝卜素的产量，此工艺中通过强制增加溶解氧提高β-胡萝卜素产量的结果也并不十分理想，而且由于大量氧气的引入，使部分类胡萝卜素发生降解，后续分离纯化过程复杂。

EP1,306,444 B1中涉及一种应用三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素并从菌丝体中提取β-胡萝卜素的方法。在发酵过程中需要添加卵磷脂及分阶段调节发酵液pH，而在提取纯化β-胡萝卜素过程中要经历多个步骤如醇类精制过滤后的菌丝体，干燥并粉碎菌丝体，有机溶剂萃取，浓缩浸提后的有机溶剂，加醇类溶剂结晶，过滤并干燥等。此工艺特别是β-胡萝卜素的提取纯化方法十分复杂繁琐，要涉及至少三次干燥和粉碎步骤，分别为精制后湿菌丝体干燥和粉碎，提取后β-胡萝卜素纯品干燥及粉碎及β-胡萝卜素提取完成后菌丝体残渣的干燥。同样也就必然涉及到三次粉状物料的转移过程，这在工业化生产中会带来一系列设备和技术上的额外要求，而且两次受热干燥过程对β-胡萝卜素这种受热时不稳定的物质来说是十分不利的，会使最终产物的收率降低。另外，菌丝体的粉碎过程一方面会增加工序，另一方面粉碎过程产生的微粉对职业健康来说也是不利的。

总之，这些先前技术中往往没有考虑到作为营养碳源的植物油脂与微生物发酵需要大量的氧气间的矛盾，一方面微生物发酵需要大量的植物油脂和氧气，另一方面大量的植物油脂的存在降低了氧气的使用效率，就不得不通过机械的强制溶氧等措施，存在着工艺复杂，不适合工业化生产等方面的缺陷，有必要找到一种方法使通过三孢布拉霉高产量地生产β-胡萝卜素或番茄红素，并且运用一种有效的方式将孢内发酵产生的β-胡萝卜素或番茄红素方便地提取出来，本发明就揭示了一种通过增加发酵培养基中有效溶氧，培养三孢布拉霉高收率地得到天然类胡萝卜素的方法。

发明内容

本发明提供了一种运用改性植物油脂增大发酵培养基中有效溶氧，利用三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素或番茄红素的方法，所述方法包括如下步骤：a)将植物油通过化学方法或酶法进行改性，得到HLB＝2.0-3.5的改性植物油脂；b)培养基中加入a)中所述的改性植物油脂，通过胶体磨高速剪切乳化混合，得到含有改性植物油脂的培养基；c)利用b)中得到的培养基接种三孢布拉霉发酵生产天然类胡萝卜素，提取、分离、烘干得到天然类胡萝卜素纯品。

本发明的制备方法的优选技术方案中，优选地，所述天然类胡萝卜素包括β‐胡萝卜素和番茄红素。

本发明的制备方法的优选技术方案中，优选地，步骤a)中，所述植物油为大豆油、葵花籽油、菜籽油、棉籽油、玉米油、棕榈油中的一种或几种。

本发明的制备方法的优选技术方案中，优选地，步骤b)中，培养基中所述改性植物油脂的加入量为培养基总质量的1.0-10.0w/w％，优选3-6w/w％。

本发明的制备方法的优选技术方案中，优选地，步骤c)中，所述改性植物油脂还可以在发酵中补加。

本发明的制备方法的优选技术方案中，优选地，所述天然类胡萝卜素纯品以干粉或油悬液形式作为添加辅料应用于食品添加剂、膳食补充剂、药物或化妆品中。

本发明涉及一种改进的方法，利用化学或酶法改性后的植物油脂代替常规植物油脂作为碳源，运用丝状真菌特别是三孢布拉霉生产天然类胡萝卜素及其提取纯化过程，也是对现有技术专利文献WO 00/77234所述的利用三孢布拉霉生产天然类胡萝卜素及其提取纯化过程的进一步改进。

在丝状真菌特别是三孢布拉霉发酵培养生产天然类胡萝卜素如β-胡萝卜素或番茄红素的过程中，为了提高发酵液中天然类胡萝卜素的单位，往往采取两种方法，一种是在培养基中添加足够量的前体物质，另一种就是尽量增加溶氧。

因为丝状真菌生产类胡萝卜素是有氧发酵，所以增加培养基中氧的浓度是非常必要和有益的，通常采取的措施是改变发酵罐的搅拌形态或加快搅拌，以及强制通氧，特别是强制通入高纯氧气，但这些措施效果也不是很理想，不仅增加能耗，而且搅拌速度加快会使生长的菌丝体断裂，生物量下降，带来负面效果。同时大量氧气的通入，除少部分被微生物生长所利用外，大部分氧气被排放，形成浪费，而且高浓度的氧气会导致生产的类胡萝卜素发生降解，产生杂质，这些杂质的存在对后续的类胡萝卜素晶体的提取分离过程是非常不利的。

目前有较多的报道认为在培养基中添加植物油脂能增加β-胡萝卜素或番茄红素的发酵单位，但添加植物油脂时一个问题就是由于植物油脂是脂溶性的，其在水基质的培养基中不能很好地分散，导致植物油脂的利用率不高，另一方面，植物油脂的大量加入会减少培养基中氧的溶解度和浓度，这又会降低最终发酵液中β-胡萝卜素和番茄红素的浓度。

为了解决发酵生产天然类胡萝卜素时植物油脂应用效率不高，溶氧困难的问题，许多报道通过强化搅拌，强制通高纯度氧气同时，在培养基中加入大量的乳化剂，但大量乳化剂的加入会使培养基在高速搅拌时产生大量的泡沫，这对发酵过程也是不利的。

本发明找到了一种方便的方法利用化学或酶法改性后的植物油脂替代常规的植物油脂作为可以供微生物利用的碳源，利用改性植物油脂良好的乳化性能，增强其在培养基中的分散效率，使得微生物利用油脂的效率得到提升，植物油脂的使用量得以下降。同时，改性植物油脂使得氧气在培养基中的溶解度也得到提高，降低了氧气的通入强度，不仅节约了能耗，而且氧气量的减少，使得产生的类胡萝卜素降解可能性大为降低，有利于后续产品的分离纯化过程。也就是说，通过利用改性植物油脂替代普通植物油脂，避免了通过额外添加乳化剂时产生泡沫问题的同时，提高了植物油脂本身和氧气在培养基中的分散性，使得微生物利用植物油脂和氧气的效率得到提升，降低了植物油脂和氧气的使用量，在降低生产成本的同时，减少了类胡萝卜素降解的可能，有利于后续的产物分离纯化过程。

具体地说，先将普通植物油如大豆油、棕榈油、葵花籽油、菜籽油、棉籽油、玉米油等，通过化学方法或酶法进行改性，得到部分水解的甘油一酯和甘油二酯及甘油三酯的混合物，也就是改性植物油脂。接着在包含碳源、氮源、磷源和微量元素的培养基中加入一定量的改性植物油脂后，添加或不添加其它乳化剂，经过胶体磨高速剪切乳化，使油滴能均匀分散于水基培养基中，这样在后续培养过程中，不仅扩大了霉菌与植物油滴的接触机会，细小的植物油滴能被微生物充分地利用，从而增加类胡萝卜素产量。而且，在高速剪切过程中，大量的氧气能被卷入到培养基中，利用改性植物油脂的乳化分散性，从而增大了培养基中氧的浓度，使氧能大量分散于乳化后界面膜上，这对后续的培养过程也是非常有利的。

改性植物油脂中植物油脂的改性程度是非常关键的。因为之所以应用改性植物油，一方面是利用植物油脂改性后仍可以作为良好的碳源供微生物生长用的前体，另一方面是改性后植物油脂具有良好的乳化性能，经高速剪切混合后，改性植物油脂本身以及氧气能更好地分散在乳化界面，从而可以更好地被微生物利用，提高了油脂和氧气的利用效率，降低了其使用量。这样的话，为了保证改性植物油脂在整个微生物发酵过程中一直保持良好的乳化性能就十分关键。在微生物利用改性植物油脂提供的碳源生长时，其本身就一直在利用微生物体内的酶将改性植物油脂进一步水解，使甘油脂肪酸酯中的部分脂肪酸游离下来以游离脂肪酸形式进行利用，改性植物油脂中脂肪酸不断地游离下来后，其亲水性不断增强，HLB值(亲水亲油平衡值)不断升高，但HLB值升高到一定程度，会破坏植物油脂本身和氧分子在相界面的溶解性，降低了其利用效率。所以前期加入的改性植物油的HLB值不能太高，否则加入改性植物油脂后，随着微生物对改性植物油脂的利用，越来越多的甘油酯被水解更低一级的单甘酯或双甘酯，其HLB值越来越大，会导致改性植物油脂本身和溶解在培养基中的氧气被释放出来，从而降低了其利用效率。

经过前期大量试验表明，加入改性植物油脂的HLB值在2.0-3.5之间较为合适，也就是植物油脂被化学方法或酶法水解时，水解率为5％--30％之间。当水解率过低，HLB值过低时，起不到改性植物油脂的乳化分散作用，当水解率过高，HLB值过高时，在发酵后期微生物对改性植物油脂本身和氧的分散性变差，导致使用效率变低。而且，改性植物油脂的HLB值控制在2.0-3.5之间，还能有效地避免培养基搅拌时泡沫的生成，有利于发酵过程。

改性植物油脂中甘油三酯的水解率可以通过常规的酸值滴定法或气相色谱法进行测定。HLB值可以通过常规乳化法测定。

除了改性植物油脂外，培养基中的碳源可以是一种或多种的其它碳水化合物或脂肪类物质，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、植物油或动物油；氮源可以是一种或多种有机或无机氮源，如大豆蛋白、玉米蛋白、酵母提取物、多肽、酪蛋白等；培养基中可加入一定量的微量元素如磷酸盐、硫酸盐、钙盐、镁盐等。具体到碳源、氮源、磷源及微量元素的比例和浓度，要使其有利于微生物的生长及发酵单位的提高。

培养基中改性植物油脂总的加入量为1-10wt％，优选3-6wt％。此外，在发酵开始前改性植物油脂的加入量为其总加入量的10-90wt％，优选40-70wt％，剩下的可以在发酵过程中分批加入。

种子培养基中用到的乳化剂可以为常规乳化剂如吐温系列产品、司班系列产品及卵磷脂，单双甘油酯等，乳化剂的加入量为培养基的0.01-10.0wt％，优选0.1-5.0wt％，更优选0.5-2.0wt％之间。

发酵完成后，添加有机或无机碱类物质将发酵液调整为碱性，一般是添加氢氧化钠或氢氧化钾或甲醇钠或乙醇钠等使发酵液pH达到8.0左右，保持0.1-2.0小时后使细胞壁破碎。

运用常规方法如过滤、压滤、离心等方式将湿菌丝体分离出来。

用冷的非极性有机溶剂处理湿菌丝体将除去菌丝体中的脂溶性杂。由于在发酵过程中用到大量的植物油，一方面这些植物油中少量部分可能没有被微生物利用完全，另一方面微生物在代谢过程中会产生较多的脂溶性物质，这些脂溶性物质的存在对后续产品的提取收率和纯度会产生不好的影响，所以应在前期尽可能去除。并且发酵产生的天然类胡萝卜素在非极性有机溶剂中的溶解度很小，特别是在温度低的时候溶解度更低，通过温度较低的非极性有机溶剂就能在不损耗类胡萝卜素的情况下将脂溶性有机杂质去除，为后续的类胡萝卜素提取和纯化创造条件。

将湿菌丝体与非极性有机溶剂如正己烷、环己烷、正庚烷等进行充分混和，混和温度为0-60℃之间，优选10-40℃之间。混和时间为0.1-3.0hr，优选0.5-2.0hr。非极性有机溶剂与湿菌丝体的比例为0.5/1(V/V)到10/1(V/V)之间，优选1/1(V/V)到5/1(V/V)之间。湿菌丝体处理完成后过滤得到脱除了脂溶性杂质的湿菌丝体。

脱除脂溶性有机杂质后，将此湿菌丝体用有机溶剂浸提其中的类胡萝卜素。使用到的有机溶剂主要是酯类溶剂，如乙酸乙酯，乙酸异丁酯，乙酸异丙酯，乙酸丁酯，浸提时温度为10℃到溶剂的沸点温度，优选为30℃到60℃之间，以减少β-胡萝卜素在提取过程中的损耗。浸提用溶剂的比例根据菌丝体中的单位确定，一般为湿菌丝体质量的5-30倍，优选10-20倍。

浓缩浸提后的有机溶剂。溶剂浓缩完成后加入醇类有机溶剂结晶，也可以在浓缩过程中将析出的部分晶体直接过滤得到纯品，余下部分的晶体在溶剂浓缩至干后加入醇类有机溶剂结晶析出。用到的醇类主要有乙醇，异丙醇，丙二醇，正丙醇等。醇类体积为浓缩液体积的5-50倍，优选10-30倍，结晶温度为10-80℃，优选30-60℃。

将得到的晶体烘干，即得类胡萝卜素纯品，其含量可达96％以上，提取收率可达85％左右。

得到的类胡萝卜素晶体可通过应用微胶囊技术制备稳定性好，可直接应用的微胶囊制剂产品，也可制备成可在油中分散的油悬浮液产品。

本发明的制备方法首先将植物油脂通过化学方法或酶法进行适度改性，得到改性植物油脂，随后利用得到的改性植物油脂作为微生物发酵的碳源与培养基通过胶体磨高速剪切混合。发酵完成后最终发酵液中β-胡萝卜素单位最高可达13.5g/l。发酵完成后调节发酵液pH使细胞破壁，用有机溶剂提取胞内类胡萝卜素，浓缩后结晶就可得高纯度的类胡萝卜素晶体，不需其它的精制分离步骤，其中类胡萝卜素的含量可达96％以上，提取收率在85％左右。在整个生产过程中操作简便，类胡萝卜素素的损失少，杂质少，产率高，易于工业化生产。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不限定本发明。

实施例1

将1000ml葵花籽油，加入500ml叔丁醇，搅拌均匀，加入TL脂肪酶0.4g，在40℃酶解5hr，回收溶剂叔丁醇，得到改性葵花籽油。改性葵花籽油的HLB值为2.7，其中甘油三酯的水解率为20％。

将保藏的能代谢β-胡萝卜素的菌种三孢布拉霉(Blakeslea trispora)“+”“-”菌株(+菌株，保藏号HCB200505，－菌株，保藏号HCB200506)分别接种到PDA培养基上，在25-30℃条件下培养48-60小时，待大量长出孢子后用无菌生理盐水洗脱孢子成悬浮液，悬浮液中含孢子的量约为1-3×10⁶个/ml。PDA培养基由葡萄糖、马铃薯和琼脂培养基组成。

新鲜孢子悬浮液中的孢子在种子罐中萌发繁殖成大量菌丝体作为发酵用种子，种子培养基组成为(每升)：玉米淀粉，21g；葡萄糖，13g；改性葵花籽油，100g；盐酸硫胺素，0.02g；硫酸镁，0.3g；吐温-20，0.1g；pH6.3。培养温度25-30℃，培养时间24-30小时。

将种子罐中孢子接种到发酵罐中发酵培养生产β-胡萝卜素。发酵罐培养基组成为(每升)：玉米淀粉，23g；玉米浆，31g；粕饼粉，12g；改性葵花籽菜籽油，30g；磷酸氢二钾，2g；硫酸镁，0.3g；盐酸硫胺素，0.02g；卵磷脂，1.0g；pH6.8。培养基经过胶体磨高速剪切乳化，使改性植物油脂在其中充分分散，并带入大量的氧气。培养温度27-30℃，培养24hr后补加改性葵花籽棉籽油，数量为每升培养基加3.3g。96hr后发酵完成。发酵完成后发酵液中β-胡萝卜素单位可达13.46g/l。

向发酵液中添加NaOH调节溶液pH＝8.0，搅拌2.0hr后过滤得湿菌丝体。将湿菌丝体与0℃的正己烷混和搅拌，正己烷体积为湿菌丝体质量的一倍，菌丝体浸提时间为3.0hr，过滤后得去除脂溶性杂质的湿菌丝体。

湿菌丝体与10倍量的乙酸丁酯在60℃温度下充分混合，过滤得到浸提液，真空状况下浓缩至干，浓缩时温度不超过40℃。加入正丙醇于60℃温度下结晶，正丙醇的加入量为浓缩液体积的10倍。

过滤结晶得β-胡萝卜素纯品，其含量达99.1％，浸提收率达87.3％。得到的β-胡萝卜素晶体可添加其它辅料如明胶、淀粉、蔗糖、植物油等作为食品添加剂或药物应用。

与对照试验相比，植物油脂使用量减少了18.4％，氧气使用效率提高了25％。

比较实施例1-1

参照文献现有技术专利文献WO 00/77234利用三孢布拉霉生产天然类胡萝卜素及其提取纯化过程，其中三孢布拉霉(Blakeslea trispora)孢子悬浮液的培养及种子培养，发酵罐培养条件完全同实施例1，培养基组成也一样，与实施例1不同之处在于用普通葵花籽油代替改性葵花籽油。发酵完成后发酵液中β-胡萝卜素单位只有9.79g/l，且按实施例1浸提和精制方法，得到的β-胡萝卜素纯品，其含量只达78.7％，浸提收率75.6％。

实施例2

取棉籽油1000ml，加入20ml 45％的乙醇钾溶液，80℃下水解0.5hr，反应在真空条件下进行，反应完成后加入少量醋酸以中和未反应完全的碱液，得到改性棉籽油脂，水解率为5.2％，HLB值2.04。

三孢布拉霉(Blakeslea trispora)孢子悬浮液的培养见实施例1。

新鲜孢子悬浮液中的孢子在种子罐中萌发繁殖成大量菌丝体作为发酵用种子，种子培养基组成为(每升)：玉米淀粉，24g；葡萄糖，15g；改性棉籽油，60g；盐酸硫胺素，0.02g；硫酸镁，0.3g；司班-40，5.0g；pH6.5。培养温度25-30℃，培养时间24-30小时。

将种子罐中孢子接种到发酵罐中发酵培养生产β-胡萝卜素。发酵罐培养基组成为(每升)：玉米淀粉，25g；玉米浆，24g；粕饼粉，15g；改性棉籽油，10g；磷酸氢二钾，2g；硫酸镁，0.4g；盐酸硫胺素，0.02g；吐温-40，20.0g；pH6.5。培养基经过胶体磨高速剪切乳化，使植物油在其中充分分散，并带入大量的氧气。培养温度27-30℃，培养24hr后补加改性菜籽油，数量为每升培养基加90.0g。100hr后发酵完成。发酵完成后发酵液中β-胡萝卜素单位可达14.08g/l。

向发酵液中添加KOH调节溶液pH＝8.0，搅拌0.1hr后过滤得湿菌丝体。将湿菌丝体与60℃的正庚烷混和搅拌，正庚烷体积为湿菌丝体质量的0.5倍，菌丝体浸提时间为2.0hr，过滤后得去除脂溶性杂质的湿菌丝体。

湿菌丝体与30倍量的乙酸异丙酯在30℃温度下充分混合，过滤得到浸提液，真空状况下浓缩至干，浓缩时温度不超过40℃。加入丙二醇于80℃温度下结晶，丙二醇的加入量为浓缩液体积的30倍。

过滤结晶得β-胡萝卜素纯品，其含量达97.2％，浸提收率达86.5％。得到的β-胡萝卜素晶体可添加其它辅料如明胶、淀粉、蔗糖、植物油等作为食品添加剂或药物应用。

实施例3

取大豆油1000ml，加入60ml 45％的乙醇钾溶液，80℃下水解0.75hr，反应在真空条件下进行，反应完成后加入少量醋酸以中和未反应完全的碱液，得到改性大豆油脂，水解率为29.8％，HLB值3.54。

三孢布拉霉(Blakeslea trispora)孢子悬浮液的培养见实施例1。

新鲜孢子悬浮液中的孢子在种子罐中萌发繁殖成大量菌丝体作为发酵用种子，种子培养基组成为(每升)：玉米淀粉，22g；葡萄糖，11g；改性玉米油，10g；盐酸硫胺素，0.02g；硫酸镁，0.3g；单双甘油酯，100.0g；pH＝6.5。培养温度25-30℃，培养时间30-36小时。

将种子罐中孢子接种到发酵罐中发酵培养生产番茄红素。发酵罐培养基组成为(每升)：玉米淀粉，19g；玉米浆，27g；粕饼粉，18g；改性大豆油，50g；磷酸氢二钾，2g；硫酸镁，0.4g；盐酸硫胺素，0.02g；吐温-60，50.0g；pH＝6.5。培养基经过胶体磨高速剪切乳化，使植物油在其中充分分散，并带入大量的氧气。124hr后发酵完成。发酵完成后发酵液中番茄红素素单位可达10.32g/l。

向发酵液中添加甲醇钠调节溶液pH＝8.1，搅拌1.0hr后过滤得湿菌丝体。将湿菌丝体与40℃的环己烷混和搅拌，环己烷体积为湿菌丝体质量的10.0倍，连续压滤后得去除脂溶性杂质的湿菌丝体，菌丝体平均浸泡时间为0.1hr。

湿菌丝体与20倍量的乙酸异丁酯在10℃温度下充分混合，过滤得到浸提液，真空状况下浓缩至干，浓缩时温度不超过40℃。加入异丙醇于10℃温度下结晶，异丙醇的加入量为浓缩液体积的50倍。

过滤结晶得番茄红素纯品，其含量达97.3％，浸提收率达87.4％。得到的番茄红素晶体可添加其它辅料如明胶、淀粉、蔗糖、植物油等作为食品添加剂或药物应用。

与使用普通大豆油的对照试验相比，本实施例中植物油使用量减少了20.5％，氧气消耗量减少了14.7％，发酵单位提高了近15.3％。

实施例4

将300ml棕榈油和700ml玉米油，加入500ml异丙醇，搅拌均匀，加入TL脂肪酶1.2g，在40℃酶解6hr，回收溶剂异丙醇，得到改性棕榈玉米油，HLB值为3.0，棕榈玉米油水解率为25％。

三孢布拉霉(Blakeslea trispora)孢子悬浮液的培养见实施例1。

新鲜孢子悬浮液中的孢子在种子罐中萌发繁殖成大量菌丝体作为发酵用种子，种子培养基组成为(每升)：玉米淀粉，20g；葡萄糖，17g；改性棕榈玉米油，10g；盐酸硫胺素，0.02g；硫酸镁，0.3g；司班-60，10.0g；pH6.8。培养温度25-30℃，培养时间30-36小时。

将种子罐中孢子接种到发酵罐中发酵培养生产番茄红素。发酵罐培养基组成为(每升)：玉米淀粉，25g；玉米浆，17g；粕饼粉，19g；改性大豆菜籽油，40g；磷酸氢二钾，2g；硫酸镁，0.4g；盐酸硫胺素，0.02g；pH6.5。培养基经过胶体磨高速剪切乳化，使植物油在其中充分分散，并带入大量的氧气。培养温度27-30℃。124hr后发酵完成。发酵完成后发酵液中番茄红素单位可达11.24g/l。

向发酵液中添加乙醇钠调节溶液pH8.5，搅拌1.0hr后过滤得湿菌丝体。将湿菌丝体与10℃的正己烷混和搅拌，正己烷体积为湿菌丝体质量的5.0倍，连续压滤后得去除脂溶性杂质的湿菌丝体，菌丝体平均浸泡时间为0.5hr。

湿菌丝体与5倍量的乙酸乙酯在其沸点温度下充分混合，过滤得到浸提液，真空状况下浓缩，浓缩时温度不超过40℃，在浓缩过程中取出析出的部分β-胡萝卜素晶体，继续浓缩至干。加入乙醇于30℃温度下结晶，乙醇的加入量为浓缩液体积的5倍。

离心过滤结晶得番茄红素纯品，其含量达98.1％，浸提收率达88.2％。得到的番茄红素晶体可添加其它辅料如明胶、淀粉、蔗糖、植物油等作为食品添加剂或药物应用。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

Claims (7)

1.一种通过增加天然类胡萝卜素发酵过程中溶氧生产天然类胡萝卜素的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将植物油通过化学方法或酶法进行改性，得到HLB＝2.0-3.5的改性植物油脂；

b)培养基中加入a)中所述的改性植物油脂，通过胶体磨高速剪切乳化混合，得到含有改性植物油脂的培养基；

c)利用b)中得到的培养基接种三孢布拉霉发酵生产天然类胡萝卜素，提取、分离、烘干得到天然类胡萝卜素纯品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天然类胡萝卜素包括β‐胡萝卜素和番茄红素。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述植物油为大豆油、葵花籽油、菜籽油、棉籽油、玉米油、棕榈油中的一种或几种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中，培养基中所述改性植物油脂的加入量为培养基总质量的1.0-10.0w/w％。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤b)中，培养基中所述改性植物油脂的加入量为培养基总质量的3-6w/w％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述改性植物油脂还可以在发酵中补加。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天然类胡萝卜素纯品以干粉或油悬液形式作为添加辅料应用于食品添加剂、膳食补充剂、药物或化妆品中。