CN114127259A - β-胡萝卜素发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于生物的类胡萝卜素的生产，尤其涉及用于提高合适的宿主细胞中的β‑胡萝卜素发酵的滴度和纯度的方法。

Description

β-胡萝卜素发酵方法
本发明涉及基于生物的类胡萝卜素的生产，尤其涉及用于提高合适的宿主细胞中的β-胡萝卜素发酵的滴度和纯度的方法。
对于类胡萝卜素(例如番茄红素或β-胡萝卜素)的商业生产，化学合成和生物技术合成是相互竞争的。在自然界，类胡萝卜素是由某些细菌、真菌和光合生物合成的。然而化学产生的β-胡萝卜素仅以全反式构型可得，天然产生的β-胡萝卜素以各种构型，例如全反式、单顺式、双顺式和多顺式可得。在具有商业相关性的β-胡萝卜素的生物技术生产中最常用的宿主系统是藻类，例如盐生杜氏藻(Dunaliella salina)或雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)；以及真菌，例如三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)(关于综述，参见例如Mussagy等人，Appl Microbiol Biotechnol 103:1095-1114(2019))。
为了在β-胡萝卜素的生物生产中提高生产率并抑制杂质形成，特别是7,8-二氢-β-胡萝卜素的形成，已经在发酵中包括抗生素例如异烟肼。
虽然异烟肼在β-胡萝卜素形成中的作用模式尚不清楚，但是异烟肼在其他情况下已被确定为脂肪酸合成酶(Slayden等人，Mol Microbiol,38,第514-525页,2000)以及细胞色素P450酶(Desta等人，Antimicrob Agents Chemother，第45卷，第2期，第382-392页,2001)的抑制剂。
包括异烟肼在内的抗生素的大规模使用由于潜在的使抗生素耐药性细菌传播的作用而正在进行仔细审查，并且因此在生物生产过程中应最少化。
因此，需要鉴定新的天然化合物，所述天然化合物能够经由合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞(例如三孢布拉氏霉菌)的发酵有效地替代类胡萝卜素生产中的异烟肼。
令人惊讶的是，我们现在发现姜黄素在合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞(例如三孢布拉氏霉菌)的β-胡萝卜素发酵中的存在对β-胡萝卜素形成具有刺激效应，并且同时能够减少杂质，例如特别地降低7,8-二氢-β-胡萝卜素的百分比。
具体地，本发明涉及一种用于在如本文所定义的产生类胡萝卜素的宿主细胞中，例如在作为宿主系统的三孢布拉氏霉菌中发酵生产类胡萝卜素的方法，其中发酵是在有效量的姜黄素存在下执行的，例如经由在发酵期间添加姜黄素，优选以低于约1.0％(w/v)的姜黄素浓度添加姜黄素。
在一个方面中，本发明涉及一种用于存在发酵期间添加的有效量的姜黄素的情况下，在产生类胡萝卜素的宿主细胞(例如三孢布拉氏霉菌)中生产类胡萝卜素的方法，特别地其中与不添加姜黄素的发酵相比，β-胡萝卜素的产量增加了至少约12％。优选地，例如在发酵期间存在约0.3％姜黄素的情况下，可以实现大于约220％的β-胡萝卜素增加。
具体地，根据本发明的用于在产生类胡萝卜素的宿主细胞，例如作为宿主系统的三孢布拉氏霉菌中发酵生产类胡萝卜素的方法，是在发酵期间存在约0.01％(w/v)至1.0％(w/v)的姜黄素，优选约0.03％(w/v)至1.0％(w/v)，例如约0.03％(w/v)至0.05％(w/v)姜黄素的情况下进行的，这可能在(中等/大规模)发酵器中特别有用，例如在0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1.0％的姜黄素的存在下进行的，其中与不存在姜黄素的发酵相比，产生的β-胡萝卜素的量(g/l)可增加约12％至大于220％。更优选地，发酵是在约0.3％(w/v)至1.0％(w/v)姜黄素的存在下进行的。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于在产生类胡萝卜素的宿主细胞，例如作为宿主系统的三孢布拉氏霉菌中生产类胡萝卜素的方法，其中减少了在发酵期间生成的杂质(例如7,8-二氢-β-胡萝卜素)的形成，特别地其中基于在发酵期间生成的总类胡萝卜素的7,8-二氢-β-胡萝卜素的百分比在基于总类胡萝卜素约7％或更低的范围内，例如与未添加姜黄素的发酵相比减少了至少约28％。可以实现基于总类胡萝卜素的大致约70％的7,8-二氢-β-胡萝卜素减少，例如约68％的减少，即基于发酵期间形成的总类胡萝卜素约70％的7,8-二氢-β-胡萝卜素减少，特别地可经由在发酵期间添加约1.0％(w/v)姜黄素所获得的。
优选地，根据本发明的用于在产生类胡萝卜素的宿主细胞，例如作为宿主系统的三孢布拉氏霉菌中发酵生产类胡萝卜素的方法，是在约0.01％(w/v)至1.0％(w/v)，优选约0.03％(w/v)至1.0％(w/v)的姜黄素存在下，例如在约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1.0％的姜黄素存在下进行的，其中基于总类胡萝卜素的7,8-二氢-β-胡萝卜素的百分比可以从约9.7％(不含姜黄素)降低到在约7％至3％的范围中(在姜黄素存在下)。更优选地，方法是在约0.3％至1.0％的姜黄素存在下进行的，从而导致7,8-二氢-β-胡萝卜素的最大减少，即基于总类胡萝卜素为约3％的7,8-二氢-β-胡萝卜素的水平。
因此，本发明涉及一种用于在产生类胡萝卜素的宿主细胞，例如作为宿主系统的三孢布拉氏霉菌中类胡萝卜素生产中减少杂质的方法，特别是在生产β-胡萝卜素的发酵方法中减少7,8-二氢-β-胡萝卜素杂质的方法，所述方法包括在发酵期间添加有效量的姜黄素，特别地在发酵期间存在约1.0％(w/v)或更少的姜黄素，更特别地在发酵期间添加约0.3％(w/v)至1.0％(w/v)的量的姜黄素。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种用于在产生类胡萝卜素的宿主细胞，例如作为宿主系统的三孢布拉氏霉菌中类胡萝卜素生产中增加β-胡萝卜素的百分比的方法，所述方法包括在发酵期间添加有效量的姜黄素，特别是在存在约1.0％或更少的姜黄素的情况下发酵，其中与不含姜黄素的发酵相比，基于总类胡萝卜素的β-胡萝卜素的百分比可增加约3％至11％。
在本发明的一个方面中，提供了一种用于在产生类胡萝卜素的宿主细胞，例如作为宿主系统的三孢布拉氏霉菌中生产类胡萝卜素的方法，其中可增加基于总类胡萝卜素的β-胡萝卜素的百分比，特别地其中与发酵期间不存在姜黄素的发酵相比，基于总类胡萝卜素的β-胡萝卜素的百分比增加至大于约90％，例如92％，优选地其中例如在发酵期间添加的1.0％姜黄素存在下，β-胡萝卜素的百分比在约86％至92％的范围中，相比之下在发酵期间不添加姜黄素的情况下百分比为约83％。
另一个优选实施方式是一种在0.3％姜黄素存在下的发酵方法，所述发酵方法导致基于总类胡萝卜素的β-胡萝卜素的百分比为约91％，即与不含姜黄素的发酵相比增加约10％。这种效应甚至高于在0.28g/l异烟肼存在下的发酵，导致与不添加异烟肼的发酵相比增加小于10％。
在一个特定实施方式中，在如本文所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，例如三孢布拉氏霉菌中的类胡萝卜素生产是在发酵期间不添加抗生素，特别是不添加异烟肼的情况下进行的。
如本文所用，术语“1.0％(w/v)”是指发酵培养基的1重量％。
与本发明相关的术语“姜黄素的有效量”是指至少约0.01％，例如约0.01％至1％，更优选约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2.0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1.0％或更高的浓度。具体地，关于摇瓶实验的姜黄素的有效量可以是在约0.1％至1.0％的浓度。具体地，关于(中等/大规模)发酵罐的姜黄素的有效量可以是约0.01％至0.05％的浓度。
如本文所定义的以有效量使用的姜黄素可以来源于姜黄(Curcuma longa/turmeric)根，以包含姜黄素类化合物的经研磨的姜黄的形式，其中姜黄素是姜黄的主要姜黄素类化合物。它包括但不限于姜黄素或其衍生物，例如去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素。姜黄素可以从姜黄中纯化至95％，可以在油性树脂姜黄中以37-55％存在，在稀释的油性树脂中以6-15％存在，或者作为可以CAS号458-37-7从各种商业供应商获得的其他形式存在。
如本文所用，术语“杂质”包括但不限于7,8-二氢-β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素和顺式β-胡萝卜素，特别是7,8-二氢-β-胡萝卜素。
用于根据本发明的方法的合适宿主细胞包括能够进行类胡萝卜素生物合成的微生物，所述微生物选自细菌、藻类或真菌，特别是酵母，例如选自埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、泛菌属(Pantoea)(欧文氏菌属(Erwinia))、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、粘球菌属(Mixococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、鼠尾菌属(Muricauda)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、集胞藻属(Synochocystis)、副球菌属(Paracoccus)、酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、须霉属(Phycomyces)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、发夫酵母属(Phaffia)、布拉霉属(Blakeslea)、红球藻属(Haematococcus)、小球藻属(Chlorella)、杜氏藻属(Dunaliella)、新绵球藻属(Neospongicoccum)、衣藻属(Chlaydomonas)、拟穆氏藻属(Murielopsus)、或栅列藻属(Scenedesmus)，例如选自大肠杆菌(Escherichia coli)、产玉米黄素副球菌(Paracoccus xeaxanthinifaciens)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、布氏须霉(Phycomyces blakesleanus)、三孢布拉氏霉菌、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、或盐生杜氏藻。优选地，宿主细胞选自天然类胡萝卜素生产者，包括盐生杜氏藻、雨生红球藻、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、锁掷孢酵母属(Sprodidiobolus)、副球菌属(Paracoccus)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、布氏须霉、卷枝毛霉(Mucor circinellioides)、布拉霉属(Blakeslea)，更优选地选自三孢布拉氏霉菌。
关于本发明，应当理解的是，生物(诸如微生物、真菌、藻类或植物)也包括具有相同生理性质的此类物种的同义词或基名(basonyms)，如由国际原核生物命名法(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)或国际命名法(InternationalCode of Nomenclature)(Melbourne法)关于藻类、真菌和植物的所限定的。
如本文所用的术语“类胡萝卜素”是本领域中众所周知的。它包括通过两个具有20个碳的香叶基香叶基焦磷酸酯分子的连接而自然形成的长的40个碳缀合的类异戊二烯多烯。这些类胡萝卜素包括但不限于八氢番茄红素、番茄红素和胡萝卜素，诸如β-胡萝卜素，所述类胡萝卜素可以在4-酮位置或3-羟基位置上被氧化以产生角黄素、玉米黄质或虾青素。选自耶氏酵母属和酵母属的产生β-胡萝卜素的宿主细胞的培养和分离描述于例如WO2008042338或WO2014096992中。使用真菌宿主的类胡萝卜素生物合成描述于例如WO2006102342中。关于在作为宿主细胞的大肠杆菌中产生β-胡萝卜素，方法描述于例如US20070166782中。在例如EP1367131或WO2002010429中描述了三孢布拉氏霉菌中的类胡萝卜素生产。
本文所述的基于生物的类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素，可用作本领域技术人员已知的食物、饲料、美容或制药行业中的成分，例如以晶体形式。
具体地，本发明的特征为以下实施方式：
(1)一种用于在三孢布拉氏霉菌中生产β-胡萝卜素的发酵过程中提高β-胡萝卜素生产的滴度的方法，其中所述方法包括在发酵期间添加加有效量的姜黄素。
(2)如实施方式(1)所述的方法，其中所述姜黄素是以按发酵培养基的重量计1.0％或更少的量添加的。
(3)如实施方式(1)或(2)所述的方法，其中所述姜黄素是以按发酵培养基的重量计0.3％或更少的量添加的。
(4)如实施方式(1)、(2)或(3)所述的方法，其中所述姜黄素是以按发酵培养基的重量计0.1％或更少的量添加的。
(5)如实施方式(1)、(2)、(3)或(4)所述的方法，其中所述姜黄素是以按发酵培养基的重量计0.03％或更少的量添加的。
(6)如实施方式(1)、(2)、(3)、(4)或(5)所述的方法，其中所述方法进一步减少在发酵期间产生的7,8-二氢-β-胡萝卜素的量。
(7)如实施方式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)或(6)所述的方法，其中在所述发酵期间生成的7,8-二氢-β-胡萝卜素的量小于按发酵培养基的重量计的7％。
(8)如实施方式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)或(7)所述的方法，其中在所述发酵期间不添加异烟肼。
(9)一种用于在三孢布拉氏霉菌中生产β-胡萝卜素的发酵过程中减少生成的7,8-二氢-β-胡萝卜素的量的方法，其中所述方法包括在发酵期间添加有效量的姜黄素。
(10)如实施方式(9)所述的方法，其中所述姜黄素是以按发酵培养基的重量计1.0％或更少的量添加的。
(11)如实施方式(9)或(10)所述的方法，其中所述姜黄素是以按发酵培养基的重量计0.3％或更少的量添加的。
以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。在本申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容通过引用并入本文，特别是WO2008042338、WO2014096992、WO2006102342、US20070166782、EP1367131、WO2002010429。
实施例
实施例1：通用方法、菌株和质粒
摇瓶种子培养基MIBLT-1.将23.5g/l玉米粉、23g/l豆粕、10g/l葡萄糖、0.5g/lKH2PO4混合，将培养基pH调节至6.3，用Ultra-
Figure BDA0003473822160000081
搅拌机(Ika)以13500rpm进行均质化8分钟，并于70℃加热45分钟，然后进行高压灭菌。
摇瓶生产培养基MF-BLT-22.将17.5g/l玉米粉、40g/l大豆粉、10g/l大豆卵磷脂、0.5g/l KH2PO4、109g/l大豆油、任选的0.28g/l异烟肼、任选的姜黄素(1.0％w/v、0.3％w/v、0.1％w/v、0.03％w/v、或0.01％w/v)混合，将培养基pH调节至6.3，用Ultra-
Figure BDA0003473822160000082
搅拌机(Ika)以13500rpm进行均质化8分钟，并于70℃加热45分钟，然后进行高压灭菌。
溶液A.将二氯甲烷和甲醇以1:1的比率混合。
摇瓶过程.将含有30ml种子培养基(MIBLT-1)的锥形瓶(250mL或300mL的体积)接种三孢布拉氏霉菌(-)菌株的孢子至4.5×103个孢子/ml的浓度。将含有30ml的MIBLT-1的第二锥形瓶接种三孢布拉氏霉菌(+)菌株的孢子至1.5×103个孢子/ml的浓度。将烧瓶孵育(220rpm，5cm位移，27℃，避光)48小时。将3ml(+)菌株培养物添加到30ml的(-)菌株培养物中，并将经交配的菌株混合物孵育(220rpm，5cm摆度，27℃，避光)45分钟。将含有20ml生产培养基(MF-BLT-22)的锥形瓶(250或300mL的体积)接种2ml经交配的菌株混合物。对烧瓶进行孵育(250rpm，5cm位移，25℃，避光)。在接种20mL生产培养物后48小时，向每个烧瓶中添加40μL的50％v/v无菌β-紫罗兰酮的无水乙醇溶液。在接种后，将培养物放回培养箱达共7天。
用于HPLC分析的样品制备.将每个烧瓶培养物转移到50mL的锥形管中，并用
Figure BDA0003473822160000083
搅拌机(Ika)以24000rpm进行均质化2分钟。称出一克样品放入100ml容量瓶中。向烧瓶中加入80毫升溶液A，并将烧瓶进行超声处理5min。用溶液A使体积达到100ml，并将溶液搅拌60分钟并再静置一小时。
HPLC分析.使用Suplex-PKB-100柱(Supelco)，以0.6ml/min的流率和30℃的柱温，在经校准的HPLC上按原样注射来自上述提取物的样品(10μl)。流动相含有(每L)455ml乙腈、500ml甲醇、0.2ml N-乙基二异丙胺、25ml 0.2％乙酸铵水溶液、和50mg BHT(溶于20ml2-丙醇中)。鉴定化合物并通过448nm下的UV定量。
实施例2：姜黄素的存在对用三孢布拉氏霉菌进行β-胡萝卜素生产的影响
如实施例1所述测量β-胡萝卜素的浓度，并比较不同浓度的姜黄素。如表1所示，向生产培养基中添加0.3％(w/v)姜黄素时观察到β-胡萝卜素的最高增加。添加0.28g/l异烟肼导致每升4.17gβ-胡萝卜素，由此少于添加0.3％或1.0％的姜黄素时。
表1.姜黄素对β-胡萝卜素(“BC”)形成的影响。“增加BC”是指相较于在培养基中不存在姜黄素/异烟肼的对照(“无”)中的β-胡萝卜素生产，在姜黄素存在下百分比增加(两次测量的平均值)。有关更多详细信息，请参见文本。
Figure BDA0003473822160000091
实施例3：姜黄素存在对使用三孢布拉氏霉菌时的β-胡萝卜素纯度特性的影响
发酵和分析如实施例2所述执行，包括添加不同浓度的姜黄素。β-胡萝卜素和7,8-二氢-β-胡萝卜素的形成是通过HPLC分析的(参见实施例1)并且如表2所示。最佳结果是在0.3％(w/v)至1.0％(w/v)姜黄素存在下获得的，其中基于总类胡萝卜素的β-胡萝卜素的百分比增加了10.3％至11.2％，并且基于总类胡萝卜素的7,8-二氢-β-胡萝卜素的百分比减少了65.4％至67.7％。添加异烟肼导致了类胡萝卜素混合物，其中7,8-二氢-β-胡萝卜素的百分比为28.1％，并且β-胡萝卜素的百分比增加了小于10％(均基于总类胡萝卜素)。
表2.姜黄素对β-胡萝卜素(“BC”)、7,8-二氢-β-胡萝卜素(“7,8-DH”)形成的影响，显示为总类胡萝卜素的百分比。“无”表示培养基中不存在姜黄素(两次测量的平均值)。有关更多详细信息，请参见文本。
Figure BDA0003473822160000101

Claims (12)

1.一种用于在产生类胡萝卜素的宿主细胞，优选地天然类胡萝卜素生产者，更优选三孢布拉氏霉菌中发酵生产类胡萝卜素的方法，其中所述发酵是在所述发酵期间添加的有效量的姜黄素的存在下执行的，优选添加了低于约1.0％(w/v)的姜黄素浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在发酵期间添加的所述姜黄素浓度在约0.01％(w/v)至1.0％(w/v)的范围中，优选在约0.3％(w/v)至1.0％(w/v)的范围中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中与不添加姜黄素的发酵相比，β-胡萝卜素的产量增加了至少约12％。
4.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在所述发酵期间7,8-二氢-β-胡萝卜素的形成减少。
5.根据权利要求4所述的方法，其中基于在所述发酵期间形成的总类胡萝卜素，7,8-二氢-β-胡萝卜素的百分比降低至约7％或更低，优选降低至基于总类胡萝卜素约3％。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中与不添加姜黄素的发酵相比，在所述发酵期间形成的7,8-二氢-β-胡萝卜素的百分比降低了约70％。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中基于在所述发酵期间形成的总类胡萝卜素，β-胡萝卜素的百分比增加，优选增加了约3％至11％。
8.根据权利要求7所述的方法，其中与不添加姜黄素的发酵相比，基于在发酵期间形成的总类胡萝卜素，β-胡萝卜素的百分比在约90％或更高的范围中。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述发酵是在所述发酵期间不添加异烟肼的情况下执行的。
10.在产生类胡萝卜素的宿主细胞，优选天然类胡萝卜素生产者，更优选三孢布拉氏霉菌的发酵期间以有效量添加的姜黄素用于增加基于总类胡萝卜素的β-胡萝卜素百分比，优选将所述百分比增加至少约3％的用途。
11.在产生类胡萝卜素的宿主细胞，优选天然类胡萝卜素生产者，更优选三孢布拉氏霉菌的发酵期间以有效量添加，优选在所述发酵期间以1.0％(w/v)或更少的浓度添加的姜黄素用于降低基于总类胡萝卜素的7,8-二氢-β-胡萝卜素的百分比，优选将所述百分比降低约70％的用途。
12.根据权利要求10或11所述的姜黄素的用途，其中在发酵期间添加约0.1％(w/v)至1.0％(w/v)浓度的姜黄素。
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