WO2020011176A1

WO2020011176A1 - 一种从含叶黄素二酯的植物油树脂中提取分离叶黄素晶体的方法

Info

Publication number: WO2020011176A1
Application number: PCT/CN2019/095327
Authority: WO
Inventors: 许新德; 谢恬; 王升帆; 王秋岩; 郑建永; 曾昭武; 殷晓浦; 劳学军; 邵康忠
Original assignee: 浙江医药股份有限公司新昌制药厂
Priority date: 2018-07-10
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2020-01-16
Also published as: EP3822257A1; CN109232345B; EP3822257A4; CN109232345A; US20210147353A1; US11920175B2

Abstract

本发明提供了一种从含叶黄素二酯的植物油树脂中提取分离叶黄素晶体的方法，所述方法包括如下步骤：a)将脂肪酶溶解于去离子水中形成酶溶液；b)将叶黄素浸膏溶解于含去离子水的醇溶剂中形成均一的醇溶液；c)向醇溶液中加入所述酶溶液进行水解反应，搅拌以得到叶黄素溶液；d)将叶黄素溶液进行过滤、压滤分离，以得到结晶；e)将所述结晶重新溶解于非极性有机溶剂中，用去离子水洗涤水溶性杂质；f)回收有机溶剂，降温，以得到重结晶；以及g)将重结晶进行分离，再进行干燥以得到叶黄素晶体。本发明专一性较强，反应时间较短，不产生任何废水，工艺绿色环保，并且得到的叶黄素晶体纯度高，收率高，适于工业化生产。

Description

一种从含叶黄素二酯的植物油树脂中提取分离叶黄素晶体的方法

技术领域

本发明涉及到以较高的收率从植物油树脂，特别是从万寿菊油树脂中利用来源于宏基因组文库酯酶(脂肪酶)催化同时分离纯化叶黄素和玉米黄质的一种方法。

技术背景

类胡萝卜素是自然界中广泛存在的一类黄色到红色的物质。在不同的水果和蔬菜中，存在着不同种类的类胡萝卜素，比如胡萝卜中β-胡萝卜素，万寿菊花中叶黄素，草莓中玉米黄质，番茄中番茄红素，辣椒类植物中辣椒红色素和辣椒色素的含量都较高。而在一些深色水果和蔬菜、蛋黄、一些鱼类甲壳、鸟类、海藻和细菌中存在较多的类胡萝卜素，其中叶黄素类的含量也较高。

近年来的一些动物和人体试验表明了类胡萝卜素的有益功效。总体上类胡萝卜素可能分为两个亚类，即极性相对较强一点的叶黄素类或含氧类胡萝卜素类，如叶黄素、玉米黄质、虾青素等，以及非极性的碳氢类胡萝卜素类，比如β-胡萝卜素、番茄红素等。这两个亚类的类胡萝卜素中都包含着至少九个共轭双键，这些共轭双键不仅赋予了类胡萝卜素的颜色特征，也使其在疾病防治中具有较强的抗氧化功能，它们能阻止或预防像癌症、动脉硬化、白内障、色斑退化及其它类疾病。而且由于类胡萝卜素的清除高效活性氧自由基及防止自由基产生的能力，它们能限制自由基的氧化破坏作用。

在所有的类胡萝卜素中，由于其潜在的预防一种与年龄相关的色斑退化疾病(ARMD)的能力，叶黄素和玉米黄质越来越引起科学家和公众的关注。叶黄素和玉米黄质是唯一存在于人类视网膜中斑点区域的类胡萝卜素，而此区域与人的视觉敏锐性密切相关(Bone et al.Invest.Ophthamal.Vis.Sci.34:2033-2040,1993).经常食用富含叶黄素和玉米黄质的水果和蔬菜能使患老年色斑退化疾病的风险减少43％(Seddon et al.J.Am.Med.Assoc.272:1413-1420,1994)，而且，目前这些化合物在预防老年色斑退化疾病上的代谢途径已经明了。美国食品和药品监督管理局也认为叶黄素和玉米黄质“一般认为安全”(GARS)。因此，这些类胡萝卜素类能单独或与其它物质一起作为营养补充剂和食品着色剂使用，也可应用于临床预防老年色斑退化和癌症等。

叶黄素(分子式：C ₄₀H ₅₆O ₂ 分子量：568.85)

玉米黄质(分子式：C ₄₀H ₅₆O ₂ 分子量：568.85)

由于化学合成叶黄素类涉及到多步反应，费时费力，成本很高。比较经济且易于大规模生产而得到大量叶黄素晶体的方法是从天然资源中提取、分离和纯化得到。

许多蔬菜和水果，比如菠菜、椰菜、甘蓝和玉米等，含有较多的叶黄素，但万寿菊花和金盏花是叶黄素最丰富来源，当然，这些植物中还存在其它类类胡萝卜素。植物中的叶黄素类往往是与一些C ₁₂-C ₁₈长链脂肪酸如肉豆蔻酸、油酸、亚油酸和棕榈酸等酯化形成单酯或双酯的形式存在。

叶黄素脂肪酸二酯典型结构式如下式所示。

叶黄素棕榈酸二酯的结构式(lutein dipalmitate C ₇₂H ₁₁₆O ₄，M＝1045.71)

为了得到高纯度的叶黄素晶体，现有技术一般是使用有机溶剂从植物，优先从万寿菊花、金盏花和其它深绿色蔬菜中提取叶黄素脂肪酸酯，这些有机溶剂本身应该比较容易分离出去。万寿菊花珠粒提取物(万寿菊油树酯)是一种很好的叶黄素酯来源，并且其中其它类类胡萝卜素的含量相对不高。回收有机溶剂后的含叶黄素脂肪酸酯的混合物为膏状，一般称为“万寿菊浸膏”，或“万寿菊花提取物”，或“叶黄素浸膏”，或“叶黄素油膏”，或“叶黄素油树脂”等(以下统称为“叶黄素浸膏”)，其中叶黄素脂肪酸酯含量一般在30％左右，除了叶黄素脂肪酸酯外，其它还包括植物蜡类，其它脂肪酸等脂溶性化合物，成分复杂，气味难闻。

在碱性条件下水解叶黄素浸膏中叶黄素脂肪酸酯，叶黄素晶体就游离出来，将皂解得到的脂肪酸盐洗掉后，叶黄素晶体可进一步得到纯化，最终得到高质量的叶黄素晶体。

目前有大量专利和文献涉及到通过化学法从叶黄素浸膏中大规模分离叶黄素晶体的方法。这些文献的目的一般是得到较纯的叶黄素晶体形式，并用到多个分离步骤。

U.S.Pat.No.5,382,714中在较低的温度下通过水洗强碱皂解后的万寿菊油树脂，并在混合溶剂中低温下结晶，从而分离和提纯叶黄素。此纯化过程不仅费时，而且使用到含氯有机溶剂，得到的产品不适于食品和药物上使用。

U.S.Pat.No.5,648,564说明了一种分离叶黄素结晶的方法，先在万寿菊油树脂的丙二醇溶液中利用强碱皂解叶黄素二酯，再重结晶。这个过程也有几个缺点：首先，用到高浓度的强碱，这对不饱和双键较多的叶黄素有一定的破坏作用，降低终产品的收率；其次，由于丙二醇的粘度较大，在皂化及随后的处理过程中要求温度较高，整个体系在70℃以上的温度要保持10小时左右，这对叶黄素的稳定性显然不利，叶黄素的顺反异构体也会发生变化，而且，随后的分离过程如离心或过滤也比较困难；最后，叶黄素的收率较低，只有59％左右，产品中叶黄素的含量也不高。

U.S.Pat.No.6,262,284中描述了用四氢呋喃同时从万寿菊干花中提取和利用强碱皂解类胡萝卜素，在此过程中要用到大量的有机溶剂，这些溶剂对叶黄素的稳定性不利，有可能会导致产品由于过氧化而引起的降解。

U.S.Pat.No.6,380,442报道了一种从植物中分离类胡萝卜素的方法，该方法在工业生产上也不是很有吸引力，因为生产过程中要用到大量的水(至少为原料量30倍以上)，而且操作比较困难。

U.S.Pat.No.6,743,953使用到几种有机溶剂来从万寿菊油树脂中分离和纯化叶黄素类。此过程中用到大量的强碱，以及异丙醇、乙酸乙酯、正己烷、丙酮和甲醇等多种有机溶剂，操作繁杂，有机溶消耗大，收率低。因此此方法也不适于工业化生产。

总之，以上这些专利描述的方法有以下几个缺点：1)过程中用到大量的强碱皂解叶黄素脂肪酸酯，大量强碱的存在，在较高反应温度下易将不饱和双键较多的叶黄素脂肪酸酯和叶黄素降解，降低终产品的收率；2)由于采用化学醇解工艺，过程中产生大量的废水，工艺不绿色环保；3)使用到一些有毒的有机溶剂，这些溶剂比较困难或者不可能完全去除，导致产品叶黄素结晶不适于人类食用；而且由于使用到的有机溶剂粘度较大，分离和纯化过程中的操作比较困难，为了得到高含量的晶体，需要多步的结晶过程，不适于工业化生产；4)叶黄素的收率较低，由于过程中涉及到多个步骤，导致产品收率低，只有50％左右。

因此，有必要找到一种适于工业化规模生产高纯度叶黄素和玉米黄质的方法，在此过程中不用到无机或有机强碱，而是利用生物酶制剂使叶黄素脂肪酸酯在温和条件下水解为游离叶黄素，而且要使用尽量少的毒性有机溶剂和操作步骤，但有较高的收率。

在前期文献中也出现了少量的利用生物学方法提取叶黄素晶体的报道。如：

CN 101532045 B中描述了一种酶法提取叶黄素的方法。将万寿菊花与安琪酵母粉的水溶液混合，发酵后先后加入乙醇、干粉活性碳，经过滤，烘干得叶黄素晶体，产品含量50-60％，收率9.5-13％。

CN 101235409 B揭示一种酶法水解制备晶体叶黄素的方法。利用蕈菌菌丝体产生的酶液将叶黄素酯酶进行酶促水解，经过结晶纯化、干燥步骤后得到叶黄素晶体，但在酶促水解过程中为了保持pH值不变，要不断地滴加40％KOH等强碱溶液。

CN 107475343 A提供了一种从万寿菊花中提取叶黄素的方法，包括发酵、酶解、超临界萃取、真空冷冻干燥等步骤。利用酵母粉发酵将叶黄素酯转化为游离的叶黄素，代替了皂化反应，但反应专一性差，效率差，为了提高转化效率，必须要加入一定时的活性短肽，反应时间长，达7天以上，反应后要加入有机溶剂和纤维素酶，再经超临界CO2萃取，真空冷冻干燥，操作步骤十分复杂，最终得到的叶黄素含量和收率都不高。

上述方法中利用酵母粉或蕈菌菌丝体产生的初级发酵酶液将叶黄素脂肪酸酯水解成叶黄素，但由于这些初级发酵酶液活性不高，专一性差，所以发酵时间很长，甚至达到10天以上，产生的杂质也很多，需要复杂的步骤进行纯化操作，导致最终产品的收率偏低，而且为了控制反应液的pH值，还要不间断地滴加高浓度碱溶液，这对含不饱和双键较多的叶黄素的稳定性也是不利的。

发明内容

为了克服化学醇解法生产叶黄素晶体时易产生大量的废水，强碱性导致的产品收率低等不足，以及先前技术中利用生物酶生产叶黄素晶体时效率低，专一性差，产品收率低等缺陷，发明了一种合适的，易于工业化生产的，利用一种自制的来源于宏基因组文库的酯酶(脂肪酶)高效生产叶黄素晶体的工艺，该脂肪酶已经在CN102796715 B中公开。

本发明中得到的产品可供人类食用，叶黄素含量在80％以上，其中全反式叶黄素至少占90％，其余的为玉米黄质，少量的顺式叶黄素和其它类胡萝卜素类。

本发明提供了一种从含叶黄素二酯的植物油树脂中提取分离叶黄素晶体的方法，所述方法包括如下步骤：a)将脂肪酶溶解于去离子水中形成酶溶液；b)在30～65℃温度下，将叶黄素浸膏溶解于含少量去离子水的醇溶剂中形成均一的醇溶液；c)在30～65℃温度下，向所述醇溶液中加入所述酶溶液进行水解反应，搅拌，直至叶黄素脂肪酸酯全部水解成叶黄素，以得到叶黄素溶液；d)将所述叶黄素溶液趁热于30～65℃之间进行过滤、压滤分离，以得到结晶；e)将所述结晶重新溶解于非极性有机溶剂中，溶解温度为20-110℃之间，用去离子水洗涤水溶性杂质；f)回收部分非极性有机溶剂，降温，以得到重结晶；以及g)将重结晶进行分离，再进行真空干燥或冷冻干燥，以得到叶黄素晶体，所述叶黄素晶体的最终的干燥失重小于5％。此过程中先将叶黄素浸膏中类胡萝卜素酯与含少量水份的醇类溶剂形成均一溶液，加入脂肪酶水溶液，温度为30～65℃；反应完成后过滤得固体滤饼；将上述固体滤饼溶解于非水溶性有机溶剂中，水洗分层去除残留的脂肪酶和少量的水溶性杂质；回收部分溶剂，降温结晶；通过离心或过滤方法得到生成的结晶；将得到的结晶用无水乙醇重结晶后干燥就得到了一种黄色到红色的细粉状结晶的产品。

本发明采用从自然资源中含较多量叶黄素酯如万寿菊、金盏花、菠菜、草莓、椰菜、甘蓝、玉米中分离和纯化叶黄素和玉米黄质的提取物。在这些原料中，万寿菊花提取物中叶黄素类含量相对较高，是一种优先考虑的原料。

在本发明中，通过正己烷萃取到的食用级万寿菊油树脂作为分离全反式叶黄素含量较高的产品的起始原料。基于品种、种植条件、收割时期及提取方法的不同，此油树脂含5-30％的叶黄素脂和少量其它类胡萝卜素如全反式玉米黄质，α-和β-隐黄质以及β-胡萝卜素等。

在本发明中，优选地，将脂肪酶溶解于去离子水中得到脂肪酶溶液，去离子水的体积为脂肪酶重量的5-250倍。所述脂肪酶为杭州师范大学谢恬教授研发的自制酯酶(脂肪酶)Est076(C23)，该脂肪酶已经在CN102796715B中公开。

优选地，在30～65℃范围内，叶黄素浸膏溶解于含少量水的醇类溶剂中形成均一的溶液，醇溶剂中去离子水的含量在5-15％(w/w)之间，一般，一份重量的叶黄素浸膏溶解于0.5-8.0倍体积的醇溶剂中。通过搅拌，叶黄素酯及其它类杂质如蜡、树脂、其它类胡萝卜素和色素等溶解或分散于此溶剂中形成一种均一的溶液。

优选地，所述醇溶剂选自乙醇，正丙醇，异丙醇，丙二醇中的一种。优选地，向此均匀分散的叶黄素浸膏溶液中加入酶溶液，酶的加入量(折干)为浸膏质量的0.1-3.0％。搅拌均匀，在30-65℃下搅拌6-18小时直至反应完全，是否水解反应完全可通过薄层色谱来监控。水解反应完成后，叶黄素、玉米黄质及其它类胡萝卜素类游离出来并析出，同时叶黄素浸膏中的脂肪酸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸等也被释放出来，溶解于反应溶剂中。过滤反应液，得固体滤饼为反应生成的叶黄素晶体。

优选地，将得到的叶黄素晶体滤饼重新溶解于非极性的有机溶剂中形成叶黄素溶液，有机溶剂量为滤饼重量的3-10倍(v/w)。溶解温度为30-80℃,提到的非极性有机溶剂选自乙酸乙酯，乙酸异丁酯，正己烷，正庚烷，二氯甲烷中一种或两种混合物。

优选地，在上述叶黄素溶液中加入去离子水洗涤，将残留的脂肪酶、水溶性杂质洗除。

优选地，回收部分有机溶剂，使回收有机溶剂后的叶黄素溶液中叶黄素含量在10-80％之间，降温结晶，结晶温度在-20℃-35℃之间。通过传统的分离过程如离心、过滤、压滤等将上述结晶分离出来得叶黄素晶体。经常规真空干燥方式干燥后得叶黄素晶体粉末。

通过紫外-可见光分光光度分析和HPLC分析得知最终产品含80-95％类胡萝卜素类，其中包括90-95％全反式叶黄素，0.1-1.0％其几何异构体，2.0-7.0％全反式玉米黄质及少于1.0％的其它类胡萝卜素。这些微量的其它类类胡萝卜素完全不用担心有害，因为其本身也是膳食来源，并且发现人体血清中相对于叶黄素，它们的浓度要高得多。

由于生产过程中，没有应用到强碱及高温，只是利用特异性的新型脂肪酶将叶黄素脂肪酸酯中的酯键水解，反应条件温和，反应底物叶黄素脂肪酸酯和反应产物叶黄素晶体受到的破坏少。而且在反应过程中选择特定水含量的醇溶剂作为反应溶剂，对反应的顺利进行非常关键。之所以选择醇溶剂是因为研究发现醇溶剂对叶黄素浸膏有较好的溶解度，在相对较高的温度下植物蜡类，游离脂肪酸在其中也能溶解完全，而醇解后游离的叶黄素晶体在其中的溶解度则较小，醇溶剂的这种溶解特性对反应的顺利进行，以及反应产生的叶黄素晶体的析出很有好处，从而使反应完成后，后续的精制步骤简洁许多，只需将析出的叶黄素粗品重新溶解于非极性有机溶剂中，通过水洗涤掉残留的脂肪酶和水溶性杂质，就可使终产品中叶黄素含量达80％以上。通过试验，发现反应时醇溶剂中水含量应控制在5-15％，主要是因为利用生物脂肪酶水解叶黄素脂肪酸中的酯键时需要一定的水分子存在，而且脂肪酶也应溶解于一定量的水中，但反应体系中含水量也不能太高，水含量高的话会影响到叶黄素脂肪酸酯在其中的溶解度，从而影响到反应的彻底进行，而且水含量太高的话，会导致产生的杂质也容易析出，降低终产品的纯度，考虑到脂肪酶要用一定的去离子水溶解，加入到反应液中的是酶溶液，所以醇溶剂中水份含量可以根据酶溶液的浓度进行适当调整。

正是基于以上特异性宏基因组来源的新型脂肪酶，以及特异性含一定水量的醇溶剂的选择，才得以使万寿菊油树脂中叶黄素脂肪酸酯在温和的条件下发生专一性较强的反应，反应在较短时间内完成，过程中不产生任何废水，工艺绿色环保，并且得到的叶黄素晶体纯度高，收率高，适于工业化生产。

本发明提供了一种方便并易于工业化生产的从含叶黄素二酯的植物油树脂中利用脂肪酶高效提取叶黄素晶体的方法。此过程中利用自制的来源于宏基因组文库的酯酶(脂肪酶)将叶黄素脂肪酸水解成叶黄素晶体，条件温和，效率高，而且使用到最低限度的有机溶剂，精制步骤简洁，产品的收率高。本发明的优点体现在以下几个方面：首先，利用自制的来源于宏基因组文库酯酶(脂肪酶)水解叶黄素浸膏中叶黄素脂肪酸酯，反应条件温和，克服了化学法皂解时的高碱性环境对叶黄素破坏，有利于产品收率的提高；其次，应用的新型重组脂肪酶活性高，专一性强，反应效率高；其三，选择特定浓度的醇溶剂，既有利于生物脂肪酶和反应底物叶黄素浸膏，以及反应后杂质植物蜡类、释放出来的游离脂肪酸等的溶解，又有利于反应产物叶黄素晶体的析出，对产物的精制纯化过程有利；其四，后续的精制纯化步骤非常简洁，易于产业化生产。发明工艺中终产品的含量和收率可分别达到80％和85％，这比以前发明显示的结果都高。所以说此发明揭示的过程是很经济的并适于大规模商业化生产。这些以及其它一些优点在随后的发明叙述中会得到很好的体现。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。

实施例1

取1g杭师大谢恬教授构建的重组新型酯酶(脂肪酶)Est076(C23)，溶解于95ml水中形成酶溶液。1000g万寿菊油树脂(总叶黄素含量15.8％，购自青岛赛特香料有限公司)与2250mL无水乙醇混合，反应开始时醇溶剂中水含量为5.1％，升温至65℃，搅拌直至形成一种均一流动的溶液，加入酶溶液反应，通过薄层色谱法监控反应进行程度，18小时后叶黄素脂肪酸酯水解完全，停止搅拌静置0.5hr。

反应液降温到65℃,趁热过滤(65℃)得黄色滤饼305.6g，将此滤饼加入到1000ml乙酸乙酯中，升温到70℃溶解，再用500ml的去离子水洗涤三次，分去水层。回收乙酸乙酯900ml左右，降温到-20℃下冷冻结晶。结晶完成后离心分离，真空干燥后，直至其干燥失重小于5％.

最后得到150.7g成品，其中含85.2％总类胡萝卜素(用紫外-可见光光度仪分析),这些类胡萝卜素中含91.8％全反式叶黄素，4.5％全反式玉米黄质(用HPLC分析)，其余的为微量其它类类胡萝卜素。总叶黄素收率为85％。

产品中不含有毒的有机溶剂，适合于以营养补充剂和食品添加剂的形式使用。此结晶的应用形式可为油悬液(与植物油混合乳化)、珠粒(通过喷雾冷凝得到的微胶囊)、干粉(通过喷雾干燥得到的微胶囊)等。

实施例2

取15g杭师大谢恬教授构建的重组新型酯酶(脂肪酶)Est076(C23)，溶解于988ml水中形成酶溶液。1000g万寿菊油树脂(总叶黄素含量15.8％，购自青岛赛特香料有限公司)与8000mL98.5％的正丙醇混合，升温至65℃,搅拌直至形成一种均一流动的溶液，加入酶溶液反应，通过薄层色谱法监控反应进行程度，6小时后叶黄素脂肪酸酯水解完全，停止搅拌静置0.5hr。反应开始时醇溶剂中水含量为15.0％。

反应液升温到30℃,在此温度下趁热过滤得黄色滤饼321.4g，将此滤饼加入到3200ml乙酸异丁酯中，升温到110℃溶解，再用800ml的去离子水洗涤三次，分去水层。回收乙酸异丁酯2400ml左右，降温到-18℃下冷冻结晶。结晶完成后离心分离，真空干燥后，直至其干燥失重小于5％.

最后得到162.1g成品，其中含81.6％总类胡萝卜素(用紫外-可见光光度仪分析),这些类胡萝卜素中含90.9％全反式叶黄素，5.4％全反式玉米黄质(用HPLC分析)，其余的为微量其它类类胡萝卜素。

实施例3

取30g杭师大谢恬教授构建的重组新型酯酶(脂肪酶)Est076(C23)，溶解于120ml水中形成酶溶液。1000g万寿菊油树脂(总叶黄素含量15.8％，购自青岛赛特香料有限公司)与3000mL含10.0％去离子水的丙二醇混合，升温至30℃,搅拌直至形成一种均一流动的溶液，加入酶溶液反应，通过薄层色谱法监控反应进行程度，15小时后叶黄素脂肪酸酯水解完全，停止搅拌静置0.5hr。

反应液升温到60℃,趁热过滤得黄色滤饼297.6g，将此滤饼加入到1000ml二氯甲烷中，20℃下溶解，再用900ml的去离子水洗涤三次，分去水层。回收二氯甲烷750ml左右，降温到-4℃下结晶。结晶完成后过滤分离固体，真空干燥后，直至其干燥失重小于5％.

最后得到142.6g成品，其中含80.9％总类胡萝卜素(用紫外-可见光光度仪分析),这些类胡萝卜素中含92.1％全反式叶黄素，4.3％全反式玉米黄质(用HPLC分析)，其余的为微量其它类类胡萝卜素。

实施例4

取15g杭师大谢恬教授构建的重组新型酯酶(脂肪酶)Est076(C23)，溶解于250ml水中形成酶溶液。1000g万寿菊油树脂(总叶黄素含量15.8％，购自青岛赛特香料有限公司)与3000mL含10.0％去离子水的异丙醇混合，升温至45℃,搅拌直至形成一种均一流动的溶液，加入酶溶液反应，通过薄层色谱法监控反应进行程度，10小时后叶黄素脂肪酸酯水解完全，停止搅拌静置0.5hr。

反应液升温到45℃,在此温度下趁热过滤得黄色滤饼303.5g，将此滤饼加入到3000ml正己烷和正庚烷混合物(7:3)中，45℃下溶解，再用900ml的去离子水洗涤三次，分去水层。回收有机溶剂1600ml，降温到35℃下结晶。结晶完成后压滤分离固体，真空干燥后，直至其干燥失重小于5％.

最后得到156.1g成品，其中含87.2％总类胡萝卜素(用紫外-可见光光度仪分析),这些类胡萝卜素中含91.2％全反式叶黄素，5.6％全反式玉米黄质(用HPLC分析)，其余的为微量其它类类胡萝卜素。

实施例5

取12g杭师大谢恬教授构建的重组新型酯酶(脂肪酶)Est076(C23)，溶解于140ml水中形成酶溶液。1000g万寿菊油树脂(总叶黄素含量15.8％，购自青岛赛特香料有限公司)与4800mL含15.0％去离子水的丙二醇混合，升温至45℃,搅拌直至形成一种均一流动的溶液，加入酶溶液反应，反应开始时醇溶剂中水含量为18％，通过薄层色谱法监控反应进行程度，16小时后叶黄素脂肪酸酯仍有少量未水解完全，停止搅拌静置0.5hr。

反应液升温到60℃,趁热过滤得黄色滤饼380.0g，将此滤饼加入到3600ml正己烷和正庚烷混合物(7:3)中，45℃下溶解，再用900ml的去离子水洗涤三次，分去水层。回收有机溶剂1600ml，降温到35℃下结晶。结晶完成后压滤分离固体，真空干燥后，直至其干燥失重小于5％.

最后得到132.5g成品，其中含68.4％总类胡萝卜素(用紫外-可见光光度仪分析)。

实施例6

取30g杭师大谢恬教授构建的重组新型酯酶(脂肪酶)Est076(C23)，溶解于120ml水中形成酶溶液。1000g万寿菊油树脂(总叶黄素含量15.8％，购自青岛赛特香料有限公司)与3000mL无水乙醇混合，升温至30℃,搅拌直至形成一种均一流动的溶液，加入酶溶液反应，反应开始时醇溶液中水含量为4.88％，反应过程中通过薄层色谱法监控反应进行程度，发现酶未能完全溶解，有少量颗粒悬浮其中，18小时后叶黄素脂肪酸酯仍未能水解完全。

需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。

Claims

一种从含叶黄素二酯的植物油树脂中提取分离叶黄素晶体的方法，所述方法包括如下步骤：

a)将脂肪酶溶解于去离子水中形成酶溶液；

b)在30～65℃温度下，将叶黄素浸膏溶解于含少量去离子水的醇溶剂中形成均一的醇溶液；

c)在30～65℃温度下，向所述醇溶液中加入所述酶溶液进行水解反应，搅拌，直至叶黄素脂肪酸酯全部水解成叶黄素，以得到叶黄素溶液；

d)将所述叶黄素溶液趁热于30～65℃之间进行过滤、压滤分离，以得到结晶；

e)将所述结晶重新溶解于非极性有机溶剂中，溶解温度为20-110℃之间，用去离子水洗涤水溶性杂质；

f)回收部分非极性有机溶剂，降温，以得到重结晶；以及

g)将重结晶进行分离，再进行真空干燥或冷冻干燥，以得到叶黄素晶体，所述叶黄素晶体的最终的干燥失重小于5％。
如权利要求1所述的方法，其中，步骤a)中，所述叶黄素浸膏为含较多量叶黄素酯的万寿菊、金盏花、菠菜、草莓、椰菜、甘蓝、玉米的提取物。
如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤a)中，所述去离子水的体积为所述脂肪酶的质量的5-250倍。
如权利要求1所述的方法，其中，步骤b)中，所述醇溶剂中去离子水的含量在5-15％(w/w)之间。
如权利要求1所述的方法，其中，步骤b)中，含少量去离子水的醇溶剂的用量为所述叶黄素浸膏的0.5-8.0倍(v/w)。
如权利要求1、4或5所述的方法，其中，步骤b)中，所述醇类为乙醇、异丙醇、正丙醇、丙二醇。
如权利要求1所述的方法，其中，步骤c)中，所述脂肪酶的用量为所述叶黄素浸膏质量的0.1-3.0％。
如权利要求1或7所述的方法，其中，步骤c)中，所述水解反应的反应时间为6-18小时。
如权利要求1所述的方法，其中，步骤e)中，所述非极性有机溶剂的用量为滤饼质量的3-10倍(v/w)。
如权利要求1所述的方法，其中，步骤e)中，所述滤饼在非极性有机溶剂中溶解温度为30-80℃之间。
如权利要求1、9或10所述的方法，其中，步骤e)中，所述非极性有机溶剂选自乙酸乙酯，乙酸异丁酯，正己烷，正庚烷，二氯甲烷中一种或两种混合物。
如权利要求1所述的方法，其中，步骤f)中，回收非极性有机溶剂后，叶黄素溶剂中固形物浓度在10-80wt％之间。
如权利要求1或12所述的方法，其中，步骤f)中，结晶温度在-20℃-35℃之间。
如权利要求1所述的方法，其中，所述叶黄素晶体适合于在营养补充剂和食品添加剂中以油悬液、珠粒或干粉的形式使用。