CN103649328B - 类胡萝卜素组合物的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供类胡萝卜素组合物的制造方法，该方法包括：使用30℃以下的有机溶剂(A)对含有类胡萝卜素的法夫酵母属酵母清洗后，在10～70℃的温度、用有机溶剂(B)对酵母中的类胡萝卜素进行提取。并且，该制造方法不需要特殊的提取设备、无需经过烦杂的精制工序，另外并非一定需要使用对人体有害的有机溶剂，即可从法夫酵母属酵母的培养物中，工业高效地生产含有高含量虾青素等的天然物来源的类胡萝卜素组合物。

Description

类胡萝卜素组合物的制造方法
技术领域
本发明涉及类胡萝卜素组合物的制造方法。更详细而言，该类胡萝卜素的制造方法的特征在于从法夫酵母属酵母中提取虾青素等类胡萝卜素。
背景技术
类胡萝卜素作为广泛分布在自然界的呈现黄色、橙色直至红色或者紫色的天然色素被公知，其中之一的虾青素，作为鱼类、鸡蛋的着色剂在饲料用途中广泛使用。此外公知虾青素作为食品添加剂在油脂加工食品、蛋白质性食品、水溶液状食品、健康食品等中广泛使用。进一步地，近年来通过利用虾青素的对于由自由基所诱发的脂质过氧化的抗氧化活性、以及其高达α-生育酚的数百倍的对单线态氧的消除作用等的强抗氧化作用，来抑制体内过剩的活性氧，期待虾青素作为化妆品类或功能性食品、医药品用于以下用途：斑和皱纹的改善，预防白内障、动脉硬化、或心脏病等，强化免疫力、或预防癌症等。
虾青素广泛分布在自然界中的鲑鱼、鳟鱼、鲷等鱼类，螃蟹、虾、磷虾等甲壳类等中，同时也可以通过属于副球菌属(Paracoccus)、短杆菌属(Brevibacterium)等细菌类，雨生红球藻(Hematococcus pluvialis)等藻类，红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)(别名：红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)等酵母类微生物生产。由于虾青素、玉米黄质等类胡萝卜素在供给稳定性、成本方面存在问题，目前广泛使用的是化学合成品。但是，化学合成品中混入了来源于制造方法的杂质，特别是存在会混入合成反应中使用的对人体有害的毒物类的担忧，从安全性方面出发希望供给来源于天然原料的产品。
在这样的背景下，多有如下报道：特别是，利用了认为适于工业规模大量生产的天然产物藻类、微生物来制造以虾青素为代表的类胡萝卜素的方法。例如，专利文献1中报道了如下方法：对于红球藻属藻类，对经培养的藻类孢囊细胞进行热丙酮处理，使杂质叶绿素溶出，然后用乙醇提取虾青素的方法。但是，由于按照相同方法得到的类胡萝卜素组合物中含有大量来源于生物体的杂质，因此，难以在工业上制造含有充足的虾青素含量的类胡萝卜素组合物，此外，难以将制造中使用的丙酮除去至例如食品添加剂使用的规定值以下的水平。
此外，专利文献2还报道了如下方法：将破坏了细胞壁的红球藻属藻类和水、甘油等助溶剂混炼以得到成形体，将该成形体填充在提取槽内，供给超临界流体以提取虾青素，而不使用对人体有害的有机溶剂，由此得到0.5～60%含量的虾青素的方法。但是，按照相同方法进行大量生产时需要特殊的设备，除此以外，为了达到充分的收率还需要长时间的提取操作，并且为获得高含量虾青素，还需要另行进行浓缩操作等，在工业生产高含量的类胡萝卜素组合物时，无法满足简便性、经济性。
专利文献3公开如下方法：作为使用法夫酵母属(法夫酵母属)酵母的方法，将该酵母的菌体放入正己烷-乙醇的混合溶剂中，用压缩粉碎机粉碎的同时进行提取，将浓缩提取物而得到的油状物质在-50℃的冷却状态下悬浊，过滤以除去游离脂肪酸和甘油三酸酯，进一步将色素油中残存的游离脂肪酸进行金属皂化而除去，从而将虾青素高浓度化。此外，专利文献4公开了如下方法：用有机溶剂提取法夫酵母属(法夫酵母属)酵母的破碎菌体，将提取液浓缩后得到的油状粗提物通过离子交换色谱法、吸附色谱法等精制方法精致，得到虾青素或其酯类。但是这些方法中的任一方法的工序都很复杂，特别是在后者方法中，低浓度的虾青素的粗提液需经过多种色谱法进行精制，采用繁杂的工序，因此难以实现工业化。
另一方面，专利文献5，6报告如下例子：使用生产虾青素的新的细菌(E-396株)，用低级醇或者低级醇和水的混合物进行提取，之后将其浓缩得到沉淀物，通过用低级醇类对沉淀物清洗，得到虾青素含量为40%以上的干燥物。按照相同方法可以仅用乙醇等安全性高的溶剂和水来制造高含量的虾青素组合物，但在专利文献5的情况下于80℃以上的温度下进行提取，需要在密闭压力容器中处理，此外，在上述高温操作下，存在如下问题：天然来源的自由体反式虾青素的一部分可能发生顺式化，具有目标结构的虾青素的精制收率低。进一步地，专利文献5、6的方法，对于确认了该制造的新的细菌以外的菌，实际上是否适用尚且未知。
除此以外，专利文献7还报道了以下制造方法：用丙酮提取培养后的法夫酵母属(法夫酵母属)酵母菌体，将得到的提取液浓缩得到粗提物，向粗提物中加入烃类溶剂，使其结晶析出。该法具有简便性高，可得到虾青素含量为40%以上的高含量的组合物等优点，但是制造过程中使用烃类溶剂，因此存在着最终得到的组合物中残留此类溶剂的担忧。
特别是，公知法夫酵母属酵母每单位干燥菌体重量含有25重量%左右的脂质，由该酵母得到的提取液的组成中以该脂质为主成分，因此将这样的提取液浓缩后得到的浓缩物会变成很黏的粘性液体。因此，为了使用法夫酵母属酵母获得含有高浓度虾青素的组合物，需要在制造中除去以脂质为代表的大量杂质，其结果，需要伴随如上所述的复杂且非工业的方法，或需要使用己烷等有机溶剂，所述有机溶剂对人体有害，对其在最终产品中的残留量进行了限制。
基于上述情况，谋求如下制造类胡萝卜素组合物的方法：通过操作简便，且残留溶剂少、或者残留溶剂不会产生问题的方法来制造含有高浓度虾青素的天然来源的类胡萝卜素组合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平11-56346号公报
专利文献2：日本特开2004-41147号公报
专利文献3：日本特开平7-101827号公报
专利文献4：日本特开平10-276721号公报
专利文献5：WO2009/028643号公报
专利文献6：日本特开2007-319015号公报
专利文献7：日本特开2004-208504号公报
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，现有的含有高浓度虾青素的天然来源的类胡萝卜素组合物的制造方法中，提取操作需要特殊的设备，或为了除去来源于菌体的脂质等杂质需要复杂且非工业的方法等，会导致操作烦杂化、成本增加的问题。进一步地，在制造过程中使用烃类溶剂等不适合于食用用途的有机溶剂的情况下，残留溶剂的去除已成问题。特别是，对于脂质含量多的法夫酵母属酵母，或者难以进行为得到高浓度虾青素的精制操作，或可能实现但会变成非常烦杂的操作，其中，认为在工业水平上进行含有虾青素的组合物的粉末化事实上是不可能的。例如，本发明人将上述专利文献5的方法实际运用于法夫酵母属酵母时明确：沉淀物中残存了大量的脂质，在清洗工序中不进行过滤等操作，难以以满意的效率进行制造。
本发明的目的在于提供如下制造方法，该方法能够在不需要特殊提取设备、烦杂的精制工序、此外在未必需要使用对人体有害的有机溶剂的条件下，从法夫酵母属酵母的培养物中高效地工业生产含有高浓度虾青素等的天然来源的类胡萝卜素组合物。
解决问题的方法
对上述问题进行了深入研究后，结果发现：从法夫酵母属酵母提取类胡萝卜素之前，在特定条件下清洗该酵母，能够从法夫酵母属酵母高效提取虾青素等类胡萝卜素，此外，该方法也适用于工业生产，从而完成了本发明。
即，本发明涉及类胡萝卜素组合物的制造方法，该方法包括：
使用30℃以下的有机溶剂(A)对含有类胡萝卜素的法夫酵母属酵母进行清洗的工序，以及
在10～70℃的温度、用有机溶剂(B)对清洗过的酵母中的类胡萝卜素进行提取的工序。
类胡萝卜素优选虾青素。
有机溶剂(A)优选为选自酮类、醇类、烃类、醚类以及脂肪酸酯类中的至少1种有机溶剂。
有机溶剂(B)优选为选自醇类、烃类以及醚类中至少1种的有机溶剂。
优选有机溶剂(A)以及有机溶剂(B)均为乙醇。
优选进一步包括对得到的类胡萝卜素提取液进行浓缩使其成为油状组合物的工序。
得到的油状组合物中的虾青素含量优选为1～20重量%。
进一步优选使类胡萝卜素从得到的类胡萝卜素提取液中析出，并对得到的析出物进行固液分离而使其成为粉末组合物的工序。
得到的粉末组合物中的虾青素含量优选为20～80重量%。
进一步，本发明涉及类胡萝卜素组合物，其含有虾青素，所述虾青素在粉末X射线衍射中，于衍射角13.3°(2θ±0.2°)、13.8°(2θ±0.2°)、14.3°(2θ±0.2°)、15.8°(2θ±0.2°)、16.3°(2θ±0.2°)、18.2°(2θ±0.2°)、20.5°(2θ±0.2°)、24.8°(2θ±0.2°)以及25.3°(2θ±0.2°)处有峰，并且具有(3R、3’R)的化学结构。
优选上述类胡萝卜素组合物为卡尔粉体流动特性指数(Carr index)在60以上的粉体。
上述类胡萝卜素组合物中的虾青素含量优选为20～80重量%。
进一步本发明涉及类胡萝卜素组合物，其为油状组合物，其含有法夫酵母属酵母来源的虾青素，并且组合物中的麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率为40重量%以下。
优选上述类胡萝卜素组合物中的虾青素含量为1～20重量%，并且所述组合物在30℃、剪切速度为100s-1时的粘度为0.01～1Pa·s。
发明效果
按照本发明的制造方法，通过事先除去法夫酵母属酵母中含有的脂质等大部分杂质，之后可以高效地进行类胡萝卜素的提取、浓缩操作，因此可以提供简便且适于工业生产的、天然物来源的类胡萝卜素组合物的制造方法。此外按照本发明的制造方法，可以仅使用适于食用用途的安全的溶剂进行操作，可以通过操作简便、且残留溶剂少或者残留溶剂不会产生问题的方法进行制造。
进一步地，按照本发明可制造的类胡萝卜素组合物，不仅高浓度地含有以虾青素等为目标物的类胡萝卜素，还可以得到具有优异的粉体流动特性的粉体。此外，向按照本发明可制造的类胡萝卜素组合物中添加食用液体油脂，使之成为油状物的情况下，和按照现有方法制得的相同虾青素含量的油状物相比，可以得到粘度低、操作方面优异的油状物。
附图说明
图1：表示实施例14、比较例5以及参考例1中的组合物的吸收性的评价结果的图。
具体实施方式
以下详细说明本发明的实施方式。
本发明的制造方法是类胡萝卜素组合物的制造方法，其包括：使用30℃以下的有机溶剂(A)对含有类胡萝卜素的法夫酵母属酵母进行清洗后，在10～70℃的温度、用有机溶剂(B)对酵母中的类胡萝卜素进行提取。
作为本发明中的类胡萝卜素，没有特别限定，具体地可列举：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、番茄红素等胡萝卜素类，叶黄素、玉米黄质、角黄素、岩藻黄素、虾青素、花药黄质等叶黄素类等，其中，本发明的制造方法特别适合于制得虾青素作为类胡萝卜素。此种情况下，作为得到的虾青素也包括得到虾青素和虾青素以外的类胡萝卜素的混合物的情况。
作为用作本发明的制造方法中的原料的法夫酵母属酵母，只要是生产类胡萝卜素的物质，就不做特别限定，但是特别是作为制造作为类胡萝卜素的虾青素的法夫酵母属酵母的具体例，可列举法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)(别名：法夫酵母(Phaffia rhodozyma))等。
需要说明的是，本发明中，不仅限于使用上述法夫酵母属酵母的野生株，例如，还可优选使用对类胡萝卜素类的生物合成相关的基因的转录以及翻译活性、或者表达蛋白质的酶活性进行了改变或改良的突变体、重组体，所述类胡萝卜素类是上述法夫酵母属酵母的目标产物。
对本发明中使用的法夫酵母属酵母的培养方法不做特别限定，只要适当选择适宜作为对象的法夫酵母属酵母的培养方法，或者适合作为目标产物的类胡萝卜素的生产的培养方法即可。作为培养用碳源，可列举，例如：蔗糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖、玉米糖浆、糖蜜、淀粉、甘油、乙醇、醋酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸等，但不限定于这些物质。这些碳源可以单独使用，以增加菌体中的类胡萝卜素的含量作为目的，可以组合使用2种以上的碳源。组合使用2种以上的碳源的情况下，可将这些碳源同时添加至培养基中，也可以在培养过程中变更添加的碳源。作为后者的例子可列举：作为碳源，在培养的前半段添加葡萄糖、在培养的后半段使用木糖进行培养的方法；同样，在前半段使用葡萄糖，在后半段使用麦芽糖进行培养的方法；在前半段使用葡萄糖、在后半段使用乙醇进行培养的方法；在前半段使用葡萄糖、在后半段使用甘油进行培养的方法；以及在前半段使用葡萄糖、在后半段使用柠檬酸的培养方法等，但不限定于上述组合，任何碳源的组合都可同样实施。作为培养用氮源，可列举：例如，氨、铵盐、尿素、氨基酸类、酵母提取物、胨、玉米浆等，但不限定于上述物质。上述的氮源可单独使用，和碳源的情况相同，也可组合使用其中2种以上。作为碳源、氮源以外的营养素，可列举，例如：磷酸等磷源、镁、钾、钠、铜、铁、锌、锰、钼等矿物质，生物素等维生素类等，但不限定于上述物质。碳源、氮源、以及其他的营养素，可通过一次性添加、分开添加、或者连续添加等方法供给。对培养温度不做特别限定，但优选15～26℃的范围。对培养液的pH不做特别限定，但优选3～7的范围。
本发明的制造方法中，从按照如上所述的培养得到的含有类胡萝卜素的法夫酵母属酵母中提取酵母细胞中的类胡萝卜素时，可从培养后的法夫酵母属酵母中直接提取，也可根据要求将上述法夫酵母属酵母破碎而使其成为细胞破碎物，再从该破碎物中提取。因此作为本发明的制造方法中使用的“法夫酵母属酵母”，其所指的对象是酵母细胞本身，通过冷冻干燥、喷雾干燥等干燥得到的物质，以及以下所述实施了细胞破碎处理的物质中的任意物质。特别是酵母细胞的破碎，有助于高效地提取在法夫酵母属酵母中生产、蓄积的类胡萝卜素。细胞破碎处理未必是必需的，但若不对细胞进行破碎，则在细胞中生产、蓄积的类胡萝卜素的回收率较低。需要说明的是，本发明中的酵母细胞的破碎，以能够提取作为目标物的类胡萝卜素的程度为准，进行对细胞壁表面结构的损伤即可，不需要一定将细胞壁完全破坏，或者使酵母细胞片段化。
成为上述细胞破碎和/或后述的利用有机溶剂(A)进行清洗的对象的法夫酵母属酵母的形态可列举：含有该酵母的培养液，将该培养液进行浓缩后的物质，通过加压过滤、减压过滤、自然过滤、离心分离、倾析等常规方法从这些培养液中采集作为湿菌体的法夫酵母属酵母得到的物质，或将该湿菌体进行清洗后的物质，或将湿菌体悬浮在溶剂(例如：包括水、生理食盐水、缓冲液等)中得到的物质，或使上述湿菌体干燥后得到的干燥菌体、或者通过喷雾干燥、冷冻干燥等使含有该酵母的培养液干燥得到的干燥菌体、使这些干燥菌体悬浮在溶剂(例如，包括水、生理食盐水、缓冲液等)中得到的物质等，上述任意物质均可。此外，进行上述过滤操作的情况下，为了高效的操作可以使用过滤助剂，这种情况下，可以不除去使用的过滤助剂而以湿菌体或者干燥菌体的形式进行以后的操作。在细胞破碎时，优选法夫酵母属酵母悬浮在水性溶剂中的水性悬浮液的形态，从操作性等方面出发，更优选使用下述物质作为法夫酵母属酵母的水性悬浮液：含有法夫酵母属酵母的培养液本身，或对该培养液进行浓缩得到的物质、或将法夫酵母属酵母的湿菌体悬浮在溶剂中得到的物质。
上述法夫酵母属酵母的破碎，通过以下的1种或者几种破碎方法以任意顺序进行。作为破碎方法，可列举，例如：除物理处理、化学处理、酶处理之外，还有加热处理、自溶解、渗透压溶解、原生质溶解等。
作为上述物理处理，可列举：例如，使用高压均质器、旋转刃式均质器、超声波均质器、法压壶、球磨机等，或组合使用这些物理处理。
作为上述化学处理，可列举：例如，使用盐酸、硫酸等酸(优选强酸)的处理，使用氢氧化钠、氢氧化钾等碱(优选强碱)的处理等，或者组合使用这些化学处理。
作为上述酶处理，可列举：例如，可以使用溶菌酶、酵母裂解酶、葡聚糖酶、Novozyme、蛋白水解酶、纤维素酶等的方法，也可以适当地组合使用这些酶处理。
作为上述加热处理可列举：例如，在60～140℃加热30分钟～3小时左右的处理。
作为上述自溶解，可列举：例如，除通过乙酸乙酯等溶剂进行的处理以外，还有在30～60℃加热1～48小时左右的处理等。
此外，通过使用和细胞内的盐浓度不同的溶液进行处理，可以引发细胞的渗透压溶解、原生质溶解。但是，仅通过此方法，多发生细胞的破碎效果不充分的情况，因此优选组合使用上述的物理处理、化学处理、酶处理、加热如理、自溶解等。上述破碎方法中，优选物理处理、化学处理(特别是酸处理，优选强酸(例如，水溶液中的pKa为2.5以下的酸))、加热处理，从高效破碎的观点出发，更优选物理处理、化学处理。
本发明的制造方法中，将如上述制备的含有类胡萝卜素的法夫酵母属酵母，用30℃以下的有机溶剂(A)进行清洗。在此，清洗优选在含有类胡萝卜素的法夫酵母属酵母作为湿菌体、干燥菌体或者水性悬浮液的状态下进行。此外，对该情况下的湿菌体、干燥菌体的含水率、水性悬浮液中的菌体浓度不做特别限制，但若为湿菌体，通常可优选使用含水率在20～75重量%的范围的物质，若为干燥菌体，通常可优选使用含水率在0.01～20重量%的范围的物质，此外，若为水性悬浮液，通常可使用作为干燥重量换算的菌体浓度在1～25重量%的范围的物质。
本发明的制造方法中，作为清洗时所用的有机溶剂(A)，不做特别的限定，但优选在清洗条件下，对目标物类胡萝卜素的溶解度不高的溶剂。作为这样的有机溶剂，可以优选使用例如酮类、醇类、烃类、醚类、以及脂肪酸酯类。
作为上述酮类，不做特别限制，可以适当使用碳原子数为3～6的物质。作为具体例，可列举：例如，丙酮、甲乙酮、甲基丁基酮、甲基异丁基酮等。优选丙酮、甲乙酮、最优选丙酮。
作为上述醇类，无论环状、非环状，也无论饱和、不饱和，不做特别限制，但是通常优选使用饱和醇。通常碳原子数为1～20，优选碳原子数为1～12，更优选碳原子数为1～6。其中，优选碳原子数为1～5的一元醇、碳原子数为2～5的二元醇、碳原子数为3的三元醇。
作为这些醇类的具体例，可列举：例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、1-十二烷醇、烯丙醇、丙炔醇、苯甲醇、环己醇、1-甲基环己醇、2-甲基环己醇、3-甲基环己醇、4-甲基环己醇等一元醇；1,2-乙二醇、1,2-丙二醇、1.3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、1,5戊二醇等二元醇；甘油等三元醇。
作为一元醇，优选：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、1-十二烷醇、苯甲醇、环己醇、1-甲基环己醇、2-甲基环己醇、3-甲基环己醇、4-甲基环己醇等。更优选：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、环己醇等。更加优选：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇等。特别优选：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇等。最优选乙醇。
作为二元醇，优选：1,2-乙二醇、1,2-丙二醇、1,3丙二醇等，最优选1,2-乙二醇。作为三元醇，优选甘油。
作为上述烃类，不做特别的限制，可列举：例如，脂肪族烃、芳香族烃、卤代烃等。其中优选脂肪族烃、芳香族烃，更优选脂肪族烃。
作为脂肪族烃，无论环状，非环状，也无论饱和、不饱和，不做特别的限制，但通常优选使用饱和脂肪族烃。通常使用碳原子数为3～20的脂肪族烃，优选碳原子数为5～12的脂肪族烃，更优选碳原子数为5～8的脂肪族烃。作为具体例，可列举：例如，丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、庚烷异构体(例如：2-甲基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷)、辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、异辛烷、壬烷、2,2,5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、2-戊烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-壬烯、1-癸烯、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷、对萜烷、环己烯等。优选：戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷、辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、异辛烷、壬烷、2,2,5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷、对萜烷等。更优选：戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷、辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、异辛烷、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷等，更加优选：戊烷、己烷、环己烷、甲基环己烷等，从对氧化的防护效果特别高的观点出发，特别优选：庚烷、甲基环己烷，最优选庚烷。
作为芳香族烃，不做特别的限制，通常使用碳原子数为6～20的芳香族烃，优选使用碳原子数为6～12的芳香族烃，更优选碳原子数为7～10的芳香族烃。作为具体例，可列举：苯、甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙基苯、异丙苯、均三甲苯、四氢化萘、丁基苯、对甲基异丙基苯、环己基苯、二乙基苯、戊基苯、二戊基苯、十二烷基苯、苯乙烯等。优选甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙基苯、异丙苯、均三甲苯、四氢化萘、丁基苯、对甲基异丙基苯、环己基苯、二乙基苯、戊基苯等。更优选：甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、异丙苯、四氢化萘等。最优选异丙苯。
作为卤代烃，无论环状、非环状，也无论饱和、不饱和，不做特别限制，但通常优选使用非环状的卤代烃。更优选氯代烃、氟代烃，进一步优选氯代烃。此外，可适当使用碳原子数为1～6的卤代烃，优选使用碳原子数为1～4的卤代烃、更优选使用碳原子数为1～2的卤代烃。作为具体例，可列举：例如，二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、1,1,1,2-四氯乙烷、1,1,2,2-四氯乙烷、五氯乙烷、六氯乙烷、1,1-二氯乙烯、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、1,2-二氯丙烷、1,2,3-三氯丙烷、氯苯、1,1,1,2-四氟乙烷等。优选：二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、1,1-二氯乙烯、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1,1,1,2-四氟乙烷等。更优选：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1,1,1,2-四氟乙烷等。
作为上述醚类，无论环状、非环状，也无论饱和、非饱和，不做特别限制，但通常优选使用饱和醚类。通常使用碳原子数为3～20的醚类，优选使用碳原子数为4～12的醚类，更优选使用碳原子数为4～8的醚类。作为具体例，可列举：例如，二乙醚、甲基叔丁基醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、二己醚、乙基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、茴香醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二氧杂环己烷、呋喃、2-甲基呋喃、四氢呋喃、四氢吡喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二丁醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙二醇单丁醚等。优选二乙醚、甲基叔丁基醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、二己醚、茴香醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二氧杂环己烷、2-甲基呋喃、四氢呋喃、四氢吡喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二丁醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚等。更优选：二乙醚、甲基叔丁基醚、茴香醚、二氧杂环己烷、四氢呋喃、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚等。进一步优选：二乙醚、甲基叔丁基醚、茴香醚、二氧杂环己烷、四氢呋喃、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚等。更进一步优选：二乙醚、甲基叔丁基醚、茴香醚等。最优选甲基叔丁基醚。
作为上述脂肪酸酯类，不做特别的限制，可列举：例如，丙酸酯、乙酸酯、甲酸酯等。优选：乙酸酯、甲酸酯，进一步优选乙酸酯。作为酯基，不做特别的限制，通常使用碳原子数为1～8的烷基酯、碳原子数为7～12的芳烷基酯，优选使用碳原子数为1～6的芳烷基酯，进一步优选使用碳原子数为1～4的烷基酯。
作为丙酸酯的具体例，可列举：例如，丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丙酸异戊酯等。优选丙酸乙酯等。
作为乙酸酯的具体例，可列举：例如，乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯、乙酸仲己酯、乙酸环己酯、乙酸苄基酯等。优选：乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯、乙酸仲己酯、乙酸环己酯等。进一步优选：乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯等，最优选乙酸乙酯。
作为甲酸酯的具体例，可列举：例如，甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸异丙酯、甲酸丁酯、甲酸异丁酯、甲酸仲丁酯、甲酸戊酯等。优选：甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸异丁酯、甲酸戊酯等，最优选甲酸乙酯。
关于本发明的有机溶剂(A)，不言而喻，上述溶剂可以单独使用，也可以组合2种以上使用。此外，上述溶剂也可以在和水混合的状态下使用。即，含水有机溶剂也包括在本发明的有机溶剂(A)中。
在本发明的制造方法中，作为清洗时的温度条件，只要满足将清洗用有机溶剂(A)的温度设定在30℃以下的条件，就不做特别限定，优选20℃以下，更优选10℃以下，特别优选8℃以下。有机溶剂(A)的温度超过30℃时会产生以下问题：清洗液中的类胡萝卜素的含量升高，其结果，可从酵母中提取的类胡萝卜素量降低，类胡萝卜素的回收率变差。
此外，清洗所使用的有机溶剂(A)的量，并不因使用的有机溶剂(A)的种类、洗净时的温度、作为目标物的类胡萝卜素的种类而作特别限定，但例如，类胡萝卜素相对于有机溶剂(A)的溶解度在30重量%以下的条件、具体而言，相对于菌体的干燥重量1重量份，有机溶剂(A)的量在200重量份以下、进一步优选50重量份以下、更优选20重量份以下，可以在一定程度上抑制清洗时类胡萝卜素的损失。但是，在清洗时的有机溶剂(A)的温度非常低的情况下，或使用几乎不能溶解目标物类胡萝卜素的有机溶剂(A)(例如：甘油、己烷、乙酸乙酯、甲苯等)的情况下，使用更多量的有机溶剂(A)进行清洗，也可达成同样的目的。
特别是，以制得作为类胡萝卜素的虾青素为目的的情况下，作为有机溶剂(A)优选使用酮类或者醇类，其中，进一步优选使用丙酮或者乙醇，更优选使用乙醇。例如，使用丙酮或者乙醇作为有机溶剂(A)的情况下，作为其用量，不做特别限定，例如：相对于菌体的干燥重量1重量份，有机溶剂(A)优选为0.1重量份以上，进一步优选1重量份以上，更优选5重量份以上，且优选200重量份以下，进一步优选50重量份以下，更优选20重量份以下。
本发明的制造方法中，使用有机溶剂(A)对含有类胡萝卜素的法夫酵母属酵母进行清洗时的清洗方式不做特别限制，例如，可以用搅拌叶或静态混合搅拌器、泵等进行混合，或在对菌体进行过滤操作时，向滤板上的法夫酵母属酵母中添加有机溶剂(A)进行过滤清洗，从清洗效率的观点出发，优选使用搅拌叶使含有类胡萝卜素的法夫酵母属酵母和有机溶剂(A)接触、混合一定时间，之后，将该法夫酵母属酵母和有机溶剂(A)分离，从而进行清洗操作。对这种情况下的清洗时间(即，有机溶剂(A)和含有类胡萝卜素的法夫酵母属酵母的接触时间)，不做特别的限制，但优选24小时以内，进一步优选1分钟～6小时的范围，更优选10分钟～3小时的范围。需要说明的是，在此，通过适宜调整清洗时间，可以在一定程度上抑制清洗时类胡萝卜素的损失。此外，对清洗结束后的法夫酵母属酵母和有机溶剂(A)的分离操作的种类不做特别的限制，可以通过加压过滤、减压过滤、自然过滤、离心分离、倾析等常规方法进行实施，不言而喻，也可以组合进行上述操作。在进行过滤操作的情况下，为了高效操作可以使用过滤助剂。
本发明的制造方法中，如上所述，在进行提取操作之前，使用有机溶剂(A)对法夫酵母属酵母预先进行清洗，从菌体内含有大量脂质的法夫酵母属酵母中，除去来源于菌体的以脂质为主的大部分杂质，最终除了可实现所制得的目标物类胡萝卜素组合物的高含量化、降低作为油状组合物时的粘度、提高得到粉末组合物时的粉体流动性，还可以抑制在制造过程中由残存脂质引起的黏性，大幅改善粘附在装置内等问题等，增加生产效率或生产率。
在本发明的制造方法中，随后，从使用上述有机溶剂(A)进行了清洗的法夫酵母属酵母中，在10～70℃的温度、使用有机溶剂(B)进行作为目标物的类胡萝卜素的提取。
在本发明的制造方法中，作为提取所使用的有机溶剂(B)，若能够有效地提取目标物类胡萝卜素就不做特别的限制，例如，可优选使用醇类，烃类以及醚类。
作为上述醇类，无论环状、非环状，也无论饱和、不饱和，不做特别限制，通常优选使用饱和醇类。通常，碳原子数为1～20，优选碳原子数为1～12，进一步优选碳原子数为1～6。其中，优选碳原子数为1～5的一元醇，碳原子数为2～5的2元醇，碳原子数为3的3元醇。
作为这些醇的具体例可列举：例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、1-十二烷醇、烯丙醇、丙炔醇、苯甲醇、环己醇、1-甲基环己醇、2-甲基环己醇、3-甲基环己醇、4-甲基环己醇等一元醇；1,2-乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、1,5-戊二醇等2元醇；甘油等3元醇。
作为1元醇，优选：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、1-十二烷醇、苯甲醇、环己醇、1-甲基环己醇、2-甲基环己醇、3-甲基环己醇、4-甲基环己醇等。进一步优选：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、环己醇等。更优选：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇等。特别优选：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、2-乙基-1-丁醇、异戊醇等，最优选乙醇。
作为2元醇，优选：1,2-乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇等，最优选1,2-乙二醇。作为3元醇，优选甘油。
作为上述烃类，不做特别限制，可列举：例如，脂肪族烃、芳香族烃、卤代烃等。其中优选脂肪族烃、芳香族烃，进一步优选脂肪族烃。
作为脂肪族烃，无论环状、非环状，也无论饱和、不饱和，不做特别限制，通常优选使用饱和脂肪烃。通常使用碳原子数为3～20的脂肪族烃，优选使用碳原子数为5～12的脂肪族烃，进一步优选使用碳原子数为5～8的脂肪族烃。作为具体例，可列举：例如，丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、庚烷异构体(例如：2-甲基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷)、辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、异辛烷、壬烷、2,2,5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、2-戊烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-壬烯、1-癸烯、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷、对萜烷、环己烯等。优选：戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷、辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、异辛烷、壬烷、2,2,5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷、对萜烷等。进一步优选：戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷、辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、异辛烷、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷等，更优选：戊烷、己烷、环己烷、甲基环己烷等，从氧化的防护效果特别高的观点出发，特别优选：庚烷、甲基环己烷，最优选庚烷。
作为芳香族烃，不做特别限制，通常使用碳原子数为6～20的芳香族烃，优选使用碳原子数为6～12的芳香族烃，进一步优选使用碳原子数为7～10的芳香族烃。作为具体例，可列举：例如，苯、甲苯、二甲苯，邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙基苯、异丙苯、均三甲苯、四氢化萘、丁基苯、对甲基异丙基苯、环己基苯、二乙基苯、戊基苯、二戊基苯、十二烷基苯、苯乙烯等。优选甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲醚、对二甲苯、乙基苯、异丙苯、均三甲苯、四氢化萘、丁基苯、对甲基异丙基苯、环己基苯、二乙基苯、戊基苯等。进一步优选：甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、异丙苯、四氢化萘等。最优选异丙苯。
作为卤代烃，无论环状、非环状，也无论饱和、不饱和，不做特别限制，但通常优选使用非环状的卤代烃。进一步优选使用氯代烃、氟代烃，更优选氯代烃。此外，可适当使用碳原子数为1～6的卤代烃，优选使用碳原子数为1～4的卤代烃，进一步优选使用碳原子数为1～2的卤代烃。作为具体例，可列举：例如，二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、1,1,1,2-四氯乙烷、1,1,2,2-四氯乙烷、五氯乙烷、六氯乙烷、1,1-二氯乙烯、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、1,2-二氯丙烷、1,2,3-三氯丙烷、氯苯、1,1,1,2-四氟乙烷等。优选：二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、1,1-二氯乙烯、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1,1,1,2-四氟乙烷等。进一步优选：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1,1,1,2-四氟乙烷等。
作为上述醚类，无论环状、非环状，也无论饱和、非饱和，不做特别限制，但通常优选使用饱和醚类。通常使用碳原子数为3～20的醚类，优选使用碳原子数为4～12的醚类，进一步优选使用碳原子数为4～8的醚类。作为具体例，可列举：例如，二乙醚、甲基叔丁基醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、二己醚、乙基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、茴香醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二氧杂环己烷、呋喃、2-甲基呋喃、四氢呋喃、四氢吡喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二丁醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙二醇单丁醚等。优选：二乙醚、甲基叔丁基酯、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、二己醚、茴香醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二氧杂环己烷、2-甲基呋喃、四氢呋喃、四氢吡喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二丁醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚等。进一步优选：二乙醚、甲基叔丁基醚、茴香醚、二氧杂环己烷、四氢呋喃、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚等。更优选：二乙醚、甲基叔丁基醚、茴香醚等。最优选：甲基叔丁基醚。
对于本发明中的有机溶剂(B)，不言而喻，上述溶剂可单独使用，也可组合2种以上使用。此外，清洗时使用的有机溶剂(A)和提取时使用的有机溶剂(B)，可以相同也可以不同。从使用的溶剂的回收、再利用的观点出发，优选清洗时使用的有机溶剂(A)和提取时使用的有机溶剂(B)使用相同的有机溶剂。此外，从不产生残留溶剂的问题的观点出发，最优选清洗时使用的有机溶剂(A)和提取时使用的有机溶剂(B)两者均使用乙醇。
本发明的制造方法中，对作为提取溶剂使用的有机溶剂(B)的用量不做特别限定，有机溶剂(B)的用量相对菌体的干燥重量显著较多的情况下，得到的提取液中的类胡萝卜素浓度会变的极端稀薄，难以进行有效的精制处理。另一方面，相对对于菌体的干燥重量，有机溶剂(B)的用量显著较少的情况下，虽然能够得到高浓度的类胡萝卜素提取液，但从类胡萝卜素相对于有机溶剂(B)的饱和溶解度的观点出发，极难有效地提取菌体中的类胡萝卜素。从这样的观点出发，本发明的制造方法中有机溶剂(B)的用量，相对于菌体的干燥重量1重量份优选为1重量份以上，进一步优选为5重量份以上，最优选为10重量份以上。此外，对其上限也不做特别限定，优选1000重量份以下，进一步优选500重量份以下，最优选300重量份以下。
本发明的制造方法中，用有机溶剂(B)进行提取时的温度在10～70℃的范围，优选20℃以上，进一步优选25℃以上，特别优选35℃以上。此外，优选60℃以下，进一步优选50℃以下。需要说明的是，提取时的温度越高提取效率越高，但超过70℃的情况下，类胡萝卜素中的虾青素的一部分会发生顺式体化等，产生类胡萝卜素的结构变质的问题。另一方面，在低于10℃的提取温度下，类胡萝卜素相对于有机溶剂(B)的溶解度很低，因此难以得到满意的收率。
在本发明的制造方法中，使用有机溶剂(B)进行提取操作时，对有机溶剂(B)和法夫酵母属酵母的混合方式不做特别限制，例如：可以使用搅拌叶或静态混合搅拌器、泵等，或高压均质器、旋刃式均质器、超声波均质器等破碎、乳化装置，不言而喻，可以组合这些装置进行提取。
在本发明的制造方法中，作为提取方法可以采用间歇提取、连续提取中的任意方法，可以多次重复进行这些操作，从生产率的各方面来看，优选在工业上连续提取，特别优选连续提取中的逆流多步提取。间歇提取的情况下，对搅拌时间不做特别限定，但通常为5分钟以上，连续提取的情况下，对平均时间不做特别限制，但通常为10分钟以上。此外，对间歇提取的次数也不做特别限定，即使是单次提取也可高效提取，但从收率的观点出发，优选重复进行2次以上的提取。
需要说明的是，在本发明的制造方法中，从可以提高后续提取工序的提取效率，可大幅减少提取时使用的有机溶剂(B)的用量的观点出发，优选在使用有机溶剂(B)进行提取前，在和提取时使用的有机溶剂(B)接触的状态下对清洗后的法夫酵母属酵母进行加热处理。加热处理时使用的有机溶剂(B)的用量即便是提取时使用的有机溶剂(B)的用量的一部分，例如，相对于提取时使用的有机溶剂(B)的总用量，加热处理时使用的有机溶剂(B)的量为其10～70%左右，也可发挥效果。具体而言，相对于菌体的干燥重量1重量份，在加热处理时可优选使用1～50重量份以上的有机溶剂(B)，进一步优选5～30重量份左右的有机溶剂(B)。该加热处理时的温度，若在40℃以上就不做特别限定，但优选在50～80℃的范围进行。对加热时间也不做特别限定，优选1～120分钟，进一步优选15～60分钟。作为加热方法也不做特别限定，可以在用有机溶剂(A)清洗了法夫酵母属酵母后，加入加热至给定温度的有机溶剂(B)，也可以在加入常温的有机溶剂(B)后，将该混合物加热到给定温度。此外，加热时有机溶剂(B)和法夫酵母属酵母可在静置状态下、也可在搅拌状态下进行，优选在适当进行搅拌的状态下进行加热。这种情况下对搅拌方式不做特别限定，可以直接使用提取时所使用的混合方法和/或装置。本发明的制造方法中，可在上述加热处理后，除去加热处理中使用的部分或者全部有机溶剂(B)后，进行下面的提取，但优选不对加热处理后的有机溶剂(B)和法夫酵母属酵母的混合物进行分离，而接着进行下面的提取工序。此外，提取时，可根据需要进一步追加需要的有机溶剂(B)(即，提取时使用的有机溶剂(B)为，加热处理后残留的有机溶剂(B)和之后根据需要追加的有机溶剂(B)的总和)。需要说明的是，加热处理时的温度比提取温度高的情况下，可冷却到所希望的温度后，再实施下面的提取操作。
上述使用有机溶剂(B)进行的类胡萝卜素的提取操作结束后，进行法夫酵母属酵母和有机溶剂(B)的分离。对分离操作的种类不做特别限定，可通过加压过滤、减压过滤、自然过滤、离心分离、倾析等常规方法进行，不言而喻，也可组合这些方法进行操作。
按照本发明的制造方法，可以高效地提取法夫酵母属酵母中含有的虾青素等类胡萝卜素，其提取率通常在50%以上，进一步优选70%以上，更优选80%以上。
在本发明的制造方法中，可以得到如上所述获得的类胡萝卜素组合物的提取液本身，或对其进行适宜加工，获得类胡萝卜素组合物。对按照本发明的制造方法得到的类胡萝卜素组合物的性状不做特别限定，优选按照以下说明进行处理得到的油状组合物、或者粉末组合物。
上述油状组合物可通过用有机溶剂(B)对类胡萝卜素的提取液进行浓缩制造。对该情况下的浓缩操作的方式不做特别限制，可适当使用反应罐中的减压浓缩、快速浓缩、薄膜浓缩等操作。
上述浓缩操作，优选实施至充分除去油状物组合物中的有机溶剂(A)、或有机溶剂(B)。油状组合物中的有机溶剂(A)以及有机溶剂(B)的残留浓度，只要作为食品、化妆品、医药品而言处于不危害人体的程度就不做特别限制，作为油状组合物中的残留量，优选1重量%以下，进一步优选0.1重量%，更优选0.01重量%以下。
上述浓缩操作中的温度条件，只要是不会在浓缩中显著发生类胡萝卜素的分解或顺式体化等变质的条件，就不做特别限定，优选在10～80℃的范围，进一步优选20～70℃的范围，更优选25～60℃的范围。此外，本发明中的浓缩操作，可根据需要在减压下进行。
在本发明的制造方法中，通过进行上述浓缩得到的浓缩物为油状的情况下，可将其作为油状组合物直接利用，但作为固体物被制得的情况下或从作为产品的易操作性的观点出发，也可以通过向该浓缩物中添加液体油脂进行混合，从而制备目标油状组合物。需要说明的是，本发明中的“油状组合物”，不仅是指类胡萝卜素和其他成分以均匀的油状状态混合在一起的情况，还包括类胡萝卜素部分析出、成为浆状的形态。
作为可进行上述添加的液体油脂，若是能够使虾青素等类胡萝卜素的浓缩物溶解或者分散的油脂，就不做特别限定，例如，可以是来源于动植物的天然油脂，也可以是合成油脂或加工油脂。更优选在食品、化妆品或者医药用途中容许使用的油脂。作为植物油，可列举：例如，椰子油、棕榈油、棕榈仁油、亚麻油、山茶油、糙米胚芽油、菜籽油、米油、花生油、玉米油、小麦胚芽油、大豆油、苏子油、棉籽油、向日葵籽油、木棉油、月见草油、牛油树油脂(shea butter)、波罗双树脂(sal fat)、可可脂、芝麻油、红花油、橄榄油等，作为动物油脂，可列举：例如，猪油、乳脂、鱼油、牛脂等，进一步可列举：通过分离、氢化、酯交换等对其进行了加工而得到的油脂(例如硬化油)。不言而喻，也可使用中链脂肪酸甘油三酯(MCT)。或者可使用这些油脂的混合物。作为中链脂肪酸甘油三酯，可列举：例如，脂肪酸的碳原子数分别为6～12、优选为8～12的甘油三酯。
上述油脂中，从容易操作，臭气等方面出发，优选植物油脂，合成油脂、加工油脂等，作为进一步优选的具体例，可列举：椰子油、棕榈油、棕榈仁油、菜籽油、米油、大豆油、棉籽油、红花油、橄榄油、MCT等。
可以在制作类胡萝卜素提取液的浓缩物后，添加、混合上述液体油脂，从而制备作为目标物的类胡萝卜素的油状组合物，也可在提取操作、或者浓缩操作之前或中途预先添加，再进行之后的处理。
作为本发明的含有类胡萝卜素的油状组合物中的类胡萝卜素的含量，不做特别限定，可根据目标产品所需要的用途适宜选择，例如将虾青素作为目标物类胡萝卜素的情况下，从制备具有易操作的粘度、性状的油状组合物的观点出发，作为油状组合物中的虾青素含量的上限，优选30重量%以下，进一步优选20重量%以下，更进一步优选15重量%以下。此外，作为油状组合物中的虾青素含量的下限，不做特别限定，优选0.1重量%以上，进一步优选1重量以上，更进一步优选3重量%以上。
特别地，按照本发明的制造方法，可以制造来源于法夫酵母属酵母的麦角固醇的含量较低的油状组合物。例如，按照本发明的制造方法得到的油状组合物中，麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率(麦角固醇含量/虾青素含量)在40重量%以下。即，如上所述，含有来源于法夫酵母属酵母的虾青素，且麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率在40重量%以下的、含有类胡萝卜素的油状组合物与其制造方法无关均属于本发明的范畴。麦角固醇含量的比率优选35重量%以下，进一步优选30重量%以下。麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率可以通过高效液相色谱等测定。
进而，按照本发明的制造方法，不仅可以得到含有高浓度虾青素的油状组合物，而且与按照现有公知的制造方法得到的含有来源于法夫酵母属酵母的虾青素的油状组合物相比，按照本发明的制造方法所得到的油状组合物粘度非常低，具有容易操作的性状的特点。例如，采用本发明优选的制造方法，可以制造目前还未实现的高浓度且低粘度的含有类胡萝卜素的油状组合物，该含有类胡萝卜素的油状组合物中，虾青素含量为1～20重量%，30℃、剪切速度100s-1时的粘度为0.01～1Pa·s，优选0.01～0.7Pa·s的范围。即，含有来源于法夫酵母属酵母的虾青素，且虾青素含量为1～20重量%，30℃、剪切速度100s-1时的粘度为0.01～1Pa·s，优选0.01～0.7Pa·s的、含有类胡萝卜素的油状组合物与其制造方法无关均属于本发明的范畴。
进一步确认了：与按照现有公知的制造方法得到的来源于法夫酵母属酵母的类胡萝卜素组合物相比，按照本发明的制造方法得到的类胡萝卜素组合物在由生物体吸收的吸收性方面也优异。
另一方面，在本发明的制造方法中，通过对利用有机溶剂(B)得到的类胡萝卜素提取液进行浓缩和/或冷却等处理，使类胡萝卜素析出，并对得到的析出物进行固液分离，可以制造高浓度地含有作为类胡萝卜素的虾青素的粉末组合物。
需要说明的是，从法夫酵母属酵母提取类胡萝卜素的情况下，在提取工序之前未进行用有机溶剂实施的清洗工序的情况下，即使将提取液浓缩也只能得到粘稠的浓缩物，类胡萝卜素不能以可分离的状态析出，例如，如专利文献5、6所述，即使用乙醇等清洗该浓缩液，也不能制得作为晶体的类胡萝卜素，尤其是虾青素。因此，按照本发明的制造方法，特别是以类胡萝卜素组合物呈现粉末状为目的时，下述顺序非常重要，即，在利用有机溶剂(B)提取之前，先用有机溶剂(A)进行清洗。
本发明的制造方法中，对析出类胡萝卜素的方法没有特别的限制，可列举，例如：浓缩提取液的同时进行蒸发析晶的方法；直接向提取液或者适宜浓缩后的提取液中添加类胡萝卜素的不良溶剂，使类胡萝卜素析出的方法；直接将提取液或者适宜浓缩后的提取液冷却到超过类胡萝卜素饱和溶解度的条件下进行析晶的方法等。本发明中，不言而喻，可以组合这些方法进行制造，但从收率、操作性的观点出发，优选将提取液浓缩，在类胡萝卜素呈现一定程度的结晶析出的状态下，通过添加不良溶剂或冷却使类胡萝卜素析出。
在上述粉末组合物的制造中，进行提取液浓缩操作的情况下，提取液的浓缩倍率过低时，目标物类胡萝卜素大部分溶解在母液中，制得的粉末组合物的总量变少，存在不能得到满意的收率、生产率的倾向。另一方面，提取液的浓缩倍率过高的情况下，除类胡萝卜素以外的来源于法夫酵母属酵母的杂质的析出变得显著，存在可制得的粉末组合物中的虾青素含量低的问题。因此，在粉末组合物的制造中，为了满足充分的收率、生产率、含量，应将提取液浓缩至适当的浓缩倍率，例如，优选浓缩至提取液的浓缩倍率在10～1000倍的范围，进一步优选浓缩至50～500倍的范围。
在粉末组合物的制造中，在上述析出操作之后，接着进行提取时使用的有机溶剂和析出物的固液分离。上述固液分离中可使用通常的固液分离操作，例如：倾析、离心分离、加压过滤、减压过滤、自然过滤等，进一步根据需要进行滤饼清洗，进而通过进行真空干燥等干燥处理以除去残存的有机溶剂等，得到作为干燥粉末的类胡萝卜素组合物。
对于虾青素，在粉末X射线衍射中，公知有如下两种多晶型：于衍射角13.3°(2θ±0.2°)、13.8°(2θ±0.2°)、14.3°(2θ±0.2°)、15.8°(2θ±0.2°)、16.3°(2θ±0.2°)、18.2°(2θ±0.2°)、20.5°(2θ±0.2°)、24.8°(2θ±0.2°)、以及25.3°(2θ±0.2°)处有强峰的I型，以及于衍射角12.2°(2θ±0.2°)、13.2°(2θ±0.2°)、13.5°(2θ±0.2°)、16.1°(2θ±0.2°)、16.6°(2θ±0.2°)、20.1°(2θ±0.2°)、21.3°(2θ±0.2°)、22.7°(2θ±0.2°)、24.6°(2θ±0.2°)、以及27.5°(2θ±0.2°)处有强峰的II型，可知按照上述本发明的制造方法得到的粉末组合物，在粉末X射线衍射中，于衍射角13.3°(2θ±0.2°)、13.8°(2θ±0.2°)、14.3°(2θ±0.2°)、15.8°(2θ±0.2°)、16.3°(2θ±0.2°)、18.2°(2θ±0.2°)、20.5°(2θ±0.2°)、24.8°(2θ±0.2°)以及25.3°(2θ±0.2°)处有强峰。即，按照本发明的制造方法得到的粉末组合物，作为晶型可以说是高含量含有I型虾青素的类胡萝卜素组合物。进一步地，按照本发明的制造方法得到的类胡萝卜素组合物中的虾青素是来源于法夫酵母属的虾青素，其具有(3R,3’R)的化学结构。目前，还没有报告来源于法夫酵母属酵母的、高含量含有具备上述晶型和化学结构的虾青素的粉末状组合物。因此，在粉末X射线衍射中，含有下述虾青素的类胡萝卜素组合物与其制造方法无关均属于本发明的范畴，所述虾青素于衍射角13.3°(2θ±0.2°)、13.8°(2θ±0.2°)、14.3°(2θ±0.2°)、15.8°(2θ±0.2°)、16.3°(2θ±0.2°)、18.2°(2θ±0.2°)、20.5°(2θ±0.2°)、24.8°(2θ±0.2°)以及25.3°(2θ±0.2°)处有强峰，并且具有(3R,3’R)的化学结构。
在本发明的制造方法中，通过在制造过程中使用有机溶剂(A)清洗菌体，除去大部分来源于法夫酵母属酵母的脂质等杂质，作为类胡萝卜素组合物而得到的粉末组合物，其粉体流动特性优异。具体地，按照本发明优选的制造方法得到的粉末组合物，能够得到卡尔(Dr.Carr)粉体流动特性指数在60以上的粉体。从粉体的流动特性的观点出发，其指数越高越优选，通过适宜选择上述优选的制造条件，可以得到卡尔粉体流动特性指数在70以上，进一步80以上的粉末组合物。另一方面，按照专利文献7的方法得到的含有虾青素的粉末组合物，其卡尔粉体流动特性指数低于60，流动性差，存在输送类胡萝卜素粉末时效率恶化，无法顺利填充至装置等生产率、操作性方面的问题。因此，作为含有上述虾青素的类胡萝卜素组合物，卡尔粉体流动特性指数在60以上的粉体也是本发明的类胡萝卜素组合物的优选方式之一。
需要说明的是，卡尔粉体流动特性指数是综合评价粒子的刮铲角、压缩度、刮铲角、均匀度的指数，在CHEMICAL ENGIBEERING,January18(1965)中也有定义。有关上述粉体流动性指数的定义如表1所示。
进一步，按照上述本发明的制造方法得到的粉末组合物中的虾青素含量，优选在20～80重量%的范围，进一步优选30～80重量%，更优选40～80重量%。按照现有的制造方法，事实上难以得到如上所述高浓度含有来源于法夫酵母属酵母的虾青素、且杂质少的粉末组合物。即，含有来源于法夫酵母属酵母的虾青素、且虾青素含量在20～80重量%范围的粉末组合物，也是本发明的类胡萝卜素组合物的优选方式之一。
实施例
接下来通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不只限于这些实施例。
(高效液相色谱分析条件)
色谱柱：FinePak SIL C18T-5,4.6×250mm(日本分光株式会社制造)
流动相：乙腈/乙酸乙酯/甲酸/蒸馏水=600/300/60/40
流速：0.8mL/分钟
检测波长：471nm
(气相色谱分析条件)
色谱柱：J&W DB-624,30m×0.32mm,膜厚1.8μm(Agilent Technologies公司制造)
气体：He(70kPa)，空气(50kPa)，H2(60kPa)
检测：FID
(粘度测定条件)
装置：TA Instruments公司制造AR-G2
剪切速度：10～1000s-1
锥板：40mm2°铝锥板
温度30℃
(粉末X射线衍射测定条件)
装置：株式会社Rigaku制造MiniFlexII
使用的X射线：Cu·Kα射线，X射线强度：30kV·15mA，角度范围：2θ=2～60°
扫描速度：2°/分钟
样品间隔：0.02°
发散狭缝：1.25°
散射狭缝：1.25°
需要说明的是，本实施例中使用的乙醇为99.5w/w%以上(比重约为0.79)的无水乙醇，其他的有机溶剂都是试剂级的。
(合成例1)
将用NTG对法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)NBRC10129株(独立行政法人制品评价技术基础机构生物遗传资源部门(〒292－0818千葉県木更津市かずさ鎌足2－5－8)购入)进行了突变处理而得到的突变菌株KNK-11株接种到4支含有5mL的YM培养基(聚蛋白胨0.5%、酵母提取物0.3%、麦芽提取物0.3%、葡萄糖1.0%)的试管中，在20℃培养48小时。将培养液转移到4只含有50mL的YM培养基的容积为500mL的坂口烧瓶中，在20℃培养48小时。将培养液转移到含有2500mL培养基(含有磷酸铵1.3%、磷酸钾0.7%、酵母提取物0.3%、葡萄糖1%)的容积为5000mL的发酵罐中，在20℃培养，得到包含虾青素以及HDCO的、含菌体的培养液。培养中，pH控制在4.4～5.6之间，分批补料式加入葡萄糖使溶解氧浓度达到饱和的30～80%。
向3000mL得到的培养液中加入硫酸400g，在70℃搅拌1小时。之后，加入30%的氢氧化钠1300g，得到经中和了的培养液，向培养液中加入作为过滤助剂的硅藻土150g并混合，然后进行减压过滤，制备湿菌体(水分含量60重量%，菌体含量20重量%(作为干燥重量))。
(实施例1)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入冷却至5℃的乙醇100mL(79g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素浓度，为0.005重量%。向得到的滤饼-1中加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。向得到的滤饼-2中进一步加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-2和滤液-3的混合液中的虾青素的量为0.11g。将该液体进行减压浓缩至1/100后，加入红花油1.63g，继续进行浓缩。得到的油状物2.5g中虾青素的含量为4.0重量%。此外，通过气相色谱测定得到的油状物中残存的乙醇含量，为0.1重量%。需要说明的是，该油状物中的麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率(=麦角固醇含量/虾青素含量；以下相同)为33.0重量%，30℃、剪切速度100s-1时的粘度为0.30Pa·s。
(实施例2)
向通过和合成例1相同的操作而得到的湿菌体646kg(含有虾青素2.58kg)中加入冷却到8℃的乙醇2000L(1580kg)，在该温度搅拌30分钟。对其进行加压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.005重量%。向得到的滤饼-1中加入乙醇16000L(12640kg)，在室温搅拌1小时。对其进行加压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。向得到的滤饼-2中进一步加入乙醇16000L(12640kg)，在40℃搅拌1小时。对其进行加压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-2和滤液-3的混合液中的虾青素的量为2.13kg。将该液体进行减压浓缩至1/100后，加入红花油32.6kg，继续进行浓缩。得到的油状物50.0kg中虾青素的含量为4.2重量%。此外，通过气相色谱测定得到的油状物中残存的乙醇含量，为0.04重量%。需要说明的是，该油状物中的麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率为29.5重量%，30℃、剪切速度100s-1时的粘度为0.33Pa·s。
(实施例3)
向通过和合成例1相同的操作而得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入冷却到5℃的丙酮50mL(39.5g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.03重量%。向得到的滤饼-1中加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。向得到的滤饼-2中进一步加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-2和滤液-3的混合液中的虾青素的量为0.10g。将该液体进行减压浓缩至1/100后，加入红花油1.63g，继续进行浓缩。得到的油状物2.5g中虾青素的含量为3.6重量%。此外，通过气相色谱测定得到的油状物中残存的乙醇含量，为0.2重量%。需要说明的是，该油状物中的麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率为38.3重量%，30℃、剪切速度100s-1时的粘度为0.62Pa·s。
(实施例4)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入冷却到5℃的乙醇100mL(79g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.005重量%。向得到的滤饼-1中加入含有20体积%的正庚烷的乙醇800mL(614g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。向得到的滤饼-2中进一步加入含有20体积%的正庚烷的乙醇800mL(614g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-2和滤液-3的混合液中的虾青素的量为0.09g。将该液体进行减压浓缩至1/100后，加入红花油1.63g，继续进行浓缩。得到的油状物2.5g中的虾青素的含量为3.2重量%。此外，通过气相色谱测定得到的油状物中残存的正庚烷和乙醇的含量，分别为0.1重量%以下。需要说明的是，该油状物中的麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率为32.0重量%，30℃、剪切速度100s-1时的粘度为0.40Pa·s。
(实施例5)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入冷却至5℃的乙醇100mL(79g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.005重量%。向得到的滤饼-1中加入乙醇1600mL(1264g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。得到的滤液-2中的虾青素的含量为0.11g。将该液体进行减压浓缩至1/100后，加入红花油1.63g，继续进行浓缩。得到的油状物2.5g中的虾青素的含量为4.0重量%。此外，通过气相色谱测定得到的油状物中残存的乙醇含量，为0.1重量%。需要说明的是，该油状物中的麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率为32.2重量%，30℃、剪切速度100s-1时的粘度为0.26Pa·s。
(实施例6)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入冷却至5℃的甲醇50mL(39.5g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.018重量%。向得到的滤饼-1中加入2-丙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。向得到的滤饼-2进一步加入2-丙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-2和滤液-3的混合液中的虾青素的量为0.11g。将该液体减压浓缩至1/100后，加入MCT1.63g，继续进行浓缩。得到的油状物2.5g中的虾青素的含量为3.9重量%。此外，通过气相色谱测定得到的油状物中残存的2-丙醇的含量，为0.1重量%。需要说明的是，该油状物中的麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率为28.6重量%，剪切速度100s-1时的粘度为0.18Pa·s。
(实施例7)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(干燥重量为12.9g，含有虾青素0.13g)中加入冷却至5℃的乙醇100mL(79g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.005重量%。向得到的滤饼-1中加入乙醇200mL(158g)，在60℃搅拌30分钟。之后进一步加入乙醇400ml(316g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。滤液-2中的虾青素的量为0.11g。将该液体减压浓缩至1/100后，加入红花油1.63g，继续进行浓缩。得到的油状物2.5g中的虾青素的含量为3.9重量%。此外，通过气相色谱测定得到的油状物中残存的乙醇的含量，为0.1重量%。
(实施例8)
将法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)NBRC10129株(独立行政法人制品评价技术基础机构生物遗传资源部门(〒292－0818千葉県木更津市かずさ鎌足2－5－8)购入)接种到4支含有5mL的YM培养基(聚蛋白胨0.5%、酵母提取物0.3%、麦芽提取物0.3%、葡萄糖1.0%)的试管中，在20℃培养48小时。将培养液转移到4只含有50mL的YM培养基的容积为500mL坂口烧瓶中，在20℃培养48小时。将培养液转移到含有2500mL培养基(含有磷酸铵1.3%、磷酸钾0.7%、酵母提取物0.3%、葡萄糖1%)的容积为5000mL发酵罐中，在20℃培养。培养中，pH控制在4.4～5.6之间，分批补料式加入葡萄糖使溶解氧浓度达到饱和的30～80%。
向得到的培养液3000mL中加入硫酸400g，在70℃搅拌1小时。之后，加入30%的氢氧化钠1300g，得到经中和了的培养液，向培养液中加入作为过滤助剂的硅藻土150g并混合，然后进行减压过滤，制备湿菌体(水分含量58重量%，菌体含量21重量%(作为干燥重量))。
向如上所述得到的湿菌体500g(含有虾青素0.006g)中加入冷却至10℃的乙醇1400mL(1106g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.0001重量%。向得到的滤饼-1中加入冷却至10℃的乙醇1400mL(1106g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。滤液-2中的虾青素的浓度为0.0001重量%。向得到的滤饼-2中加入乙醇15000mL(11850g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-3中的虾青素的量为0.0032g。将该液体减压浓缩至1/1000后，加入红花油0.5g，继续进行浓缩。得到的油状物1.0g中的虾青素的含量为0.3重量%。此外，通过气相色谱测定得到的油状物中残存的乙醇含量，为0.1重量%。
(实施例9)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入冷却至5℃的乙醇100mL(79g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.005重量%。向得到的滤饼-1中加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。向得到的滤饼-2进一步加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-2和滤液-3的混合液中的虾青素的量为0.11g。将该液体减压浓缩至1/100后，将浓缩液进行减压过滤使其固液分离，进一步将得到的固态成分在室温进行减压干燥得到黑紫色粉末。得到的粉末0.20g中的虾青素的含量为51.4重量%。此外，通过粉末X射线衍射对得到的粉末进行测定后，其晶型为I型。需要说明的是，通过粉末测试仪(Hosokawa Micron株式会社制造powder-tester PT-R型，以下相同)对得到的粉末进行粉体流动特性评价，卡尔粉体流动特性指数为81，流动特性的程度为“良好(Good)”。
(实施例10)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入冷却至5℃的乙醇100mL(79g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.005重量%。向得到的滤饼-1中加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。向得到的滤饼-2中进一步加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-2和滤液-3的混合液中的虾青素的量为0.11g。将该液体减压浓缩至1/150后，将浓缩液进行减压过滤使其固液分离，进一步将得到的固态成分在室温进行减压干燥，得到黑紫色粉末。得到的粉末0.21g中的虾青素的含量为45.1重量%。此外，通过粉末X射线衍射对得到的粉末进行测定后，其晶型为I型。需要说明的是，通过粉末测试仪(Hosokawa Micron株式会社制造powder-tester PT-R型，以下相同)对得到的粉末进行粉体流动特性评价，卡尔粉体流动特性指数为76，流动特性的程度为“稍微良好(Fair)”。
(实施例11)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入冷却至5℃的乙醇100mL(79g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.005重量%。向得到的滤饼-1中加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。向得到的滤饼-2中进一步加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-2和滤液-3的混合液中的虾青素的量为0.11g。将该液体减压浓缩至1/50后，将浓缩液冷却至5℃。对冷却后的浓缩液进行减压过滤使其固液分离，进一步将得到的固态成分在室温减压干燥，得到黑紫色粉末。得到的粉末0.34g中的虾青素的含量为30.7重量%。此外，通过粉末X射线衍射对得到的粉末进行测定后，其晶型为I型。需要说明的是，通过粉末测试仪(Hosokawa Micron株式会社制造powder-tester PT-R型，以下相同)对得到的粉末进行粉体流动特性评价，卡尔粉体流动特性指数为64，流动特性的程度为“普通(Passable)”。
(实施例12)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入冷却至5℃的丙酮50mL(39.5g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.03重量%。向得到的滤饼-1中加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。向得到的滤饼-2中进一步加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-2和滤液-3的混合液中的虾青素的量为0.10g。将该液体减压浓缩至1/150后，将浓缩液进行减压过滤使其固液分离，进一步地，将得到的固态成分在室温进行减压干燥，得到黑紫色粉末。得到的粉末0.20g中的虾青素的含量为48.6重量%。此外，通过粉末X射线衍射对得到的粉末进行测定后，其晶型为I型。需要说明的是，通过粉末测试仪(Hosokawa Micron株式会社制造powder-tester PT-R型，以下相同)对得到的粉末进行粉体流动特性评价，卡尔粉体流动特性指数为80，流动特性的程度为“良好(Good)”。
(实施例13)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入冷却至5℃的甲醇50mL(39.5g)，在该温度搅拌30分钟。对其进行减压过滤得到滤饼-1和滤液-1。通过高效液相色谱法测定滤液-1中的虾青素的浓度，为0.018重量%。向得到的滤饼-1中加入2-丙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。向得到的滤饼-2中进一步加入2-丙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-3和滤液-3。滤液-2和滤液-3的混合液中的虾青素的量为0.11g。将该液体减压浓缩至1/50后，将浓缩液冷却至5℃。将冷却后的浓缩液进行减压过滤使其固液分离，进一步地，将得到的固体成分在室温进行减压干燥，得到黑紫色粉末。得到的粉末0.36g中的虾青素的含量为28.8重量%。此外，通过粉末X射线衍射对得到的粉末进行测定后，其晶型为I型。需要说明的是，通过粉末测试仪(Hosokawa Micron株式会社制造powder-tester PT-R型，以下相同)对得到的粉末进行粉体流动特性评价，卡尔粉体流动特性指数为64，流动特性的程度为“普通(Passable)”。
(比较例1)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入丙酮1600mL(1264g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼和滤液。滤液中的虾青素的量为0.12g。将该液体减压浓缩后，加入MCT1.63g，继续进行浓缩。得到的油状物2.9g中的虾青素的含量为3.5重量%。此外，通过气相色谱法测定得到的油状物中残存的丙酮含量，为0.2重量%。需要说明的是，该油状物的麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率为40.8重量%，30℃、剪切速度100s-1时的粘度为3.2Pa·s。
(比较例2)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-1和滤液-1。向得到的滤饼-1中进一步加入乙醇800mL(632g)，在40℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。滤液-1和滤液-2的混合液中的虾青素的量为0.11g。将该液体减压浓缩后，加入MCT1.63g，继续进行浓缩。得到的油状物3.6g中的虾青素的含量为2.8重量%。此外，通过气相色谱测定得到的油状物中残存的乙醇的含量，为0.1重量%。需要说明的是，该油状物中的麦角固醇含量相对于虾青素含量的比率为58.9重量%，30℃、剪切速度100s-1时的粘度为2.1Pa·s。
(比较例3)
向合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)中加入乙醇800mL(632g)，在85℃搅拌1小时。对其进行减压过滤，得到滤饼和滤液。滤液中的虾青素的量为0.12g。将该液体减压浓缩至1/100后，为了从得到的浓缩液中将沉淀物进行固液分离，尝试了减压过滤，但是沉淀物的粘性显著，无法进行过滤。
(比较例4)
将合成例1中得到的湿菌体32.3g(含有虾青素0.13g)进行48小时冷冻干燥，得到15.8g干燥菌体。向该干燥菌体中加入丙酮400mL(316g)，室温搅拌3小时。对其进行减压过滤，得到滤饼-1和滤液-1。向得到的滤饼-1中加入丙酮200mL(158g)使其悬浮后，再次进行减压过滤，得到滤饼-2和滤液-2。滤液-1和滤液-2的混合液中的虾青素的量为0.12g。将该液体减压浓缩至1/13后，向浓缩液中加入去离子水10g进行搅拌，进一步进行减压浓缩后静置，除去分离的水相。向其中加入己烷50g，搅拌后减压过滤，使其固液分离，得到固体成分。使得到的固体成分悬浮在30g己烷后，进行减压过滤使其固液分离，进一步将得到的固体成分在室温减压干燥，得到黑紫色的粉末。得到的粉末0.18g中虾青素的含量为50.7重量%。此外，通过粉末X射线衍射对得到的粉末进行测定后，其晶型为II型。需要说明的是，通过粉末测试仪(Hosokawa Micron株式会社制造powder-tester PT-R型，以下相同)对得到的粉末进行粉体流动特性评价，卡尔粉体流动特性指数为53，流动特性的程度为“稍微不良(Poor)”。
实施例1～6、比较例1、2中的准备条件，得到的类胡萝卜素油状物中的虾青素含量、麦角固醇相当于虾青素的重量%、以及油状物的粘度结果示于表2中。此外，表3中表示了实施例9～13、比较例3、4中的准备条件、得到的类胡萝卜素粉末中的虾青素的含量、粉末的晶型以及粉体流动特性指标的结果。
(实施例14,、比较例5以及参考例1)
<给药的组合物的制备>
向实施例1以及比较例1中得到的油状物，以及用于参考的市售的虾青素组合物(来源于雨生红球藻)中混合红花油，分别制备虾青素浓度为0.5重量%的组合物。分别作为实施例14、比较例5以及参考例1的组合物。
<使用小鼠进行吸收性评价>
将该组合物口服给药于小鼠的情况下，通过以下方法比较吸收性。分别以虾青素50mg/kg的剂量向7周龄的雄性ICR小鼠(购入单位：日本CharlesRiver)口服给药上述组合物。给药被测物质2、4、6小时后，分别从各小鼠采集肝脏。用剪刀将采集的肝脏剪成细丝，称量0.3g。向其中加入2mL蒸馏水，通过Polytron均质器进行均匀化。加入2mL甲醇(含有500ppm的BHT)搅拌10秒钟，进行除蛋白处理。然后加入4mL的正己烷，使用震动机混合5分钟。进行离心分离后(3000rpm×10分钟)，通过HPLC对己烷层中的虾青素进行定量，算出肝脏中的虾青素的浓度。
<通过HPLC的虾青素的定量>
通过以下分析体系对虾青素进行定量。在以下的分析体系中，虾青素的保留时间为9.1分钟。虾青素的标准物质使用Sigma公司制造的试药。
色谱柱：SYMMETRY C18250mm×φ4.6mm(Waters公司制造)
流动相：乙腈/乙酸乙酯/水/甲酸=600/300/60/40(体积比)
检测波长：471nm
流速：0.8mL/分钟
结果如图1所示。确认到：与含有比较例1的按照现有公知的方法得到的油状物的组合物(比较例5)相比，摄取含有实施例1的油状物的组合物(实施例14)后的肝脏中的虾青素的浓度高，被吸收至生物体内的吸收性高。

Claims (6)

1.虾青素组合物的制造方法，该方法包括：
使用5～10℃的有机溶剂(A)对含有虾青素的法夫酵母属酵母进行清洗的工序，以及
在35～60℃的温度、用有机溶剂(B)对清洗过的酵母中的虾青素进行提取的工序，其中，
法夫酵母属酵母进行过细胞破碎处理，
有机溶剂(A)为选自碳原子数3～6的酮及碳原子数1～6的醇中的至少1种，
有机溶剂(B)为选自碳原子数1～6的醇、及碳原子数5～8的脂肪族烃中的至少1种。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，有机溶剂(A)和有机溶剂(B)均为乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其进一步包括：
对得到的虾青素提取液进行浓缩使其成为油状组合物的工序。
4.根据权利要求3所述的制造方法，其中，得到的油状组合物中的虾青素含量为1～20重量％。
5.根据权利要求1或2所述的制造方法，其进一步包括：
使虾青素从得到的虾青素提取液中析出，并对得到的析出物进行固液分离而使其成为粉末组合物的工序。
6.根据权利要求5所述的制造方法，其中，得到的粉末组合物中的虾青素含量为20～80重量％。
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