CN101815790A

CN101815790A - 类胡萝卜素的制造方法

Info

Publication number: CN101815790A
Application number: CN200880104826A
Authority: CN
Inventors: 高桥季之; 内泽将太郎; 土肥英幸; 清水健太郎; 石崎友幸
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 2007-08-29
Filing date: 2008-08-29
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2028-08-29
Also published as: KR101154907B1; WO2009028643A1; EP2192191B1; JP4969370B2; AU2008292356A1; US20100291251A1; US10701957B2; CA2697670C; CN101815790B; CA2697670A1; EP2192191A1; JP2009050237A; EP2192191A4; KR20100063746A; AU2008292356B2

Abstract

本发明提供一种高含量含有高纯度、廉价且安全的类胡萝卜素的组合物及其工业制造方法，进一步，还提供含有该组合物的功能性食品、医药组合物或化妆品。另外，本发明提供类胡萝卜素含量在80％以上的组合物的制造方法，该制造方法的特征在于：在使用80℃以上的低级醇类、或80℃以上的水与低级醇类的组合对微生物培养物进行萃取处理之后，用低级醇类与水的组合对从萃取液中获得的沉淀物进行清洗、过滤。

Description

类胡萝卜素的制造方法

技术领域

本发明涉及类胡萝卜素的制造方法，特别涉及适于工业生产的虾青素的制造方法，所述虾青素用作食品、医药组合物或化妆品的成分。具体而言，本发明涉及用80℃以上的低级醇类、或80℃以上的水与低级醇类的组合对微生物培养物进行萃取处理的方法，该方法的特征在于，在进行上述萃取之后，用低级醇类和水的组合对从萃取液中获得的沉淀物进行清洗。此外，本发明涉及不使用除低级醇类以外的其它有机溶剂的、用来获得生物来源的污染物少的、含虾青素的类胡萝卜素含量至少为80％的组合物的制造方法。另外，本发明涉及由上述方法获得的含类胡萝卜素组合物、以及含有该含类胡萝卜素组合物的食品、医药组合物或化妆品。

背景技术

类胡萝卜素是自然界中广泛存在的天然色素，是从黄色到红色或紫色的多烯色素。虾青素是目前发现的天然类胡萝卜素中的1种，除了以游离状态或酯的形式存在以外，还以与蛋白质结合而成的各种色素蛋白质的形式存在。

虾青素被广泛用作鱼类、鸡蛋的提色剂。并且，还被视作一种食品添加剂而被广泛用于油脂加工食品、蛋白质性食品、水性液态食品等。另外，由于虾青素还具有对抗由自由基引发的脂质过氧化的抗氧化活性、高达α-生育酚的数百倍的单线态氧消除作用等，因此，其作为可发挥强效抗氧化活性的功能性食品、化妆品或医药品的用途备受期待。

虾青素不仅广泛分布于自然界，如大马哈鱼、鳟鱼、加级鱼等鱼类、蟹、虾、磷虾等甲壳类等，同时，还产生于属于土壤杆菌属、短杆菌属、副球菌属的细菌类、红球藻属(Haematococcus)绿藻类、法夫酵母属(Phaffia)酵母类等微生物。虾青素、玉米黄素等类胡萝卜素可通过化学合成法进行工业生产，但由于其存在安全方面的隐患，因此期待天然物来源的类胡萝卜素。

在这样的背景之下，已有众多关于适于大量生产藻类、含微生物来源的虾青素的类胡萝卜素类的制造方法。

例如，已报道了下述方法：对于红球藻藻类，在对培养后的藻类胞囊细胞进行热丙酮处理、使作为污染物的叶绿素洗脱之后，对该胞囊细胞进行喷雾干燥，再利用乙醇从所得的干燥细胞中萃取类胡萝卜素的方法(专利文献1)等。但是，由于利用上述制造方法获得的组合物中仍包含大量生物来源的污染物，因此无法满足对1)类胡萝卜素的含量、2)虾青素的含量等方面的要求。

为了获得虾青素含量较高的组合物，报道了下述方法：对于按上述方法获得的粗品胡萝卜素，在水存在下使脂肪酶发挥作用来分解污染物之一的中性脂质，并使该脂肪酶处理液发生油水分离，然后从分离得到的油层中蒸馏出游离脂肪酸、使其与虾青素分离，从而对上述粗品胡萝卜素进行浓缩提纯的方法(专利文献2)等。然而，即使实施如上所述的繁琐的处理步骤，仍然无法获得虾青素含量超过30％的产品。

此外，还报道了采用超临界流体萃取法获得0.5～60％含量的虾青素的方法(专利文献3)，但是，对于在该处理步骤中作为副产品生成的不足目标含量的虾青素级分，必须要将其废弃或进一步进行浓缩操作以提高其含量。因此，从简便性和经济性方面考虑，本制造方法仍不满足制造高纯度类胡萝卜素的工业生产方法的要求，所述高纯度类胡萝卜素是高含量地含有生物来源的污染物少的虾青素的胡萝卜素。

此外，作为使用法夫属酵母的方法，已报道了下述方法：用有机溶剂萃取该酵母的破碎菌体，并浓缩萃取液以获得油状的粗萃取物，再利用离子交换色谱、吸附色谱等对该粗萃取物进行提纯，以获得虾青素的方法(专利文献4)。由于该方法要利用多个柱色谱对低浓度的虾青素粗液进行提纯，因此很难实现工业化。

此外，作为其它方法，还报道了下述方法：用丙酮萃取培养后的法夫属酵母菌体，并浓缩所得萃取液以获得粗萃取物，再添加烃类溶剂使该粗萃取物发生晶体析出的制造方法(专利文献5)。该制造方法简便性高，但由于获得的组合物中类胡萝卜素的含量仅70～73％左右(虾青素含量为36～42％)，因此无法满足作为生物来源的污染物少的高纯度类胡萝卜素的制造方法的要求，此外，由于类胡萝卜素中残留的丙酮及烃类溶剂存在安全隐患，就这一点而言也无法满足要求。

另一方面，对于虾青素、金盏花黄质(ァドニキサンチン)等的生产菌株E-396株(FERM BP-4283：1993年4月27日保藏(原生物保藏日)，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6))，还报道了下述方法：使菌体与环状亲水性有机化合物接触来进行萃取处理的方法，但该方法在用于食品制造时就安全性而言存在隐患(专利文献6)；采用像专利文献3那样的超临界流体萃取的方法(专利文献7)；使E-396株与水溶性有机溶剂、非极性溶剂及水接触以进行液液萃取的方法(专利文献8)；等等。

基于上述背景，迫切渴望确立一种简便且低成本、无需特殊设备的方法。

专利文献1：日本特开平11-56346号公报

专利文献2：日本特开2002-218994号公报

专利文献3：日本特开2004-41147号公报

专利文献4：日本特开平10-276721号公报

专利文献5：日本特开2004-208504号公报

专利文献6：日本特开平7-242621号公报

专利文献7：日本特开平8-89280号公报

专利文献8：日本特开平8-253695号公报

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供一种使用廉价且安全的溶剂制造的、高含量含有高纯度类胡萝卜素的组合物及其工业制造方法，此外，还提供含有该组合物的功能性食品、医药组合物或化妆品。

解决问题的方法

为了解决上述问题，本发明人等针对微生物培养物进行了研究。结果发现了下述的新问题：作为一种简便、无须特殊的设备及复杂的操作、并且可使用对食品制造安全的溶剂来制造高含量地含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的工业生产方法，如果采用使用低级醇类、并在该溶剂的沸点以下进行萃取处理的方法，则必须要使用大量的溶剂来从菌体中萃取类胡萝卜素，因而无法以廉价实现该工艺。为了解决包括该问题在内的问题，本发明人等经过进一步的深入研究后发现：在利用80℃以上的低级醇类、或80℃以上的水与低级醇类的组合对微生物培养物进行萃取处理之后，在必要时对萃取液进行浓缩，通过用低级醇类与水的组合对所得沉淀物进行清洗，可以以极少的溶剂用量获得高纯度的类胡萝卜素组合物，并由此完成了本发明。

即，本发明包括以下各方面。

(1)含类胡萝卜素组合物的萃取方法，该萃取方法包括下述步骤：使用80℃以上的低级醇类、或80℃以上的水与低级醇类的组合对微生物培养物进行萃取处理的步骤。

(2)含类胡萝卜素组合物的制造方法，该制造方法包括下述步骤1)～4)：

1)使用80℃以上的低级醇类、或80℃以上的水与低级醇类的组合对微生物培养物进行萃取处理的步骤；

2)从所得萃取液中获得沉淀物的步骤；

3)用低级醇类清洗沉淀物的步骤；

4)进一步用水清洗沉淀物的步骤。

(3)含类胡萝卜素组合物的制造方法，该制造方法包括下述步骤1)～3)：

2)从所得萃取液中获得沉淀物的步骤；

3)用低级醇类清洗沉淀物的步骤。

(4)(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，低级醇类为乙醇。

(5)(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，含类胡萝卜素组合物中至少含有80％类胡萝卜素。

(6)(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，类胡萝卜素中至少含有40％虾青素。

(7)(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，与微生物的16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列是与SEQ ID NO：1记载的碱基序列基本上同源的碱基序列。

(8)(1)～(7)中任一项所述的方法，其中，微生物是E-396株(FERMBP-4283)或其变异株。

(9)采用(1)～(8)中任一项所述的方法获得的含类胡萝卜素组合物。

(10)(9)所述的含类胡萝卜素组合物，其中，类胡萝卜素为游离体。

(11)含有(9)或(10)所述的含类胡萝卜素组合物的食品、医药组合物或化妆品。

发明的效果

本发明可提供一种高含量含有天然物来源的、高纯度、廉价且安全的类胡萝卜素的组合物及其工业制造方法，此外，还可提供含有该组合物的功能性食品、医药组合物或化妆品。

发明的具体实施方式

以下，对本申请发明进行具体说明。但本发明的范围并不限于这些说明，除了下述示例之外，还可以在不偏离本发明的要点的范围内进行适当变更后实施。

需要说明的是，本说明书中引用的全部出版物，例如现有技术文献、公开公报、以及除了专利公报以外的其它专利文献中的全部内容并入本说明书中以供参考。本说明书包含作为本申请要求优先权的基础的日本特愿2007-222476号说明书中的内容。

作为可用于本发明的微生物，只要是生产类胡萝卜素的微生物则没有特殊限制，可使用副球菌属细菌、红球藻属藻类、法夫属酵母等。作为副球菌细菌，可列举例如Paracoccus carotinifaciens、马氏副球菌(Paracoccusmarcusii)、Paracoccus haeundaensis、Paracoccus zeaxanthinifaciens、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)、嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus)、Paracoccus kourii、盐脱氮副球菌(Paracoccus halodenitrificans)及嗜碱副球菌(Paracoccus alcaliphilus)。此外，作为红球藻属藻类，可列举例如雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)、湖泊红球藻(Haematococcus lacustris)、Haematococcus capensis、Haematococcus droebakensis及Haematococcus zimbabwiensis等。而作为法夫属酵母，可列举例如红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)。需要指出的是，可用于本发明的微生物并不限于上述列举的实例。

特别是，从增殖速度的快慢、类胡萝卜素类的生产性考虑，优选下述细菌，所述细菌的16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列与SEQ ID NO：1记载的碱基序列基本上同源。

考虑到测定DNA的碱基序列时的错误频率等，所述的基本上同源是指：序列具有94％以上、优选96％以上、更优选98％以上的同源性。在这样的细菌中，特别优选E-396株(FERM BP-4283)。此外，作为特别优选的实例，也可以使用下述菌株：对上述微生物进行变异处理、使得其类胡萝卜素生产性提高而选择出的类胡萝卜素高生产株。

这里，作为进行变异处理的方法，只要是用来诱发突变的方法则没有特殊限制。例如，可以采用下述方法：利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯(EMS)等变异剂的化学方法；利用紫外线照射、X射线照射等的物理方法；利用基因重组、转座子等的生物学方法等。该变异处理可以进行1次，此外，也可以进行2次以上的变异处理，例如，通过该突变处理得到虾青素生产微生物的变异体，然后，再对该变异体进行突变处理。

用于本发明的微生物培养物只要是利用能够有效地培养上述微生物的方法得到的培养物，则没有任何限制。所述能够有效地培养上述微生物的方法例如，使用下述的培养基，通过液体培养、固体培养、或它们的组合进行培养的方法。

作为在用于本发明的微生物的培养中使用的营养培养基，只要是含有生产菌生长繁殖所必须的碳源、氮源及无机盐的营养培养基即可，但有时还优选添加维生素类。此外，也有时还优选添加氨基酸、核酸碱基等。此外，也可以适当添加酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、麦芽提取物、玉米浸渍液、干酵母、大豆粕等。

作为碳源，可列举：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、麦芽糖等糖类，乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸、丙酮酸等有机酸，乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇、甘油等醇类，大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油、亚麻籽油等油脂类等，可以使用1种或2种以上的碳源。添加比例因碳源种类而异，只要进行适当调整即可，但通常为：相对于每1L培养基添加1～100g、优选2～50g。

作为氮源，可使用例如硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、氨、尿素等中的1种或2种以上。添加比例因氮源种类而异，只要进行适当调整即可，但通常为：相对于每1L培养基添加0.1g～30g、优选1～10g。

作为无机盐，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙、碳酸钠等中的1种或2种以上。添加比例因无机盐的种类而异，只要进行适当调整即可，但通常为：相对于每1L培养基添加0.001～10g。

对于添加维生素类的情况，添加比例因维生素类的种类而异，只要进行适当调整即可，但通常为：相对于每1L培养基添加0.1～1000mg、优选1～100mg。

氨基酸、核酸碱基、酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、麦芽提取物、玉米浸渍液、干燥酵母、大豆粕等的添加比例因物质的种类而异，只要进行适当调整即可，但通常为：相对于每1L培养基添加0.2g～200g、优选3～100g。

培养基的pH调整为2～12、优选6～9。培养条件为15～80℃、优选20～35℃的温度，通常培养1日～20日、优选2～8日，在需氧条件进行培养。作为需氧条件，可列举例如振荡培养或通气搅拌培养等。

在萃取用于本发明的培养微生物所产生的虾青素时，作为更优选的实例，可列举：在培养后，将培养液、或从培养液中获得的菌体浓缩液、湿菌体或干燥菌体用于下述萃取处理。所述菌体浓缩液可以通过例如对培养液进行膜过滤浓缩而获得，所述湿菌体可以通过采用离心分离、加压或减压过滤等公知的过滤方法处理培养液而获得。进一步，还可以通过采用喷雾干燥、流动干燥、旋转鼓式干燥或冷冻干燥等公知的干燥方法使该湿菌体干燥来获得干燥菌体。此外，在进行下述萃取之前，还可以在培养液、菌体浓缩液、湿菌体或干燥菌体阶段进行下述处理中的1种或2种以上：使用碱性试剂、表面活性剂等的化学处理，使用溶菌酶、脂质分解酶及蛋白质分解酶等的生物化学处理，或超声波、粉碎等物理处理。其中，对于获得了该干燥菌体的情况，可以认为，在1g干燥菌体中含有约20mg左右的虾青素。

作为在本发明的萃取及清洗中使用的溶剂，可列举低级醇类，例如，可列举碳原子数1～6、优选碳原子数1～3的低级醇，具体而言，优选乙醇、甲醇、异丙醇等，尤其优选使用乙醇。此外，也可以将上述低级醇中的2种以上混合使用。萃取时低级醇类的温度至少为80℃、优选在80℃以上，更优选在85℃以上，更加优选在90℃以上，尤其优选在93℃以上。

其中，所述“至少”是指，最低限度保持萃取时低级醇类的温度的作为基准的温度。

该萃取时的温度关系到含有虾青素的类胡萝卜素在乙醇中的溶解度的提高，是用以提高萃取效率的重要因素。另外，萃取时低级醇类的上限温度优选在150℃以下、更优选在130℃以下、更加优选在120℃以下、尤其优选在110℃以下、最优选在100℃以下。该上限温度对于抑制含有虾青素的类胡萝卜素的热分解尤为重要。因此，在本发明的萃取中使用的低级醇类的温度范围为：例如，80℃～150℃，优选85℃～120℃，更优选萃取时的低级醇类的温度为90℃～110℃，尤其优选在95℃左右。

此时，由于需要溶剂的沸点以上或沸点附近的温度，因此必须要在密闭式的压力容器内进行处理。此时，进行处理时的最大压力以表压计在0.8MPa以下、优选在0.4MPa以下、更优选0.2MPa以下。

作为低级醇类的量，根据萃取时的温度而确定，只要是可以将菌体内所含的虾青素量溶解的量即可，对于使用低级醇类从干燥菌体中进行萃取的情况，相对于菌体内所含的虾青素量1g，低级醇的量为300～3,000g、优选500～2,000g、更优选800～1,600g。

例如，对于从上述包含约20mg虾青素的干燥菌体1g中进行萃取的情况，当在95℃的乙醇中进行萃取时，可使用5g～100g左右量的乙醇、优选8g～60g、更优选10g～35g左右的量的乙醇。

萃取时，如果添加水，可以使从菌体中萃取色素变得容易，因此，可以向低级醇类中加水进行萃取。向低级醇类中加水时，添加低级醇类的容量的1/400～1/5左右、优选1/300～1/10左右、更优选1/200～1/15。

另外，通过在加入低级醇类之前添加水，可使干燥菌体表面湿润、随后添加的低级醇类容易进入菌体内，从而使类胡萝卜素的萃取效率提高5～10％左右。因此，对于添加水的情况，优选在向干燥菌体中加入低级醇类之前添加水。此外，也可以将低级醇与水混合，将该混合物用于萃取。对于混合比例并无特殊限制，可以是1∶10～1∶100、优选1∶20～1∶40。

对于使用干燥材料的情况，优选添加水；但对于从诸如活菌、活试验体等水分含量较多的试验体中进行色素萃取的情况，如果添加水，会导致低级醇类的浓度降低，萃取效率下降。因此，必须要对欲进行萃取的材料中的水分含量进行考察，以确定是否添加水。

在萃取操作中，对于对防止类胡萝卜素的氧化要求较高的情况，可以在氮气等非活泼气体氛围中进行处理，此外，还可以选取可用于医药品、食品的抗氧剂并添加至萃取溶剂中进行处理。或者，也可以将这些处理组合。

希望上述抗氧剂最终从类胡萝卜素组合物中除去，但根据所使用的抗氧剂种类(例如，维生素C)，也有无需除去的抗氧剂。

另外，为了最大程度地防止类胡萝卜素在光作用下发生分解，可以在无光照的条件下进行处理。

此外，对于萃取时间并无特殊限制，为了减轻因热分解引起的产率降低，优选进行短时间处理，优选进行120分钟以内萃取，更优选60分钟以内，尤其优选30分钟以内。

可以采用任意方法将萃取操作后的萃取液从微生物中分离出来，可以采用膜过滤、离心分离、倾析等，工业生产中优选采用离心分离。另外，对于工业生产的情况，对分离温度并无特殊限制。当在80℃以上的高温下进行萃取、并使溶解于低级醇类中的类胡萝卜素色素暂时达到过冷状态时，即使冷却至-20℃～70℃也不易在短时间内析出，因此在低温下也可以将萃取液稳定地分离。

作为用低级醇类对微生物培养物进行萃取处理后从所得萃取液中获取沉淀物的方法，通常可列举加热和/或减压浓缩、或沉淀化的方法。除此之外，也可以通过在低温下使类胡萝卜素色素析出，利用酸、碱试剂或各种盐类使类胡萝卜素色素析出，从而在不进行浓缩的情况下分离出类胡萝卜素色素。另外，本操作中的过冷状态可通过在常温下放置1小时以上来解除，以使类胡萝卜素色素析出。此时，还可以通过进行搅拌或施加振动来加快过冷状态的解除。这里，由于过冷状态会因萃取温度不同而发生变化，因此，要根据萃取温度来选择过冷解除条件。

通过进行这些操作，可获得游离体的反式(トランス型)类胡萝卜素。并且，当通过上述操作解除过冷状态时，游离体的反式虾青素难溶于常温乙醇，即使添加乙醇也不会溶解而是呈悬浮状态。

以浓缩类胡萝卜素色素的情况为例，可根据所得沉淀物的量和纯度来适当确定浓缩的程度，例如，萃取液以重量计可浓缩10倍～1000倍、优选30倍～500倍、更优选50倍～400倍、尤其优选100倍～200倍。最优选将萃取液中的溶剂完全蒸馏除去，以使类胡萝卜素色素干燥。

此外，浓缩萃取液所得到的馏出液可以直接循环至从微生物培养物中进行萃取的步骤进行再利用。

用于工业生产时，优选进行沉淀化。例如，可通过对溶液进行冷却、或通过添加降低溶质的溶解度的新溶剂、或者通过使pH改变来进行沉淀化。

为了对干燥沉淀物、经过浓缩的沉淀物或经过晶析的沉淀物进行清洗，可根据需要使用少量的低级醇类进行悬浮搅拌。在解除过冷后使沉淀物悬浮的低级醇类的量，优选在考虑沉淀物的纯度的同时选择工业生产可接受程度的量。例如，相对于每1g干燥的沉淀物，可以使用2倍量左右的少量低级醇量，也可以在该量以上，优选使用4倍量以上、更优选8倍量以上、进一步优选16倍量以上，也可以根据需要而使用32倍量以上。使用经过浓缩的沉淀物时，可以预先对未干燥物的容量或重量与干燥后沉淀物的重量之间的相关关系进行研究，以设定换算系数，并使用通过该换算系数计算出的干燥物的重量。

为了提高沉淀物的纯度，可以进行超声波或粉碎等物理处理以使沉淀物成为更为微细的状态并分散于低级醇类中。关于进行本操作时的具体条件，根据所得沉淀物的纯度来适当确定即可。

对于清洗的方法没有任何限定，作为就实用性而言的优选方法，可列举例如在悬浮搅拌后进行过滤的方法，或从沉淀物上方流通液体的方法等。清洗时的温度通常优选在1℃～30℃范围，也可以视情况而设定为低于1℃或高于30℃的温度。这里，作为上限温度，可列举能够提高在低级醇类中的溶解度的、低级醇类沸点附近的温度，优选沸点以下的温度。

此时，在利用低级醇类进行清洗时，游离体的反式虾青素显示难溶性，而在高温下发生顺式化而得到的顺式虾青素会显示对乙醇的易溶性，因此，通过进行过滤清洗，仅游离体的反式虾青素以固体形式残留，由此可以与顺式化的顺式虾青素向区别。本说明书中使用的所述游离体的虾青素指的是，虾青素未与脂肪酸形成酯键，在其基本结构中存在2个羟基的状态。

在为了从沉淀物中获得高纯度类胡萝卜素而进行清洗时，可采用蒸馏、减压蒸馏等方法从清洗产生的废液中回收所使用的低级醇类，并将该回收的低级醇类再次作为用于清洗的溶剂使用。

此外，为了减少经清洗、干燥后本发明的含类胡萝卜素组合物中的残存溶剂量，可以在清洗的最后增加下述步骤：用水进行清洗以进行溶剂置换的步骤。

通过进行该水清洗操作，可以除去水可溶性级分，从而，可将类胡萝卜素的纯度提高2～10％左右。

可以通过适当改变上述精制步骤的条件来进行对由上述制造方法获得的含类胡萝卜素组合物中类胡萝卜素含量、及虾青素等主成分的含量的调整，从而达到产量的最大化。本发明的含类胡萝卜素组合物中类胡萝卜素的含量由菌体内的类胡萝卜素中的虾青素量确定。本发明获得的含类胡萝卜素组合物中类胡萝卜素的含量至少为80％，例如，可以在80％以上、优选85％以上、更优选88％以上、最优选90％以上。该类胡萝卜素中的虾青素含量至少为40％，例如，可以在40％以上、优选43％以上、更优选44％以上、最优选48％以上。

其中，所述“至少”是指，组合物中最低限度含有类胡萝卜素的基准值。对于虾青素的情况也相同。

如果使用E-396株或其变异株作为上述菌体，则可获得下述含类胡萝卜素组合物：相对于组合物中的全部类胡萝卜素量，所含的虾青素占40％以上。

本发明的制造方法的特征如下：在如上所述地利用80℃以上的低级醇类、或80℃以上的水与低级醇类的组合对微生物培养物进行萃取处理之后，对该萃取液进行浓缩干燥等得到沉淀物，再用低级醇类及水对所得沉淀物进行清洗。仅通过进行上述极为简便的操作即能够以高纯度获得类胡萝卜素，并可通过在高温下进行萃取来使所使用的溶剂量显著降低。

与现有技术相比，本发明的方法因下述三方面而显示出工业性方面的显著优势：1)无须繁琐的操作；2)无须进行低效的精制操作，如对低浓度溶液进行高纯度化的操作；3)无须使用大量溶剂来进行萃取。此外，就本发明的效果而言，因存在下述优势--4)可廉价地提供以高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素组合物；5)可以简单地对各步骤中使用的溶剂进行回收并能够进行再利用，从而可提供优异的工业制造方法。

含有本发明的含类胡萝卜素组合物的食品、医药组合物或化妆品也属于本发明的范畴内。

对于含有由本发明的制造方法制造的高含量地含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的医药品，作为其剂型，可列举散剂、颗粒剂、丸剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片、速崩片、糖浆、液剂、混悬剂、栓剂、软膏、乳剂、凝胶剂、粘附剂、吸入剂、注射剂等。这些制剂可由常规方法制备，但由于类胡萝卜素难溶于水，因此可以将其溶解于植物油、动物油等疏水性有机溶剂中，或利用匀浆机(高压匀浆机)将其与乳化剂、分散剂或表面活性剂等一起分散于水溶液中，并使其乳化、或升温使其溶解后使用。此外，为了提高类胡萝卜素的吸收性，也可以将其微粉碎至平均粒径1微米左右后使用。

作为可以用于形成制剂的添加剂，可列举例如：大豆油、藏红花油、橄榄油、胚芽油、葵花籽油、葡萄籽油、牛脂、沙丁鱼油等动植物油，聚乙二醇、丙二醇、甘油、山梨糖醇等多元醇，山梨糖醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯等表面活性剂，精制水、乳糖、淀粉、结晶纤维素、D-甘露醇、卵磷脂、阿拉伯胶、山梨糖醇液、糖液等赋形剂，其它的甜味料、色素、pH调节剂、香料等。其中，液体制剂可以是在服用时溶解或悬浮于水或其它适当溶剂中的形式；而片剂、颗粒剂可以是用公知的方法包覆的形式，也可以是由溶胶状或凝胶状物质等包覆的形式。

以注射剂的形式给药时，优选静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、经皮、关节内、滑液囊内、泡内(in bullla)、骨膜内、舌下、口腔内等给药，尤其优选静脉内给药或腹腔内给药。静脉内给药可以是滴注给药、推注给药中的任一种。

将类胡萝卜素用作医药品时，其用法及用量为：成人每日1mg～3g、优选3mg～1g、更优选10mg～670mg。按体重1kg换算，则分别为17μg～50mg、54μg～17mg、160μg～12mg。上述用量可以1次或分多次给药。但就药学有效量、给药方法或给药手段、以及给药间隔而言，本领域技术人员可根据给药对象的临床状态、性别、年龄、体重等适当设定。

作为包含本发明的高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的食品形态，可列举例如：滋补品(散剂、颗粒剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片、速崩片、糖浆、液剂等)、饮料(茶、碳酸饮料、乳酸饮料、运动饮料等)、点心(软糖(Gummi)、果冻、口香糖、巧克力、小甜饼干、糖果等)、油、油脂食品(蛋黄酱、调味汁、黄油、乳脂、人造黄油等)、调味料(番茄酱、沙司等)、流动食、乳制品(牛乳、酸奶、乳酪等)、面包类、面类(乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面(pasta)、炒面、扁面条、挂面、冷面、米粉等)等。但不限于这些形态。

作为含有本发明的高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的功能性食品，可根据需要配合各种营养素、各种维生素类(维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B 12、维生素C、维生素E等)、各种矿物质类、食物纤维、多元不饱和脂肪酸、其它营养素(辅酶Q10、卡尼丁、芝麻素、α-硫辛酸、肌醇、D-构型肌醇、松醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰DHA、磷脂酰肌醇、牛磺酸、葡糖胺、硫酸软骨素、S-腺苷蛋氨酸(Adenosylmethionine)等)、分散剂、乳化剂等稳定剂、甜味料、呈味成分(柠檬酸、苹果酸等)、香味调料、蜂王浆、蜂巢蜡胶、蘑菇(Agaricus)等。此外，还可以配合薄荷、香柠檬素、甘菊、薰衣草、百里香等香草类。此外，还可以配合茶氨酸、脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone)、褪黑激素等材料。

作为含有本发明的高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的化妆品，可列举乳脂、乳液、化妆水、微乳精化、沐浴剂等，也可以混合香料等。

将类胡萝卜素用作食品或滋补品时，对于其用法及用量并无特殊限制，按体重1kg换算，其用量为17μg～50mg、优选54μg～17mg、更优选160μg～12mg。

此外，将类胡萝卜素用作化妆品时，每100g化妆品可配合10μg～5g、优选10μg～2g、更优选10μg～1g量的类胡萝卜素。

实施例

结合实施例、参考例、制剂例及试验例对本发明进行说明，但本发明的范围并不限于下述实例。

需要说明的是，实施例及比较例中的虾青素和类胡萝卜素的定量采用高效液相色谱法(HPLC)进行。使用的色谱柱由2根Wakosil-IISIL-100(

4.6×250mm)(和光纯药制)连接而成。洗脱的流动相为正己烷-四氢呋喃-甲醇混合液(40∶20∶1)，通过使该流动相在室温附近的恒定温度下以每分钟1.0mL的流速流动来进行洗脱。在测定中，用四氢呋喃将样品溶解后，用流动相稀释100倍，取20μL该稀释液作为进样量，在波长470nm下进行色谱柱洗脱液的检测。此外，使用Sigma公司制造的虾青素(Cat.No.A9335)作为定量用标准品。对于标准液中的虾青素浓度，在测定标准液于477nm的吸光度(A)、及上述条件下进行HPLC分析时虾青素峰的面积百分率％(B)之后，利用下式进行了设定。

虾青素的浓度(mg/L)＝A÷2150×B×100

[实施例1]高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的制造1

步骤1：乙醇萃取步骤

对于培养E-396菌株(FERM BP-4283)而得到的、每1g中含20mg虾青素的干燥菌体13g，向其中添加200g乙醇，在高压容器内、经过了氮气置换的气体氛围中，于95℃搅拌30分钟的同时进行了含虾青素的类胡萝卜素的萃取。冷却至30℃之后，过滤除去菌体，再用乙醇对菌体滤饼进行清洗，从而得到了含虾青素0.14％(wt/wt)、类胡萝卜素重量浓度0.36％(wt/wt)的萃取液300g。

步骤2：萃取液浓缩及析出步骤

用蒸发器对本实施例的步骤1中获得的萃取液300g进行减压浓缩，得到了含沉淀物的浓缩干燥物(约2g)和馏出液(约300g乙醇)。

步骤3：沉淀物滤取、清洗及干燥步骤

向本实施例的步骤2中获得的浓缩干燥物约2g中添加20g乙醇进行悬浮清洗，并过滤。然后，再用10g水对过滤物进行清洗之后，进行常温减压干燥，得到了0.2g沉淀物的干燥物。该干燥物中虾青素及类胡萝卜素的含量分别为43％和86％。

[实施例2]高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的制造2

步骤1：乙醇萃取步骤

对于培养E-396菌株(FERM BP-4283)而得到的、每1g中含20mg虾青素的干燥菌体13g，向其中添加乙醇200g和水10g，在高压容器内、经过了氮气置换的气体氛围中，于95℃搅拌30分钟的同时进行了含虾青素的类胡萝卜素的萃取。冷却至30℃之后，过滤除去菌体，再用乙醇对菌体滤饼进行清洗，从而得到了含虾青素0.16％(wt/wt)、类胡萝卜素重量浓度0.38％(wt/wt)的萃取液300g。

步骤2：萃取液浓缩及析出步骤

步骤3：沉淀物滤取、清洗及干燥步骤

向实施例1的步骤2中获得的浓缩干燥物约2g中添加20g乙醇进行悬浮清洗，并进行过滤。然后，再用10g水对过滤物进行清洗之后，进行常温减压干燥，得到了0.2g沉淀物的干燥物。该干燥物中虾青素及类胡萝卜素的含量分别为48％和88％。

[实施例3]高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的制造3

步骤1：乙醇萃取步骤

对于培养E-396菌株(FERM BP-4283)而得到的、每1g中含20mg虾青素的干燥菌体13g，按照实施例2的步骤1的方法进行类胡萝卜素的萃取和过滤，得到了300g萃取液。

步骤2：萃取液浓缩及析出步骤

按照实施例1的步骤2的方法进行类胡萝卜素的萃取和过滤后，得到了300g萃取液。按照实施例1的步骤2的方法对该萃取液进行减压浓缩，得到了约2g浓缩干燥物。

步骤3：沉淀物滤取、清洗及干燥步骤

向实施例3的步骤2中获得的浓缩干燥物约2g中添加20g乙醇进行悬浮清洗，并进行过滤。然后，进行常温减压干燥，得到了0.25g沉淀物的干燥物。该干燥物中虾青素及类胡萝卜素的含量分别为44％和80％。

可以确定：在免去用水进行清洗的步骤的情况下，虽然纯度降低，但回收量有所增加。

[实施例4]高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的制造4

向大马哈鱼肉样品中添加少量乙醇，用食物加工器将大马哈鱼制成肉馅(mince)状后，按照实施例1的步骤1的方法进行了类胡萝卜素的萃取和过滤，得到了萃取液。按照实施例1的步骤2的方法对该萃取液进行减压浓缩，得到了浓缩干燥物。按照实施例1的步骤3的方法从该浓缩干燥物中滤取沉淀物、并进行清洗及干燥，得到了干燥物。对该干燥物进行分析的结果，类胡萝卜素含量为大马哈鱼中所含类胡萝卜素的60％。

已知在从鱼肉样品中萃取类胡萝卜素时，要进行反复萃取，本法中进行1个循环的类胡萝卜素萃取方法得到的类胡萝卜素的量与按照常规方法进行类胡萝卜素萃取的第1萃取循环所得到的类胡萝卜素的量等同。

[实施例5]使用了回收溶剂的高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的制造1

向与实施例1相同的E-396株的干燥菌体13g中添加在实施例1的步骤1中获得的馏出液(乙醇)200g，按照实施例1的步骤1的方法进行了类胡萝卜素的萃取和菌体过滤，得到了300g萃取液。按照实施例1的步骤2的方法对该萃取液进行减压浓缩，得到了约2g浓缩干燥物。按照实施例1的步骤3的方法从该浓缩干燥物中滤取沉淀物、并进行清洗及干燥，得到了0.2g干燥物。该干燥物中虾青素及类胡萝卜素的含量分别为43％和86％。

根据以上可以确定：回收的乙醇的再利用完全没有问题。

[实施例6]使用了回收溶剂的高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的制造2

向与实施例1相同的E-396株的干燥菌体13g中添加在实施例1的步骤1中获得的馏出液(乙醇)200g，按照实施例1的步骤1的方法进行了类胡萝卜素的萃取和菌体过滤，得到了300g萃取液。按照实施例1的步骤2的方法对该萃取液进行减压浓缩，得到了约2g浓缩干燥物。向该浓缩干燥物中添加在实施例1的步骤2中获得的回收乙醇20g，进行了悬浮、过滤。然后，用10g水对过滤物进行清洗之后，进行常温减压干燥，得到了0.2g沉淀物的干燥物。该干燥物中虾青素及类胡萝卜素的含量分别为43％和86％。

根据以上可以确定：将减压蒸馏回收的乙醇用于清洗步骤完全没有问题。

[食品例1]人造黄油

作为抗氧化剂及着色剂，在将实施例1中获得的虾青素组合物添加到植物油中、使其占人造黄油的5重量％之后，与乳化剂等一起搅拌至均一，并利用常规方法制成了人造黄油。该人造黄油与通常的人造黄油相比，因虾青素的存在而略呈红色。

[食品例2]橄榄油

将实施例1中获得的虾青素组合物添加到植物油中、使其占橄榄油的0.25重量％之后，在50℃进行搅拌以使其溶解，再冷却至常温。该橄榄油与通常的橄榄油相比，因虾青素的存在而略呈红色。另外，通过改变虾青素组合物的添加量，可使颜色的深浅发生改变。并且，虾青素一旦溶解后，在放置长时间之后也未发生析出。

[制剂例1]含虾青素的片剂

相对于实施例1中得到的含类胡萝卜素组合物120重量份，使用了结晶纤维素330重量份、羧甲基纤维素钙15重量份、羟丙基纤维素10重量份及精制水60重量份，按照常规方法进行混合、干燥之后，添加10重量份的硬脂酸镁进行制片，得到了每片中含有20mg含类胡萝卜素组合物的片剂100mg。

[制剂例2]含虾青素的软胶囊

将实施例1中得到的含类胡萝卜素组合物1重量份悬浮于5重量份的大豆油中、使其充分混合至均一之后，用胶囊填充机进行胶囊填充，得到了内容物约300mg的红褐色胶囊。

[化妆品例1]含虾青素的乳剂(化妆品)

将实施例1中得到的含虾青素的组合物添加至白色凡士林中、使其达到10重量％后，与芳香剂等一起分散至均一，用常规方法制作了乳剂。

工业实用性

根据本发明，可以提供一种高含量含有天然物来源的高纯度、廉价且安全的类胡萝卜素的组合物及其工业制造方法，并由此提供含有该组合物的功能性食品、医药组合物或化妆品。

序列表独立文本(free text)

SEQ ID NO：1：对未知生物(E-396)的说明

序列表

<110>新日本石油株式会社(Nippon Oil Corporation)

旭化成制药株式会社(Asahi Kasei Pharma Corporation)

<120>类胡萝卜素的制造方法

<130>PCT08-0039

<150>JP 2007-222476

<151>2007-08-29

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1452

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>未知生物的记载：E-396

<220>

<221>misc_feature

<222>(1350)..(1350)

<223>n是a，c，g，或t

<400>1

agtttgatcc tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcga 60

gaccttcggg tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg 120

aatagccccg ggaaactggg agtaataccg tatacgccct ttgggggaaa gatttatcgg 180

agaaggatcg gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240

atccatagct ggtttgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300

ctacgggagg cagcagtggg gaatcttaga caatgggggc aaccctgatc tagccatgcc 360

gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttca gctgggaaga taatgacggt 420

accagcagaa gaagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct 480

agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggactggaaa gtcagaggtg 540

aaatcccagg gctcaacctt ggaactgcct ttgaaactat cagtctggag ttcgagagag 600

gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc 660

gaaggcggct cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 720

attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc cagacgtcgg caagcatgct 780

tgtcggtgtc acacctaacg gattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 840

aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900

aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat ggcaggaccg ctggagagat tcagctttct 960

cgtaagagac ctgcacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc 1020

ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccacg tccctagttg ccagcaattc agttgggaac 1080

tctatggaaa ctgccgatga taagtcggag gaaggtgtgg atgacgtcaa gtcctcatgg 1140

gccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggtt aatccccaaa 1200

agccatctca gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca tgaagttgga atcgctagta 1260

atcgcggaac agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320

accatgggag ttggttctac ccgacgacgn tgcgctaacc ttcggggggc aggcggccac 1380

ggtaggatca gcgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg 1440

gatcacctcc tt 1452

Claims

1.萃取含类胡萝卜素组合物的方法，该萃取方法包括下述步骤：使用80℃以上的低级醇类、或80℃以上的水与低级醇类的组合对微生物培养物进行萃取处理的步骤。

2.制造含类胡萝卜素组合物的方法，该制造方法包括下述步骤1)～4)：

2)从所得萃取液中获得沉淀物的步骤；

3)用低级醇类清洗沉淀物的步骤；

4)进一步用水清洗沉淀物的步骤。

3.制造含类胡萝卜素组合物的方法，该制造方法包括下述步骤1)～3)：

2)从所得萃取液中获得沉淀物的步骤；

3)用低级醇类清洗沉淀物的步骤。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述低级醇类为乙醇。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述含类胡萝卜素组合物是含有至少80％的类胡萝卜素的组合物。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述类胡萝卜素是含有至少40％的虾青素的类胡萝卜素。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，与所述微生物的16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列是与SEQ ID NO：1记载的碱基序列基本上同源的碱基序列。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述微生物是E-396株(FERM BP-4283)或其变异株。

9.采用权利要求1～8中任一项所述的方法获得的含类胡萝卜素组合物。

10.根据权利要求9所述的含类胡萝卜素组合物，其中，类胡萝卜素是游离体。

11.含有权利要求9或10所述的含类胡萝卜素组合物的食品、医药组合物或化妆品。