JPH02504101A - アスタキサンチン生産性酵母細胞，その製造方法及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アスタキサンチン生産性酵母細胞、 その製造方法及びその使用 本発明は、アスタキサンチン生産性酵母細胞株、その製造方法、その培養方法、 及び該酵母細胞からアスクキサンチンを単離する方法に関する。さらに、本発明 は、アスタキサンチン生産性酵母細胞又はそれから回収されたアスタキサンチン を含有する食品又は飼料、並びに食品又は飼料の製造方法及び該飼料による動物 の飼育方法に関する。

サケ又はマスのごとき遡行魚類の肉の赤色が、該魚類によって消費される食餌中 に存在するアスタキサンチンのごとき赤色色素に基くごとが知られている。天然 環境において、魚はその赤色を甲殻類又は他のアスタキサンチン含有生物から得 るが、しかし養魚場で飼育される場合、魚はこれらの天然色素源に接近せず、そ してそれ故に赤色色素が飼料中に供給されない限り魅力的な赤色を獲得しない。

従って、甲殻類廃棄物から単離された又は合成的に製造されたアスタキサンチン 、及びカンタキサンチンのごとき他の合成赤色色素が魚餌中の成分として使用さ れてきた。しかしながら、幾つかの国においては動物飼料中でのカンタキサンチ ンの使用は禁止されており、そして合成的アスタキサンチン製造及び天然アスタ キサンチンの単離方法はどちらかと言えば高価であり、そしてしばしば季節的変 動にさらされる。

他の天然アスクキサンチン源が知られており、特に酵母ファフィア・ロドチーマ （Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈμ謹上駐）及び若干の微小藻類、例えば緑藻クラミドモ ナス・ニバリス（Ｃｈｌａａ＋　ｄｏｍｏｎａｓ紅ｍｌ旦）の単細胞群が挙げら れる（Ｇｅｒｔ　Ｍｎｏｔｓｏｎら、ｒＰｉｇｍｅｎｔｅｒｉｎｇ　ｏｆ　１ａ ｋｓ　ｗｅｄ　ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ　ｆｒａ　ｍｉｋｒｏａｌｇｅｒ」。

Ｎｏｒｓｋ　Ｆｉｓｋｅｏｐｄｒａｅｔ＋　Ｎｏ３．　４　６頁、５５（１９８ ０）　）　、これらの生物によって生産されるアスタキサンチンは遡行魚類に好 ましい赤色を付与することが示されている（Ｅｒｉｃ　Ａ、Ｊｏｈｎｓｏｎら、 　ｒＰｈａｆｆｉａ　０ｊ息上姐ａｓ　ａｎ　ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ　５ｏｕ ｒｃｅ　ｉｎｓａｌｍｏｎｉｄ　ｄｉｅｔｓ」、　Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ　２ ０＋　１２３　１３４頁（１９８０）及びＪＰ−Ａ　５７−２０６３４２）。し かしながら、魚の栄養として大量の酵母細胞の使用は望ましくない。なぜなら、 この飼料は効率的に変化しないからである。他方、生物により生産されそしンチ ンの量は所望の着色を得るためには十分でなく、そして既知の方法による酵母か らのアスタキサンチンの単離はどちらかと言えばコスト高である。

しかしながら、もしこれらの生物からのより高いアスタキサンチン生産性が得ら れるなら、季節条件に依存しない有利なアスタキサンチン製造が可能であろう。

本発明は、動物肉の着色又は動物の生産が望まれる遡行魚類及び他の動物のため の飼料として又は飼料中で使用することができる程十分に高い濃度でアスタキサ ンチンを含有する酵母細胞を提供する。本発明はさらに、アスタキサンチン含有 酵母細胞、特に高含量のアスクキサンチンを存する前記酵母細胞からアスタキサ ンチンを得るための魅力的な方法を提供する０本発明の重要な観点は、アスタキ サンチン生産性細胞を培養するための特定の方法、及び／又はアスタキサンチン 生産の本来の能力が改善されている変異株の提供に基いている。

従って、本発明の１つの観点は、５０ｍｅの培地を収容しており２枚のバフフル を有する、１５０ｒｐｍの回転振とうにかけられた５００１１１の振とうフラス コ中で、３０１１＋０＋０１　／　ｉ、　／時の酵素移動速度、ディフコＹＭ培 地で２０〜２２°Ｃにて５日間、接種量がＹＭ−培地中４日間培養物１００ｍ、 の条件下で増殖した場合に、２０−のメタノール中０．２　ｇの酵母乾物の懸濁 液を氷水による冷却ジャケットを有する、直径０．４　ｍｍのガラスポール１５ ｇを含むガラスボールミル中で２０℃以下の温度で、０．５分間の間隔で５×１ 分行われる破砕にかけることにより調製された酵母のメタノール抽出物に対する 、標準として純粋なアスタキサンチンを用いるＨＰＬＣ分析により決定された場 合に、酵母乾物ｇ当り３００．ｇ以上の量でアスタキサンチンを生産する酵母細 胞に関する。

前記の増殖条件及び測定条件は、得られた結果が問題の酵母の本来のアスタキサ ンチン生産能力を反映するように増殖及び試験方法を標準化するために与えられ る。この方法は、本件出願人会社により行われた幾つかの実験により、実施する のが容易で適切で且つ再現性のある方法であることが見出された。この測定方法 は従来文献において使用されているそれとは同一でないことに注目すべきである 。文献、例えばＥｒ１ｃ　Ａ、Ｊｏｈｎｓｏｎら、　’Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ 　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔＰｈａｆｆｉａ　ｊ副止込ｖ ｌＪ　Ｉ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｌＩｌｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｏｇｙ１１５、１９７９．１７３−８３頁、において今まで使用された方法は１ Ωキユベツトにおけるアセトン中１％（Ｗ／Ｖ）？ｇ液Ｏ吸収１６００に基いて おり、他方Ｈｏｆｆｔｎａｏ−Ｌａ　Ｒｏｃｈｅからのアスクキサンチン標準を 測定することにより得られる値は２１００である。

この値は出願人会社自身の測定及びＨｏｆｆｍａｎ−Ｌａ　Ｒｏｃｈｅにより提 供された情報に基いている。

さらに、既知の測定方法は酵母の全色素含量を測定し、他方本出願において使用 される前記の標準法はアスタキサンチン含量のみを測定する。前記の標準化され た方法により得られる値を文献中に記載されている値と比較する場合、文献中に 記載されている値は前記の標準化された方法により得られる真の値よりかなり高 いことを心に留めておくべきである。

従って、本発明の全色素含量を文献の記載と比較する場合、文献に記載されてい る全色素含量を１６００／２１００で乗することにより吸光係数の差の補正を行 うべきである。

前記の増殖条件は、本来のアスタキサンチン生産能力の測定のために再現性があ り且つ有意義であることが本件出願人会社により見出されているものである。酵 母菌株の本来のアスクキサンチン生産能力を測定するために使用される増殖及び 測定条件のより詳細な説明は実施例と関連させて記載する。

本発明の酵母細胞は好ましくはファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属に属する酵母細 胞であり、そして特に現在知られている唯一のフ７フィアの種であるファフィア ・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ劫Δ立上駐）種に属するものである。

現在、フ７フィア・ロドチーマはアスタキサンチンを生産することが知られてい る唯一の酵母である。野性型Ｐ、ロドチーマは落葉樹の浸出物から単離され、そ してこの様な野性型株のサンプルはアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクシ ョン（Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）に寄託番号ＡＴＣＣ２４２６１として寄託されている。

Ｐ、ロドチーマの栄養細胞は異形担子菌酵母（ｈｅｔｅｒｏｂａ−ｓｉｄｉｏｍ ｙｃｅｔｏｕｓ　ｙｅａｓｔ）のように出芽を形成する。厚膜胞子が出芽によっ て出現するが、前菌糸体及び真の胞子形成は起らない、厚膜胞子は、栄養細胞よ り脂質含量の多い比較的大きな球形細胞である。三核菌糸及び冬胞子の形成を得 るために種々の株を交配せしめる試は成功していない。従って、Ｐ。

ロドチーマはフ゛ラストミセーテス（且ｊ違ｆｉ虹翌）目のドイテロミコチナ（ Ｄｅｕ　ｔｅｒｏｍｙｃｏ　ｔ　ｉｎａ　）属に分類されている（Ｉｎｔｅｒｎ ａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒ ｉｏｉｏｇｙ　２６：２、１９７６、２８６−２９２頁、Ｍ、Ｗ、Ｍｉｌｌｅｒ ら、’Ｐｈａｆｆｉａ、　ａ　ｎｅｗｙａｓｔ　ｇｅｎｕｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄ ｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ　（Ｂｌａｓｔｏ＋ｎｙｃｅｆｅｓ）　Ｊを参照 のこと）。

栄養細胞は長円形（３，６−７，５）　ｘ　（５，５−１０，５）であり、そし て液体培地中では個別に、対になって、そしである場合には短い連鎖状に、又は 小さい房状に存在する。真の菌糸は発達せず、しかし未発達の擬菌糸が存在する 場合がある。出芽は細胞上の同じ点から数回生ずる。Ｐ、ロドチーマは多層から 成る強い細胞膜を有し、そしてカプセル物質は表面に粒状の外観を与え、そして 上記の房を形成せしめる。

生活の性周期は観察されていない。厚膜胞子の発達中、栄養細胞が出芽により形 成される。これらの細胞は、アソスボロン（旦且匹肛匹）について記載されてい るように胞子を伴う前菌糸体と考えることはできない（Ｊ、Ｐ、ｖａｎ　ｄｅｒ 　Ｗａｉｔ。

’Ｔｈｅ　ｐｅｒｆｅｃｔ　ａｎｄ　ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ　５ｔａｔｅｓ　ｏｆ 　Ｓ　ｏｒｏｂｏｌｏｍ　ｃｅｓｓａ１ｍｉｎｉｃｏ］ｏｒ」、　Ｊ、Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　５ｅｒｏ１．３６．１９７０．４９　５５頁を参照のこと）、厚 膜胞子はゴツトコンタ−（ｇｏｎｏｔｏｃｏｎ　ｔｅｒ）（性的に分離された胞 子）と考えることができず、そしてその出芽は一倍体世代と考えることができな い。いずれの増殖段階においても核染色により二倍体化証明することは不可能で あった。透過電子顕微鏡写真はすべての増殖相において１個の単一核のみを示し ている（Ｍ、Ｗ、Ｍｉｌｌｅｒら、前掲）。従って、Ｐ、ロドチーマは一倍体の ようであるが、これはまだ証明されていない。

ＹＭ寒天（ディフコ・ラボラドリース社、ディフコマニュアル；脱水培地及び顕 微鏡写真用試薬、第１０版、デトロイト、１９８４　）上での２〜４週間の増殖 の後、線状（ｓｔｒｉｎｇ）培養物は菌株に応じてオレンジ〜サーモンピンク色 である。

Ｐ、ロドチーマは、２７°Ｃより高温では増殖しないという特殊な性質を有する 。このものはＤ−グルコース、マルト−ス、シュークロース及びラフィノースを 発酵するが、Ｄ−ガラクトース及びメリビオースを発酵しない。はとんどの一般 的な炭素源は資化されるが、しかしながらＤ−ガラクトース、Ｌ−ソルボース、 メリビオース、ラクトース、グリセロール及びクエン酸塩は資化されない。この 酵母はビオチンを添加しなければビタミン不含有培地で増殖することができない （ＬＷ。

ＭｉＩｌｅｒら、前掲）、尿素を含むほとんどの一般的窒素源が資化される。硝 酸カリウム及びエチルアミンは資化されない。

この酵母は５０重量％のグルコース−酸エキス寒天上で増殖することができず、 １０重量％の塩化ナトリウム−酵母エキス寒天上でも増殖することができない、 この酵母によるチッーク寒天上での酸生成は弱く、そしてセラチンの液化もその 通りである。Ｏ，ｌｎ／−のシクロヘキシミドの存在下での増殖、カゼインの加 水分解及び解重合（ｄｅｐｏ］ｙｔｉｃ）活性は存在せず、他方この酵母はｐＨ に依存することなく澱粉様化合物を合成することができる。Ｃ＋Ｃのモル％は４ ８．３±０．１８と測定される（Ｍｉｌｌｅｒ等、前掲）。

炭水化物−及び／又は窒素−制限条件下での増殖の間、フェト−バッチ発酵にか けられた場合、Ｐ、ロドチーマは炭水化物蓄積物としてトレハロースを生産する 。このことは、出願人会社により行われまだ報告されていない全く新しい観察で ある。

文献によれば、Ｐ、ロドチーマは多数のカロチノイドを生産し、その内アスタキ サンチンが８３〜８７％、β−カロチンが２〜２．５％、エチネノンが２〜４％ 、そしてフェニコキサンチンが５〜７％を占める。しかしながら実際には、Ｐ、 ロドチーマにより生産される全色素に対するアスタキサンチンの比率は酵母細胞 の増殖条件及び色素の測定法に依存して大きく異ることが見出され、そして５０ 〜８０％範囲にあることが見出された。

アスタキサンチンをはじめとするヒドドキシル化されたすべての色素は非結合形 として記載されており、エステル又は他の誘導体としては記載されていない（Ｇ 、Ａｎｄｒｅｉｅｓら著、ｒｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ　ｏｆ　Ｐｈａｆｆｉａ　 肋優！■弦、　ａ　ｒｅｄ−ｐｉｇ＋＊ｅｎｔｅｄｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ　ｙｅ ａｓＪ　、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ　１５＋　１９７６＋　１００ ３−１００７頁）、アスタキサンチンの３つの光学異性体形（３３，３’Ｓ）。

（３Ｒ，３’Ｒ）及び（３Ｓ、３Ｒ）が存在し、それぞれが種々のトランス−及 びシス−配置で存在する。Ｐ、ロドチーマは（ＳＲ，３’Ｒ）−アスタキサンチ ンのみを生産することが報告されている（Ｃ，Ａｎｄｒｅｗｓら、ｒ　（３Ｒ， ３’　Ｒ）−ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ　ｆｒｏｗｎ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｌｔ　Ｐ ｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、１前掲、１００９−１０１１頁）、この場 合、「アスタキサンチン」はアスタキサンチンのトランス−配置及びシス−配置 について用いられる。

細胞を顕微鏡観察する場合、個々のＰ、ロドチーマ細胞中の色素は見えず、この ことは色素が細胞全体に分散していることを示している。しかしながら、色素を 細胞のある部分に濃縮することも可能である。

アスタキサンチンは酸化されたカロチノイドであり、そしてそれ故にキサントフ ィル群に属する。他のカロチノイドと同櫂に、アスクキサンチンは８個のイソプ レノイド単位から構成されている０分解物（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ）抑制される アスタキサンチンの生合成において、アセチル〜ＣｏＡからイソペンテニルビロ リン酸が次のようにして生成する。

３つのプレニルトランスフェラーゼ反応により、インプレニルピロホスフェート はゲラニルピロホスフェート及びファルネシルピロホスフェートを介してゲラニ ル−ゲラニルピロホスフェートを次の様にして生成せしめる。

ゲラニルゲラニルピロホスフェート ２分子のゲラニルゲラニルピロボスフェートの縮合がフィトエンを生成せしめ、 これが脱水素段階及び環形成を経てβ最後の部分は明確には決定されていないが 、Ａｎｄｒｅｗｓら（前掲）はＰ、ロドチーマの色素組成に基いて下記の代謝経 路を提藁している。

■ “ｊ ■ 」 実施例の第２表及び第６表に示すように、文献に記載されているファフィア・ロ ドチーマ種には、前記の標準法により測定した場合に酵母乾燥ｇ当り３００Ｊｒ ｇ以上の本来的アスクキサンチン生産能力を有するものはない、しかしながら、 本発明によれば、前記の標準法により増殖及び測定を行った場合に酵母乾物ｇ当 り４５０Ｒ以工、例えば酵母乾物ｇ当り６００Ｒ以上、好ましくは酵母乾物ｇ当 り７００ｒａｒ以上、さらに好ましくは酵母乾物ｇ当り１０００ｘ以上、特に酵 母乾物ｇ当り１５００Ｊｒｇ以上、そして最も好ましくは酵母乾物ｇ当り２００ Ｏｎ以上の量でアスタキサンチンを製造することができる酵母を得ることができ ることが見出された。これらの酵母細胞は天然のファフィア・ロドチーマから変 異誘発により作られた。従って、本発明の１つの観点は、上記の高い本来的アス クキサンチン生産能力を示す酵母細胞を作る方法に関し、この方法は酵母細胞を 変異原により処理し、そして前記の方法により測定した場合に酵母乾物ｇ当り３ ００■以上の量でアスタキサンチンを生産することができる変異株を選択するこ とを含んで成る。

変異誘発は単一の変異誘発として行うことができるが、２回以上の逐次的変異誘 発を行うのが好ましい。各変異誘発段階によりアスタキサンチンを生産する本来 的能力が改良され得ることが見出されたからである。変異誘発にかけられる出発 酵母細胞は、通常は、前記の条件下で増殖せしめ前記の方法で測定した場合に酵 母乾物ｇ当り３００ｕ未満の量でアスタキサンチンを生産する酵母細胞であるが 、変異誘発処理のための通常の候補はできるだけ高い本来的アスタキサンチン生 産性を有する自然の酵母細胞であることが明らかである。この様な酵母細胞は普 通、前記のようにファフィア属に属する酵母細胞、特にファフィア・ロドチーマ 種に属する酵母細胞である。

変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行うことができる（これに関して、 ｒ変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみな らずＵＶ照射のごとき変異原効果を存する処理をも含むものと理解すべきである 。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル− Ｎ′−二トローＮ〜ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのごときヌクレオチド 塩基類似体及びアクリジン類が挙げるが、他の任意の効果的な変異原が処理のた めに適当であろう。

常用の変異誘発技法に従えば、変異誘発に続き最高のアスクキサンチン生産性を 有する細胞の適切な選択を行う、アスタキサンチンが色素であるという事実のた め、この選択は通常の視覚的手段、例えば単一コロニーの簡単な観察により行う ことができる。これに代る方法は、単一コロニーから作られた培養物の分析を、 例えば前記の標準的培養条件及び測定条件を用いて行うことである。

本発明の変異誘発法により作られそして特に高いアスタキサンチン生産性を有′ する２つの株が１９８７年４月６日に、Ｃｅｎｆ、ｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏ ｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ　（ＣＢＳ）、　０ｏｓｔｅｒｓｔｒ ａａｔ］、＋　Ｐｏ５ｔｂｕｓ　２７３＋　ＮＬ−３７４０ＡＧ　Ｂａａｒｎ、 オランダ、にそれぞれ毘２２４−８７及び２２５−８７として寄託されており、 そしてＣＢＳ　２２５−８７の再分離株である１つの株（実施例１を参照のこと ）が１９８８年３月２３日にＣＢＳに随２１５−８８として寄託されており、そ して本発明の１つの観点はこれらの酵母株、並びにこれらの株のアスタキサンチ ン生産能を実質的に維持しており又はさらに改良している変異株又は誘導株に関 する。

本発明はまた、アスタキサンチン含有酵母細胞又は細胞の部分、あるいはこれら の細胞又は細胞の部分に由来するアスクキサンチンの製造方法に関する。この方 法は、アスタキサンチン生産性酵母細胞を好気的条件下で、炭水化物源、資化性 窒素源及びリン、微量栄養素並びにビオチンを含有する培地中で１５〜２６°Ｃ の範囲の温度において培養することにより、前記の方法により測定した場合に酵 母乾物ｇ当り３００４以上の量でアスクキサンチンを含有する生物体を得、そし て所望により次の工程の１つ又は幾つかを任意の順序で行うことを含んで成る。

◎　培養物から細胞を収得して酵母クリームを得る；◎　機械的、化学的及び／ 又は酵素的処理により、及び／又は細胞を超音波、自己消化、浸透圧溶解（ｏｓ ｍｏｌｙｓｉｓ　）及び、／又は原形質溶解（ｐｌａｓ＋ｍｏｌｙｓｉｓ）にか けることにより、場合によっては適当な薬剤、例えば洗浄、酸、塩基、酵素、自 己消化増強物質、浸透圧溶解剤、例えば塩及び／又は原形質溶解剤を添加して、 細胞を開く、例えば細胞壁を破る；◎　細胞をホモゲナイズしてホモジネートを 得る；◎　細胞、細胞片又はホモジネートを乾燥させて好ましくは１２重量％以 下の水含量、好ましくは１０重量％以下の水含量にする； ◎　細胞、細胞片又はホモジネートからアスタキサンチンを抽出する。

前記のアスタキサンチン量、すなわち酵母乾物ｇ当り３００ｎは文献中に報告さ れているいずれのアスタキサンチン濃度よりも高い。Ｊｏｈｎｓｏｎら、前掲、 は酵母乾物ｇ当り２９５ｎのアスタキサンチン含量を報告しているが、この値は アスタキサンチン含量を含むのみならず、酵母細胞の全色素含量を含む、さらに 、この色素含量はＩＣのキュベツトにおいてアセトン中１％（ｗ／ｖ）ｉ液の吸 収の値１６００を用いて測定されたものであり、その値は本出願人により測定さ れたもの（２１００）より低いので、Ｊｏｈｎｓｏｎらにより報告された値は、 酵母乾物ｇ当り全色素（アスタキサンチンのみならず）最大２９５Ｘ１６００／ ２１００＝　２２５題に相当する。文献からのこの色素含量を本発明の酵母株の 全色素含量、ＣＢＳ　２２４−８７株については酵母乾物ｇ当り８８５．ｑ、　 ＣＢＳ　２２５−８７株については酵母乾物ｇ当り１．１７６ａｇ、そしてＣＢ Ｓ　２１５−８８株については酵母乾物ｇ当り約１３４０ｇ、あるいはさらに高 い酵母乾物ｇ当り２０００ａｇ以上と比較すべきである。

本発明の酵母細胞中の高いアスタキサンチン濃度は部分的には後に説明する特定 の培養条件の使用によって得られ、そして部分的には高い本来的アスタキサンチ ン生産性を有する酵母株、好ましくは上に検討した酵母株、の選択により得られ 、そして特に特定の培養条件と特定のアスクキサンチン生産酵母株の使用とを組 合わせるのが好ましい。

培養は好ましくは、アルコールが実質的に生成しない条件下でフェト−バンチ（ ｆ　ｅｄ　−ｂａ　ｔｃｈ　）発酵として行われる。前記のように、培養の温度 は１５〜２６”Ｃの範囲である。１５°Ｃ未満では工業的生産のために許容され るには低過ぎる傾向があり、そして２８°Ｃより高温では培養物の生存が深刻に 障害される。

好ましい温度範囲は２０〜２２°Ｃである。

発酵又は少なくともその部分は通常、細胞のための適当な多量−又は微量−栄養 素、例えば炭水化物源としての糖蜜又はサッカロース、及び窒素源、例えばコー ンスチーブリカー、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウ ム又は尿素、リン源、例えばリン酸アンモニウム及びリン酸、並びに添加された 微量栄養素又は鉱物塩、例えば硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、並びにビオチン又 はデスチオビオチンを含んで成る培地中で行われる。酵母製造において使用され る常法に従えば糖蜜又はサッカロースは好ましくは他の成分から分離して培地に 供給される。培地が糖蜜を含有する場合、酵母細胞の増殖は発酵槽中の糖又はそ の中に存在する他の増殖阻害物質の濃度により影響されることが見出された。こ の効果は、培地がコーンスチープリカー又は固形物を含有する場合に観察された 。従って、発酵槽中の糖の濃度（グルコース及びサッカロースの合計濃度として 表わされる）が８ｇ／ｌ以下、好ましくは５ｇ７１２以下、そして最も好ましく は１ｇ／Ｅ以下であるように発酵を制御するのが有利であることが証明される。

培養物は全発酵期間にわたり通気される。すなわちそれは好気的条件下で増殖さ れる。「好気的条件」なる語は、発酵中に酸素の制限が実質的に生じない様に酸 素の供給が十分であるべきことを意味する。

前記のように本発明の特定の観点に従えば、得られる生物体中のアスタキサンチ ンの濃度は選択された条件下で培養を行うことによって増加する。これらの条件 は、実質的にすべての増殖条件に関して実質的に十分である条件下での増殖期及 びそれに続く増殖制限期を含んで成る培養に関する。増殖制限期は好ましくは、 連続通気下での増殖培地が少なくとも１つの増殖因子を消耗し、この結果それに 続く期間にアスタキサンチンの生産が増強される条件を提供することにより達成 される。

増殖制限期は一般に、細胞の大部分が増殖を停止する期間を意味すると理解され るべきである。言うまでもなくこの期間は培地が少なくとも１つの増殖因子を消 耗する時に起こるが、発酵槽中に存在する細胞の量が該発酵槽の通気能力を十分 に超える場合に炭水化物添加期間の最後の部分にも観察される。

引き続く増殖制限期がアスタキサンチンの生産をかなり増加せしめる驚くべき効 果を存する（例えば、後の実施例の１つにおいて得られるように酵母乾物ｇ当り ２３１〜３６９Ｒ）を有する理由は知られていないが、増殖期間中にアスタキサ ンチンの前駆体が生産されており、そしてそれに続く増殖制限期間がアスクキサ ンチンの最終生産を促進する条件、おそらく、増殖が停止した時に得られる酸素 過剰による酸化的条件、を提供するものと予想される。いずれにしても、後に続 く増殖制限期を通じて通気が続けられるのが必須のようである。

後に続く増殖制限期の持続時間は好ましくは約１６時間以上、例えば１６〜２４ 時間であり、より短い持続時間は得られる余分の効果を減少せしめる傾向があり 、他方増殖制限期間を約２４時間より延長することにより得られる実質的な効果 はないようである。

機能的に表現すれば、増殖制限期間の条件は、この期間なくして得られる生産の １．２倍以上、例えばこの期間なくして得られる生産の１，３倍以上、好ましく はこの期間なくして得られる生産の１．５倍以上、そして最も好ましくはこの期 間なくして得られる生産の１．５倍以上にアスタキサンチンの生産を増強するよ うに調整されるべきである。

引き続く増殖制限期を伴う特定の培養に付される酵母細胞は、該増殖制限段階の ためにそのアスタキサンチン生産性が増加する野性典のアスタキサンチン生産酵 母細胞、例えばファフィア属の、特にファフィア・ロドチーマ種の野生形酵母細 胞であることができるが、培養に付される酵母細胞はアスクキサンチンを生産す る本来の且つ改良された能力を有する酵母細胞、典型的には前に説明したような 変異誘発により得られた酵母細胞であることが好ましい。本来の増加したアスタ キサンチン生産性を有するこれらの酵母細胞を用いて、増殖制限期を含む特定の 培養法を用いる場合に得られる生物体中のアスタキサンチンの濃度は、前記のよ うにして測定した場合、酵母乾物ｇ当り６００ａｇ以上、好ましくは８００ｘ以 上、さらに好ましくは１１０００ａ以上、特に酵母乾物ｇ当り１５００Ｉ４以上 、例えば酵母乾物ｇ当り２０００ａｇ以上、そして最も好ましくは酵母乾物３０ ００ｇ以上である。

通常、そして前記のように、酵母細胞又は酵母細胞部分中の全色素含量及びアス タキサンチン含量は酵母乾物ｇ当りのｎとして記載される。しかしながら、全色 素及びアスタキサンチン含量を記載する他の方法が便利であることが見出されよ う１例えば、全色素含量及びアスタキサンチン含量をそれが存在する懸濁液、例 えば増殖培地−当りだとして記載するのが有用であろう。従って、アスタキサン チン又は全色素がそこから回収される酵素乾物の重量を測定する必要がない。

従って、酵母細胞の培養又は発酵中、酵母細胞のアスタキサンチン及び／又は色 素含量を容易に語法することができる。

高アスタキサンチン含量を存する酵母細胞を得るための前記の培養の後、培養物 をそれに続く細胞単離のための前記の処理、及び／又はそれに続いて例えば細胞 の破壊によりそれを使用するための処理に付く、そして／又はアスタキサンチン を細胞から抽出することができる。

これらの処理の次の重要な例をさらに詳細に検討する。

細胞を上昇した圧力及び次の該圧力の開放にかけることにより該細胞を破壊する ことができる。

細胞をバルブホモジナイザーを有する系に通すことにより上昇した圧力及び該圧 力の開放にかけることができ、この場合、上昇した圧力はバルブホモジナイザー の前で達成される。

バルブホモジナイザーは、細胞懸濁液が高圧下で通過するエアロジェット、及び 該バルブを通過した実質的に後にジェットがそれに当る障害部材を有する。細胞 破砕バルブの例は１９８５年３月のＡＰＶ　Ｇａｕｌｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ 　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　（ＡＰＶ　ＧａｕｌｉｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ Ａ、　Ｐ、０．Ｂｏｘ　５８＋　１２００　ＡＢ　Ｈ４ｌｖｅｒｓｕｍ　、オラ ンダ）に記載されており、引例によりこの明細書に組み入れる。適当な細胞破壊 ホモジナイザーの例として前記刊行物に記載されているＣＲ型の細胞破壊バルブ を有するＡＰＶ　Ｇａｕｌｉｒ＋ＨＣ４ホモジナイザーを挙げることができる。

このホモジナイザーは熱交換器に連結され、その熱交換器中を、破壊された細胞 を含有する懸濁液が細胞破壊バルブから通過する。バルブの前での細胞懸濁液の 圧力は約４００〜１２００ｂａｒ　、例えば約７００ｂａｒであろう。この処理 は例えば３回、その間に熱交換器中でホモジネートの冷却を行いながら反復する 。

後で説明するように、アスタキサンチン含量の利用性は問題の動物の消化系に利 用され得る細胞含量に大きく依存するから、細胞が飼料中で使用される場合はそ れが破壊されるか又は他の処理がなされなければならない。

破壊された酵母細胞は該破壊された細胞を濃縮するために限外濾過又は蒸発にか けられる。限外濾過は、例えばＤｅＤｅｎｓｋｅ　５ｕｋｋｅｒｆａｂｒｉｋｋ ｅｒから得られる１ａｆｆｉニー１−７ト系、例えば、タイプＲＣ７０の０．８ ８背の全フィルター面積の限外濾過膜３枚を有するシステム３７において行うこ とができる。破壊された細胞を濃縮するための他の方法は、細胞の懸濁液からの 水の真空蒸発を行うことである。

破壊された細胞は噴霧乾燥又はドラム乾燥により乾燥せしめることができる。乾 燥の前にキャリヤー、例えばナトリウムカゼイン、酸化防止剤及び／又は乳化剤 を添加するのが好ましい。噴霧乾燥は、例えば、破壊された細胞及び場合によっ ては好ましくは水溶液の形のナトリウムカゼインのごときキャリヤーの均一に混 合されたスラリーを噴霧乾燥にかけることにより行うことができる。噴霧乾燥は 、ナトリウムカゼインの水溶液と酵母スラリーと混合して約２〜１０％（Ｗ／Ｖ ）のナトリウムカゼイン濃度を得ることによって好適に得られる。次に、得られ る混合物を窒素雰囲気中に撹拌しながら置き、この後噴霧乾燥塔にポンプ輸送し 、その中で例えば１５０〜２３０°Ｃ１例えば約１８０”Ｃの温度での乾燥に付 して酵母細胞材料の水含量を例えば１０％以下に減少せしめる。次に酵母細胞材 料を噴霧ホイールにより霧化する。噴霧乾燥処理から得られた粉末状酵母材料は サイクロンにより好適に回収され、そして場合によっては次に篩別しそして包装 する。適当な噴霧乾燥装置の例はＡｎｈｙｄｒｏからのタイプＥＡＫ−１の噴霧 塔である。あるいは、破壊された酵母細胞を、例えば密閉されたドラム乾燥装置 において１５０〜２００°Ｃの温度でドラム乾燥にかけることができる。

アスタキサンチンは高温において非常に容易に分解されるので、破壊された酵母 細胞を高温にかける時間を可及的に短かくすることが重要である。さらに、アス タキサンチンは酸素に感受性であるため、乾燥は好ましくは非酸化条件下で、例 えば不活性雰囲気中、例えば水蒸気（これは酵母懸濁液から蒸発した水蒸気であ ることができる）、窒素、及び／又は二酸化炭素中で行うべきである。

乾燥に先立って、破壊された細胞は場合によっては適当な乳化剤、例えばソルビ タンモノステアレート又は酸化防止剤、ビチルヒドロキシトルエン（Ｂｌ（Ｔ） 　、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）　、ビタミンＥ１アスコルビン酸、 アスコルビン酸の（ＩＩ）サルフェート又は（ＩＩ）ホスフェートエステル、あ るいはアスコルビルパルミテートと混合される。

破壊された乾燥細胞は、例えば後で説明するように、動物飼料の成分としてその まま有用である。

酵母細胞の含有アスタキサンチンは、種々の抽出側及び抽出方法を用いてそこか ら抽出して、酵母細胞からのアスタキサンチンの実質的な全抽出が得られること を保証することができる。はとんどの場合、抽出は破壊された細胞材料において 行われなければならない。すなわち、乾燥していても湿っていてもよい破壊され た細胞材料は有機溶剤、例えば石油エーテルは水相から分離した相を形成するの で湿った細胞材料の場合に好適に使用される石油エーテルにより抽出することが できる。他の適当な有機溶剤はアセトン又はアルコール、例えばメタ、ノールも しくはエタノール、エーテル、ケトン及び塩素化炭化水素である。抽出により、 アスタキサンチンは有機溶剤中に溶解する。アスタキサンチンは溶液から溶剤を 除去することにより、例えば落下フィルム蒸発系での蒸発及びその後の乾燥によ り得ることができる。しかしながら、ある目的のためにはｆ機溶剤中アスタキサ ンチンの濃縮物が便利である。ｍＮ物はそれ自体飼料又は食品の製造において使 用することができ、あるいは濃縮物は稀釈し、そして稀釈された状態で飼料又は 食品の製造において使用することができ、例えば飼料又は食品の構成成分を前記 溶液により含浸せしめることにより、又は油脂のごとき食品成分を着色するため に前記溶液（又は濃縮物）を使用することができる。

アスタキサンチンはまた酵母細胞からａｔ界条件下で二酸化炭素を使用すること により抽出することができる。二酸化炭素は適当なエントレイナー、例えば有機 溶剤、特に前記のタイプの溶剤、又はクロロホルムもしくはアセトニトリルのご とき溶剤、又は氷酢酸と組み合わせて使用することができる。超臨界抽出にかけ られる酵母細胞は湿った又は乾燥した全体酵母細胞又は破壊された、例えばホモ ジナイズされた酵母細胞であることができる。

培養物からアスタキサンチン含有全体細胞を単離するための好ましい方法は、例 えばフィルタープレス又は回転ドラムフィルター上で酵母クリームを濾過して約 ２５〜３５％の乾物含量のフィルターケーキを得ることである。次に、フィルタ ーケーキを好適に、孔を有するプレートを装着した押出機においてひも状物、例 えば約０．５〜２．０ｍの直径を存するひも状物にして押出し、酵母粒子から成 るひもを得ることができる。

ひもは好ましくは流動床中の熱空気中に直接押出され、そこで乾燥される。流動 床での蒸発は好ましくは、酵母粒子の温度が５０°Ｃ未満、例えば３０〜４０℃ に保持されるように調節し、そして酵素乾物量により測定した水分含量（この方 法は実施例に記載する）１０重量％未満、好ましくは８重量％未満となった時に この工程を停止する。あるいは、流動床におけるのと同じ条件下トレイ乾燥具中 で乾燥を行うことができる。次に、乾燥した全体細胞材料をＣｏｂａｌｌ　（商 標）のごときボール撹拌ミル中で粉砕し、そして次に抽出にかける。

特定の方法に従えば、例えば前記のようにして得た全体細胞乾燥材料を油相、例 えば可食性油脂、例えば大豆油もしくは魚油又は他の有機溶剤、例えば前に検討 したタイプの溶剤と混合することができる。温度は好ましくは２０〜３０’Ｃの 範囲である。細胞材料と油相又は有機溶剤とから得られる混合物はミル、例えば ボールミル、例えばボール撹拌ミル、例えばＣｏｂａｌｌ　（商標）ミル中で粉 砕して細胞を破壊しそして細胞からアスクキサンチンを放出せしめることができ る。生ずる懸濁液をそのまま飼料中に使用することができ、あるいはアスタキサ ンチンを含有する油相を細胞残渣から分離した後に使用することができる。麦芽 浸出液から細菌を分離するのに用いられるのと同じ原理で、初流（ｆａｓｔ　ｒ ｕｒ＋ｒ＋ｉｎｇ）遠心機中での遠心分離により、前記の分離を好適に行うこと ができる。

言うまでもなく、他の可能性は前記の方法により得られた破壊された乾燥細胞材 料を油相と混合することであり、これは前記の油相へのアスタキサンチンの抽出 及び分離の実施の同様にして行う、油相は前記の方法と同様にして飼料を着色す るために用いることができる。

破壊された細胞材料に対して行われなければならない前記のような最も従来的な 抽出方法に対して、破壊されていない全体酵母細胞からアスタキサンチンを抽出 するために氷酢酸を好結果に使用することができることが見出された。すなわち 、本発明の１つの観点に従えば、アスタキサンチンは全体酵母細胞から氷酢酸を 含有する溶剤によって抽出することができ、この抽出は好ましくは溶剤の氷点よ り高い温度、例えば２０〜１００°Ｃの範囲、好ましくは２０〜８０°Ｃの範囲 、そしてさらに好ましくは２０〜６０″Ｃの範囲において行われる。抽出をより 低い温度で行えばアスタキサンチンのさらに選択的な抽出を得ることができると 考えられる。脂肪及び他の抽出され得る成分の同時抽出がこれらの低い温度では 制限されるであろうからである。溶剤中の氷酢酸の濃度は好ましくは５〜１００ ．１０〜７０の範囲である。氷酢酸による抽出は、細胞の色素の約７０〜９０％ の抽出をもたらす、すなわち、酵母細胞の実質上すべての色素及びアスタキサン チン含量が氷酢酸抽出物中に見出される。さらに、抽出物は通常約３０〜３５％ の酵母乾物を含有する。適切には、氷酢酸による抽出にかけられる酵母は乾燥酵 母、すなわち、濾過され、そして次に流動床に押出され、そこで乾燥された酵母 である。この様に処理された酵母細胞は抽出処理により破壊されない（抽出処理 が酵母細胞の激しい機械的処理を伴わない限り）からである。これは、破壊され 又はホモジナイズされた細胞の抽出に比べて酵母細胞からの色素を含む抽出物の その後の分離を促進するであろう、破壊又はホモジナイズされた細胞は非破壊細 胞に比べて比較的小サイズであるため、使用されるフィルターの孔を閉塞する傾 向が非常に大であるからである。氷酢酸抽出を実施例９に例示する。氷酢酸によ る湿酵母の抽出もまた有用であることが証明されよう。

抽出されたアスタキサンチン及び全体乾燥細胞材料は、アスタキサンチンを分解 から保護するために好ましくは酸素欠乏条件下に保持される。すなわち、アスク キサンチン含有酵母細胞又は抽出されたアスタキサンチンは好ましくは酸化防止 剤、例えばブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）　、ブチルヒドロキシトルエ ン（ＢＩＴ）　、ビタミンＥ又はアスコルビン酸、アスコルビン酸の（ｎ）サル フェート又は（ＩＴ）ホスフェートエステル、あるいはアスコルビルパルミテー ト、及び／又は乳化剤、例えばモノグリセライド又はソルビタンエステルにより 保持され、そして密閉条件下で保持される。

本発明はまた、前記の方法により測定した場合に酵母乾物ｇ当り３００ｍ以上の 量でアスタキサンチンを含有する酵母細胞又は酵母細胞部分を他の飼料成分と組 み合わせて含んで成る飼料に関する。好ましくは、アスクキサンチン含有酵母細 胞又は酵母細胞部分は、全飼料組成物の乾物に対して１０重量％以下、好ましく は５％以下、そしてさらに好ましくは３％以下を占める。これらの値は、動物に 投与されるべき最終飼料に基いて計算される。高濃度の酵母細胞を有する飼料プ レミックスを調製することも可能である。酵母細胞、酵母細胞部分又はアスクキ サンチンは場合によっては、該アスタキサンチンを水中分散性にすることができ る乳化剤と混合される。

さらに、アスタキサンチン含有酵母細胞又は酵母細胞部分は酸化防止剤及び／又 は上記の乳化剤により酸化に対して保護することができ、そして／又は動物飼料 を気密性のそして場合によっては真空にした容器中に詰めることができる。

アスタキサンチン含を酵母細胞はまた、それ自体飼料成分として使用するために 包装することができ、あるいは酵母細胞はそれ自体、通常の又は適合された飼料 混合物が供与された動物に与えられる。

酵母細胞又は酵母細胞の部分は好適にはそして通常は、蛋白質及び炭水化物源、 油脂並びに微量栄養素、例えばビタミン及びミネラルから選択される他の栄養素 と混合される。蛋白質源の例として、カゼイン、アルブミン、小麦グルテン、魚 粉、濃縮魚類残渣にべ粉末及び血粉）が挙げられる。炭水化物源の例として糊化 澱粉、胛皮、糖蜜、野菜粉末、及びコーンスターチが挙げられる。飼料中の脂肪 成分は例えば魚油及びタラの肝油及び／又は植物油、例えばトウモロコシ油であ ることができる。ミネラルは、カルシウム、リン、ナトリウム、カリウム、塩素 、マグネシウム、銅、マンガン、亜鉛、コバルト及びセレンの無機化合物又は単 純な有機化合物から選択される。ビタミンの例として、ビタミンＩ３＋ｚ、プロ リン、ビタミンＡ、ビタミンＤ１ビタミンＥ、ビタミンＫ。

チアミン、アスコルビン酸、リボフラビン、ピリドキシン、ナフトエ酸、ナイア シン、ビオチン、コリン及びイノシトールが挙げられる。

本発明はまた、酵母から、好ましくは本発明の酵母又は本発明の方法により製造 された酵母から例えば前記の方法のいずれかにより抽出されたアスタキサンチン を含んで成る食品又は飼料に関する。アスタキサンチンは前記の飼料成分との混 合物として、そしてさらに他の食品又は栄養成分との混合物として、並びに他の 着色剤との混合物として使用することができる。すなわち、酵母細胞から抽出さ れたアスクキサンチンは、可食性油、バター、マーガリン、ショートニング、マ ヨネーズ、パテ、スープ、スタック製品、すり身製品、デザート、アイスクリー ム、菓子、燻製品及び飲み物中で使用するために他の着色剤と混合して、又は単 独で使用するのに非常に適当である。アスタキサンチンがほとんど水又は水相か ら成る食品に使用される場合、アスタキサンチンは好ましくは前記の乳化剤と混 合され、この乳化剤は、結晶化のなんらの傾向を伴わないでそしてアスタキサン チンを溶解するのに油相の添加を必要としないでアスタキサンチンを水相中に分 散性にするものである。

さらに、本発明は動物の肉の及び／又は該動物により生産される生成物の赤の着 色を得るために動物を飼育する方法に関し、この方法は、前記の方法により測定 した場合に酵母乾物ｇ当り３００ｎ以上の量でアスクキサンチンを含有する酵母 細胞又は細胞部分、あるいはそのような酵母細胞又は細胞部分から抽出したアス タキサンチンを含有する飼料を動物に供与することを含んで成る。

アスタキサンチン又はアスタキサンチン含を酵母細胞もしくは酵母細胞部分を含 有する飼料の動物に投与する量は、問題の動物種、及びアスタキサンチンにより 得ることが望まれる着色効果に依存するであろう、明らかに、従うべき原理は、 動物が通常の推奨される日用量の大量−及び微量栄養素を摂取し、そしてさらに 問題の動物の肉又は動物産物の所望の着色をもたらすであろう形態及び量のアス クキサンチンを摂取することである。幾つかのケースにおいて、供与されるべき アスタキサンチンの量は季節に依存し、従って例えば、牛が主車を摂取する時に はバターの着色は適切であると一般に考えられるので、夏場にバターの着色を得 るために牛にアスタキサンチン又は他のカロチノイドを投与するのは好ましくな いであろう。さらに、アスクキサンチン又はアスタキサンチン含有酵母細胞もし くは細胞の部分が動物に投与される量は幾つかの場合には季節に依存するであろ う。すなわち、例えば、サケ又はマスのごとき魚類の場合、夏場に魚により消費 される量とは対象的に冬場に魚により消費される量は相対的に少い。しかしなが ら、魚に供与される適当な量は一日当り魚体重の約１．５％であり、これはＣａ １ｉｆｏｒｎｉａ　５ｔａｔｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ　Ｆｉｓｈ　ａｎｄ 　Ｇａｍｅにより与えられた推奨に相当する。

家禽により生産される卵の黄味及び／又は家禽の肉もしくは皮膚の着色のために 前記の方法により家禽を飼育する場合、飼料は常用の家禽飼料成分により構成す ることができ、その例は、好ましくは蛋白質及び炭水化物源、例えば大豆粉、大 豆蛋白質、セルロス、澱粉及び脂肪源、例えば大豆油、ビタミン、例えば全ビタ ミン混合物、及びミネラル、例えば家禽のための一般的ミネラル成分の混合物、 並びに卵殻のためのカルシウム源、好ましくは炭酸カルシウム及びリン酸水素カ ルシウムを含有するものである。少量の塩化ナトリウムも存在することができる 。飼料は常用の供与量で供与することができる。

次に実験例によりこの発明をさらに説明する。

林料及塁去抜 豊ｌ立１１Ｌ且 ファフィア・ロドチーマの培養物を次の２つの方法により維持する。

１）寒天スラント（ＹＭ−寒天）上でやスラントを２０°Ｃにて１週間インキニ ベートし、そして４　’Ｃにて１ケ月保持し、あらたなスラントを作る前にＹＭ −液体培地中で再培養する。

２）−８０°Ｃでの凍結保存。凍結バイアル又はスラントから菌株を２５０−の 振とうフラスコ中５０ｄのＹＭ−液体培地に接種する。振とうフラスコを回転振 とう機（１５０ｒｐｍ）上で２０°Ｃにて４〜５日間インキュベートする。酵母 細胞を沈澱せしめ、そして液をデカントする。沈降物をグリセロール中に２０％ の濃度に混合し、凍結バイアルに分注し、そしてディープ・フリーザー中で一８ ０°Ｃにて貯蔵する。

の：１ ５ｄの酵母細胞培養物を秤量したザルステッド（Ｓａｒｓ　ｔｅｄ　ｔ）チュー ブ（！１０°Ｃにて一定重量になるまで乾燥したもの）中で１０．０ＯＯＸ　ｇ にて５分間遠心し、そして脱塩水で２回洗浄する。

液をデカントにより除去し、そして１１０″Ｃにて一定重量にまで乾燥した後、 細胞を含むチューブの重量を測定する。これにより酵母細胞の重量（Ｙｇ）が得 られる。次に、酵母乾物含量（ＹＤＭＣ）を次の様にして計算する。

ＹＤ？ｌＣＣｇ／Ｉ！　）−Ｙ１５．０ＯＸ１．０００記載される含量は２個の 測定の平均値である。

の：１　のか　の　　　　゛　ゝ メタノール抽出物中の全色素の含量は、Ｂ、Ｈ，Ｄａｖｉｅｓ＋ｒｃａｒｏｔｅ ｕｏｉｄｓＪ、　Ｔ、Ｗ、ＧｏｏｄｗｉｎＣＷ集）　、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａ ｎｄＢｉｏｃｈｅｌｌｌｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｐｉｇｍｅｎｔｓ、　 Ｎｅ１１Ｙｏｒｋ＋　Ｖｏｌ、２＋　１４９頁により記載されているようにして 、λａａｘの平均及びベール（Ｂｅｅｒ）の法則により分光光度法により測定さ れる。使用する分光光度計は島津ＵＶ可視記録分光光度計υｖ２６０である。色 素含量は後記の式１，１ａ、２，２ｂ、及び下記第１表の吸光係数を用いて計算 される。

溶　剤　　　　吸光最大　　　Ｅ１九 アセトン　　　　　４７５　　　　２１０５メタノール　　　　４７２　　　　 ２１００エタノール　　　　４７６　　　　２１００氷酢酸　　　　　　４８２ 　　　　１８５６Ｅ１八＝１０キュベツト中１％（Ｗ／Ｖ）溶液の吸収。

−Ｌｌ　び−１ 約３０−の酵母培養物をサルステンドチューブに移し、そして１０，０ＯＯＸ　 ｇにて５分間遠心した。酵母細胞を脱イオン水中で洗浄し、そして約２０ｄのメ タノールに懸濁した。ローターが直径０．４　ｍｍのガラスポール（ガラスポー ル約１５ｇ）で覆われているＢｅａｄ　Ｂｅａｔｅｒ型ガラスボールミル（Ｂｉ ｏｓｐｅｃ　ＰｒｏｄｕｃｔｓＩｎｃ−＋米国）にメタノール懸濁液を添加して 残りの遊離ボールミル容量をうめた。ミルを３０秒間の間隔をおいて１分間ずつ ５回運転することにより破砕処理を行い、破砕処理の温度を２０°Ｃ未満に維持 するように冷却ジャケントに氷水を保持した。破砕処理の直後にホモジネートの 一部をサルステンドチューブに移し、そして前記のようにして、但し遠心をしな いで酵母乾物を測定した。既知量（ｂｇ）のホモジネートを１０ｍのメスフラス コに移し、そして溶剤を加えて１０ｄとした。この溶液の吸収を測定した。

酵母乾物ｇ当りの全色素量４次の様にして決定される。

Ｅ：１．ｃｍｍコニベット中用された溶剤でのλ５１、における吸収。

Ｅｌご、：１Ωキュベツト中１％（ｗ／ｖ　）溶液の吸収。

ｂ二抽出物のｇ数 Ｄ＝酵母乾物の■／抽出物ｇ 、の　　　び＼　−゛ 所定量の酵母培養物（ａ　ｗｌ　）をサルステンドチューブに移し、そして１０ ，０ＯＯＸ　ｇにて５分間遠心分離する。酵母細胞を脱イオン水中で洗浄し、そ して約２０ｄのメタノールに懸濁する。ローターが直径０．４ｍｍのガラスポー ルで覆われている（ガラスポール約１５ｇ）Ｂｅａｄ　Ｂｅａｔｅｒ型ガラスボ ールミル（Ｂｆｏ−ｓｐｅｃ　Ｐｒｏｃｌｕｃｔｓ　Ｉｎｃ、米国）にメタノー ル懸濁液を加えて残りの遊離ボールミル容量をうめた。ミルを３０秒間の間隔を おいて１分間ずつ５回運転することにより破砕処理を行い、破砕処理の温度を２ ０°Ｃ未満に維持するように冷却ジャケットに氷水を保持した。破砕処理の直後 に液体を５０−のメスフラスコに移した。ミル中のガラスピーズを４×８−のメ タノールで洗浄した０両分を集め、そして混合し、そしてメタノールを分析する 。培養物中の酵母乾物は前記のようにして測定する。

サンプル−当りの全色素含量を次のようにして決定する。

Ｘ′　：色素Ｒ／サンプル− ａ：サンプル容量（−） Ｅ：１ｃｍのキュベツト中使用される溶剤のλｍｉｘでの吸収 Ｅ）ｃ％、：１ｃｍのキュベツトでの１％（ｗ／ｖ　）溶液の吸収 酵母乾物ｇ当り全色素含量は次のようにして決定する。

Ｙ：色素４／酵母乾物ｇ ＹＤ？’ｌＣ：酵母乾物ｇ／培養液！ アス　キサンチンの′　のためのＨＰＬＣ−’１装−エ カラム：　ＬＫＢ　Ｕｌｔｒｏｐａｃ　Ｐｒｅｃｏｌｕｓ、　Ｌｆｃｈｒｏｓｏ ｒｂ　ＲＰ１８７μ、４Ｘ３０Ｅｌｌｌ； ＩＪＢ　Ｕｌｔｒｏｐａｃ　Ｃｏｌｕｍ、　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ１Ｂ５ 　ｉｓ、　　４　Ｘ　２５０ｍｍ。

検　出：　ＬＫＢ　２１５１可変波長モニター。

積分機：　Ｗａｔｅｒｓ　７４０　Ｄａｔｅ　Ｍｏｄｕｌｅ。

コントローラー：　ＬＫＢ　２１５２　ＨＰＬＣコントローラー。

ポンプ：　ＬＫＢ　２１５０　ＨＰＬＣポンプ。

自動サンプラー：可変ループを有するＬ）ｆＢ　２１５７オートサンプラー。

手動注入：　Ｒｈｅｏｄｙｎｅ　２０ｍループ。

主−剋　Ａ：８６０！１！のアセトニトリル＋１００−の水＋４０−の蟻酸。

Ｂ　：　　９６０ｄの酢酸エチル＋４０ｄの蟻酸。

すべての溶剤は）ＩＰＬＣグレードであった。

ＬＪＬ　１−０１６１７分。

グうジェフト　０−１００％　Ｂ　　２０分間、直線グラジェント１００−０％ 　Ｂ　　１０分間、直線グラジェントｍ　　４７１ｎｍ。

１−皮　周囲温度。

ＭＵＭ瓜　ホフマン・ラーｏシュ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ、　Ｌａ　Ｒｏｃｈｅによ り供給される純アスタキサンチン（融点２２０−２２２°Ｃ２１Ωキユベツト中 １％Ｗ　／　Ｖアセトン溶液の吸収２１０００）　（以後、アスタキサンチン標 準と称する）を秤量し、そして５０Ｍ！のアセトンに溶解する。

）ＩＰＬＣ分析のため、問題のサンプル２０ｊＪ１をＨＰＬＣクロマトグラフィ ー装置に注入する。

カラム：　５ｕｐｅｌｃｏプレカラム ５ｕｐｅＸｃｏ　ＬＣ１８−ＤＢ、粒子サイズ　５μ力ラム寸法　４．５　Ｘ　 ２５０ｃｍ。

検出器：　ＬＫＢ　２１５１可変波長モニター。

積分器：　Ｗａｔｅｒｓ　７４０　Ｄａｔｅ　Ｍｏｄｕｌｅ。

コントローラー：　ＩＪＢ　２１５２　）ＩＰＬＣコントローラー。

ポンプ：　ＬＫＢ　２１５０　ＨＰＬＣポンプ。

自動サンプラー：可変ループを有するＬＫＢ　２１５７オートサンブラー。

手動注入：　Ｒｈｅｏｄｙｎｅ　２０．ｃｆループ。

痘−泣　Ａ：　４００ｄ　テトラヒドロフラン４００ｄ　　メタノール ２００ｄ　　０．０２Ｍグリシン緩衝液ｐ）１２．６Ｂ　：　１０００ｍ　　テ トラヒドロフラン。

緩衝液以外のすべての溶剤はＨＰＬＣグレートである。緩衝液は使用前に０．２ ２ｎフイルターを通して無菌化する。

捜■器４８０ｎ＋ｓ。

ｌ一度　室温。

ゲージエンド　び１゛ 溶剤　％　時間　流れ （分）　　（ｄ／分） Ｂ　　０　０−１１　１．０ Ｂ　　０−９０　１１−２１　１．０ Ｂ　　９０　２１−２９　１．５ Ｂ　９０−５０　２９−３１　１．５ Ｂ　　５０　３１−３２　１．０ Ｂ　　５０−０　３２−３５　１．０ Ｂ　　０　３５−３９　１．０ 星！且丘　５ｍｇのアスタキサンチン標準を秤量し、そして５００　ｍのテトラ ヒドロフランに溶解する。

ＨＰＬＣ分析のため、問題のサンプル２０Ｊｉ１を）ＩＰＬｃクロマトグラフィ ー装置に注入する。

二亜ス±ヱヱ上土ニブ Ｈｏｕｎｉｓｅｎｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ）＋＋　Ａｒｈｕｓ、デンマークによ り供給されるタイプ５５５３３のポリプロピレン栓を有するポリプロピレン遠心 チニーブ。

止ヱＩｔ 実験室規模で使用する化学物質は分析グレードのものである。発酵に使用する化 学物質は食品グレードのものである。

グルコース及びシュークロース濃度はベーリンガー・マンノｈイムからのキット （Ｂｅｓｔ、　Ｎｏ、１３９０４１　）を用いて分析した。

と゛フースコ立　　び塞　プレートト　立ＩＤ１ｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより供給されるＹＭ（Ｙｅａｓｔ　Ｍｏｒｐ ｈｏｌｏｇｙ）培地（ディフコ・？　二、：Ｌアル：　Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄｃ ｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉａ　ａｎｄ　ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌｏｇｙ＋第１０版、デトロイト、１９８４）　。

遠ｌビ臼仁乙と Ｔｅｃｈｎｕｎｃ＋　Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマークにより供給されるタイプ３ ６３４０１の２．０ｍ１容量のポリプロピレンチューブ。

各場合において、処理された培養物の生存の程度カ月〜５％であるように変異誘 発処理を行った。寒天プレートに単一コロニーとしてプレートした場合に変異株 の赤色の強さを視覚的に比較することによって適当な変異体を選択した。

旦ヱニ皿■ ＹＭ培地中に２０〜２２°Ｃにて増殖したＡＴＣＣ２４２６１のちょうど濁って いる４日培養物を０．９％Ｎａ（Ｊ溶液中に、それぞれ１０−’　、　１０”・ ’　、　１０−”　、　１０−”・５及び１０−３の濃度に稀釈し、そしてこれ らの稀釈物のそれぞれの０．３−を寒天プレート上にプレートし、１００〜３０ ０コロニーを含む寒天プレートを得た。

次に、これらのプレートを照射原（Ｖｉｌｂｅｒｔ　Ｌｏｕｒｍａｔ　ＶＬ　３ ０ＬＣ）から２０ｃｍの距離で２５４ｎ耐こで３０秒間紫外線照射にかけ、そし て次に２０〜２２°Ｃにて１０日間増殖せしめ、この後、生じたコロニーの色を 比較した。

ＥＭＳ　　エチル−メ　ンースルホネート　几振とうボード上ＹＭ培地中で２０ 〜２２°Ｃにて増殖したＡＴＣＣ２４２６１の４日間培養物２ＸＩ５ａｄを、Ｍ ＳＥ　Ｍａｊｏｒ遠心機中で１２５０Ｘ　ｇにて１５分間遠心し、そしてベレッ トを２００ｍの遠心チューブ中無菌０．９％ＮａＣ１溶液２Ｘ１５ｄ中に懸濁し た。細胞懸濁液の１つを対照として用いた。他の細胞懸濁液に１ｇのＥＭＳ（Ｓ ｅｒｖａ　２８７５５）を添加した。２０℃にて３０分間の処理の後、１５０１ ｄ、の冷無菌０．９％ＮａＣ４溶液を加えた。酵母細胞を無菌０．９％ＮａＣｊ ！中で２回洗浄し、そして０．９％ＮａＣｊ！に懸濁した。次に、Ｕｖ−処理に ついて前記したのと同じ方法で酵母細胞懸濁液を稀釈しそして寒天プレート上に プレートした。

単離された変異株の１つを１９８７年４月６日にＣＢＳ　（Ｃｅｎ　ｔｒａａ　 １−ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍ＋＋＋ｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）にＮｏ 、２２４−８７として寄託した。

Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二）・ロソグアニジンによる処理 ２５■のＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン（Ａｌｄｒｉｃｈ 　Ｃｈｅｍｉｅ　ＢＤＲ）を、ガラス栓を有する１０−の目方を量った目盛付き シリンダーに加えた。水を加えて全容１０ｄとし、そしてその中でＮ−メチル− Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを振とうにより溶解した。この溶液から １０×１−のストック溶液を得た。

振とうボード上ＹＭ培地中で２０〜２２°Ｃにて増殖したＣＢ５２２４−８７　 （前記２ＭＳ処理により得られた変異株）の４日培養物２Ｘ２０ｄをサルステッ ドチューブに移し、そして２回の遠心分離にかけた。ベレットを１，５威の０． ９％無菌ＮａＣ４溶液に懸濁し、そして上に調製した１−のストック溶液を加え た。

２０〜２２°Ｃにて１時間のインキュベーションの後、酵母細胞を５回、１０ｍ の冷無菌０．９％ＮａＣｊ２溶液中で洗浄し、これによってＮ−メチル−Ｎ′− 二トローＮ−ニトロソグアニジンを除去した０次に、ＵＶ−処理について前記し たようにして酵母細胞を稀釈し、そして寒天プレート上にプレー１−　した。単 離された変異株の１つを１９８７年４月６日にＣＢＳにＮα２２５−８７として 寄託した。

豆１版 ＣＢＳ　２２５−８７を次に記載するようにして単離に付した。凍結乾燥したバ イアルから酵母をＹＭ培地に懸濁し、そして２０〜２２°Ｃにて５日間インキニ ベートした。培養物をＹＭプレート上にプレートし、そして２０〜２２゛Ｃにて １０日間インキュベートし、そして新しいコロニーを単離した。コロニーの１つ を１９８８年３月２３日にＣＢＳにＮα２１５−８８として寄託した。

この例において記載される酵母細胞の培養及びアスタキサンチンの測定は、一方 において、酵母株の本来的アスタキサンチン生産能を測定するための本件出願人 の前記標準法において酵母細胞が増殖する条件を構成し、そして他方においてア スタキサンチンを測定する条件を構成する。これらは、請求の範囲に記載するの と同じ標準条件である。

と゛　−スコ悴 振とうボード上ＹＭ培地中で２０〜２２°Ｃにて増殖したＡＴＣＣ２４２６１の ４日培養物１００ｄを２個のバッフルを有する５００ｍｅ振とうフラスコ中の５ ０−のＹＭ培地そ；接種した。この培養物を１５０ｒｐａ＋、　４日間、２０〜 ２２°Ｃ５そして３０ｍｍｏｌ／　４２７時の酸素移動速度での振とうボード上 での増殖に付し、これにより０゜６％の酵母細胞培養密度を得た。

二二皇丘択 抽出物中のアスタキサンチン含量を次の３つの方法により決定した。

１、　メタノール抽出調製物について前記した様にして調製されたアセトン、メ タノール及びエタノール抽出物を分光光度スキャンニングにかけ、そして第１表 に示すλ、、あゆ値を得た。

２　前記の方法と同様にして調製した１０ｄのエタノール抽出液の半分に５０■ 以上のカリウムボロヒドリドを加え、そしてこの混合物を３０分間撹拌した。抽 出物及びカリウムボロヒドリド処理したサンプルの吸収を分光光度計上で変化す る波長を用いて測定した０文献に記載されている値に対応して、遊離アスタキサ ンチンは４８０ｎｍに広いピークを示し、そして還元されたアスタキサンチンは ４５０及び４７６ｎｍに２個のピークを示した。

３、前記の標準的条件下ＦＩＰＬＣでのアスタキサンチン含有抽出物の保持時間 を前に定義した標準溶液の保持時間と比較した。すなわち、標準的条件下でのＨ ＰＬＣにおける本発明のアスタキサンチン含有サンプルのピークをＨＰＬＣにお ける標準溶液のピークと比較した。保持時間が同一であることが見出された。

本発明の変異株（ＣＢＳ　２２４−８７及びＣＢＳ　２２５−８７）並びに既知 のすべての寄託されているアスタキサンチン生産性Ｐ、ロドチーマ株を上記のよ うにして増殖せしめ、そして分析した。

これらの株の全色素含量及びアスタキサンチン含量を下記の第２表に示す。

全色素の分析は、「色素の抽出及び分析一方法１」に従って行った。アスタキサ ンチンは、「アスタキサンチンの測定のための）ＩＰＬｃ分析一方法１ｊに行っ て行った。

男−」−一表 ＣＢＳ　５９０５＝ＡＴＣＣ２４２０２＝ＵＣＤ　６７−２１０　　　　３３２ 　　　　　　　２５４ＣＢＳ　５９０８−ＡＴＣＣ２４２０３＝ｔｌＣＤ　６７ −３８３　　　　３１８　　　　　　　２５２ＣＢＳ　６９３８　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　３０３　　　　　　　２０４ＣＢＳ　６９５４． 　　　　　　　　　　　　　　、　　＜　５０　　　　　　＜１００ＡＴＣＣ２ ４２０１−ＵＣＤ　６７−２０３　　　　　　　　　　　２２９　　　　　　　 １４３ＡＴＣＣ２４２０３冨υＣＤ　６７−３８３　　　　　　　　　　　３３ ８　　　　　　　　１６４ＡＴＣＣ２４２２８−ｕｃｆ）６８−６５３Ｃ２５４ １０７ＡＴＣＣ２４２２９−ＵＣＤ　　６７−２０２　　　　　　　　　　　　 　　　　２８７　　　　　　　　　　　１４２ＡＴＣＣ２４２３０−１ｌｃＤ　 ６７−３８５　　　　　　　　　　　　２４７　　　　　　　　１３２ＡＴＣＣ ２４２６１−ＬＩＣＤ　　６７−４８４　　　　　　　　　　　　４４９　　　 　　　　　２８６ＣＢＳ　２２４−“８７　　　　　　　　　　　　　　　　８ ８５　　　　　　５７０ＣＢＳ　２２５−８７　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　１１７６　　　　　　　　７０にれらの値は４個の独立した測定の平均 値である。本発明の変異株がかなり増加したアスクキサンチン含量を示すことが 注目されよう。

五３−　　ｌ−■ 孔を有する空気パイプから成る静止通気系を有するＢｕｂｂｌｅＣＯＩＬＩＲＩ ＩＩＩ型の十分に洗浄されそして殺菌された４ｎｆの発酵槽中で炭水化物制限下 でフェト−バッチ発酵として発酵を行った。

この発酵槽はｐＨ電極、ｐ）（０！整剤及び消泡剤用の入口、並びに排出される 空気中のアルコールを測定するためのアルコール検出器を装着していた０発酵槽 のジャケットは温度調節した。

出発培地は次の組成、すなわち２０　ｇ　／　ｆの糖蜜、０．６ｇ／ｌの硫酸ア ンモニウム、０．８ｇ＃のリン酸水素ニアンモニウム及び０．１．２５ｇ／Ｅの 硫酸マグネシウムを有し、これらを適当量の水Ｃ１００１の増殖発酵槽中に３０ ！、そして４ボの生産発酵槽中に２０００ｊ２）と共に発酵槽中で３０分が蕉沸 した後、発酵槽に接種した。フェト−バンチ発酵において発酵槽にフィードされ る培地は２つの異る貯槽、すなわち１０）ｃｇの硫酸アンモニウム、５．６　ｋ ｇのリン酸水素ニアンモニウム及び８０２の水から成る化学貯槽、並びに４５０ ｋｇの糖蜜及び１００（Ｈ！の水から成るオートクレーブ殺菌された糖蜜貯槽か ら取った。培地の残りを供給する直前に０．１■のデスチオビオチン及び１．６ 　ｋｇの硫酸マグネシウムを発酵槽に直接供給した。すべての化学物質は食品グ レードのものであった。糖蜜はＤｅ　Ｍａｎｓｋｅ　５ｕｋｋｅｒ−ｆａｂｒｉ ｋｋｅｒからのビート糖蜜であった。

発酵中の通気は８゜４ボ／分であった。消泡剤としてＣｏｎｔｒａｓｐｕｍ　２ １０（Ｚｓｃｈｉ＋ｎｍｅｒ　＆　５ｃｈｉ＜ａｒｔｚ）を用い、そしてｐＨ調 整剤として硫酸を用いた。

ＡＴＣＣ２４２６１株の酵母細胞をスラントから５ｉのＹＭ培地を含む直径２ｃ ｍの試験管に移し、この培地中で４日間振とうボード上で十分な通気のもとで２ ０〜２２°Ｃの温度にて培養して増殖せしめ、次にこの培養物を１１のＹＭ培地 を含む２１のエルレンマイヤースラスコに移した。振とうボード上、十分な通気 のもとで２０〜２２°Ｃの温度で３日間インキュベートした後、１！の培養物を ３０１２の出発培地を含む１０Ｍの発酵槽に移した。培養物を、１ｇ／！の酵母 乾物量が得られるまで２０〜２２°Ｃにてバッチ増殖せしめた。次に、栄養の供 給を開始し、そして２０〜２２℃にてフェト−バッチ発酵を行った。２日間の増 殖の後、３０４２の培養物を無菌条件下でベリスタルポンプにより、２００Ｏｆ の出発培地を含む４ｎ？の発酵槽に移送した。この培養物を、培養物中１　ｇ／ ／！の酵母乾物含量が得られるまで２０〜２２゛Ｃでバッチ増殖せしめた。次に 、糖蜜の供給を開始し、そして３８時間続け、この後糖蜜貯槽は空になった。化 学物質は糖蜜と並行して最初の２４時間供給した。フェト−バッチ発酵は２０〜 ２２°Ｃの温度にて行った。糖蜜貯槽中の糖蜜の量は、発酵液中４％を越えない 酵母乾物含量が得られるように調整しブこ。

フェト−バッチ発酵中の発酵槽への糖蜜の供給は、μ−〇、１５時１の酵母細胞 の比増殖速度を達成することを目標に調整し、そしてさらに発酵液中のエタノー ル濃度がＯ，］容量％未満となるように制御した。すなわち、エタノール濃度を しばしば測定し、そしてこれが高過ぎることが見出された場合、許容されるエタ ノール濃度が再び達成されるまで糖蜜供給速度を低下せしめた。

発酵した液の通気をなんらの栄養も供給することなり２０〜２２°Ｃにて１６時 間続けた。

酵母細胞の組成、並びに全色素含量及びアスタキサンチン含量を、０時、すなわ ち４ボ発酵槽への栄養の供給を開始する直前、発酵及び増殖が停止した時である 一３８時間後、並びに発酵した液の１６時間の通気の後に測定した。全色素含量 及びアスタキサンチン含量を例２に記載したようにして測定し、そして酵母細胞 の組成を常法に従って測定した。すなわち、全窒素含量をキュルダール分析によ り測定し、トレハロース含量をＪｏｕｒｎ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、７２＋　 １９５０＋　２０５９頁に記載されているようにして測定し、そしてリン酸含量 をＷａｔｅｒ　ａｎｃｌ　Ｗａｓｔｅ−ｗａｔｅｒ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｕ ｂｌｉｃ　）Ｉｅａｌｔｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ、　Ｉｎｃ、＋　１９９頁 （１９６０）に記載されているようにして測定した。エタノール分析は少量のエ タノールを測定するためのボイデン（Ｂｏｉｄｉｎ）法（Ａｎｎａｌ、ｄｅ　Ｉ ａ　ｂｒｕｓｓｅｒ５ｅ　ｅｔ　ｄｅ　ｌａ　ｄｉｓｔｉ］１ｅｒｒｅ、　１９ ２４−２５＋１７７頁）により測定した。結果を第３表に示す。

全色素の分析は方法−１に従って行った。ＨＰＬＣによるアスタキサンチンの分 析は方法−１により行った。

ＡＴＣＣ２４２６１のフェト−バッチ発酵時間　　　　　０　１８　２４　３１ 　３８　４５　５４酵母乾物ｇ当り全色素ｎ　　　　−１８１，２］、、８　　 ２８４　　４１５　　４１１　　５７９酵母乾物％（ｗ／’ｗ）　　　　　０． ０Ｂ　　０．４Ｂ　　０．９５　２．７５　３．０６　３．１５　３．２９工タ ノール％（Ｖ／Ｖ）　　　　　−０，０００，０００，０００，１００，０００ ，００ｐＨ４，７４゜４　　４．０　　４．０　　４．５　　７．８　　８．５ 酵母乾物含量％（Ｗ／Ｗ）　　　　−−−−６，２６，１，５，７酵母乾物中Ｐ ｚＯｓ％（ｗ／ｗ）　　　−−−−２，７２，６２，４土工 例３に記載した実験と同様の方法で、ＡＴＣＣ２４２６１を用いるフェト−パッ チ発酵を行い、相違は出発培地の容量を１０００　ｆとし、４ｒｒｒ発酵槽への 接種物として前記の欅にして増殖せしめたＡＴＣＣ２４２６１を６×１２使用し 、化学貯槽が０．５ｋｇ（７）硫酸アンモニウム、２．５ｋｇのリン酸水素ニア ンモニウム及び８０ｊ２の水から成り、そして糖蜜貯槽が２５０ｋｇの糖蜜及び １ｏｏｏ　ｊ２の水から成る点のみであった。フェト−バッチ発酵中栄養を発酵 槽に最初に６５時間フィードし、そしてこの後栄養の供給を停止し、そして培養 物を７２時間の通気に付した。

結果を下の第４表に示す。

呈−ｌ−１ ＡＴＣＣ２４２６１のフェト−バンチ発酵時間　　　　　０　６５　１３７ 酵母乾物ｇ当り全色素ｔｒｇ　　　１４９　　３７９　　５６１酵母乾物％（ｗ ／ｗ）　　　　　　０．０５　　３．５　　３．７５工タノール％（ｖ／ｖ）　 　　　　　　　　０．０ｐ）Ｉ　　　　　　　　　　　　　　４．５　　７．８ 　　９．１酵母乾物含量％（Ｗ／Ｗ）　　　　　　　　４．１．　　４．５酵母 乾物中Ｐ２Ｏ５％（Ｗ／Ｗ）　　　−１，９２，２班１ 本発明の変異株ＣＢＳ　２２５−８７を用いる実験を例４に記載したのと同様に して行い、１０００　ｊ２の出発培地容量を用い、接種物として例３に記載した 方法により増殖せしめたＣＢＳ　２２５−８７を６×１！用い、化学貯槽は５ｋ ｇの硫酸アンモニウム、２．８ｋｇのリン酸水素ニアンモニウム及び８０ｆの水 から成った。フェト−パッチ発酵中アルコールは生成されず、そして栄養は０〜 ５７時間の間供給し、この後培養物を栄養供給を伴わない通気にかけた。８０時 間目における酵母細胞組成は、酵母乾物中窒素６．５％酵母乾物中五酸化リン２ ．５％、及び酵母乾物中トレハロース６．６％であった。フェト−バッチ発酵中 、全色素、アスタキサンチン及び酵母乾物を測定し、下の第５表に示す値が得ら れた。

メー」Ｌ−表 ＣＢＳ　２２５−８７のフェト−パッチ発酵０　　　１．４　　　　　０．９　 　　６４０２２　　１．１．２　　　　　８．１　　　７２０３３　　１８．４ 　　　　　１２．５　　　６８０３７　　２０．０　　　　１５．６　　　７８ ０　　　１１．０　　　５５０４０　　２０．８　　　　　１６．５　　　７９ ０　　　８．８　　　４２０５７　　２３．８　　　　２４．０　　　１０１． ０　　　１６．２　　　６８０６１　　２４．７　　　　２４．１　　　９８０ 　　　１？、０　　　６９０６４　　２４、．３　　　　２５．５　　　１０５ ０　　　１７．３　　　７１０全色素及びアスタキサンチン含量（ｎ　／　ｄ　 ）は分析された酵母乾物含量と全色素及びアスタキサンチンのｔｒｇ１ｇ値から 計算した。

ＣＢＳ　２１５−８８並びにＰ、ロドチーマ変異株ＤＢＴ４０６及びＤＢＴ４０ ３、並びに野性型株ＣＢＳ　５９０５及びＡＴＣＣ２４２６１の色素及びアスタ キサンチン含量を測定した。

と°フースコ１ 寒天斜面から酵母細胞をＹＭ培地に接種し、そして２０〜２２℃にて２日間イン キュベートした。１ｄのこの培養物を、４個のバッフルを有する２５０ｄの振と うフラスコ中の５０ｄのＹＭ培地中に接種した。培養物を、１５０ｒｐａ＋で回 転する振とうボード上での２０〜２２℃にて５日間の増殖に付した。

全色素の定量測定は方法−２に従って行った。アスタキサンチンの測定は方法− ２に従って行った。

墓　の　　ＣＢＳ　２１５−８８についてメタノール抽出物中の全色素を分光光 変法分析により測定した。５０成の抽出物の吸収マイナスメタノールの吸収をＥ ＝１．１８９であると測定した。サンプルの容量は２９ｄであった。

弐（２）に従って計算される酵母抽出物中の全色素含量は次の通りである。

Ｘ’　−１，１６０ｘ５０／２１００／２９Ｘ１０．０００Ｊ４／ｄ＝９．５２ 鱈／−酵母乾物は６．７　ｇ　／　ｌであると測定された。酵母乾物ｇ当りの全 色素含量は次の様に決定される。

Ｙ−９，５２／　７．　ｉ　ＸＩ、０００Ｒ／　ｇ−１３４０尾／ｇメタノール 中のアスタキサンチンの濃度はＨＰＬＣ分析により６、４　ｔｒｇ　／　ｍＲと 決定され、これは、６．２Ｒ／７．１．　ｇ／β＝８８０Ｒアスタキサンチン／ ｇ酵母乾物に相当する。

すべての株を上記のようにして増殖せしめ、そして分析した。菌株の全色素及び アスタキサンチン含量を第６表に示す。

２ユ」ヨー衷 ＣＢ５５９０５　　　５．３　　　　　１．３８　　　２６０　　　　０．８４ 　　　１６０ＡＴＣＣ２４２６１５，５２，１０３８０１，３８２５０ＤＢＴ４ ０６　　　　２．２　　　　５．８４　　２６５０　　　　３．４　　　１５４ ０ＤＢＴ４０３　　　　１．６　　　　　５．０４　　　３１５０　　　　３． ３　　　２０５０ＣＢＳ２１５−８８　　７．１　　　　　９．５２　　　１３ ４０　　　　６．２　　　　８８０■１ 本発明の変異株ＣＢＳ　２１５−８８のフェト−パッチ発酵を、例３に記載した との同じ４ｒｒｒ発酵槽中で、炭水化物源としてのシュークロース及びコーン・ ステイープ・ソリドを用いて行った。

次の成分： １０　　ｋｇ　　　　コーン・ステイープ・ソリド１２＃　　　　シュークロー ス １０＃　　　　硫酸アンモニウム ３　ｌ　　　リン酸二水素カリウム １　〃　　　硫酸マグネシウム ０．０５ｇ　　　　ビオチン ３００　　ｄ　　　　消泡剤Ｃｏｎｔｒａｓｐｕｍ　２１０１０００　ｆ水 かう成る出発培地をＰＨ４，６において蒸気の導入により９５°Ｃにて１時間殺 菌し、そして２２°Ｃに冷却した後、前記のようにして増殖させた６×１！のＣ ＢＳ　２１５−８８を接種物として加えた。

３５時間の通気（４，２が７分）の後、シュークロース溶液（０，３０ｇ／ｊり の供給を開始した。添加速度は２．３ｆ／時であった。通気を８．２ｎ（７分に 増加し、そしてｐＨ調整器をスタートさせた（セットポイント４．０）。培地中 のシュークロース濃度が２８時間後に約１ｇ／ｆｆｉに低下した時、シュークロ ースの供給を７．３４！／時に増加し、そしてこの速度を２４時間維持した。次 にシュークロースの供給を停止し、そして通気速度を４．２ｒｒｒ／分に低下せ しめて７２時間続けた。フェト−バッチ発酵中に全色素及びアスタキサンチンを 測定した。その値を第７表に示す。

男エニし一衷 ＣＢＳ　２］５−８８のフェト−パッチ発酵全色素ｎ／ｒｔｔｌ培地　　　　　 　１４．１　　３７．７　　４３．４ｐ）Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　４ ．．０　　４．０　　４．０酵母乾物中Ｎ％（Ｗ／Ｗ）　　　　　　　　　　　 　７．６９酵母乾物中Ｐ２Ｏ１％（Ｗ／Ｗ）　　　−３，７２Ｄｅ　Ｌａｖａｌ 　ＯＡ５Ｍ遠心分離機中での遠心分離により培地から酵母細胞を分離し、そして 水で２回洗浄した。ＦＩＬＴＯＲＯχフィルター・タイプＶＡＲＩＯＸ　４０／ ４０での濾過により酵母クリームから酵母を分離し、そして２６．３％の乾物を 含むフィルターケーキをｌａｂ流動床乾燥機（ＧＬＡＴＴ、　Ｈａｌｔｉｎｇｅ ｎ−Ｂｉｎｚｅｎ　Ｂｄ、）中で１ｍ篩を通して押出し、そして３０″Ｃにて９ ０分間乾燥せしめた。乾燥酵母（乾＠１Ｊ９１．６％）は、酵母乾物ｇ当り１３ ６０■の全色素、及び酵母乾物ｇ当り１１０８０ａのアスタキサンチンを含有し ていた。

１−　　玉流処理 例３の方法により得られた酵母細胞をＤｅ　Ｌａｖａｌ　ＯＡ５Ｍ遠心分離機中 での遠心分離により発酵液から単離した。この細胞を水で２回洗浄し、そして１ ３％の酵母乾物を含有する酵母クリームを得た。硫酸を添加して酵母クリームｐ Ｈを４．０に調整し、そしてこの酵母クリームに安息香酸ナトリウムを０．２％ （Ｗ／Ｖ）の濃度に添加した。単離された酵母細胞を処理する間、これらを窒素 のもとにおくことにより酵母細胞のアスタキサンチンの実質的な酸化を防止し、 そして温度を約１０°Ｃに保持した。

細胞破壊バルブ及び熱交換器を装着したＡＰＶ−Ｇａｕｌｉｎ　ＭＣ４ホモジナ イザーから成る系に前記酵母クリームを３回通し、そこで酵母クリームを７００ ｂａｒの圧力の破砕に付し、これにより温度が１０〜１５°Ｃ上昇し、次に熱交 換器での冷却により１５°Ｃの温度を得た。この系の中で酵母クリームを２５Ｏ ｆ！、７時の速度で循環せしめた。

破砕された細胞中のアスタキサンチン含量を次の様にして測定した。０．５　ｗ ｉｔのホモジナイズされた酵母クリームの重量を量り、そしてサルステッドチュ ーブに移し、そして５ｄのアセトンと共に振とうした。サンプルを遠心分離し、 １０ｄの目盛付シリンダーに移し、そして遠心分離及び定量的移送を行いながら アセトンにより３回洗浄した。全色素含量を方法１により測定し、そしてアスタ キサンチン含量を１（ＰＬＣ一方法１により測定し、そしてこの含量を、「材料 及び方法ｊの項で前記した方法により測定したサンプル中の全乾物含量と関連付 けた。この例に従ってホモジナイズされた酵母クリーム中の抽出可能なアスタキ サンチン含量を、細胞が完全に破砕されている方法１により測定された酵母クリ ーム中の含量と比較することにより、この例における破砕の程度が全細胞の９０ ％以上であると決定された。

窒素で覆われているこうして破砕された細胞に、７％のナトリウムカゼインを約 ４５°Ｃの温度において撹拌しながら添加した０次に、ナトリウムカゼインと混 合された酵母細胞ホモジネートを、入口温度が１８０°ＣであるＡｎ　ｈｙｄｒ ｏ型の噴霧塔において噴霧乾燥にかけた。酵母細胞材料は噴霧ホイールの使用に よって霧化され、そして噴霧塔の出口の空気の温度は約９０°Ｃであった。生ず る酵母粉末をサイクロンを用いて回収した。この酵母粉末の水分含量は１０重量 ％未満であった。

ｌＬｊ　　　による　　、の ９５％の乾物含量を存しそして酵母乾物ｇ当り５２３１４のアスタキサンチンを 含有する２０ｇの破砕されていないファフイア・ロドチーマ酵母細胞（濾過し、 そして次に流動床に押出し、そこで乾燥させたもの）を長さ１２Ｃ１１１及び内 径２．４ｃｍ０カラムに導入した。このカラムはジャケットを有し、その中に７ ５゛Ｃの温度の水を循環せしめた。このカラムの底部において、少量の酸洗浄砂 （サンドフィルター）を綿層上に配置した。酵母細胞を７５°Ｃの温度の氷酢酸 ５Ｘ１００ｍにより抽出し、そして各抽出物中の、及び抽出された酵母細胞材料 （カラム中に残留する氷酢酸約１００１１１１を含む）中のアスタキサンチンの 量を測定した。アスタキサンチンの測定を行う前に、抽出された酵母細胞材料蒸 発乾燥せしめた（１．６．１６ｇの材料が生ずる）。

結果を次の第８表に示す。

特表千２−５０４１０１（１７） １、抽出物　　　　　　１００ｄ　Ｘ　５５．７パ／ｄ　　　　５５７０■λ　 抽出物　　　　　　１００ｄ　Ｘ　１４．６鱈／ＪＩ！１！１４６０ａｒ３、抽 出物　　　　　　１００ｄＸ　４．４Ｘ／ａｄ　　　　４４０ｇ４、抽出物　　 　　　　１０Ｍ！Ｘ　３．１ａｇ／Ｉｄ１３１０ｇ従って、酵母細胞のアスタキ サンチン含量の７７．９％（８１４３，６／　１０４００Ｘ　１００％）が抽出 により放出された。

流動床において乾燥されそして酵母乾物ｇ当り３３６Ｊ！ｇのアスクキサンチン を含有することが見出されたファフィア・ロドチーマ酵母細胞を大豆油中に４０ ％（Ｗ／Ｗ）の濃度で懸濁した。このｇ濁液を、ジルコニウムボール（０，１〜 １．５　ｍｍ　）を含みそしてビーズを７０〜７５％満たしたボールミル（Ｃｏ Ｂａｌｌ−Ｍｉｌ］、タイプＭＳＺ−１２）にポンプ輸送した。ローターのスピ ードは１３ｍ／秒であった。各試行の後にサンプルを採取し、そしてサンプルの アスタキサンチン含量を）ＩＰＬＣ上で分析した。

ボールミルの温度は４０”Ｃ〜５０℃に保持した。

同様に、７５％の水中上記乾燥酵母細胞の懸濁液をボールミル中で処理した。こ の処理においてローグーのスピードを１５ｍ／秒とした。

結果を第９表に示す、この表中、アスクキサンチン含量を酵母乾物ｇ当り屑とし て示す。

呈−主一表 ６０％大豆油　　７５％水 第−試行　　　２２１　　　　１７９ 第二試行　　　３０８　　　　１９２ 第三試行　　　３１３　　　　２７６ 比較のため、乾燥酵母をホモゲナイゼーションを伴わないで大豆油又は水で処理 した場合、酵母乾物ｇ当りわずか２３ａｇのアスタキサンチンが見出された。

酵母細胞の実質的全破砕を得るためにボールミル中での約３回の処理で十分であ ることが実験により示された。

免優坦！ 異るアスクキサンチン含量の魚餌を調製した。魚粉、大豆粉、魚油、押小麦、レ シチン及び混合物の形のビタミンの混合物である、Ｄａｎｓｋ　０ｒｒｅｄｆｏ ｄｅｒ、　Ｂｒａｎｄｅ、デンマーク、からの市販魚餌Ｅｃｏｌｉｎｅ　１６か ら魚餌を調製した。この飼料に種々の量のアスタキサンチンを添加した０例３に 記載したのと同じ方法で増殖せしめそして噴霧乾燥したＰ、ロドチーマ酵母細胞 からアスタキサンチンを得た。５０°Ｃにて２．７ｋｇの水に溶解したナトリウ ムカゼイン０．４７５ｋｇと混合されたホモジナイズされた酵母クリーム２８ｋ ｇから噴霧乾燥した酵母細胞を調製した。２ｇのアスコルビルパルミテート及び 大豆からのトコフェロール１ｇを含有する０、０６８ｋｇのＧＲＩＮＤＴＥＫ　 ＭＯＲ５０をナトリウムカゼイン溶液中に乳化した。ナトリウムカゼイン溶液（ 酸化防止剤を含有する）をホモジナイズされた酵母クリームと混合し、そしてこ の混合物を例８に記載したようにして噴霧乾燥した。噴霧乾燥した生成物（９２ ，６％乾物）は酵母乾物ｇ当り約６７４Ｊ４のアスタキサンチンを含有していた 。この噴霧乾燥した生成物を前記の市販の魚餌に添加して種々のアスタキサンチ ン濃度の魚餌（飼料Ａ−Ｄ）（下記第１０表に示す）を得た。

対象として合成アスタキサンチンを含有する魚餌（飼料Ｅ）を用いた。飼料Ｅは 合成アスタキサンチンを４０ｐｐｍに相当する量で含有していた。

飼料Ａ−Ｅは次の組成を有した。

魚　　　　餌 ＡＢＣＤＥ アスタキサンチン　　　４．４　　１２．８　　２０．４　　３９．２ｎ／ｋｇ 飼料 合成アスタキサンチン　−　　　　　　　　　　　　　　　４０乾物（％）　　 　　９１．９４　９１．４９　９１．５６　９１．８８　８８．８１灰分（％） 　　　　　９．１２　９．００　８．７９　８，４５　７．０３セルロース（％ ”）　　　　　１．４６１．４５　　１．６０　　２．０５　　１．７１蛋白質 （％’Ｊ　　　　　　　４．３．６２　４３．２０　４３．８６　４３．８１　 ４３．１５脂肪（％）　　　　１７．５９　１７．２１　１８．６２　２０．０ ０　２１．１９’）　　　　　７（ｇ／ｋｇ）　　　　　　　　　　１１．５８ 　　　　１０．８９　　　　１１．２５　　　　１０．８０　　　　　９．X６ 無窒素抽出物（％）　　　２０．１５　２０．５３　１８．６９　１？、５７　 １５．７３それぞれが約４００ｇの体重を存する約６０尾のニジマスを魚餌Ａ− Ｈのそれぞれの実験において用いた。魚をケージ中に保持し、そして飼料を自由 に取らせた。水は２．５〜１４°Ｃの温度とし、魚飼育実験中の後の期間では低 温とした。

髄か°のアス　キサンチンの 使用した装置は実験室実験において常用されている装置である。

皮膚を存しないニジマスを小片に切断し、そして１５ｇの肉を秤り取って遠心チ ューブ（１００ｍｇ　）に入れた。抽出剤として１５ｍｅのテトラヒドロフラン を加えた。肉をＵＬＴＲＡＴＬＩＲＡχミキサー中でさらに細砕し、そして次に 遠心分離した。テトラヒドロフラン抽出物を５０−のメスフラスコに移した。残 渣を音波処理浴中で１０−のテトラヒドロフランにより２〜３回洗浄し、そして 遠心分離し、そしてテトラヒドロフラン相をメスフラスコに移し、これに追加の テトラヒドロフランを加えて５０ｄにした。この５０ｍ１の内１０Ｊ１１１７を 窒素のもとで４０°Ｃの温度にて蒸発せしめた。蒸発残渣をｌｄの移動相に溶解 し、そして０．４５−のフィルターを通して濾過し、その後に分析した。

肚匹立折 カラム：　ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ−１８＋　５　ａｒｍ、　　２５０Ｘ　 ４．６　ｔｒｍ移動相：　　４０ｄ蟻酸 ６０ｄ水 ３８４ｉ酢酸エチル ５１６１１！アセトニトリル 流速：　１０ｄ／分 注　入：２０Ｉループ、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ　７１２０ポンプ：　Ｗａｔｅｒｓ　 ５１０ 検出器：　Ｗａｔｅｒｓ　４８１＋　Ｕ　Ｖ−分光光度計、４７１ｎｍ積分器： 　Ｗａｔｅｒｓ　７４０ １臼駐糧旦 魚肉の色を、ミノルタカメラ・メーター■を用いるＬ”ａ”ビー色決定法により 決定した。Ｌ”−値は明度成分を示し、ａ゛−値（−６０〜＋６０）は緑／赤成 分（負の値は緑成分を示し、そして正の値は赤成分を示す）を示し、そしてｂ” −値（−６０〜＋９０）は青／黄成分を示す、ａ”−値のみを第１１表に示す。

皮膚を存しないニジマスの肉をブレンダーでホモジナイズして均一材料を得、こ れを小ベトリ皿（高さＩＣ１１、直径３．５ＣＩ１１）に入れてその全容を占め るようにした。ベトリ皿中の材料の表面を平らにし、ガラス板で覆い、そして次 に分析を待った。

次の表に、魚飼育実験の結果を示す。

男ユニＬ−表 １６日間飼育された魚の分析 １１　　　　　捻 ２゛３日間飼育された魚の分析 １　　　　　　　番 ３０日間飼育された魚の分析 命Δ２ ４３日間飼育された魚の分析 男−工Ｌ」し〇九旺 ７２日間飼育された魚の分析 この結果が示すところによれば、魚餌Ａ−Ｅのそれぞれのアスタキサンチンは魚 に吸収され、そして魚肉は飼料中のアスタキサンチンの量の増加（飼料Ａ−Ｄ） に従って、そして飼育期間の増加に従って増加する赤色の着色〔ａ″−値（色の 赤成分を示す）により観察されるように〕を含有する。

さらに、上記の結果は、飼料中のアスタキサンチンの存在が魚の成育に影響を与 えないことを示している。

魚を視覚実験にかけ、そして魅力的な赤色を有することが見出された。飼育の４ ３日後、飼料り及びＥ（それぞれ本発明に従って製造されたアスタキサンチン４ ０ｐｐｍ及び合成アスタキサンチン４０ｐｐｍを含をする）を供与された色の着 色に実質的な差が観察されなかった。飼育の７２時間後、飼料Ｃ，Ｄ及びＥ（そ れぞれ、本発明に従って製造されたアスタキサンチン約２０ｐｐｍ　、本発明に 従って製造されたアスタキサンチン４０１）Ｉ）ａ　％及び合成アスタキサンチ ン４０ｐｐｖａを含有する）により飼育された魚の着色に実験的な差が観察され なかった。

五■− ヱヱユ之五ニバ±旦ｉｓｈ胆丘Ｌ タラの小片　　　　　　　　　　　　　　　７１％油　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　３％ラスク（ｒｕｓｋ）４％ グリンドステッド・プロティン１７７”）　　　　１％澱粉　　　　　　　　　 １％ アスタキサンチン　　　　　　　　　　　　０．００１％水、防腐剤及びスパイ ス　　　　　　　　１００％まで＊）グリンドステッド・プロティンは７５％の グリンドステンド・プロティン１００と２５％のアルギン酸ナトリウムとのブレ ンドである。

アスタキサンチンを油相に分散せしめた。グリンドステッド・プロティン１７７ 　、ｇ粉及び他の乾燥成分を混合し、そして魚をコロイドミルに加えた。次に、 油相、乾燥成分、及び水を加え、そしてコロイドミル中で１０分間処理を続ける 。パテを錫容器に満たし、そして熱処理にかけた。

レー　！・ドレ・シング 魅力的な赤色を有するレッド・ドレッシングを次の成分から常法に従って製造す ることができる。

油　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０．０％タラゴン酢　 　　　　　　　　　　　　１２．３％トメトペースト　　　　　　　　　　　　 　８．０％マヨダン（Ｍａｙｏｃｊａｎ）　Ｄ　Ｃ”）　　　　　　　　　０． ３％糟　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８．０％食塩　　　　　　　 　０．８％ アスタキサンチン　　　　　　　　　　０．０１〜０．５％水、防腐剤及びスパ イス　　　　　　　１００％マチ＊）マヨダン（Ｍａｙｏｄａｎ）　Ｄ　Ｃ（商 標）はグリンドステッド・ブロダクスＡ／Ｓからの安定剤である。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） １　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＤＫ８８１０００６　Ｂ ２　発明の名称 アスタキサンチン生産性酵母細胞、その製造方法及びその使用３　特許出願人 住　所　デンマーク国、デーコー−２６００グロスドループ。

ファブリクスバルケン　５Ｂ 名　称　ダニスコ　バイオテクノロジー　アクティーゼルスカブ４代理人 住　所　東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル〒１０５　１ｉ話（ ５０４）０７２１ 請求の範囲 １、接種物として１００Ｊ１１の４日間ＹＭ培養物を用い、５０ｍｆｔの培地を 含み２個のバッフルを存し１５０ｒｐｍの回転振とうに付された５００ｉの振と うフラスコ中で２０〜２２°Ｃにて５日間ディフコＹＭ培地で、３０ｍｍｏｌ　 ／　ｉＬ　／時の酸素移動速度を用いる条件下で培養せしめ、２０−のメタノー ル中０．２ｇの酵母乾物の懸濁液を、氷水で冷却されるジャケットを有し直径０ ．４−のガラスポール１５ｇを収容するガラスボールミル中で２０°Ｃ以下の温 度において、０．５分間の間隔をおいて５×１分間の破砕にかけることによって 調製した酵母のメタノール抽出物について、標準として純粋なアスタキサンチン を用いてＨＰＬＣにより測定した場合に、酵母乾物ｇ当り６００ｇ以上の量でア スタキサンチンを生産する酵母細胞。

λ　ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属に属し、そして好ましくはファフィア・ロ ドチーマ（ハ立江、臘か匣逆上組）種に属する、請求項１に記載の酵母細胞。

３、寄託番号に２２４−８７　ＣＢＳのもとに寄託されている酵母株、寄託番号 Ｎα２２５−８７　ＣＢＳのもとに寄託されている酵母株又は寄託番号Ｎα２１ ５８８　ＣＢＳのもとに寄託されている酵母株に属するか、あるいはその°アス タキサンチン生産能を有しているその変異株又は誘導体である、請求項２に記載 の酵母株６４、請求項１に記載された条件下で増殖しそして請求項１に記載した 方法により測定した場合に、酵母乾物ｇ当り７００ｎ以上、５好ましくは酵母乾 物ｇ当り１０００ｉ以上、特に酵母乾物ｇ当り１５００ｇ以上、そして最も好ま しくは酵母乾物ｇ当り２０００１！ｇ以上の量でアスタキサンチンを特徴する請 求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母細胞。

５、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母細胞の製造方法であって、酵母細 胞を変異系で処理し、そして請求項１に記載の条件下で増殖せしめそして請求項 】に記載の方法により測定した場合に酵母乾物ｇ当り３００ａｇ以上の量でアス タキサンチンを生産することができる生じた変異株を選択することを含んで成る 方法。

６、　酵母細胞を引き続いての２回以上の変異誘発処理にかける、請求項５に記 載の方法。

７、変異誘発にかけられる酵母細胞が、請求項１に記載の条件下で増殖せしめそ して請求項１に記載の方法で測定した場合に酵母乾物ｇ当り３００．ｑ以上の量 でアスタキサンチンを生産する酵母細胞である、請求項５又は６に記載の方法。

８、前記変異原がエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射及びＮ−メチル＝Ｎ′− ニトローＮ−二トロソグアニジンから選択される、請求項５〜７のいずれか１項 に記載の方法。

９、７スタキサンチン含有酵母細胞もしくは細胞の部分又はアスクキサンチンの 製造方法であって、炭水化物源、資化性窒素源及びリン源、微少栄養素及びビオ チン又はデスチオビオチンを含有する培地中でアスタキサンチン生産性酵母細胞 を１５〜２６°Ｃの温度において培養することによって酵母乾物ｇ当り６００ｇ 以上の量でアスクキサンチンを含有する生物体を得、そして所望により下記の段 階を任意の順序で行うことを含んで成る方法： ◎　培養物から細胞を収得して酵母クリームを得る；◎　細胞を開く、例えば機 械的、化学的及び／又は酵素処理の手段により、そして／又は細胞を音波処理、 自己消化、浸透圧分解及び／又は原形質分離にかけることにより、場合によって は適当な薬剤、例えば洗剤、酸、塩基、酵素、自己消化増強物質、浸透圧分解剤 例えば塩、及び／又は原形質分解剤の添加を伴って、細胞壁を破壊する；◎　細 胞をホモジナイズしてホモジネートを得る；◎　細胞、細胞断片又はホモジネー トを、好ましくは１２重量％以下の水分含量に、好ましくは１０重量％以下の水 分含量に乾燥する； ◎　細胞、細胞断片又はホモジネートからアスクキサンチンを抽出する。

１０、培養をフェト−パッチ発酵により行い、アルコールが実質的に生成されず そして場合によってはグルコース及びサッカロースの合計濃度が８ｇ／ｊ’以下 、好ましくは５　ｇ／ｆ、そして最も好ましくは１　ｇ／ｌであり温度が２０〜 ２２°Ｃである条件下で発酵を行い、発酵又はその部分を、糖蜜及び／又はサッ カロース並びに窒素源、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化 アンモニウム又は尿素、リン源、例えばリン酸アンモニウム及びリン酸、並びに 添加された微量栄養素又は鉱物塩、例えば硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛及びビオ チン又はデスチオビオチンを含有する培地中で行い、糖蜜を他の成分とは別に培 地に供給する、請求項９に記載の方１１、培養が、実質的にすべての培養条件に ついて実質的に十分である条件下での増殖期、及びこれに続く、連続する通気の もとで増殖培地が少なくとも１種類の増殖因子を消耗しこれによってこれに続く 期間でのアスタキサンチンの生産を増強する増殖制限期を含んで成る、請求項９ 又は１０に記載の方法。

１２、前記増殖制限期を約１６時間以上、例えば１６〜２４時間続け、増殖制限 期を、この期間を用いないで得られる生産の１．２倍以上、好ましくはこの期間 を用いないで得られる生産の１．３倍以上、例えば１．４倍以上、そしてさらに 好ましくは１．５倍以上アスタキサンチン生産を増強するように適合せしめ、増 殖制限期を好ましくは培地になんらの栄養又は微量栄養も実質上添加することな く行う、請求項１１に記載の方法。

１３、培養される酵母細胞が野性型アスタキサンチン生産性酵母細胞、好ましく はファフィア属に属する酵母細胞、例えばファフィア・ロドチーマ種に属する酵 母細胞である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。

１４、得られる生物体中のアスタキサンチンの濃度が請求項１に記載の方法によ り測定した場合酵母乾物ｇ当り６００ｉ以上、好ましくは酵母乾物ｇ当り７００ ４以上である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

１５、培養される酵母細胞が請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母細胞であ る、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。

１６、得られる生物体中のアスクキサンチンの濃度が、請求項１に記載の方法に より測定した場合、酵母乾物ｇ当り６００ｎ以上、好ましくは８００４以上、さ らに好ましくは１０００ｉ以上、特に酵母乾物ｇ当り１５００■以上、例えば酵 母乾物ｇ当り２０００ｉ以上、そして最も好ましくは酵母乾物ｇ当り３０００ｉ 以上である、請求項１５に記載の方法。

１７、前記培養及びそれに続く任意的増殖制限期に続き、酵母細胞を次の処理： ◎　細胞を上昇した圧力にかけそして次に圧力を開放することにより細胞を破砕 し、そして次に破砕された細胞を限外濾過又は蒸発にかけて該破砕された酵母細 胞を濃縮する；◎　細胞を上昇した圧力にかけそして次に圧力を開放することに より細胞を破砕し、そして次に該破砕された細胞を噴霧乾燥又はドラム乾燥する ； ◎　濾過してフィルターケーキを得、これを次に押出し、次に、押出したものを 例えば流動床中で又はトレイ乾燥により乾燥する； ◎　流動床中で又はトレイ乾燥により乾燥された全体細胞乾燥材料を油相、例え ば可食性油脂と混合し、この混合物をミル、例えばボール撹拌ミル中で粉砕して 細胞を破砕しそしてアスクキサンチンを前記油相に放出せしめる；◎　好ましく はホモジナイズ゛された破砕された細胞を有機溶剤、例えば石油エーテル、アセ トン、又はアルコール、例えばメタノール、エタノール又はイソプロパツールで 抽出することにより有機溶剤に溶解したアスタキサンチンを得、そして次に場合 によっては溶剤を例えば蒸発により除去する；◎　全体細胞を氷酢酸を含んで成 る溶剤により抽出することによって氷酢酸台を溶剤中に含まれたアスタキサンチ ンを得る； ◎　破砕された又は全体の湿った又は乾燥した細胞を、場合によっては例えば前 記の有機溶剤の存在下で二酸化炭素により超臨界抽出する； の１つ又は複数にかける、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。

１８、前記処理を、酸素制限条件下で、例えば不活性雰囲気、例えば水蒸気より 及び／又は窒素により及び／又は二酸化炭素により達成される不活性雰囲気中で 行う、請求項１７に記載の方法。

１９、氷酢酸含有溶剤による全体酵母細胞の抽出を溶剤の氷点より高い温度、例 えば２０〜１００°Ｃの範囲、好ましくは２０〜８０°Ｃの範囲、そしてさらに 好ましくは２０〜６０°Ｃの範囲の温度において行う、請求項１７又は１８に記 載の方法。

２０、請求項１に記載の方法により測定した場合に酵母乾物ｇ当り３００ｉ！ｇ 以上の量でアスタキサンチンを含有する酵母細胞又は酵母細胞部分を他の飼料成 分、好ましくは動物飼料と組み合わせて含んで成る動物飼料であって、前記アス タキサンチン含１ｉｒ酵母細胞又は酵母細胞部分が全動物飼料組成物乾物の１０ 重量％以下、好ましくは５％以下、そしてさらに好ましくは３％以下であり、他 の成分が好ましくは蛋白質及び炭水化物、例えば魚粉、小麦、血粉、穀粉、脂肪 、例えば魚油及び植物油、ビタミン及びミネラルから選択される、動物飼料。

２１、前記アスタキサンチン含有酵母細胞又は酵母細胞部分が、請求項１〜４の いずれか１項に記載の酵母細胞もしくはその部分、又は請求項５〜１９のいずれ か１項に記載の方法により製造された酵母又はその部分である、請求項２０に記 載の動物飼料。

２２、請求項５〜１６のいずれか１項の方法により製造されたアスタキサンチン 含有酵母細胞から請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法により抽出され たアスクキサンチンを他の栄養成分、例えば蛋白質、炭水化物及び／又は脂肪と 組合わせて含んで成り、好ましくはアスクキサンチンが油相中に含まれている食 品又は飼料。

２３、動物の肉及び／又は動物により生産される生成物の赤色の着色を得るため に動物を飼育する方法であって、該動物に、請求項１に記載の方法により測定し た場合に酵母乾物ｇ当り６００ｗ以上の量でアスタキサンチンを含有する酵母細 胞又は細胞部分を、あるいはこれらの酵母細胞又はその部分から抽出されたアス タキサンチンを含有する飼料を供与することを含んで成り、該動物が好ましくは 魚、特にサケもしくはマス、バターに着色するためにウシ、あるいは卵黄を着色 するために家禽である、前記方法。

国際調査報告 ＋−−０，１ｅ−１Ａ−−１，＝ｂ−ＰＣＴ／ＤＫａＢ１０００６１１

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．接種物として１００μｌの４日間ＹＭ培養物を用い、５０ｍｌの培地を含み ２個のバッフルを有し１５０ｒｐｍの回転振とうに付された５００ｍｌの振とう フラスコ中で２０〜２２℃にて５日間ディフコＹＭ培地で、３０ｍｍｏｌ／ｌ／ 時の酸素移動速度を用いる条件下で培養せしめ、２０ｍｌのメタノール中０．２ ｇの酵母乾物の懸濁液を、氷水で冷却されるジャケットを有し直径０．４ｍｍの ガラスポール１５ｇを収容するガラスボールミル中で２０℃以下の温度において 、０．５分間の間隔をおいて５×１分間の破砕にかけることによって調製した酵 母のメタノール抽出物について、標準として純粋なアスタキサンチンを用いてＨ ＰＬＣにより測定した場合に、酵母乾物ｇ当り３００μｇ以上の量でアスタキサ ンチンを生産する酵母細胞。
2. ２．ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属に属し、そして好ましくはファフィア・ロ ドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）種に属する、請求項１に記載 の酵母細胞。
3. ３．寄託番号Ｎｏ．２２４−８７　ＣＢＳのもとに寄託されている酵母株、寄託 番号Ｎｏ．２２５−８７　ＣＢＳのもとに寄託されている酵母株又は寄託番号Ｎ ｏ．２１５−８８　ＣＢＳのもとに寄託されている酵母株に属するか、あるいは そのアスタキサンチン生産能を有しているその変異株又は誘導体である、請求項 ２に記載の酵母株。
4. ４．請求項１に記載された条件下で増殖しそして請求項１に記載した方法により 測定した場合に、酵母乾物ｇ当り　４５０ｍｇ以上、例えば酵母乾物ｇ当り　６ ００μｇ以上、好ましくは酵母乾物ｇ当り７００μｇ以上、さらに好ましくは酵 母乾物ｇ当り１０００μｇ以上、特に酵母乾物ｇ当り１５００μｇ以上、そして 最も好ましくは酵母乾物ｇ当り２０００μｇ以上の量でアスタキサンチンを生産 する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母細胞。
5. ５．請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母細胞の製造方法であって、酵母細 胞を変異系で処理し、そして請求項１に記載の条件下で増殖せしめそして請求項 １に記載の方法により測定した場合に酵母乾物ｇ当り３００μｇ以上の量でアス タキサンチンを生産することができる生じた変異株を選択することを含んで成る 方法。
6. ６．酵母細胞を引き続いての２回以上の変異誘発処理にかける、請求項５に記載 の方法。
7. ７．変異誘発にかけられる酵母細胞が、請求項１に記載の条件下で増殖せしめそ して請求項１に記載の方法で測定した場合に酵母乾物ｇ当り　３００μｇ以上の 量でアスタキサンチンを生産する酵母細胞である、請求項５又は６に記載の方法 。
8. ８．前記変異原がエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射及びＮ−メチル−Ｎ′− ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンから選択される、請求項５〜７のいずれか１項 に記載の方法。
9. ９．アスタキサンチン含有酵母細胞もしくは細胞の部分又はアスタキサンチンの 製造方法であって、炭水化物源、資化性窒素源及びリン源、微少栄養素及びビオ チン又はデスチオビオチンを含有する培地中でアスタキサンチン生産性酵母細胞 を１５〜２６℃の温度において培養することによって酵母乾物ｇ当り　３００μ ｇ以上の量でアスタキサンチンを含有する生物体を得、そして所望により下記の 段階を任意の順序で行うことを含んで成る方法： ◎　培養物から細胞を収得して酵母クリームを得る；◎　細胞を開く、例えば機 械的、化学的及び／又は酵素処理の手段により、そして／又は細胞を音波処理、 自己消化、浸透圧分解及び／又は原形質分解にかけることにより、場合によって は適当な薬剤、例えば洗剤、酸、塩基、酵素、自己消化増強物質、浸透圧分解剤 例えば塩、及び／又は原形質分解剤の添加を伴って、細胞壁を破壊する；◎　細 胞をホモジナイズしてホモジネートを得る；◎　細胞、細胞断片又はホモジネー トを、好ましくは１２重量％以下の水分含量に、好ましくは１０重量％以下の水 分含量に乾燥する； ◎　細胞、細胞断片又はホモジネートからアスタキサンチンを抽出する。
10. １０．培養をフェドーバッチ発酵により行い、アルコールが実質的に生成されず そして場合によってはグルコース及びサッカロースの合計濃度が８ｇ／ｌ以下、 好ましくは５ｇ／ｌ、そして最も好ましくは１ｇ／ｌであり温度が２０〜２２℃ である条件下で発酵を行い、発酵又はその部分を、糖蜜及び／又はサッカロース 並びに窒素源、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニ ウム又は尿素、リン源、例えばリン酸アンモニウム及びリン酸、並びに添加され た微量栄養素又は鉱物塩、例えば硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛及びビオチン又は デスチオビオチンを含有する培地中で行い、糖蜜を他の成分とは別に培地に供給 する、請求項９に記載の方法。
11. １１．培養が、実質的にすべての培養条件について実質的に十分である条件下で の増殖期、及びこれに続く、連続する通気のもとで増殖培地が少なくとも１種類 の増殖因子を消耗しこれによってこれに続く期間でのアスタキサンチンの生産を 増強する増殖制限期を含んで成る、請求項９又は１０に記載の方法。
12. １２．前記増殖制限期を約１６時間以上、例えば１６〜２４時間続け、増殖制限 期を、この期間を用いないで得られる生産の１．２倍以上、好ましくはこの期間 を用いないで得られる生産の１．３倍以上、例えば１．４倍以上、そしてさらに 好ましくは１．５倍以上アスタキサンチン生産を増強するように適合せしめ、増 殖制限期を好ましくは培地になんらの栄養又は微量栄養も実質上添加することな く行う、請求項１１に記載の方法。
13. １３．培養される酵母細胞が野性型アスタキサンチン生産性酵母細胞、好ましく はファフィア属に属する酵母細胞、例えばファフィア・ロドチーマ種に属する酵 母細胞である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. １４．得られる生物体中のアスタキサンチンの濃度が請求項１に記載の方法によ り測定した場合酵母乾物ｇ当り２５０μｇ以上、好ましくは酵母乾物ｇ当り　３ ００μｇ以上である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. １５．培養される酵母細胞が請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母細胞であ る、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
16. １６．得られる生物体中のアスタキサンチンの濃度が、請求項１に記載の方法に より測定した場合、酵母乾物ｇ当り　６００μｇ以上、好ましくは　８００μｇ 以上、さらに好ましくは１０００μｇ以上、特に酵母乾物ｇ当り１５００μｇ以 上、例えば酵母乾物ｇ当り２０００μｇ以上、そして最も好ましくは酵母乾物ｇ 当り３０００μｇ以上である、請求項１５に記載の方法。
17. １７．前記培養及びそれに続く任意的増殖制限期に続き、酵母細胞を次の処理： ◎　細胞を上昇した圧力にかけそして次に圧力を開放することにより細胞を破砕 し、そして次に破砕された細胞を限外濾過又は蒸発にかけて該破砕された酵母細 胞を濃縮する；◎　細胞を上昇した圧力にかけそして次に圧力を開放することに より細胞を破砕し、そして次に該破砕された細胞を噴霧乾燥又はドラム乾燥する ； ◎　濾過してフィルターケーキを得、これを次に押出し、次に、押出したものを 例えば流動床中で又はトレイ乾燥により乾燥する； ◎　流動床中で又はトレイ乾燥により乾燥された全体細胞乾燥材料を油相、例え ば可食性油脂と混合し、この混合物をミル、例えばボール撹拌ミル中で粉砕して 細胞を破砕しそしてアスタキサンチンを前記油相に放出せしめる；◎　好ましく はホモジナイズされた破砕された細胞を有機溶剤、例えば石油エーテル、アセト ン、又はアルコール、例えばメタノール、エタノール又はイソプロパノールで抽 出することにより有機溶剤に溶解したアスタキサンチンを得、そして次に場合に よっては溶剤を例えば蒸発により除去する；◎　全体細胞を氷酢酸を含んで成る 溶剤により抽出することによって氷酢酸含有溶剤中に含まれたアスタキサンチン を得る； ◎　破砕された又は全体の湿った又は乾燥した細胞を、場合によっては例えば前 記の有機溶剤の存在下で二酸化炭素により超臨界抽出する； の１つ又は複数にかける、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. １８．前記処理を、酸素制限条件下で、例えば不活性雰囲気、例えば水蒸気によ り及び／又は窒素により及び／又は二酸化炭素により達成される不活性雰囲気中 で行う、請求項１７に記載の方法。
19. １９．氷酢酸含有溶剤による全体酵母細胞の抽出を溶剤の氷点より高い温度、例 えば２０〜１００℃の範囲、好ましくは２０〜８０℃の範囲、そしてさらに好ま しくは２０〜６０℃の範囲の温度において行う、請求項１７又は１８に記載の方 法。
20. ２０．全体細胞材料及び／又は抽出されたアスタキサンチンを酸化防止剤、例え ばビチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ ）、ビタミンＥアスコルビン酸、又はアスコルビン酸の（ＩＩ）サルフェートも しくは（ＩＩ）ホスフニート、及び／又は乳化剤、例えばモノグリセライド又は ソルビタンエステルにより保護する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の 方法。
21. ２１．請求項１に記載の方法により測定した場合に酵母乾物ｇ当り　３００μｇ 以上の量でアスタキサンチンを含有する酵母細胞又は酵母細胞部分を他の飼料成 分、好ましくは動物飼料と組み合わせて含んで成る動物飼料であって、前記アス タキサンチン含有酵母細胞又は酵母細胞部分が全動物飼料組成物乾物の１０重量 ％以下、好ましくは５％以下、そしてさらに好ましくは３％以下であり、他の成 分が好ましくは蛋白質及び炭水化物、例えば魚粉、小麦、血粉、穀粉、脂肪、例 えば魚油及び植物油、ビタミン及びミネラルから選択される、動物飼料。
22. ２２．前記アスタキサンチン含有酵母細胞又は酵母細胞部分が、請求項１〜４の いずれか１項に記載の酵母細胞もしくはその部分、又は請求項５〜２０のいずれ か１項に記載の方法により製造された酵母又はその部分である、請求項２１に記 載の動物飼料。
23. ２３．請求項５〜１６のいずれか１項の方法により製造されたアスタキサンチン 含有酵母細胞から請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法により抽出され たアスタキサンチンを他の栄養成分、例えば蛋白質、炭水化物及び／又は脂肪と 組合わせて含んで成り、好ましくはアスタキサンチンが請求項２６の方法により 製造される油相中に含まれている食品又は飼料。
24. ２４．動物の肉及び／又は動物により生産される生成物の赤色の着色を得るため に動物を飼育する方法であって、該動物に、請求項１に記載の方法により測定し た場合に酵母乾物ｇ当り　３００μｇ以上の量でアスタキサンチンを含有する酵 母細胞又は細胞部分を、あるいはこれらの酵母細胞又はその部分から抽出された アスタキサンチンを含有する飼料を供与することを含んで成り、該動物が好まし くは魚、特にサケもしくはマス、バターに着色するためにウシ、あるいは卵黄を 着色するために家禽である、前記方法。